KR100320165B1 - 누에핵다각체병바이러스-케이원과그의다각체단백질유전자를포함하는전이벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한국에서 분리된 새로운 누에 핵다각체병 바이러스 (Bombyx moriNuclear Polyhedrosis Virus) 변이주인 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 (Bombyx moriNuclear Polyhedrosis Virus-K1)과 그로부터 유래한 다각체 단백질 유전자의 프로모터를 포함하는 전이벡터에 관한 것이다.

Description

누에 핵다각체병 바이러스-케이원과 그의 다각체 단백질 유전자를 포함하는 전이벡터{BOMBYX MORI NUCLEAR POLYHEDROSIS VIRUS-K1 AND TRANSFECTION VECTOR COMPRISING THE POLYHEDRIN GENE THEREOF}
본 발명은 한국에서 분리된 새로운 변이주인 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 (BmNPV-K1)과 그의 다각체 단백질 유전자 프로모터를 포함하는 전이벡터에 관한 것이다.
베큘로비리대 (Baculoviridae)에 속하는 핵다각체병 바이러스 (Nuclear Polyhedrosis Virus: NPV)는 곤충의 섭식에 의해 장내로 침입하여 충체의 거의 모든 조직에서 증식하며, 유전공학적 측면에서 연구가 활발히 이루어지고 있는 곤충바이러스이다. 핵다각체병 바이러스는 바이러스 입자내의 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 수에 따라 하나의 입자내에 한 개의 뉴클레오캡시드가 존재하는 단일 뉴클레오캡시드 핵다각체병 바이러스 (Single nucleocapsid NPV : SNPV)와 하나의 바이러스 입자내에 여러개의 뉴클레오캡시드가 존재하는 다중 뉴클레오캡시드 핵다각체병 바이러스 (Multiple nucleocapsid NPV : MNPV)로 나누어진다 (Harrap,Virology, 50 : 114∼123 (1972); O'Reillyet al,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992); Rohrmann,J. Gen. Virol., 73 : 749∼761 (1992)). 다중 뉴클레오캡시드 핵다각체병 바이러스로 대표적인 것이 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스 (Autographa californicaNPV)이며, 단일 뉴클레오캡시드 핵다각체병 바이러스로 대표적인 것은 누에 핵다각체병 바이러스 (Bombyx moriNPV)가 있다.
핵다각체병 바이러스의 DNA 복제는 바이러스 유전자의 발현과 DNA복제가 순차적 반응으로 일어나는 케스케이드 (cascade) 모델에 의해 수행되는데 (Kelly, The structure and physical characterisitics of baculoviruses, InViral Insecticides for Biological Control. pp. 469∼488, Edited by K. E. Shermann & K. Maramorosch, Academic Press, New York & Luondon. (1985); Maeda, Expression of foreign gene in insect cells using baculovirus vectors, InInsect cell biotechnology,Edited by maramorosch, K. & NcIntosh A. Boca Raton: CRC Press : 1∼31 (1994); Pearsonet al,Science, 257 : 1382∼1384. (1992)), 핵다각체병 바이러스의 유전자는 그 발현시기에 따라 극초기 유전자 (immediate early gene),초기 유전자 (early gene), 후기 유전자 (late gene) 및 초후기 유전자 (very late gene)로 구분된다. 현재 핵다각체병 바이러스의 유전자에 대한 연구는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스를 중심으로 이루어지고 있으며, 이 바이러스의 경우 유전자 구조가 완전히 밝혀졌다 (Ayreset al,Virology, 202 : 586∼605. (1994)). 극초기 유전자는 발현되는데 있어서 바이러스에 의한 다른 생성물이 불필요한 유전자로서 숙주세포를 이용하여 발현되는 유전자이며, 초기 유전자는 비교적 감염초기에 발현되나 바이러스에 의한 생성물이 있어야 발현되는 유전자이다. 그리고 후기 유전자는 DNA복제 후 풍부하게 mRNA가 합성되는 유전자이며, 초후기 유전자는 DNA복제 후부터 감염과정 전기간에 걸쳐 계속해서 매우 높은 수준으로 mRNA와 단백질을 축적하는 유전자이다 (Maeda, Expression of foreign gene in insect cells using baculovirus vectors. InInsect cell biotechnology. Edited by maramorosch, K. & NcIntosh A. Boca Raton: CRC Press : 1∼31 (1994)). 다각체 단백질(polyhedrin) 유전자는 이러한 초후기 유전자의 대표적인 유전자이다.
이와 같은 핵다각체병 바이러스는 곤충 이외의 척추동물에는 전혀 병원성이 없어 안전한 바이러스로 알려져 있으며 (Kelly,The structure and physical characteristics of baculoviruses, Sherman & Maramorosch eds, Academic Press, 469-488, (1985)), 특이한 봉입체인 다각체 형태로서 존재하여 바이러스 입자가 이 다각체안에 매립되어 바이러스의 활성이 장기간 유지될 수 있는 장점이 있다. 핵다각체병 바이러스의 다각체를 구성하는 다각체 단백질의 유전자는 바이러스 복제나 병원성에는 무관하고, 또한 이 단백질은 강력한 프로모터 (promoter)의 활성에 의해서 단시간에 다량 합성된다는 사실이 밝혀짐으로써, 그 프로모터를 이용하여 유용한 물질을 생산할 수 있는 발현벡터계가 개발되어 그에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다 (Maeda,Insect cell biotechnology, Maramorosch & Mclntosh eds, CRC Press, 1-31 (1994); Smithet al,J. Virol.,46 : 584∼593. (1983)).
