KR101563583B1

KR101563583B1 - 베큘로바이러스 다각체 단백질의 부분 융합을 이용한 외래 재조합 단백질의 발현량을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR101563583B1
Application number: KR1020110046126A
Authority: KR
Inventors: 우수동; 배성민; 최재방; 신태영; 진병래; 제연호; 이광식; 최재영; 노종열
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2015-10-27
Also published as: KR20120128730A

Abstract

본 발명은 외래 발현 목적 단백질의 발현 효율을 크게 증가시킬 수 있는 베큘로바이러스 전이 벡터, 상기 전이 벡터를 포함하는 숙주세포, 및 상기 전이 벡터를 이용하여 발현 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 전이 벡터는 베큘로 바이러스의 다각체단백질의 특정 일부분을 발현 목적 단백질에 융합시켜, 강력한 다각체단백질 코딩 유전자의 프로모터하에서 발현시킴으로써, 베큘로 바이러스 발현 벡터 시스템에서 발현 목적 단백질의 발현양을 현저하게 증대시킬 수 있다.

Description

베큘로바이러스 다각체 단백질의 부분 융합을 이용한 외래 재조합 단백질의 발현량을 증가시키는 방법{Method for Enhancing the Expression of Foreign Recombinant Protein Using Fusion Expression with Partial Polyhedrin of Baculovirus}

본 발명은 외래 재조합 단백질의 발현량을 증가시키기 위한 베큘로바이러스 전이 벡터 시스템, 이를 포함하는 숙주 세포 및 이를 이용하여 외래 재조합 단백질을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 외래 재조합 단백질을 베큘로바이러스의 다각체 단백질의 일부 펩티드 또는 이의 변이체와 융합된 융합단백질 형태로 발현시키는 베큘로바이러스 전이 벡터 시스템에 관한 것이다.

베큘로 바이러스 발현 벡터 시스템(Baculovirus Expression Vector System; BEVS)은 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus; NPV) 유전자의 강력한 프로모터(promoter)를 이용하는 발현 벡터 시스템으로 발현 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 고등 진핵세포인 곤충세포를 이용함으로써 발현된 외래 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 뛰어나기 때문에, 대장균(E. coli), 효모(Yeast), 포유동물세포(Mammal cell) 등을 이용하는 다른 발현벡터 시스템에 비해 여러 가지 면에서 장점을 가지고 있어 크게 주목을 받고 있다(O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992). 현재, 오토그라파켈리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica NPV; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori NPV; BmNPV)를 이용하는 두 가지 발현벡터 시스템이 널리 이용되고 있다(Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165, 1983; Maeda et al., Nature 315:592-594, 1985). 곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키는 경우, 베큘로 바이러스 발현 벡터를 이용하면 여러 가지 장점이 있는 바, 대장균에서의 발현 시스템과 유사한 정도로 단백질을 대량 생산할 수 있고, 당부가(glycosylation)와 같은 번역 후 수식(post-translational modification)이 효과적으로 이루어져 대장균과 효모를 숙주세포로 이용한 경우와는 달리, 천연형 단백질과 유사한 정도의 생물학적 활성을 갖는 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다. 또한 번역 후 수식이 정확하게 이루어지는 포유동물세포를 사용하는 방법은 치료적 가치가 높은 단백질을 다른 시스템에 비해 비교적 많이 얻을 수 있지만, 포유동물세포의 배양 및 유지에는 포유동물 유래의 각종 호르몬과 생장조절물질이 다량으로 필요하므로 상당한 비용이 요구된다. 따라서, 포유동물세포와 유사한 번역 후 수식이 이루어지며 저비용으로 재조합 단백질을 생산할 수 있는 새로운 생산 시스템인 곤충 베큘로바이러스 발현벡터 시스템이 단백질 의약품의 생산에 주목을 받고 있다.

그러나 이러한 장점에도 불구하고, 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터만을 이용한 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템으로 곤충 숙주세포에서 외래 단백질을 발현하는 경우, 발현 단백질의 양이 현저히 낮은 경우가 있다. 외부 단백질이 곤충 세포에서 낮은 수준으로 발현되는 이유는 주로 외부 유전자의 시그날 서열이 숙주세포에 의해서 비효율적으로 인식되거나, 바이러스의 감염에 따른 숙주 세포의 단백질 프로세싱(processing) 능력의 감소에 기인하는 것으로 여겨지고 있다. 또한, 이외에도 다각체 단백질 코딩 유전자의 강력한 프로모터를 이용하여 외래 단백질을 발현시키지만 원래 다각체 단백질의 발현량 수준과 비교할 때 외래 단백질의 발현량이 그에 미치지 못하는 한계점을 지니고 있다. 이러한 문제점을 해결하고자 최근에는 외부 유전자의 시그날 서열을 조작함으로써 발현되는 단백질을 숙주세포의 세포외로 분비시켜 그 발현양을 증대시키거나, 인핸서(enhancer) 역할을 하는 유전자 서열의 융합에 의하여 발현양을 증대시키는 방법이 많이 개발되어지고 있다. 예를 들어 꿀벌의 독액을 만드는 중요한 요소인 멜리틴(melittin)의 유전자와 융합하였을 때 외래 단백질이 세포외로 분비되어 발현양을 성공적으로 증대시킨 결과가 보고되어 있다(Tessier, D. C., et al., gene, 1991, 98, 177-183). 또한 유비퀴틴(ubiquitin) 유전자를 개량하여 외래 유전자와 융합하였을 때 발현양이 증대되는 결과를 보였고 현재 스몰 유비퀴틴-라이크 모디퍼(Small Ubiquitin-like MOdifer; SUMO)로 상품화되어 판매되고 있다(LifeSensors Inc.).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 베큘로 바이러스 발현 벡터 시스템에서 발현 목적 단백질의 발현양을 효과적으로 증대시키기 위해 연구 노력한 결과, 베큘로 바이러스의 다각체단백질의 특정 일부분을 발현 목적 단백질에 융합시키고, 강력한 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터하에서 발현시키면, 발현 목적의 외래 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 외래 발현 목적 단백질의 발현 효율을 크게 증가시킬 수 있는 베큘로바이러스 전이 벡터를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 베큘로바이러스 전이 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베큘로바이러스 전이 벡터를 이용하여 발현 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 베큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터; (ⅱ) 상기 프로모터와 작동적으로 연결된 베큘로바이러스 다각체단백질의 일부 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅲ) 발현 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 클로닝될 수 있는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 베큘로바이러스 다각체단백질의 일부는 서열목록 제 23 서열의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이고, 상기 변이체는 상기 펩티드의 아미노산 치환 변이체 또는 절단 변이체이며, 상기 발현 목적 단백질은 상기 펩티드 또는 이의 변이체와의 융합 단백질 형태로 발현되는 것을 특징으로 하는, 발현 목적 단백질을 발현시키기 위한 용도의 베큘로바이러스 전이 벡터를 제공한다.

