KR20170012551A - 유전자 발현 시스템 - Google Patents

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마르타 코우키도우
루크 알페이
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옥시테크 리미티드
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Abstract

둘 이상의 조건부 우성 치사 유전자 발현 시스템은 곤충에서 높은 수준의 침투율을 제공한다. 치사는 발육의 초기 단계에서 유도되고, 생화학적 내성의 위험은 단일 곤충의 조건부 우선 치사 유전자 발현 시스템과 비교할 때 감소된다. 본 발명은 곤충 개체군의 조절에 유용하다.

Description

유전자 발현 시스템{GENE EXPRESSION SYSTEM}
본 발명은 곤충에 대한 조건부 치사 발현 시스템, 이의 용도, 및 이에 의해 형질전환된 곤충을 이용하는 개체군 조절 방법에 관한 것이다.
야생에서 곤충 개체군을 조절하는 유의한 방법은, 파리를 대량으로 사육하고 방사선에 의해 수컷을 불임으로 만드는 단계를 포함하는 환경 친화적인 곤충 조절 방법의 역할을 하는 방사선 조사된 불임충 방사법(Sterile Insect Technique, SIT)을 들 수 있다. 그러나 SIT는 다른 조절 방법과 비교할 때 모든 지역에서 효과적이거나 경제적이지 못하며, 방사선 SIT 프로그램의 성공은 야생 수컷 개체군과 유사한 행동 패턴을 갖는 방사선 조사된 파리에 달려 있다. SIT 방법의 또 다른 한계는 번데기 단계에서 수컷과 암컷을 분리하는 것이다. 암컷 곤충의 방사가 방사 지역에서 작물의 큰 피해를 유발할 수 있기 때문에, 수컷 곤충만 방사하는 것이 바람직하다. 특히, 분리는 노동 집약적이고 시간 소모적인 곤충의 수동 분류를 포함한다.
대안적인 방법은 온도-민감성-치사(temperature-sensitive-lethal, TSL) 성감별 균주(sexing strain)를 도입하는 것으로, 이에 의해 메드플라이(Medfly)에서의 자연 돌연변이의 염색체 변위가 온도에 민감한 분리를 가능하게 하며(Caceres 2002); 이러한 형질전환된 계통은 암컷을 제거하는데 99% 효과적이다(Mumford 2012). 그러나, TSL 균주는 높은 수준의 불안정성을 나타냈고, 따라서 대량 사육 시설에서 번거롭고 값비싼 여과 군집의 구성을 필요로 한다(Caceres 2002).
또 다른 조절 방법은 곤충의 게놈에 도입된 억제 가능한 우성 치사 유전 시스템의 사용이다. 이러한 방법의 또 다른 개선은 암컷-특이적이고 억제 가능한 우성 치사 유전 시스템을 사용하는 것이었다. 이러한 시스템은 리프레서(repressor)의 부재 하에 치사 유전자 산물의 암컷-특이적 발현을 제공한다. 치사 유전자에 대한 프로모터(promoter)를 활성화시킴으로써, 전사활성인자(transactivator) 유전자 산물이 치사 유전자의 전사활성인자로 작용하는 2-성분 시스템이 개발되었다. 이 시스템은 치사 유전자에 대한 프로모터 상의 전사활성인자 유전자 산물의 작용을 방지하는 리프레서를 제공함으로써 억제될 수 있다.
이러한 암컷-특이적이고 억제 가능한 우성 치사 유전 시스템의 추후의 개발에서, 발현될 단일 유전자가 제공되며, 유전자 산물은 유전자에 대해 전사활성인자이고 치사 산물이기 때문에, 양성 피드백 루프를 생성하고 이는 형질전환 곤충의 사멸로 이어진다.
Gong 등은, 이형접합 자손의 초기 발육 단계에서는 치사를 일으키지만, 부모의 형질전환 곤충의 생존에는 거의 영향을 주지 않는 테트라시클린 전사활성인자(tetracycline transactivator, tTA)를 보유하는 메드플라이의 균주를 개시하고 있다. 이 시스템에서, 높은 수준의 tTA는 세포에 해로운 것으로 생각되기 때문에, tTA는 전사활성인자 및 치사 모두의 역할을 한다. 실제로, tTA는 곤충에서의 발현을 위해 최적화되도록 변형되었으며, 이 변이체는 tTAV로 지칭된다. 그러나, 이 문헌은 일부 곤충이 tTAV의 치사 효과를 벗어났으며, 치사 효과 분자에 대한 생화학적 내성의 가능성이 이 시스템에 대한 단점이 될 수 있음을 개시하고 있다. 발육 초기의 치사가 선호된다는 것도 개시되어 있다.
Fu 등은 tTA와 Cctra를 사용하는 C. 카피타타(C. capitata)에서 암컷-특이적 자멸유도(autocidal) 유전 시스템을 개시하고 있다. tTA에 삽입된 Cctra는 수컷 스플라이스 변이체(splice variant)에서 tTA 전사체를 파괴하지만 암컷 스플라이스 변이체에서는 그렇지 않다(도 1). 이전에는, 초기 발육 단계에서 암컷-특이적 발현을 부여할 수 있는 특성화된 유전자 발현 시스템이 부족했다. Fu 등의 시스템은 초기 발육 단계에서 이러한 암컷-특이적 발현을 제공한다. Cctra 암컷-특이적 인트론은 Gong 등의 양성 피드백 루프에서 tTAV 코딩 영역에 삽입되었고, 이는 암컷-특이적 치사를 제공했다.
그러나, Fu 등에서 얻은 데이터는, 치사가 발육의 후기 애벌레/초기 번데기 단계에서 발생하고 대부분의 곤충 계통이 100% 침투자(penetrant)는 아니라는 것을 시사한다. Fu 등은 또한 이 시스템의 잠재적 어려움은 반응 능력의 포화라는 것을 개시하고 있다. 대체 스플라이싱(alternative splicing)을 조절하는 요인은 상대적으로 공급이 부족한 것으로 생각되며, 따라서 너무 많은 pre-mRNA가 생성되면 대체 스플라이싱 경로가 포화될 수 있다. 암컷-특이적 양성 피드백 시스템이 치명적이기 위해서는, 많은 양의 tTAV가 생성되어야 하며, 따라서 높은 수준의 F1 형(암컷 형태) 스플라이싱이 필요하다. 또 다른 문제는 비효율성인데, 이는 암컷에서 pre-mRNA의 상당한 부분이 수컷 형태 M1 및 M2)로 처리되기 때문이고, 이들은 기능성 단백질을 생성하지 않고, 따라서 비-성별-특이적 구조물에 비해서 치사율을 약화시키는 경향이 있다.
따라서, 발육에서 이전에 보였던 것보다 더욱 이른 치사 효과의 발생, 바람직하게는 개선된 침투율(penetrance), 그리고 바람직하게는 생화학적 내성의 감소된 위험을 갖는, 개선된 암컷-특이적이고 억제 가능한 우성 치사 유전 시스템을 제공하는 것이 바람직하다. 추가적인 바람직한 개선은 숙주 게놈에 삽입된 시스템의 높은 안정성이다.
놀랍게도, 이러한 형질전환 시스템의 침투율은 두 가지 암컷-특이적이고 억압 가능한 우성 치사 유전 시스템을 갖는 전이유전자(transgene)를 제공함으로써 향상된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 두 가지 발현 시스템의 제공은 놀랍게도 치사 산물에 대한 생화학적 내성이 발생할 위험을 줄이는 것 외에도 치사의 조기 발생을 유도하는 이점을 더 갖는다.
따라서, 제 1 양태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서,
i) 제 1 유전자 발현 시스템은 다음 성분을 포함하고; 제 1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 1 우성 치사 유전자, 제 1 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자, 및 제 1 스플라이스 제어 서열,
ii) 제 2 유전자 발현 시스템은 다음 성분을 포함하고; 제 2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 2 우성 치사 유전자, 제 2 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자, 및 제 2 스플라이스 제어 서열을 포함하고, 여기서,
상기 활성화 전사 인자 각각은, 상기 전사 인자 둘 모두가 발현될 때 상기 프로모터 둘 모두가 활성화되는 경우, 상기 프로모터 중 적어도 하나를 활성화시킬 수 있고,
제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 각각은 대체 스플라이싱에 의해 각각 제 1 및 제 2 우성 치사 유전자의 암컷-특이적 발현을 매개하고,
상기 제 1 및 제 2 활성화 전사 인자 각각의 전사활성화(transactivation) 활성은 각각 제 1 및 제 2 외인성 조절 인자에 의해 억제될 수 있고, 상기 제 1 외인성 제어 인자는 상기 제 2 외인성 제어 인자와 동일하거나 상이하고, 및
상기 제 1 유전자 발현 시스템의 상기 성분 각각은 상기 제 2 유전자 발현 시스템의 상기 성분과 동일하거나 상이하다.
본 발명의 발현 시스템은 곤충에서, 바람직하게는 적어도 쌍시류(dipteran), 딱정벌레류(coleopterans) 및/또는 인시류(lepidopteran)에서 발현될 수 있다.
본 발명의 발현 시스템은 바람직하게는 곤충에서, 바람직하게는 적어도 쌍시류, 딱정벌레류, 및/또는 인시류에서의 발현을 위해 선별된 프로모터를 각각 포함한다. 프로모터는 곤충 프로모터 또는 표적 곤충의 적어도 하나의 조직에서 작동 가능한 프로모터일 수 있다.
둘 이상의 조건부 우성 치사 유전자 발현 시스템이 곤충에서 높은 수준의 침투율을 제공하는 것으로 나타났다. 치사는 일반적으로 발육의 초기 단계에서 유도되고, 생화학적 내성의 위험은 단일 곤충의 조건부 우성 치사 유전자 발현 시스템과 비교할 때 감소된다. 본 발명은 곤충 개체군의 조절에 유용하다.
두 시스템 각각은 발현되는 우성 치사 유전자 및 치사 유전자의 발현을 활성화시키는 활성화 전사 인자를 포함한다. 활성화 전사 인자의 효과는 억제될 수 있고, 우성 치사 유전자의 산물은 충분한 양으로 발현될 때 곤충에 치명적인 영향을 미친다. 각각의 발현 시스템은 또한 치사 효과의 암컷 특이성을 제공하는 스플라이스 제어 서열을 포함한다. 2 개의 암컷-특이적이고 억제 가능한 우성 치사 발현 시스템의 존재는 치사 산물의 발현량을 증가시킴으로써 시스템의 침투율을 향상시키고, 따라서 효과적인 치사 가능성을 높일 수 있다. 두 가지 발현 시스템의 존재는 또한 치사 산물의 축적으로 인해 발육 도중 치사의 조기 발생을 유도하고, 발현 시스템 모두에 대한 저항성이 발생할 확률이 낮기 때문에 내성 기전의 위험이 감소된다.
본원에서 사용되는 용어 “침투율(penetrance)”은 해당 변이체와 관련된 표현형 형질을 또한 발현하는 유전자의 특정 변이체를 갖는 개체의 비율을 의미한다. 따라서, 본 발명과 관련하여 “침투율”은 치사 표현형을 발현하는 형질전환된 유기체의 비율을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 “구조물(construct)”은 숙주 유기체를 유전적으로 변형시키기 위해 숙주 유전자에 삽입하기 위한 인위적으로 구성된 DNA 단편을 의미한다. 구조물의 적어도 일부는 숙주 유기체의 게놈에 삽입되어 숙주 유기체의 표현형을 변경시킨다. 구조물은 벡터의 일부를 구성하거나 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 용어 “전이유전자(transgene)”는 숙주 유기체의 표현형을 변경하기 위해 숙주 유기체의 게놈에 삽입되는 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에 사용된 용어 “유전자 발현 시스템”은 임의의 유전자 및 발현되는 상기 유전자의 발현에 필요한 DNA 서열과 함께 발현되는 유전자를 의미한다.
본원에 사용된 용어 “스플라이스 제어 서열”은 유전자에 관련된 DNA 서열을 의미하며, DNA 서열은 스플라이소좀(spliceosome)과 함께 상기 유전자의 RNA 산물의 대체 스플라이싱을 매개한다. 바람직하게, 스플라이스 제어 서열은 스플라이소좀과 함께 기능성 단백질을 코딩하는 mRNA를 생성하기 위해 관련 유전자의 RNA 전사체(transcript)의 스플라이싱을 매개하고, 비기능성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 대체 mRNA를 생성하기 위해 상기 RNA 전사체의 대체 스플라이싱을 매개한다.
본원에서 사용되는 용어 “전사활성화 활성”은 유전자의 발현율을 증가시키는 활성화 전사 인자의 활성을 의미한다. 활성화 전사 인자는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되는 프로모터와 결합함으로써 프로모터를 활성화시키고, 결과적으로 상기 유전자의 발현을 강화시킬 수 있다. 대안적으로, 활성화 전사 인자는 상기 프로모터에 결합된 인핸서(enhancer)와 결합함으로써, 상기 인핸서를 통해 상기 프로모터의 활성을 촉진시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “치사 유전자(lethal gene)”는 이의 발현 산물이, 치사 유전자가 발현되는 유기체에 대해, 충분한 양으로 치사 효과를 갖는 유전자를 말한다.
본원에 사용된 용어 “치사 효과”는, 유기체 그 자체 또는 이의 자손을 죽일 수 있거나 또는 이의 특정 조직, 바람직하게는, 이의 생식 조직의 기능을 감소시키거나 파괴시킴으로써 유기체 또는 이의 자손이 불임이 되게 하는 효과와 같은, 해로운 또는 불임 효과를 의미한다. 따라서, 독약과 같은 일부 치사 효과는 이들의 수명에 비해 짧은 시간 내에 유기체 또는 조직을 죽이는 반면, 다른 효과는 예를 들어 생식적으로 기능하는 유기체의 능력을 간단히 저하시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 “tTAV 유전자 변이체”는 기능성 tTA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미하지만, 이는 뉴클레오티드의 서열에서 상이하다.
본원에 사용된 용어 “프로모터”는 유전자의 기본 전사 및/또는 조절 전사에 필요한, 일반적으로 코딩 서열 바로 상류의 DNA 서열을 의미한다. 특히, 프로모터는 전사의 개시를 가능하게 하는 정보를 가지며, 일반적으로 전사 개시 시작 부위 및 중합효소 복합체에 대한 결합 부위를 갖는다.
본원에 사용된 용어 “최소 프로모터”는 일반적으로 전사 개시 시작 부위 및 중합효소 복합체에 대한 결합 부위를 가지며, 일반적으로 이들 둘이 효과적이 되도록 충분한 추가 서열을 더 갖는, 위에서 정의된 바와 같은 프로모터를 의미한다. 예를 들어, 조직 특이성을 결정하는 것과 같은 다른 서열 정보는 일반적으로 부족하다.
본 명세서에서 사용된 용어 “외인성 제어 인자”는 숙주 유기체에서 자연적으로 발견되지 않고 숙주 유기체의 자연 서식지에서 발견되지 않거나, 숙주 유기체의 자연 서식지에서 발견되지 않는 환경 조건에서 발견되지 않는 물질을 지칭한다. 따라서, 외인성 제어 인자의 존재는 유전자 발현 시스템의 발현을 조절하기 위해 형질전환된 숙주 유기체의 조작자에 의해 조절된다.