베큘러바이러스 발현벡터계 (Baculovirus Expression Vector System)가 처음으로 개발된 것은 스미스 등 (Smithet al,Mol. Cell. Biol.,3 : 2156∼2165 (1983))에 의하여 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스와 스포도프테라 프루지퍼다 (Spodoptera frugiperda;Sf) 배양세포계를 조합한 것이며, 그 후 마에다 등 (Maedaet al,Nature,315 : 592∼594(1985))이 누에 핵다각체병 바이러스와 누에 종령유충 생체를 이용한 벡터계를 개발하여, 현재 이 두 가지 형태의 벡터계를 중심으로 연구가 진행되어 진핵 및 원핵생물로부터 유래한 다양한 유전자가 곤충 세포계 및 유충에서 발현되고 있다 (O'Reillyet al,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)).
베큘러바이러스 발현벡터계에 의한 단백질의 발현특성은 세포내에서 생산된 목적단백질이 본래 국재하고있는 세포소기관까지 이행됨으로써, 이후 단백질의 수정이나 안정성을 높여 준다는 것이다 (Javis and Summers,Mol. Cell. Biol.,9 : 214∼223(1989)). 또한, 합성된 단백질가운데 세포밖에서 효소로서의 기능을 갖거나, 개체의 구조에 관련하는 단백질들, 또는 세포나 기관에 정보를 보내는 분비단백질들은 합성과 동시에 소포체를 통과하면서 분비신호가 절단되어야 하는데 (Wanget al,Gene,100 : 131∼137. (1991)), 이러한 분비단백질에 대해 베큘러바이러스발현벡터계에 의한 발현은 분비신호가 정확하게 인식, 절단되면서 목적산물이 배지안으로 분비되어짐이 확인되었으며 (Lebacq-Verheydenet al,Mol. Cell. Biol.,8 : 3129∼3135 (1988); Luckow and Summers,Bio/Technology,6 : 47∼55 (1988); Tessieret al,Gene,98 : 177∼183 (1991)), 또한 누에에서도 이와 같은 과정이 정확하게 수행되어 체액안으로 단백질이 분비되어 체액내 단백질분해효소 억제제 (protease inhibitor)의 작용에 의해 분해되지않고 안정적으로 축적된다고 보고되었다 (Knepperet al,Biochemistry,31 : 11651∼11656 (1992)). 분비단백질이나 세포막에 주재하는 단백질들은 당사슬의 부가 (glycosilation)가 그 활성에 중요한 역할을 담당하는 경우가 있는데, 이러한 당사슬의 부가에 대해서 베큘러바이러스 발현벡터계는 곤충세포를 숙주로 이용함으로써 사람의 유전자산물과 유사한 당사슬이 부가되고있음이 밝혀졌으나, 이러한 당사슬의 부가가 척추동물세포에 의한 것에 비해서는 당사슬이 짧은 것으로 알려져있다 (Hsieh and Robbins,J. Biol. Chem.,259 : 2375∼2382 (1984); Murphyet al,Genet. Anal.,7 : 160∼171 (1990); Shimokawa and Smith,Biochem, Biophys. Res, Commun.,183 : 975∼979 (1992)). 그러나 당사슬의 부가가 일어나지 않는 대장균이나 당사슬의 부가가 일어나더라도 매우 긴 사슬이 결합되는 효모, 그리고 척추동물에는 없는 당이 부가되거나 하는 식물세포 등을 이용하는 경우에 비해서는 장점으로 인정되고 있다. 아미드화 (amidation)가 필요한 펩타이드 (peptide)의 경우, 아미드화는 생물활성이나 펩타이드의 안정성에 깊이 관련되나 배양세포계에서는 척추동물세포이든 곤충세포이든 이러한 아미드화가 제대로 일어나지 않는 것으로 보고되었다 (Shimoiet al,J.Biochem.,209 : 189∼193 (1992); Suzukiet al,Embo J.,9 : 4259∼4265 (1990); Yamadaet al,Biochem. J.,272 : 633∼636 (1990)). 그러나 곤충유충을 이용한 베큘러바이러스 발현벡터계의 경우 이러한 아미드화가 완벽하게 일어나는 것으로 보고되고있다 (Maeda,Ann. Rev. Entomol.,34 : 351∼372 (1989)). 더욱이 베큘러바이러스 발현벡터계는 단백질의 고차구조 (folding) 형성이나 항원성에 있어서도 우수한 것으로 알려져있다 (Hasemann and Capra,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,87 : 3942∼3946 (1990); Higashihashiet al,J. Virol. Methods,35 : 159∼163 (1991); Stow,J. Gen. Virol.,73 : 313∼317 (1992)).
핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질은 감염말기에 세포내 단백질의 약 30 % 정도까지 다량 합성되는 것으로 알려져 있으며 (Smithet al,J. Virol.,46 : 584∼593 (1983); Vlak and Rohrmann, The nature of polyhedrin. InViral Insecticides for Biological Control. Edited by K. E. Shermann & K. Maramorosch. Academic Press, pp.489∼542 (1985)), 그 유전자에 대한 연구는 블락과 스미스(Vlak and Smith,J. Virol.41 : 1118∼1121 (1982))가 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스 다각체 단백질 유전자가EcoRⅠ- I 단편에 존재함을 밝힌 후 후프트 반 이데킨지 등 (Hooft van Iddekingeet al,Virology ,131 : 5561∼5565 (1983))에 의하여 그 염기서열이 결정되었다. 누에 핵다각체병 바이러스의 경우에는 마에다 등 (Maedaet al,Nature,315 : 592∼594 (1985))과 이아트로우 등 (Iatrouet al,J. Virol.,54 : 436∼445 (1985))에 의해 그 위치와 염기서열이 분석되었으며, 그 외 스포도프테라 프루지퍼다 핵다각체병 바이러스(Spodoptera frugiperdaNPV), 오리지아 슈도츄가타 핵다각체병 바이러스 (Orygia pseudotsugataNPV), 안테레아 프레니 핵다각체병 바이러스 (Antheraea prenyiNPV), 파밤나방 핵다각체병 바이러스 (Spodoptera exiguaNPV), 흰불나방 핵다각체병 바이러스 (Hyphantria cuneaNPV) 등에 대해 다각체 단백질 유전자의 위치와 구조가 결정되었다 (Choeet al,Biotech. letters.,8(12) : 853∼858 (1986); Chun-faet al,Canye Kexue, 18 : 77∼87 (1992); Gonzalezet al,Virology,170 : 160∼175 (1989); Leisyet al,J. Gen. Virol.,67 : 1073∼1079 (1986)). 이들 다각체 단백질 유전자간에는 그 구조에 있어서 유사성이 상당히 높은 것으로 보고되고있다. 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스와 누에 핵다각체병 바이러스 다각체 단백질 유전자간에는 염기배열상 86 %의 상동성이 인정되며, 특히 이 두 유전자의 -1 부터 -71 까지의 프로모터 영역은 동일한 구조로 이루어져있어 이 부위가 다각체 단백질의 발현에 매우 중요한 부위로 여겨지고있다.
핵다각체병 바이러스의 다각체 단백질 유전자의 프로모터에 관한 연구는 다각체 단백질 유전자의 발현에 중요하다고 생각되는 5' 말단의 프로모터 영역이 오토그라파 카리포니카 핵다각체병 바이러스와 누에 핵다각체병 바이러스간에는 상당한 차이가 있으나, 프로모터와 번역개시의 메타이오닌 (methionine, ATG) 사이에 존재하는 71 염기는 완전히 보존되고 있으며, 이 보존염기서열은 다각체 단백질 유전자가 강력하게 발현되는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되고있다 (Adang and Miller,J. Virol., 44 : 782∼793 (1982); Blissard and Rohrmann,Annu. Rev. Entomol., 35 : 127∼155 (1990); Frisen and Miller,Curr. Top.Microbiol. Immunol., 131 : 31∼49 (1986)). 또한, 현재까지의 베큘로바이러스 발현벡터계의 외래유전자 발현효율에 관해서는 다각체 단백질 합성개시점의 첫 코돈 (codon)인 "ATG"의 "A"를 포함한 5' 및 3' 말단부위가 완전히 보존될 때 벡터로서 가장 이상적이라고 결론을 내리고있다 (Luckow and Summers,Virology, 170 : 31∼39 (1989); Luckow and Summers,Bio/Technology, 6 : 47∼55 (1988); Matsuuraet al, J. Gen. Virol., 68 : 1233∼1250 (1987); Miller,Opinion Genet. Dev., 3 : 97∼101 (1993)). 현재까지 누에 핵다각체병 바이러스를 이용하여 제작된 전이벡터는 주로 마에다에 의한 융합형벡터 (fusion vector)로서 생산된 물질의 정제시에는 난점이 있으나, 전사개시점이 포함되지 않은 유전자의 발현에 이용하거나 어떤 유전자의 경우에는 융합형으로 발현되었을 때 그 발현효율이 높아지는 장점을 가지고 있다고 보고되고있다 (Maeda,Ann. Rev. Entomol., 34 : 351∼372 (1989)). 또한, 마에다 (Maeda,Insect cell biotechnology. Edited by Maramorosch, K. & Mclntosh A. Boca Raton: CRC Press; 1∼31 (1994))에 의해 현재까지 개발된 비융합형벡터 (non-fusion vector)의 경우도 동일한 프로모터를 가지는 오토그라파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스 발현벡터에서 보고된 것처럼, 외래유전자 발현에 가장 효율적이라는 완전한 프로모터 부위의 보존은 이루어지지 않고있다.
이와같이 유용물질의 생산이나 살충제로서 이용가능한 베큘러바이러스 발현벡터계는 금후, 질병진단 시약의 개발이나 살충효과가 높은 바이러스제제의 개발 등에서 그 가치를 충분히 발휘할 것으로 기대된다. 특히, 누에 핵다각체병 바이러스를 이용한 베큘러바이러스 발현벡터계의 경우 누에유충 생체를 직접 이용하여 유용물질을 생산함으로써, 세포주를 이용하는 것에 비해 외래유전자의 발현효율은 물론, 그 활성도가 보다 안정하다는 점에서 이에 대한 관심을 높여주고있다 (Maeda,Biochem. Biophys. Res. Commun.,165 : 1177∼1183 (1989)). 또한 누에 핵다각체병 바이러스를 이용한 발현벡터계는 대량 인공사육 체계가 확립된 누에유충을 이용함으로써 발현효율을 크게 높일 수 있는 장점을 지니고 있음에도 불구하고 아직 그 연구는 미진한 상태이다.