본 발명은 베큘로바이러스 전이 벡터에서 다각체단백질의 일부 또는 이의 변이체를 발현 목적 단백질의 앞 부분에 융합되어 발현되도록 설계하면, 발현 목적 단백질의 발현 효율이 크게 증가함을 발견한 것에 기초한다. 즉, 본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터에서는 베큘로바이러스 다각체단백질의 일부 또는 이의 변이체를 발현 목적 단백질과 융합된 형태로 발현시킴으로써 목적 단백질의 발현 효율을 성공적으로 향상시킨다.

본 명세서에서 용어 "베큘로바이러스(baculovirus)"는 사람이나 척추동물에는 병원성이 없으며, 곤충에 대해서만 병원성을 가지고 있는 곤충 병원성 바이러스를 총칭하는 의미이다. 베큘로바이러스는 크게 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus: NPV)와 과립병바이러스(Granulovirus: GV)로 나누어지며, 본 발명에서의 베큘로바이러스는 상기 핵다각체병 바이러스를 의미한다.

본 명세서에 용어 "베큘로바이러스의 다각체 단백질"은 감염 말기에 곤충 세포의 핵으로부터 대량 합성되어지는 베큘로 바이러스 다각체의 구조단백질로서(Smith et al., 1993, J. Virol., 46, 584-593), 예를 들어, 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nucleopolyhedrovirus, AcNPV)의 다각체 단백질, 파밤나방(Spodoptera exigua) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Elisabeth et al., 1992, J. gen. Viral., 13, 2813-2821), 누에(Bombix mori) 핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질(Iatrou et al., 1985, J. Virol., 54, 436-445) 등을 들 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 상기 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질을 이용한다.

본 명세서에서의 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 프로모터 부위는 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다. 즉, ATG 모티프를 포함하는 추정의 개시코돈이 확인되어 있고, 이 개시코돈으로부터 상류 부위가 추정 프로모터 부위이다.

본 명세서에서 상기 "베큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터"는 상기 다각체 단백질의 전사 및 기능적 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미하며, 바람직하게는 핵다각체병 바이러스(AcNPV) 다각체 단백질의 구조 유전자 상류 약 100 bp 서열 부위, 보다 바람직하게는 상류(upstream) -1 bp 내지 -52 bp 부위를 포함한다.

본 발명에서 상기 "베큘로바이러스 다각체단백질의 일부"는 서열목록 제 23 서열의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이다. 상기 서열목록 제 23 서열의 펩티드는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(AcNPV)의 다각체 단백질의 19번째 아미노산 부터 110번째 아미노산 까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이다(도 1의 (a) 참조).

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 다각체단백질 일부의 변이체는 상기 서열목록 제 23 서열로 이루어지는 펩티드의 아미노산 치환 변이체 또는 절단 변이체(truncated mutant)이며, 보다 바람직하게는, 서열목록 제24서열, 서열목록 제25서열, 서열목록 제26서열, 서열목록 제27서열, 서열목록 제28서열, 서열목록 제29서열, 서열목록 제30서열, 및 서열목록 제31서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어는 펩티드이다.

본 명세서에서 용어 "베큘로바이러스 전이 벡터(baculovirus transfer vector)"는 다각체 단백질의 일부 또는 이의 변이체와 융합된 발현 목적 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 베큘로바이러스의 DNA 지놈으로 옮겨주는 역할을 수행하는 벡터를 의미하며, 일반적으로 베큘로바이러스의 발현 벡터와 동일한 의미로 사용된다.

본 발명의 전이 벡터에서 베큘로바이러스 다각체단백질의 일부 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 베큘로바이러스 다각체단백질 코딩 유전자의 프로모터에 작동적으로 연결(operatively linked)된다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된" 은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션(translation)을 조절하게 된다.

본 발명의 전이 벡터는 발현 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 클로닝될 수 있는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오타이드 서열, 즉 다중클로닝자리(multiple cloning site, MCS) 서열이 포함된다. 상기 제한효소로는 예를 들어, Eag I, EcoR I, EcoR Ⅱ, BamH Ⅰ, Bgl Ⅱ, BstB Ⅰ, Hind Ⅲ, Taq Ⅰ, Not Ⅰ, Hinf Ⅰ, Sau3A, Pac I, Pov Ⅱ, Sma I, Hae Ⅲ, Hga I, Alu I, EcoR V, EcoP15 I, Kpn I, Pst I, Sac I, Sal I, Sca I, Spe I, Sph I, Stu I, Xba I, Xho I 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터에서 상기 발현 목적 단백질은 상기 펩티드 또는 이의 변이체와의 융합 단백질 형태로 발현되도록 설계된다. 즉, 상기 (ⅲ) 발현 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 클로닝될 수 있는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오타이드 서열은, 상기 (ⅱ) 베큘로바이러스 다각체단백질의 일부 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하류(down stream)에 연결되어, 발현 목적 단백질은 발현되는 경우 다각체 단백질의 일부 또는 이의 변이체와의 융합단백질 형태로 발현되도록 위치한다.

