JP4353754B2 - 昆虫への遺伝子導入ベクターおよび遺伝子産物製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、こうした状況に鑑み、組換えバキュロウイルスを用いる必要がなく、かつ、目的タンパク質の精製を容易にすることができる昆虫用の遺伝子工学材料を提供すると同時に、その遺伝子工学材料を利用した外来タンパク質の製造方法を提供することを課題としている。
本発明は、以下の遺伝子カセット、ベクターなど昆虫での外来タンパク質生産に利用可能な遺伝子工学材料、形質転換体、その形質転換体を用いた外来タンパク質の製造方法および外来タンパク質を含む絹糸に関する。
(2)前記(1)の下流に連結された、フィブロインH鎖遺伝子の5’末端部分を外来タンパク質構造遺伝子の5’側に融合させた遺伝子と、
を含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
(2)前記(1)の下流に連結された、終止コドンを含まない外来タンパク質構造遺伝子の3’側にフィブロインH鎖遺伝子の3’末端部分を融合させた遺伝子と、
を含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット;あるいは(1)絹糸腺で発現するプロモーターと、(2)前記(1)の下流に連結された、フィブロインH鎖遺伝子の3’末端部分の3’側に外来タンパク質構造遺伝子を融合させた遺伝子と、を含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
(2)前記(1)の下流に連結された、終止コドンを含まない外来タンパク質構造遺伝子の5’側にフィブロインH鎖遺伝子の5’末端部分を融合させ且つ前記構造遺伝子の3’側にフィブロインH鎖遺伝子の3’末端部分を融合させた遺伝子と、
を含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
5)前記フィブロインの第1エキソンと第2エキソンを合わせた部分が、フィブロインH鎖遺伝子の分泌シグナル遺伝子領域であることを特徴とする4)の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
7)前記1)〜6)のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、該外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる(1)絹糸腺プロモーターおよび/または(2)フィブロインH鎖遺伝子の5’末端部分が実質的に同等の機能を有する範囲において1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
9)前記フィブロインH鎖遺伝子の3’末端部分が、システインをコードするコドンを少なくとも一つ含むことを特徴とする2)または3)記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
11)前記10)に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、前記フィブロインH鎖遺伝子の3’末端部分が、実質的に同等の機能を有する範囲において、1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
13)前記絹糸腺で発現するプロモーターが、フィブロインH鎖遺伝子のプロモーター、フィブロインL鎖遺伝子のプロモーター及びセリシン遺伝子のプロモーターのうちから選ばれる少なくとも一つのプロモーターであることを特徴とする1)から12)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
15)前記1)〜14)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットの両側に、1対のピギーバック(piggyBac)トランスポゾンの逆位反復配列が存在することを特徴とする昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセット。
17)前記15)に記載の昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用遺伝子導入ベクター。
18)前記16)または17)に記載の昆虫細胞用遺伝子導入ベクターを昆虫細胞へ導入することを特徴とする外来タンパク質の製造方法。
19)昆虫細胞が鱗翅目昆虫由来であることを特徴とする18)に記載の外来タンパク質の製造方法。
21)昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)の絹糸腺細胞であることを特徴とする20)に記載の外来タンパク質の製造方法。
22)ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースのDNA転移活性を利用して、該外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製し、得られた組換えカイコの絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生させた後、その絹糸腺または絹糸から外来タンパク質を回収することを特徴とする18)に記載の外来タンパク質の製造方法。
24)前記1)〜14)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットが染色体に導入されており、かつ、絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生する能力を持つ組換えカイコ。
