CN112062824B - Krp基因在害虫防治中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及KRP基因在害虫防治中的应用。本发明通过构建家蚕BmKRP的CRISPR/Cas9敲除品系，初步探究了新的转录因子BmKRP对雌性家蚕生殖过程的影响，通过对家蚕BmKRP‑/‑表型的观察，发现BmKRP的缺失影响了家蚕的雌性生殖，导致卵巢变小、卵母细胞体积变小及成虫产卵数减少；还发现BmKRP的突变缺失，影响了BmKRP与BmKr‑h1启动子上反应元件的结合，进而使得BmKr‑h1不表达或者下调表达，对家蚕激素调控生殖的分子机制的阐释具有重要的意义，通过研究推测在其它昆虫中也有类似的调控机制，为益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供线索和理论指导，具有应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及KRP基因在害虫防治中的应用。
背景技术
家蚕(Bombyx mori L.)是一种鳞翅目泌丝昆虫，属无脊椎动物，节肢动物门蚕蛾科蚕蛾属桑蚕种。在科研领域，家蚕作为鳞翅目的重要模式昆虫，被广泛用于研究昆虫生殖遗传与变态发育，从而掌握并利用其生长调控机制，最终达到农林业害虫防治等效果。
家蚕属于全变态昆虫，一个世代须经历卵、幼虫、蛹与成虫四个形态完全不同的发育阶段；其幼虫转入蛹的阶段需要经历五次蜕皮。家蚕蜕皮和变态的过程是由体内复杂的激素内分泌调控的，但起主要调控作用的是蜕皮激素(Ecdys-teroids)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)，并发现蜕皮激素的主要活性成分是20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone,20E)。这两种激素协同调控昆虫的变态发育，对昆虫的生长和生殖都具有重要作用。
Kr-h1(Krüppel homolog 1)属于Krüppel基因家族，可编码具有8个C2H2锌指结构域的转录因子。Kr-h1在昆虫生殖和卵成熟过程中也发挥着重要作用。在多个物种中都发现Kr-h1通过多个方面影响了昆虫的生殖。在雌性飞蝗(Locusta migratoria)中，发现Kr-h1RNAi后的卵巢发育不良，与对照组相比，卵巢显著变小，在东方果实蝇(Bactroceradorsalis)中也发现了类似的现象，并且发现雌性东方果实蝇的产卵数显著减少。在褐飞虱(Nilaparvata lugens)和埃及伊蚊(Aedes aegypti)中干扰Kr-h1的表达后，都发现了产卵数显著下降的现象。此外，Kr-h1在果蝇(Drosophila melanogaster)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)的胚胎发育和胚后幼虫蜕皮发育过程中表达比较活跃；对褐飞虱若虫Kr-h1基因沉默后，发现雌性外生殖器畸形比例显著上升；西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)的Kr-h1在胚胎期转录水平非常高，表明FoKr-h1在胚胎阶段起着调控作用。Kr-h1还具有调控昆虫幼虫生长发育和变态的功能。许多研究已经证明，JH通过Kr-h1的表达来介导抑制20E的生物合成和信息传导，从而抑制变态发育进程。在家蚕中，BmKr-h1也被鉴定为JH受体激活的JH初级应答基因。还有研究发现，Kr-h1经JH的诱导可在产生20E前体的前胸腺中高表达，高水平的Kr-h1可通过减小前胸腺的大小和降低类固醇生成基因的表达来抑制20E的生物合成，从而延长幼虫期。可见Kr-h1在JH信号途径抑制昆虫的变态发育过程中具有重要作用。然而，目前对于20E是否可反向诱导Kr-h1表达及Kr-h1相关分子机制等问题并不清楚。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明经过研究发现了20E可通过一个新鉴定的转录因子KRP(Kr-h1 regulatory protein)调控昆虫生长发育、变态发育及生殖等过程的Kr-h1基因的表达。这对于家蚕的生殖研究具有重要意义，也为利用生殖进行益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供了线索。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明一方面提供了KRP基因在制备调控Kr-h1基因表达药物中的应用，所述KRP基因包括可以与所述Kr-h1基因的启动子区域的TTATTAA和AATAATCATT特异性结合的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方式，所述KRP基因为BmKRP(Bombyx mori L.Kr-h1regulatory protein)基因。
根据本发明的一些实施方式，所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明的一些实施方式，所述BmKRP基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据本发明的一些实施方式，所述调控为正调控。
研究表明，JH可抑制20E的合成，反过来20E也能抑制JH的生物合成从而促进变态发育。而Kr-h1不仅可响应JH诱导，也能响应20E诱导。本发明人研究发现，家蚕BmKr-h1启动子的-248nt～-202nt区域是响应20E诱导的关键区域，而-248nt～-202nt区域两端的DNA，-248nt～-241nt(TTATTAA)和-227nt～-217nt(AATAATCATT)，能与20E处理后的BmN细胞核蛋白特异结合，并在此基础上发现了能与BmKr-h1启动子上248nt～-241nt和-227nt～-217nt片段结合的转录因子BmKRP，其N-端含有3个典型的Cys2/His2锌指结构域，定位于细胞核；通过EMSA实验、ChIP实验、细胞内蛋白超表达及RNAi实验，进一步证明BmKRP确实能与BmKr-h1启动子上的20E响应元件(20E cis-regulatory element,20E CRE)结合进而激活的BmKr-h1转录表达。另外，在埃及伊蚊、意蜂、豌豆长管蚜、黑腹果蝇和赤拟谷盗中的Kr-h1基因的启动子上游区域均发现了类似的20E CRE元件(TTATTAA或AATAATCATT)。这表明，本发明所鉴定的Kr-h1启动子上的20E CRE在多个昆虫中是高度保守的，暗示了20E诱导Kr-h1表达不仅在昆虫中普遍存在，而且20E诱导Kr-h1表达的分子机理可能也是一样的。本发明的另一方面还提供了KRP基因作为制备特异性干扰有害昆虫基因表达或抑制有害昆虫生长的干扰分子或CRISPR/Cas9系统的抑制靶标或沉默靶标的应用，其中，所述KRP基因包括可以与所述Kr-h1基因的启动子区域的TTATTAA和AATAATCATT特异性结合的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方式，所述KRP基因为BmKRP基因。所述BmKRP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。进一步地，所述BmKRP基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据本发明的一些实施方式，所述干扰分子是KRP基因或其转录本为抑制靶标或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或者能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
根据本发明的一些实施方式，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9和特异性靶向KRP基因的sgRNA；其中，特异性靶向KRP基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
