JP2013005740A - アリールアルキルアミン−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 - Google Patents
アリールアルキルアミン−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013005740A JP2013005740A JP2011139217A JP2011139217A JP2013005740A JP 2013005740 A JP2013005740 A JP 2013005740A JP 2011139217 A JP2011139217 A JP 2011139217A JP 2011139217 A JP2011139217 A JP 2011139217A JP 2013005740 A JP2013005740 A JP 2013005740A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insect
- gene
- arylalkylamine
- dna
- nat1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010074515 Arylalkylamine N-Acetyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 130
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 48
- 102000008095 Arylalkylamine N-Acetyltransferase Human genes 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 78
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 abstract description 53
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 18
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 13
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract 1
- 101000884385 Homo sapiens Arylamine N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 56
- 101001034811 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2 Proteins 0.000 description 56
- 101000639975 Homo sapiens Sodium-dependent noradrenaline transporter Proteins 0.000 description 56
- 102100033769 Sodium-coupled neutral amino acid transporter 3 Human genes 0.000 description 56
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 30
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 30
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 22
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 17
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 11
- OFSAJYZMIPNPHE-UHFFFAOYSA-N N-acetyldopamine Chemical compound CC(=O)NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 OFSAJYZMIPNPHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101150082943 NAT1 gene Proteins 0.000 description 9
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 8
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 7
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 6
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 6
- 101150087123 nat gene Proteins 0.000 description 6
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 5
- 102100038238 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Human genes 0.000 description 4
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 4
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 4
- 241001272720 Medialuna californiensis Species 0.000 description 4
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 4
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 4
- 108010035075 Tyrosine decarboxylase Proteins 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 4
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 108020005224 Arylamine N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 3
- 241000397426 Centroberyx lineatus Species 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000238675 Periplaneta americana Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- YGPSJZOEDVAXAB-UHFFFAOYSA-N kynurenine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(=O)C1=CC=CC=C1N YGPSJZOEDVAXAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical class NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGZWXTYWZFMLSQ-UHFFFAOYSA-N 3-amino-N-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl]propanamide Chemical compound NCCC(=O)NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 KGZWXTYWZFMLSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 1
- 241000238660 Blattidae Species 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- 241000255749 Coccinellidae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000003385 Diospyros ebenum Nutrition 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 108700008064 Drosophila NAT1 Proteins 0.000 description 1
- 241000792913 Ebenaceae Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000884399 Homo sapiens Arylamine N-acetyltransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713305 Homo sapiens Sodium-coupled neutral amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710205162 Laccase-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 208000003351 Melanosis Diseases 0.000 description 1
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 1