26)以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号2の第1−4111位塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)塩基配列(a)において1若しくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有する塩基配列からなり、絹糸腺組織で外来遺伝子の発現を増大させることを特徴とするポリヌクレオチド。
28)前記26)または27)に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする絹糸腺組織で外来遺伝子の発現を増大させる方法。
30)前記29)に記載の遺伝子カセットの両側に、1対のピギーバック(piggyBac)トランスポゾンの逆位反復配列が存在することを特徴とする昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセット。
31)前記30)に記載の遺伝子導入用遺伝子カセットが染色体に導入されており、かつ絹糸腺又は絹糸に組換えタンパク質を産生する能力をもつ組換えカイコ。
32)前記31)に記載の組換えカイコが産生する外来タンパク質を含む絹糸。
33)前記24)または31)に記載の組換えカイコが産生する外来タンパク質(ただしGFPを除く)を含む絹糸。
本発明におけるベクターとは、環状DNA構造または線状DNA構造を有するものをいう。特に、大腸菌内でも複製可能で、かつ、環状DNA構造を持つベクターが好適に使用できる。このベクターには、形質転換体の選抜を容易にする目的で、抗生物質耐性遺伝子、クラゲ由来蛍光緑色タンパク質遺伝子などマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。
カイコガ(Bombyx mori)の卵に含まれる細胞に遺伝子を導入する場合には、マイクロインジェクションする方法が好適である。ここで卵にマイクロインジェクションを行う場合、卵中の細胞に直接マイクロインジェクションする必要はなく、卵中にマイクロインジェクションするだけで遺伝子を導入することが可能である。
本発明で得られる組換えカイコは、通常のカイコと同様に飼育が可能であり、通常の条件で飼育することで外来タンパク質を産生させることが可能である。目的とする外来タンパク質に応じて、特に5令時期の培養温度、湿度、給餌条件などを最適化することで、外来タンパク質の産生量を向上させることも可能である。
実施例1. Bombyx mori genomic DNAの調製
5齢3日目のカイコを解剖し、後部絹糸腺組織を取り出した。1×SSCで洗浄した後、DNA 抽出バッファー(50mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH8.0, 100mM NaCl)200μlを加えた。Proteinase K(final 200μg/ml)を加えて組織をグラインダーで充分すりつぶし、更にDNA抽出バッファーを350μl、10%SDS 60μlを加え混合後、50℃ 2時間保温した。Tris-HCl飽和フェノール pH8.0 500μlを加え10分混合後、10,000rpm 5分 4℃にて遠心分離し上清を回収した。
用いた遺伝子は既知の配列を利用して、その両端配列のプライマーを作製し、適当なDNAソースを鋳型としてPCRを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。
フィブロインH鎖プロモーター(GeneBank登録番号AF226688の塩基番号62118〜62437番目:以下P領域)は、Bombyx mori genomic DNAを鋳型に、プライマー4(配列番号4)とプライマー5(配列番号5)の2種類のプライマーを用いたPCRにより取得した。
フィブロインH鎖上流プロモーター・フィブロインH鎖遺伝子第一エキソン・第一イントロン領域(GeneBank登録番号AF226688の塩基番号57444〜62927番目:以下HUP領域)は、Bombyx mori genomic DNAを鋳型に、プライマー12(配列番号12)とプライマー13(配列番号13)の2種類のプライマーを用いたPCRにより取得した。
フィブロインH鎖C末端領域遺伝子・フィブロインH鎖ポリAシグナル領域(GeneBank登録番号AF226688の塩基番号79099〜79995番目:以下HA領域)は、Bombyx mori genomic DNAを鋳型に、プライマー11(配列番号11)とプライマー9(配列番号9)の2種類のプライマーを用いたPCRにより取得した。
PCRはKODplus(東洋紡(株)製)を用いて添付のプロトコールに従って行った。すなわち、それぞれの鋳型を、Bombyx mori genomic DNAの場合には100ng,、Bombyx mori 後部絹糸腺 cDNAおよびpβgal-Basic vectorの場合には10ng加え、各プライマーを50pmol、添付の10×PCRバッファーを10μl、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs、2単位KODplusとなるように各試薬を加え、全量100μlとする。DNAの変性条件を94℃,15秒、プライマーのアニーリング条件を55℃,30秒、伸長条件を68℃,60秒〜300秒の条件でPerkin-Elmer社のDNAサーマルサイクラーを用い、30サイクル反応させた。
実施例2で調製したβ-gal遺伝子を持つプラスミドをSal IとHind IIIにより切断し、ここにフィブロインH鎖プロモーターを持つプラスミドからSal IとHind IIIにより切り出した約0.3kbp.断片(P領域)を挿入した。さらにこれをBamH Iにより切断し、ここにフィブロインH鎖ポリAシグナル領域を持つプラスミドからBamH Iにより切り出した約0.8kbp.断片(A領域)を挿入し、得られたβ-gal遺伝子を持つプラスミドをQIAGEN Plasmid Maxi Kitを用い、添付のプロトコールに従って精製した。得られたプラスミドをpPgalAと名付け、PCRおよびシークエンスにより目的のプラスミドであることを確認した。
