JP5780631B2 - カイコの卵および眼の着色に関与する遺伝子およびその利用 - Google Patents
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(a)配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または3に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1または3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
(e)配列番号:1または3に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上の塩基配列からなるDNA
(a)[1]に記載のDNAの転写産物と相補的な一重鎖RNAを含む二重鎖RNA
(b)[1]に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA
本発明は、カイコの卵および眼を変色させる活性を有する活性を有するタンパク質をコードするDNAを提供する。
また、本発明は、上記した本発明の野生型系統のre遺伝子の発現を抑制するために用いるDNAを提供する。本発明においては、re遺伝子の機能が喪失することにより、カイコの卵および眼が変色することが見出された。従って、re遺伝子の発現を抑制する活性を有するDNAの導入により、カイコの卵および眼を変色させることが可能である。この意味において、re遺伝子の発現を抑制するために用いるDNAは、カイコの卵および眼を変色させるための薬剤である。ここで「re遺伝子の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制の双方が含まれる。また、「発現の抑制」には、発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。また、「カイコの卵および眼を変色させる活性」とは、典型的には、カイコの卵および成虫の眼を赤色に変色させる活性を意味する。被検DNAが、カイコの卵および成虫の眼を赤色に変色させる活性を有するか否かは、例えば、当該DNAを、野生型異系統(卵が藤鼠色および眼が黒色となる系統)に導入し、卵および成虫の眼が赤色に変色するか否かにより、判定することができる。
本発明は、また、上記本発明のDNA(re遺伝子、およびre遺伝子の発現を抑制するためのDNA)を含むベクター、上記本発明のDNAが導入された細胞、上記本発明のDNAが導入されたカイコを提供する。
本発明は、また、卵および眼が変色されたカイコの生産方法であって、上記本発明のDNA(re遺伝子、およびre遺伝子の発現を抑制するためのDNA)をカイコに導入することを特徴とする方法を提供する。
本発明は、また、遺伝子組換えカイコの生産方法であって、任意のDNAと上記本発明のDNA(re遺伝子、およびre遺伝子の発現を抑制するためのDNA)をカイコに導入し、卵および眼が変色した個体を選抜することを特徴とする方法を提供する。
(1)カイコの飼育
カイコは人工飼料(日本農産工業)で25度〜27度で飼育した。C108系統は、研究室で累代飼育しているもの、911(re)系統は農業生物資源研究所内で累代飼育しているもの、e28系統はナショナルバイオリソースプロジェクトで累代飼育している系統(九州大学)を取り寄せて実験に用いた。
reの表現型の責任領域のマッピングのため、C108(正常着色卵)と911(re)を交配して生まれたF1のオスのカイコと、911(re)のメスの交配を行った。この交配により生まれたBF1卵(正常着色282、赤卵114、計396)から孵化した1零幼虫からゲノムDNAをDNAzol(Invitrogen)を用いて抽出した。抽出したDNAに用いて、SNPマーカー(表1)を用い、文献(非特許文献7)と類似の方法で連鎖解析を行い、reの表現型の責任領域を絞り込んだ。SNPマーカーの一部は(Yamamoto, K. et al., (2008) Genome Biol 9:R21)で使用されているものである。
P50T(正常着色卵、ゲノム解読系統)、C108(正常着色卵)、911(re変異系統)、e28(re変異系統)について、産下直後、24時間後、48時間後、72時間後の卵からtotal RNAをIsogen(NipponGene)を用いて抽出し、First-Strand cDNA Synthesis Kit(GE Healthcare)を用いてcDNAを合成した。RT-PCRは、絞り込み範囲内に存在した予測遺伝子BGIBMGA003497、003498、003499、003494、003695についてプライマー(表2)を設計し、total RNA 0.5ng分のcDNAを鋳型に用いて行った。PCRで増幅した断片の配列決定は、BigDye Ver.3.1(Applied Biosystems)とABI3130xl(Applied Biosystems)を用いて行い、配列解析はVector NTI ver.11(Invitrogen)を用いて行った。