본원에 사용된 용어 “tetO 요소”는 직렬로 위치된 하나 이상의 tetO 오퍼레이터 단위를 의미한다.
본원에 사용된 용어, 예를 들어, “tetOx7”은 표시된 수의 tetO 오퍼레이터 단위로 이루어진 tetO 요소를 의미한다. 따라서, “tetOx7”에 대한 언급은 7 개의 tetO 오퍼레이터 유닛으로 이루어진 tetO 요소를 의미한다. 마찬가지로, “tetOx14”에 대한 언급은 14 개의 tetO 오퍼레이터 유닛으로 이루어진 tetO 요소를 의미한다.
본원에 사용된 용어 “tra 인트론”은 RNA 전사체의 대체 스플라이싱이, 예를 들어, 단독으로 또는 TRA2와의 조합(즉, 복합체화할 때)으로 이에 결합하는 TRA 단백질에 의해 조절되는 스플라이스 제어 서열을 의미한다.
본원에 사용된 용어 “최소 반복”은 주어진 전이효소(transposase)의 활성에 필요한 것으로 관찰된 고도로 보존된 반복 서열을 의미한다.
특정 뉴클레오티드 또는 단백질 서열에 대한 언급이 이루어지는 경우, 실질적으로 이와 동등한 생물학적 활성을 갖는 임의의 돌연변이체 또는 변이체에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는, 돌연변이체 또는 변이체는 참조 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 99%, 바람직하게는 적어도 99.9%, 가장 바람직하게는 적어도 99.99%의 서열 동일성을 갖는다.
도 1에서 (A) 및 (B)는 암컷-특이적 치사 특성의 개략도이다. 암컷만이 기능성 tTA를 코딩하는 mRNA를 생성하도록 테트라시클린 억제 유전 시스템의 tTA 성분에 Cctra 암컷-특이적 인트론의 삽입. (A): 상자는 절단된 TRA를 유발하는 수컷 전사체에 존재하는 정지 코돈을 포함하는 엑손을 나타낸다. (B): 도면 아래의 화살표는 RT-PCR 분석을 위한 프라이머 어닐링의 위치를 나타낸다. (C)는 성-특이적 발현을 위한 Tra 스플라이싱의 PCR 분석 결과를 나타내는 겔의 사진이다. Cctra 인트론은 암컷에서만 tTAV의 F1 전사체를 생성하도록 올바르게 스플라이싱된다.
도 2는 본 발명의 유전자 구조물의 일 실시형태의 개략도이다.
도 3에서 (A), (B), (C) 및 (D)는 OX3864A/OX3647Q 균주를 Dafa'alla 등(2006)에 의해 기술된 전이효소의 공급원인 OX3133 균주와 교배시킨 이후 piggyBac 서열이 카세트 교환을 통해 제거되어야 하는 구조물의 영역에 걸친 4 가지 PCR 반응으로부터의 겔 사진이다.
도 4에서 (A)는 “스트레스 테스트” 조건, 즉 부화(eclosion) 이후 먹이 또는 물이 없는 조건에서 형질전환된 C. 카피타타의 생존을 나타내는 그래프이다. 성체 수컷 및 암컷의 생존 데이터가 병합됨(n = 180). (B)는 임의의 먹이와 물이 있는 비-스트레스 조건에서의 생존을 나타내는 그래프이다(n = 180). (C)는 개별적인 암컷 일생의 생식력을 나타내는 그래프이다. (D)는 3 주 동안의 암컷 30 마리의 3 개의 케이지로부터의 평균 생산량을 나타내는 암컷 일생의 알 생산성을 나타내는 그래프이다. (E)는 패널 (C)에서 암컷이 낳은 알의 부화율을 나타내는 그래프이다. (F)는 야생형 수컷(왼쪽)과 비교하여 형질전환된 균주 OX3864A(오른쪽) 및 OX3647Q(중간)의 수컷에서 DsRed2 형광을 나타내는 사진이다. (G)는 백색광 아래에서 (F)와 동일한 성체 수컷의 사진이다.
도 5는 OX3864A의 특정 동정을 위한 PCR-기반 분석으로부터의 겔의 사진이다. 겔은 OX3864 동형접합, OX3864 이형접합, 야생형 개체, 및 Adh 프라이머와 함께 OX3864-특이적 프라이머인 TG1과 TG2로 증폭된 물 음성 대조군을 나타내고 있다. 마커(M) = Smart ladder(Eurogentec).
도 6은 OX3864A 파리 샘플에서 플라스미드 백본의 검출을 위한 PCR-기반 분석으로부터의 겔의 사진이다. 레인 1-4: OX3864A 동형 접합체 파리 샘플; 레인 5: 양성 대조군-플라스미드 백본이 삽입된 형질전환 곤충; 레인 6: WT-메드플라이 야생형 gDNA.
도 7은 OX3864A 파리에서의 침묵 삽입의 검출을 위한 PCR 분석으로부터의 겔의 사진이다. 양성 대조군: 한 마리의 이형접합 번데기가 첨가된 9 마리의 야생형 번데기. 음성 대조군: 물. (A)는 프라이머 TD539) Diag3K10(CAACTCTTCTCGTTTTGAAGTCAGC; 서열번호 22) 및 852) ttAVdiagF(CGTCAGGCAATCGAGCTGTTC; 서열번호 23)를 사용하여 전이유전자 서열(772 bp)의 검출을 나타낸다. (B)는 프라이머 1351) Med3864altF(GGATACCGAATTCATAGCGGCG; 서열번호 24) 및 1366) Med3864fldiagR2(GGTGAGAAGCATCCATTCCAGGC; 서열번호 25)를 사용하여 야생형 서열(이전에 관측된 WT 다형성에 기초한 852/952 bp)의 검출을 나타낸다. 마커(M) = Smart ladder(Eurogentec).
도 8은 OX3864A 수컷의 도입을 통해 변화하는 메드플라이 개체군 동태의 그래프이다. 도 8A는 처리군 및 대.
조군 케이지에서 각각의 주어진 주(week) 동안의 평균 일일 알 생산율을 나타내는 그래프이다. 가장 아래의 선은 일일 정오 온도 측정치에서 취한 평균 주간 낮 시간 온도(섭씨)를 나타낸다. 도 8B는 처리군 및 대조군 케이지에서 계산된 암컷 수를 나타낸다. 도 8C는 DsRed2 형광 표현형을 나타내는 산란 트랩에서 각각의 처리군 케이지로 복귀한 자손의 비율을 나타낸다.
서열 목록의 간단한 설명
서열번호 1은 곤충 유전자 발현 시스템의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 C. 카피타타 게놈 DNA에 의해 플랭킹된(flanked) 유전자 발현 시스템의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 C. 카피타타 게놈 DNA에 의해 플랭킹된 유전자 발현 시스템의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 프라이머 TG1-3864AttpflR의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 5는 프라이머 TG1-AttPF2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 프라이머 TG2-3864FRTFlF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 프라이머 TG2-FRTNheF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 프라이머 CcAdh2RTF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 9는 프라이머 CcAdh2RTR의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 10은 프라이머 Cc3864FRTtaqF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 프라이머 Cc3864FRTtaqR의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 12는 Cc3864FRTprobe의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 프라이머 PB5out의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 14는 프라이머 PB3out의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 15는 프라이머 Diag-5PBmin의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 16은 프라이머 Diag-Pb5의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 17은 프라이머 AmCydiagF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 18은 프라이머 Dlag6-pb3의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 19는 프라이머 Dlag-K10-1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 20은 프라이머 Diag7-pb3의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 21은 프라이머 Diag2-hr5의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 22는 프라이머 Diag3K10의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 23은 프라이머 ttaVdiagF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 24는 프라이머 Med3864altF의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 25는 프라이머 Med3864fldiagR2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 26은 tTAV 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 27은 tTAV2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 28은 tTAV3 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 29는 tTAV 단백질의 폴리펩티드 서열을 나타낸다.
서열번호 30은 5'ITR을 포함하는 5'piggyBac 말단의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 31은 3'ITR을 포함하는 3'piggyBac 말단의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열번호 32는 3'ITR을 포함하는 3'piggyBac 말단의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
본 발명은 제 1 및/또는 제 2 우성 치사 유전자의 발현을 선택적으로 조절하여 치사 표현형의 발현을 선택적으로 조절할 수 있다. 따라서, 치사 유전자 각각은 기능성 단백질을 코딩하는 것을 알 수 있을 것이다. 각각의 유전자 발현 시스템은 WO 2005/012534에 기술된 바와 같은 것이 바람직하다.
치사 유전자 각각은 조건부인 치사 영향을 갖는다. 적절한 조건의 예는 온도를 들 수 있는데, 치사는 한 온도에서는 발현되지만 다른 온도에서는 발현되지 않거나 발현량이 낮다. 적합한 조건의 다른 예는 물질의 존재 또는 부재이며, 따라서 치사는 물질의 존재 또는 부재 하에 발현되지만 둘 다에서 발현되지는 않는다. 치사 유전자의 영향은 조건부이며, 치사 시스템의 치사 영향이 유기체의 자연 환경에서 발생하도록 유기체의 자연 환경에는 존재하지 않는 물질의 존재를 필요로 하는 허용 조건 하에서는 발현되지 않는 것이 바람직하다.
각각의 치사 유전 시스템은 특정 세포나 조직에 작용하거나 전체 유기체에 영향을 미칠 수 있다. 엄격하게 치명적이지는 않지만 상당한 적응 비용을 강요함으로써, 예를 들어, 실명, 비행 불능(정상적으로는 날아다닐 수 있는 유기체에 대해), 또는 불임을 유발하는 시스템이 또한 고려된다. 성 결정을 방해함으로써, 예를 들어, 하나의 성별에서 다른 성별로 유기체의 전부 또는 일부를 형질전환시키거나 형질전환시키는 경향이 있는 시스템이 또한 고려된다. 그러나, 유기체는 자연 환경에서(“야생에서”) 야생형 유기체와 경쟁할 수 있기 때문에 각 치사 유전자의 산물이 불임을 유발하는 것이 바람직하지만, 불임 유기체는 생존 가능한 자손을 생산할 수 없다. 이러한 방식으로, 본 발명은 비용, 사용자에 대한 위험, 및 조사된 유기체의 경쟁력 저하와 같은 불임충 방사법(Sterile Insect Technique, SIT)과 관련된 문제점 없이 곤충에서 SIT와 같은 기술과 유사한 결과를 달성한다.
일부 실시형태에서, 치사 유전자 중 적어도 하나의 산물은 바람직하게는, 예를 들어, Cande 등의 문헌(Journal of Cell Science 115, 4727-4734 (2002))에 기재된 AIF 단백질 또는 이이 동족체와 같은 세포사멸 유도 인자이다. AIF 동족체는 포유동물 및 심지어 곤충, 선충류, 균류 및 식물을 포함하는 무척추동물에서도 발견되며, 이는 AIF 유전자가 진핵 생물계 전역에서 보존되어 있음을 의미한다. 다른 실시형태에서, 치사 유전자 중 적어도 하나의 산물은 노랑초파리(Drosophila melanogaster)의 두부 퇴화 결함(head involution defective, Hid) 유전자의 단백질 산물인 Hid, 초파리의 리퍼(reaper) 유전자 산물인 리퍼(Rpr), 또는 이의 돌연변이체이다. Hid의 사용은 Heinrich 및 Scott의 문헌(Proc. Natl Acad. Sci USA 97, 8229-8232 (2000))에 기재되어 있다. 돌연변이 유도체인 HidAla5의 사용은 Horn 및 Wimmer의 문헌(Nature Biotechnology 21, 64-70 (2003))에 기재되어 있다. Rpr의 돌연변이 유도체인 RprKR의 사용은 본원에 기재되어 있다(White et al 1996, Wing et al., 2001 and Olson et al., 2003 참조). Rpr 및 Hid 모두는 친-세포사멸(pro-apoptotic)단백질이며 IAP1에 결합한다고 여겨진다. IAP1은 잘 보존된 항-세포사멸 단백질이다. 따라서, Hid와 Rpr은 자신의 염기 서열이 잘 보존되어 있지 않더라도 넓은 계통발생 범위(Huang et al., 2002, Vernooy et al., 2000)에 걸쳐 작용할 것으로 기대된다.
다른 실시형태에서, 치사 유전자 중 적어도 하나는, 포유류 Nipp1의 초파리 동족체((Parker et al Biochemical Journal 368, 789-797 (2002); Bennett et al., Genetics 164, 235-245 (2003))인 Nipp1Dm이다. Nipp1Dm은 본 기술 분야의 숙련자가 이해할 수 있는 바와 같이, 적절한 수준으로 발현되는 경우, 치사 효과를 갖는 단백질의 또 다른 예이다. 실제로, 치사 효과를 갖는 다른 많은 단백질의 예는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지될 것이다.
바람직하게, 치사 유전자 중 적어도 하나는 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체이다. tTAV는 tTA의 유사체이며, tTA의 서열은 원하는 곤충 종과의 양립성을 향상시키기 위해 변형되었다. tTAV 변이체 유전자 산물이 tTA 유전자 산물과 동일한 기능을 갖도록 tTA 단백질을 코딩하는 tTAV의 변이체가 가능하다. 따라서, tTAV 유전자의 변이체는 tTA 뉴클레오티드 서열 및 서로와 비교할 때 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 동일한 기능을 갖는 단백질을 코딩한다. 따라서, tTAV 유전자 변이체는 tTA 대신에 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 전이유전자에서 tTAV 유전자 변이체를 사용하는 것이 바람직하다.
치사 유전자의 임의의 조합이 사용될 수 있으며, 일부 실시형태에서 치사 유전자가 동일한 반면, 다른 실시형태에서는 치사 유전자는 상이하다. 치사 효과의 개선된 침투율과 치사의 조기 발생은 치사 산물의 축적에 의해 달성된다.
바람직한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 치사 유전자 각각은 독립적으로 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체이다. 일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 치사 유전자 각각은 독립적으로 tTAV(서열번호 26), tTAV2(서열번호 27) 및 tTAV3(서열번호 28) 중 하나이다. 다른 실시형태에서, 제 1 및 제 2 치사 유전자는 동일하다. 또 다른 실시형태에서, 제 1 및 제 2 치사 유전자 중 하나는 tTAV(서열번호 26)이고 다른 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이다. 그러나, tTAV 변이체의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 중 하나는 tTAV(서열번호 26)이고 다른 하나는 tTAV2(서열번호 27)인 반면, 또 다른 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 중 하나는 tTAV2(서열번호 27)이고 다른 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이다. 다른 실시형태에서, 제 1 치사 유전자는 tTAV(서열번호 26)이고 제 2 치사 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이다.
각각의 치사 유전자는 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 상기 프로모터는 유전자 발현 시스템 중 적어도 하나에도 포함된 유전자에 의해 코딩되는 활성화 전사 인자에 의해 활성화될 수 있다.