遺伝子導入用プラスミドにはpigA3GFP(Nature Biotechnology 18,81-84,2000)を利用した。すなわち、米国特許第6218185号に開示されるプラスミドp3E1.2よりtransposaseをコードする領域を取り除き、その部分にA3プロモーター(GenBank登録番号U49854の塩基番号1764〜2595番目)およびpEGFP-N1ベクター(Clontech社製)由来のGFPおよびSV40由来ポリA付加配列(GenBank登録番号U55762の塩基番号659〜2578番目)を挿入したベクターがpigA3GFPであり、このベクターは独立行政法人農業生物資源研究所から分与可能である。そのA3プロモーターの上流側にあるXho I部位を平滑化しネコインターフェロン−ω遺伝子の発現カセットを挿入した。
P・IC・Aコンストラクトの作製は以下の手法により行った。実施例2で調製したネコインターフェロンーω(IC領域)を持つプラスミドをSal IとHind IIIにより切断し、ここにフィブロインH鎖プロモーターを持つプラスミドからSal IとHind IIIにより切り出した約0.3kbp.断片(P領域)を挿入した。さらにこれをBamH Iにより切断し、ここにフィブロインH鎖ポリAシグナル領域を持つプラスミドからBamH Iにより切り出した約0.8kbp.断片(A領域)を挿入した。このP・IC・Aを持つプラスミドをAsc Iで切断し、切り出した約1.7kbp断片を宝酒造(株)T4 DNA Polymeraseにより平滑化したものと、Xho Iで切断後平滑化、脱リン酸化処理したpigA3GFPとを連結し、P・IC・A遺伝子カセットを含む遺伝子導入用コンストラクトを作製した。その手法を図1及び図2に示す。
直径1.6umの金粒子を100%エタノールで洗浄滅菌し、滅菌蒸留水中に懸濁(60mg/ml)した。カイコ絹糸腺へのβ-gal遺伝子発現カセットの導入は、遺伝子銃を用いて行った。すなわち、金粒子50ul(0.3mg)、実施例3で得られた発現用プラスミドpPgalA もしくはpHPgalHA 10ugと、2.5M塩化カルシウム50ul、0.1Mスペルミジン20ulを順々に混合し、室温で30分間放置した後に遠心分離でpHgalCがコーティングされた金粒子を回収した。
実施例4に記載の遺伝子導入用プラスミドとピギーバックトランスポゼースタンパク質を生産するDNA(pHA3PIG)を各200μg/ml含んだ0.5mMリン酸バッファー(pH7.0)・5mMKCl溶液を調製し、3〜20nlを産卵後4時間以内のカイコ卵500個に対してマイクロインジェクションした。pHA3PIG(Nature biotechnology 18,81-84,2000 農業生物資源研究所より分与可能)は、ピギーバックトランスポゾンの一方の逆位反復配列と5’フランキング領域、トランスポゼース遺伝子のリーダー配列を欠いており、その代わりにカイコアクチン遺伝子の5’フランキング領域とリーダー配列が組み込まれている。pHA3PIGはアクチンプロモーターの働きによりピギーバックトランスポゼースタンパク質を作る機能を持つが、ピギーバックトランスポゾンの一方の逆位反復配列が欠損しているため自身のDNAは転移しない。
非形質転換カイコ、形質転換カイコ(HP・IC・A形質転換カイコ、HP・IC・HA形質転換カイコ、HUP・IC・HA形質転換カイコ)の後部絹糸腺組織を回収し、組織中でのネコインターフェロンωの発現をウエスタン解析により調べた。カイコ後部絹糸腺を100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)中でホモジナイズし、遠心分離後上清を回収しサンプルとし、ECL PlusTM Western blotting Kit (アマシャムファルマシア社製)を用い、添付のプロトコールに従ってネコインターフェロンの検出を行った。すなわち、ブロッティングしたメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク・0.1%Tween20・PBS)中で4℃終夜ブロッキングした。
次に絹糸への外来タンパク質すなわちネコインターフェロンωの分泌を調べた。
非形質転換カイコ、形質転換カイコ(HP・IC・A遺伝子導入形質転換カイコ、HP・IC・HA遺伝子導入形質転換カイコ、HUP・IC・HA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭を各10mg量り採り、60%LiSCN4mlを加え攪拌後、終夜室温に静置し繭を溶解した。これを8M尿素・2%SDS・5%2-メルカプトエタノールで10培希釈したものをサンプルとし、、ECL PlusTM Western blotting Kit (アマシャムファルマシア社製)を用い、添付のプロトコールに従ってネコインターフェロンの検出を行った。その結果をモレキュラーイメージャー(BioRad社製)を用いてシグナル強度を測定し、濃度既知のネコインターフェロンのシグナル強度と比較しタンパク質含量を測定した。
絹糸中のネコインターフェロンωの定量をELISA法により行った。
非形質転換カイコ、形質転換カイコ(HP・IC・A遺伝子導入形質転換カイコ、HP・IC・HA遺伝子導入形質転換カイコ、HUP・IC・HA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭を各10μg量り採り、60%LiSCN4mlを加え攪拌後、終夜室温に静置し繭を溶解した。これをPBSで8倍もしくは16倍に希釈し、マイクロタイタープレートにアプライした。スタンダードとして濃度既知のネコインターフェロンをPBSで順次希釈し用いた。