本发明另一方面还提供了KRP基因在制备防治有害昆虫的制剂中的应用，其中，所述KRP基因包括可以与所述Kr-h1基因的启动子区域的TTATTAA和AATAATCATT特异性结合的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方式，所述KRP基因为BmKRP基因。所述BmKRP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。进一步地，所述BmKRP基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据本发明的一些实施方式，所述有害昆虫为鳞翅目昆虫；优选地，所述有害昆虫为家蚕。
本发明人研究发现BmKRP的缺失使家蚕蛹体重降低了18.69％，蛹长和蛹宽分别减少了7.31％和18.61％，卵巢变小，卵巢内的卵子宽和长分别减少了11.03％和9.47％，产卵数减少了44.68％，表明BmKRP参与调控了家蚕卵巢发育和卵子生成，这对家蚕的生殖研究具有重要的理论意义，也为利用生殖进行益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供了线索。
本发明还提供了一种防治有害昆虫的方法，所述方法包括：下调有害昆虫体内KRP基因的表达或活性；其中，所述KRP基因包括可以与所述Kr-h1基因的启动子区域的TTATTAA和AATAATCATT特异性结合的核苷酸序列；优选地，所述KRP基因为BmKRP基因。所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。进一步地，所述BmKRP基因的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
根据本发明的一些实施方式，所述有害昆虫的基因组中具有KRP基因；
根据本发明的一些实施方式，所述下调有害昆虫体内KRP基因的表达或活性的方法包括：在有害昆虫的基因组中敲除或沉默KRP基因；或将下调KRP基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入有害昆虫体内。
根据本发明的一些实施方式，所述有害昆虫为鳞翅目昆虫。进一步地，所述有害昆虫为家蚕。
本发明还提供了一种敲除BmKRP基因的CRISPR/Cas9系统，包括Cas9和特异性靶向BmKRP基因的sgRNA；其中，特异性靶向BmKRP基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了如上所述敲除BmKRP基因的CRISPR/Cas9系统在制备防治有害昆虫的制剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明成功构建了家蚕BmKRP的CRISPR/Cas9敲除品系，初步探究了新的转录因子BmKRP对雌性家蚕生殖过程的影响，通过对家蚕BmKRP-/-表型的观察，发现BmKRP的缺失影响了家蚕的雌性生殖，导致卵巢变小、卵母细胞体积变小及成虫产卵数减少；并将其与BmKr-h1的调控联系起来，推测BmKRP的突变缺失，影响了BmKRP与BmKr-h1启动子上反应元件的结合，进而使得BmKr-h1不表达或者下调表达，同时也可能干扰了下游信号通路相关基因或营养相关通路基因的表达，进而影响家蚕卵巢发育和卵子生成。不仅丰富了BmKr-h1对家蚕生殖和卵成熟调控的认识，对家蚕激素调控生殖的分子机制的阐释(20E→BmKRP→BmKr-h1)具有重要的意义，也为益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供线索和理论指导，具有应用意义。
附图说明
图1BmKRP基因的ORF序列结构图；
图2BmKRP蛋白结构示意图；
图3为sgRNA合成电泳图；
图4为BmKRP-/-G0代家蚕死胚胎靶点序列PCR产物测序峰图；
图5为BmKRP-/-G0代突变检测结果；
图6为BmKRP-/-G1代突变检测结果；
图7为BmKRP-/-G2代杂合突变体检测结果；
图8为BmKRP-/-G2代纯合突变体检测结果；
图9为野生型与BmKRP-/-家蚕在不同生长阶段的外观图；
图10为野生型与BmKRP-/-家蚕的卵巢结构及卵子孵育情况；
图11为野生型与BmKRP-/-家蚕的受精卵和P6蛹的数据统计；
图12为BmKRP蛋白对BmKr-h1启动子活性的调控；
图13为不同昆虫种类中Kr-h1响应20E诱导元件的比对。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
昆虫：选用家蚕P50品系作为实验材料。蚕蛾产卵后先进行检毒处理，将检毒合格的蚕卵置于温度26℃、相对湿度70±5％、光照12：12(Light:Dark)的空间下饲养，孵化出的幼虫以新鲜桑叶喂养。在此条件下，产下的蚕卵于产卵7天后开始点青、8天后转青、9天后孵出幼虫，此为1龄幼虫，也称蚁蚕。蚁蚕经过3天后进入2龄，2龄与3龄、3龄与4龄之间也是间隔3天，4龄4天后家蚕开始蜕皮进入5龄，5龄家蚕约取食桑叶6-7天后，开始停食进入熟蚕期，蚕逐步排出肠道中剩余的食物，蚕体变得透亮，约半天左右开始吐丝，在结茧网上吐丝结茧约2天，然后进入预蛹期，约持续半天时间后蜕皮进入蛹期，蛹期经历8-9天后羽化成成虫。为了使所取材料发育时期保持较高的一致性，在预蛹阶段用剪刀剪去茧的一小侧，便于观察确定预蛹状态和化蛹的时间。
实施例中所涉及的引物均由中涉及的引物均由上海Invitrogen公司合成；所涉及的酶均购自TAKARA公司；Cas9蛋白购自PNA BIO INC(California，USA)；其余试剂均为分析纯试剂。
实施例中所用引物的序列如表1所示。
表1引物序列
实施例1 BmKRP的生物信息分析
BmKRP在NCBI的Genbank数据库的Accession number是XM_004922171.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_004922171.3/)，在NCBI数据库中尚未有关于该基因的描述或文章，其编码的蛋白目前是一个未知蛋白。通过对BmKRP的核酸序列进行分析可知，BmKRP基因全长2689bp，开放阅读框1557bp，包含3个外显子和2个内含子，3个外显子的大小分别为422bp、237bp和899bp，2个内含子的大小则为1195bp和1889bp(如图1所示)。BmKRP编码的蛋白在N-端存在3个典型的Cys2/His2锌指结构域，在C-端含有3个lowcomplexity区域(如图2所示)。推测其锌指结构域是作为转录因子BmKRP与DNA结合的结构域。BmKRP蛋白编码518个氨基酸，预测分子量为58.951kDa，等电点pI为9.25。
实施例2 sgRNA的设计与合成
(1)引物设计
根据靶点设计原则，使用在线靶点设计程序设计sgRNA核心序列并选择了site1作为靶位点(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的1015nt-1037nt为site1)，经测序验证，所用P50家蚕BmKRP靶点序列皆为纯合，可以作为Cas9作用的靶点。
(2)引物PCR
将设计好的正向和反向引物送公司合成，经过PCR程序互为引物扩增，合成完整的sgRNA序列转录模板。用于合成BmKRP靶点sgRNA所用的引物序列如表1所示(SEQ ID NO：3～4)。所用的PCR体系如表2所示，扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃复性15s，72℃延伸20s，29个循环；72℃再延伸2min；12℃保存。
表2合成sgRNA所用PCR体系
(3)构建sgRNA克隆载体
切胶回收上述PCR产物，将其连接至TAKARA的pMD-18T克隆载体，体系如表3所示。将所得质粒转化入DH5α感受态细胞(购于深圳市康体生命科技有限公司，货号KTSM101L)。
表3 pMD18/19-T载体克隆体系
| 试剂 | 体系/μL |
| DNA | 4.5 |
| 缓冲液 | 5 |
| PMD-18/19T | 0.5 |
| 总体积 | 10 |
(4)菌落PCR检测反向插入载体的克隆
挑选单克隆菌落。进行菌落PCR，菌落PCR所用引物为pMD-T-F(SEQ ID NO：7)和R20(SEQ ID NO：8)，菌落PCR所用PCR体系如表4所示，反应程序参照实施例2中的(2)引物PCR，后送测序。
表4菌落PCR所用PCR体系
(5)挑选无突变的单克隆菌群提质粒
应用天根质粒小提中量试剂盒(TIAN prep Mini Plasmid KitⅡ)进行质粒抽提。