프로모터는 크거나 복잡한 프로모터일 수 있지만, 이들은 자주 비-숙주 곤충에 도입될 때 불량하게 또는 뒤죽박죽으로 이용된다는 단점을 갖는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 최소 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 최소 프로모터는 공지된 프로모터의 공지된 공급원으로부터 직접 수득되거나 더욱 큰 자연 발생 프로모터 또는 공지된 프로모터에서 유래할 수 있음을 이해할 것이다. 적합한 최소 프로모터 및 이들을 수득하는 방법은 본 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 적절한 최소 프로모터는 Hsp70 유래의 최소 프로모터, P 최소 프로모터, CMV 최소 프로모터, Act5C-기반 최소 프로모터, BmA3 프로모터 단편 및 Adh 핵심 프로모터를 포함한다(Bieschke, E., Wheeler, J., and Tower, J. (1998). "oxycycline-induced transgene expression during Drosophila development and aging". Mol Gen Genet, 258, 571-579). 모든 최소 프로모터가 곤충의 모든 종에서 반드시 작동하는 것은 아니지만, 프로모터가 어떻게 활성화되는지에 대해서 본 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
본 발명에 존재하는 작동 가능하게 연결되는 프로모터 중 적어도 하나는 치사 유전자가 유기체의 초기 발육 동안 발현될 수 있도록 숙주 유기체의 초기 발육 동안, 특히 바람직하게는 배아 단계 동안 활성인 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 프로모터 중 적어도 하나는 Hsp70과 같은 열 충격 프로모터이다. 다른 실시형태에서, 프로모터 중 적어도 하나는 노랑초파리(Drosophila melanogaster)로부터의 sry α 배아-특이적 프로모터(Horn & Wimmer (2003)), 또는 이의 동족체, 또는 초파리(Drosophila) 유전자 slow as molasses ( slam )의 프로모터, 또는 다른 종으로부터의 이의 동족체와 같은 다른 배아-특이적 또는 배아 활성 유전자로부터의 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 프로모터 중 적어도 하나는 최소 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터의 각각은 독립적으로 Hsp70, Hsp73 또는 sry α이다. 바람직한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 프로모터 중 하나는 Hsp70이고 다른 하나는 sry α이다. 일 실시형태에서, 제 1 프로모터는 Hsp70이고 제 2 프로모터는 sry α이다.
각각의 유전자 발현 시스템은 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자를 더 포함하며, 여기서 각각의 활성화 전사 인자는 전이유전자의 치사 유전자의 발현을 활성화시킨다. 따라서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 각각의 유전자는 숙주 유기체에 의해 발현되어 기능성 단백질을 생성할 수 있다. 특히, 각각의 활성화 전사 인자는 적어도 하나의 프로모터를 활성화시킬 수 있으며, 프로모터는 치사 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 그 결과, 활성화 전사 인자가 프로모터를 활성화시키면, 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 치사 유전자의 발현이 상향 조절된다. 각각의 활성화 전사 인자는 제 1 또는 제 2 프로모터에 작용할 수 있거나, 또는 각각의 활성화 전사 인자는 제 1 및 제 2 프로모터 모두에 작용할 수 있다. 하나 이상의 활성화 전사 인자가 발현되는 경우, 하나 이상의 프로모터가 활성화되는 것이 바람직하다. 따라서, 제 1 및 제 2 활성화 전사 인자가 모두 발현되는 경우, 제 1 및 제 2 프로모터가 모두 활성화된다.
활성화 전사 인자로서 작용하는 유전자 산물은 임의의 적합한 방식으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 활성화 전사 인자는 적어도 하나의 프로모터에 인접하게 위치하는 인핸서에 결합할 수 있고, 따라서 프로모터에서 중합효소 결합을 향상시키는 역할을 한다. 전사 또는 번역의 억제제의 차단과 같은 리프레서 대항 기전과 같은 다른 기전이 사용될 수 있다. 전사 억제제는, 예를 들어, 억제제를 코딩하는 mRNA의 번역을 차단하기 위해 헤어핀 RNA 또는 리보자임의 사용에 의해 차단되거나, 또는 생성물이 억제제에 직접 결합하여 전사 또는 번역의 억제를 방지할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 치사 유전자의 발현에 대한 활성화 전사 인자의 영향은 숙련자에 의해, 바람직하게는 외인성 제어 인자의 사용을 통해 조절될 수 있다. 활성화 전사 인자의 전사활성화 활성은 외인성 제어 인자에 의해 억제될 수 있는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 활성화 전사 인자의 전사활성화 활성을 조절함으로써 치사 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 숙련자에 의해 적용되는 외인성 제어 인자의 존재는 관련 프로모터에 대한 활성화 전사 인자의 활성을 감소시킨다. 그 결과, 작동 가능하게 연결되는 치사 유전자의 발현이 감소되도록 프로모터의 활성화는 억제된다.
전사활성화 활성이 조절될 수 있는 모든 활성화 전사 인자는 유전자 발현 시스템 각각 또는 어느 하나에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 전사 인자는 발현될 때 tetO 오퍼레이터 서열에 결합하고 근처의 최소 프로모터로부터의 발현을 유도하는 테트라시클린 억제 전사활성인자(tTA) 단백질일 수 있다. 조절 가능한 활성화 전사 인자의 다른 예는 GAL4를 포함한다.
활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 각각의 유전자는 독립적으로 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 각각의 유전자는 독립적으로 tTAV 유전자 변이체이고, 동일하거나 상이한 tTAV 유전자 변이체일 수 있다. tTA 및 tTAV 유전자 변이체의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자 각각은 독립적으로 tTAV(서열번호 26), tTAV2(서열번호 27) 및 tTAV3(서열번호 28)이고, 유전자는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 각각의 유전자는 독립적으로 tTAV(서열번호 26), tTAV2(서열번호 27) 및 tTAV3(서열번호 28) 중 하나이다. 또 다른 실시형태에서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 제 1 및 제 2 유전자 중 하나는 tTAV(서열번호 26)이고 다른 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이다. tTAV 변이체의 모든 조합이 사용될 수 있고, 따라서, 일부 실시형태에서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 제 1 및 제 2 유전자 중 하나는 tTAV(서열번호 26)이고 다른 하나는 tTAV2(서열번호 27)인 반면, 또 다른 실시형태에서 활성화 전사 인자를 코딩하는 제 1 및 제 2 유전자는 tTAV2(서열번호 27)이고 다른 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이다. 다른 실시형태에서, 제 1 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자는 tTAV(서열번호 26)이고 제 2 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이다.
상기한 바와 같이, 활성화 제어 인자는 외인성 제어 인자에 의해 조절 가능하고, 바람직하게는 억제 가능하다. 활성화 전사 인자의 조절은 임의의 적절한 수단에 의해 이루어질 수 있으며, 임의의 수준에서 효과적일 수 있다. 예를 들어, 조절은 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자의 전사를 차단하거나 이의 RNA 산물의 번역을 차단하거나, 또는 유전자의 번역 산물의 작용을 방지 또는 억제하는데 효과적일 수 있다.
사용된 외인성 제어 인자는 전이유전자에 코딩된 활성화 전사 인자에 의존할 것이다. 예를 들어, 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나가 GAL4를 코딩하는 실시형태에서, 제어 인자는 온도(GAL4가 저온 민감성인 경우) 및/또는 GAL80 또는 이의 돌연변이일 수 있다. 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나가 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체인 경우, 외인성 제어 인자는 테트라시클린이다. 테트라시클린은 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체 산물(즉, tTA)과 결합함으로써, tTA가 전사활성화 활성을 갖지 못하게 한다. 테트라시클린의 존재 또는 부재 또는 이의 농도의 조절은 tTA, 또는 tTAV와 같은 이의 유사체가 사용될 때 시스템을 조절하는데 사용된다.
전이유전자의 우성 치사 유전자의 발현은, 각각의 유전자 발현 시스템에서 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열의 존재로 인해, 성-특이적일 수 있고, 또는 성-특이적 및 단계-특이적, 생식 계열-특이적 또는 조직-특이적 조합일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 성-특이적 발현은 암컷-특이적 이다. 각각의 유전자 발현 서열에서의 스플라이스 제어 서열은 프로모터 이외에 단백질 발현의 추가적인 수준의 조절을 허용한다. 예를 들어, 배아에서의 조직 또는 성-특이적 발현은 통상적인 방법으로는 극히 어렵다.
제 1 및 제 2 치사 유전자는, 단백질 또는 폴리펩티드, 즉 단백질 또는 이의 단편과 같은 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 적어도 하나의 엑손, 바람직하게는 둘 이상의 엑손에 대한 코딩 서열을 포함한다. 바람직하게, 상이한 엑손은 차별적으로 스플라이싱되어 대체 mRNA를 제공한다. 바람직하게, 상기 대체 스플라이싱된 mRNA는 상이한 코딩 잠재력을 갖는다, 즉 상이한 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 코딩한다. 따라서, 코딩 서열의 발현은 대체 스플라이싱에 의해 조절된다.
시스템의 각각의 스플라이스 제어 서열은 적어도 하나의 스플라이스 수용체 부위 및 적어도 하나의 스플라이스 공여체 부위를 포함한다. 공여체 및 수용체 부위의 수는 함께 스플라이싱될 서열의 세그먼트 수에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 또는 둘 모두의 스플라이스 제어 서열은 인트론 및 엑손 뉴클레오티드 둘 모두에 의해 대체 스플라이싱을 조절한다. 다른 실시형태에서, 하나 또는 둘 모두의 스플라이스 제어 서열은 인트론 스플라이스 제어 서열이다. 다시 말해, 상기 스플라이스 제어 서열(들)은 인트론의 일부를 형성하는 폴리뉴클레오티드에서 실질적으로 유래하고 따라서, 이들 뉴클레오티드가 성숙한 mRNA 서열에 보유되지 않도록, 스플라이싱에 의해 1 차 전사체에서 절제(excision)되는 것이 바람직하다.
대체 스플라이싱에서, 서열은 일부 환경(즉, 일부 대체 스플라이싱 변이체)에서는 인트론성일 수 있지만, 다른 환경에(즉, 다른 변이체)에서는 엑손성일 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 상기 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열은 바람직하게는 적어도 하나의 대체 스플라이싱 변이체에서, 즉, 제 1 스플라이싱된 mRNA 산물 또는 상기 적어도 하나의 대체 스플라이싱된 mRNA 산물에서 인트론의 일부를 형성하는 폴리뉴클레오티드에서 실질적으로 유래하는 것이 바람직하다. 따라서, 인트론 또는 인트론 서열은 적어도 하나의 전사체 또는 전사체 유형에서 스플라이싱된 것으로 간주될 수 있다.
“정상적인”(비-대체) 스플라이싱 및 대체 스플라이싱에서, 인트론은 일반적으로 스플라이싱된 mRNA를 형성하기 위해 pre-RNA에서 제거되고, 이어서 아미노산 서열을 갖는, 단백질 또는 단백질 단편과 같은 폴리펩티드로 번역될 수 있다. 따라서, 숙련자는 엑손성이라기 보다는 인트론성으로 간주되는 본 시스템의 이들 서열을 결정하는 방법을 쉽게 알 수 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 엑손 서열은 대체 스플라이싱의 조절의 매개에 관여할 수 있지만, 적어도 일부의 인트론 제어 서열이 대체 스플라이싱의 매개에 관여하는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 각각의 유전자 발현 시스템은 또한 일부 제어의 인트론 관여가 있는 한, 엑손에 존재하는 스플라이스 제어 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 둘 모두의 스플라이스 제어 서열은 dsx 유전자의 요소에서 유래되었거나 이를 포함하며, 이론에 구애 받지 않고, 엑손 서열은 대체 스플라이싱의 메커니즘을 보조하는 것으로 생각된다.
따라서, 일부 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열은 엑손 서열을 포함하고, 이는 본 발명을 설명하는데 사용된 정의에 의해 예상되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 명백하게 알 수 있는 바와 같이, 일부 뉴클레오티드는 상기 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열의 정의 내에 포함될 수 있으며, 또한 기능성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 정의 내에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 특정 뉴클레오티드가 하나 이상의 요소의 정의에 의해 커버될 수 있도록 이러한 요소의 정의는 중복될 수 있다. 그러나, 숙련자는 뉴클레오티드가 종종 하나 이상의 역할을 수행할 수 있기 때문에 이것이 분자 생물학에서 특이하지 않다는 것을 알 것이다. 다른 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열 중 적어도 하나는 단독으로, 즉 엑손의 영향이 없는 인트론성이다.
적어도 하나 이상의 스플라이스 제어 서열은 스플라이싱에 의해 pre-RNA에서 제거될 수 있는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열은 생성된 적어도 하나의 스플라이스 변이체에서 프레임 시프트를 유발하지 않는다. 바람직하게, 이는 전장 기능성 단백질을 코딩하는 스플라이스 변이체이다. 다시 말해서, 상기 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열은 바람직하게, 유기체에서 발현되는, 개시 코돈과 정지 코돈 사이에 정의된 기능성 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부를 형성하거나 그 일부를 형성하고자 했던 뉴클레오티드의 제거를 매개하지 않는다. 이에 의해, 이는 적어도 하나의 스플라이스 변이체에서 스플라이싱에 의해 절제된 뉴클레오티드가 단백질 또는 유전자의 야생형 형태에서 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드는 아닌 것을 의미한다. 하나 이상의 스플라이스 변이체는 상기 뉴클레오티드를 절제할 수 있지만, 적어도 하나의 변이체는 프레임 시프트가 상기 적어도 하나의 변이체에서 유도되지 않도록 이러한 뉴클레오티드를 보유해야 한다. 이러한 제거된 뉴클레오티드는 인트론과 같이 정상적으로 스플라이싱된 서열과 함께 제거되는 뉴클레오티드이다.
적어도 하나의 스플라이스 제어 서열 및 세포 스플라이싱 기구, 예를 들어, 스플라이소좀은 간의 상호작용은 1 차 전사체에서 일련의, 바람직하게는 적어도 50 개의 연속적인 뉴클레오티드의 제거를 유도하거나 중개하며, 1 차 전사체에서는 연속적이지 않은 뉴클레오티드 서열을 함께 라이게이션(ligation)(스플라이싱)한다(이들 또는 이들의 보체는, 안티센스 서열이 고려되는 경우, 1 차 전사체가 전사된 최초의 템플릿 서열에서 연속적이지 않기 때문이다). 상기 일련의 적어도 50 개의 연속적인 뉴클레오티드는 인트론을 포함한다. 이러한 매개는 바람직하게 성-특이적, 더욱 바람직하게는 암컷-특이적 방식으로 작용하여, 성별이 상이한 그리고 선택적으로 단계, 조직 유형 등에서 상이한 동등한 1차 전사체는 상이한 크기 또는 서열의 인트론을 제거하는 경향이 있고, 또는 경우에 따라 인트론을 제거할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 이러한 현상, 즉, 다른 상황에서 상이한 크기 또는 서열의 인트론을 제거하거나, 다른 환경에서 주어진 크기 또는 서열의 인트론을 차별적으로 제거하는 것을 대체 스플라이싱이라고 한다. 대체 스플라이싱은 사실상 잘 알려진 현상이며, 많은 경우가 알려져 있다(위 참조).