その結果絹糸中のネコインターフェロンωはHP・IC・A遺伝子導入形質転換カイコでは検出されず、HP・IC・HA遺伝子導入形質転換カイコでは約1.1〜2.2%であり、HUP・IC・HA遺伝子導入形質転換カイコでは約1.0〜4.9%であった。
Claims (18)
- 配列番号1または配列番号2に示すDNAを外来タンパク質構造遺伝子の5’側に融合させた遺伝子を含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 前記外来タンパク質構造遺伝子の3’側に配列番号3に示すDNAを融合させたことを特徴とする、請求項1に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 請求項1または2に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、該外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる配列番号1または配列番号2に示すDNAがカイコ絹糸腺細胞中での転写促進活性を有する範囲において1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 請求項1または2に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、該外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる配列番号1または配列番号2に示すDNAに代えて、該DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、カイコ絹糸腺細胞中での転写促進活性を有する遺伝子を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 請求項2に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、前記配列番号3に示すDNAが、外来タンパク質を絹糸に分泌させる機能を有する範囲において、1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 請求項2に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、前記配列番号3に示すDNAにかえて、前記配列番号3に示すDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、外来タンパク質を絹糸に分泌させる機能を有する遺伝子を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 該外来タンパク質発現遺伝子カセットの下流に、フィブロインH鎖遺伝子のポリA付加領域、フィブロインL鎖遺伝子のポリA付加領域およびセリシン遺伝子のポリA付加領域のうちから選ばれる少なくとも一つのポリA付加領域が存在することを特徴とする請求項1から6のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットの両側に、1対のピギーバック(piggyBac)トランスポゾンの逆位反復配列が存在することを特徴とする昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセット。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用遺伝子発現ベクター。
- 請求項8に記載の昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用遺伝子導入ベクター。
- 請求項9に記載の昆虫細胞用遺伝子発現ベクターまたは請求項10に記載の昆虫細胞用遺伝子導入ベクターを昆虫細胞へ導入することを特徴とする外来タンパク質の製造方法。
- 昆虫細胞が鱗翅目昆虫由来であることを特徴とする請求項11に記載の外来タンパク質の製造方法。
- 昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)由来であることを特徴とする請求項12に記載の外来タンパク質の製造方法。
- 昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)の絹糸腺細胞であることを特徴とする請求項12または13に記載の外来タンパク質の製造方法。
- ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースのDNA転移活性を利用して、前記外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製し、得られた組換えカイコの絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生させた後、その絹糸腺または絹糸から外来タンパク質を回収することを特徴とする請求項11に記載の外来タンパク質の製造方法。
- 昆虫細胞用遺伝子導入ベクターと、ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースを産生するDNAもしくはRNAを同時にカイコ卵にマイクロインジェクションすることによって前記外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製することを特徴とする請求項15に記載の外来タンパク質製造方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットが染色体に導入されており、かつ、絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生する能力を持つ組換えカイコ。
- 請求項17に記載の組換えカイコから絹糸を回収することによる、外来タンパク質を含む絹糸の製造方法。
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