- FULZLIGZKMKICU-UHFFFAOYSA-N N-phenylthiourea Chemical compound NC(=S)NC1=CC=CC=C1 FULZLIGZKMKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000195888 Physcomitrella Species 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100036916 Sodium-coupled neutral amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010042602 Supraventricular extrasystoles Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- OCYSGIYOVXAGKQ-UHFFFAOYSA-N hydron;3-[1-hydroxy-2-(methylamino)ethyl]phenol;chloride Chemical compound Cl.CNCC(O)C1=CC=CC(O)=C1 OCYSGIYOVXAGKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011392 neighbor-joining method Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000001054 red pigment Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009366 sericulture Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】 昆虫の様々な発生段階において肉眼で識別可能であり、野生型個体にも適用可能であり、かつ、母性遺伝しない、遺伝子組換えマーカーを提供すること
【解決手段】 昆虫の例としてカイコを選択し、カイコにおいて、アルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を全身で過剰発現する遺伝子組換え体を作出した結果、その卵および体が薄色化することを見出した。アルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、昆虫における優れた遺伝子組換えマーカーとなる。
【選択図】 なし
【解決手段】 昆虫の例としてカイコを選択し、カイコにおいて、アルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を全身で過剰発現する遺伝子組換え体を作出した結果、その卵および体が薄色化することを見出した。アルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、昆虫における優れた遺伝子組換えマーカーとなる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、昆虫の卵および体を薄色化させるための、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の利用に関する。また、本発明は、この薄色化を指標とした遺伝子組換え体の選抜などのための、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の利用に関する。
カイコは、昆虫の発生学、生理学、遺伝学を研究する上で重要なモデル昆虫である。最近では、カイコは、学術研究のみならず、遺伝子組換え技術（非特許文献１）を利用した有用物質生産（非特許文献２〜４）にも利用されている。さらに、カイコを用いた薬剤スクリーニングも試みられており（非特許文献５）、遺伝子組換えカイコを用いて、薬剤スクリーニングのシステムをさらに発展させる試みも行われている。
現在、マーカーを用いたカイコの遺伝子組換え個体の判別法は、3xP3プロモーターを用いて眼においてGFPなどの蛍光タンパク質を発現させ、蛍光により判別する方法（非特許文献６、７）か、w-1遺伝子（キヌレニン酸化酵素遺伝子）を導入して1齢幼虫の着色の変化で判別する方法（非特許文献８）が利用されている。
しかしながら、3xP3プロモーターとGFPマーカーを利用する方法は、GFPマーカーの検出に蛍光顕微鏡を必要とする点や、眼や卵に着色のないw-1遺伝子に変異が入った系統(w-1変異系統) （非特許文献９）を用いる必要がある点に問題がある。さらに、w-1変異系統を用いた場合でも、通常、産卵後7日目にならないと組換え体の判別ができないが、産卵後9日目以降になると頭部が黒く着色されるため、組換え体の判別が困難となる。すなわち、組換え体を判別しやすい時期が数日間に限定されてしまう。
w-1遺伝子を導入して判別する方法においても、w-1変異系統を用いる必要があるが、導入したw-1遺伝子の効果は母性遺伝するため、母親の遺伝型に影響をうけるという問題点がある。
このように、遺伝子組換えカイコを作製するための従来のシステムでは、w-1の劣性変異体を用いる必要があるが、現在、絹糸生産に使用されている実用系統はすべてw-1遺伝子が野生型となっている。このため、w-1遺伝子に変異を持つ実用系統を作出するためには、実用系統をw-1変異系統と何世代も交配してw-1遺伝子以外は実用系統と同じ個体を選抜する必要がある。絹糸生産に用いられるカイコの多くは交雑種のため、それぞれの原種に対し上記の交配と選抜を行う必要があるが、このような交配と選抜の作業には、多大な労力と時間を要する。
これらのことから、カイコの遺伝子組換え技術をより汎用的にするためには、肉眼で容易に識別可能で、w-1遺伝子に変異が入っていない系統でも利用可能な優性の遺伝子組換えマーカーを利用する必要がある。
また、コオロギ（非特許文献１０）、ネッタイシマカ（非特許文献１１〜１３）、ハマダラカ（非特許文献１４）、コクヌストモドキ（非特許文献１５）、テントウムシ（非特許文献１６）、ジャノメチョウ（非特許文献１７）など、カイコやショウジョウバエ以外の疫学及び基礎生物学に重要な昆虫においても遺伝子組換え技術が構築されている。しかし、ショウジョウバエに比べると組換え個体を得られる効率が低いため、組換え個体の大規模スクリーニングの際に判別しやすいマーカーの作出が重要である。肉眼で容易に識別可能で優性の遺伝子組換えマーカーは、系統を選ばないため、様々な昆虫種における遺伝子組み換え技術の確立と普及を促進するものと予想される。
Tamura, T. et al., 2000. Nat Biotechnol 18:81-84
Tomita, M. et al., 2003. Nat Biotechnol 21:52-56
Kurihara, H. et al., 2007. Biochem Biophys Res Commun 355:976-980
Iizuka, M. et al., 2009. FEBS J 276:5806-5820
Kaito, C. et al., 2005. Mol Microbiol 56:934-944
Horn, C. et al., 2000. Dev Genes Evol 210:623-629
Thomas, JL. et al., 2002. Insect Biochem Mol Biol 32:247-253
Kobayashi, I. et al., 2007. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 76:145-148
Quan, GX. et al., 2002. Molecular Genetics and Genomics 267:1-9
Nakamura, T. et al., 2010. Curr Biol 20: 1641-1647.
Coates, C. J. et al., 1998. Proc Natl Acad Sci U S A 95:3748-3751.
Jasinskiene, N. et al., 1998. Proc Natl Acad Sci U S A 95:3743-3747.
Kokoza, V. et al., 2001. Insect Biochem Mol Biol 31:1137-1143.
Catteruccia, F. et al., 2000. Nature 405:959-962.
Lorenzen, M. D. et al., 2003. Insect Mol Biol 12:433-440.
Kuwayama, H. et al., 2006. Insect Mol Biol 15:507-512.
Marcus, J. M. et al., 2004. Proc Biol Sci 271 Suppl 5:S263-265.
Wittkopp, PJ. et al., 2003. Trends Genet 19:495-504
Arakane, Y. et al., 2005. Proc Natl Acad Sci U S A 102:11337-11342
Arakane, Y. et al., 2009. J Biol Chem 284:16584-16594
Futahashi, R, H Fujiwara., 2005. Dev Genes Evol 215:519-529
Shirataki, H. et al., 2010. Evol Dev 12:305-314
Futahashi, R. et al., 2008. Genetics 180:1995-2005
Liu, C. et al., 2010. Proc Natl Acad Sci U S A 107:12980-12985
Wittkopp. et al., 2002. Development 129:1849-1858
Futahashi, R. et al., 2010. Evol Dev 12:157-167
Futahashi, R. et al., 2011. Insect Biochem Mol Biol 41:191-196
Karlson, P, CE Sekeris. 1962. Nature 195:183-184
Hintermann, E. et al., 1996. Proc Natl Acad Sci U S A 93:12315-12320
Amherd, R. et al., 2000. DNA Cell Biol 19:697-705
Bembenek, J. et al., 2005. Arch Insect Biochem Physiol 59:219-229
Tsugehara, T. et al., 2007. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 147:358-366
Dai, FY. et al., 2010. J Biol Chem 285:19553-19560
Brodbeck, D. et al., 1998. DNA Cell Biol 17:621-633
Zhan, S. et al., 2010. Development 137:4083-4090
Mehere, P. et al., 2011. Identification and characterization of two arylalkylamine N-acetyltransferases in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol.
Ichihara, N. et al., 1997. Insect Biochem Mol Biol 27:241-246.