대체 스플라이싱의 매개가 성-특이적인 경우, 유기체에서 발현되는 기능성 단백질을 코딩하는 스플라이스 변이체는 F1 스플라이스 변이체, 즉 암컷에서만 또는 암컷에서 우성적으로 발견되는 스플라이스 변이체, 바람직하게는 암컷에게서 발견되는 가장 풍부한 변이체인 것이 바람직하지만, 이는 필수적인 것은 아니다.
상기한 바와 같이, 일부 실시형태에서, 대체 스플라이싱의 방식 또는 기전은 성-특이적, 바람직하게는 암컷-특이적이며, 임의의 적합한 스플라이스 제어 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 스플라이스 제어 서열은 tra 인트론에서 유래한다. 트랜스포머( transformer ) 유전자로부터의 세라티티스 카피타타(Ceratitis capitata) tra 인트론은 처음에 상기한 Pane 등(2002)에 의해 특징화되었다. 곤충에서, 예를 들면, TRA 단백질은 차별적으로 다른 성에서 발현된다. 특히, TRA 단백질은 주로 암컷에게 존재하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 코딩 서열이 성-특이적 방식으로 발현되는 방식으로, 즉, 경우에 따라서 단백질이 암컷에서만 또는 수컷보다는 암컷에서 훨씬 높은 수준으로 발현되는 방식으로, 그렇지 않으면, 다른 경우에 있어서 단백질이 수컷에서만 또는 암컷보다는 수컷에서 훨씬 높은 수준으로 발현되는 방식으로 대체 스플라이싱을 매개한다. TRA 단백질 또는 TRA/ TRA-2 복합체에 의해 매개되는 성-특이적 대체 스플라이싱을 달성하기 위한 기전은 공지되어 있으며, 예를 들어 Pane 등의 문헌(Development 129, 3715-3725 (2002))에 개시되어 있다.
트랜스포머 유전자로부터의 세라티티스 카피타타 tra 인트론의 동족체는 다른 종에 존재하며, 이들은 상기 종 및 이들의 다양한 속(genus)에서 쉽게 확인될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, tra를 언급할 때, 이는 또한 다른 종에서의 tra 동족체와 관련이 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 각각의 대체 스플라이싱 기전은 세라티티스 카피타타 tra 인트론(Cctra), 또는 또 다른 상동체 또는 동족체에서 독립적으로 유래한다. 일부 실시형태에서, 상동체 또는 동족체는 절지동물, 바람직하게는 테프리티드(tephritid)에서 유래한다. 다른 실시형태에서, 상동체 또는 동족체는 세라티티스(Ceratitis) 속, 박트로세라(Bactrocera) 속, 아나스트레파(Anastrepha) 속 또는 라골레티스(Rhagoletis) 속에서 유래한다. 다른 실시형태에서, 상동체 또는 동족체는 C. 로사(C. rosa) 또는 B. 조나타(B. zonata)에서 유래한다. 또 다른 실시형태에서, 상동체 또는 동족체는 B. 조나타에서 유래하며, 이 상동체 또는 동족체는 본원에서 Bztra(GenBank 기탁 번호 BzTra KJ397268)로 지칭된다.
유전자 발현 시스템의 스플라이스 제어 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열은 재조합의 위험을 감소시키기 위해 상이한 종에서 유래하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나는 Cctra이고 다른 하나는 상이한 종에서 유래한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나는 Cctra이고 다른 하나는 Bztra(GenBank 기탁 번호 BzTra KJ397268)이다. 또 다른 실시형태에서, 제 1 스플라이스 제어 서열은 Cctra이고 제 2 스플라이스 제어 서열은 Bztra(GenBank 기탁 번호 BzTra KJ397268)이다.
tra 인트론에서 유래한 스플라이스 제어 서열의 정확한 길이는 대체 스플라이싱을 매개할 수 있다면 필수적이지는 않다. 이 점에 있어서, 대략 55 개 내지 60 개의 뉴클레오티드가 변형된 tra 인트론에 대한 최소 길이라고 생각되지만, C. 카 피타타로부터의 야생형 tra 인트론(F1 스플라이스 변이체)은 1345 개의 뉴클레오티드 길이의 영역에 있다.
다른 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열 중 적어도 하나는 절지동물, 바람직하게는 테프리티드에서 유래하는 Actin -4 유전자의 대체 스플라이싱 기전에서 유도된다. 하나 이상의 스플라이스 서열이 Actin -4에서 유래하는 실시형태에서, 이들은 동일하거나 상이한 테프리티드 종에서 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 Actin -4 유전자는 세라티티스 속, 박트로세라 속, 아나스트레파 속 또는 라골 레티스 속 에서 독립적으로 유래한다. 다른 실시형태에서, 제 1 및 제 2 Actin -4 유전자는 세라티티스 카피타타, 트로세라 올레아에(Trocera oleae), 세라티티스 로사(Ceratitis rosa) 또는 박트로세라 조나타(Bactrocera zonata)에서 독립적으로 유래한다. 일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 Actin -4 유전자 중 적어도 하나는 세 라티티스 카피타타에서 유래한다. 하나 이상의 스플라이스 제어 서열이 Actin -4에서 유래하는 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열은 동일한 종에서 유래할 수 있다. 그러나, 재조합의 위험을 줄이기 위해서 스플라이스 제어 서열은 서로 다른 종에서 유래하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열 중 적어도 하나는 적어도 절지동물, 바람직하게는 테프리티드에서 유래하는 doublesex(dsx) 유전자의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 스플라이스 제어 서열(예를 들어, 제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 모두)은 dsx에서 유래하고, dsx 유전자는 동일하거나 상이한 테프리티드 종에서 유래한다. 일부 실시형태에서, 각각의 dsx 유전자는 세 라티티스 속, 박트로세라 속, 아나스트레파 속 또는 라골레티스 속의 종에서 독립적으로 유래한다. 일부 실시형태에서, dsx 유전자는 세라티티스 카피타타, 트로세 라 올레아에, 세라티티스 로사 또는 박트로세라 조나타에서 독립적으로 유래한다. 일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 dsx 유전자 중 적어도 하나는 세라티티스 카피타타에서 유래한다. 하나 이상의 스플라이스 제어 서열이 dsx에서 유래하는 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열은 동일한 종에서 유래할 수 있다. 그러나, 재조합의 위험을 줄이기 위해서 스플라이스 제어 서열은 서로 다른 상이한 종에서 유래하는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열이 동일한 유전자 또는 동일한 기원의 인트론에서 유래하는 것으로 예상되지만, 다른 실시형태에서 스플라이스 제어 서열은 상이한 유전자 또는 상이한 기원의 인트론에서 유래한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 스플라이스 제어 서열 중 하나는 tra 인트론에서 유래하고 다른 하나의 스플라이스 제어 서열은 Actin -4 유전자 또는 dsx 유전자에서 유래한다.
일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 중 적어도 하나는 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터에 결합되는 인핸서를 더 포함한다. 제 1 및/또는 제 2 유전자 발현 시스템에서 코딩된 활성화 전사 인자 중 적어도 하나는, 활성화 전사 인자(들)의 결합이, 예를 들어, 프로모터에서 중합효소 결합을 촉진함으로써 상기 결합된 프로모터의 활성을 강화시키는 역할을 하도록 인핸서에 결합한다.
유전자 발현 시스템의 프로모터가 인핸서와 결합되는 실시형태에서, 프로모터는 활성 인핸서의 부재 하에 실질적으로 비활성이다. 이러한 프로모터는 바람직하게는 상기한 것과 같은 최소 프로모터이다.
본 기술 분야의 숙련자는 어떠한 인핸서가 본 발명에서 사용하기에 적합한지를 알 것임을 이해할 것이다. 특히, 인핸서는 상기한 바와 같은(즉, 외인성 제어 인자에 의해 조절 가능한) 활성화 전사 인자에 의해 결합되기에 적합해야 한다.
따라서, 우성 치사 유전자 중 하나 이상이 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체인 실시형태에서, 인핸서는 하나 이상의 tetO 오퍼레이터 유닛을 포함하는 tetO 요소이다. 프로모터의 상류에, 임의의 배향에서, tetO는 tTA 유전자 또는 tTAV 유전자 변이체의 산물에 의해 결합될 때, 아주 근접한 프로모터로부터의 전사 수준을 강화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 각 인핸서는 독립적으로 tetOx1 , tetOx2 , tetOx3, tetOx4 , tetOx5 , tetOx6 , tetOx7 , tetOx8 , tetOx9 , tetOx10 , tetOx11 , tetOx12, tetOx13 , tetOx14 , tetOx15 , tetOx16 , tetOx17 , tetOx18 , tetOx19 , tetOx20 및 tetOx21 중 하나이다. 일부 실시형태에서, 각각의 인핸서는 독립적으로 tetOx7, tetOx14 및 tetOx21 중 하나이다. 하나 이상의 인핸서를 포함하는 실시형태에서, 제 1 인핸서는 제 2 인핸서와 동일하거나 상이하다.
바람직한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 모두는 인핸서, 즉 각각 제 1 및 제 2 인핸서를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 인핸서 중 하나는 tetOx7이고, 다른 인핸서는 tetOx14이다. 다른 실시형태에서, 제 1 인핸서는 tetOx7이고 제 2 인핸서는 tetOx14이다.
일부 실시형태에서, 주어진 유전자 발현 시스템에서, 상기 유전자 발현 시스템의 우성 치사 유전자를 동일한 유전자 발현 시스템의 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자와 연결하는 것이 바람직하다. 이는 두 개의 유전자를 융합 산물로 제공할 수 있는 가능성을 포함하여, 또는 예를 들어, 각각의 유전자에 반대 방향에서 자신의 프로모터를 제공하지만 인핸서 부위와 병렬로 배치함으로써 두 유전자를 나란히 배치함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 발현 시스템 중 적어도 하나는 선형 발현 시스템을 형성한다. 따라서, 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자가 발현되면, 상기 활성화 전사 인자는 치사 유전자에 작동 가능하게 연결되는 프로모터를 활성화시킴으로써, 치사 유전자의 발현을 상향 조절한다. 일부 실시형태에서, 활성화 전사 인자는 상기 활성화 전사 인자를 발현하는 유전자 발현 시스템의 프로모터만을 활성화시킨다. 다른 실시형태에서, 활성화 전사 인자는 또한 다른 유전자 발현 시스템의 프로모터를 활성화시킬 수 있다.
더욱 바람직한 실시형태에서, 특정 유전자 발현 시스템의 우성 치사 유전자는 상기 유전자 발현 시스템의 일부인 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자이고 이와 동일하다. 따라서, 치사 산물은 적어도 해당 유전자 발현 시스템에 대한 활성화 전사 인자로서 작용한다. 그 결과, 치사 유전자 산물은 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터를 활성화시킴으로써, 상기 치사 유전자의 발현을 상향 조절하여 양성 피드백 루프를 제공한다. 다시 말해서, 우성 치사 유전자는 상기 유전자 발현 시스템의 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자이기도 하다. 따라서, 프로모터의 강화는 활성화 전사 인자의 전사를 증가시킬 뿐만 아니라 해당 유전자 발현 시스템의 치사 산물의 축적을 야기함으로써, 숙주 유기체에 대한 치사 영향을 제공한다. 이와 관련하여, 일 실시형태에서, 제 1 및/또는 제 2 유전자 발현 시스템의 양성 피드백 루프는 WO 2005/015534에 개시된 것인 것이 특히 바람직하다.
바람직하게, 제 1 및/또는 제 2 치사 유전자는 상기한 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체이다. 이러한 실시형태에서, 관련 유전자 발현 시스템은 인핸서로서 상기한 tetO 요소를 더 포함한다. 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자는 상기 치사 유전자이고 이와 동일하다. 외인성 제어 인자는 테트라시클린이다. 따라서, 테트라시클린의 존재 또는 부재에 의한 양성 피드백 메커니즘에 대한 조절은 프로모터상의 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체 생성물의 전사활성화 활성을 억제하는 테트라시클린의 존재 하에 수행된다.
유전자 발현 시스템 중 적어도 하나가 양성 피드백 루프인 경우, 상기 양성 피드백 루프의 활성화 전사 인자는 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터를 활성화시키고, 일부 실시형태에서 상기 활성화 전사 인자는 또한 다른 유전자 발현 시스템의 프로모터를 활성화시킨다.
일부 실시형태에서, 유전자 발현 시스템 중 하나는 상기한 바와 같은 선형 유전자 발현 시스템이고, 다른 하나는 상기한 바와 같이 양성 피드백 루프이다.
일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템은 양성 피드백 루프로서 작용한다. 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 각각은 상이한 치사 유전자 산물을 발현함으로써, 제 1 유전자 발현 시스템의 치사 유전자 산물이 제 1 유전자 발현 시스템에 대해서만 활성화 전사 인자로서 작용하고, 그 반대도 마찬가지이다.
바람직한 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 모두는 양성 피드백 루프로서 작용하고 동일하거나 유사한 치사 산물을 발현시킨다. 따라서, 제 1 유전자 발현 시스템에 의해 발현되는 치사 유전자 산물은 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 모두에 대해 활성화 전사 인자로서 작용하고, 그 반대도 마찬가지이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 모두는 치사 유전자 및 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자 모두로서 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체를 포함한다. 따라서, 두 유전자 발현 시스템 모두는 결합된 프로모터로부터의 발현을 유도하는, 상기한 바와 같은 tetO 요소인 인핸서를 포함한다. 제 1 활성화 전사 인자(즉, 제 1 치사 유전자 산물)는 제 1 및 제 2 인핸서 모두에 결합될 수 있고, 제 2 활성화 전사 인자는 제 1 및 제 2 인핸서 모두에 결합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 발현 시스템 중 하나는 제 3 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 3 우성 치사 유전자를 더 포함한다. 관련 유전자 발현 시스템의 프로모터를 활성화시킬 수 있는 활성화 전사 인자는 또한 제 3 프로모터를 활성화시킴으로써, 제 3 치사 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 제 3 치사 유전자의 발현은 또한 상기 활성화 전사 인자에 작용하는 외인성 제어 인자에 의해 조절되거나, 바람직하게는 억제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 관련 유전자 발현 시스템은 상기한 바와 같은 인핸서뿐만 아니라 선택적으로 제 3의 치사 유전자 및 제 3 프로모터를 더 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터 및 제 3 프로모터는 모두 상기 인핸서에 결합된다. 바람직하게, 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터는 인핸서의 일단에 결합되고, 제 3 프로모터는 인핸서의 타단에 결합된다. 특히, 상기한 바와 같이, 일부 인핸서는 어느 방향으로나 전사 수준을 향상시킬 수 있다.
제 3 치사 유전자는 치사 산물을 발현시키고, 따라서 총 치사 산물의 축적으로 인해 전이유전자의 치사 효과를 추가한다. 그러나, 전이유전자에 의해 제공되는 상기한 개선점은 전이유전자에서 제 3의 치사 유전자의 존재가 없는 경우에도 관찰된다.