(6)sgRNA体外转录模板制备
以无突变的质粒为模板，菌落PCR引物pMD-T-F(SEQ ID NO：7)和R20(SEQ ID NO：8)进行扩增一个约500bp的片段做最终体外转录模板，PCR反应体系如表5所示；
表5质粒PCR体系
| 试剂 | 体系/μL |
| 质粒模板 | 3ng |
| DNA聚合酶 | 0.3 |
| 10×PCR缓冲液 | 3 |
| pMD-T-F | 1 |
| R20 | 1 |
| dNTP混合液(2.5mM) | 0.6 |
| 加入ddH<sub>2</sub>O至总体积 | 30 |
PCR反应程序参照实施例2中的(2)引物PCR，PCR产物用苯酚氯仿(pH>7)的方法进行纯化，纯化后用Nuclease-free水溶解沉淀，1μL用于测浓度，1μL用于电泳检测。
(7)sgRNA的体外合成
以纯化后的PCR产物为模板，应用
Kit试剂盒进行体外转录，然后再用酚氯仿异戊醇方法纯化得注射所需sgRNA，取1μL sgRNA电泳检测，其余置于-80℃冰箱待用。结果如图3所示，其中，从左至右依次为M泳道、第1泳道和第2泳道；M：DL2000 Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；第1泳道为制备的sgRNA体外转录模板，与
Kit的合成要求的500bp相符；第2泳道为合成的sgRNA。
实施例3家蚕BmKRP-/-的CRISPR/Cas9敲除品系构建
1、实验方法
1)家蚕BmKRP突变体筛选
检测注射阳性情况
注射量：取适量已制备好的sgRNA和购买的Cas9蛋白，配制5μL混合液(sgRNA终浓度与Cas9终浓度均为600ng/μL)，本方案选择sgRNA混合后与Cas9蛋白同时注射到家蚕卵内。将Cas9蛋白2.5μL、site1 sgRNA 2.5μL混合均匀再注射，注射量约2-3nL/颗卵。
在注射卵孵化之后，通过收集多颗死胚混合来提取基因组，将提好的基因组DNA(按常规方法提取)用ddH2O稀释至100ng/μL，20μL PCR体系取1μL死胚基因组DNA作为模板，按表7加入模板/引物混合液，将混合液混匀后离心至管底，进行PCR反应。
PCR产物经电泳检测后直接送测序，若测序峰图上出现多层叠峰时，则表明该注射过的蚕卵发生了靶位点的DNA突变。
表7基因组DNA所用PCR体系
| 试剂 | 体系/μL |
| 基因组DNA | 1 |
| DNA聚合酶 | 0.2 |
| dNTP | 0.5 |
| 10×PCR缓冲液 | 2 |
| 引物SEQ ID NO：5 | 0.5 |
| 引物SEQ ID NO：6 | 0.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 补充至20 |
PCR反应程序参照实施例2中的(2)引物PCR。反应结束后1％的琼脂糖电泳检测。
2)BmKRP-/- G0代蛾子的检测
在未筛选出突变体的特异表型之前，要确保G0代存活个体的完整和正常生长，所以可提取G0代5龄蚕化蛹时的蚕蜕基因组进行PCR，PCR产物经电泳检测后送去测序，若PCR产物测序峰图出现双峰，说明靶位点DNA发生了突变，未出现双峰则仍是野生型。将有突变的PCR样品返回，进行TA-clone，连接T载体，混合突变会被一一分开，后转化涂板挑取阳性单克隆进行PCR，电泳检测后送去测序获得每一个具体的突变类型，通过与野生型靶序列比较，可得到具体的DNA碱基插入或缺失的情况。
基因组DNA的提取步骤和PCR反应体系参见“1)检测注射阳性情况”部分。
连接反应步骤：根据TAKARA产品说明书进行。
将所得质粒转化入DH5α感受态细胞。
从经过夜培养的具有氨苄青霉素抗性的LB平板上挑取单克隆菌落，参照“1)检测注射阳性情况”部分的PCR反应体系配置反应液并充分混合。
PCR反应程序参照实施例2中的(2)引物PCR。反应结束后1％的琼脂糖电泳检测。将出现特异DNA条带的PCR产物送去测序。
3)蛾子交配策略
对于注射后的蛾子(G0代)，测序后优先选取有双峰的杂合突变体作为亲本进行交配传代，此后各代均提取5龄蚕化蛹后的蚕蜕基因组DNA，按照2)中G0代蛾子检测的步骤选取有双峰的雌雄个体进行交配直至出现纯合突变体。
4)BmKRP-/-纯合突变体筛选和表型分析
由于还未能确定家蚕BmKRP的缺失会影响哪方面的功能，也有可能不会出现可见的外观表型，但根据BmKRP在卵巢中有高水平表达且利用RNA干扰方法降低蛹期BmKr-h1(BmKRP参与调控表达的基因)的表达影响了卵巢中部分卵母细胞的成熟，我们推测，BmKRP可能与家蚕生殖发育相关。因此，除外观表现外，还将观察BmKRP-/-纯合突变体中卵巢发育及产卵情况等。
2、实验结果
1)检测注射阳性情况
通过测序检测注射过的死胚胎，结果如图4所示，为BmKRP G0代家蚕死胚胎靶点序列PCR产物测序峰图，BmKRP靶点序列用下划线表示，可以看出，在峰图靶点处出现了叠峰，表明发生了突变，说明合成的sgRNA能准确发挥切割效应。
2)BmKRP-/- G0代突变体筛选
提取孵化的G0代所有5龄蚕化蛹后的蚕蜕基因组进行PCR，PCR产物直接送去测序。测序结果如图5所示，可以看出，在靶点附近出现双峰现象，表明成功获得突变基因的家蚕，可以进行纯合突变体筛选。将一部分靶位点都发生了突变的G0代雌雄蛾进行交配，一部分G0代突变体与野生型家蚕交配，后收集蚕卵并孵化，为筛选纯合突变体做准备。
3)BmKRP-/- G1代突变体筛选
正常喂养G1代幼虫，待其进入蛹期后，提取G1代所有5龄蚕化蛹时的蚕蜕基因组进行PCR，PCR产物直接送去测序，测序结果如图6所示，发现在靶位点设计的位置出现双峰现象，表明突变基因的家蚕能够成功进入蛹期，可以进行下一步突变体筛选。将测序出现双峰的样品选择返样，连接T载体，后转化涂板挑取阳性单克隆进行PCR，经电泳检测后送去测序，将突变体基因型测序结果与野生型靶序列在NCBI BLASTN线上网站进行比对，得到G1代突变体家蚕的基因型，如表8所示。发现在site 1发生突变。将含有相同基因型的突变体家蚕进行交配，进一步筛选纯合突变体。
表8 G1代突变体家蚕的基因型
注：靶点序列为加粗部分，PAM以下划线标记，短线表示碱基的删除，斜体标记代表碱基的插入，删除和插入的碱基数目在最右边标注(+，插入；-，删除)。
4)BmKRP-/- G2代突变体筛选
在G1中筛选出均携带有相同突变基因的亲本进行杂交，按照孟德尔遗传定律，它们交配所产的后代中(G2)很有可能会有纯合突变体。提取G2代所有5龄蚕化蛹时的蚕蜕基因组进行PCR，PCR产物经电泳检测后送去测序，测序结果如图7所示，发现在靶位点设计的位置出现双峰，表明该家蚕为杂合突变体，另一测序结果如图8所示，发现在靶位点设计的位置出现单峰，且在靶点位置缺失了4bp，表明该家蚕为纯合突变体，成功获得BmKRP-/-在靶点位置缺失了4bp的纯合突变体，突变体基因型为：AAAATGGGTTCAA----ACCAGG(-4)，“-”表示删除。
5)家蚕BmKRP-/-表型分析
将在G2代得到的缺失了4bp的纯合突变体作为亲本自交得到G3代家蚕，按照孟德尔遗传定律，G3代个体也是在靶点序列缺失了4bp的纯合突变体，至此家蚕BmKRP的CRISPR/Cas9敲除品系构建成功。将野生型家蚕的受精卵和G3代突变体的受精卵同步分开孵育，观察突变纯合体的表型。
①BmKRP-/-在不同生长阶段的表型观察
图9示出了野生型与BmKRP-/-家蚕在不同生长阶段的外观，其中Wt表示野生型，Bmkrp-/-表示BmKRP纯合突变体；通过对BmKRP-/-生长各个阶段外形和体型的观察，发现突变体在外表形态上与野生型无明显区别，在体型上略有差异。产卵后观察发现纯合突变体的卵在形态上与野生型无明显区别，但突变体产卵的数量相对较少(图9中a-b)；观察突变体和野生型的1龄幼虫(图9中c)和5龄幼虫(图9中d)，两者在体型和外型上均无明显区别；纯合突变体和野生型家蚕在蛹期第6天的外形上无明显区别，但纯合突变体的蛹体积明显较小(图9中e)；成虫期纯合突变体家蚕的体型略微比野生型小，外形上并无明显区别(图9中f)。上述结果表明，BmKRP可能作用于家蚕的蛹期和成虫期阶段。
②BmKRP-/-卵子发育和生殖相关表型观察