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、昆虫の様々な発生段階において肉眼で識別可能であり、野生型個体にも適用可能であり、かつ、母性遺伝しない、遺伝子組換えマーカーを提供することにある。
カイコの幼虫のヒフには、w-1遺伝子が関わるオモクローム系色素の他に、メラニン色素が存在する。メラニンは昆虫の体表の主要な色素のグループの1つである。メラニンは昆虫のクチクラに存在し、黒や茶などの色を呈する。例えば、キイロショウジョウバエの腹部の着色(非特許文献１８)や、コクヌストモドキの鞘翅の茶色(非特許文献１９、２０)、ナミアゲハやキアゲハの幼虫の模様の黒色(非特許文献２１、２２)、カイコの幼虫の黒色の模様(非特許文献２３、２４)はメラニンであることが報告されている。メラニンはチロシンを前駆体として合成される。まず、チロシンが、チロシン水酸化酵素(Tyrosine Hydroxylase, TH)によりドーパ(Dopa)に変換され、Dopaはドーパ脱炭酸酵素（Dopa decarboxylase, DDC）によりドーパミンに変換される（図１）。ドーパミンが昆虫のメラニン合成の主要な基質であることが、多くの昆虫で報告されており、ドーパミンからドーパミンメラニンが合成される過程でyellow遺伝子やlaccase2遺伝子が関与することが示されている(非特許文献１９、２３、２５から２７)（図１）。
また、ebonyの作用により、ドーパミンがβ-アラニンと反応して合成されるN-β-alanyldopamine (NBAD)は、ショウジョウバエにおける黄色いメラニン(非特許文献２５)やナミアゲハの終齢幼虫の眼状紋における赤い色素の前駆体であることが報告されている(非特許文献２１)（図１）。この他、ドーパミンは、N-アセチル化されると、脱皮直後のヒフでクチクラたんぱく質を架橋してクチクラの形成に働くN-アセチルドーパミン(NADA)となることが報告されている(非特許文献２８)（図１）。ドーパミンなどをN-アセチル化する活性を持つ酵素はアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ(NAT)と呼ばれ、ショウジョウバエでは神経等での機能が解析されているものの、皮膚の着色に関与するかどうかは現時点でも不明である(非特許文献２９〜３２)。
最近、カイコのNAT遺伝子に変異がある系統melanism(mln)で、終齢幼虫の頭や尾部、成虫の翅の着色に異常が見られることが報告された(非特許文献３３、３５)。
しかしながら、他の部位やステージではmlnと野生型で表現型が異なるという報告はない。また、カイコのNAT遺伝子については、遺伝子組換えを利用した遺伝子機能の証明や、組換えマーカーとしての開発は行われていない。この遺伝子がコードする酵素を野生型個体において過剰発現させた場合に、この酵素がドーパミンメラニンの合成反応と競合してNADAを合成できるのか否か、そして、いかなる表現型を野生型個体にもたらすのかについては報告されておらず、予測することはできない。ショウジョウバエのNAT1遺伝子欠損ホモ個体は胚性致死であり(非特許文献３４)、NATは神経系においても機能すると考えられているため、強制発現により致死的影響を受けることも考えられる。
そこで、本発明者らは、昆虫の例としてカイコを選択し、カイコにおいて、NAT1遺伝子を全身で過剰発現する遺伝子組換え体を作出して、この遺伝子の機能を検証した。まず、GAL4/UAS系を利用してこの遺伝子を全身発現させるために、酵母の転写因子GAL4によって活性化されるUAS配列にNAT1遺伝子をつないだpiggyBacトランスポゾンベクターを持つ遺伝子組換えカイコを作出し、全身でGAL4を発現する遺伝子組換えカイコ（カイコの細胞質アクチンプロモーター領域に、酵母の転写因子であるGAL4を結合したpiggyBacトランスポゾンベクターを持つトランスジェニックカイコ）との交配を行った。その結果、孵化直後の一齢幼虫の体色が著しく薄くなることが判明した。一齢幼虫の体色が著しく薄いことは、孵化前の卵の段階でも判別できた。また、その他の齢の幼虫においても、ほとんどの系統は斑紋があるが、その斑紋等の色が薄くなることが判明した。さらに、成虫の触角においても色が薄くなることが判明した。これらの結果は、昆虫において、アルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現させた場合、その卵および体が薄色化することを初めて証明するものである。アルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性を持つ遺伝子は、様々な昆虫において知られているため（図１４〜１６、非特許文献２９〜３２、３６、３７）、本発明は広く昆虫に適用可能である。
すなわち、本発明は、昆虫の卵および体を薄色化させるための、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の利用、並びに、この薄色化を指標とした遺伝子組換え体の選抜などのための、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の利用に関し、より詳しくは以下の発明を提供するものである。
（１）昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含む、昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤。
（２）昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、薄色化された昆虫。
（３）（２）に記載の昆虫の卵、子孫またはクローン。
（４）卵および体が薄色化された昆虫の生産方法であって、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入することを特徴とする方法。
（５）昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価することを含む方法。
（６）遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価し、卵および／または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法。
本発明により、昆虫の卵および体の薄色化を誘導する活性を持つ遺伝子としてアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が同定された。アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いれば、昆虫の卵や眼の色を薄色化させることが可能であり、当該遺伝子は、遺伝子組換え体の選抜のためのマーカーとして好適に利用することができる。
チョウ目昆虫であるカイコにおける組換え個体の識別においては、従来EGFP等が主に利用されてきたが、蛍光を検出するために、眼や卵に着色のないw-1遺伝子に変異が入った系統(w-1変異系統)(非特許文献９)を用いる必要があった。また、識別に蛍光顕微鏡を必要とするため、蛍光顕微鏡を持たない施設での組換え個体の識別は行えず、分子生物学の専門教育を受けていない者が識別作業を行うことは問題であった。さらに、w-1変異系統を用いた場合でも、産卵後7日目にならないと組換え体の判別ができないが、産卵後9日目以降になると頭部が黒く着色されるため、組換え体の判別が困難であった。
本発明によれば、眼や卵に着色のない変異系統を用いることなく、卵、幼虫、成虫などの様々な発生段階で、かつ、蛍光顕微鏡を持たない施設において肉眼で、組換え個体の判別が可能になる。アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、優性マーカーとして機能するため、養蚕農家で飼育されているような実用品種などの野生型系統に適用することが可能となる。
アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、蛍光マーカーとの併用が可能であり、さらに蛍光マーカーの判別も容易になる。これは、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をw-1変異系統に適用した場合には、産卵後約9日目以降や孵化後の幼虫でも頭部着色が薄くなるためである。アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を野生型系統に適用した場合であっても、幼虫の段階においては、蛍光マーカーを判別することが可能である。従って、この組み合わせは、多重遺伝子組換えのマーカーとして優れている。
カイコの様々な突然変異体を用いた基礎研究において、遺伝子組換えにより原因遺伝子の機能証明する際には、従来は、数世代の交配によって個々の突然変異系統の個体にw-1変異を導入してから遺伝子組換え個体を作出する必要があったが、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いれば、このような変異導入は不要で、個々の突然変異系統に対して直接遺伝子組換えを行うことが可能になる。このため、解析に要する期間を大幅に短縮することができる。