제 3 치사 유전자는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제 3 치사 유전자는 제 1 및 제 2 치사 유전자와 관련하여 상기한 것들 중 임의의 것이다. 일부 실시형태에서, 제 3 치사 유전자는 tTA, tTAV 유전자 변이체 또는 VP16이다. 바람직한 실시형태에서, 제 3 치사 유전자는 VP16이다.
제 3 프로모터는 전이유전자의 제 1 및 제 2 프로모터와 관련하여 상기한 것들 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제 3 프로모터는 최소 프로모터이다. 바람직한 실시형태에서, 제 3 프로모터는 유기체의 초기 발육에서, 바람직하게는 적어도 배아 단계에서 발현된다. 바람직하게, 제 3 프로모터는 Hsp70 또는 sry α이다. 또 다른 실시형태에서, 제 3 프로모터는 Hsp70이다.
일부 실시형태에서, 전이유전자는 유전자 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 마커는 형광 마커이며, 형광 단백질을 코딩하는 유전자이다. 적합한 유전자 마커는 본 기술 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 형광 마커는 DsRed2 형광 단백질을 코딩하는 DsRed2이다. 다른 실시형태에서, 유전자 마커는 녹색 형광 단백질 또는 이의 변이체이다. 이들 유전자 마커는 성공적으로 형질전환된 유기체의 선택에 유용하다. 또한, 이러한 마커는, 예를 들어, 현장에서 야생형 파리 또는 현장에서 채집된 파리로부터 형질전환 파리를 식별하는데 유용하다.
이러한 유전자 마커를 포함하는 실시형태에서, 마커를 발현하는데 필요한 성분 또한 상기 실시형태에 포함될 것이라는 것을 본 기술 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 예를 들어, 형광 마커는 따라서 프로모터에 작동 가능하게 연결될 것으로 예상된다. 임의의 적합한 프로모터, 예를 들어 Hr5 / IE1이 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, tTAV(서열번호 26)는 제 1 우성 치사 유전자이고, Hsp70은 제 1 프로모터이며, Cctra는 제 1 스플라이스 제어 서열이다. 이러한 제 1 유전자 발현 시스템은 제 1 치사 유전자가 제 1 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자가 되도록 상기한 바와 같은 양성 피드백 루프이다. 제 1 유전자 발현 시스템은 제 1 인핸서를 더 포함하며, 제 1 인핸서는 tetOx7이다. 제 2 유전자 발현 시스템은 제 2 우성 치사 유전자로서 tTAV3 서열번호 28), 제 2의 프로모터로서 sry α 및 제 2 스플라이스 제어 서열로서 Bztra(GenBank 기탁 번호 BzTra KJ397268)를 포함한다. 제 2 유전자 발현 시스템은 또한 제 2 치사 유전자가 제 2 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자가 되도록 양성 피드백 루프를 형성한다. 제 2 유전자 발현 시스템은 제 2 인핸서를 더 포함하고, 여기서 제 2 인핸서는 tetOx14이다. 제 2 유전자 발현 시스템은 또한 제 3 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 3 치사 유전자를 더 포함하고, 여기서 제 3 치사 유전자는 VP16이고 제 3 프로모터는 Hsp70이다. 제 3 프로모터는 제 2 인핸서에 결합되고, 제 2 프로모터는 인핸서의 일단에 결합되며, 제 3 프로모터는 제 2 인핸서의 타단에 결합된다. 전이유전자는 유전자 마커 및 이를 위한 프로모터를 더 포함하며, 유전자 마커는 DsRed2이고, 따라서 프로모터는 Hr5/IE1이다. 또 다른 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 1로 표시되는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템은 직렬로 배열되어 전이유전자를 형성하고, 전이유전자는 각각의 유전자 발현 시스템 사이에 뉴클레오티드의 링커 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 유전자 발현 시스템 사이에 링커 서열을 포함하지 않는 실시형태에서, 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템은 근접해 있다. 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 사이에 링커 서열을 포함하는 실시형태에서, 링커 서열은 길이가 1 bp 내지 10 kbp이다.
또한, 전이유전자가 유전자 마커 및 이의 관련 프로모터를 더 포함하는 실시형태에서, 유전자 마커(또는 이의 프로모터) 및 인접한 유전자 발현 시스템 사이에 뉴클레오티드의 링커 서열이 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 이해할 것이다. 상기한 바와 같이, 링커 서열이 존재하지 않는 실시형태에서, 유전자 마커 또는 이의 프로모터는 전이유전자의 유전자 발현 시스템 중 하나에 인접해 있다. 전이유전자가 유전자 마커 및 관련 유전자 발현 시스템 사이에 링커 서열을 포함하는 실시형태에서, 링커 서열은 길이가 1bp 내지 10kbp이다.
그러나, 본 기술 분야의 숙련자는 전이유전자의 요소들이 인접하도록 전이유전자에 링커 서열이 존재하지 않는 것이 바람직하다는 것을 또한 알 것이다. 이는 전이유전자에 무작위 돌연변이가 도입될 위험을 줄이고 재조합 위험을 줄이기 위한 것이다.
유전자 발현 시스템을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열, 즉 전이유전자는 유전자 구조물의 일부를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 상기한 바와 같은 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템을 포함하는 유전자 구조물이 제공된다. 유전자 구조물은 전이유전자의 일부를 형성하지 않는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 이에 의해 형질전환된 유기체에 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 유전자 구조물은 적어도 두 쌍의 대향하는 역 반복(inverted repeat)을 형성하는 적어도 네 쌍의 역 반복을 더 포함한다. 전이유전자는 두 쌍의 역 반복 사이에 위치한다. 이는 계내에서(in situ)의 역 반복 쌍의 절제가, 호스트 게놈에 존재하는 트랜스포존(transposon)-유래 반복을 플랭킹(flanking)하지 않고, 호스트 유전체에 삽입된 유전자 발현 시스템을 남겨 두는데 효과적이라는 것을 의미한다. 상기 적어도 4 개의 역 반복은 WO2005/003364에 기술된 바와 같으며 Dafa'alla 등(2006)에 기술된 바와 같은 전이 가능한 말단의 제거를 제공한다.
일부 실시형태에서, 유전자 구조물은 적어도 두 쌍의 대향하는 역 반복을 형성하는 4 개의 역 반복을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 4 개의 역 반복은 piggyBac 역 말단 반복(ITR)인 것이 바람직하다. 역 반복 중 2 개는 전이유전자에 대해 원위이고, 즉 이들은 외부 역 반복이고, 나머지 역 반복은 내부 역 반복이다. 특히 이는 하나의 내부 역 반복이 하나의 외부 역 반복과 전이유전자 사이에 있음을 의미한다. 4 개의 역 반복은 따라서 4 개의 상이한 전이 요소를 형성하며, 전이 요소 중 2 개는 전이유전자를 포함하지 않는다. 유전자 발현 시스템을 포함하지 않는 전이 요소는 다른 2 개의 전이 요소보다 훨씬 짧다. 일반적으로, 트랜스포존은 짧은 서열을 절단하는데 더욱 효과적일 것이며, 따라서 트랜스포존이 하나의 5' 반복 및 두 개의 3' 반복을 갖는 경우, 예를 들어, 다른 자리로 이동하는 것으로 관찰되고 더 근접한 두 개의 3' 반복과 5' 반복에 의해 형성될 가장 일반적인 트랜스포존은 더 짧을 것이다. 따라서, 전이유전자를 포함하지 않는 트랜스포존은 전이유전자를 포함하는 트랜스포존보다 짧기 때문에, 전이유전자를 포함하지 않는 트랜스포존의 절제는 전이유전자를 포함하는 트랜스포존의 절제보다 더 큰 빈도로 발생한다.
일부 실시형태에서, 2 개의 내부 piggyBac ITR은 대략 160 염기 쌍의 추가 아말단(subterminal) piggyBac 서열을 포함하도록 변형된다. 이 추가 서열은 짧은 트랜스포존(즉, 전이유전자를 포함하지 않는 것)이 트랜스포존에 대한 노출의 후속 라운드 동안 절제되는 것을 보장하기 위해 추가될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 구조물은 적어도 두 쌍의 대향하는 역 반복을 형성하는 4 개의 piggyBac 역 반복을 포함한다. 4 개의 piggyBac 역 반복은 서열번호 30 내지 서열번호 32로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 서열번호 30으로 표시되는 서열은 2 개의 piggyBac 역 반복에 대해 사용된다. 특히, 하나의 외부 역 반복 서열은 서열번호 30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 다른 하나의 외부 역 반복 서열은 서열번호 31로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 내부 piggyBac 반복 중 하나는 서열번호 30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 다른 내부 piggyBac 역 반복은 서열번호 32로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 더욱 상세하게, 5' 외부 piggyBac 반복은 서열번호 30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 서열번호 32로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 3' 내부 piggyBac 역 반복은 5' 외부 piggyBac 역 반복과 전이유전자의 중간에 있다. 3' 외부 piggyBac 역 반복은 서열번호 31로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성되고, 서열번호 30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 구성된 5' 내부 piggyBac 역 반복은 3' 외부 piggyBac 역 반복과 전이유전자의 중간에 있다.
따라서, 이러한 실시형태에서 가능한 네 가지 트랜스포존은:
i) 5' 외부 및 3' 외부 piggyBac 역 반복,
ii) 5' 외부 및 3' 내부 piggyBac 역 반복,
iii) 3' 외부 및 5' 내부 piggyBac 역 반복
iv) 5' 내부 및 3' 내부 piggyBac 역 반복 사이에 있다.
상기한 바와 같이, 트랜스포존 ii) 및 iii)은 전이유전자를 포함하지 않고, 트랜스포존 (i) 및 (iv)보다 짧다.
4 개의 역 반복을 갖는 일부 실시형태에서, 구조물은 사용자가 전위 및 절제의 다양한 단계의 진행을 따를 수 있게 하고 상기 어떠한 단계에서 개체들이 성공적이었는지를 결정할 수 있게 하기 위해 적어도 하나의 가능한 트랜스포존과 관련된 적어도 하나의 유전자 마커를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 유전자 마커는 전위/절제 과정에서 확인 가능한 단계와 관련되고, 더욱 바람직하게, 마커는 전이유전자와 관련된다. 전이유전자와 관련된 마커는 상기한 바와 같을 수 있다.
바람직하게, 적어도 하나의 유전자 마커가 각각의 가능한 트랜스포존과 관련된다. 따라서, 적어도 하나의 유전자 마커는 역 반복의 각각 쌍 사이에 위치한다. 임의의 적합한 유전자 마커가 사용될 수 있고, 그러한 마커의 예는 DsRed2 , AmCyan 및 ZsGreen을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일부 실시형태에서, 구조물은 3 개의 유전자 마커를 포함하며, 하나의 마커는 역 반복의 각각 쌍의 쌍 사이에 위치한다. 트랜스포존을 구별하기 위해, 마커 각각은 상이해야 한다는 것을 이해할 것이다.
적어도 하나의 유전자 마커를 포함하는 실시형태는 또한 유전자 마커의 발현을 유도하는 프로모터를 또한 포함할 것이라는 것을 본 기술 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 Hr5 / IE1(Choi & Guarino, 1995)인 반면, 다른 실시형태에서는 프로모터는 폴리유비퀴틴(Polyubiquitin)(Handler & Harrel, 2001)이다. 그러나, 유전자 마커와 함께 사용하기 위한 프로모터는 이들 두 가지 예에 한정되지 않으며, 다른 것들도 사용될 수 있다. 본 기술 분야의 숙련자는 어느 프로모터가 적합한지를 알 것이다.
바람직한 실시형태에서, 구조물은 서열번호 1로 표시되는 전이유전자를 포함하고, 상기한 4 개의 piggyBac 역 반복을 더 포함한다. 구조물은 5' 외부 piggyBac 반복과 3' 내부 piggyBac 반복 사이의 유전자 마커 및 3' 외부 piggyBac 반복과 5' 내부 piggyBac 반복 사이의 유전자 마커를 포함하며, 이들 유전자 마커 중 하나는 AmCyan이고, 다른 하나는 ZsGreen이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 구조물은 도 2에 도시된 바와 같고, 5' 외부 piggyBac 반복 및 3' 내부 piggyBac 반복 사이의 마커는 ZsGreen이고, 3' 외부 piggyBac 반복 및 5' 내부 piggyBac 반복 사이의 마커는 AmCyan이다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 전이유전자 및 유전자 구조물은 야생에서 유기체 개체군의 조절에 유용하다. 구체적으로, 전이유전자로 형질전환된 절지동물은 이전에 개시된 형질전환 곤충과 비교할 때 향상된 전이유전자 침투율 및 치사의 조기 발생과 함께 성-특이적 치사를 나타낸다. 상기한 전이유전자 또는 구조물 중 어느 하나에 의한 절지동물의 형질전환은 또한 생화학적 내성이 발생하는 경우 안전 메커니즘을 제공한다. 상기한 바와 같이 적어도 4 개의 역 반복을 포함하는 구조물은 모든 트랜스포존 서열의 통합 후 제거가 가능하여 대량 사육 및 현장 조건 모두에서 안정성을 제공한다는 추가 이점을 제공한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 상기한 전이유전자 또는 구조물로 형질전환된 유기체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 유기체는 절지동물이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 곤충이다. 다른 실시형태에서, 유기체는 나비목(Lepidoptera), 벼룩목(Siphonaptera), 파리목(Diptera), 막시목(Hymenoptera), 딱정벌레목(Coleoptera), 총채벌레목(Thysanoptera), 매미목(Hemiptera), 메뚜기목(Orthoptera) 또는 중기문진드기목(Mesostigmata)이다. 다른 실시형태에서, 유기체는 과실파리과(Tephritidae), 초파리과(Drosophilidae), 깜장파리과(Lonchaeidae), 날개무늬파리과(Pallopteridae), 알락파리과(Platystomatidae), 파이로고티다에(Pyrogotidae), 라차디이다에(Richardiidae) 또는 울리디이다에(Ulidiidae)이다. 바람직한 실시형태에서, 유기체는 과실파리과 또는 초파리과이다. 바람직한 실시형태에서, 유기체는 세라티티스 속, 드로소필라 속, 박트로세라 속, 아나스트레파 속 또는 라골레티스 속이다. 더욱 바람직하게, 유기체는 세라티티스 속이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 유기체는 세라티티스 카피타타이다.
전이유전자 또는 구조물은 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있지만 일반적으로 게놈에 통합된 후에 시험되는 것으로 이해될 것이다. 투여는 비경구로, 정맥 내로, 근육 내로, 경구로, 경피적으로, 점막을 통해 전달되는 것과 같은 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 배아로의 주입이 특히 바람직하다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 또는 구조물은 플라스미드로서 투여된다.
바람직한 실시형태에서, 형질전환된 유기체는 세라티티스 카피타타이고, 형질전환된 곤충은 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 형질전환된 세라티티스 카피타타는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하고, 이 서열을 포함하는 세라티티스 카피타타는 본원에서 OX3864A로 지칭된다. 다른 실시형태에서, 형질전환된 세라티티스 카피타타는 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하고, 이 서열을 포함하는 형질전환된 세라티티스 카피타타는 본원에서 OX3647Q로 지칭된다.