上述结果显示，与野生型相比，BmKRP-/-的蛹和成虫有差异。为进一步了解BmKRP突变对家蚕的影响，对成虫进行解剖，结果如图10所示，为野生型与纯合突变体家蚕的卵巢结构及卵子孵育情况，其中，Wt表示野生型，Bmkrp-/-表示BmKRP纯合突变体，(A)家蚕成虫时期的卵巢结构；(B)单条卵管内的卵子排列；(C)产卵后第8天的受精卵；(D)刚孵出的幼虫。可以看出，与野生型相比，BmKRP-/-的卵巢明显变短，其内部包含的卵子数量也相应减少，但卵子的形态并无明显变化(图10中A)；将卵巢中的卵管逐一分开，观察单条卵管内的卵子形态，可以看到与野生型家蚕相比，BmKRP-/-单条卵管内的卵子数目明显减少(图10中B)；观察产卵后第8天的受精卵，BmKRP-/-和野生型成虫产的卵大部分都能够成功进入转青期，这表明BmKRP的突变对受精卵的胚胎发育无显著影响(图10中C)；比较突变体和野生型刚孵出的幼虫，两者也无明显差异(图10中D)。上述结果初步表明，BmKRP可能与雌性生殖有关，主要包括影响卵巢发育和卵子生成。
③BmKRP-/-蛹、卵子及产卵数的分析
除了观察BmKRP-/-的外型和卵巢发育，我们还通过t-test统计分析了BmKRP-/-与野生型第6天蛹的体重、蛹长和蛹宽、成虫期卵子的长和宽及成虫产卵数的差异，结果如图11所示，其中，(A)蛹期第6天蛹的重量；(B)蛹期第六天蛹的长度；(C)蛹期第6天蛹的宽度；(D)成虫产卵数；(E)卵的长度；(F)卵的宽度。P6：蛹期第6天；Wt：野生型；Bmkrp-/-：BmKRP纯合突变体。“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p＜0.001，显著性统计均用t-检验的方法。结果显示，与野生型相比，BmKRP-/-蛹期第6天蛹的重量、长度和宽度都有所降低(图11中A-C)，分别下降了18.69％、7.31％和18.61％，表明BmKRP的缺失影响了蛹末期的正常生长。同时发现BmKRP-/-与野生型相比产卵数降低了44.68％(图11中D)；对成虫期未交配卵的长度和宽度的统计也发现BmKRP-/-比野生型降低了11.03％和9.47％(图11中E-F)。表明BmKRP的突变影响了家蚕成虫的卵子数目和卵成熟过程。由于家蚕蛹末期是体内卵子成熟的关键时期，所以初步推断BmKRP是通过维持蛹末期的正常生长来保证家蚕成虫的正常卵子生成和卵成熟。
实施例4 BmKRP对BmKr-h1启动子的作用
利用dsRNA合成试剂盒(T7 RiboMAXTM Express RNAi System，购自Promega公司)和两对带有T7启动子的引物(SEQ ID NO：9～12)合成BmKRP的dsRNA。
为检测BmKRP蛋白对BmKr-h1启动子的作用，将BmKRP-EGFP超表达载体(以EGFP载体作为对照)与WT-BmKr-h1-p-Luc质粒或Mut-BmKr-h1-p-Luc质粒(突变位点为-248nt～-217nt)及内参载体pRL-SV40共转染BmN细胞，48h后检测细胞内荧光素酶的活性；其中，BmKr-h1-p-Luc表示BmKr-h1启动子序列与pGL3的重组载体，WT表示启动子序列为野生型，Mut表示突变启动子上20E CRE位点的突变型。
为研究在BmN细胞中抑制BmKRP蛋白的表达是否会降低20E对BmKr-h1启动子的诱导，将BmKRP dsRNA转染BmN细胞24h，以GFP为对照，合成GFP dsRNA的引物序列如SEQ IDNO：13～16所示，并进行qRT-PCR(所用引物序列如SEQ ID NO：17～18所示)检测各基因的表达情况。
在细胞中转染BmKRP dsRNA(以EGFP dsRNA作为对照)24h后，再共转染WT-BmKr-h1-p-Luc质粒或Mut-BmKr-h1-p-Luc质粒及内参载体pRL-SV40进BmN细胞，6-8h后用终浓度为1μM的20E处理(DMSO处理为对照)，48h后测定细胞内荧光素酶的活性。
如图12所示，为BmKRP蛋白对BmKr-h1启动子活性的调控；A中a和b图表明在BmN细胞中能够成功地超表达BmKRP和EGFP蛋白，且表达量相当。B图可以看出，与在细胞中共转染EGFP和WT-BmKr-h1-p-Luc载体相比，共转染了BmKRP-EGFP和WT-BmKr-h1-p-Luc载体的细胞内的荧光素酶活性显著增强；而共转染了EGFP和突变型BmKr-h1-p-2877bp-mut-pGL3载体细胞内的荧光素酶活性与共转染了BmKRP-EGFP和Mut-BmKr-h1-p-Luc载体细胞内的荧光素酶活性无明显变化。这一结果表明，BmKRP蛋白通过BmKr-h1启动子上的-248nt～-217nt位点激活BmKr-h1启动子对下游基因进行转录。C图中可以看出，转染dsRNA后，BmKRP的表达量与对照相比显著降低，说明合成的dsRNA可以明显抑制BmKRP的表达。D图中可以看出，当共转染EGFP dsRNA和WT-BmKr-h1-p-Luc时，20E对BmKr-h1启动子有显著的激活作用，而当共转染BmKRP dsRNA和WT-BmKr-h1-p-Luc时，20E对BmKr-h1启动子没有显著的激活作用；在转染了Mut-BmKr-h1-p-Luc质粒的实验组中，无论是转染EGFP dsRNA还是BmKRP dsRNA，20E对突变的启动子都没有显著的激活作用。
上述结果表明，降低BmN细胞内的BmKRP抑制了BmKr-h1启动子对20E的响应，且20E是通过调控BmKRP蛋白结合到BmKr-h1启动子的-248nt～-217nt位点激活BmKr-h1启动子的。
实施例5不同昆虫中的Kr-h1响应20E诱导元件的比对
根据上述实施例的结果可知，BmKr-h1启动子上的-248nt～-217nt区域是响应20E的CRE。进一步发现-248nt～-217nt区域中的-248nt～-241nt(TTATTAA)和-227nt～-217nt(AATAATCATT)区域还是与细胞核蛋白结合所需的位点。
在果蝇、赤拟谷盗TcA细胞、棉铃虫的幼虫表皮中，20E处理均能诱导Kr-h1的表达(Pecasse et al.,2000；Xu et al.,2018；Zhang et al.,2018)，这暗示了在昆虫中，20E诱导Kr-h1表达可能是一个普遍现象。因此，我们将BmKr-h1启动子上响应20E并与核蛋白结合的TTATTAA(-248nt～-241nt)和AATAATCATT(-227nt～-217nt)检索埃及伊蚊、意蜂、豌豆长管芽、黑腹果蝇及赤拟谷盗的Kr-h1启动子序列，以分析这些昆虫的Kr-h1启动子上是否存在相似的元件。
分析结果显示，在埃及伊蚊、意蜂、豌豆长管蚜、黑腹果蝇和赤拟谷盗这些物种的Kr-h1启动子上均能找到类似的20E CRE元件(TTATTAA或AATAATCATT)
如图13所示，为不同昆虫种类中Kr-h1响应20E诱导元件的比对，图中，Aa：Aedesaegypti，埃及伊蚊；Am：Apis mellifera，意蜂；Ap：Acyrthosiphon pisum，豌豆长管蚜；Bm：Bombyx mori，家蚕；Dm：Drosophila melanogaster，黑腹果蝇；Tc：Tribolium castaneum，赤拟谷盗；数字表示的是与转录起始位点(AaKr-h1,BmKr-h1,TcKr-h1,AmKr-h1和DmKr-h1)或翻译起始位点(ApKr-h1)的距离；A图为-227nt～-217nt区域(AATAATCATT)的比对，B图为-248nt～-241nt(TTATTAA)区域序列的比对，可以看出，-248nt～-241nt(TTATTAA)区域序列和-227nt～-217nt区域(AATAATCATT)中的AATAAT在各物种中完全一致，且两个区域也是相邻或者有部分重叠。这表明我们所鉴定的Kr-h1启动子上的20E CRE在多个昆虫中是高度保守的，暗示了20E诱导Kr-h1表达不仅在昆虫中普遍存在，而且20E诱导Kr-h1表达的分子机理可能也是一样的。
实施例5不同昆虫中的BmKRP基因
由于多种昆虫的Kr-h1都能受到20E的诱导，且在多种昆虫的Kr-h1启动子上都能找到相似性很高的BmKr-h1(在NCBI上的Gene ID:100415910)启动子中响应20E诱导的位点-248nt～-241nt(TTATTAA)和-227nt～-217nt区域(AATAATCATT)。而BmKr-h1启动子上的-248nt～-241nt(TTATTAA)和-227nt～-217nt区域(AATAATCATT)可与BmKRP蛋白特异性结合。