膜貫通ドメインはSOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)プログラムで予測した。
BGIBMGA003497-1と相同性が予測された100個の遺伝子について、MEGA5ソフトウェアを用い、アミノ酸配列のアラインメント及び近隣接合法で分子系統解析を行った。
(1)ポジショナルクローニングによるre遺伝子の存在領域の絞り込み
reの責任領域の絞り込みのため、まず、C108(正常着色卵、+re/+re)のメスと911(re/re)のオスを掛け合わせ、F1を得た。F1のオス(re/+re)を911(re/re)のメスに掛け、戻し交配し、BF1個体(卵)を得た。BF1(卵)には正常着色卵と赤卵が存在した。BF1正常着色卵から生まれた幼虫282個体、BF1赤卵から生まれた幼虫114個体からそれぞれゲノムDNAを抽出し、5番染色体上に作成した40個のSNPマーカー(表1)を用いてジェノタイピングを行った。その結果、reの責任領域はSNPマーカーre-071119-R2_F1とre-080104R-R12_F1の間の202kbに絞り込まれた(表1、図3A)。
ポジショナルクローニングより絞り込んだ領域には、5つの予測遺伝子BGIBMGA003497、003498、003499、003494、003695が存在した(図3A)。これらの配列をNCBIのデーターベースに対し検索を行ったところ、BGIBMGA003497の5’側はMajor Facilitator superfamilyに属する遺伝子に、3’側はChromodomain-helicase-DNA-binding proteinという全く異なる遺伝子にホモロジーが検出されたため、2つの遺伝子が融合して1つの遺伝子として誤って予測されていることが考えられた。そこで、BGIBMGA003497の5’側と3側を仮にBGIBMGA003497-1とBGIBMGA003497-2とした。reの責任領域範囲内の予測遺伝子の発現を調べるため、BGIBMGA003498、003499、003494、003695にはそれぞれ1セットずつ、BGIBMGA003497については、BGIBMGA003497-1とBGIBMGA003497-2に1セットずつ、プライマーを設計した。カイコの卵は、産卵後40時間頃に薄茶色に着色し始め、この時期には野生型系統とre系統を見分けにくいが、72時間頃になると、野生型は藤鼠色になるのに対し、re系統は薄オレンジ色または赤色を呈し、それ以降はそれぞれの色が濃くなる。このため、reの原因遺伝子は、主に産卵後72時間より前に働いていることが考えられた。そこで、標準型の卵色と複眼色を示すP50TとC108の2つの系統について産下直後、1日後、2日後、3日後の卵における遺伝子の発現をRT-PCRにより調べた(図3B)。その結果、BGIBMGA003499はC108で発現が見られたが、p50Tではその発現が非常に弱くなっていた。003498、003494、003695では発現を示すバンドが検出できなかった。BGIBMGA003497-2は発現が検出されたが、特に、p50T系統では一様に発現していた。興味深いことに、BGIBMGA003497-1は24~48時間後に発現がピークになり、72時間後には発現量が下がっており、卵の着色に先立って発現していると考えられた。BGIBMGA003497-1とBGIBMGA003497-2では発現パターンが異なることから、この二つは独立の遺伝子であることが考えられた。
BGIBMGA003497-1のORF配列を調べるため、カイコのESTライブラリーとゲノム配列にBlastN検索をかけたところ、アラタ体と神経由来のESTライブラリーから対応するESTが得られた。これらのEST配列を基にORF全長を野生型の卵およびre系統の卵(911系統とe28系統)のcDNAから単離し、遺伝子構造の比較を行った。P50T系統、C108系統共に、BGIBMGA003497-1は、495アミノ酸のORFをコードする転写産物が発現していた(図4、図5、図6)。911系統、e28系統では、BGIBMGA003497-1は正常な転写産物が検出されず、exon 9の一部を失ったType 1および、exon 9全体を失った転写産物Type 2の2種類の異常な転写産物が検出された(図4〜6、配列番号:5〜8)。