일부 실시 예에서, 서열번호 2로 표시되는 서열(즉, OX3864A)을 포함하는 형질전환된 세라티티스 카피타타가 다음과 같은 이유로 특히 바람직하다:
i) 전이유전자 침투율은 단일 복제에서 100%이고; 즉, 실시예에서 볼 수 있듯이, 이형접합 상태에서도 애벌레 배지로부터의 모든 암컷은 테트라시클린의 부재 하에 죽었고;
ii) 애벌레 사료에 포함된 테트라시클린의 존재 하에서 수컷:암컷의 비율은 50:50으로 암컷에서의 전이유전자 발현의 양호한 억제성을 나타내고(이는 사육 시설에서의 비용 효율적인 증식에 있어서 중요함);
iii) OX3864A는 테트라시클린의 부재 하에 완전한 전용(pre-pupal) 번데기의 암컷 치사를 보였고;
v) 적색 마커(DsRed2)의 발현은 강력하고 지속 가능하다. 마커는 모든 발육 단계에서 명백하게 나타나고 이는 대량 사육 시설에서의 철저한 품질 관리(QC) 프로토콜 및 현장에서의 신뢰할 만한 모니터링을 가능하게 하고;
vi) 생애사(life history) 파라미터는, 실시예에 나타낸 바와 같이, 형질전환에 사용된 야생형 균주의 파라미터와 유사하며, 이는 O3864A가 테트라시클린에서 사육될 때 거의 야생형 적응을 갖는 것을 의미하며;
vii) 벡터 piggyBac 말단의 제거에 의해 삽입된 구조물이 삽입 후 안정화되었고, 이러한 전이유전자는 곤충의 게놈에서 고정되고 유전된다.
상기한 전이유전자 또는 구조물로 성공적으로 형질전환된 유기체를 동정하는 것도 유용하다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에서, 상기한 전이유전자 또는 구조물로 형질전환된 유기체를 검출하는 방법 및 상기 방법에서 사용하기 위한 프라이머가 제공된다. 상기 방법은 삽입된 전이유전자 및 전이유전자 자체를 플랭킹하는 유기체의 게놈 DNA와 중첩되는 DNA 서열을 증폭시킴으로써 형질전환된 유기체를 검출하기 위한 PCR-기반 분석을 포함한다. 상기 방법은 유기체에서 수득된 DNA 샘플을 곤충 게놈에 삽입된 상기한 전이유전자에 특이적인 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계, 상기 쌍의 하나의 프라이머는 전이유전자의 뉴클레오티드 서열에 특이적이고, 상기 쌍의 다른 프라이머는 삽입된 전이유전자를 플랭킹하는 게놈 뉴클레오티드 서열에 특이적이고, 및 DNA 샘플을 증폭시키는 단계를 포함한다. 따라서, 프라이머 쌍의 하나의 프라이머는 플랭킹 게놈 DNA를 어닐링하고 프라이머 쌍의 다른 프라이머는 전이유전자를 어닐링한다. 이어서, 증폭 산물은 가시화될 수 있고, 일반적으로 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
DNA 샘플의 증폭은 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 PCR 기술을 사용하여 수행된다. 상기한 바와 같이, 프라이머 쌍의 프라이머들은 형질전환된 유기체에 특이적이고, 전이유전자가 관련 게놈 위치에 통합될 때만 적절한 크기의 밴드를 증폭할 것이다.
본 기술 분야의 숙련자는 다양한 프라이머가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 이러한 프라이머는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있음을 알 것이다. 사용된 프라이머는 시각화되거나 더욱 일반적으로 검출되는 PCR 증폭 산물의 크기를 정의한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 전이유전자 또는 유전자 구조물로 형질전환된 유기체를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 절지동물이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 곤충이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 나비목, 벼룩목, 파리목, 막시목, 딱정벌레목, 총채벌레목, 매미목, 메뚜기목 또는 중기문진드기목이다. 또 다른 실시형태에서, 유기체는 과실파리과, 초파리과, 깜장파리과, 날개무늬파리과, 알락파리과, 파이로고티다에, 라차디이다에 또는 울리디이다에이다. 바람직한 실시형태에서, 유기체는 과실파리과 또는 초파리과이다. 바람직한 실시형태에서, 유기체는 세라티티스 속, 드로소필라 속, 박트로세라 속, 아나스트레파 속 또는 라골레티스 속이다. 바람직한 실시형태에서, 유기체는 세라티티스 속이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 유기체는 세라티티스 카피타타이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 형질전환된 세라티티스 카피타타에 특이적인 프라이머를 사용한다. 일부 실시형태에서, 세라티티스 카피타타에 특이적인 프라이머는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 실시형태에서, 제 1 프라이머 쌍(TG1), 제 2 프라이머 쌍(TG2) 또는 제 3 프라이머 쌍이 제공된다. TG1은 프라이머 TG1-3864AttpflR(서열번호 4) 및 TG1-AttPF2(서열번호 5)로 구성된다. 이 쌍에서, TG1-3864AttpflR은 전이유전자를 플랭킹하는 게놈 DNA에 특이적이고 TG1-AttPF2는 전이유전자 자체에 특이적이다. TG2는 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머로 구성된다. TG2는 프라이머 TG2-3864FRTF1F(서열번호 6) 및 TG2-FRTNheF(서열번호 7)로 구성된다. TG2에서, TG2-3864FRTF1F는 삽입된 전이유전자를 플랭킹하는 게놈 DNA에 특이적이고, TG2-FRTNheF는 전이유전자 자체에 특이적이다. 제 3 프라이머 쌍은 Cc3864FRTtaqF(서열번호 10) 및 Cc3864FRTtaqR(서열번호 11)로 구성된다. 제 3 프라이머 쌍에서, Cc3864FRTtaqF는 전이유전자에 특이적이고, Cc3864FRTtaqR는 플랭킹 게놈 DNA에 특이적이다.
다른 실시형태에서, 상기한 전이유전자에 특이적인 프라이머 중 임의의 하나는 플랭킹 게놈 DNA에 특이적인 프라이머 중 어느 하나와 쌍을 이룰 수 있고, 본 기술 분야의 숙련자는 PCR 증폭 산물의 크기는 사용된 프라이머 쌍에 따라 달라질 수 있다는 것을 알 것이다.
다른 실시형태에서, 상기한 전이유전자 또는 구조물로 형질전환된 유기체를 검출하는 방법은 증폭 단계 동안 이중 표지된 프로브의 사용을 더 포함한다.
통합 전이유전자와 유기체 게놈 DNA의 접합부에서의 서열은 독특한 지문을 나타낸다. 따라서, 3 개의 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 고유한 접합부를 검출할 수 있다. 상기 방법에 사용된 2 개의 올리고뉴클레오티드는 삽입된 전이유전자 및 플랭킹 게놈 DNA의 소정의 단편의 증폭을 가능하게 하는 프라이머이고, 세 번째 이중 표지된 올리고뉴클레오티드, 즉 프로브가 이에 어닐링한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 켄처 분자(quencher molecule) 및 5' 리포터 분자(reporter molecule)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 유기체에서 수득된 DNA 샘플을 유기체 게놈에 삽입된 상기한 전이유전자에 특이적인 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계, 상기 쌍의 하나의 프라이머는 전이유전자에 특이적이고, 상기 쌍의 다른 프라이머는 삽입된 전이유전자를 플랭킹하는 게놈 뉴클레오티드 서열에 특이적이고, 및 DNA 샘플을 증폭시키는 단계를 포함한다. 이 방법의 단계는 대체로 상기한 바와 같다. 프라이머와의 PCR 증폭 혼합물에 프로브가 추가된다. 프로브는 전이유전자와 증폭된 PCR 산물에서의 플랭킹 DNA의 접합부를 특이적으로 연결하며, 이는 양성 출력을 위해 이러한 경계를 필요로 한다. PCR 증폭의 각각의 단계에서 Taq 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성은 어닐링된 프로브로부터 5' 리포터 분자(FAM)를 방출하여, 통합 전이유전자를 보유한 샘플로부터 실시간 PCR 기계에서 검출 가능한 축적 방출을 유발한다. 따라서, 상기 방법은 DNA 샘플의 PCR 증폭 동안 DNA 샘플을 프로브와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 유기체는 절지동물이고, 바람직한 절지동물은 위에서 논의되었다. 바람직한 실시형태에서, 유기체는 곤충, 바람직하게는 테프리티드, 더욱 바람직하게는 세라티티스 속이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 곤충은 세라티티스 카피타타 종이다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 프라이머는 형질전환된 세라티티 스 카피타타에 특이적이다. 바람직하게, 프라이머는 서열번호 2로 표시되는 서열(즉, OX3864A)을 포함하는 세라티티스 카피타타에 특이적이다. 본 실시형태에서, 소정의 단편의 증폭을 가능하게 하는 프라이머는 각각 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 Cc3864FRTtaqF 및 Cc3864FRTtaqR이다. Cc3864FRTtaqF는 플랭킹 게놈 DNA에 특이적이고 Cc3864FRTtaqR은 전이유전자에 특이적이다. 이러한 실시형태에서, 프로브는 서열번호 12로 표시되는 Cc3864FRT 프로브이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 유기체의 개체군 조절 방법이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 유기체 또는 유기체들을 상기한 전이유전자 또는 구조물로 형질전환시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 형질전환된 유기체(들)를 조절되는 개체군으로 방사하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 또한 조절되는 개체군을 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 방사된 유기체는 조절되는 개체군과 함께 번식하며, 유전자 발현 시스템에 의해 부여되는 암컷-특이적 치사는 이러한 교배 육종에 의해 생산된 암컷 자손이 발육 초기 단계에서 사망한다는 것을 의미한다. 유전자 발현 시스템을 물려받은 수컷 자손은 생존하여 치사 표현형을 다음 세대에 전달한다.
일부 실시형태에서, 조절되는 개체군은 절지동물 개체군이다. 일부 실시형태에서, 개체군은 곤충 개체군이다. 일부 실시형태에서, 개체군은 나비목, 벼룩목, 파리목, 막시목, 딱정벌레목, 총채벌레목, 매미목, 메뚜기목 또는 중기문진드기목이다. 다른 실시형태에서, 개체군은 과실파리과, 초파리과, 깜장파리과, 날개무늬파리과, 알락파리과, 파이로고티다에, 라차디이다에 또는 울리디이다에이다. 바람직한 실시형태에서, 개체군은 과실파리과 또는 초파리과이다. 또 다른 실시형태에서, 개체군은 세라티티스 속, 드로소필라 속, 박트로세라 속, 아나스트레파 속 또는 라골레티스 속이다. 바람직한 실시형태에서, 개체군은 세라티티스 속이다. 바람직한 실시형태에서, 개체군은 세라티티스 카피타타 개체군이다.
유기체의 방사는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, Simmons 등(2011) 또는 Harris 등(2011)에 기술된 것과 같은 케이지 방사 또는 페이퍼백 방사와 같은 방법에 의해 이루어질 수 있다..
유기체 개체군을 모니터링하는 단계는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 형질전환된 유기체(들)에 삽입된 전이유전자는 DsRed2와 같은 유전자 마커를 포함한다. 따라서, 조절되는 개체군의 모니터링은, 형질전환된 유기체(들)의 방사 및 포집된 개체의 유전자 마커에 대한 시각화, 또는 더욱 일반적으로 검출 이후에 개체군으로부터 곤충을 포획하는 것에 의한 것일 수 있다.
본 발명은 이제 다음의 비제한적인 실시예를 참고하여 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 우성 산물 C. 카피타타 균주의 선별
Toliman(원산지: 과테말라)의 도 2에 도시된 구조물을 사용하여 piggyBac 매개 형질전환을 통해 형질전환된 균주를 생성하였다. 야생형 파리에 대한 역교배는 다중 형질전환 계통을 생성했다(표 1). OX3864(생존율 21%)에 대해 49 마리의 G0 성체를 수득했고, OX3647(생존율 35%)에 대해 950 마리를 수득했다.
다음의 두 가지 중요한 파라미터에서 구조물의 기능성을 평가하기 위해 이들 두 가지 식이 조건 하에서의 성비를 사용하였다: 1) 테트라시클린을 제공했을 때 암컷 치사율의 총 억제; 및 2) 테트라시클린의 부재 하의 총 암컷 치사율. 계통은 이들 파라미터를 충족시킬 수 있는 이들의 능력 및 형광 강도를 기반으로 추가 검사를 위해 선택되었다.
11 개의 계통은 전이유전자의 단일 복제에서 완전한 침투율을 제공하지 못하고 폐기되었다. 한 계통은 불완전한 테트라시클린 억제성을 나타내었으며 이 또한 폐기되었다. 두 계통은 아마도 전이유전자 삽입에 의해 부과된 적응 형벌로 인해 충분한 자손을 생산하지 않아 중단되었다. 생성된 모든 라인에서 형광은 양호했으나, OX3864는 일반적으로 강력하고 명확한 형광 표현형을 제공하였다. OX3864A 및 OX3647Q 성체 수컷 파리의 사진을 도 4F 및 도 4G에서 볼 수 있다. 이들 두 균주는 모두 야생형 수컷에 비해 인식 가능한 표현형을 나타내지만, OX3864A 형광 표현형(+++)은 OX3647Q(++)의 그것보다 강하다는 것이 명백하다.
Figure pct00001
표 1 : 다양한 OX 계통으로부터의 수컷 및 암컷의 G2 생존율 분석을 위해, 야생형 TOLIMAN 에 교배되기 전에 온- 및 오프-테트라시클린 미세 주입 생존자(G0)를 수집하였다. 계통은 G1 자손이 수집된 풀을 나타내기 위해 숫자와 알파벳 접미사에 따라 명명하였다(예를 들어, OX3647 Q). 매우 많은 수의 OX3647 생존자로 인해, 알파벳 체계를 재사용하였고 알파벳 접미사 앞에 괄호 안의 숫자로 표시하였다(예를 들어, OX3647 (2)B). 동일한 풀에서 출현하는 다수의 G1 자손에 대해 추가 번호가 주어졌고(예를 들어, OX3647 L1, L2), 이들은 잠재적으로 분리된 삽입 이벤트로서 초기에 처리되었다. 단일 형질전환 G1 수컷은 각각 여러 마리의 처녀 야생형 암컷과 교배되었다. G2 자손은 테트라시클린-(T, 100 μg/ml) 또는 비-테트라시클린(NT) 함유 배지에서 형광(F) 또는 비-형광(NF) 및 성별로 점수를 매겼다.
생성된 균주에 대한 추가 분석은 다음을 포함하였다.
- G2에서 마커 대립 유전자 분리로 원래 측정된 단일 전이유전자 삽입,
- 동일 계통의 수컷과 암컷이 교배되었을 때 마커 대립 유전자 분리로 측정된 동형접합 가능성,
- Dafa'alla 등(2006)에 의해 기술된 방법에 따라, 전이효소의 공급원을 제공하는 OX3133 균주와의 교배를 통한 piggyBac 말단 제거.