＜昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤、並びに、卵および体が薄色化された昆虫、およびその生産方法＞
本発明における昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤は、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含むことを特徴とする。
本発明における昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤は、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含むことを特徴とする。
本発明において「昆虫の卵および体を薄色化させる活性」とは、典型的には、昆虫の卵の色、幼虫における体の全体、斑紋（例えば、半月紋や星状紋）若しくは気管の色、または成虫の触角の色を薄色化させる活性を意味する。薄色化される部位は、ドーパメラニンが蓄積する部位であれば、特に制限はない。「昆虫」としては、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAの導入により、その卵および体を薄色化させることができるものであれば特に制限はない。メラニン色素は幅広い昆虫に存在している。また、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAの存在は、広く昆虫において知られている（図１４〜１６）。従って、本発明が適用される昆虫としては、例えば、カイコなどのチョウ目昆虫、キイロショウジョウバエやネッタイシマカなどのハエ目昆虫、ワモンゴキブリなどのゴキブリ目昆虫が挙げられるが、これらに制限されない。
昆虫は、野生型系統であっても、変異系統（例えば、カイコにおけるw-1変異系統）であってもよい。このため、本発明は、実用品種を含む幅広い系統に適用できる点で有利である。
本発明において用いられる、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAとしては、特に制限はないが、例えば、カイコのアクセション番号NM_001079654.1で特定されるDNA（NAT1タンパク質をコードするDNA；非特許文献３２）やアクセション番号NM_001190842.1で特定されるDNA（NAT2タンパク質をコードするDNA）、キイロショウジョウバエのアクセション番号NM_206212.1で特定されるDNAやアクセション番号NM_135161.3で特定されるDNA（非特許文献２９、３０）、ネッタイシマカのアクセション番号XM_001661350.1で特定されるDNAやアクセション番号XM_001663072.1で特定されるDNA（非特許文献３６）、ワモンゴキブリのアクセション番号AB106562.1で特定されるDNA（非特許文献３１、３７）が挙げられる。
本発明においては、昆虫におけるアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性の発現と昆虫の卵および体の薄色化との相関関係が見出されたため、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性を持つタンパク質（すなわち、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ）をコードするDNAである限り、広く本発明に適用可能である。
なお、カイコにおけるアクセション番号NM_001079654.1で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：１に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。カイコのアクセション番号NM_001190842.1で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：３に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。キイロショウジョウバエのアクセション番号NM_206212.1で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：５に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。キイロショウジョウバエのアクセション番号NM_135161.3で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：７に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。ネッタイシマカのアクセション番号XM_001661350.1で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：９に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。ネッタイシマカのアクセション番号XM_001663072.1で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：１１に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。ワモンゴキブリのアクセション番号AB106562.1で特定されるDNAの塩基配列を配列番号：１３に、このDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。
現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の昆虫におけるアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列は異なるが、同様の活性を有するタンパク質をコードするDNAを取得することが可能である。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明において用いるDNAは、これら特定の昆虫におけるアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４）において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。ここで「複数」とは、改変後のタンパク質がアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性を維持する範囲における、アミノ酸の改変数であり、通常、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内、2アミノ酸）である。
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の昆虫からアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が得られた場合、そのDNAの塩基配列情報を利用して、同一または他の昆虫から、同様の活性を有するタンパク質をコードするDNAを取得することが可能である。従って、本発明において用いるDNAは、特定の昆虫におけるアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３）とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。
こうして得られた変異遺伝子や相同遺伝子をコードするDNAが、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、文献（非特許文献２９〜３２、３６、３７）に記載の方法によって判定することができる。
なお、上記した変異遺伝子をコードするDNAを作製するための、DNAへの人為的な変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発（site-directed mutagenesis）法（Kramer, W. ＆ Fritz, HJ., Methods Enzymol, 154:350-367, 1987）により行うことができる。
また、上記した相同遺伝子をコードするDNAを単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, 98:503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K., et al. Science, 230:1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Science, 239:487-491, 1988）が挙げられる。相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離されたDNAは、核酸レベルあるいはアミノ酸配列レベルにおいて、少なくとも50％以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993)に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