본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터로부터 발현되는 베큘로바이러스 다각체 단백질 일부 또는 이의 변이체와 발현 목적 단백질의 융합단백질에서, 발현 목적 단백질을 다각체 단백질로부터 절단하여 분리하기 위한 단백질 분해 효소 인식 자리를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함될 수 있으며, 이러한 서열은 상기 (ⅱ) 서열과 상기 (ⅲ) 서열 사이에 위치할 수 있다. 상기 단백질 분해 효소 인식 자리는 예를 들어 엔테로키나아제(Enterokinase, EK)에 인식되는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 발현하고자하는 목적 단백질은 예를 들어, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절인자 , 혈액 응고 인자 또는 백신 단백질을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터는 전사 종결 서열로서, 폴리 아데닐화서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 핵다각체병 바이러스(AcNPV) 다각체 단백질로부터 유래한 폴리 아데닐화 서열을 포함한다.

본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터는 선별을 위한 선택표지를 포함할 수 있으며, 이러한 선택표지로서는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자가 포함할 수 있다. 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신(G418), 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 들 수 있다.

본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터는 벡터의 복제를 위한 복제개시점(origin of replication)을 포함하며, 예를 들어, colE1 또는 p15A와 같은 박테리아의 복제원점을 포함할 수 있으며, f1 origin과 같은 박테리오파이지의 복제 개시점을 포함할 수 있다.

본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터는 이로부터 발현되는 재조합 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 다른 서열과 추가적으로 융합될 수 있으며, 예컨대, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), FLAG, 6x His (hexahistidine), Nus A (N utilization substance A)및 Trx (thioredoxin)을 인코딩하는 서열 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명이 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 본 발명에서 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고, 본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 복제시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터를 이용하여 재조합 베큘로바이러스를 제조하는 경우의 숙주 세포는 바람직하게는 곤충 세포이며, 예를 들어 곤충세포주 스포돕프테라 푸르기페다 21(Spodoptera frugiperda, Sf 21)를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 상기 베큘로바이러스 전이 벡터를 이용하여 발현 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다: (a) 상기 베큘로바이러스 전이 벡터를 준비하는 단계; (b) 상기 베큘로바이러스 전이 벡터에 발현 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 제조한 재조합 베큘로바이러스 전이 벡터를 베큘로바이러스 DNA와 함께 숙주세포에 동시전이(cotransfection)시키는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 제조한 숙주세포로부터 재조합 베큘로바이러스를 선별 및 분리하는 단계; 및 (e) 상기 단계 (d)에서 선별 및 분리된 재조합 베큘로바이러스를 숙주세포에 감염시킨 후 목적단백질을 대량으로 생성시키는 단계.

하기에서 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 설명한다.

단계 (a): 상기 베큘로바이러스 전이 벡터를 준비하는 단계

상술한 본 발명의 베큘로바이러스 전이 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 제조될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 베큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 부위 및 베큘로바이러스 다각체 단백질의 일부 또는 이의 변이체를 코딩하는 DNA 단편을 제조한 후, 이를 통상의 플라스미드 벡터안으로 클로닝하여 제조할 수 있다.

단계 (b): 상기 베큘로바이러스 전이 벡터에 발현 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계

본 발명에서 발현하고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 다량으로 얻을 수 있으며, 예를 들어, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 통하여 얻을 수 있다. 얻어진 발현 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 제조한 전이 벡터에 존재하는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오타이드 서열안으로 클로닝한다. 상기 클로닝 방법은 당업계에서 공지된 제한효소 및 리가아제(ligase)를 사용한 DNA 분자 조작 방법을 통해 행할 수 있으며, 베큘로바이러스 전이벡터에 최종적으로 올바른 뉴클레오타이드 서열이 클로닝이 되었는지에 대해서는 염기서열 분석 방법을 통해 확인할 수 있다.

단계 (c) : 상기 단계 (b)에서 제조한 재조합 베큘로바이러스 전이 벡터를 베큘로바이러스 DNA와 함께 숙주세포에 동시전이(cotransfection)시키는 단계

재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위해, 상기 재조합 베큘로바이러스 전이 벡터를 베큘로바이러스 전체 지놈(genome) DNA와 함께 숙주세포내로 동시전이(cotransfection) 시킨다. 전이벡터의 발현 목적 외래 단백질을 코딩하는 염기서열 양 옆에 존재하는 원래의 베큘로바이러스 DNA 단편 부위와 전체 베큘로바이러스 지놈 DNA 내에서 상기 단편 부위에 대응하는 부위가 같은 염기서열로 이루어져 있기 때문에, 이들 간의 상동재조합(homologous recombination)이 일어나게 되어, 최종적으로 재조합 베큘로바이러스가 만들어진다. 본 발명에서 재조합 베큘로바이러스를 제조하기 위해 전이 벡터와 동시전이되는 바이러스는 야생형의 바이러스이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서 동시전이 방법은 당업계에서 공지된 진핵세포내로 유전자를 전달하는 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 리포좀을 이용한 리포펙션(lipofection, liposometransfection)을 사용한다. 상기 동시전이에 사용되는 숙주세포는 바람직하게는 곤충세포주를 사용하며, 예컨대, Sf21 (Spodoptera frugiperda 21; Invitrogen), Sf9 (Spodoptera frugiperda 9;Invitrogen), Tn5 (Trichoplusia ni 5; Invitrogen) 등을 사용할 수 있으며, Sf21 세포주가 가장 바람직하다.