为明确其它昆虫中是否也存在BmKRP的同源蛋白，我们首先在NCBI上比对到了BmKRP在其它昆虫的同源基因，包括鳞翅目(Lepidoptera)的棉铃虫(H.armigera,Ha)、绿棉铃虫(Heliothis virescens,Hv)、脐橙螟(Amyelois transitella,At)、偏瞳蔽眼蝶(Bicyclus anynana,Ba)、黑脉金斑蝶(Danaus plexippus,Dp)、金凤蝶(Papilio machaon,Pm)、玉带凤蝶(Papilio polytes,Pp)、菜粉蝶(Pieris rapae,Pr)、、小菜蛾(P.xylostella,Px)及斜纹夜蛾(S.litura,Sl)，并对它们的氨基酸相似性分析。结果显示，BmKRP与这些昆虫同源基因的氨基酸相似度在30％左右，家蚕(基因编号LOC101738779)与脐橙螟(基因编号LOC106134402)、偏瞳蔽眼蝶(基因编号LOC112056002)、黑脉金斑蝶(基因编号OWR50023.1)、棉铃虫(基因编号LOC110381305)、绿棉铃虫(基因编号B5V51_576)、玉带凤蝶(基因编号LOC106108092)、菜粉蝶(基因编号LOC110997796)、小菜蛾(基因编号LOC105380729)、金凤蝶(基因编号LOC106712588)和斜纹夜蛾(基因编号L0C111360983)中相比，相似性分别为33.8％、30.3％、29.2％、29.5％、32.0％、28.6％、28.8％、22.2％、24.7％和33.4％，属于中等水平(表2)，这可能与该蛋白在不同物种中的大小、蛋白结构、锌指结构域数量差异较大有关。
表2不同昆虫KRP氨基酸同源性(％)
注：At：Amyelois transitella，脐橙螟；Ba：Bicyclus anynana，偏瞳蔽眼蝶；Bm：Bombyx mori，家蚕；Dp：Danaus plexippus，黑脉金斑蝶；Ha：Helicoverpa armigera，棉铃虫；Hv：Heliothis virescens，绿棉铃虫；Pm：Papilio machaon，金凤蝶；Pp：Papiliopolytes，玉带凤蝶；Pr：Pieris rapae，菜粉蝶；Px：Plutella xylostella，小菜蛾；Pm：Papilio machaon，金凤蝶；Sl：Spodoptera litura，斜纹夜蛾。
虽然不同昆虫中BmKRP同源性基因的相似度并不是很高，但对不同昆虫中BmKRP的同源性基因进行氨基酸序列比对分析后，发现该蛋白在不同昆虫之间中度保守，都含有典型的Cys2/His2锌指结构域，但含有的Cys2/His2锌指结构域数目不一致，在N-端的3个锌指结构域内的氨基酸中度保守，末端的20个氨基酸高度保守。这一结果暗示了，Cys2/His2锌指结构域和末端的20个氨基酸使得该蛋白的功能保守。
综上，本发明在G0代采用突变杂合体作为亲本交配产生G1代，从而使G1代筛选出复合型杂合子(compound heterozygote)的概率大大提高。这里复合型杂合子指的是两个等位基因均发生了突变，由于突变是随机的，所以突变类型不一样，删除和插入的碱基也是随机的，类似于突变纯合子，属于有义的杂合突变。这可以作为一种快速获得纯合突变体的方法。
在对G1代的蚕蜕基因组测序和筛选时，鉴定并筛选出了较多的有义杂合突变，通过测基因型将具有相同突变类型的复合型杂合突变体进行交配，其后代G2中出现较多相同类型的纯合突变体，主要有在靶位点分别缺失1bp和4bp的纯合突变体及(-1，-4)复合型杂合突变。本发明将G2代中少量缺失了4bp的纯合突变体进行自交，产生均为缺失4bp的纯合突变体G3代，因此可直接观察G3代纯合突变体的表型，大大提高了纯合突变体的筛选效率。
利用CRISPR/Cas9技术，成功地构建了家蚕BmKRP的CRISPR/Cas9敲除品系，为分析纯合突变体的表型以及探索BmKRP的功能奠定了基础。在本实验中，也设计了BmKRP基因敲除的靶位点，结果显示CRISPR/Cas9系统在site 1切割的成功率较高。
通过对家蚕BmKRP-/-表型的观察，发现BmKRP的缺失影响了家蚕的雌性生殖，导致卵巢变小、卵母细胞体积变小及成虫产卵数减少，这可能也是造成BmKRP-/-在蛹和成虫阶段的体型都比野生型小的原因。因此，BmKRP主要参与调控家蚕的卵巢发育和卵子生成。
BmKr-h1在蛹末期和成虫期卵巢存在较高水平的表达，而蛹末期是家蚕体内卵子成熟的关键时期，暗示BmKr-h1可能参与家蚕的卵成熟过程。而利用RNAi降低蛹期BmKr-h1(BmKRP参与调控表达的基因)的表达也影响了卵巢中部分卵母细胞的成熟。BmKRP是在鉴定与BmKr-h1启动子上的20E响应元件结合的蛋白质过程中发现的新的转录因子，能够激活BmKr-h1的转录表达。在本发明中，利用CRISPR/Cas9突变BmKRP后，出现卵巢变小、卵子变小及成虫产卵数显著下降等现象。因此，推测，BmKRP的突变缺失，影响了BmKRP与BmKr-h1启动子上反应元件的结合，进而使得BmKr-h1不表达或者下调表达，同时也可能干扰了下游信号通路相关基因或营养相关通路基因的表达，进而影响家蚕卵巢发育和卵子生成。这是首次探究新鉴定的转录因子的功能。
本发明成功构建了家蚕BmKRP的CRISPR/Cas9敲除品系，初步探究了新的转录因子BmKRP对雌性家蚕生殖过程的影响，并将其与BmKr-h1的调控联系起来，不仅丰富了BmKr-h1对家蚕生殖和卵成熟调控的认识，对家蚕激素调控生殖的分子机制的阐释(20E→BmKRP→BmKr-h1)具有重要的意义，也为益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供线索和理论指导，具有应用意义。
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。
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cctaatcttc aaaatgtcta ttaacatcgc ctcaaaactt atcagggctt gttgtcaaat 300
taatcttttt atataagaat gagattaatt aaattgttta atacatgaaa ttttaattgc 360
tctattatca tttttcattg acgtgaacaa ataaatataa attaattata ttaaaaacgc 420
atactaaatg aaccagaacc agataattgt tgatttatgt cagcgcgaaa agcattagca 480
gataaggaag gatttctcaa gctcacagtg gaaataagtt cgaaaaatac aaatttaatg 540
cgcaaaactc catctgacga cactaagctt gcctgtgtag gtatttgtct atggtcggcg 600
cagattaagc acaagaaccc aaaaaataca attgtttttt tttgtcaaat gcttgttttg 660
tttgtgaaat acggctacat gttgtcaact ttcggcccgc ttagcaccag ttgggcagtg 720
tactcgttag accatttata gtcctagtga aaaaaaatga tgcatcatca ccatagaatt 780
gatgctgaga ataattaaat tgctcctgta ctgtgtagag tgcatgatct tctatccttg 840
ttcaacttcc taaactgtga ctttgttttc tctttcacct gtccgtaagc gttaacgtca 900
caaatccgtt ccattgttga cctgaatcta tggaacgttt tcaagattgt tcgcgtcgct 960
tgaacagtga aaaaaataca cttttatgac ctaattgaaa cgaatgctga acataaaatg 1020
ggttcaaaga taccaggaaa gttgagaagt caacggttga cgtgtaaatg tgatacttgt 1080
gctctaggat tcaaaaatgt gcaagcgtta cgttcgcacc aagccgttgc ccatccgctg 1140
aagaaaagga ttgcataccg acctaaaacc gaagttatag ccaaaaggaa gcttataccc 1200
cataaaaagg taataaaagt ggcccataaa atgaacaaaa catccgaaaa tgcttcgaca 1260