本発明において用いられるアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAとしては、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、カイコからゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、フォスミド、BAC、PACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３に記載のDNA）の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、アリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、鱗翅目昆虫から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
本発明における昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤において、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、ベクターに挿入されている形態であってもよい。ベクターとしては、例えば、染色体中に遺伝子導入可能なベクターまたは自律複製可能なベクターを使用することができる。
カイコ卵に対してDNAの導入を行う場合、例えば、トランスポゾンベクターを利用してカイコの発生初期卵へ注射する方法（Tamura,T. et al., (2000) Nature Biotechnology 18:81-84）を利用することができる。例えば、トランスポゾンの逆位末端反復配列（Handler AM. et al.,（1998） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95（13）:7520-5）の間に上記DNAを挿入したベクターとともに、トランスポゾン転移酵素をコードするDNAを有するベクター（ヘルパーベクター）をカイコ卵に導入する。ヘルパーベクターとしては、pHA3PIG（Tamura,T. et al., (2000) Nature Biotechnology 18, 81-84）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明に用いるトランスポゾンとしては、piggyBacが好ましいが、これに限定されるものではなく、マリーナ（mariner）、ミノス（Minos）等を用いることもできる（Shimizu,K. et al., （2000） Insect Mol. Biol., 9, 277-281；Wang W. et al.,（2000） Insect Mol Biol 9（2）:145-55）。また、本発明では、バキュロウイルスベクターを使用することも可能である（Yamao, M. et al., (1999) Genes Dev 13:511-516）。昆虫の細胞にベクターを導入する場合、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
ベクターに用いるプロモーターとしては、例えば、昆虫の全身での発現を誘導するアクチンプロモーター、AcNPVのhr5-IE1プロモーターなどが挙げられる。
一旦、染色体内に上記DNAが導入された昆虫が得られれば、該昆虫から、卵、子孫、あるいはクローンを得て、それらを基に昆虫を繁殖させることも可能である。
従って、本発明は、上記昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、薄色化された昆虫、並びに、その卵、子孫およびクローンをも提供するものである。また、本発明は、上記昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入することを特徴とする、卵および体が薄色化された昆虫の生産方法をも提供するものである。
昆虫に、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAに加えて、遺伝子組換えを行いたい任意のDNAを導入する場合、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、任意のDNAによる遺伝子組換え体を選抜するためのマーカーとして利用することができる。
＜昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法、遺伝子組換え昆虫の生産方法＞
従って、本発明は、昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価することを含む方法を提供するものである。また、本発明は、遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価し、卵および／または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法をも提供するものである。
＜昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法、遺伝子組換え昆虫の生産方法＞
従って、本発明は、昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価することを含む方法を提供するものである。また、本発明は、遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価し、卵および／または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法をも提供するものである。
昆虫に導入する「任意のDNA」としては、特に制限はない。例えば、医薬品や検査薬の原料となる有用タンパク質をコードするDNA、高機能シルクの生産に有用な蛋白質をコードするDNA、ヒトの病態のモデルを作製するために有用なDNAが挙げられる。任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、一つのベクターに配置して昆虫に導入することが好ましいが、それぞれを異なるベクターに配置して導入することも可能である。任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAは、ベクター上では、昆虫において発現を保証するプロモーター（例えば、アクチンプロモーター）に発現可能に連結されている。
任意のDNAと上記の昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、該DNAが発現している昆虫は、その卵および体が薄色化する。従って、昆虫の卵および体の薄色化を指標に、遺伝子組換え昆虫を評価し、選抜することが可能である。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例における実験材料と方法は、下記の通りである。
（１）カイコの飼育
カイコは人工飼料（日本農産工業）で25〜27度で飼育した。トランスジェニックカイコの作成に用いたw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。トランスジェニックカイコの交配相手であるActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2(Imamura, M. et al., 2003. Genetics 165:1329-1340、Uchino, K. et al., 2006. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97)を保持する系統と、黒縞系統は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。
カイコは人工飼料（日本農産工業）で25〜27度で飼育した。トランスジェニックカイコの作成に用いたw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。トランスジェニックカイコの交配相手であるActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2(Imamura, M. et al., 2003. Genetics 165:1329-1340、Uchino, K. et al., 2006. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97)を保持する系統と、黒縞系統は農業生物資源研究所で累代飼育されたものである。
（２）pBacUAS-NAT1/3xP3-EGFPベクターの作成