누에의 유충시기는 다른 곤충과 같이 번데기시기에 필요로 하는 모든 것들을 준비하는 시기로 먹이를 효율적으로 소화하여 필요한 영양소를 거둬들이고 있으며, 몸 전체로 볼 때는 단백질합성 능력이 대단히 높은 시기이다 (Maeda,Ann. Rev. Entomol.,34 : 351∼372(1989)). 특히, 종령누에는 저장단백질을 비롯한 2∼3 종의 특이한 단백질을 다량합성한다. 이러한 유충의 체액은 무균상태이며, 단백질분해효소 저해제를 상당히 함유하고 있어 단백질분해가 잘 일어나지 않음으로, 베큘러바이러스 벡터에 의해 발현된 물질이 안정적으로 존재할 수 있다. 누에는 또한 오랫동안 사람들에 의해 사육되고 길들여져 야외환경에서는 생존능력을 가지지 못하게 됨으로써, 재조합유전자 실험의 숙주로는 매우 적합한 곤충이다 (Maeda,Ann. Rev. Entomol.,34 : 351∼372 (1989)). 특히 누에 핵다각체병 바이러스는 체강안의 중장을 제외한 대부분의 조직에서 증식이 가능하기 때문에 충체내의 거의 모든 세포에서 외래유전자의 발현이 가능하여, 배양세포주에 비해 재조합단백질의 생산성이 훨씬 높게 나타난다. 또한 누에체액내에 분비된 목적단백질은 일반적으로 쓰여지고있는 생화학적 정제법에 의해 비교적 간단하게 회수가 가능하며, 따라서 혈청 (FBS)을 함유하고있는 세포배양액으로 부터의 단백질정제보다 훨씬 수월한 것으로 알려져있다 (Higashihashi et al,J. Virol. Methods,35 : 159∼163 (1991)).
따라서, 본 발명의 목적은 한국에서 분리된 새로운 변이주인 누에 핵다각체병 바이러스-케이원, 및 그의 다각체 단백질 유전자를 포함하고 유용한 외래유전자를 발현시킬 수 있는 전이벡터를 제공하는 데 있다.
도 1a는 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 게놈 DNA의 제한효소 처리 양상이며, 도 1b는 도 1a의 결과를 기존에 보고된 누에 핵다각체병 바이러스의 제한효소 처리 양상과 비교한 것이다.
도 2는 감염 말기에 세포로부터 방출된 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 비율을 조사한 결과이다.
도 3은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 p10 유전자의 뉴클레오티드 염기 서열과 그 유전자의 바로 상부 및 하부에 있는 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 p10 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 다각체 단백질 유전자를 포함한 DNA 단편의 유전자 지도이다.
도 6은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 다각체 단백질 유전자의 뉴클레오티드 염기 서열과 그 유전자의 바로 상부 및 하부에 있는 서열을 나타낸 것이다.
도 7은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 다각체 단백질 유전자의 프로모터 부위를 이용한 전이벡터 pBmKSK3의 제작과정이다.
도 8은 재조합 형질 발현벡터 pBmKSK3-lacZ 를 제작하기 위해 목적한 표지 유전자인 대장균 (E. coli) LacZ 유전자를 전이벡터 pBmKSK3내로 클로닝 시키는 방법에 관한 개요도이다.
도 9는 재조합 형질 발현벡터 pBmKSK3-lacZ를 배양된 BmN-4 세포에서 누에 핵다각체병 바이러스-케이원과 동시전이 (cotransfection) 시키고, 정제된 재조합 바이러스 BmK1-LacZ로 연속감염시키는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 10은 재조합 바이러스 BmK1-LacZ에 의해 감염된 BmN-4 세포와 누에 유충에서 발현된 베타갈락토시다제 (β-galactosidase)의 활성을 비교한 결과이다.
본 발명에서는 한국의 양잠농가에서 분리한 누에 핵다각체병 바이러스 중에서 새로운 구조를 가지는 것으로 판명된 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 및 이의 다각체 단백질 유전자를 이용하여 제작된 전이벡터가 제공된다.
누에 핵다각체병 바이러스-케이원은 그의 게놈 DNA (genomic DNA)를 제한 효소, 예를 들어,BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,KpnⅠ 및PstⅠ등으로 처리한 후 0.7 % 아가로스 겔에 전기영동할 때 마에다와 마지마 (Maeda and Majima,J. Gen. Virol., 71 : 1851∼1855. (1990))가 보고한 기존의 누에 핵다각체병 바이러스 게놈 DNA와는 다른 분리 양상을 나타낸다.
또한, 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 다각체 단백질의 구조 유전자는 마에다 등 (Maedaet al,Nature,315 : 592∼594 (1985))이 보고한 기존의 누에핵다각체병 바이러스 다각체 단백질 유전자와 비교한 결과 99.6%의 상동성을 나타내고, 염기서열에 따라 추정된 아미노산 분석결과는 마에다 등의 보고와 비교할 때 5 세린 (serine)이 프롤린(proline)으로 155 메티오닌 (methionine)이 발린 (valine)으로 변경된 결과를 보여 99.2%의 상동성을 나타낸다.