aaaaaatcac agccacacaa tttattaaga aaatacaaca ctaaaacgcc aatacctagt 1320
gaagacggga aacaatccga atttgagtgc ccggtttgtt ctaaaatatt caaggtttac 1380
tcctgggctt ggaaacacat ccagaaatat cattgcattg acgagaaagg gaaccctgtg 1440
taagtatagt ttcgcgccat aaatttgata caatataaag ttgacgaccc cacgtagttc 1500
tttttaaacc gctgcctgtt atgtagtaat aagtttataa aattaataat ataagcgcgc 1560
ctgcgctttg ctttttgtag taaccagacc aaaatttctc tgaaaaataa gacgattaca 1620
ttgttaatat tacatacagc atttgcgctg tttctgctag caatggacag gatacaatat 1680
aattatggta accagtcaga attgtgttca acagaaaaaa atgtactgat cgaaataact 1740
ctcagttata gcattttttt ttattgtttc tttacaaatg tgtatattaa tttagttcat 1800
tatttgcttt aggacattta tattttattg taataaattc ttaggtgaag taggtctcta 1860
tttaaataga catgaaaagt aagtttactg ccacttggtg acatttggag agcaatttct 1920
cactgcactc atcgtttgct acattatata ggtctgtatt actaaatggc atactatata 1980
agatcaagtg gagacaactt gtgagagccc tatgtaccag cgggataccc taggaccaca 2040
acaacaagaa caagaaagat actacagtgg gagttcaact acacattttt tatacatcat 2100
tagctatgtg taaaaacact ttaattaagt atattgtgtg tgatatcctt cgaaaagaca 2160
ttccctggcc tattaatatt aattctttta gtaactttag tatattctaa acatgtaaat 2220
attctgtgta aaattttatt tggcaatagt atttatcttt aaagtagtta gtccatcata 2280
ttttatttgt ttgtgctatt cttaaaatca aagtttcgcg tatggaattt attcatattt 2340
agtaaatttt ttccctctta ttacctgtca tttttgtgca tactttgata ttggcaaaat 2400
caatgccaaa ggcataggag ccaaattcct atttaaaaaa aagtatattg tgcaaaacca 2460
gcaattttca acagcaaatg tctgaacaaa ttatgattta agttactaca aatattactg 2520
aagtattaga atatttttat aaaacaaatc atgattccca ttagactata gctttaggag 2580
gtaaacaaat ctcacatttt ctatatacca tcctaacaac accatggttt tgcagtttac 2640
caacatcgaa agatataatc aagccagttc gtatagaacg ttgcatcgcc tgtaatgtat 2700
taataaagtc cgatgatcat acatgtggta tatcattctc taacgttctg aagagccagt 2760
actcttgtct cggttgcaat cagcagttca atactttaca tttgtacgaa ctacacatag 2820
caggacttca cagtgaagga gctgagaacc tgttctttcc tgatgaggct ggtgagtttt 2880
attaatgaat aaatttgagt ttagctgtaa tctttcatag gtaacatcat tccttctatt 2940
tcccgggaaa caagaacact tttcagattt atgagtgaca tcagaaaagc ttttgcattg 3000
tgcttttttt ataagcttca gaaccaccca gattgagtaa tagaaagatg aggtatcaaa 3060
ttgatagtgt agcaacctca aagcattaac gttactggtg atgtctggat gtcttgtgag 3120
tccgcacagg tagataccac caccctgcct atttctgacg tgaagcagta atgcgtttcg 3180
tttaaagggt ggcgcagttg ttttaactat acttgagacc ttaaaactta tatctcaagg 3240
tggttggcgt atttacgttg tagatgtata tgggctccag taaccactga acaccaggcg 3300
ggctgtgagc ttgtccaccc aactaagcaa taaaaaatta ctataataaa aatatgaatt 3360
acattgaatg tcaccagcat ataggggatg agtttttaac cacatgctag ttgatttagt 3420
tttagtcatt tttgtttttc tatctaagct gatacctaca cgtaaagggc tcaaacctga 3480
cgacgttgct aacacgatta ctggtgcttg aggtacctca aagcaccgtt agtggatcgg 3540
ggggatccga aatgacgtgt tttgtgcgac gtcgaatgct ttccattcgg tccacagaat 3600
cggaagagta taatagtaca atattattga gggccactaa ttgtatcttt gtaagacatt 3660
tatatcccga cttcatgaat atatggaaac atttctgtaa caatgcaggt aagagagctg 3720
ctagaatgag aaaagcttag tcaaatttat tctgaattaa gaaataaata catatattgt 3780
accaggtatc aatacatata ttgtatcggt aaaatgcaaa taaacacttc aaaatatatt 3840
tttttattga tgtcttatgt tggtgtaaag tttgttatca aaaaaagttt ttaaaactta 3900
tggcgccacg gtaccgaaat gaagtctaca taaaattgct tgttaaaaaa attgtttccc 3960
attacagtca gataaagtat aaattaatta cccacacaaa aatttttaat gataattgtc 4020
gttctgaatt accatattgt aattcatttg aggtttgata gcacacgaac cccattttga 4080
ctggtgctcg taatttcatt acctctttag cacaccgtaa tttttgtgaa aaaaaaagaa 4140
gtgagcgtct cgggaaaccc taccagaagt gataaattaa acaaatcaag ttgaactatt 4200
taatattaaa attatttaac ttgagacaaa gcttaggtta tttcttaaat tttatgtata 4260
ttaatattat aatgtaagga aaactgtaac atacattgaa aaagatacaa aaaatagtta 4320
ggagttacat acgttctcaa tgccaccacc gtgtgcgtga gagaaaggga agccagacag 4380
actggcgccg taacgcgcca cgtaaccaag cgtcttaccc gcccataaga agttattact 4440
tcaacaaaag caagaaaaat attagtacac aagctgtacc cgtccacttc gctgggcatt 4500
taacattaac attattattc ctcaccccca caaagattat catcattgac gccccccaac 4560
tggtgtaggg agtccaacac tcatgtaaat atcagcctat ccattaagta catgtatttt 4620
ctatatggat accaagtttc aagtgaatcg gatgcacggt tcagtagtta taacggaaca 4680
tccgtaaaaa ccactgtagc tttatatatt agtattgatt tatgtattat tgtcgaaatt 4740
taataagcga tttgttgcag cgttctcggc gtggcgacag gacacggaga aacgctgcga 4800
tataaaatac acgaccctaa gcaaaattga taatatgcaa atatatcact gcagtcacat 4860
gaaatgcgac agctctacgg ccagcatgtg cccgtctagc ttcacgaagc aagagttcag 4920
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cctccccgag gagttcaaga agtactcaat aagctcactg ttgagagata cggattgtta 5040
caccgtgctg agcgtcgact gtgactcgga cgacctcagc gtgcaattca agaggttaat 5100
ggacactatt ttgggtaaat cgttgcatgt taaggagaac gtattgaaat tgttgtacgg 5160
taaagcactg gagatggctt cgctgttgaa cgatgaggct ggctgtaaaa ttgagtgtca 5220
gaatggtaag gagctcgcta aaaagacatc caccgatgac attgtcgagg acgaatctaa 5280
acttgacacg gaaatgaaaa caaaagtgcc cgttaagact tacagcaata cgaggaagaa 5340
cgtgaagttt gaggacaaca aaattgggtc cccgaagttc gggtcgcccg cgtcgctgac 5400
gtcattcaat gattcgtacc ggcacttcgt cgaggacacc ctgggcgcgg tcgacgagaa 5460
aattaaaaag aaaaaaatga tcgttaaaac cagaataggg cagttcaagc ccacctcacc 5520
gacaaacgac agggcgacaa taaaaaaatc gcccaagtct tcaaccaaag ttaaaagtag 5580
cctaagattg aaacgcgact tcgaatacga agtcatagaa agggacaaag aatgcaacat 5640
tatggttata aaaatttaag aaaaaaaaaa aaacaataaa aagcaacttt tcgttgttgt 5700
aaatcaaatt taaattacgc atcgactgaa aagaattaag tttttaaaaa cgtctataaa 5760
ttttgtacaa taaa 5774
<210> 2
<211> 518
<212> PRT
<213> Bombyx mori
<400> 2
Met Gly Ser Lys Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ser Gln Arg Leu Thr Cys
1 5 10 15
Lys Cys Asp Thr Cys Ala Leu Gly Phe Lys Asn Val Gln Ala Leu Arg
20 25 30
Ser His Gln Ala Val Ala His Pro Leu Lys Lys Arg Ile Ala Tyr Arg
35 40 45
Pro Lys Thr Glu Val Ile Ala Lys Arg Lys Leu Ile Pro His Lys Lys
50 55 60
Val Ile Lys Val Ala His Lys Met Asn Lys Thr Ser Glu Asn Ala Ser
65 70 75 80
Thr Lys Lys Ser Gln Pro His Asn Leu Leu Arg Lys Tyr Asn Thr Lys
85 90 95
Thr Pro Ile Pro Ser Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Phe Glu Cys Pro
100 105 110
Val Cys Ser Lys Ile Phe Lys Val Tyr Ser Trp Ala Trp Lys His Ile
115 120 125
Gln Lys Tyr His Cys Ile Asp Glu Lys Gly Asn Pro Val Leu Pro Thr
130 135 140
Ser Lys Asp Ile Ile Lys Pro Val Arg Ile Glu Arg Cys Ile Ala Cys
145 150 155 160
Asn Val Leu Ile Lys Ser Asp Asp His Thr Cys Gly Ile Ser Phe Ser
165 170 175
Asn Val Leu Lys Ser Gln Tyr Ser Cys Leu Gly Cys Asn Gln Gln Phe
180 185 190
Asn Thr Leu His Leu Tyr Glu Leu His Ile Ala Gly Leu His Ser Glu
195 200 205
Gly Ala Glu Asn Leu Phe Phe Pro Asp Glu Ala Ala Phe Ser Ala Trp
210 215 220
Arg Gln Asp Thr Glu Lys Arg Cys Asp Ile Lys Tyr Thr Thr Leu Ser
225 230 235 240
Lys Ile Asp Asn Met Gln Ile Tyr His Cys Ser His Met Lys Cys Asp
245 250 255
Ser Ser Thr Ala Ser Met Cys Pro Ser Ser Phe Thr Lys Gln Glu Phe
260 265 270
Ser Lys Gly Ile Gln Val Val Tyr Tyr Lys Ala His Tyr Gly His Ile
275 280 285
Ile Asp Glu Tyr Thr Leu Pro Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Ser Ile Ser
290 295 300
Ser Leu Leu Arg Asp Thr Asp Cys Tyr Thr Val Leu Ser Val Asp Cys
305 310 315 320
Asp Ser Asp Asp Leu Ser Val Gln Phe Lys Arg Leu Met Asp Thr Ile
325 330 335
Leu Gly Lys Ser Leu His Val Lys Glu Asn Val Leu Lys Leu Leu Tyr
340 345 350
Gly Lys Ala Leu Glu Met Ala Ser Leu Leu Asn Asp Glu Ala Gly Cys
355 360 365
Lys Ile Glu Cys Gln Asn Gly Lys Glu Leu Ala Lys Lys Thr Ser Thr
370 375 380
Asp Asp Ile Val Glu Asp Glu Ser Lys Leu Asp Thr Glu Met Lys Thr
385 390 395 400
Lys Val Pro Val Lys Thr Tyr Ser Asn Thr Arg Lys Asn Val Lys Phe
405 410 415
Glu Asp Asn Lys Ile Gly Ser Pro Lys Phe Gly Ser Pro Ala Ser Leu
420 425 430
Thr Ser Phe Asn Asp Ser Tyr Arg His Phe Val Glu Asp Thr Leu Gly
435 440 445
Ala Val Asp Glu Lys Ile Lys Lys Lys Lys Met Ile Val Lys Thr Arg
450 455 460
Ile Gly Gln Phe Lys Pro Thr Ser Pro Thr Asn Asp Arg Ala Thr Ile
465 470 475 480
Lys Lys Ser Pro Lys Ser Ser Thr Lys Val Lys Ser Ser Leu Arg Leu
485 490 495
Lys Arg Asp Phe Glu Tyr Glu Val Ile Glu Arg Asp Lys Glu Cys Asn
500 505 510
Ile Met Val Ile Lys Ile
515
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
taatacgact cactatagga aaatgggttc aaagataccg ttttagagct agaaatagca 60
agttaaaata aggctagtcc 80
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60
gctatttcta gctctaaaa 79
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gtactgtgta gagtgcatga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
aggtattggc gttttagtgt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
cggtgatgac ggtgaaaacc tc 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
aagcaccgac tcggtgcc 18
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
taatacgact cactataggg gaagcttata ccccataaaa aggt 44
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
tagttcgtac aaatgtaaag tattg 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
ggaagcttat accccataaa aaggt 25
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
taatacgact cactataggt agttcgtaca aatgtaaagt attg 44
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
tacggcgtgc agtgcttcag cc 22
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
taatacgact cactataggg tgctcaggta gtggttgtcg g 41
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
taatacgact cactataggt acggcgtgca gtgcttcagc c 41
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
gtgctcaggt agtggttgtc gg 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
accagaatag ggcagttcaa g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
ctttggttga agacttgggc 20
Claims (9)
1.KRP基因在制备抑制Kr-h1基因表达药物中的应用，其特征在于，所述KRP基因为BmKRP基因，所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.KRP基因作为制备特异性干扰有害昆虫基因表达或抑制有害昆虫生长的干扰分子或CRISPR/Cas9系统的抑制靶标或沉默靶标的应用，其特征在于，所述KRP基因为BmKRP基因，所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述干扰分子是KRP基因或其转录本为抑制靶标或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或者能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9和特异性靶向KRP基因的sgRNA。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性靶向KRP基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
6.KRP基因在制备防治有害昆虫的制剂中的应用，其特征在于，所述KRP基因为BmKRP基因，所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
7.一种防治有害昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括：下调有害昆虫体内KRP基因的表达或活性；其中，所述KRP基因为BmKRP基因，所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
8.根据权利要求7所述的防治有害昆虫的方法，其特征在于，所述下调有害昆虫体内KRP基因的表达或活性的方法包括：在有害昆虫的基因组中敲除或沉默KRP基因；或将下调KRP基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入有害昆虫体内。
9.一种敲除BmKRP基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括Cas9和特异性靶向BmKRP基因的sgRNA；其中，特异性靶向BmKRP基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。
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| Publication Number | Publication Date |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN106834339A (zh) * | 2017-01-04 | 2017-06-13 | 天津大学 | 特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP‑RNAi表达盒及应用 |
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2020
- 2020-08-20 CN CN202010844257.0A patent/CN112062824B/zh not_active Expired - Fee Related
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|---|
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