NAT遺伝子はカイコ蛹期翅から作成したESTライブラリーよりpBacMCS-UAS-BlnI-Kozak-BmNAT1-ORF-sプライマー(5’-GCCTAGTAGACCTAGAAAAATCAAAATGGCTGTTACAAGTACAAGAGGC-3’／配列番号：１５)とpBacMCS-UAS-BlnI-BmNAT1-ORF-aプライマー(5’-GTATGGCTGACCTAGTTACAGCTCCTTAATGTAGACCCTG-3’／配列番号：１６)とPhusion Hot Start II High-Fidelity DNA polymerase(New England Biolabs)を用いて増幅した。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、0.9kbの断片をQiaquick gel extraction kit(Qiagen)を用いて、切り出し、精製を行った。NAT1のORFの配列は、GenBank accession no. DQ256382と同一である。この断片を、In-fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、pBacUASMCS-3xP3-EGFPベクターのBlnIサイトにサブクローニングした。完成したプラスミドの配列はABI3130xl(Applied Biosystems)を用いたシークエンシングにより確認した。
NAT遺伝子はカイコ蛹期翅から作成したESTライブラリーよりpBacMCS-UAS-BlnI-Kozak-BmNAT1-ORF-sプライマー(5’-GCCTAGTAGACCTAGAAAAATCAAAATGGCTGTTACAAGTACAAGAGGC-3’／配列番号：１５)とpBacMCS-UAS-BlnI-BmNAT1-ORF-aプライマー(5’-GTATGGCTGACCTAGTTACAGCTCCTTAATGTAGACCCTG-3’／配列番号：１６)とPhusion Hot Start II High-Fidelity DNA polymerase(New England Biolabs)を用いて増幅した。増幅産物についてアガロースゲル電気泳動を行い、0.9kbの断片をQiaquick gel extraction kit(Qiagen)を用いて、切り出し、精製を行った。NAT1のORFの配列は、GenBank accession no. DQ256382と同一である。この断片を、In-fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、pBacUASMCS-3xP3-EGFPベクターのBlnIサイトにサブクローニングした。完成したプラスミドの配列はABI3130xl(Applied Biosystems)を用いたシークエンシングにより確認した。
（３）トランスジェニックカイコの作成
トランスジェニックカイコの作成は、Tamuraらの方法（非特許文献１）と同様の方法で行った。pBacUAS-NAT1/3xP3-EGFPと、ヘルパープラスミドpHA3PIGを5mM KCl 0.5mM リン酸バッファー（pH7.0）にそれぞれ400ng/μl、200ng/μlになるように調整した。この混合溶液を、産下後3.5〜8時間のw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）の卵に注入した。遺伝子組換え体の選抜はG1世代の卵でEGFPの蛍光を用いて蛍光顕微鏡(オリンパス)を用いて行った。樹立したUAS-NAT1/3xP3-EGFP系統の雄蛾とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2系統の雌蛾を交配し、生まれた卵をEGFPとDsRed2の蛍光を用いてスクリーニングを行った。
トランスジェニックカイコの作成は、Tamuraらの方法（非特許文献１）と同様の方法で行った。pBacUAS-NAT1/3xP3-EGFPと、ヘルパープラスミドpHA3PIGを5mM KCl 0.5mM リン酸バッファー（pH7.0）にそれぞれ400ng/μl、200ng/μlになるように調整した。この混合溶液を、産下後3.5〜8時間のw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）の卵に注入した。遺伝子組換え体の選抜はG1世代の卵でEGFPの蛍光を用いて蛍光顕微鏡(オリンパス)を用いて行った。樹立したUAS-NAT1/3xP3-EGFP系統の雄蛾とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2系統の雌蛾を交配し、生まれた卵をEGFPとDsRed2の蛍光を用いてスクリーニングを行った。
（４）カイコの観察
蛍光顕微鏡（ライカ）を用いて観察した。
蛍光顕微鏡（ライカ）を用いて観察した。
（５）解剖
1xPTU（フェニルチオ尿素）/PBS中で解剖した。
1xPTU（フェニルチオ尿素）/PBS中で解剖した。
[実施例１] NAT1遺伝子を強制発現させたカイコの1齢幼虫の表現型の解析
NAT1遺伝子をカイコ1齢幼虫のヒフで強制発現させるために、Gal4/UASシステム(Fischer, JA. et al., 1988. Nature 332:853-856)を用いた。UASの下流にカイコのNAT1遺伝子のORFの全長をつないだものと、眼での遺伝子発現を誘導する3xP3プロモーターにEGFPをつないだもの2種類をpiggyBac転移因子の認識配列（ITR）の間に組み込んだプラスミドを作成し（図２）、これをw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）の卵に微小注射することで、UAS-NAT1/3xP3-EGFPを持つカイコの系統を作成した。UAS-NAT1の有無は、眼のEGFPの蛍光で識別した。次に、全身でGal4の発現が観察されるActin A3プロモーター-Gal4/3xP3-DsRed2（以下、「Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2」と称する）トランスジェニック系統(Imamura, M. et al., 2003. Genetics 165:1329-1340、Uchino, K. et al., 2006. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97)(図２)の蛾をUAS-NAT1/3xP3-EGFPの蛾と交配した。産下後7日目の時期に、UAS-NAT1とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。EGFPのみや、DsRed2のみの個体では、NAT1は強制発現されないが、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる個体では、NAT1が全身で強制発現されていると考えられる。
NAT1遺伝子をカイコ1齢幼虫のヒフで強制発現させるために、Gal4/UASシステム(Fischer, JA. et al., 1988. Nature 332:853-856)を用いた。UASの下流にカイコのNAT1遺伝子のORFの全長をつないだものと、眼での遺伝子発現を誘導する3xP3プロモーターにEGFPをつないだもの2種類をpiggyBac転移因子の認識配列（ITR）の間に組み込んだプラスミドを作成し（図２）、これをw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）の卵に微小注射することで、UAS-NAT1/3xP3-EGFPを持つカイコの系統を作成した。UAS-NAT1の有無は、眼のEGFPの蛍光で識別した。次に、全身でGal4の発現が観察されるActin A3プロモーター-Gal4/3xP3-DsRed2（以下、「Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2」と称する）トランスジェニック系統(Imamura, M. et al., 2003. Genetics 165:1329-1340、Uchino, K. et al., 2006. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97)(図２)の蛾をUAS-NAT1/3xP3-EGFPの蛾と交配した。産下後7日目の時期に、UAS-NAT1とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。EGFPのみや、DsRed2のみの個体では、NAT1は強制発現されないが、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる個体では、NAT1が全身で強制発現されていると考えられる。
対照区では産下後9〜10日目では、幼虫の体も着色し、卵全体が灰色にみえるが、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる区でのみ、その着色が薄い茶色であった。孵化した幼虫を観察すると、対照区のw-1;pnd系統（w-1遺伝子と休眠遺伝子に変異が入った系統）は頭及び体の着色が黒であるのに対し、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められる区では、明るい茶色であった（図３）。すなわち、NAT1の強制発現によりカイコの1齢幼虫の体色が薄くなることが明らかとなった。このことは、カイコの1齢幼虫の体表のクチクラおよび頭にはドーパミンメラニンが含有されていることを示唆している。興味深いことに、頭の色が薄くなったためか、幼虫の眼の蛍光が見やすくなった（図３、DsRed2の写真）。また、孵化までの時点で、EGFPのみ、DsRed2のみの個体と比べても、死亡率の高さは特に認められなかった。さらに、w-1遺伝子が正常に働いており、オモクローム系の色素が正常に合成される系統(1齢幼虫の頭が黒で体色が濃い茶色の系統)においても、NAT1を強制発現させると、1齢幼虫の頭が薄い茶色に、体色が赤褐色になったことから（図４）、実用系統など、他の様々な系統でNAT1の強制発現が1齢幼虫の体色を変化させることが可能であると考えられる。NAT1はActin A3プロモーターの機能により発現が制御されているため、Actin A3プロモーターとNAT1を繋げれば、肉眼で遺伝子組換え個体を判別するためのマーカーとして非常に有用であると考えられる。
