CN112048506B - BmKRP基因的dsRNA及其在害虫防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及BmKRP基因的dsRNA及其在害虫防治中的应用。本发明首次发现了BmKRP的缺失会影响了家蚕的雌性生殖，导致卵巢变小、卵母细胞体积变小及成虫产卵数减少；并将其与BmKr‑h1的调控联系起来，推测BmKRP的突变缺失，影响了BmKRP与BmKr‑h1启动子上反应元件的结合，进而使得BmKr‑h1不表达或者下调表达，同时也可能干扰了下游信号通路相关基因或营养相关通路基因的表达，进而影响家蚕卵巢发育和卵子生成。本发明结合RNA干扰技术，提供了针对BmKRP基因的dsRNA，也为益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供线索和理论指导，具有应用意义。

Description

BmKRP基因的dsRNA及其在害虫防治中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及BmKRP基因的dsRNA及其在害虫防治中的应用。

背景技术

家蚕是一种鳞翅目泌丝昆虫，属无脊椎动物，节肢动物门蚕蛾科蚕蛾属桑蚕种。作为一种重要的经济昆虫，家蚕的丝具有很高的商业价值，不仅是珍贵的纺织原料，且在军工、交电等方面也有广泛用途，此外，家蚕的蛹、蛾和蚕砂也可综合利用，是多种化工和医药工业的原料及植物的养料。在科研领域，家蚕作为在科研领域，家蚕作为鳞翅目的重要模式昆虫，被广泛用于研究昆虫生殖遗传与变态发育，从而掌握并利用其生长调控机制，最终达到农林业害虫防治等效果。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指外源或内源的双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象。RNAi作为研究功能基因组学的一个技术平台，促进了昆虫基因功能研究的革命。RNAi包括起始阶段和效应阶段；在RNAi起始阶段，加入的双链RNA被切割成21～23bp长的小分子干扰RNA片段(smallinterfering RNA,siRNA)。在效应阶段，siRNA双链结构结合一个核酶复合物，形成了RNA诱导的沉默复合物，其正义链被释放出来后，反义链将作为引导链与靶mRNA作用。从而精确的降解与siRNA序列相同的mRNA，完全抑制该基因在细胞内的翻译和表达。RNAi具有较高的特异性，能够非常特异性地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给下一代。

近年来，RNAi技术在田间作物保护中的应用成为了研究热点。一方面，通过转基因作物作为自身转录合成害虫靶标基因的dsRNA，当害虫生物取食转基因作物时，引发害虫体内发生RNAi，降低害虫的取食能力。另一方面，以化学合成siRNA作为生物农药。现有研究都表明了RNAi技术作为防治害虫的方法是可行的。RNAi防治害虫的效果依赖于高效的干扰片段和简便的导入方法，筛选大量有效的靶标基因是RNAi应用于害虫防治的基础。因此，靶标基因的筛选、dsRNA的设计是害虫防治的关键。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明基于一种新的靶标BmKRP(Bombyx mori Kr-h1 regulatory protein)基因，提供了其dsRNA，及在害虫防治中的应用。

本发明的技术方案如下文所示。

本发明一方面提供了BmKRP基因，其中，所述BmKRP基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

本发明又一方面还提供了一种BmKRP基因的双链RNA(dsRNA)分子，所述双链RNA分子包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列。

根据本发明的一些实施方式，合成所述双链RNA分子的引物包括序列如SEQ IDNO:2～3所示的引物对和如SEQ ID NO:4～5所示的引物对。

本发明还提供了一种核酸构建体，其包含如上所述的双链RNA分子中的至少一条链。

本发明还提供了一种核酸分子，其编码如上所述的双链RNA分子中的至少一条链。

本发明还提供了一种核酸构建体，其包含如上所述的核酸分子。

本发明还提供了一种重组载体，其包含调节序列，所述调节序列可操作地连接至编码如上所述的双链RNA分子的至少一条链的核苷酸序列。

本发明还提供了宿主细胞，其包含如上所述的核酸构建体或如上所述的核酸分子或如上所述的重组载体。

本发明还提供了一种组合物，其包含两个或更多个如上所述的双链RNA分子。

根据本发明的一些实施方式，所述两个或更多个双链RNA分子存在于同一核酸构建体上、存在于不同的构建体上或其任何组合。

本发明还提供了一种用于抑制昆虫BmKRP基因表达的组合物，其包含如上所述的双链RNA分子。

根据本发明的一些实施方式，所述组合物还包括农业上可接受的载体。

本发明还提供了如上所述的双链RNA分子、如上所述的核酸构建体、如上所述的重组载体或如上所述的组合物的用途，所述用途包括：调控昆虫滞育、制备调控昆虫滞育的产品、防治害虫或制备防治害虫的产品。

根据本发明的一些实施方式，所述昆虫为鳞翅目昆虫；优选地，所述昆虫为家蚕。

已有研究详细阐释了JH介导的BmKr-h1(Krüppel homolog 1)诱导表达的分子机制。研究表明，保幼激素(Juvenile hormone,JH)可抑制20-羟基蜕皮酮(20-Hydroxyecdysone,20E)的合成，反过来20E也能抑制JH的生物合成从而促进变态发育。Kr-h1在昆虫生殖和卵成熟过程中也发挥着重要作用；Kr-h1不仅可响应JH诱导，也能响应20E诱导。BmKRP是一未知蛋白，尚未有相关的研究报道，本发明人研究发现，家蚕BmKr-h1启动子的-248～-202nt区域是响应20E诱导的关键区域，而-248～-202nt区域两端的DNA，-248～-241nt(TTATTAA)和-227～-217nt(AATAATCATT)，能与20E处理后的BmN细胞核蛋白特异结合，并在此基础上发现了能与BmKr-h1启动子上248～-241nt和-227～-217nt片段结合的转录因子BmKRP，其N-端含有3个典型的Cys2/His2锌指结构域，定位于细胞核；通过EMSA实验、ChIP实验、细胞内蛋白超表达及RNAi实验，进一步证明BmKRP确实能与BmKr-h1启动子上的20E响应元件(20E cis-response element,20E CRE)结合进而激活的BmKr-h1转录表达。

发明人通过研究进一步发现，BmKr-h1启动子上的-248～-217nt区域是响应20E的顺式反应元件(CRE)。-248～-217nt区域中的-248～-241nt(TTATTAA)和-227～-217nt(AATAATCATT)区域还是与细胞核蛋白结合所需的位点。且在埃及伊蚊、意蜂、豌豆长管蚜、黑腹果蝇和赤拟谷盗中的Kr-h1基因的启动子上游区域也发现了类似的20E CRE元件(TTATTAA或AATAATCATT)。这表明鉴定的Kr-h1启动子上的20E CRE在多个昆虫中是高度保守的，推测这些昆虫中Kr-h1启动子上的20E CRE可能也能响应20E的诱导。在果蝇中，与BmKRP相似性最高的基因Dmel_CG12942，在C-端含有10个ZnF-C₂H₂结构域，这暗示了BmKRP在不同昆虫中的功能可能较保守。利用CRISPR-Cas9技术缺失果蝇中的Dmel_CG12942基因的Zinc-finger associated domain，观察突变体果蝇的表型变化发现，Dmel_CG12942的功能与雌性生殖有关，影响卵巢中卵子的发育进程，并对卵巢的排卵也有一定的影响。

本发明的有益效果：

本发明通过对家蚕BmKRP^-/-表型的观察，发现BmKRP的缺失影响了家蚕的雌性生殖，导致卵巢变小、卵母细胞体积变小及成虫产卵数减少；并将其与BmKr-h1的调控联系起来，推测BmKRP的突变缺失，影响了BmKRP与BmKr-h1启动子上反应元件的结合，进而使得BmKr-h1不表达或者下调表达，同时也可能干扰了下游信号通路相关基因或营养相关通路基因的表达，进而影响家蚕卵巢发育和卵子生成。不仅丰富了BmKr-h1对家蚕生殖和卵成熟调控的认识，对家蚕激素调控生殖的分子机制的阐释(20E→BmKRP→BmKr-h1)具有重要的意义，在此基础上，结合RNA干扰技术，提供了针对BmKRP基因的dsRNA，也为益虫利用和害虫防治新靶标与新策略提供线索和理论指导，具有应用意义。

附图说明

图1BmKRP基因的ORF序列结构图；

图2BmKRP蛋白结构示意图；

图3为BmKRP蛋白对BmKr-h1启动子活性的调控结果图；

图4为对BmKr-h1进行RNA干扰后的不同组织中mRNA表达水平的变化图；

图5为BmKr-h1 RNAi后家蚕发育的表型观察；

图6为BmKr-h1 RNAi后胚胎发育情况；

图7为BmKr-h1 RNAi后卵内胚胎发育情况；

图8为sgRNA合成电泳图；

图9为野生型与BmKRP^-/-家蚕在不同生长阶段的外观图；

图10为野生型与BmKRP^-/-家蚕的卵巢结构及受精卵孵育情况；

图11为野生型与BmKRP^-/-家蚕的受精卵和P6蛹的数据统计。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

昆虫：选用家蚕P50品系作为实验材料。蚕蛾产卵后先进行检毒处理，将检毒合格的蚕卵置于温度26℃、相对湿度70±5％、光照12:12(Light:Dark)的空间下饲养，孵化出的幼虫以新鲜桑叶喂养。在此条件下，产下的蚕卵于产卵7天后开始点青、8天后转青、9天后孵出幼虫，此为1龄幼虫，也称蚁蚕。蚁蚕经过3天后进入2龄，2龄与3龄、3龄与4龄之间也是间隔3天，4龄4天后家蚕开始蜕皮进入5龄，5龄家蚕约取食桑叶6-7天后，开始停食进入熟蚕期，蚕逐步排出肠道中剩余的食物，蚕体变得透亮，约半天左右开始吐丝，在结茧网上吐丝结茧约2天，然后进入预蛹期，约持续半天时间后蜕皮进入蛹期，蛹期经历8-9天后羽化成成虫。为了使所取材料发育时期保持较高的一致性，在预蛹阶段用剪刀剪去茧的一小侧，便于观察确定预蛹状态和化蛹的时间。

BmN表示家蚕卵巢来源细胞株、GFP表示绿色荧光蛋白基因；EGFP(绿色荧光蛋白表达载体)购于美国Clontech Laboratories公司；pGL3(荧光素酶报告载体)购于美国Promega公司；pRL-SV40(海肾荧光素酶载体)购于美国Promega公司、pMD-18T(T载体)购于TAKARA公司；Cas9蛋白购自PNABIO INC(California，USA)。

实施例中所涉及的引物均由上海Invitrogen公司合成；所涉及的酶均购自TAKARA公司；其余试剂均为分析纯试剂。

实施例中所用引物的序列如表1所示。

表1引物序列

实施例1 BmKRP的生物信息分析

BmKRP在NCBI的Genbank数据库的Accession number是XM_004922171.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_004922171.3/)，在NCBI数据库中尚未有关于该基因的描述或文章，其编码的蛋白目前是一个未知蛋白。通过对BmKRP的核酸序列进行分析可知，BmKRP基因mRNA全长2689bp，开放阅读框1557bp，包含3个外显子和2个内含子，3个外显子的大小分别为422bp、237bp和899bp，2个内含子的大小则为1195bp和1889bp(如图1所示)。BmKRP编码的蛋白在N-端存在3个典型的Cys2/His2锌指结构域，在C-端含有3个lowcomplexity区域(如图2所示)。推测其锌指结构域是作为转录因子BmKRP与DNA结合的结构域。BmKRP蛋白编码518个氨基酸，预测分子量为58.951kDa，等电点pI为9.25。

实施例2 dsRNA的合成及对BmKr-h1基因的影响

利用dsRNA合成试剂盒(T7 RiboMAXTM Express RNAi System，购自Promega公司)和两对带有T7启动子的引物(SEQ ID NO：2～5)合成BmKRP的dsRNA(SEQ ID NO:1)。

为检测BmKRP蛋白对BmKr-h1启动子的作用，将BmKRP-EGFP超表达载体(以EGFP载体作为对照)与WT-BmKr-h1-p-Luc质粒或Mut-BmKr-h1-p-Luc质粒(突变位点为-248nt～-217nt)及内参载体pRL-SV40共转染BmN细胞，48h后检测细胞内荧光素酶的活性；其中，BmKr-h1-p-Luc表示BmKr-h1启动子序列与pGL3的重组载体，WT表示启动子序列为野生型，Mut表示突变启动子上20E CRE位点的突变型。

为研究在BmN细胞中抑制BmKRP蛋白的表达是否会降低20E对BmKr-h1启动子的诱导，将BmKRP dsRNA转染BmN细胞24h，以GFP为对照，合成GFP dsRNA的引物序列如SEQ IDNO：13～16所示，并进行qRT-PCR(所用引物序列如SEQ ID NO：17～18所示)检测各基因的表达情况。

在细胞中转染BmKRP dsRNA(以EGFP dsRNA作为对照)24h后，再共转染WT-BmKr-h1-p-Luc质粒或Mut-BmKr-h1-p-Luc质粒及内参载体pRL-SV40进BmN细胞，6-8h后用终浓度为1μM的20E处理(DMSO处理为对照)，48h后测定细胞内荧光素酶的活性。

如图3所示，为BmKRP蛋白对BmKr-h1启动子活性的调控；A中a和b图表明在BmN细胞中能够成功地超表达BmKRP和EGFP蛋白，且表达量相当。B图可以看出，与在细胞中共转染EGFP和WT-BmKr-h1-p-Luc载体相比，共转染了BmKRP-EGFP和WT-BmKr-h1-p-Luc载体的细胞内的荧光素酶活性显著增强；而共转染了EGFP和突变型BmKr-h1-p-2877bp-mut-pGL3载体细胞内的荧光素酶活性与共转染了BmKRP-EGFP和Mut-BmKr-h1-p-Luc载体细胞内的荧光素酶活性无明显变化。这一结果表明，BmKRP蛋白通过BmKr-h1启动子上的-248nt～-217nt位点激活BmKr-h1启动子对下游基因进行转录。C图中可以看出，转染dsRNA后，BmKRP的表达量与对照相比显著降低，说明合成的dsRNA可以明显抑制BmKRP的表达。D图中可以看出，当共转染EGFP dsRNA和WT-BmKr-h1-p-Luc时，20E对BmKr-h1启动子有显著的激活作用，而当共转染BmKRP dsRNA和WT-BmKr-h1-p-Luc时，20E对BmKr-h1启动子没有显著的激活作用；在转染了Mut-BmKr-h1-p-Luc质粒的实验组中，无论是转染EGFP dsRNA还是BmKRP dsRNA，20E对突变的启动子都没有显著的激活作用。

上述结果表明，降低BmN细胞内的BmKRP抑制了BmKr-h1启动子对20E的响应，且20E是通过调控BmKRP蛋白结合到BmKr-h1启动子的-248nt～-217nt位点激活BmKr-h1启动子的。

实施例3 BmKr-h1基因对家蚕发育的影响

为研究BmKr-h1在蛹末期和成虫期的功能，用dsRNA合成试剂盒(T7RiboMAXTMExpress RNAi System，购自Promega公司)和两对带有T7启动子的引物(SEQ ID NO：19～22)合成BmKr-h1的dsRNA(SEQ ID NO：27)。将合成的BmKr-h1的双链RNA注入刚进入蛹期第6天(P6)的家蚕蛹腹部(每头注射15μg)作为实验组(dsKr-h1)，以注射GFP dsRNA为对照(Mock)，进行qRT-PCR；其中BmKr-h1-RNAi的qRT引物序列如SEQ ID NO：23～24所示，BmRP49的qRT引物序列如SEQ ID NO：25～26所示。

如图4所示，为对BmKr-h1进行RNA干扰后的不同组织中mRNA表达水平的变化；从A到C图，可以看出，与对照组相比，BmKr-h1在表皮、翅和精巢中的表达量没有明显变化，表明RNAi在表皮、翅和精巢中未发挥显著效果；D图和E图则可以看出，在卵巢中，与对照组相比，注射BmKr-h1 dsRNA 24h和48h后，BmKr-h1的表达量显著下降，在72h后表达量没有明显变化，这表明，RNAi在卵巢中有效，且作用于卵巢中的卵子。

为研究BmKr-h1 RNAi后家蚕发育和生殖相关表型，在蛹期第6天(P6)注射BmKr-h1dsRNA(dsKr-h1)，并与对照组(Mock)的蛹和蛾的表型进行比较。

经过观察发现，对照组与BmKr-h1 RNAi组的蛹期历时均为8天左右，无显著差异；对照组与BmKr-h1 RNAi组的化蛾均在94％以上，无显著性差异，这表明BmKr-h1 RNAi未影响家蚕的化蛾。

如图5所示，为BmKr-h1 RNAi后家蚕发育的表型观察，A图可以看出注射了BmKr-h1dsRNA后，RNAi组家蚕蛹期表皮和翅与对照组相比没有差异；而B图中化蛾后，RNAi组和对照组都出现了少量翅发育不正常的蛾。

为了研究RNAi后，是否会导致蚕卵受精后发育受阻，进一步检测了BmKr-h1RNAi组产下的异常卵内部的胚胎发育情况。

如图6所示，为BmKr-h1 RNAi后胚胎发育情况；图中，所有比例尺均为表示1000μm；(a)图中，对照组家蚕产的卵在3天时，卵外部呈黄色，颜色均一，卵壳外部有光泽；而(e)图BmKr-h1 RNAi组的缺陷卵则外部颜色不均一，呈黄黑色，且在卵的边缘或中间部位有黑色斑块，且卵没有透亮的光泽。(b)图可以看出，在卵产下5天后，对照组中的卵可清晰观察到卵内部的胚胎发育情况，可看到胚胎的黑色轮廓；而(f)图BmKr-h1 RNAi组的异常卵的卵壳开始凹陷，没有正常卵的饱满状态，且卵变成了棕褐色。(c)图可以看出，在产卵7天后，对照组中的卵可清晰看到完整的胚胎，此时已进入点青期，可观察到黑色的胚胎头部；而(g)图BmKr-h1RNAi组的异常卵的卵壳仍是凹陷的，出现大小位置不一的黑斑块。(d)图可以看出，在产卵8天后，对照组中的卵可清晰看到黑色的完整胚胎，此时进入转青期，整个卵呈现青黑色，胚胎已发育成蚁蚕，透过卵壳可看到蚁蚕上的绒毛，而(h)图BmKr-h1 RNAi组的异常卵的卵壳凹陷面积更大，呈现干瘪的状态，内部未见有明显的胚胎。这一结果表明，BmKr-h1RNAi后家蚕产生的异常卵未有胚胎发育过程。

选取同样时期的卵，进一步将卵壳剪开，观察卵内部的发育情况。

如图7所示，为BmKr-h1 RNAi后卵内胚胎发育情况；图中所有比例尺均为表示1000μm；A图中(a)～(c)可以看出，在卵产下1、2和3天时，对照组的卵外部颜色均一，将卵壳剪开后，发现卵壳内部的内容物呈现浅黄色，且内容物颜色均一干净；而(d)～(f)中，BmKr-h1RNAi组的异常卵外部颜色不均一，出现局部棕褐色，将卵壳剪开后，发现卵壳内部的内容物有些呈现棕褐色，内容物浑浊，棕褐色内容物与淡黄色内容物混杂在一起。B图中(g)则可以看出，在第7天时，对照组的卵已形成了胚胎，可清楚地区分胚胎身体部分和头部，卵内部湿润；(h)图可以看出，在第8天时，对照组卵的卵内部干爽，且胚胎已发育成蚁蚕，蚁蚕表皮颜色呈现浅黑色，可清晰看到胸足、腹足和绒毛；(i)图可以看出，在产卵后第9天，蚁蚕从卵壳中爬出；而B图中(j)-(l)，可以看出，BmKr-h1 RNAi组的异常卵在7-9天时，卵壳内部的内容物呈现棕褐色，内容物浑浊，未见到胚胎。

实施例4BmKRP基因沉默对家蚕发育的影响

1、sgRNA的设计、合成

引物PCR：将设计好的正向引物和反向引物送公司合成，经过PCR程序互为引物扩增，合成完整的sgRNA序列转录模板。用于合成BmKRP靶点sgRNA所用的引物序列如表1所示(SEQ ID NO：7～8)。

构建sgRNA克隆载体：切胶回收上述PCR产物，将其连接至TAKARA的pMD-18T克隆载体。将所得质粒转化入DH5α感受态细胞。

菌落PCR检测反向插入载体的克隆：挑选单克隆菌落。进行菌落PCR，菌落PCR所用引物为pMD-T-F(SEQ ID NO：11)和R20(SEQ ID NO：12)。

挑选无突变的单克隆菌群提质粒：应用天根质粒小提中量试剂盒(TIAN prepMini Plasmid KitⅡ)进行质粒抽提。

sgRNA体外转录模板制备：以无突变的质粒为模板，菌落PCR引物pMD-T-F(SEQ IDNO：11)和R20(SEQ ID NO：12)进行扩增一个约500bp的片段做最终体外转录模板。用苯酚氯仿(pH>7)的方法纯化PCR产物。

sgRNA的体外合成：以纯化后的PCR产物为模板，应用

Kit试剂盒进行体外转录，其中所用引物序列如SEQ ID NO：9～10所示。

取1μL sgRNA电泳检测，其余置于-80℃冰箱待用。结果如图8所示，其中，从左至右依次为M泳道、第1泳道和第2泳道；M：DL2000 Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；第1泳道为制备的sgRNA体外转录模板，第2泳道为合成的sgRNA。

2、家蚕BmKRP-/-的CRISPR/Cas9敲除品系构建及其表型分析

1)实验方法

取适量已制备好的sgRNA和购买的Cas9蛋白，配制5μL混合液(sgRNA终浓度与Cas9终浓度均为600ng/μl)，本方案选择两个靶点的sgRNA混合后与Cas9蛋白同时注射到家蚕卵内。将Cas9蛋白2.5μL和site1 sgRNA 1.25μL混合均匀再注射，注射量约2-3nL/颗卵。

蛾子交配策略：对于注射后的蛾子(G₀代)，测序后优先选取有双峰的杂合突变体作为亲本进行交配传代，此后各代均提取5龄蚕化蛹后的蚕蜕基因组DNA，选取有双峰的雌雄个体进行交配直至出现纯合突变体。

BmKRP^-/-纯合突变体筛选和表型分析：由于还未能确定家蚕BmKRP的缺失会影响哪方面的功能，也有可能不会出现可见的外观表型，但根据BmKRP在卵巢中有高水平表达且利用RNA干扰方法降低蛹期BmKr-h1(BmKRP参与调控表达的基因)的表达影响了卵巢中部分卵母细胞的成熟，我们推测，BmKRP可能与家蚕生殖发育相关。因此，除外观表现外，还将观察BmKRP^-/-纯合突变体中卵巢发育及产卵情况等。

2)实验结果

家蚕BmKRP^-/-表型分析

将在G₂代得到的缺失了4bp的纯合突变体(突变体基因型为：AAAATGGGTTCAA----ACCAGG(-4)，“-”表示删除)作为亲本自交得到G₃代家蚕，按照孟德尔遗传定律，G₃代个体也是在靶点序列缺失了4bp的纯合突变体，至此家蚕BmKRP的CRISPR/Cas9敲除品系构建成功。将野生型家蚕的受精卵和G₃代突变体的受精卵同步分开孵育，观察突变纯合体的表型。

①BmKRP^-/-在不同生长阶段的表型观察

图9示出了野生型与BmKRP^-/-家蚕在不同生长阶段的外观，其中Wt表示野生型，Bmkrp^-/-表示BmKRP纯合突变体；通过对BmKRP^-/-生长各个阶段外形和体型的观察，发现突变体在外表形态上与野生型无明显区别，在体型上略有差异。产卵后观察发现纯合突变体的卵在形态上与野生型无明显区别，但突变体产卵的数量相对较少(图9中a-b)；观察突变体和野生型的1龄幼虫(图9中c)和5龄幼虫(图9中d)，两者在体型和外型上均无明显区别；纯合突变体和野生型家蚕在蛹期第6天的外形上无明显区别，但纯合突变体的蛹体积明显较小(图9中e)；成虫期纯合突变体家蚕的体型略微比野生型小，外形上并无明显区别(图9中f)。上述结果表明，BmKRP可能作用于家蚕的蛹期和成虫期阶段。

②BmKRP^-/-卵子发育和生殖相关表型观察

上述结果显示，与野生型相比，BmKRP^-/-的蛹和成虫有差异。为进一步了解BmKRP突变对家蚕的影响，对成虫进行解剖，结果如图10所示，为野生型与纯合突变体家蚕的卵巢结构及卵子孵育情况，其中，Wt表示野生型，Bmkrp^-/-表示BmKRP纯合突变体，(A)家蚕成虫时期的卵巢结构；(B)单条卵管内的卵子排列；(C)产卵后第8天的受精卵；(D)刚孵出的幼虫。可以看出，与野生型相比，BmKRP^-/-的卵巢明显变短，其内部包含的卵子数量也相应减少，但卵子的形态并无明显变化(图10中A)；将卵巢中的卵管逐一分开，观察单条卵管内的卵子形态，可以看到与野生型家蚕相比，BmKRP^-/-单条卵管内的卵子数目明显减少(图10中B)；观察产卵后第8天的受精卵，BmKRP^-/-和野生型成虫产的卵大部分都能够成功进入转青期，这表明BmKRP的突变对受精卵的胚胎发育无显著影响(图10中C)；比较突变体和野生型刚孵出的幼虫，两者也无明显差异(图10中D)。上述结果初步表明，BmKRP可能与雌性生殖有关，主要包括影响卵巢发育和卵子生成。

③BmKRP^-/-蛹、卵子及产卵数的分析

除了观察BmKRP^-/-的外型和卵巢发育，我们还通过t-test统计分析了BmKRP^-/-与野生型第6天蛹的体重、蛹长和蛹宽、成虫期卵子的长和宽及成虫产卵数的差异，结果如图11所示，其中，(A)蛹期第六天蛹的重量；(B)蛹期第六天蛹的长度；(C)蛹期第六天蛹的宽度；(D)成虫产卵数；(E)卵的长度；(F)卵的宽度。P6：蛹期第6天；Wt：野生型；Bmkrp^-/-：BmKRP纯合突变体。“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p＜0.001，显著性统计均用t-检验的方法。结果显示，与野生型相比，BmKRP^-/-蛹期第六天蛹的重量、长度和宽度都有所降低(图11中A-C)，分别下降了18.69％、7.31％和18.61％，表明BmKRP的缺失影响了蛹末期的正常生长。同时发现BmKRP^-/-与野生型相比产卵数降低了44.68％(图11中D)；对成虫期未交配卵的长度和宽度的统计也发现BmKRP^-/-比野生型降低了11.03％和9.47％(图11中E-F)。表明BmKRP的突变影响了家蚕成虫的卵子数目和卵成熟过程。由于家蚕蛹末期是体内卵子成熟的关键时期，所以初步推断BmKRP是通过维持蛹末期的正常生长来保证家蚕成虫的正常卵子生成和卵成熟。

尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南师范大学

<120> BmKRP基因的dsRNA及其在害虫防治中的应用

<130> 111

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ggaagcttat accccataaa aaggtaataa aagtggccca taaaatgaac aaaacatccg 60

aaaatgcttc gacaaaaaaa tcacagccac acaatttatt aagaaaatac aacactaaaa 120

cgccaatacc tagtgaagac gggaaacaat ccgaatttga gtgcccggtt tgttctaaaa 180

tattcaaggt ttactcctgg gcttggaaac acatccagaa atatcattgc attgacgaga 240

aagggaaccc tgttttacca acatcgaaag atataatcaa gccagttcgt atagaacgtt 300

gcatcgcctg taatgtatta ataaagtccg atgatcatac atgtggtata tcattctcta 360

acgttctgaa gagccagtac tcttgtctcg gttgcaatca gcagttcaat actttacatt 420

tgtacgaact a 431

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

taatacgact cactataggg gaagcttata ccccataaaa aggt 44

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

tagttcgtac aaatgtaaag tattg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ggaagcttat accccataaa aaggt 25

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

taatacgact cactataggt agttcgtaca aatgtaaagt attg 44

<210> 6

<211> 5774

<212> DNA

<213> Bombyx mori

<400> 6

atacaattca ttgcttgtca ttttagccat catttcttta tttggtttaa aattagcaca 60

attacccgct tcatttaaaa tatgttgttt ggccagtaaa gtaccattga tactttcatt 120

ggataaacta tttctaattt tagtctaaat taagtttact tggctaaaaa ttctttcaca 180

atcagctcta gaatgcggta aaattaataa attcaatgaa aattgggata tagacttata 240

cctaatcttc aaaatgtcta ttaacatcgc ctcaaaactt atcagggctt gttgtcaaat 300

taatcttttt atataagaat gagattaatt aaattgttta atacatgaaa ttttaattgc 360

tctattatca tttttcattg acgtgaacaa ataaatataa attaattata ttaaaaacgc 420

atactaaatg aaccagaacc agataattgt tgatttatgt cagcgcgaaa agcattagca 480

gataaggaag gatttctcaa gctcacagtg gaaataagtt cgaaaaatac aaatttaatg 540

cgcaaaactc catctgacga cactaagctt gcctgtgtag gtatttgtct atggtcggcg 600

cagattaagc acaagaaccc aaaaaataca attgtttttt tttgtcaaat gcttgttttg 660

tttgtgaaat acggctacat gttgtcaact ttcggcccgc ttagcaccag ttgggcagtg 720

tactcgttag accatttata gtcctagtga aaaaaaatga tgcatcatca ccatagaatt 780

gatgctgaga ataattaaat tgctcctgta ctgtgtagag tgcatgatct tctatccttg 840

ttcaacttcc taaactgtga ctttgttttc tctttcacct gtccgtaagc gttaacgtca 900

caaatccgtt ccattgttga cctgaatcta tggaacgttt tcaagattgt tcgcgtcgct 960

tgaacagtga aaaaaataca cttttatgac ctaattgaaa cgaatgctga acataaaatg 1020

ggttcaaaga taccaggaaa gttgagaagt caacggttga cgtgtaaatg tgatacttgt 1080

gctctaggat tcaaaaatgt gcaagcgtta cgttcgcacc aagccgttgc ccatccgctg 1140

aagaaaagga ttgcataccg acctaaaacc gaagttatag ccaaaaggaa gcttataccc 1200

cataaaaagg taataaaagt ggcccataaa atgaacaaaa catccgaaaa tgcttcgaca 1260

aaaaaatcac agccacacaa tttattaaga aaatacaaca ctaaaacgcc aatacctagt 1320

gaagacggga aacaatccga atttgagtgc ccggtttgtt ctaaaatatt caaggtttac 1380

tcctgggctt ggaaacacat ccagaaatat cattgcattg acgagaaagg gaaccctgtg 1440

taagtatagt ttcgcgccat aaatttgata caatataaag ttgacgaccc cacgtagttc 1500

tttttaaacc gctgcctgtt atgtagtaat aagtttataa aattaataat ataagcgcgc 1560

ctgcgctttg ctttttgtag taaccagacc aaaatttctc tgaaaaataa gacgattaca 1620

ttgttaatat tacatacagc atttgcgctg tttctgctag caatggacag gatacaatat 1680

aattatggta accagtcaga attgtgttca acagaaaaaa atgtactgat cgaaataact 1740

ctcagttata gcattttttt ttattgtttc tttacaaatg tgtatattaa tttagttcat 1800

tatttgcttt aggacattta tattttattg taataaattc ttaggtgaag taggtctcta 1860

tttaaataga catgaaaagt aagtttactg ccacttggtg acatttggag agcaatttct 1920

cactgcactc atcgtttgct acattatata ggtctgtatt actaaatggc atactatata 1980

agatcaagtg gagacaactt gtgagagccc tatgtaccag cgggataccc taggaccaca 2040

acaacaagaa caagaaagat actacagtgg gagttcaact acacattttt tatacatcat 2100

tagctatgtg taaaaacact ttaattaagt atattgtgtg tgatatcctt cgaaaagaca 2160

ttccctggcc tattaatatt aattctttta gtaactttag tatattctaa acatgtaaat 2220

attctgtgta aaattttatt tggcaatagt atttatcttt aaagtagtta gtccatcata 2280

ttttatttgt ttgtgctatt cttaaaatca aagtttcgcg tatggaattt attcatattt 2340

agtaaatttt ttccctctta ttacctgtca tttttgtgca tactttgata ttggcaaaat 2400

caatgccaaa ggcataggag ccaaattcct atttaaaaaa aagtatattg tgcaaaacca 2460

gcaattttca acagcaaatg tctgaacaaa ttatgattta agttactaca aatattactg 2520

aagtattaga atatttttat aaaacaaatc atgattccca ttagactata gctttaggag 2580

gtaaacaaat ctcacatttt ctatatacca tcctaacaac accatggttt tgcagtttac 2640

caacatcgaa agatataatc aagccagttc gtatagaacg ttgcatcgcc tgtaatgtat 2700

taataaagtc cgatgatcat acatgtggta tatcattctc taacgttctg aagagccagt 2760

actcttgtct cggttgcaat cagcagttca atactttaca tttgtacgaa ctacacatag 2820

caggacttca cagtgaagga gctgagaacc tgttctttcc tgatgaggct ggtgagtttt 2880

attaatgaat aaatttgagt ttagctgtaa tctttcatag gtaacatcat tccttctatt 2940

tcccgggaaa caagaacact tttcagattt atgagtgaca tcagaaaagc ttttgcattg 3000

tgcttttttt ataagcttca gaaccaccca gattgagtaa tagaaagatg aggtatcaaa 3060

ttgatagtgt agcaacctca aagcattaac gttactggtg atgtctggat gtcttgtgag 3120

tccgcacagg tagataccac caccctgcct atttctgacg tgaagcagta atgcgtttcg 3180

tttaaagggt ggcgcagttg ttttaactat acttgagacc ttaaaactta tatctcaagg 3240

tggttggcgt atttacgttg tagatgtata tgggctccag taaccactga acaccaggcg 3300

ggctgtgagc ttgtccaccc aactaagcaa taaaaaatta ctataataaa aatatgaatt 3360

acattgaatg tcaccagcat ataggggatg agtttttaac cacatgctag ttgatttagt 3420

tttagtcatt tttgtttttc tatctaagct gatacctaca cgtaaagggc tcaaacctga 3480

cgacgttgct aacacgatta ctggtgcttg aggtacctca aagcaccgtt agtggatcgg 3540

ggggatccga aatgacgtgt tttgtgcgac gtcgaatgct ttccattcgg tccacagaat 3600

cggaagagta taatagtaca atattattga gggccactaa ttgtatcttt gtaagacatt 3660

tatatcccga cttcatgaat atatggaaac atttctgtaa caatgcaggt aagagagctg 3720

ctagaatgag aaaagcttag tcaaatttat tctgaattaa gaaataaata catatattgt 3780

accaggtatc aatacatata ttgtatcggt aaaatgcaaa taaacacttc aaaatatatt 3840

tttttattga tgtcttatgt tggtgtaaag tttgttatca aaaaaagttt ttaaaactta 3900

tggcgccacg gtaccgaaat gaagtctaca taaaattgct tgttaaaaaa attgtttccc 3960

attacagtca gataaagtat aaattaatta cccacacaaa aatttttaat gataattgtc 4020

gttctgaatt accatattgt aattcatttg aggtttgata gcacacgaac cccattttga 4080

ctggtgctcg taatttcatt acctctttag cacaccgtaa tttttgtgaa aaaaaaagaa 4140

gtgagcgtct cgggaaaccc taccagaagt gataaattaa acaaatcaag ttgaactatt 4200

taatattaaa attatttaac ttgagacaaa gcttaggtta tttcttaaat tttatgtata 4260

ttaatattat aatgtaagga aaactgtaac atacattgaa aaagatacaa aaaatagtta 4320

ggagttacat acgttctcaa tgccaccacc gtgtgcgtga gagaaaggga agccagacag 4380

actggcgccg taacgcgcca cgtaaccaag cgtcttaccc gcccataaga agttattact 4440

tcaacaaaag caagaaaaat attagtacac aagctgtacc cgtccacttc gctgggcatt 4500

taacattaac attattattc ctcaccccca caaagattat catcattgac gccccccaac 4560

tggtgtaggg agtccaacac tcatgtaaat atcagcctat ccattaagta catgtatttt 4620

ctatatggat accaagtttc aagtgaatcg gatgcacggt tcagtagtta taacggaaca 4680

tccgtaaaaa ccactgtagc tttatatatt agtattgatt tatgtattat tgtcgaaatt 4740

taataagcga tttgttgcag cgttctcggc gtggcgacag gacacggaga aacgctgcga 4800

tataaaatac acgaccctaa gcaaaattga taatatgcaa atatatcact gcagtcacat 4860

gaaatgcgac agctctacgg ccagcatgtg cccgtctagc ttcacgaagc aagagttcag 4920

caaaggcata caggtcgtgt actataaagc tcattacggg cacataatcg atgaatacac 4980

cctccccgag gagttcaaga agtactcaat aagctcactg ttgagagata cggattgtta 5040

caccgtgctg agcgtcgact gtgactcgga cgacctcagc gtgcaattca agaggttaat 5100

ggacactatt ttgggtaaat cgttgcatgt taaggagaac gtattgaaat tgttgtacgg 5160

taaagcactg gagatggctt cgctgttgaa cgatgaggct ggctgtaaaa ttgagtgtca 5220

gaatggtaag gagctcgcta aaaagacatc caccgatgac attgtcgagg acgaatctaa 5280

acttgacacg gaaatgaaaa caaaagtgcc cgttaagact tacagcaata cgaggaagaa 5340

cgtgaagttt gaggacaaca aaattgggtc cccgaagttc gggtcgcccg cgtcgctgac 5400

gtcattcaat gattcgtacc ggcacttcgt cgaggacacc ctgggcgcgg tcgacgagaa 5460

aattaaaaag aaaaaaatga tcgttaaaac cagaataggg cagttcaagc ccacctcacc 5520

gacaaacgac agggcgacaa taaaaaaatc gcccaagtct tcaaccaaag ttaaaagtag 5580

cctaagattg aaacgcgact tcgaatacga agtcatagaa agggacaaag aatgcaacat 5640

tatggttata aaaatttaag aaaaaaaaaa aaacaataaa aagcaacttt tcgttgttgt 5700

aaatcaaatt taaattacgc atcgactgaa aagaattaag tttttaaaaa cgtctataaa 5760

ttttgtacaa taaa 5774

<210> 7

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

taatacgact cactatagga aaatgggttc aaagataccg ttttagagct agaaatagca 60

agttaaaata aggctagtcc 80

<210> 8

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60

gctatttcta gctctaaaa 79

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

gtactgtgta gagtgcatga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

aggtattggc gttttagtgt 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

cggtgatgac ggtgaaaacc tc 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

aagcaccgac tcggtgcc 18

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

tacggcgtgc agtgcttcag cc 22

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

taatacgact cactataggg tgctcaggta gtggttgtcg g 41

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

taatacgact cactataggt acggcgtgca gtgcttcagc c 41

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

gtgctcaggt agtggttgtc gg 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

accagaatag ggcagttcaa g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 18

ctttggttga agacttgggc 20

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 19

taatacgact cactatagga tgataggtga cgaggagcga g 41

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

gctctcccgt gtgagtacga g 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

atgataggtg acgaggagcg ag 22

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

taatacgact cactataggg ctctcccgtg tgagtacgag 40

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

catcgttttc aacattttgg cgag 24

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

cacatcactt taccatcggc agc 23

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 25

caggcggttc aagggtcaat ac 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 26

tacggaatcc atttgggagc at 22

<210> 27

<211> 532

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 27

atgataggtg acgaggagcg agttcatcag tgcggcgagt gtggtttgac attgtccacc 60

cgcagtgcgc ttacagcaca cgcacgatcc catcgttcta ctgctgatgc acatcgctgc 120

gacgtgtgcc ataagacttt tgctgtgcct gcacgactcg tgcgccacta ccgaacccat 180

actggcgagc gaccatttga atgtgaatat tgccataaaa tgtttagtgt gaaagaaaat 240

ttgcaagtac accgtcgtat tcacacaaag gagaggccgt atcggtgcaa tgtttgtgat 300

gcggcattcg agcattccgg aaaacttcac agacatgcta gaatccatac cggcgagaga 360

ccgcacgcat gtccacattg tcataagacg ttcatacaat ctggtcaact ggtcatacat 420

ttaaggaccc acacaggtga gaaaccctat cgttgtcctg cacctggatg cggaaagggc 480

ttcacctgct ctaaacagct taaagtacat tctcgtactc acacgggaga gc 532

Claims (10)

1.一种BmKRP基因的双链RNA分子，其特征在于，所述双链RNA分子为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和其反向互补序列所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的双链RNA分子，其特征在于，合成所述双链RNA分子的引物为序列如SEQ ID NO:2～3所示的引物对和如SEQ ID NO:4～5所示的引物对。

3.一种核酸构建体，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的双链RNA分子中的至少一条链。

4.一种核酸分子，其特征在于，编码如权利要求1或2所述的双链RNA分子中的至少一条链。

5.一种重组载体，其特征在于，包含调节序列，所述调节序列可操作地连接至编码如权利要求1或2所述的双链RNA分子的至少一条链的核苷酸序列。

6.宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求3所述的核酸构建体或如权利要求4所述的核酸分子或如权利要求5所述的重组载体。

7.一种组合物，其包含两个或更多个如权利要求1或2所述的双链RNA分子。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述两个或更多个如权利要求1或2所述的双链RNA分子存在于同一核酸构建体上、存在于不同的构建体上或其任何组合。

9.一种用于抑制昆虫BmKRP基因表达的组合物，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的双链RNA分子。

10.如权利要求1或2所述的双链RNA分子的用途，其特征在于，所述用途包括：调控昆虫滞育、制备调控昆虫滞育的产品、防治害虫或制备防治害虫的产品。

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