JP5794620B2 - アリールアルキルアミン−n−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 - Google Patents
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本発明における昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤は、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含むことを特徴とする。
<昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法、遺伝子組換え昆虫の生産方法>
従って、本発明は、昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価することを含む方法を提供するものである。また、本発明は、遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および/または体の薄色化を評価し、卵および/または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法をも提供するものである。
カイコは人工飼料(日本農産工業)で25〜27度で飼育した。トランスジェニックカイコの作成に用いたw-1;pnd系統(w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統)は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。トランスジェニックカイコの交配相手であるActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2(Imamura, M. et al., 2003. Genetics 165:1329-1340、Uchino, K. et al., 2006. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97)を保持する系統と、黒縞系統は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。
NAT遺伝子はカイコ蛹期翅から作成したESTライブラリーよりpBacMCS-UAS-BlnI-Kozak-BmNAT1-ORF-sプライマー(5’-GCCTAGTAGACCTAGAAAAATCAAAATGGCTGTTACAAGTACAAGAGGC-3’/配列番号:15)とpBacMCS-UAS-BlnI-BmNAT1-ORF-aプライマー(5’-GTATGGCTGACCTAGTTACAGCTCCTTAATGTAGACCCTG-3’/配列番号:16)とPhusion Hot Start II High-Fidelity DNA polymerase(New England Biolabs)を用いて増幅した。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、0.9kbの断片をQiaquick gel extraction kit(Qiagen)を用いて、切り出し、精製を行った。NAT1のORFの配列は、GenBank accession no. DQ256382と同一である。この断片を、In-fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、pBacUASMCS-3xP3-EGFPベクターのBlnIサイトにサブクローニングした。完成したプラスミドの配列はABI3130xl(Applied Biosystems)を用いたシークエンシングにより確認した。
トランスジェニックカイコの作成は、Tamuraらの方法(非特許文献1)と同様の方法で行った。pBacUAS-NAT1/3xP3-EGFPと、ヘルパープラスミドpHA3PIGを5mM KCl 0.5mM リン酸バッファー(pH7.0)にそれぞれ400ng/μl、200ng/μlになるように調整した。この混合溶液を、産下後3.5〜8時間のw-1;pnd系統(w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統)の卵に注入した。遺伝子組換え体の選抜はG1世代の卵でEGFPの蛍光を用いて蛍光顕微鏡(オリンパス)を用いて行った。樹立したUAS-NAT1/3xP3-EGFP系統の雄蛾とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2系統の雌蛾を交配し、生まれた卵をEGFPとDsRed2の蛍光を用いてスクリーニングを行った。
蛍光顕微鏡(ライカ)を用いて観察した。
1xPTU(フェニルチオ尿素)/PBS中で解剖した。
NAT1遺伝子をカイコ1齢幼虫のヒフで強制発現させるために、Gal4/UASシステム(Fischer, JA. et al., 1988. Nature 332:853-856)を用いた。UASの下流にカイコのNAT1遺伝子のORFの全長をつないだものと、眼での遺伝子発現を誘導する3xP3プロモーターにEGFPをつないだもの2種類をpiggyBac転移因子の認識配列(ITR)の間に組み込んだプラスミドを作成し(図2)、これをw-1;pnd系統(w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統)の卵に微小注射することで、UAS-NAT1/3xP3-EGFPを持つカイコの系統を作成した。UAS-NAT1の有無は、眼のEGFPの蛍光で識別した。次に、全身でGal4の発現が観察されるActin A3プロモーター-Gal4/3xP3-DsRed2(以下、「Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2」と称する)トランスジェニック系統(Imamura, M. et al., 2003. Genetics 165:1329-1340、Uchino, K. et al., 2006. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97)(図2)の蛾をUAS-NAT1/3xP3-EGFPの蛾と交配した。産下後7日目の時期に、UAS-NAT1とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。EGFPのみや、DsRed2のみの個体では、NAT1は強制発現されないが、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる個体では、NAT1が全身で強制発現されていると考えられる。
カイコの2齢幼虫以降の体色の大部分は尿酸からなる白であり、部分的にメラニン色素やオモクローム系色素からなる着色が見られる。この着色は系統により異なるが、NAT1の強制発現に用いた系統は、元々紋様が薄い系統であった。そこで、NAT1強制発現により幼虫のメラニン色素の色が変化するかを明確に調べるために、Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2とUAS-NAT1/3xP3-EGFPの両方を持つ個体と、黒縞遺伝子をホモで持つ個体(pS/pS)を交配し(図5)、産まれた卵をUAS-NAT1とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。オス親は、pS(黒縞)遺伝子をホモで持っており、メス親は持っていないため、F1はすべてpS(黒縞)遺伝子座をヘテロで保持し(pS/+pS)、体表に太い黒の縞模様が現れる。この黒の縞模様にNAT1の強制発現が与える影響を観察したところ、3〜4齢幼虫では、黒の縞模様が茶褐色〜黄褐色を呈していた(図6〜8)。縞の体の側面の部分の色の体色が顕著に薄くなっており、半月紋や星状紋がオレンジ色になっていた。特に、体の側面や半月紋、星状紋の体色が顕著に変化していた。5齢幼虫も、全体的に色が薄くなっており、さらに、眼状紋の着色部位が狭くなっていた(図9〜10)。半月紋と星状紋で顕著に着色部位が減少しており、紋様自体の変化を引き起こした(図10)。以上より、pS(黒縞)遺伝子座を持つ個体の幼虫では、NAT1の影響がより顕著にみられ、遺伝子組換え体を容易に判別可能であることが判明した。
カイコの幼虫の気管は通常黒っぽい色をしている。NAT1を強制発現させたカイコの5齢3日目の幼虫を解剖し、気管を観察した。その結果、NAT1強制発現カイコは気管が薄い金色であった(図11)。
NAT1を強制発現させたカイコを飼育し、その成虫を観察したところ、鱗粉や体毛の色には変化は認められなかったが、触角の色が対照区では通常濃い茶色であるのに対し、NAT1を強制発現させたカイコの触角は黄色に近い茶色になることが判明した(図12、13)。この形質は、UAS-NAT1/3xP3-EGFPのみ持つ個体や、Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2のみの個体では認められなかった。このことから、カイコの成虫の触角にも、ドーパミンメラニンが含有されていることが示唆される。また、成虫まで飼育する間、EGFPのみ、DsRed2のみの個体と比べても、死亡率の高さは特に認められなかった。
Claims (6)
- カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含む、カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現によりカイコの卵および体を薄色化させるための薬剤。
- カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現により薄色化されたカイコ。
- 請求項2に記載のカイコの卵、子孫またはクローン。
- 卵および体が薄色化されたカイコの生産方法であって、カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAをカイコに導入して、カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼを過剰発現させることを特徴とする方法。
- カイコが遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAとカイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAをカイコに導入し、カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現による当該カイコの卵および/または体の薄色化を評価することを含む方法。
- 遺伝子組換えカイコの生産方法であって、任意のDNAとカイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAをカイコに導入し、カイコのアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼの過剰発現による当該カイコの卵および/または体の薄色化を評価し、卵および/または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法。
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