[実施例２] NAT1遺伝子を強制発現させた黒縞系統の幼虫の表現型の解析
カイコの2齢幼虫以降の体色の大部分は尿酸からなる白であり、部分的にメラニン色素やオモクローム系色素からなる着色が見られる。この着色は系統により異なるが、NAT1の強制発現に用いた系統は、元々紋様が薄い系統であった。そこで、NAT1強制発現により幼虫のメラニン色素の色が変化するかを明確に調べるために、Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2とUAS-NAT1/3xP3-EGFPの両方を持つ個体と、黒縞遺伝子をホモで持つ個体（pS/pS）を交配し（図５）、産まれた卵をUAS-NAT1とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。オス親は、pS(黒縞)遺伝子をホモで持っており、メス親は持っていないため、F1はすべてpS(黒縞)遺伝子座をヘテロで保持し（pS/+pS）、体表に太い黒の縞模様が現れる。この黒の縞模様にNAT1の強制発現が与える影響を観察したところ、3〜4齢幼虫では、黒の縞模様が茶褐色〜黄褐色を呈していた（図６〜８）。縞の体の側面の部分の色の体色が顕著に薄くなっており、半月紋や星状紋がオレンジ色になっていた。特に、体の側面や半月紋、星状紋の体色が顕著に変化していた。5齢幼虫も、全体的に色が薄くなっており、さらに、眼状紋の着色部位が狭くなっていた（図９〜１０）。半月紋と星状紋で顕著に着色部位が減少しており、紋様自体の変化を引き起こした（図１０）。以上より、pS(黒縞)遺伝子座を持つ個体の幼虫では、NAT1の影響がより顕著にみられ、遺伝子組換え体を容易に判別可能であることが判明した。
カイコの2齢幼虫以降の体色の大部分は尿酸からなる白であり、部分的にメラニン色素やオモクローム系色素からなる着色が見られる。この着色は系統により異なるが、NAT1の強制発現に用いた系統は、元々紋様が薄い系統であった。そこで、NAT1強制発現により幼虫のメラニン色素の色が変化するかを明確に調べるために、Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2とUAS-NAT1/3xP3-EGFPの両方を持つ個体と、黒縞遺伝子をホモで持つ個体（pS/pS）を交配し（図５）、産まれた卵をUAS-NAT1とActin A3-Gal4/3xP3-DsRed2の有無を、眼のEGFPとDsRed2の蛍光でスクリーニングし、EGFPのみ、DsRed2のみ、EGFPとDsRed2両方の蛍光が認められるものをそれぞれ選抜した。オス親は、pS(黒縞)遺伝子をホモで持っており、メス親は持っていないため、F1はすべてpS(黒縞)遺伝子座をヘテロで保持し（pS/+pS）、体表に太い黒の縞模様が現れる。この黒の縞模様にNAT1の強制発現が与える影響を観察したところ、3〜4齢幼虫では、黒の縞模様が茶褐色〜黄褐色を呈していた（図６〜８）。縞の体の側面の部分の色の体色が顕著に薄くなっており、半月紋や星状紋がオレンジ色になっていた。特に、体の側面や半月紋、星状紋の体色が顕著に変化していた。5齢幼虫も、全体的に色が薄くなっており、さらに、眼状紋の着色部位が狭くなっていた（図９〜１０）。半月紋と星状紋で顕著に着色部位が減少しており、紋様自体の変化を引き起こした（図１０）。以上より、pS(黒縞)遺伝子座を持つ個体の幼虫では、NAT1の影響がより顕著にみられ、遺伝子組換え体を容易に判別可能であることが判明した。
[実施例３] NAT1を強制発現させた幼虫の気管の表現型の解析
カイコの幼虫の気管は通常黒っぽい色をしている。NAT1を強制発現させたカイコの5齢3日目の幼虫を解剖し、気管を観察した。その結果、NAT1強制発現カイコは気管が薄い金色であった（図１１）。
カイコの幼虫の気管は通常黒っぽい色をしている。NAT1を強制発現させたカイコの5齢3日目の幼虫を解剖し、気管を観察した。その結果、NAT1強制発現カイコは気管が薄い金色であった（図１１）。
[実施例４] NAT1を強制発現させたカイコの成虫の触角の表現型の解析
NAT1を強制発現させたカイコを飼育し、その成虫を観察したところ、鱗粉や体毛の色には変化は認められなかったが、触角の色が対照区では通常濃い茶色であるのに対し、NAT1を強制発現させたカイコの触角は黄色に近い茶色になることが判明した（図１２、１３）。この形質は、UAS-NAT1/3xP3-EGFPのみ持つ個体や、Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2のみの個体では認められなかった。このことから、カイコの成虫の触角にも、ドーパミンメラニンが含有されていることが示唆される。また、成虫まで飼育する間、EGFPのみ、DsRed2のみの個体と比べても、死亡率の高さは特に認められなかった。
NAT1を強制発現させたカイコを飼育し、その成虫を観察したところ、鱗粉や体毛の色には変化は認められなかったが、触角の色が対照区では通常濃い茶色であるのに対し、NAT1を強制発現させたカイコの触角は黄色に近い茶色になることが判明した（図１２、１３）。この形質は、UAS-NAT1/3xP3-EGFPのみ持つ個体や、Actin A3-Gal4/3xP3-DsRed2のみの個体では認められなかった。このことから、カイコの成虫の触角にも、ドーパミンメラニンが含有されていることが示唆される。また、成虫まで飼育する間、EGFPのみ、DsRed2のみの個体と比べても、死亡率の高さは特に認められなかった。
本発明によって見出されたアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、昆虫の卵および体の薄色化させる活性を有するため、遺伝子組換え体の選抜のためのマーカーとして好適に利用することができる。本発明によれば、実用系統も含めた幅広い系統において、効率的に遺伝子組換え体を生産することができる。従って、本発明は、昆虫における有用タンパク質生産やカイコにおける高機能シルク生産、昆虫におけるヒト病態モデルの作製などの幅広い実用化に大きく貢献しうるものである。
配列番号15〜16<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
Claims (6)
- 昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを含む、昆虫の卵および体を薄色化させるための薬剤。
- 昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAが導入され、薄色化された昆虫。
- 請求項２に記載の昆虫の卵、子孫またはクローン。
- 卵および体が薄色化された昆虫の生産方法であって、昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入することを特徴とする方法。
- 昆虫が遺伝子組換えされているか否かを判定する方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価することを含む方法。
- 遺伝子組換え昆虫の生産方法であって、任意のDNAと昆虫のアリールアルキルアミン-N-アセチルトランスフェラーゼをコードするDNAを昆虫に導入し、当該昆虫の卵および／または体の薄色化を評価し、卵および／または体が薄色化した個体を選抜することを含む方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011139217A JP5794620B2 (ja) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | アリールアルキルアミン−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011139217A JP5794620B2 (ja) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | アリールアルキルアミン−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013005740A true JP2013005740A (ja) | 2013-01-10 |
| JP5794620B2 JP5794620B2 (ja) | 2015-10-14 |
Family
ID=47673685