5 개의 계통은 다중 삽입을 나타내었고, 3 개의 라인에 대해 전이유전자 삽입이 성 결합된 것으로 밝혀졌다. 따라서 8 개 계통 모두가 폐기되었다. OX3864E 균주는 침묵 삽입을 포함하였고(플랭킹 서열 분석에 의해 확인됨) 폐기되었다. 남아있는 모든 균주는 동형접합에 양성 반응을 보였고, 따라서 piggyBac 절제를 위해(Dafa'alla 등, 2006) 메드플라이 균주 OX3133와 교배하였다. 오직 OX3864A 및 OX3647Q 균주만이 모든 piggyBac 서열의 완벽한 제거를 입증하였으며 따라서 잠재적인 제품 균주로 선정되었다.
이어서, OX3864A 및 OX3647Q 각각의 동형접합 계통을 근친 교배로 유도하여 추정된 동형접합체를 생성하였고, PCR에 의해 확인하였다. 완전한 piggyBac 서열 제거에 대한 추가 증거는 PCR에 의해 제공된다(도 3). 도 3에서 볼 수 있듯이, piggyBac이 구조물에 존재할 때 산물을 생성하도록 설계된 4 개의 PCR을 사용할 때 분해된 계통에 대한 겔 산물의 부재에 의해 나타난 바와 같이, OX3864A 및 OX3647Q 균주에는 piggyBac 서열이 존재하지 않았다. 겔을 생성하기 위해, Purelink 게놈 DNA 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 개별 성체로부터 게놈 DNA를 추출했다. 제조사의 지시에 따라 Biotaq(PCR biosystems)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 2 분 동안 초기 변성, 이후 사이클당 0.5℃의 감소로 94℃에서 15 초, 60℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 15 초의 10 사이클, 이어서 94℃에서 15 초, 55℃에서 30 초, 72℃에서 15의 25 사이클, 그리고 72℃에서 7 분간 최종 신장.
도 3의 패널 A에 도시된 겔을 생성하는 PCR 반응은 프라이머 916) AttPF2(GTCATGTCGGCGACCCTACGC; 서열번호 5) 및 TD935) Diag-5PBmin(GCCACCGAGTATGACCGGTAG; 서열번호 15)을 사용하였다. piggyBac 모티프의 존재는 512bp의 DNA 단편을 생성한다. 도 3의 패널 B에 도시된 겔을 생성하는 PCR 반응은 프라이머 TD222) DIag-Pb5(CTGATTTTGAACTATAACGACCGCGTG; 서열번호 16) 및 432) AmCydiagF(TCACCTACGAGGACGGCGG; 서열번호 17)를 사용하였다. piggyBac 모티프의 존재는 820bp의 DNA 단편을 생성한다. 도 3의 패널 C에 도시된 겔을 생성하는 PCR 반응은 프라이머 TD1445) DIag6-pb3(GTGCCAAAGTTGTTTCTGACTGAC; 서열번호 18) 및 TD154) DIag-K10-1(CACTTAAGCGACAAGTTTGGCCAAC; 서열번호 19)을 사용하였다. piggyBac 모티프의 존재는 972bp의 DNA 단편을 생성한다. 도 3의 패널 D에 도시된 겔을 생성하는 PCR 반응은 프라이머 TD1312) Diag7-pb3(CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACG; 서열번호 20) 및 TD677) Diag2-hr5(CATACTTGATTGTGTTTTACGCGTAG; 서열번호 21)를 사용하였고, piggyBac 모티프는 470bp의 DNA 단편을 생성한다. 미해결 양성 대조군 OX3647 및 2 개의 음성 대조군(야생형 TOLIMAN 및 물)인 OX3864A, OX3647Q로부터의 PCR 산물은 Smart ladder(Eurogentec, 밴드 크기는 위에서 아래로: 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb , 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 800bp, 600bp, 400bp, 200bp)를 이용하여 1% 겔에서 실시하였다.
삽입 및 절제 분석 후, OX3864A 및 OX3647Q 균주를 온도-민감성-치사(temperature-sensitive-lethal, tsl) Vienna 8 균주(참조)에서 유래한 TOLIMAN 야생형 균주와 비교하여 생애사 파라미터에 대해 추가로 시험하였다. tsl은 현재 전세계적으로 많은 불임충 방사법(Sterile Insect Technique, SIT) 프로그램에서 사용되는 야생형 TOLIMAN에 유전자 침투된, Vienna-8(협동원체 역위(pericentric inversion) D53 없이)(Caceres, 2002)이라고도 불리는 유전자 성감별 균주(T(Y; 5)101)이다. 수행된 테스트의 세부 사항은 아래와 같다. 그래프는 도 4에 도시되어 있다. 적응 지수는 표 2에 제공되어 있다.
장수
동일한 유전자형의 30 마리의 수컷과 30 마리의 암컷을(8.1 cm2당 한 마리 곤충) 각각 포함하는 6 개의 복제 플라스틱 케이지(9 cm x 9 cm x 9 cm)에서 21℃ 및 상대 습도(R.H.) 50%에서 장수 테스트를 수행하였다. 3 개의 케이지는 무작위로 먹이가 없고 물이 없는 “스트레스” 검사를 받았다. 이는 방사 조건 하에서 잠재 수명의 중요한 지표인 부화에서 이용할 수 있는 영양분 보유량의 상대적 측정을 평가하기 위해 수행되었다. 나머지 케이지에는 먹이와 물을 무제한으로 공급했다. 케이지는 매일 모니터링되었고, FAO/IAEA/USDA 지침에 따라 모든 파리가 죽을 때까지 죽은 성체를 제거하고 암수를 감별하였다.
스트레스 조건 하에 수용된 파리는 먹이와 물이 공급된 파리들과 비교하여 수명이 현저하게 감소하였고(로그 랭크 테스트(Log Rank Test) χ2 1 = 1307, P < 0.001); 스트레스를 받은 모든 파리는 6 일 이내에 죽었다(도 4D). 먹이와 물을 제공받은 비-스트레스 케이지에서, 유전자형의 생존에 유의한 영향이 있었다(즉, RIDL 대 야생형 및 tsl; χ2 = 15.6, P < 0.001; 도 4B). 성별은 수명에 유의한 영향을 미치지 않았으며(χ2 1 = 0.17, P = 0.68), 따라서 암컷과 수컷 모두에 대한 생존 데이터가 결합되었다. 스트레스 조건 하에서 OX3647Q는 야생형과 비교하여 암컷과 수컷 모두 유의하게 높은 생존율을 보였다(평균 ± 표준 오차: 야생형 = 4.1 일 ± 0.054, OX3647Q = 4.38 일 ± 0.066, 콕스의 비례 위험(Cox’s Proportional Hazards): z = -2.1, P = 0.035). 그러나 완전 먹이, 비-스트레스 조건 하에서의 패턴은 역전되었다(야생형 = 18.9 일 ± 0.52, OX3647Q = 13.7 일 ± 0.53, z = 5.92, P < 0.01). 스트레스 또는 비-스트레스 처리군에 있어서, 야생형에 비해 OX3864A 및 tsl 파리의 평균 수명은 유의한 차이가 없었다(OX3864A = 4.13 일 ± 0.055, z = 0.59, P = 0.55, tsl = OX3864A = 17.2 일 ± 0.53, z = 1.13, P = 0.26, tsl = 17.0 일 ± 0.52, z = 0.7, P = 0.49).
평생 암컷의 생식력
상기한 비-스트레스 케이지에서, 24 시간 동안 알을 채집하고 해부 현미경으로 계수하였다. 이어서 알 샘플을 젖은 와트만 여과지(Fisher Scientific)에서 배양하고 파라필름을 구비한 페트리 접시로 봉인하였다(페트리 접시 당 200 알, 한 줄당 총 600 알)에 봉인되었다. 알 채집 72 시간 후, 페트리 접시를 개봉하고 해부 현미경으로 검사하여 비어있는 알집 대 부화되지 않은 알집의 수를 계산하였다.
“비-스트레스” 케이지에서의 일일 알 생산은 시간이 지남에 따라 상당히 감소했다(반복 측정 ANOVA: F1.6, 12.9 = 253.04, P < 0.001) 그리고 유전자형(F4.8, 12.9 = 5.19, P = 0.008). 본페로니 교정(Bonferroni correction)과의 쌍대 비교(pairwise comparison)는 야생형에 비해 RIDL 및 tsl 계통 모두에 있어서 일생 동안 현저히 적은 알을 생산한 것을 밝혔다(야생형 평균 수명 알 생산 = 435 ± 48.51; OX3864A = 3470 ± 226, P < 0.014; OX3647Q = 2593 ± 147, P < 0.001; tsl = 2465 ± 93.29, P < 0.001). OX3647Q와 tsl 균주는 또한 OX3864A보다 현저히 적은 알을 생산하였다(OX3647Q 대 야생형, P < 0.001; tsl 대 야생형, P = 0.005, 도 4D).
일일 사망률을 기록함으로써, 암컷당 연령별 알 생산량을 추정하는 것도 가능했다. 이와 일치하게, 이는 또한 번식력이 시간에 따라 유의하게 감소함을 보여 주었다(반복 측정 ANOVA: F1.9, 15.2 = 131.85, P < 0.001). 그러나, 이러한 감소에 대해 유전자형의 유의한 영향은 없었다(F5.7, 15.2 = 2.19, P = 0.104, 도 4C). 이를 뒷받침하기 위해, 최대 산란(10 일)에서 산란한 알의 개수에 대한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)도 모든 계통 사이에서 암컷당 산란에서 유의한 차이를 보이지 않았다(F3,8 = 0.029, P = 0.97).
알 부화율
알 부화율에 대한 연령의 유의한 영향(반복 측정ANOVA F5,40 = 207.3, P < 0.001)뿐만 아니라 유전자형의 유의한 효과(F15,40 = 4.52, P < 0.001, 도 4E)가 있었다. 본페로니 교정과의 쌍대 비교는 OX3647Q와 tsl이, OX3864A는 아니고, 야생형에 비해 상당히 낮은 평균 알 부화율을 갖는다는 것을 보여주었다(89.56% ± 0.84; OX3647Q = 79.11% ± 0.84, P < 0.001; tsl = 78.33% ± 0.84, P < 0.001, OX3864A = 87.11% ± 0.84, P = 0.247).
성체 부화율
각 계통에서 300 마리의 번데기를 하나씩 놓고 부화를 모니터링했다. 기록하기 전에 성별 및 가시적인 기형을 확인하기 위해 성충을 검사했다. 부화되지 않거나 부분적으로 부화된 번데기 알집을 계수한 후 폐기하였다.
또한, 계통 사이에 성체 부화율에서 유의한 차이가 있었다(ANOVA: F3, 10 = 9.89, P < 0.001). Tukey HSD post hoc 테스트는 이러한 차이가 야생형에 비해 상당히 낮은 성체 부화율로 인한 것임을 밝혀냈다(86.1% ± 0.69, OX3647Q = 75.7% ± 2.43, P < 0.01, OX3864A = 84.7% ± 0.91, P = 0.9, tsl = 81.2% ± 1.04, P = 0.25). OX3647Q에서의 수컷과 암컷의 성비의 차이로 인해 성체 성비에 대해 유전자형의 유의한 효과가 있었지만 다른 계통에서는 그렇지 않았다(F3, 10 = 5.06, P = 0.036)(Tukey HSD post hoc 테스트: OX3647Q = 54% ± 1, P = 0.035, OX3864A = 55% ± 2.3, P = 0.055, tsl = 50% ± 1.5, P = 0.83).
적응 지수
개별 생애사 구성 요소로부터, 암컷(R0)당 순 번식률 및 평균 세대 기간(G)(한 세대에서 다음 세대로의 암컷 수정률의 피크에 걸침)을 계산하였다(표 2). 이 추정치로부터, 암컷당 적응 지수(r)를 산출하였다. 야생형에 대한 r 값은 0.195이며, 이는 다음 세대에 일일 평균 0.195 마리의 암컷에 기여하는 각각의 암컷과 동일하다. 다른 계통은 낮은 체력 지수를 보였다(OX3864A: r = 0.187, OX3647Q: r = 0.176, tsl: r = 0.165).
생애사 기록으로부터 계산된 OX3864A, OX3647Q, 야생형 및 tsl 균주에 대한 적응 지수
야생형 OX3864A OX347Q TSL
암컷의 순번식률(R0) 267.6 183.7 113.1 133.1
세대 기간 일수(G) 32 32.1 35.6 36
적응 지수(r) 0.195 0.187 0.176 0.165
야생형 TOLIMAN 파리와 OX3864A 및 OX3647 수컷과의 교미 경쟁력
성체 OX3864A, OX3647Q, 야생형 TOLIMAN는 저밀도(0.5 g 배지당 1 마리의 애벌레)로 오프-테트(off-tet)로 사육된 애벌레에서 수득하였다. 옥스퍼드 대학교(영국, 옥스퍼드) 동물학과에서 내부에 작은 오렌지 나무(높이 ~1 m)가 배치된 온실 내부에 필드 케이지(높이 1.25 m, 베이스 0.5 m2)를 구성하였고, 자연광 및 안정적인 온도와 습도(25℃, 50% RH)를 사용하여 8 월(06:00 일출) 동안 실험을 실시했다. OX3864A 또는 OX3647Q로부터 30 마리의 수컷을 30 마리의 야생형 수컷과 함께 06시 30분에 배치하였고, 30 분 후에 30 마리의 암컷을 도입하였다.
구애와 교미의 기본 순서는 메드플라이에서 잘 특징화되며, “페로몬 콜링(pheromone calling)” 및 급격한 날개 진동으로 구성된 수컷 행동 패턴(Cayol et al., 2002)의 독특한 순서를 따른다. 구애 이후 수컷은 암컷에게 달려들 것이며, 성공적인 삽입이 발생하는 경우, 해당 쌍은 일반적으로 여전히 남아있을 것이다. 교미는 일반적으로 90 분에서 195 분 동안 지속된다. 교미 쌍은 삽입 후 케이지에서 제거하고 조심스럽게 수평 배치 1.5 ml 에펜도르프(eppendorf)에 넣었다. 교미 개시 시간을 기록하고 에펜도르프로 옮긴 후 30 분 이상 교미한 쌍에 대해서만 성공적인 교미로 기록했다. 짧은 교미(15 분 미만)는 종종 정자 전달을 일으키지 않으므로 데이터에서 제외하였다. 교미 실험은 개시 9 시간 후(16:00) 또는 모든 암컷이 교미되었을 때, 어느 것이 더 빨랐던지 간에 종료하였다. 교미 수컷의 신원은 형광 현미경 하에서 DsRed2 형광 마커의 존재 또는 부재에 대해 수컷을 계수하여 결정하였다. 시험은 각 계통에 대해 10 반복으로 수행하였다. OX3864A 및 OX3647Q에 대해 각각 167 및 237 쌍을 평가하였다.