단계 (d): 상기 단계 (c)에서 제조한 숙주세포로부터 재조합 베큘로바이러스를 선별 및 분리하는 단계

통상적으로 재조합 베큘로바이러스의 생성 비율은 매우 낮기 때문에, 발현 목적 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 갖는 재조합 베큘로바이러스만을 선별 및 분리하는 과정을 행한다. 선별하는 방법은 일단 다각체를 형성하는 야생형 바이러스에 비해 재조합 바이러스는 다각체 단백질이 변이되었기 때문에 다각체를 형성하지 않으므로, 다각체를 형성하지 않는 바이러스만을 선별한다. 예컨대, 배양액을 위상차현미경으로 관찰하여 세포 및 세포핵의 크기가 정상세포보다 커지고 핵내에 바이러스 봉입체가 보이지 않는(occlusion negative, occ-) 세포로부터 감염여부를 확인하고, 확인된 배양액을 원심분리한 후 상층액을 분리하여 재조합 베큘로 바이러스들을 얻는다. 한편, 다각체 생성 여부를 선별의 기준으로 삼지 않고, 선별효율을 증가시키기 위한 다양한 방법이 응용될 수 있으며, 예를 들어, 선별 표지 유전자를 전이벡터상에 삽입하여 이를 발현시키는 방법을 통해 재조합 바이러스를 선별하는 방법이 이용될 수 있다. 본 발명에서는 특히 제조된 재조합 베큘로바이러스의 선별을 용이하게 하기 위해, 대한민국공개특허 제2003-0006477호에 개시된 재조합 바이러스 bAcGOZA를 사용할 수 있다.

이어서, 분리한 재조합 베큘로 바이러스들을 용균반점법(Plaque assay)으로 순수 분리하고, 순수 분리된 바이러스들의 양을 증식하기 위하여, 예를 들면 T-25 플라스크(SPL 사 제품)에 재접종하여 많은 양의 바이러스들을 얻는다. 얻어진 바이러스들의 정량을 위하여 희석종말법(end-point dilution; King and Possee, 1992, The Baculovirus Expression System. A Laboratory Guide)에 의하여 정량한다.

단계 (e): 상기 단계 (d)에서 선별 및 분리된 재조합 베큘로바이러스를 숙주세포에 감염시킨 후 목적단백질을 대량으로 생성시키는 단계

순수 분리한 재조합 베큘로 바이러스는 일차적으로 발현 목적 단백질의 생성 여부와 발현 목적 단백질을 코딩하는 염기 서열이 바이러스 지놈 상에 존재하고 있는 지 등을 소규모의 배양을 통해 확인한 후, 재조합 바이러스의 대량 배양 및 증식을 통해 목적 단백질을 대량으로 발현시켜 생성시킨다. 목적단백질의 대량 생산은 상기 제조한 재조합 베큘로바이러스를 숙주세포에 감염시킨 후 감염된 숙주세포를 대량으로 배양함으로써 행한다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 곤충세포주를 사용하며, 예컨대, Sf21 (Spodoptera frugiperda 21; Invitrogen), Sf9 (Spodoptera frugiperda 9;Invitrogen), Tn5 (Trichoplusia ni 5; Invitrogen)이며, 가장 바람직하게는 Sf21 세포주이다. 재조합 단백질의 발현 및 정제는 당업계에서 공지된 곤충세포의 배양 및 단백질의 정제방법을 사용하여 행한다. 예를 들어, 본 발명에서 발현된 목적 단백질은 상기 정제를 위해 도입된 추가적인 서열을 이용하여 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 통하여 신속하고, 용이하게 정제할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 베큘로 바이러스 전이벡터의 구조를 모식적으로 보여주는 도면이다.
도 1b는 베큘로바이러스 다각체 단백질(polyhedrin) 코딩 유전자의 프로모터, 외래 발현 목적 단백질인 형광단백질(eGFP) 및 이 단백질의 앞쪽에 융합 발현시키는 베큘로바이러스 다각체 단백질의 일부 또는 이의 변이체의 다양한 구조를 보여주는 모식도이다.
도 1c는 다각체 단백질의 아미노산 서열 중 19번부터 110번까지를 전이벡터인 pBacPAK9에 삽입하여 만든 전이벡터 pB9-AcPol19-110-EK 의 벡터지도이다.
도 2는 베큘로바이러스 다각체 단백질의 일부 또는 이의 다양한 변이체와 융합된 형광단백질(eGFP)을 발현하는 본 발명의 재조합 베큘로 바이러스에 의해 Sf21 숙주세포에서 생산된 융합 단백질의 전기영동 결과이다.
도 3은 본 발명에서 베큘로바이러스 다각체 단백질의 일부 또는 이의 다양한 변이체와 융합되어 발현되는 형광단백질(eGFP)의 형광광도를 형광광도계를 이용하여 측정한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 다각체 단백질의 일부 또는 이의 다양한 변이체와 융합된 형광단백질(eGFP)을 발현하는 본 발명의 재조합 베큘로 바이러스로 감염된 Sf21 세포를 배양하여 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 재조합 베큘로 바이러스 전이벡터의 제작

1-1. 전이벡터 pAc-eGFP의 제조

북미산 해파리 아에쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 eGFP(초록색형광단백질)를 포함하는 플라스미드 pEGFP (Clontech사 제품)의 eGFP를 BamH I과 EcoR I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 BamH I과 EcoR I 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (a) 참조). 이 벡터에서 eGFP 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-2. 전이벡터 pAc-19-110-eGFP의 제조

야생주 베큘로 바이러스 AcNPV 지놈 DNA를 주형으로 하고, 하기 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 프라이머를 이용하여, 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 AcNPV 다각체 단백질의 아미노산 서열 19번부터 110번까지를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 1 서열: 5'-CCCGGGATAATGAAGTACTACAAAAATTTAGGTG-3' ; 서열목록 제 2 서열: 5'-GAGCTCCCATGGTAACAATGGGGAAGCTGTCTTC-3']. 상기 AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번 까지를 코딩하는 DNA 단편을 pMD18(TaKaRa사 제품)에 클로닝하고 Sma I과 Nco I으로 절단한 후, 이를 인서트로 하여 Sma I과 Nco I 절단하여 얻은 pAc-eGFP에 삽입하여 전이벡터 pAc-19-110-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (b) 참조). 이 벡터에서 다각체 단백질과 eGFP(초록색형광단백질)의 융합 단백질 코딩 DNA 단편은 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-3. 전이벡터 pAc-NGNN19-110-eGFP의 제조

상기 제조한 전이벡터 pAc-19-110-eGFP 로부터 하기 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번 까지의 서열 중 32번부터 35번까지를 점 돌연변이시켜 리신, 아르기닌, 리신, 리신 아미노산을 각각 아스파라긴, 글리신, 아스파라긴, 아스파라긴으로 치환된 변이형 다각체 단백질과 eGFP를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다.

[서열목록 제 3 서열: 5'-AGATCTATAATGAAGTACTACAAAAATTTAGG TGCCGTTATCAAGAACGCTAATGGCAATAATCACTTC-3'; 서열목록 제 4 서열: 5'-CTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3']. 상기 제조한, AcNPV 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번까지의 서열 중 32번 부터 35번 까지를 점 돌연변이시켜 아미노산 치환된 변이체 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고 Bgl II 와 Pst I 으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech 사 제품)의 Bgl II 와 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-NGNN19-110-eGFP 를 제작하였다(도 1b의 (c) 참조). 이 벡터에서 역시 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-4. 전이벡터 pAc-19-85-eGFP의 제조

전이벡터 pAc-19-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 1 서열 및 제 4 서열과, 하기 서열목록 제 5 서열 및 제 6 서열의 프라이머를 이용하여 SOE PCR을 실시하여 다각체단백질 아미노산 서열 19번부터 85번까지의 펩타이드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 5 서열: 5'-GCTCACCATGGTAAGCTTCATCGTGTCGG-3'; 서열목록 제 6 서열: 5'-ACGATGAAGCTTACCATGGTGAGCAAGGG-3']. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 85번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고, EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-19-85-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (d) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-5. 전이벡터 pAc-32-110-eGFP

전이벡터 pAc-19-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 4 서열과 하기 서열목록 제 7 서열의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 110번으로 이루어지는 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 7 서열: 5'-GAATTCATAATGAAGCGCAAGAAGCACTTCGC-3']. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 110번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고 EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-32-110-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (e) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-6. 전이벡터 pAc-32-85-eGFP

전이벡터 pAc-32-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 4 서열 및 제 7 서열과 하기 서열목록 제 8 서열 및 제 9 서열의 프라이머를 이용하여 SOE PCR을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 85번으로 이루어지는 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 8 서열: 5'-GCTCACCATGGTAAGCTTCATCGTGTCGG-3'; 서열목록 제 9 서열: 5'-ACGATGAAGCTTACCATGGTGAGCAAGGG-3' ]. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 85번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고 EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-32-85-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (f) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-7. 전이벡터 pAc-32-59-eGFP

전이벡터 pAc-32-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 4 서열 및 제 7 서열과 하기 서열목록 제 10 서열 및 제 11 서열의 프라이머를 이용하여 SOE PCR을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 59번으로 이루어지는 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 10 서열: 5'-GCTCACCATGGTAGGATCCTCAGCCACTAGG-3'; 서열목록 제 11 서열: 5'-GCTGCGGATCCTACCATGGTGAGCAAGGG-3' ]. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 59번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고, EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-32-85-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (g) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-8. 전이벡터 pAc-32-59/90-110-eGFP

전이벡터 pAc-32-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 4 서열 및 제 7 서열과 하기 서열목록 제 12 서열 및 제 13 서열의 프라이머를 이용하여 SOE PCR을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 59번과 90번부터 110번으로 이루어지는 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다[서열목록 제 12 서열: 5'-CTCTTTTCCTTTAGGATCCTCAGCCACTAGG-3'; 서열목록 제 13 서열: 5'-GCTGAGGATCCTAAAGGAAAAGAGTTCTACAGG-3' ]. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 59번과 90번부터 110번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고, EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-32-59/90-110-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (h) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-9. 전이벡터 pAc-KRKK77-110-eGFP

전이벡터 pAc-19-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 4 서열과 하기 서열목록 제 14 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 35번과 77번부터 110번으로 이루어지는 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다[서열목록 제 14 서열: 5'-GAATTCATAATGAAGCGCAAGAAGAATGTTAAACCCGA-3']. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 35번과 77번부터 110번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고 EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-KRKK77-110-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (i) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

1-10. 전이벡터 pAc-KRKK90-110-eGFP

전이벡터 pAc-19-110-eGFP로부터 상기 서열목록 제 4 서열과 하기 서열목록 제 15 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 35번과 90번부터 110번으로 이루어지는 펩티드와 eGFP가 융합된 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻었다[서열목록 제 15 서열: 5'-GAATTCATAATGAAGCGCAAGAAGAAAGGAAAAGAGTTC-3' ]. 상기 제조한, AcNPV의 다각체 단백질 아미노산 서열 32번부터 35번과 90번부터 110번의 펩티드와 eGFP가 융합된 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝하고 EcoR I과 Pst I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 EcoR I과 Pst I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pAc-KRKK90-110-eGFP를 제작하였다(도 1b의 (j) 참조). 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

실시예 2 : 재조합 바이러스의 제조

상기 실시예 1에서 제작한 각각의 전이벡터와 재조합 바이러스 bAcGOZA(공개특허 제2003-0006477호)의 지놈 DNA를 100 ㎕의 SF900 II 배지(Gibco사 제품)에 혼합하고, 셀펙틴 II (cellfectin II, Invitrogen 사 제품) 5 ㎕를 100㎕의 SF900 II 배지에 혼합한 후 각각을 15 분간 27℃에서 방치한 다음, 두 혼합액을 섞어주고 15분간 27℃에서 방치하였다. 이 혼합액을 곤충 세포주, Sf21 (Spodoptera frugiperda 21, Invitrogen 사 제품)에 25mm² 배양 플라스크당 2.0 X 10⁶개로 분주하여 배양액에 접종하고, 더 배양하여 재조합 베큘로 바이러스가 형성되도록 하였다. 배양액을 위상차현미경(x100)으로 관찰하여 세포 및 세포핵의 크기가 정상세포보다 커지고 핵내에 바이러스 봉입체가 보이지 않는(occlusion negative, occ-) 세포로부터 감염여부를 확인하고, 확인된 배양액을 1,000xg로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 분리하여 재조합 베큘로 바이러스들을 분리하였다. 이어서, 분리한 재조합 베큘로 바이러스들을 용균반점법 (Plaque assay)으로 순수분리하고 순수 분리된 바이러스들을 증식시켜 대량으로 제조하기 위해, T-25 플라스크 (SPL 사 제품)에 재접종하여 바이러스들을 얻었다. 얻어진 바이러스들은 희석종말법(King and Possee, 1992, The Baculovirus Expression System. A Laboratory Guide)에 의하여 정량하여 사용하였다.

실시예 3: 재조합 단백질의 단백질 전기영동 분석

상기 실시예 2에서 제조된 재조합 베큘로 바이러스들을 곤충세포주 Sf21 세포에 세포당 5개의 바이러스 입자가 되도록 60mm x 15mm 배양 플레이트당 1.0 x 10⁶개로 분주하여 1시간 동안 정치하여 Sf21 세포에 감염시켰다. 접종 후 4일이 경과된 때에 세포를 형광현미경(MCXI600 inverted microscopy, Micros사 제품, 100배 배율)으로 관찰하여, 감염된 세포내에서 형광을 나타내는 것으로 감염여부를 조사하였다. 이때 대조구로는 야생형 베큘로바이러스 AcNPV(Clontech사 제품, Cat. No. K1601-D)를 사용하였다. 이 재조합 바이러스들을 플레이트에서 수거하고 배양액을 1,000xg로 5분간 원심분리하였다. 침전물에 세포용해용액(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5％ 글리세롤, 0.1％ Triton 션롤,00)을 가하고 초음파 분해기(Ultrasonic processor, 30％ Amp., pulse 10 sec stop 5 sec; Sonics사 제품)로 처리한 후, 얼음에서 30분간 방치하였다. 반응액에 5X 시료 완충액[0.6 ml 1 M Tris-HCl(pH 6.8), 5 ㎖의 50％ 글리세롤, 2 ㎖의 10％ SDS, 0.5 ㎖의 2-mercaptoethanol, 1 ml 1％ bromophenol blue, 0.9 ㎖ H₂O)을 가하고 혼합한 후 ,00℃에서 10분 동안 중탕가열하고 얼음에서 잠시 정치시킨 다음 13000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액으로 12％ SDS숭분리GE을 행하였다. 전기영동 후, 젤을 코마시 염색시약(coomasie brillant blue)으로 염색하여 단백질 발현을 확인하 션롤,0??고 초음파 분그 결Tr총 9 가지의 다각체 단백질 부분 조합 중에서 다각체 단백질 아미노산 서열의 19번부터 , 0번까지의 아미노산 서열을 1％ Tan융합한 rAc-19-110-eGFP는 예상 크기인 37.89 kDa 위치에서 존재하였고, 그 외의 다각체 단백질 조합들도 예상 위치에 존재하였으나, rAc-19-85-eGFP와 rAc-32-85-eGFP는 다각체 단백질 부분과 융합된 예상위치와 eGFP의 위치인 26.95 kDa 위치에서도 존재하였다. 총 9 가지의 다각체 단백질 일부분 또는 이의 변이체를 형광단백질(eGFP)에 융합시켜 발현시킨 경우가, 다각체 단백질의 일부분 또는 이의 변이체를 융합시키지 않고 형광단백질(eGFP)만을 단독으로 발현시킨 경우 보다 발현양이 현저히 증가되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 4: 재조합 단백질의 정량 비교

상기 실시예 2에서 제조한 재조합 베큘로 바이러스들을 곤충세포주 Sf21에 세포당 5개의 바이러스 입자가 되도록 60mm X 15mm 배양 플레이트당 1.0 X 10⁶개로 분주하여 1 시간 동안 정치하여 Sf21 세포에 감염시켰다. 접종 후 4일이 경과된 때에 세포를 형광현미경(MCXI600 inverted microscopy, Micros사 제품, 100배 배율)으로 관찰하여, 감염된 세포내에서 형광을 나타내는 것을 확인하여 감염여부를 조사하였다. 이때 대조구로는 야생형 베큘로바이러스 AcNPV(Clontech사 제품, Cat. No. K1601-D)를 사용하였다. 감염이 확인된 재조합 바이러스들을 플레이트에서 수거하고 배양액을 1,000xg로 5분간 원심분리하였다. 침전물에 세포용해용액(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5％ 글리세롤, 0.1％ Triton X-100)을 160㎕ 가하고 초음파 분해기(Ultrasonic processor, 30% Amp., pulse 10 sec stop 5 sec, Sonics사 제품)로 처리 후 얼음에서 30 분간 방치하였다. 이 반응액에 인산완충 식염수 740 ㎕ 씩을 첨가하고 1M 소디엄카보네이트(Sodium Carbonate)을 100㎕ 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 파쇄한 세포용해액을 형광광도계(K2TM, ISS사 제품)로 분석하여 510 nm에서 형광단백질의 방출 파장이 검출되는지 확인하였다(도 3). 그 결과, rAc-32-85-eGFP와 rAc-32-59/90-110-eGFP의 형광 강도 수치가 각각 162098.5 ㅁ 6049.1와 158564.6 ㅁ 1957.0 광도(intensity)로 다른 다각체 단백질 부분 조합과 비교하여 가장 높은 수치를 나타내었으며, 비교 대상인 rAc-eGFP 보다도 약 5배 이상의 차이를 보였다. 제작된 다각체 단백질 부분 조합 부분을 모두 포함하는 부위인 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번까지를 융합한 재조합 단백질인 rAc-19-110-eGFP의 형광 강도 수치는 124621 ㅁ 2628.4 광도(intensity)를 나타내었다(표 1).

재조합 바이러스	측정값
Sf21 세포	4225.2 ± 765.0
AcNPV	5297.9 ± 238.4
rAc-eGFP	28847.1 ± 3184.1
rAc-19-110-eGFP	124621 ± 2628.4
rAc-NGNN19-110-eGFP	45020.6 ± 2723.3
rAc-19-85-eGFP	106175.6 ± 5467.0
rAc-32-110-eGFP	113241.0 ± 5102.1
rAc-32-85-eGFP	162098.5 ± 6049.1
rAc-32-59-eGFP	43367.8 ± 865.2
rAc-32-59/90-110-eGFP	158564.6 ± 1957.0
rAc-KRKK77-110-eGFP	87026.5 ± 6349.5
rAc-KRKK90-110-eGFP	118503.2 ± 6408.9

상기와 같은 결과는 단백질 전기영동 분석과 동일하게, 총 9 가지의 다각체 단백질 부분 조합들을 eGFP와 융합하였을 때의 발현양이, 다각체 단백질 부분의 조합과 융합되지 않은 eGFP보다 현저히 증가되는 것을 확인시켜주는 결과이다.

실시예 5 : 재조합 베큘로바이러스의 공초점 전자 현미경 관찰

상기 실시예 2에서 제조된 재조합 베큘로 바이러스인 rAc-19-110-eGFP를 곤충세포주 Sf21 세포에 세포당 5개의 바이러스 입자가 되도록 60mm x 15mm 배양 플레이트당 1.0 x 10⁶개로 분주하여 1시간 동안 정치하여 Sf21 세포에 감염시켰다. 접종 후 3일이 경과된 때에 세포의 일부를 수거하여 슬라이드 글라스에 메탄올로 세포를 고정시키고, 프로피디움 아이오다이드(PI)로 핵을 염색시킨 후 마운팅시켜서 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다(도 4). 그 결과 rAc-19-110-eGFP, rAc-32-110-eGFP와 rAc-KRKK77-110-eGFP를 이용하여 생산된 재조합 단백질은 핵에 존재하는 것으로 확인 됐으며, 그 나머지인 rAc-eGFP, rAc-NGNN19-110-eGFP, rAc-19-85-eGFP, rAc-32-85-eGFP, rAc-32-59-eGFP, rAc-32-59/90-110-eGFP와 rAc-KRKK90-110-eGFP를 이용하여 생산된 재조합 단백질은 세포질에 존재하는 것으로 확인되었다.

실시예 6: 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번을 포함하는 전이벡터 pB9-AcPol19-110-EK의 제조

전이벡터 pAc-19-110-eGFP로부터 하기 서열목록 제 16 서열 및 제 17 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 16 서열: 5'- ACTAGTATAATGAAGTACTACAAAAAT -3'; 서열목록 제 17 서열: 5'- GAATTCCTTGTCGTCGTCATCGGTAACAATGGG -3' ]. 이 유전자를 T&A vector(RBC사 제품)에 클로닝을 하고 Bgl II과 EcoR I으로 절단하고 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 BamH I 과 EcoR I의 절단부위에 삽입하여 전이벡터 pB9-AcPol19-110-EK를 제작하였다. 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

실시예 7: 다각체 단백질 아미노산 서열 19번부터 110번내 펩티드를 이용한 전이벡터들의 제조

전이벡터 pAc-NGNN19-110-eGFP 로부터 상기 서열목록 제 16 서열 및 제 17 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다.

전이벡터 pAc-19-85-eGFP 로부터 상기 서열목록 제 16 서열 및 하기 서열목록 제 18 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 18 서열: 5'- GAATTCCTTGTCGTCGTCATCAAGCTTCATCGTGTCGG -3' ].

전이벡터 pAc-32-110-eGFP 로부터 하기 서열목록 제 19 서열 및 상기 서열목록 제 17 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 19 서열: 5'- AGATCTACTAGTATAATGAAGCGCAAGAAGCACTTC -3' ].

전이벡터 pAc-32-85-eGFP 로부터 상기 서열목록 제 19 서열 및 제 18 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다.

전이벡터 pAc-32-59-eGFp 로부터 상기 서열목록 제 19 서열과 하기 서열목록 제 20 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 20 서열: 5'- GAATTCCTTGTCGTCGTCATCAGGATCCTCAGCCACTAGG -3' ].

전이벡터 pAc-32-59/90-110-eGFP 로부터 상기 서열목록 제 19 서열 및 제 17 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다.

전이벡터 pAc-KRKK77-110-eGFP 로부터 하기 서열목록 제 21 서열 및 제 17 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다 [서열목록 제 21 서열: 5'- AGATCTACTAGTATAATGAAGCGCAAGAAGAATGTTAAACCCGA -3' ].

전이벡터 pAc-KRKK90-110-eGFP 로부터 하기 서열목록 제 22 서열 및 제 17 서열의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 다각체 단백질 부분 서열과 엔테로키나아제(Enterokinase, EK) 부위를 코딩하는 DNA 단편을 얻었다[서열목록 제 22 서열: 5'- AGATCTACTAGTATAATGAAGCGCAAGAAGAAAGGAAAAGAGTTC -3' ]. PCR을 통해 얻어진 각 DNA 단편은 T&A vector(RBC사 제품)에 각각 클로닝을 하고 Bgl II과 EcoR I으로 절단하여 pBacPAK9(Clontech사 제품)의 BamH I 과 EcoR I의 절단부위에 각각 삽입하여 전이벡터들을 제작하였다. 이 벡터에서 융합 유전자는 폴리헤드린 프로모터(PPH) 하류에 위치한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Method for Enhancing the Expression of Foreign Recombinant Protein Using Fusion Expression with Partial Polyhedrin of Baculovirus <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 cccgggataa tgaagtacta caaaaattta ggtg 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 gagctcccat ggtaacaatg gggaagctgt cttc 34 <210> 3 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 agatctataa tgaagtacta caaaaattta ggtgccgtta tcaagaacgc taatggcaat 60 aatcacttc 69 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 ctgcagttac ttgtacagct cgtccat 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gctcaccatg gtaagcttca tcgtgtcgg 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 acgatgaagc ttaccatggt gagcaaggg 29 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gaattcataa tgaagcgcaa gaagcacttc gc 32 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 gctcaccatg gtaagcttca tcgtgtcgg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 acgatgaagc ttaccatggt gagcaaggg 29 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 gctcaccatg gtaggatcct cagccactag g 31 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gctgcggatc ctaccatggt gagcaaggg 29 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 ctcttttcct ttaggatcct cagccactag g 31 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 gctgaggatc ctaaaggaaa agagttctac agg 33 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 gaattcataa tgaagcgcaa gaagaatgtt aaacccga 38 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 gaattcataa tgaagcgcaa gaagaaagga aaagagttc 39 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 actagtataa tgaagtacta caaaaat 27 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 gaattccttg tcgtcgtcat cggtaacaat ggg 33 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 gaattccttg tcgtcgtcat caagcttcat cgtgtcgg 38 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 agatctacta gtataatgaa gcgcaagaag cacttc 36 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 gaattccttg tcgtcgtcat caggatcctc agccactagg 40 <210> 21 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 agatctacta gtataatgaa gcgcaagaag aatgttaaac ccga 44 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 agatctacta gtataatgaa gcgcaagaag aaaggaaaag agttc 45 <210> 23 <211> 92 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 23 Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Ala Val Ile Lys Asn Ala Lys Arg Lys 1 5 10 15 Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu Asp Pro Leu 20 25 30 Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly Lys Asn 35 40 45 Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Met Lys Leu Val Val Gly Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg Glu Thr 65 70 75 80 Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val 85 90 <210> 24 <211> 92 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 24 Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Ala Val Ile Lys Asn Ala Asn Gly Asn 1 5 10 15 Asn His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu Asp Pro Leu 20 25 30 Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly Lys Asn 35 40 45 Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Met Lys Leu Val Val Gly Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg Glu Thr 65 70 75 80 Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val 85 90 <210> 25 <211> 67 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 25 Lys Tyr Tyr Lys Asn Leu Gly Ala Val Ile Lys Asn Ala Lys Arg Lys 1 5 10 15 Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu Asp Pro Leu 20 25 30 Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro Gly Lys Asn 35 40 45 Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Met Lys Leu 65 <210> 26 <211> 79 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 26 Lys Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu 1 5 10 15 Asp Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro 20 25 30 Gly Lys Asn Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys 35 40 45 Pro Asp Thr Met Lys Leu Val Val Gly Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr 50 55 60 Arg Glu Thr Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val 65 70 75 <210> 27 <211> 54 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 27 Lys Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu 1 5 10 15 Asp Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Phe Leu Gly Pro 20 25 30 Gly Lys Asn Gln Lys Leu Thr Leu Phe Lys Glu Ile Arg Asn Val Lys 35 40 45 Pro Asp Thr Met Lys Leu 50 <210> 28 <211> 28 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 28 Lys Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu 1 5 10 15 Asp Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro 20 25 <210> 29 <211> 49 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 29 Lys Arg Lys Lys His Phe Ala Glu His Glu Ile Glu Glu Ala Thr Leu 1 5 10 15 Asp Pro Leu Asp Asn Tyr Leu Val Ala Glu Asp Pro Lys Gly Lys Glu 20 25 30 Phe Tyr Arg Glu Thr Trp Thr Arg Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile 35 40 45 Val <210> 30 <211> 38 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 30 Lys Arg Lys Lys Asn Val Lys Pro Asp Thr Met Lys Leu Val Val Gly 1 5 10 15 Trp Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg Glu Thr Trp Thr Arg Phe Met Glu 20 25 30 Asp Ser Phe Pro Ile Val 35 <210> 31 <211> 25 <212> PRT <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 31 Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Glu Phe Tyr Arg Glu Thr Trp Thr Arg 1 5 10 15 Phe Met Glu Asp Ser Phe Pro Ile Val 20 25

Claims

다음의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 목적 단백질을 발현시키기 위한 용도의 베큘로바이러스 전이 벡터:
(a) 베큘로바이러스 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터;
(b) 상기 프로모터와 작동적으로 연결된 베큘로바이러스 다각체 단백질의 일부 또는 이의 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
(c) 발현 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 클로닝될 수 있는 하나 이상의 제한효소 인식 뉴클레오타이드 서열:
단, 상기 베큘로바이러스 다각체 단백질의 일부는 서열목록 제 23 서열의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이고, 상기 변이체는 상기 펩티드의 아미노산 치환 변이체 또는 절단 변이체로서 서열목록 제 24 서열, 서열목록 제 25 서열, 서열목록 제 26 서열, 서열목록 제 27 서열, 서열목록 제 28 서열, 서열목록 제 29 서열, 서열목록 제 30 서열 및 제 31 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 변이체이고, 상기 발현 목적 단백질은 상기 펩티드 또는 이의 변이체와의 융합 단백질 형태로 발현된다.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체와 발현 목적 단백질과의 사이에 융합 단백질 절단 자리를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스 전이 벡터.
제 3 항에 있어서, 상기 융합 단백질 절단 자리는 엔테로키나아제(Enterokinase) 절단 자리인 것을 특징으로 하는 베큘로바이러스 전이 벡터.
상기 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항의 베큘로바이러스 전이벡터를 포함하는 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 인간 개체에 포함되어 있는 인 비보(in vivo) 세포를 제외한 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
다음의 단계를 포함하는 발현 목적 단백질의 대량 생산 방법:
(a) 상기 제 1 항, 제 3 항 및 제 4 항 중 어느 한 항의 베큘로바이러스 전이 벡터를 준비하는 단계;
(b) 상기 베큘로바이러스 전이 벡터에 발현 목적 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 제조한 재조합 전이 벡터를 베큘로바이러스 DNA와 함께 숙주세포에 동시전이(cotransfection)시키는 단계로서, 상기 숙주세포는 인간 개체에 포함되어 있는 인 비보(in vivo) 세포를 제외한 세포인 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 제조한 숙주세포로부터 재조합 베큘로바이러스를 선별 및 분리하는 단계; 및
(e) 상기 단계 (d)에서 선별 및 분리된 재조합 베큘로바이러스를 숙주세포에 감염시킨 후 목적 단백질을 대량으로 생성시키는 단계로서, 상기 숙주세포는 인간 개체에 포함되어 있는 인 비보(in vivo) 세포를 제외한 세포인 단계.