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011139217A Active JP5794620B2 (ja) | 2011-06-23 | 2011-06-23 | アリールアルキルアミン−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5794620B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015136300A (ja) * | 2014-01-20 | 2015-07-30 | 株式会社ゲノム創薬研究所 | ヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックカイコ、該トランスジェニックカイコを用いた評価方法、スクリーニング方法及び薬剤製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005143428A (ja) * | 2003-11-18 | 2005-06-09 | National Institute Of Agrobiological Sciences | カイコのキヌレニン酸化酵素遺伝子をコードするｄｎａの利用 |
-
2011
- 2011-06-23 JP JP2011139217A patent/JP5794620B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005143428A (ja) * | 2003-11-18 | 2005-06-09 | National Institute Of Agrobiological Sciences | カイコのキヌレニン酸化酵素遺伝子をコードするｄｎａの利用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JPN6015018000; Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２０１０， Ｖｏｌ． ２８５， Ｎｏ． ２５， ｐｐ． １９５５３-１９５６０ * |
| JPN6015018002; Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０１０， Ｖｏｌ． １３７， ｐｐ． ４０８３-４０９０ * |
| JPN6015018005; Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ２０１１， Ｖｏｌ． ２８， Ｎｏ． ６， ｐｐ． １７８５-１７９９ * |
| JPN6015018007; ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２０１２， Ｖｏｌ． １３， Ｎｏ． ２８８ * |
| JPN6015018010; Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２０１２， Ｖｏｌ． ３， Ｎｏ． １２９５ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015136300A (ja) * | 2014-01-20 | 2015-07-30 | 株式会社ゲノム創薬研究所 | ヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックカイコ、該トランスジェニックカイコを用いた評価方法、スクリーニング方法及び薬剤製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5794620B2 (ja) | 2015-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6380458B1 (en) | Cell-lineage specific expression in transgenic zebrafish | |
| Wittkopp et al. | Evolution of yellow gene regulation and pigmentation in Drosophila | |
| Di Donato et al. | 2C-Cas9: a versatile tool for clonal analysis of gene function | |
| Fujii et al. | Transgenic analysis of the BmBLOS2 gene that governs the translucency of the larval integument of the silkworm, Bombyx mori | |
| Shim et al. | Distinct and redundant functions of μ1 medium chains of the AP-1 clathrin-associated protein complex in the nematode Caenorhabditis elegans | |
| Yoda et al. | The transcription factor Apontic-like controls diverse colouration pattern in caterpillars | |
| JP6497605B2 (ja) | 雌蚕致死カイコ系統 | |
| Heinrich et al. | Germ‐line transformation of the Australian sheep blowfly Lucilia cuprina | |
| Quan et al. | Characterization of the kynurenine 3-monooxygenase gene corresponding to the white egg 1 mutant in the silkworm Bombyx mori | |
| KR20170012551A (ko) | 유전자 발현 시스템 | |
| JP2001218588A (ja) | トランスポゾン転移酵素および遺伝子改変方法 | |
| EP1885856A1 (en) | Transposition of maize ac/ds elements in vertebrates | |
| JP5794620B2 (ja) | アリールアルキルアミン−ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子とその利用 | |
| Wu et al. | The BTB-ZF gene Bm-mamo regulates pigmentation in silkworm caterpillars | |
| JP5997772B2 (ja) | カイコフィブロイン重鎖遺伝子の突然変異配列、及び突然変異を誘発する方法と応用 | |
| Sun et al. | Ebony plays an important role in egg hatching and 30k protein expression of silkworm (Bombyx mori) | |
| JP4431739B2 (ja) | カイコのキヌレニン酸化酵素遺伝子をコードするｄｎａの利用 | |
| IL302942A (en) | Genetically edited tilapia germ lines | |
| CN114457121A (zh) | 一种利用BmYki及其异构体定向抑制家蚕丝素基因的转基因方法及其家蚕品种 | |
| JP6436908B2 (ja) | 外因性遺伝子発現ベクター、形質転換体判別マーカー及び形質転換体 | |
| Zhang et al. | The regulation of retina specific expression of rhodopsin gene in vertebrates | |
| JP5780631B2 (ja) | カイコの卵および眼の着色に関与する遺伝子およびその利用 | |
| Salvemini et al. | A new Minos vector for eye‐specific expression of white+ marker in Ceratitis capitata and in distantly related dipteran species | |
| JP4353754B2 (ja) | 昆虫への遺伝子導入ベクターおよび遺伝子産物製造法 | |
| CN105063088B (zh) | 一种生态安全型转基因荧光观赏鱼的研制方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140327 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150508 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150707 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150730 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150806 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5794620 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |