JP2001218588A - トランスポゾン転移酵素および遺伝子改変方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 メダカトランスポゾン様因子にコードされて
いる新規な蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド
の提供。また、当該蛋白質を用いて細胞、好ましくは脊
椎動物の遺伝子構造を改変する方法、それによる細胞機
能を改変する方法、及びその細胞の提供。さらに、遺伝
子の転移に必要なシスエレメント構造を解明、提供す
る。 【解決手段】 特定のアミノ酸配列、又はその類似アミ
ノ酸配列を有するトランポザーゼ様活性を有する蛋白
質、前記の蛋白質からなるトランスポゾン転移酵素。ま
た、前記の蛋白質をコードする特定の塩基配列を有する
ＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡにハイブリダイズし得るＤＮ
Ａ、又は対応するＲＮＡ。さらに、当該蛋白質又はこれ
を産生し得る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の一部を
切り出し又は切り出して他の箇所に挿入することからな
る遺伝子構造を改変させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、トランスポザーゼ
様活性を有する新規な蛋白質、当該蛋白質からなるトラ
ンスポゾン転移酵素、これを用いた細胞内の遺伝子の遺
伝子構造を改変させる方法、この方法による細胞の機能
を改変させる方法、この方法による遺伝子の導入方法、
このためのプラスミド、及びこの方法により機能が改変
された細胞に関する。

【０００２】

【従来の技術】メダカ（Oryzias latipes）は東アジア
に生息する魚であり、脊椎動物の遺伝の研究に使用され
てきた。メダカのｉ遺伝子座の変異は、メラニン欠乏症
及び赤目を生じさせる。このｉ遺伝子座はチロシナーゼ
の遺伝子をコードしていることが知られている。このｉ
遺伝子座のアレル変異体のひとつであるｉ^４から約４．
７ｋｂのＤＮＡがクローニングされ、トランスポゾン様
の配列を有しているとされていた。即ち、ショウジョウ
バエのｈｏｂｏ、トウモロコシの実のＡｃやキンギョソ
ウのＴａｍ３などのｈＡＴファミリーのトランスポゾン
のトランスポザーゼ（transposases）に類似したオープ
ンリーディイングフレームや短い逆転した配列の繰り返
し（terminal inverted repeats）を有していた。メダ
カのこのエレメントは、Ｔｏｌ２と命名された。実験室
で使用されるメダカは、一倍体（haploid）のゲノム当
たり約１０コピー有している。チロシナーゼの遺伝子座
に存在したＴｏｌ２エレメントは、ｉ^４変異体の魚では
胚発生の間に標的遺伝子座から切り出されることがＰＣ
Ｒにより示された（Koga等、1996）。

【０００３】一方、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）
もメダカ（Oryzias latipes）と同様に小型の硬骨魚で
あり、脊椎動物の遺伝現象及び発生の研究のためのモデ
ル動物として開発されてきた（Takeuchi, 1996 ; Yamam
oto, 1967 ; Streisinger 等、1981）。ゼブラフィッシ
ュにおいては、大量の化学的突然変異誘発スクリーンが
行なわれ（Driever等、1996 ; Haffter 等、1996）、突
然変異した遺伝子のクローニングを容易にするため、シ
ュードタイプ（pseudotyped）のレトロウィルスを用い
た挿入突然変異誘発法が開発され実行されてきた（Line
等、1994 ; Gaiano等、1996 ; Amsterdam等、1997）。
また、エンハンサートラップ及び遺伝子トラップスクリ
ーンが行なわれるようにするトランスポゾン技術の開発
の試みの中で、魚類におけるTcl／marinierファミリー
のトランスポゾンの転位が調べられ、明らかにされてき
た（Ivics等、1997 ; Raz等、1997 ; Fadool等、199
8）。これらの結果は励みになるものではあるが、トラ
ンスポゾンを用いた非常に効率のよいトランスジェネシ
ス又は挿入突然変異誘発法はまだ開発されていない。

【０００４】本発明者らは、Ｔｏｌ２因子を用いた新規
なトランスポゾン技術の開発に興味をもってきた。この
目標に向かう最初のステップとして、本発明者らはゼブ
ラフィッシュ胚を用いて、ゼブラフィッシュの受精卵
に、Ｔｏｌ２因子を含んでいるプラスミドＤＮＡを注入
する一過性胚エクシジョンアッセイを開発し、注入され
たプラスミドからＴｏｌ２因子を切り出すことができる
ことを示し、Ｔｏｌ２因子が自律的なメンバーでありか
つゼブラフィッシュにおいても活性があることを示した
（Kawakami等、(1998) Gene 225, 17-22）。Ｔｏｌ２因
子のＤＮＡ配列はｈＡＴファミリーのトランスポゾンの
トランスポザーゼと類似しているが、活性のあるトラン
スに機能することができる酵素も、切り出し反応に必須
なシスエレメントも同定されていない。Ｔｏｌ２因子を
トランスジェネシス及び挿入突然変異誘発に有用な道具
とするためには、シス及びトランスの必要条件を細かく
調べ、特性を明らかにしなければならない。Ｔｏｌ２因
子によってコードされている活性のあるトランスポザー
ゼはまだ同定されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、第一にゼブ
ラフィッシュ胚に注入されたＴｏｌ２因子から転写され
たｍＲＮＡを同定することを目的とする。次いで、この
転写物が活性のある酵素をコード化しているかどうかを
調べるため、ゼブラフィッシュ受精卵に、Ｔｏｌ２ｃＤ
ＮＡを鋳型として用いて試験管内で合成されたＲＮＡ
と、トランスポザーゼをコード化している領域に欠失を
もつ非自律的Ｔｏｌ２因子を含んでいるプラスミドＤＮ
Ａとをコインジェクトする新規な分析法を開発する。ま
た、本発明は、ゼブラフィッシュにおけるＴｏｌ２因子
の切り出しに機能する、活性のあるトランス因子及び必
須なシスエレメントを同定する。

【０００６】したがって、本発明は、Ｔｏｌ２因子にコ
ードされている新規な蛋白質、それをコードするポリヌ
クレオチドを提供するものである。また、本発明は、当
該蛋白質を用いて細胞、好ましくは脊椎動物の遺伝子構
造を改変する方法、遺伝子構造の改変による細胞機能を
改変する方法、これらの方法により機能が改変された細
胞を提供するものである。さらに、本発明は遺伝子の転
移に必要なシスエレメント構造を解明し、これを提供す
るものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号２に示されるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸の一
部が置換され若しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加
していてもよいアミノ酸配列を有するトランポザーゼ様
活性を有する蛋白質に関する。また、前記の蛋白質から
なるトランスポゾン転移酵素に関する。また、本発明
は、前記の蛋白質をコードする核酸、好ましくは配列表
の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ若しく
は当該ＤＮＡにハイブリダイズし得るＤＮＡ、又は対応
するＲＮＡに関する。

【０００８】本発明は、前記の蛋白質がトランスポゾン
を転移させるトランスポザーゼ様活性を有していること
明らかにし、当該蛋白質又は当該蛋白質を産生し得る核
酸の存在下で、細胞内、好ましくは脊椎動物の細胞内の
遺伝子の一部を切り出し又は切り出して他の箇所に挿入
することからなる遺伝子構造を改変させる方法に関す
る。当該切り出される遺伝子の一部の塩基配列の上流
に、少なくとも１回の逆方向反復配列（inverted repea
ts(Angel エレメント)）を含む塩基配列を有する遺伝子
であることが好ましい。また、本発明は、前記の方法を
用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法、及
び細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法に関
し、さらに本発明は、これらの方法により機能が改変さ
れた細胞に関する。そして、本発明は、これらの方法に
使用されるプラスミド、より詳細には塩基配列の上流
に、少なくとも１回の逆方向反復配列を含む塩基配列を
有するＤＮＡを含有してなるプラスミドにも関する。さ
らに、本発明は、脊椎動物のゲノムＤＮＡ中に、他の遺
伝子を挿入する方法において、トランスポザースを用い
て自律的に当該挿入を行うことを特徴とする脊椎動物の
ゲノムＤＮＡ中に他の遺伝子を挿入する方法、好ましく
は他の遺伝子がＴｏｌ２エレメントであり、脊椎動物
が、魚類である前記方法に関する。

【０００９】先に本発明者らは、チロシナーゼ遺伝子座
からクローン化したＴｏｌ２因子を含んでいるプラスミ
ドであるＴｏｌ２−ｔｙｒプラスミドをゼブラフィッシ
ュ受精卵に注入し、注入したプラスミドＤＮＡからＴｏ
ｌ２因子を切り出すことができることを示した（Kawaka
mi等、1998）。推定上のトランスポザーゼ活性をコード
化している転写物を同定するため、Ｔｏｌ２−ｔｙｒプ
ラスミドを注入した胚から全ＲＮＡを調製した。筆者等
はまず、Ｔｏｌ２配列の別の部分とアニールする、重な
りのある４対のプライマーを用いて３’ＲＡＣＥを行な
った。3’ＲＡＣＥを行なうために用いられたとなり同
士の前向きのプライマーは： Ｔｏｌ２ｆ２ ； 5' - TTGGTCAGACATGTTCATTG - 3'
と Ｔｏｌ２ｆ３ ； 5' - ATGTTCATTGGTCCTTTGGA -
3'、 Ｔｏｌ２ｆ４ ； 5' - ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC - 3'
と Ｔｏｌ２ｆ５ ； 5' - CTGCTCTGATCATGAAACAG -
3'、 Ｔｏｌ２ｆ８ ； 5' - GCTTAATAAAGAAATATCGGCC -
3'と Ｔｏｌ２ｆ９ ； 5' - AATATCGGCCTTCAAAAGTTCG -
3'、並びに Ｔｏｌ２ｆ１２ ； 5' - CTGTAATCAGAGAGTGTATGTGTA -
3'と Ｔｏｌ２ｆ１３ ； 5' - ATTGTTACATTTATTGCATACAAT -
3'である。

【００１０】ポリアデニル化されたｃＤＮＡはＴｏｌ２
ｆ８とＴｏｌ２ｆ９、及びＴｏｌ２ｆ４とＴｏｌ２ｆ５
を用いた３’ＲＡＣＥではうまく増幅されたが、Ｔｏｌ
２ｆ２とＴｏｌ２ｆ３、及びＴｏｌ２ｆ１２とＴｏｌ２
ｆ１３を用いた３’ＲＡＣＥではそうではなかった。次
いで、５’ＲＡＣＥを行なうために用いられた重なりの
ある逆向きの次のプライマー： Ｔｏｌ２ｒ４ ； 5' - CTCAATATGCTTCCTTAGG - 3'と Ｔｏｌ２ｒ５ ； 5' - CTTCCTTAGGTTTGATGGCG - 3' を用いた５’ＲＡＣＥを行ない、２１５６個のヌクレオ
チドから成る完全な長さのＴｏｌ２転写物を同定した
（図１）。

【００１１】得られたｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配
列番号１に示す。図１は、Ｔｏｌ２プラスミド及びその
転写物の構造を示す。図１の最上段は完全な長さのＴｏ
ｌ２因子（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）である。図の破線部分
は、イントロンである。一番目のイントロンにある逆向
きの反復（Ａｎｇｅｌ因子）と、前記したプライマーの
位置とを矢印で示す。その下の段は、３’ＲＡＣＥの結
果を示し、その下の段は５’ＲＡＣＥの結果を示す。い
ずれの場合も、イントロン部分は破線で示されている。
その下の段にこれらの結果から得られた全長のｍＲＮＡ
の構造を示す。翻訳領域は、配列番号１のｃＤＮＡの塩
基配列の８５番目（ＡＴＧ）から２０３２（ＴＡＧ）に
相当している。図１の下から１段目と２段目は、欠失変
異株の（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶ及び（Ｔｏｌ２−ｔ
ｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶの構造を示している。