Type 1では76塩基が、Type 2では100塩基が欠損しており、野生型とType 1、Type 2がコードする蛋白質のアミノ酸配列を比較すると、Type 1、Type 2では、欠損部位よりもC末側は野生型のアミノ酸配列よりも短く、また、フレームシフトの結果全く異なる配列になっていた(図6)。BGIBMGA003497-1は小さい溶質を通すトランスポーターのファミリーであるMajor Facilitator superfamilyに属する遺伝子にホモロジーを持っていた。Major Facilitator superfamilyは一般に12回膜貫通型もしくは14回膜貫通型の構造をとるため、BGIBMGA003497-1のコードする蛋白質の膜貫通ドメインをSOSUIプログラムで予測した。その結果、野生型の遺伝子では12回膜貫通型になると予測され、Type 1、Type 2の欠損は10番目と11番目の膜貫通部位の間及び、10番目の膜貫通部位に生じていることが判明した。re系統の転写産物がコードする蛋白質の膜貫通ドメインを予測すると、野生型とは異なり、11回膜貫通型構造をとることが予測された(図8)。以上から、re系統では、異常な構造のBGIBMGA003497-1蛋白質が発現していると考えられる。上述のように、reの責任領域範囲内の遺伝子では、卵の着色に先立って発現が上昇しているものは、BGIBMGA003497-1のみであることから、BGIBMGA003497-1がreの原因遺伝子であることが強く示唆された。
(4)他の生物種におけるBGIBMGA003497-1の探索
他の生物種におけるBGIBMGA003497-1(re遺伝子)のホモログをNCBIのデーターベースでBlastP検索を行ったところ、脊椎動物から植物まで幅広い種でホモログが存在した。昆虫種で見ると、双翅目昆虫のアカイエカ、ハマダラカ、ネッタイシマカ、膜翅目昆虫のミツバチ、キョウソヤドリコバチ、オオアリ、ジャンプアリ、鞘翅目昆虫のコクヌストモドキ、シラミ目のコロモジラミ、半翅目昆虫のアブラムシでホモログが存在した(図9)。このことから、re遺伝子は、幅広い昆虫種でオモクローム合成系に寄与していることが考えられる。しかしながら、Blast検索で抽出されたホモログ(e-value>7e-28以上,ホモロジー25%以上)のもので、その機能が報告されているものは1つも存在しなかった。NCBIのデーターベースでBlastP検索でも、flybaseのBlast検索でも、ショウジョウバエ12種ではホモログが検出されなかった。このことから、ショウジョウバエ12種では、re遺伝子は失われている可能性が強く示唆される。
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
Claims (8)
- カイコの卵および眼を変色させる活性を有するタンパク質をコードする、下記(a)〜(e)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または3に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:2または4に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(d)配列番号:1または3に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA
(e)配列番号:1または3に記載の塩基配列からなるDNAと相同性が90%以上の塩基配列からなるDNA - カイコの卵および眼を変色させる活性を有する下記(a)〜(b)のいずれかに記載のRNAをコードするDNA。
(a)請求項1に記載のDNAの転写産物と相補的な一重鎖RNAを含む二重鎖RNA
(b)請求項1に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA - 請求項1または2に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターが導入された細胞。
- 請求項3に記載のベクターが導入されたカイコ。
- 請求項5に記載のカイコの卵、子孫またはクローン。
- 卵および眼が変色されたカイコの生産方法であって、請求項3に記載のベクターをカイコに導入することを特徴とする方法。
- 遺伝子組換えカイコの生産方法であって、任意のDNAと請求項1または2に記載のDNAをカイコに導入し、卵および眼が変色した個体を選抜することを特徴とする方法。
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