한편, 핵다각체병 바이러스의 또다른 초후기 유전자로서 다각체 단백질과 같이 감염말기에 세포에서 대량으로 합성되며 바이러스의 복제와 증식에는 영향을 미치지 않는 p10 유전자가 있다. P10 단백질은 감염세포에서의 섬유상 구조 (fibrillar structure) 형성과 다각체의 모양형성 (polyhedra morphogenesis), 감염세포로부터의 다각체의 방출 등에 관여하는 것으로 알려져 있다 (van Oers, Flipsen, Reusken, Sliwinsky, Goldbach and Vlak,J. Gen. Virol., 74 : 563∼574. (1993)). 이러한 p10 유전자에 대해 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 단백질의 구조 유전자 부위를 휴 등 (Huet al,J. Gen. Virol., 75 : 2085∼2088. (1994))이 보고한 기존의 누에 핵다각체병 바이러스 p10 단백질 유전자와 그 염기서열을 비교한 결과 16개의 염기서열에서 차이를 보여 94.3%의 상동성을 나타낸다. 그러나 +210 위치에서 휴 등이 보고한 염기서열에서는 존재하지 않던 'A' 염기서열이 첨가되어 있어서 전사종료 시점이 +211이라는 휴 등의 보고와는 달리 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 유전자에서는 +283 위치가 전사종료 지점이다.
따라서, 염기서열로부터 연역되는 p10 단백질의 아미노산 서열을 휴 등이 기존에 보고한 것과 비교하면, 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 단백질은 94개의 아미노산 잔기로 이루어진 반면 휴 등의 누에 핵다각체병 바이러스의 p10 단백질은 카르복실 말단 쪽의 24개 아미노산 잔기가 존재하지 않아 70 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다.
이와 같이, 누에 핵다각체병 바이러스-케이원은 기존에 보고된 누에 핵다각체병 바이러스와는 다른 유전자 구조를 가지는 신규 바이러스이다.
누에 핵다각체병 바이러스-케이원은 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1998년 6월 9일자 기탁번호 제 KCTC 0491BP 호로서 기탁되었다.
한편, 본 발명의 전이벡터는 도 6에 나타낸 바와 같은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 다각체 단백질 유전자의 염기서열중 전사 개시시점 (Transcription start codon)인 'ATG'의 'A'를 +1로 하였을 때, 완전한 프로모터를 포함한 5' 말단 부위인 -1287 내지 +1의 서열, 이에 연결된 3' 말단 부위인 +736 내지 +2109의 서열 및 5' 말단 부위와 3' 말단 부위가 연결되는 위치에 다중 클로닝 부위를 포함한다. 전이벡터 pBmKSK3의 다중 클로닝 부위에 외래 유전자를 삽입하여 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 게놈 DNA와 함께 BmN-4 세포에 동시전이 (cotransfection)함으로써 용이하게 외래 유전자 발현용 벡터인 재조합바이러스를 제작할 수 있으며, 이렇게 제조된 재조합바이러스를 누에에 감염시킴으로써 누에에서 유용 외래 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 전이벡터 pBmKSK3은 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1998년 3월 5일자 기탁번호 제 KCTC 0442BP 호로서 기탁되었다.
본 발명에 의해 제작된 pBmKSK3 전이벡터는 비융합형 전이벡터로서 융합형의 물질 정제시에 따르는 단점을 극복할 수 있으며, 또한 완전한 프로모터 부위를 그대로 유지하므로 기존의 전이벡터에 비해 발현 효율이 더욱 우수하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명하나 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 게놈 DNA의 제한효소 처리 양상
누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 게놈 DNA (genomic DNA)를 분리하여 제한 효소BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,KpnⅠ 및PstⅠ를 처리한 후 0.7% 아가로스 겔에 전기영동하였고(도 1a), 그 양상을 마에다와 마지마 (Maeda and Majima,J. Gen. Virol., 71 : 1851∼1855. (1990))가 보고한 결과와 비교하였다 (도 1b). 도 1a에서 M열은 표준 DNA 크기 표지이고, 나머지 열들은 각 제한효소로 처리한 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 게놈 DNA이다. 또한, 도 1b에서 λ1HindIII는 파지 λ1의 DNA를HindIII로 처리한 표준 DNA 크기 표지이고, K1은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 게놈 DNA이며, M은 마에다와 마지마가 보고한 누에 핵다각체병 바이러스 게놈 DNA이다.
그 결과 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 게놈 DNA의 제한효소 처리 양상은 마에다와 마지마가 보고한 것과 차이를 보여 신규 바이러스주임을 확인하였다.
실시예 2: 감염말기 세포로부터의 다각체의 방출율
감염말기 세포로부터의 다각체의 방출율을 조사하기 위하여 1×106개의 BmN-4 세포 (Kobayashi, 일본잠사·곤충농업기술연구소)에 1.0 MOI로 누에 핵다각체병 바이러스-케이원을 접종하고 각각 감염 3일과 4일 후에 세포로부터 방출된 다각체의 수를 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 계수하였다 (도 2). 도 2에서, K1은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원이며, M은 마에다와 마지마가 보고한 누에 핵다각체병 바이러스이다.
그 결과, 누에 핵다각체병 바이러스-케이원은 마에다 등의 것과 비교하였을 때 약 6배 정도 높은 다각체 방출율을 보임으로서 마에다 등의 누에 핵다각체병 바이러스주와는 다른 신규 바이러스주임을 확인하였다.
실시예 3: p10 유전자의 염기 서열 및 p10 단백질의 아미노산 서열
누에 핵다각체병 바이러스-케이원 p10 유전자의 클로닝을 위하여 기존에 마에다 등이 보고한 p10 유전자의 염기서열을 참고로 하여 전사 개시시점인 'ATG'의 'A'를 +1으로 하였을 때 -231∼-210에 해당하는 5'-CTCGAGCAAGAAAATAAAACGC-3'의 정방향 프라이머 (sense primer)와 +384∼+365에 해당하는 5'-TTTTCGTAATCTTCCT AAT-3'의 역방향 프라이머 (antisense primer)를 합성하였다.