【００１２】５’ＲＡＣＥ分析では、プラスミド配列か
らスタートし、Ｔｏｌ２因子の一番目のエクソン内の通
常では機能しないスプライスアクセプター(cryptic spl
iceacceptor）部位へジャンプした異常な転写物も見つ
かった（データは示さず）。これらの転写物については
それ以上は調べなかった。ｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定に
よりＴｏｌ２因子のエクソン−イントロン構造（すなわ
ち、４つのエクソンと３つのイントロン）が明らかにさ
れた（図１の最上段参照）。このｃＤＮＡは６４９個の
アミノ酸から成るタンパク質をコード化している。この
蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。Ｔ
ｏｌ２エレメントがトランスポゾン様配列であることは
知られていたが、本発明は、Ｔｏｌ２エレメントが蛋白
質をコードし、当該蛋白質の発現による作用であること
を初めて確認したものである。即ち、本発明は、Ｔｏｌ
２エレメントにおいてコードされている新規な蛋白質を
提供するものであり、また、当該蛋白質をコードするポ
リヌクレオチドを提供するものである。

【００１３】図２に本発明の蛋白質のアミノ酸配列及び
公知のｈＡＴファミリーのトランスポゾンのトランスポ
ザーゼ類のアミノ酸配列を比較した図を示す。この比較
から、これらの蛋白質は特に中央部のアミノ酸配列が類
似していることがわかる（図２参照）。しかし、ＮＨ_２
−及びＣＯＯＨ−末端のアミノ酸配列にはやや多様性が
あった。

【００１４】同定された本発明の蛋白質（Ｔｏｌ２転写
物）が、活性のある酵素をコード化しているかどうかを
決定するため、コインジェクジョンによる新規な一過性
の胚エクシジョンアッセイを開発し、これによる酵素活
性を確認を行った。ゼブラフィッシュの受精卵に、配列
番号１に示すｃＤＮＡを鋳型として用いて試験管内で合
成したｍＲＮＡと、Ｔｏｌ２エレメントのＥｃｏＲＶ切
断部位の間の塩基を欠失させた、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）
ΔＲＶ（図１参照）を含む（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶ
プラスミドとをコインジェクトした。コインジェクショ
ンの約８時間後、各々の胚よりＤＮＡを抽出し、Ｔｏｌ
２エレメントの外側の配列に基づいて調製されたプライ
マーｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒ ｔｙｒ−ｅｘ４ｆ ： 5'-GCTACTACATGGTGCCATTCCT-3' ｔｙｒ−ｅｘ５ｒ ： 5'-CACTGCCAGATCTGCTGGGCTT-3' を用いてＰＣＲ法により分析した。図３にこの方法の概
要を示し、図４のＡにこれらのプライマーに一を示す。

【００１５】（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドか
らＴｏｌ２エレメントの部分が切り出された場合に生成
すると考えられる約２５０ｂｐのＰＣＲ産物が、調べた
全ての胚において増幅されていた（５６個中５６個、図
４Ｂのレーン１−１０参照）。このＰＣＲ産物は（Ｔｏ
ｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドＤＮＡのみを注入した
胚からは決して検出されなかった（５０個より多い中で
０個、図４Ｂのレーン１１−２０参照）。６個の異なる
胚からのＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定した。そ
れらのうちの３個は、野性型のメダカチロシナーゼ遺伝
子の配列（図４Ｃ、切り出し産物ａ）を有し、正確な切
り出しを示しており、他の３個は、ｈＡＴファミリーの
トランスポゾンの切り出しに特徴的な（Pohlman等、198
4 ; Sutton等、1984 ; Koga等、1996 ; Kawakami等、19
98）、少数のヌクレオチドが付加したほぼ野性型の配列
（図４Ｃ、切り出し産物ｂ及びｃ）を有しており、この
実験における切り出しという事象がトランスポザーゼ活
性に依存することを示している。

【００１６】これらの結果、即ち、本発明の配列番号１
に示す塩基配列を有するｍＲＮＡと共にインジェクショ
ンした場合には、トランスポゾンの切り出しに特徴的な
ＰＣＲ産物が得られ、これをインジェクションしない場
合にはこのようなＰＣＲ産物が得られないということ
は、本発明の蛋白質（Ｔｏｌ２転写物）が、切り出しを
触媒する活性のあるトランスポザーゼをコードしてお
り、しかも（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドは切
り出しに必須のシスエレメントの配列を含むことを示し
ている。

【００１７】図４は、この実験の結果を示すものであ
り、図４Ａは、この分析に用いたプライマーの位置及び
方向を矢印で示している。図４Ｂの上段は、プライマー
ｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒを用いたＰＣＲ
産物を、下段はプライマーＴｏｌ２ｆ１及びＴｏｌ２ｒ
３を用いたＰＣＲ産物を示す、図面に代わる写真であ
る。レーン１ー１０はゼブラフィッシュ胚に（Ｔｏｌ２
−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドとＴｏｌ２のｍＲＮＡと共
にインジェクションした場合を、レーン１１−２０は
（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドのみを単独でイ
ンジェクションした場合を、レーンＧ及びＰは５０ｎｇ
のゼブラフィッシュゲノムＤＮＡと、１０ｐｇの（Ｔｏ
ｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドＤＮＡとからのＰＣＲ
産物である。図４のＣは、上記の実験で得られた切り出
し産物のＤＮＡ配列を示している。Ｔｏｌ２配列を肉太
活字で示し、Ｔｏｌ２エレメントの外側の８ｂｐの同方
向のプライマーの配列部分に下線をつけてある。

【００１８】この実験では、切り出し産物は一回のＰＣ
Ｒ増幅の後に検出可能であったが、試験管内で調製した
ｍＲＮＡに代えて全長のＴｏｌ２エレメントを含有する
プラスミドＤＮＡを単独で受精卵に注入した分析法で
は、二回のＰＣＲが必要であったことが注目された。こ
こで観察された効率のより高い切り出し反応は 、ＤＮ
Ａ注入によって供給されるよりも多くのトランスポザー
ゼがＲＮＡ注入によって供給されたためとして説明する
ことができる。

【００１９】Ｔｏｌ２エレメントの一番目のイントロン
は約３００ｂｐの大きな逆方向反復配列（inverted rep
eats）を含んでおり、最近Ａｎｇｅｌエレメントの逆向
きの重複として同定された（Izsvak等、1999）（図１参
照）。このイントロン部分の配列が切り出しに必要であ
るかどうかを検討するために、一番目のイントロンの配
列をも完全に欠いている（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１
ΔＲＶ（図１の下段参照）を含有する（Ｔｏｌ２−ｔｙ
ｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドを構築し、その活性をＴ
ｏｌ２のｍＲＮＡとのコインジェクションにより前記の
実験と同様に分析した。この結果を図４のＤに示す。

【００２０】図４のＤの上段は、プライマーｔｙｒ−ｅ
ｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒを用いたＰＣＲ産物を、下
段はプライマーＴｏｌ２ｆ１及びＴｏｌ２ｒ３を用いた
ＰＣＲ産物を示す、図面に代わる写真である。レーン１
−８はゼブラフィッシュ胚に、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δ
ｉｎ１ΔＲＶプラスミドとＴｏｌ２のｍＲＮＡとをイン
ジェクションした場合を示し、レーン９−１２は（Ｔｏ
ｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドとＴｏｌ２のｍＲＮＡ
とをインジェクションした場合を示し、レーン１３−１
６は（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドの
みをを単独でインジェクションした場合を示す。レーン
Ｐは１０ｐｇの（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプ
ラスミドＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。

【００２１】レーン９−１２は先ほどの実験を対照とし
ておこなったものであり、切り出しを示すＰＣＲ産物を
確認することができたが、イントロン部分を欠失させた
プラスミドを用いたレーン１−８のものでは、切り出し
産物は検出することができず（１６個のうち０個、図４
Ｄ、レーン１ー８参照）、一番目のイントロンが切り出
しに必須のシスエレメントを含んでいることが示され
た。また、ΔＲＶ欠失を修復し、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）
ΔＲＶプラスミドとほぼ同じ大きさの（Ｔｏｌ２−ｔｙ
ｒ）Δｉｎ１、即ちＴｏｌ２エレメントの６４４〜２１
６３番目の塩基のみを欠失させたものを含有する（Ｔｏ
ｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１プラスミドもコインジェクショ
ンアッセイによって調べたが、切り出しを示すＰＣＲ産
物は得られなかった（１６個のうち０個、データは示さ
ず）。

【００２２】切り出しに必須のシスエレメントを正確に
特定するためには、一番目のイントロン内のより小さい
欠失及び点突然変異を用いたさらなる分析が必要であろ
うが、これらの結果からイントロン部分が切り出しに必
要であり、かつ当該イントロン部分にはＡｎｇｅｌエレ
メントが逆方向反復配列として含まれていることから、
当該逆方向反復配列が本発明の切り出しに必要な配列と
考えることもできる。

【００２３】このように、Ｔｏｌ２エレメントによって
コードされていた転写物（本発明の蛋白質）及びこの蛋
白質のトランスポザーゼ活性と、転移に必須のシスエレ
メントとを初めて同定することに成功した。これらの発
見は、Ｔｏｌ２トランスポザーゼの生化学的な特徴づけ
につながるものであろう。また、Ｔｃ１／marinerファ
ミリーに属するトランスポゾンのゼブラフィッシュゲノ
ムへの転位が報告されている（Raz等、1997 ; Fadool
等、1998）。この報告の実験では、ゼブラフィッシュの
一細胞期の胚に、インビトロで転写したトランスポザー
ゼＲＮＡと必須のシスエレメントをもつトランスポゾン
ベクターとがコインジェクトされた。異なるファミリー
に属するトランスポゾンが、ゲノムへの組込みに関して
異なる特異性及び効率を有するかもしれないが、Ｔｏｌ
２エレメントを用いた魚類における新規なトランスポゾ
ン技術を開発した本発明の方法によれば、遺伝子の切り
出しが前記したラッツ（Raz）らの方法と同様に行われ
ていることから、Ｔｃ１／marinerファミリーのトラン
スポゾンにおいて行なわれたものと類似の方法で、Ｔｏ
ｌ２エレメントなどの遺伝子をゲノム内にトランスポー
ズすることができることになるであろう。

【００２４】そこで本発明者らは、Ｔｏｌ２エレメント
を転位によりゼブラフィッシュのゲノムに導入すること
ができるかどうかを検討した。ゼブラフィッシュのゲノ
ムにはＴｏｌ２エレメントは存在しないことが知られて
いる。Ｔｏｌ２エレメントがトランスポジションを活性
化することができるトランスポゼースをコードしている
かどうかを試験するために、ゼブラフィッシュの受精卵
に、トランスポゼースをコードしていると考えられるテ
ンプレートとしてのＴｏｌ２ｃＤＮＡを用いてインヴィ
トロで転写したＲＮＡ、及びトランスポゼースをコード
していると考えられる領域を欠失させている（Ｔｏｌ２
−ｔｙｒ）ΔＲＶエレメントを有するプラスミドＤＮＡ
を、コインジェクトした。これらの（Ｔｏｌ２−ｔｙ
ｒ）ΔＲＶプラスミド及びＴｏｌ２ＤＮＡの構造を図５
に示す。３’及び５’は転写の方向を示す。

【００２５】インジェクトした卵を成魚に生長させて、
インジェクトしていない成魚とつがいにした。そして、
その子孫にＴｏｌ２配列が存在するか否かを分析した。
インジェクトした８匹の魚のうちの２匹からの子孫に、
Ｔｏｌ２配列を見出すことができた。この２匹の魚をｆ
ｆ−１（founder fish-1）及びｆｆ−７（founder fish
-7）と名付けた。ｆｆ−１からの６８匹のＦ_１のうちの
２匹がＴｏｌ２配列を持っていた。これらの２匹の魚
は、Ｔｏｌ２配列と同様にプラスミド配列も持ってい
た。また、ｆｆ−７からの５０匹のＦ_１のうち２５匹は
Ｔｏｌ２配列を持っていた。これらの２５匹の魚はプラ
スミド配列をもっておらず、図６のＡに示すサザンブロ
ットの結果からＡ、Ｂ及びＣの３種類に分類された。こ
のうちＡは７匹で、Ｂは３匹で、Ｃは１５匹であった。
図６のＡは、ｆｆ−１、ｆｆ−７からのＦ_１の尾ひれか
ら調製したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｖで消化し、こ
れを図５に示すプローブを用いてサザンブロット分析し
た結果を示す、図面に代わる写真である。ｆｆ−１から
の２匹は同じパターンを示したが、ｆｆ−７からのもの
はＡ、Ｂ及びＣの３種類のパターンを示した。

【００２６】次に、ｆｆ−１、ｆｆ−７からのＦ_１のＰ
ＣＲ分析を行った。図５にＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣ
Ｒ３として示される位置のプライマーを用いた。対照と
して、ゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡ（Ｇ）、及びゲ
ノムＤＮＡと（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミドＤ
ＮＡ（Ｇ＋Ｐ）を用いた。ｆｆ−７からのＦ_１では、Ｐ
ＣＲ２及びＰＣＲ３におけるＰＣＲ産物を増幅すること
はできなかった。即ち、ｆｆ−７からの子孫は、ｆｆ−
１からの子孫とは異なりＴｏｌ２のフランキング配列と
なるプラスミド配列を持っていなかった。

【００２７】ｆｆ−７の子孫におけるＴｏｌ２配列を含
むＤＮＡフラグメント及びその近傍領域をインバースＰ
ＣＲ（inverse PCR）によりクローニングして、その配
列を決定した。Ａ、Ｂ及びＣの３種類のいずれの場合も
Ｔｏｌ２配列はゼブラフィッシュのゲノム配列の中にあ
り、その両端には８ｂｐの繰り返し配列がみられた。Ｔ
ｏｌ２配列の両端における８ｂｐの繰り返しは、ｈＡＴ
ファミリーのトランスポザースによる挿入に特徴的なも
のであり、トランポザースによってＴｏｌ２配列の挿入
が行われたことを示すものである。図７にＡ、Ｂ及びＣ
の３種類の決定された塩基配列を示す。図７中のＴｏｌ
２は、Ｔｏｌ２の配列を示している。Ａでは、Ｔｏｌ２
配列の両端に「ＣＴＣＡＡＣＴＧ」の繰り返しが、Ｂで
は、Ｔｏｌ２配列の両端に「ＴＡＴＡＧＡＧＡ」の繰り
返しが、Ｃでは、Ｔｏｌ２配列の両端に「ＧＴＴＴＴＣ
ＡＧ」の繰り返しが見られた。

【００２８】脊椎動物の培養細胞や生殖細胞において、
Ｔｃｌ／マリナー（mariner）ファミリーに属する、人
工的に再構築され活性化されたスリーピングビューティ
ー（sleeping beauty）（Ivics,Z., et al., Cell, 91,
501-510 (1997)）、線虫のＴｃ３（Raz,E., et al., C
urrent Biology, 8, 82-88 (1997)）、ショウジョウバ
エのマリナー因子（mariner）（Fadool,J.M., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5182-5186 (1998)）
についてトランスポジション活性が報告されている。し
かし、脊椎動物ゲノムに存在する自律的なトランスポゾ
ン活性は未だ報告されていない。本発明は、脊椎動物か
らの自律的なエレメントを同定した最初の報告であり、
脊椎動物における機能的なトランスポザース活性を最初
に報告するものである。即ち、本発明は、脊椎動物にお
いて自律的に遺伝子を切り出す方法に関するのみなら
ず、遺伝子を切り出し、きりだされた遺伝子をゲノムな
どの他の遺伝子の中に挿入する方法にも関するものであ
る。

【００２９】本発明の蛋白質は、配列表の配列番号２に
示されるアミノ酸配列を有するものであるが、必ずしも
この中の全てのアミノ酸を必須とするものではなく、本
発明のトランポザーゼ活性又は当該活性と類似する活性
（これらを併せて、トランスポザーゼ様活性という。）
を有していればよく、その一部のアミノ酸が置換され若
しくは欠失し、又は他のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列を有するものであってもよい。そして、好ましくはＴ
ｏｌ２エレメントに由来するアミノ酸配列を有するもの
である。また、本発明の蛋白質は、配列表の配列番号１
に示される塩基配列に相当する塩基配列を有するｍＲＮ
Ａから産生さることを特徴とするものでもある。

【００３０】本発明の核酸は、前記した本発明の蛋白質
からなるアミノ酸配列をコードするものであり、好まし
くは配列表のはいれる番号１で示される配列を有するポ
リヌクレオチドなどが挙げられる。本発明の核酸は前記
の塩基配列を有するもののみならず、これらの塩基配列
にハイブリダイズ、好ましくはストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし得る塩基配列も包含される。

【００３１】本発明の蛋白質又は当該蛋白質を産生し得
る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の遺伝子構造を改変
させる方法としては、細胞に本発明の前記した蛋白質又
はそのｍＲＮＡなどの当該蛋白質を産生し得る核酸を導
入し、同時に転移させたい遺伝子を含有する遺伝子、例
えばプラスミドなどを導入して、本発明の蛋白質による
酵素作用により細胞内の遺伝子構造を改変することがで
きる。本発明の改変は、好ましくは自律的な転移を起こ
すものである。細胞としては、動物細胞が好ましく、よ
り好ましくは脊椎動物の細胞、さらに好ましくは魚類の
細胞、具体的にはゼブラフィッシュなどの魚類の細胞な
どが挙げられる。前記の転移させたい遺伝子を含有する
遺伝子としては、転移させたい外来遺伝子を含有するプ
ラスミドのような天然の細胞内に存在しないものであっ
てもよいが、天然の細胞内に存在する遺伝子であっても
よい。この場合に転移に必要なシスエレメントを必要に
応じて付加することもできる。転移させたい遺伝子とし
ては、トランスポゾンが好ましいが、場合によっては各
種の遺伝子異常による疾患を有する細胞に正常な遺伝子
を導入するための遺伝子であってもよい。また、本発明
の改変方法は、導入されたプラスミドなどの細胞内の遺
伝子の一部を切り出すことのみからなるものであっても
よいが、この方法により切り出された遺伝子の全部又は
一部が、他の遺伝子に挿入されることを包含するもので
あってもよい。本発明の改変方法における切り出される
遺伝子は、その塩基配列の上流に、少なくとも１回の逆
方向反復配列を含む塩基配列を有することが好ましい。
このような逆方向反復配列は、遺伝子の転移におけるシ
スエレメント、又はシスエレメントの一部と考えられる
からである。

【００３２】また、本発明は、前記してきた改変方法を
用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方法、及
び細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変する方法に関
する。前記してきた方法によれば、例えば、プラスミド
中の外来遺伝子を細胞のゲノム中に転移させることがで
き、細胞に当該細胞が本来有していない新たな遺伝子を
導入することができる。また、このようなあらたに導入
された遺伝子を発現させることにより、当該細胞の機能
を改変することも可能となる。さらに、本発明はこのよ
うな方法により細胞の機能が改変された細胞を提供する
ことができる。この方法における細胞としても、前記し
た細胞が好ましい。

【００３３】本発明の塩基配列の上流に、少なくとも１
回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有するＤＮＡを含
有してなるプラスミドとしては、逆方向反復配列の下流
にある遺伝子を転移させるためのものであり、少なくと
も１回の逆方向反復配列を含む塩基配列を有する部分と
その下流に転移させたい遺伝子を含有し、細胞に容易に
導入することができるものであればよい。

【００３４】

【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。本発明の実験においては、Ｔｅｕｂｉｎｇｅｎ、Ｔ
Ｌ及びｂｒａｓｓ系統のゼブラフィッシュを用いて注入
用の卵を得、以下の実験にはこれを使用した。

【００３５】実施例１（ｃＤＮＡのクローニング） ゼブラフィッシュの受精卵に、（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）プ
ラスミドを注入し、注入の９時間後に５０個のゼブラフ
ィッシュ胚より、Ｔｒｉ Ｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Li
fe Technologies社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、得ら
れた約３μｇの全ＲＮＡを、各々次の３’ＲＡＣＥ法及
び５’ＲＡＣＥ法に用いた。 ３’ＲＡＣＥを行なうために用いられたとなり同士の前向きのプライマーは： Ｔｏｌ２ｆ２ ； 5' - TTGGTCAGACATGTTCATTG - 3'と Ｔｏｌ２ｆ３ ； 5' - ATGTTCATTGGTCCTTTGGA - 3'、 Ｔｏｌ２ｆ４ ； 5' - ATAGCTGAAGCTGCTCTGATC - 3'と Ｔｏｌ２ｆ５ ； 5' - CTGCTCTGATCATGAAACAG - 3'、 Ｔｏｌ２ｆ８ ； 5' - GCTTAATAAAGAAATATCGGCC - 3'と Ｔｏｌ２ｆ９ ； 5' - AATATCGGCCTTCAAAAGTTCG - 3'、及び Ｔｏｌ２ｆ１２ ； 5' - CTGTAATCAGAGAGTGTATGTGTA - 3'と Ｔｏｌ２ｆ１３ ； 5' - ATTGTTACATTTATTGCATACAAT - 3'である。 ５’ＲＡＣＥを行なうために用いられた重なりのある逆向きのプライマーは： Ｔｏｌ２ｒ４ ； 5' - CTCAATATGCTTCCTTAGG - 3'と Ｔｏｌ２ｒ５ ； 5' - CTTCCTTAGGTTTGATGGCG - 3'である。 ３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ産物をゲル抽出し、ＴＯ
ＰＯ ＴＡ クローニングキット（Invitrogen社）を用
いてクローン化し、さらにABI PRISM 310 Genetic Anal
yzerを用いて配列決定した。決定された塩基配列を配列
表の配列番号１に示し、その翻訳領域のアミノ酸配列を
配列表の配列番号２に示す。また、その概要を図１に示
す。 括弧内の数字は、Ｔｏｌ２エレメントの５’末端
からのｂｐである。ｃＤＮＡ配列のＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ
／Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号はＡＢ０３２２４４であ
る。

【００３６】実施例２（（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１
ΔＲＶプラスミドの構築） （Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）Δｉｎ１ΔＲＶプラスミドは、ま
ず（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）プラスミドのＮｒｕ Ｉ−Ｎｓ
ｐ Ｖを、ｃＤＮＡのＮｒｕ Ｉ−Ｎｓｐ Ｖフラグメ
ントで置換し、さらにその結果得られたプラスミドをＥ
ｃｏＲＶで消化し、自己連結させることによって構築し
た。

【００３７】実施例３（ｍＲＮＡ合成、胚への注入、及
びＰＣＲ分析） 推定上のトランスポザーゼのコード領域全体をコード化
しているｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ^＋
（Stratagene）においてクローン化し、直鎖化し、プロ
テイナーゼＫを用いて消化し、さらにフェノール／クロ
ロフォルム抽出した。ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ及びｍＣＡＰ ｍＲＮＡ Ｃａｐｐｉｎｇキット
（Stratagene）を用いた試験管内の転写により生成し
た。転写物の濃度及び大きさは、アガロースゲル電気泳
動で調べた。ゼブラフィッシュ受精卵に、前記で得られ
たＤＮＡ溶液の１−２ｎｌ（〜２５ｎｇ／μｌのプラス
ミドＤＮＡ）をｍＲＮＡ（〜５ｎｇ／μｌのＴｏｌ２の
ｍＲＮＡ）と共に、又は単独で注入し、２８℃にて〜８
時間インキュベートした。各々の胚を、５０μｌの１０
ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫに浸
し、さらに５０℃にて３時間インキュベートした。

【００３８】次いで、１μｌの溶解した胚を、ｔｙｒ−
ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ５ｒプライマーを用いてＰＣ
Ｒ（９４℃３０秒、５５℃３０秒、及び７２℃３０秒を
３５サイクル）に使用した（Kawakami等、1998）。ＰＣ
Ｒ産物を２％のアガロースゲル電気泳動にて分析した。
結果を図４に示す。ＤＮＡ配列分析用には、ＰＣＲ産物
をゲル抽出し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Invi
trogen）を用いてクローン化し、配列決定した。各々の
サンプル中の注入されたプラスミドＤＮＡの存在を、Ｔ
ｏｌ２ｆ１（5' -TCCACCCATGCTTCCAGCAGTA - 3'）及び
Ｔｏｌ２ｒ３（5' - CGTTGTGGTTGCAATCCATTCAAC - 3'）
プライマーを用いたＰＣＲ（９４℃３０秒，５５℃３０
秒、及び７２℃３０秒を２５サイクル）により確かめ
た。

【００３９】

【発明の効果】本発明は、遺伝子の転移酵素活性を有す
る新規な蛋白質及びそれをコードする核酸を提供するも
のである。また、本発明は、脊椎細胞において異なるフ
ァミリーの遺伝子転移酵素が、遺伝子を転移させ得る活
性を発現することができることを開示するものであり、
脊椎動物における遺伝子の転移や転移による変異に関す
る技術の発展に大きく寄与するものである。一方、最近
の遺伝子工学が個々の細胞の形質転換から生体の形質転
換へと発展していることから、本発明の細胞レベルの遺
伝子の転移技術が単に細胞の形質転換のみに制限される
ものではなく、生体における形質転換の手段の一つとし
て、哺乳動物の遺伝子構造や機能を改変するための医学
や農学の分野への応用が期待される技術である。とりわ
け、遺伝子治療、魚類の品種改良においては有力な手段
となることが期待される。

【００４０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <120> Transoposon transpher factor and alternation method for a gene <130> PC901482 <160> 2 <210> 1 <211> 2156 <212> DNA <213> Oryzias latipes <400> 1 acgtcatgtc acatctatta ccacaatgca cagcaccttg acctggaaat tagggaaatt 60 ataacagtca atcagtggaa gaaaatggag gaagtatgtg attcatcagc agctgcgagc 120 agcacagtcc aaaatcagcc acaggatcaa gagcacccgt ggccgtatct tcgcgaattc 180 ttttctttaa gtggtgtaaa taaagattca ttcaagatga aatgtgtcct ctgtctcccg 240 cttaataaag aaatatcggc cttcaaaagt tcgccatcaa acctaaggaa gcatattgag 300 agaatgcacc caaattacct caaaaactac tctaaattga cagcacagaa gagaaagatc 360 gggacctcca cccatgcttc cagcagtaag caactgaaag ttgactcagt tttcccagtc 420 aaacatgtgt ctccagtcac tgtgaacaaa gctatattaa ggtacatcat tcaaggactt 480 catcctttca gcactgttga tctgccatca tttaaagagc tgattagtac actgcagcct 540 ggcatttctg tcattacaag gcctacttta cgctccaaga tagctgaagc tgctctgatc 600 atgaaacaga aagtgactgc tgccatgagt gaagttgaat ggattgcaac cacaacggat 660 tgttggactg cacgtagaaa gtcattcatt ggtgtaactg ctcactggat caaccctgga 720 agtcttgaaa gacattccgc tgcacttgcc tgcaaaagat taatgggctc tcatactttt 780 gaggtactgg ccagtgccat gaatgatatc cactcagagt atgaaatacg tgacaaggtt 840 gtttgcacaa ccacagacag tggttccaac tttatgaagg ctttcagagt ttttggtgtg 900 gaaaacaatg atatcgagac tgaggcaaga aggtgtgaaa gtgatgacac tgattctgaa 960 ggctgtggtg agggaagtga tggtgtggaa ttccaagatg cctcacgagt cctggaccaa 1020 gacgatggct tcgaattcca gctaccaaaa catcaaaagt gtgcctgtca cttacttaac 1080 ctagtctcaa gcgttgatgc ccaaaaagct ctctcaaatg aacactacaa gaaactctac 1140 agatctgtct ttggcaaatg ccaagcttta tggaataaaa gcagccgatc ggctctagca 1200 gctgaagctg ttgaatcaga aagccggctt cagcttttaa ggccaaacca aacgcggtgg 1260 aattcaactt ttatggctgt tgacagaatt cttcaaattt gcaaagaagc aggagaaggc 1320 gcacttcgga atatatgcac ctctcttgag gttccaatgt ttaatccagc agaaatgctg 1380 ttcttgacag agtgggccaa cacaatgcgt ccagttgcaa aagtactcga catcttgcaa 1440 gcggaaacga atacacagct ggggtggctg ctgcctagtg tccatcagtt aagcttgaaa 1500 cttcagcgac tccaccattc tctcaggtac tgtgacccac ttgtggatgc cctacaacaa 1560 ggaatccaaa cacgattcaa gcatatgttt gaagatcctg agatcatagc agctgccatc 1620 cttctcccta aatttcggac ctcttggaca aatgatgaaa ccatcataaa acgaggcatg 1680 gactacatca gagtgcatct ggagcctttg gaccacaaga aggaattggc caacagttca 1740 tctgatgatg aagatttttt cgcttctttg aaaccgacaa cacatgaagc cagcaaagag 1800 ttggatggat atctggcctg tgtttcagac accagggagt ctctgctcac gtttcctgct 1860 atttgcagcc tctctatcaa gactaataca cctcttcccg catcggctgc ctgtgagagg 1920 cttttcagca ctgcaggatt gcttttcagc cccaaaagag ctaggcttga cactaacaat 1980 tttgagaatc agcttctact gaagttaaat ctgaggtttt acaactttga gtagcgtgta 2040 ctggcattag attgtctgtc ttatagtttg ataattaaat acaaacagtt ctaaagcagg 2100 ataaaacctt gtatgcattt catttaatgt tttttgagat taaaagctta aacaag 2156 <210> 2 <211> 649 <212> PRT <213> Oryzias latipes <400> 2 Met Glu Glu Val Cys Asp Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Val 15 Gln Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg 30 Glu Phe Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn Lys Asp Ser Phe Lys Met 45 Lys Cys Val Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys Glu Ile Ser Ala Phe 60 Lys Ser Ser Pro Ser Asn Leu Arg Lys His Ile Glu Arg Met His 75 Pro Asn Tyr Leu Lys Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys Arg 90 Lys Ile Gly Thr Ser Thr His Ala Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys 105 Val Asp Ser Val Phe Pro Val Lys His Val Ser Pro Val Thr Val 120 Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile Ile Gln Gly Leu His Pro Phe 135 Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys Glu Leu Ile Ser Thr Leu 150 Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro Thr Leu Arg Ser Lys 165 Ile Ala Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys Val Thr Ala Ala 180 Met Ser Glu Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp Cys Trp Thr 195 Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp Ile Asn 210 Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys Arg 225 Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu Val Leu Ala Ser Ala Met Asn 240 Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr 255 Thr Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys Ala Phe Arg Val Phe 270 Gly Val Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Glu Ala Arg Arg Cys Glu 285 Ser Asp Asp Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly Ser Asp Gly 300 Val Glu Phe Gln Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly 315 Phe Glu Phe Gln Leu Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu 330 Leu Asn Leu Val Ser Ser Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn 345 Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln 360 Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala 375 Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu Leu Arg Pro Asn Gln Thr 390 Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp Arg Ile Leu Gln Ile 405 Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn Ile Cys Thr Ser 420 Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu Phe Leu Thr 435 Glu Trp Ala Asn Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val Leu Asp Ile 450 Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro Ser 465 Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu 480 Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln 495 Thr Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala 510 Ala Ile Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr Asn Asp Glu 525 Thr Ile Ile Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val His Leu Glu 540 Pro Leu Asp His Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Asp 555 Glu Asp Phe Phe Ala Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala Ser 570 Lys Glu Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu 585 Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr 600 Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser 615 Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys Arg Ala Arg Leu Asp Thr 630 Asn Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys Leu Asn Leu Arg Phe 645 Tyr Asn Phe Glu 649

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｔｏｌ２プラスミド及びその転写物の
構造、及び本発明のｃＤＮＡの構造を示すものである。
破線部分はイントロンを示す。一番目のイントロンにあ
る逆方向反復配列（Ａｎｇｅｌエレメント）と、本発明
で用いたプライマーの位置とを矢印で示す。

【図２】図２は、本発明のＴｏｌ２及びＡｃトランスポ
ザーゼのアミノ酸配列の比較を示す。

【図３】図３は、本発明のコインジェクションによる一
過性胚エクシジョンアッセイの概要を示したものであ
る。切り出し産物（ｔｙｒ−ｅｘ４ｆ及びｔｙｒ−ｅｘ
５ｒ）の検出に用いたプライマーを矢印で示す。

【図４】図４は、ゼブラフィッシュ胚における本発明の
切り出し反応のＰＣＲ分析の結果を示す図面に代わる写
真である。

【図５】図５は、Ｔｏｌ２エレメントをゲノムに転移さ
せるための（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）ΔＲＶプラスミド、
（Ｔｏｌ２−ｔｙｒ）及びＴｏｌ２ｃＤＮＡの構造を示
す。図５上部の黒線はサザンブロット分析に使用するプ
ローブ部分を示す。

【図６】図６は、Ｔｏｌ２エレメントの存在が確認され
た親（ｆｆ−１及びｆｆ−７）のそれぞれの子孫Ｆ_１の
サザンブロット分析の結果（図６のＡ）、及びＰＣＲ分
析の結果（図６のＢ）を示す、図面に代わる写真であ
る。

【図７】図７は、ｆｆ−７の子孫Ｆ_１のＡ、Ｂ及びＣの
３種における、ゲノム中に挿入されたＴｏｌ２エレメン
トの周囲の塩基配列を示すものである。

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
   配列、又はそのアミノ酸の一部が置換され若しくは欠失
   し、又は他のアミノ酸が付加していてもよいアミノ酸配
   列を有するトランポザーゼ様活性を有する蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の蛋白質からなるトラン
   スポゾン転移酵素。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の蛋白質をコードする核
   酸。
4. 【請求項４】 核酸が、配列表の配列番号１に示される
   塩基配列を有するＤＮＡ、又は当該ＤＮＡにハイブリダ
   イズし得るＤＮＡである請求項３に記載の核酸。
5. 【請求項５】 核酸がＲＮＡである請求項３又は４に記
   載の核酸。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の蛋白質又は当該蛋白質
   を産生し得る核酸の存在下で、細胞内の遺伝子の遺伝子
   構造を改変させる方法。
7. 【請求項７】 当該蛋白質を産生し得る核酸が、ｍＲＮ
   Ａである請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 細胞が脊椎動物の細胞である請求項６又
   は７に記載の方法。
9. 【請求項９】 細胞内の遺伝子が、プラスミドである請
   求項６〜８のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 プラスミドが、その細胞の外来遺伝子
    を含有するものである請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 遺伝子構造を改変させる方法が、細胞
    内の遺伝子の一部を切り出すことからなる請求項６〜１
    ０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 切り出された遺伝子の一部が、他の遺
    伝子に挿入される請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 切り出される遺伝子の一部の塩基配列
    の上流に、少なくとも１回の逆方向反復配列を含む塩基
    配列を有する請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 遺伝子構造を改変させられる遺伝子
    が、シスエレメントとして少なくとも１回の逆方向反復
    配列を含む塩基配列を有する請求項６〜１３のいずれか
    に記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項６〜１４のいずれかに記載の方
    法を用いて、細胞の遺伝子に外来遺伝子を導入する方
    法。
16. 【請求項１６】 請求項６〜１４のいずれかに記載の方
    法を用いて、細胞の遺伝子の発現に基づく機能を改変す
    る方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法により機能が
    改変された細胞。
18. 【請求項１８】 塩基配列の上流に、少なくとも１回の
    逆方向反復配列を含む塩基配列を有するＤＮＡを含有し
    てなるプラスミド。
19. 【請求項１９】 プラスミドが、請求項１の記載の蛋白
    質又は当該蛋白質を産生し得る核酸の存在下で、そのな
    かの一部のＤＮＡが切り出されるためのものである請求
    項１８に記載のプラスミド。
20. 【請求項２０】 脊椎動物のゲノムＤＮＡ中に、他の遺
    伝子を挿入する方法において、当該トランスポザースの
    活性を用いて他の遺伝子を挿入する方法。
21. 【請求項２１】 他の遺伝子が請求項１３〜１４の特徴
    を有するＴｏｌ２エレメントである請求項２０に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 脊椎動物が、魚類である請求項２０又
    は２１に記載の方法。