누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 유전자에 대한 증폭반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)은 반응완충액 10㎕와 최종 농도 2.5mM의 염화마그네슘(MgCl2), 0.2mM 디엔티피(dNTP), 2.5U 탁중합효소(Taq polymerase), 25pmol의정방향 및 역방향 프라이머를 첨가하고, 10ng의 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 게놈 DNA를 주형 (template)으로 첨가하여 멸균증류수로 전체량을 100㎕의 양으로 맞춘 후, 94℃에서 5 분, 45℃에서 2 분, 72℃에서 2 분씩 1 과정, 94℃에서 1 분, 45℃에서 2 분, 72℃에서 2 분씩 33 과정과 94℃에서 1 분, 45℃에서 2 분, 72℃에서 7 분씩 1 과정에 의해 써말사이클러 (Thermal Cycler, Perkin Elmer)로 수행하였다. 그 결과 약 0.6Kb의 증폭 산물을 얻었다.
이와 같이 PCR 증폭된 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 유전자를 pGemT-easy (Promega) 벡터에 클로닝하고 이를 pBmK1P10이라 명명하였다. pBmK1P10에 대하여 생거 등 (Sangeret al,Proc. Nat'l. Acad. Sci.,74 : 5463∼5467 (1977))의 방법에 따라 염기서열 분석을 수행한 결과, p10 유전자의 프로모터 부위와 구조 유전자를 포함한 615bp의 염기서열을 결정하였다 (도 3). 도 3에서, K1은 누에 핵다각체병 바이러스-케이원이고, M은 누에 핵다각체병 바이러스이며, 232번 내지 513번 염기가 p10 단백질의 구조 유전자 부위로서, 232∼234번의 "ATG"가 전사 개시시점이고, 514∼516번의 "TAA"가 전사 종료시점이다.
이렇게 결정된 염기서열중 p10 단백질의 구조 유전자 부위에 대해 휴 등 (Huet al,J. Gen. Virol., 75 : 2085∼2088. (1994))이 보고한 기존의 누에 핵다각체병 바이러스 p10 단백질 유전자와 그 염기서열을 비교한 결과 16개의 염기서열에서 차이를 보여 94.3%의 상동성이 있음을 확인하였다. 그러나 전사 개시시점의 'A'를 +1로 하였을 때 +210 위치에서 휴 등이 보고한 염기서열에서는 존재하지 않던 'A' 염기서열이 첨가되어 있어서 전사 종료시점이 +211이라는 휴 등의 보고와는 달리누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 유전자에서는 +283 위치가 전사 종료시점이었다.
따라서 염기서열로부터 연역되는 p10 단백질의 아미노산 서열을 휴 등이 기존에 보고한 것과 비교한 결과, 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 p10 단백질은 94 개의 아미노산 잔기로 이루어진 반면 휴 등의 누에 핵다각체병 바이러스의 p10 단백질은 카르복실 말단 쪽의 24개 아미노산 잔기가 존재하지 않아 70 개의 아미노산 잔기로 이루어져 있었다 (도 4).
이러한 결과들을 종합할 때, 누에 핵다각체병 바이러스-케이원은 기존에 보고된 누에 핵다각체병 바이러스와는 다른 새로운 종류의 누에 핵다각체병 바이러스임을 알 수 있다.
실시예 4: 다각체 단백질 유전자의 클로닝
누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 게놈 DNA를 분리하고 기존에 상동성이 있는 것으로 알려진 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스 (AcNPV C6 strain, Clontech)의 다각체 단백질 유전자를 탐침으로 서던블랏 (Southern blot) (Southern,J. Mol. Biol., 98 : 503∼517. (1975))을 수행한 결과 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 다각체 단백질 유전자가PstI 처리시 6.5Kb 단편내에 존재함을 확인하고, 이 단편을 pUC19 (New England Biolab, Inc.) 벡터에 클로닝하여 pBmPF로 명명하였다 (도 5). pBmPF에 대하여 생거 등의 방법 (Sangeret al,Proc. Nat'l. Acad. Sci.,74 : 5463∼5467 (1977))에 따라 염기서열 분석을 수행한 결과, 구조 유전자를 포함한 1,375bp의 염기서열을 결정하였다 (도 6). 이렇게 결정된 염기서열중 다각체 단백질의 구조 유전자 부위인 193번 내지 927번 염기에 대해 마에다 등 (Maedaet al,Nature,315 : 592∼594 (1985))이 보고한 기존의 누에 핵다각체병 바이러스 다각체 단백질 유전자와 비교한 결과 3개의 염기서열에서 차이를 보여 99.6%의 상동성이 있음을 확인하였다.
또한 염기서열 결과에 따라 추정된 아미노산 분석결과는 마에다 등의 보고와 비교할 때 5 세린 (serine)이 프롤린(proline)으로 155 메티오닌 (methionine)이 발린 (valine)으로 변경된 결과를 보여 99.2%의 상동성이 있음을 확인하였다.
이러한 결과는 누에 핵다각체병 바이러스-케이원이 기존에 보고된 누에 핵다각체병 바이러스와는 다른 다각체 단백질 유전자의 구조를 가지며, 또한 바이러스가 다른 종류의 것임을 나타낸다.
실시예 5: 다각체 단백질 프로모터 부위에 대한 증폭 프라이머 제작
본 발명의 전이벡터로서 프로모터 부위가 완전히 보존된 효율적인 벡터의 제작을 위해, 다각체 단백질의 구조 유전자를 PCR에 의해 완전히 제거시키기 위한 PCR용 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.
즉, 다각체 단백질 유전자의 프로모터 부위를 포함한 5' 말단부위의 클로닝을 위하여 전사 개시시점의 "ATG"의 "A"를 +1로 할 때 +1∼-18에 해당하는 부위에 제한효소EcoRI과SacI 위치를 첨가한 하기 서열 1의 역방향 프라이머와 -1287∼-1262에 해당하는 부위에 제한효소SphI 위치 (5'-GCATGC-3')를 추가한 하기 서열 2의 정방향 프라이머를 제작하였다:
[서열 1]
5'-GAGCTCGAATTCTATTTATAGGTTTTTTTATT-3'
[서열 2]
5'-GCATGCAAGCCGAAATTAAATCATTGC-3'
한편, 다각체 단백질 유전자의 3' 말단부위의 클로닝을 위해서는 다각체 단백질 유전자의 전사 개시시점으로부터 +736∼+759에 해당하는 부위에 제한효소PstI 위치 (5'-CTGCAG-3')와 완전한 종결 염기서열 (TTAATTAAT)을 추가한 하기 서열 3의 정방향 프라이머와 +2,109∼+2,085에 해당하는 부위중에서BamHI 위치 (5'-GGATCC-3')를 약간 변형하여KpnI 위치 (5'-GGTACC-3')를 갖게 한 하기 서열 4의 역방향 프라이머를 제작하였다:
[서열 3]
5'-CTGCAGTTAATTAATTAAAACACTATACATTGTTATTAG-3'
[서열 4]
5'-GGTACCGAGCTTGAGACCATTCCTC-3'
증폭반응은 반응완충액 10㎕에 최종 농도 2.5mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.2mM 디엔티피(dNTP), 2.5U 탁중합효소(Taq polymerase), 각 25pmol의 정방향 및 역방향 프라이머와 주형으로서 플라스미드 pBmPF DNA를 첨가하고 멸균증류수로 전체량을 100㎕의 양으로 맞춘 후, 94℃에서 5 분, 55℃에서 2 분, 72℃에서 2 분씩 1 과정,94℃에서 1 분, 55℃에서 2 분, 72℃에서 2 분씩 33 과정과 94℃에서 1 분, 55℃에서 2 분, 72℃에서 7 분씩 1 과정에 의해 써말사이클러(Thermal Cycler, Perkin Elmer)로 수행하였다. 그 결과 5' 말단부위의 약 1.3Kb와 3' 말단부위의 약 1.4Kb 증폭산물을 얻었다.
실시예 6: 전이벡터 pBmKSK3의 제작
전이벡터 pBmKSK3의 제작과정은 도 7에 개략적으로 나타나있다. PCR 증폭된 3' 말단부위를 pGemT-easy 벡터에 클로닝한 후, 제작된 벡터를 다시 제한효소PstI과KpnI으로 처리하여 얻은 1.4Kb DNA 단편을 pBluescriptII-SK(+) (Stratagene) 벡터의PstI/KpnI 위치에 클로닝하여 pBluescriptII-SK(+)-3'를 제작하였다.
5' 말단부위의 생성물 역시 pGemT-easy 벡터에 클로닝하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pGem-T(5')를SphI으로 처리한 후, 클레노우 단편 (Klenow fragment)으로 처리하여 평면말단 (blunt end)을 형성시키고, 이를 다시SacI으로 처리하여 얻은 1.3Kb 단편을 상기에서 제작된 플라스미드 pBluescriptII-SK(+)-3'의PvuII/SacI 위치에 클로닝하여 전이벡터 pBmKSK3를 제작하였다.
완성된 pBmKSK3에 수종의 제한효소를 처리하여 제한효소지도를 작성하고 클로닝 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 다각체 단백질의 구조 유전자중 +2 부터 +735 까지의 염기가 제거되었음을 확인하였다.
pBmKSK3 전이벡터는 누에 핵다각체병 바이러스-케이원의 다각체 단백질 부위의 유전자를 이용하여 제작된 비융합형 전이벡터로서 기존에 보고된 융합형 전이벡터의 물질 정제시에 따르는 단점을 극복할 수 있으며, 또한 완전한 프로모터 부위를 그대로 유지하므로 프로모터 부위의 완전한 보존이 이루어지지 않은 기존의 비융합형 전이벡터에 비해 외래 유전자의 발현 효율이 우수할 것으로 판단된다.
실시예 7: 재조합 전이벡터 pBmKSK3-lacZ 및 재조합 바이러스의 제작
벡터 pBmKSK3의 기능성을 검정하기 위해 표지 유전자 (marker gene)로서 대장균 (E. coli) lacZ 유전자를 클로닝하였다. 플라스미드 pCH110 (Pharmacia)에서 유래한 lacZ 유전자를 함유한 3.7Kb의 DNA 단편을 가진 pGem7lacZ (서울대학교 농업생명과학대학 응용생물화학부 곤충병리·유전공학연구실)에XbaI과BamHI을 처리하여 lacZ 유전자를 포함한 3.7Kb 단편을 분리하고 이를 pBmKSK3의XbaI/BamHI 위치에 클로닝하여 pBmKSK3-lacZ를 제작하였다. 그 제작과정은 도 8에 나타나 있다.
이렇게 제작된 재조합 전이벡터 pBmKSK3-lacZ를 전이물질인 도탭(DOTAP, Boehringer Manheim) 시약을 이용하여 리포좀매개전이 (liposome mediated transfection) 방법 (O'Reillyet al,Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992))에 의하여 누에 핵다각체병 바이러스-케이원 DNA와 함께 BmN-4 세포주에 동시전이시켜 재조합 바이러스를 제작하였다. 두 DNA의 동시전이 후 5 일된 세포를 수거하여 PBS 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)으로 3회 세척하고 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) 용액 (0.1M 인산나트륨 완충액, pH 7.0, 1mMMgCl2)으로 15분간 세포를 고정시켰다. 이를 엑스갈 (X-gal) 용액 (0.2% 엑스갈, 10mM 인산나트륨(pH 7.0), 1mM MgCl2, 150mM NaCl, 3.3mM K4Fe(CN)6·3H2O)로 처리하고 37℃에서 30 분간 반응시킨 뒤, 70% 글리세롤막 (glycerol film)을 형성시켜 도립현미경하에서 세포의 염색여부를 관찰하였다. 그 결과, 재조합 바이러스가 감염된 것으로 추정되는 세포만이 엑스갈에 염색되어 베타갈락토시다제 (β-galactosidase)가 발현되었으며, 또한 그 활성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
모바이러스 (누에 핵다각체병 바이러스-케이원) 및 재조합 바이러스가 혼재되어있는 배양액으로부터 lacZ 유전자를 포함하는 재조합 바이러스만을 순수하게 분리하기 위하여 엔드-포인트 희석 (end-point dilution)방법 (O'Reilly et al, Baculovirus Expression Vectors - A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992))에 따라 재조합 바이러스를 선발하였다. 즉, 동시전이 후 5일 된 BmN-4 세포의 배양액을 10-6∼ 10-8으로 희석하고, 이를 웰당 1×105개의 BmN-4 세포가 분주된 96-웰 조직배양용기 (96-well tissue culture plate)에 접종하여 27℃에서 배양하였다. 접종 후 4일부터 세포내 다각체 형성 및 엑스갈 검정에 의하여 다각체를 형성하지 않고 엑스갈에 염색되는 웰을 선발하였다. 동일한 방법으로 3회의 순화과정을 거쳐 순수한 재조합 바이러스를 선발하고 BmK1-LacZ로 명명하였다. BmK1-LacZ의 제작과정에 대한 개요를 도 9에서 보여주고 있다.
실시예 8: 재조합바이러스 BmK1-LacZ에 의한 외래유전자의 발현
재조합 바이러스 BmK1-LacZ의 대량증식을 위해 BmN-4 배양세포에 접종한 결과, 야생주 바이러스가 감염되었을 때 나타나는 다각체를 재조합 바이러스가 감염된 세포에서는 발견할 수 없었으며, 바이러스가 감염된 것으로 추정되는 세포는 핵이 확장되어 다각체의 미형성 외에는 전형적인 바이러스 병징을 보였다.
재조합 바이러스 BmK1-LacZ의 세포주에서 베타갈락토시다제의 발현 효율을 세포주와 유충에서 비교·조사하기 위하여, 누에 세포주인 BmN-4 세포주 및 5령 1일째의 누에 유충에 각각 재조합 바이러스를 접종하고 1일 간격으로 세포 배양액 및 누에 체액을 수거하여 베타갈락토시다제 활성을 비교·조사 하였다.
그 결과, 베타갈락토시다제 활성은 두 숙주 모두에서 3 일이 경과하면서 발현량이 증가하기 시작하여, 세포주에서의 경우 접종 후 5 일째에 최대를 보이고 6 일째에도 큰 변화가 없었다. 그러나 유충의 경우 역시 5 일째에 최대의 발현량을 보였으나 6일째에는 유충이 죽어 그 발현량을 확인할 수 없었다. 두 숙주에서의 최대 발현량을 비교한 결과, 세포주에서는 배지 1㎖당 약 4 유니트(units)인 반면, 유충에서의 경우 체액 1㎖당 약 200 유니트로서, 유충의 경우 약 50배 정도 높은 발현량을 보여 유충에서의 발현이 훨씬 효과적이었다 (도 10). 이와 같은 결과는 마에다 (Maeda,Ann. Rev. Entomol., 34, 351∼372(1989))에 의해 보고된 유충에서의 높은 발현량과 일치하는 결과로서, 본 발현벡터를 이용한 발현 역시, 세포주에서도 효과적이지만, 누에 유충을 이용함으로써 발현량의 극대화를 유도할 수 있음을 보여준다.
본 발명에 따른 누에 핵다각체병 바이러스-케이원은 기존에 보고된 누에 핵다각체병 바이러스와 다른 유전자 구조와 특성을 갖는 신규 바이러스이며, 이의 완전한 다각체 단백질 유전자 프로모터 부위를 포함하는 본 발명의 전이벡터 pBmKSK3는 기존의 전이벡터에 비해 발현 효율이 훨씬 우수하다.

Claims (2)

  1. 누에 핵다각체병 바이러스-케이원(제 KCTC 0442BP 호).
  2. 누에 핵다각체병 바이러스-케이원(BmNPV-K1)의 다각체 단백질 유전자의 프로모터가 포함된 하기 서열 5, BmNPV-K1의 다각체 단백질 구조유전자의 3'-말단 이후의 서열인 서열 6, 및 서열 5와 서열 6 사이에 다중 클로닝 부위를 포함하는 전이벡터 pBmKSK3 (제 KCTC 0442BP 호):
    [서열 5]
    [서열 6]
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