상대 불임 지수(relative sterility index, RSI)를 수컷의 성적 경쟁력의 척도로 사용하였다(McInnis et al., 2002; FAO/IAEA/USDA, 2003). RSI는 0과 1 사이의 범위이고, 1의 RSI는 형질전환 수컷에 의한 교배의 100%를 나타내며, 0의 값은 야생형에 대해 100%를, 그리고 0.5는 동일한 수의 교미를 나타낸다. 결과에 따르면 형질전환 균주는 야생형 수컷에 비해 경쟁력이 현저히 감소하지 않았다(t-test: OX3864A: RSI 0.46 ± 0.08, t18 = -2.09, OX3864A 교미 수컷 n = 77, 야생형 교미 수컷 n = 90, P = 0.05, OX3647Q: RSI 0.47 ± 0.09, t18 = -1.72, OX3647Q 교미 수컷 n = 112, 야생형 교미 수컷 n = 125, P = 0.1).
야생형 또는 fsRIDL 수컷과 처음 교미한 암컷들 사이에서 암컷 재교미(remating) 빈도에 유의한 차이가 보이지 않았다(Fisher’s Exact test: OX3864A: χ2 1 = 0.82, n = 40, P = 0.775; 7 마리의 암컷이 재교미한 OX3864A 수컷과 처음 교미하였고, 8 마리의 암컷이 재교미한 야생형 수컷과 처음 교미하였고; OX3647Q: χ2 1 = 0, n = 40, P = 1, 12 마리의 암컷이 재교미한 OX3647Q과 처음 교미하였고 12 마리의 암컷이 재교미한 야생형 수컷과 처음 교미함). RIDL 수컷과 처음 교배했을 때 재교미한 암컷의 경우, 두 번째 수컷의 유전자형은 재교미 빈도에 영향을 미치지 않았다(OX3864A: χ2 1 = 0.58, P = 0.4 (OX3864A와 처음 교배하고 이후 야생형과 재교미한 암컷 n = 3, OX3864A와 재교미한 암컷 n = 4; 야생형과 처음 교미하고 이후 야생형과 재교미한 암컷 n = 5, OX3864A와 재교미한 암컷 n = 3); OX3647Q: χ2 1 = 0.17, P = 0.5 (OX3647Q와 처음 교미하고 이후 야생형과 재교미한 암컷 n = 6, OX3647Q와 재교미한 암컷 n = 6, 야생형과 처음 교미하고 이후 야생형과 재교미한 암컷 n = 7, OX3647Q와 재교미한 암컷 n = 5)).
메드플라이 균주는 모두 tsl Vienna 8 균주 및 야생형 TOLIMAN 균주와 비교하여 우수한 사육 및 교미 특성을 나타냈지만, OX3864A 균주는 OX3647Q 균주보다 성능이 우수하였고, 따라서 메드플라이 제품 균주로 선정되었다.
실시예 2: OX3864A 균주의 분자 특성
이벤트 OX3864A 의 특정 동정을 위한 PCR -기반 분석
OX3864A 균주에 대한 품질 관리를 수행하고 현장 사용을 모니터링을 위해, 이벤트-특이적, PCR-기반 뉴클레오티드 검출 분석법을 개발하였다. 이러한 분석을 위한 프로토콜을 아래의 실시예 4에 나타내었고, 사용된 프라이머는 표 3에 기재하였다.
TG1-3864AttpflR - 플랭킹 게놈 프라이머 5'- GCTGCCCATTGCTAAGGTTTGTG - 3' (서열번호 4)
TG1-AttPF2 - 전이유전자 특이적 프라이머 5’ - GTCATGTCGGCGACCCTACGC - 3’ (서열번호 5)
TG2-3864FRTFlF - 플랭킹 게놈 프라이머 5’ - CAACGAGTGACAGCAATGATATTCCTTAC- 3’ (서열번호 6)
TG2-FRTNheF - 전이유전자 특이적 프라이머 5’ - GGTGTGGCTAGCTCGAAGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCC- 3’ (서열번호 7)
CcAdh2RTF - Cca Adh 프라이머 5’ - GAAAGCTGTTCGGGCTTCAGGC - 3’ (서열번호 8)
CcAdh2RTR - Cca Adh 프라이머 5’- CTTGGAGGTGATGTCGAATTTGGTG-3’ (서열번호 9)
각각의 전이유전자 검출 프라이머 쌍은 전이유전자 내에서 어닐링하는 하나의 프라이머 및 OX3864의 플랭킹 게놈 DNA에서 어닐링하는 하나의 프라이머를 포함한다. 따라서, 전이유전자가 OX3864에 대해 기술한 게놈 위치에 통합될 때만 적절한 크기의 밴드를 증폭할 것이다. 프라이머 쌍 TG1 및 TG2는 전이유전자의 대향 말단에서 플랭킹 DNA를 표적으로 한다. 내인성 Adh 유전자의 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 양성 대조군으로 사용하여 이 분석에 사용된 게놈 DNA의 품질을 보증하였다.
PCR기반 분석 결과는 도 5에 도시되어 있다. OX3864 샘플은 TG1 및 TG2에 대해 각각 예상 591bp 및 523bp 밴드를 나타내었지만, 야생형 및 물 샘플은 음성이었다. 모든 게놈 DNA 샘플은 Adh 프라이머가 있는 예상 491bp 산물을 나타냈으며, 게놈 DNA가 PCR 증폭에 충분한 품질인 것을 나타냈다.
통합된 전이유전자와 플랭킹 서열의 접합부를 특이적으로 검출하기 위한 TAQMAN 분석법
이 분석법은 통합 전이유전자와 세라티티스 카피타타 gDNA의 접합부에서의 서열을 검출하기 위해 개발되었으며, 이 서열은 OX3864에 대한 독특한 지문을 나타낸다. 이 분석법은 3 개의 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 하나의 접합부를 검출하기 위해 개발되었다(표 4). 2 개의 프라이머는 98 bp(52 bp플랭킹 gDNA + 46 bp 전이유전자) 단편의 증폭을 가능하게 하고, 프로브인 세 번째 이중 표지된 [5' 리포터(FAM) -3' 켄처(BHQ1)] 올리고뉴클레오티드가 이에 어닐링한다. 프로브는 증폭된 PCR 산물에서 통합 및 플랭킹 DNA의 접합부를 특이적으로 연결하며, 이는 양성 출력을 위해 이러한 경계를 필요로 한다. PCR 증폭의 각각의 단계에서 Taq 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성은 어닐링된 프로브로부터 5' 형광 리포터 분자(FAM)를 방출하여, OX3864 DNA를 보유한 샘플로부터 실시간 PCR 기계에서 검출 가능한 축적 방출을 유발한다. 이 분석에 사용된 프라이머 및 프로브는 표 4에 도시되어 있다.
Cc3864FRTtaqF 플랭킹 특이적 프라이머 5’- CAGGCAATCTGCTCCATTAAC -3’ (서열번호 10)
Cc3864FRTtaqR 전이유전자 특이적 프라이머 5’- GACCTAGTCCCAAAGATTTCG-3’ (서열번호 11)
Cc3864FRTprobe OX3864-fla 프로브 5’ FAM- AGTGCTTACATTCATTTTAAGAGCACCTCAT - BHQ1-3’ (서열번호 12)
OX3864A 균주에 대한 플라스미드 백본 분석
이 균주의 게놈에서 플라스미드 백본의 존재는 piggyBac 요소에 어닐링하는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 확인되었다:
PB5out(CTCTGGACGTCATCTTCACTTACGTG)(서열번호 13) 및
PB3out(CTCGATATACAGACCGATAAAACACATGC)(서열번호 14), 이는 플라스미드 백본이 존재하는 경우 4045bp 단편을 제공한다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. 플라스미드 백본 서열의 완전한 부재는 테스트된 모든 파리 샘플에서 확인되었다.
OX3864A 균주에서 침묵 전이유전자 삽입
이 균주에서 침묵 삽입의 가능성을 PCR 분석에 의해 검사하였다. 야생형 수컷은 OX3864A 이형접합 암컷과 교배되었고 그 반대는 1:3의 비율(수컷:암컷)로 교배되었다. 차세대는 번데기로 사육되고 형광 검사를 받았다. 1000 마리의 비-형광성 개체를 -20℃로 유지하고 PCR로 분석하였다.
결과는 도 7에 도시되어 있다. 야생형 서열의 증폭을 위한 프라이머의 사용은 분석된 DNA 샘플의 품질을 보증하는 것이었다. 1 마리의 이형접합 번데기가 추가된 9 마리의 야생형 번데기의 양성 대조군이 물의 음성 대조군과 함께 포함되었다. PCR 산물은 Smart ladder(Eurogentec, 밴드 크기는 위에서 아래로: 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3kb, 2.5kb, 2kb, 1.5kb, 1kb, 800bp, 600bp, 400bp, 200bp)를 이용하여 1% 겔에서 실시하였다.
실시예 3: OX3864A 균주의 현장 테스트
지중해 지역으로부터의 야생 메드플라이와의 교미 경쟁
FAO/IAEA/USDA 지침(FAO/IAEA/USDA, 2003)에 따라 야생형 암컷 대 야생형 수컷에 대한 균주의 경쟁 교미 테스트를 수행하였다. 암컷에서 재교미에 대한 무반응을 유도하는 수컷의 능력을 테스트하기 위해, 교미한 암컷을 이들의 초기 교미 선택을 기반으로(야생형 또는 Oxitec 수컷) 40 마리의 두 그룹으로 분리한 후 다음 날 동일한 수의 야생형 및 Oxitec 수컷에 이들을 재노출시켰다. 이 과정은 3일 동안 진행되었고, 매일 9 시간 동안 각 케이지에서 교미에 대해 기록하였다. 상기한 바와 같이 교미하는 동안 교미한 쌍을 제거하였고 수컷은 형광을 검사하여 다시 유전자형을 결정했다. 야생에서 파생된 파리와의 교미 경쟁력 시험을 위해, 크레타(Crete) 주의 헤라클리온(Heraklion)의 살충제가 없는 오렌지 과수원에서 수집한 벌레 먹은 오렌지에서 번데기를 채취하였다. 야생에서 파생된 성체는 부화 직후 성별로 분리되었다. 야생에서 파생된 파리는 성적 성숙에 도달할 때까지 25℃, 50% 상대 습도(R.H.)에서 10일 내지 13일 동안 방치되었다. 실험 시작 전 최소 24 시간 동안 모든 파리는 자연광 및 온실 상태에 적응하도록 하였다. 각 실험은 일출 한 시간 후에 시작되어 최소 9 시간 동안 지속되었다. 교미 테스트는 크레타 대학의 온실 시설에서 수행하였다. OX3864A 교미 경쟁 테스트는 평가된 89 쌍에 대해 7회 반복으로 수행하였다.
OX3864A 파리의 평균 RSI 값은, 크레타로부터의 야생에서 파생된 메드플라이와 교미할 때, 0.45 ± 0.13(t-테스트: t12 = -0.9, n = 89, P = 0.38)이었으며, 이는 OX3864A와 야생에서 파생된 수컷 간의 교미 경쟁력에서 유의한 차이의 증거가 없었다
안정적인 야생형 개체군의 케이지 억제
4 개의 대형 필드 케이지에 야생형 메드플라이의 안정적인 개체군을 수립하였고, 2 개의 케이지는, 케이지에 추가된 정상 수의 번데기 외에도, 주당 대략 1500 마리의 RIDL 수컷이 방사된 “처리군” 케이지로서 무작위로 선택하였다. 이 프로토콜은 Wise de Valdez 등의 프로토콜을 기반으로 하였다. 온실 기반의 필드 케이지는 각각 8 m3이었고 1.5 m 높이의 레몬 나무를 포함하였으며, 자연광 및 안정적인 온도와 습도(25℃, 50% R.H.)를 이용하여 헤라클리온의 크레타 대학교에 수용되었다. 케이지는 3 개의 먹이 및 물 공급원 및, 각각 2 개의 40 cm2의 산란 표면을 갖는, 탈이온수로 채워진(매일 비워짐) 2 개의 산란 포트를 포함하였다.
고정된 수의 번데기를 매주 각각의 케이지에 도입하여 8 주 동안 야생형 개체군을 수립하였다(1 주 200 마리, 2 주 300 마리, 3 주 180 마리, 이후 4 내지 8 주 230 마리). 처음 4 주 동안의 번데기 추가는 야생형 스톡 군집에서 유래하였고; 이후의 모든 번데기 추가는 산란 포트에 포집된 알에서 나온 것이었으며, 번데기로서 필드 케이지에 재도입되기 전에 저밀도(0.5 g 배지당 1 마리의 애벌레)로 실험실에서 사육되었다. 산란 포트에서 알의 수는 매일 계수한 반면, 성체의 수는 매주 계산하였다.
7 주째, 케이지를 무작위로 처리군 또는 대조군으로 나누었다. 8 주부터 RIDL 처리군 케이지는 오프-테트로 사육된 1700 마리의 OX3864A 번데기를 매주 추가하였다(이로 인해 주당 대략 1,500 마리의 성체 수컷이 추가됨). 이는 케이지 개체군(대략 220 마리의 야생형 수컷 개체군을 갖는 케이지에 1500 마리의 수컷이 방사됨) 및 대략 15:1의 주간 모집 비율(야생형 수컷 대 OX3864A)의 추정치를 기반으로, 8 주째 1 마리의 야생형 수컷에 대해 ~7 마리의 OX3864A 수컷의 초기 비율을 나타냈다. OX3864A의 도입이 시작되면, 처리군 케이지로의 번데기의 복귀는 번데기 생산율에 비례하여 이루어졌으며, 대조군 케이지는 이 계산에 대해 안정적인 매주 번데기 복귀 계수를 제공하였다. 예를 들어, 16 주에 대조군 케이지로부터 회수된 번데기의 평균 수는 300이었다. 대조군 케이지로의 복귀는 주당 230 번으로 설정되었으므로, 모든 케이지로 복귀하는 번데기 수는 발육한 모든 번데기를 제외하고 (230/300 = 0.76)의 계수로 설정된다. 예를 들어, 같은 주에 하나의 처리군 케이지는 총 126 마리의 번데기를 생산하였다. 이 케이지로 복귀한 번데기의 수는(계수를 사용하여) 따라서 96(126 × 0.76)이었다. 이 방법은 알 생산 및 번데기 생존에 의존하는 활발한 번데기 복귀를 제공하였으며, 산란 수 및 암컷 애벌레 생존에 대한 RIDL의 작용을 반영한다. 결과는 도 8에 도시되어 있다.
대조군 케이지에서 지속적으로 안정한 알 생산율과 비교하여, 주간 알 생산율의 급격한 감소는 처리군 케이지에서 RIDL 방사 이후(PR) 7 주까지 관찰되었으며, 처리군 케이지(알 생산이 없는 2 주까지 평가됨) 모두에서 야생형 개체군의 최종 멸종까지 22 주 동안 계속되었다(도 8A). 이는 OX3864A 전이유전자를 보유한 반환 자손의 비율이 처리군 케이지에서 증가하여 암컷 개체군이 급격히 감소했기 때문이다(도 8B). 처리군 케이지 개체군의 전이유전자 빈도를 DsRed2 형광 마커의 존재에 대해 복귀 번데기(무작위로 생산 모든 번데기에서 선택됨)를 조사하여 모니터링하였다. 처리군 케이지의 복귀 자손에서의 전이유전자의 빈도는 8 주 PR에 의해 100%이었고(도 8C), 두 케이지 모두는 14 주 PR에 의해 멸종된 것으로 간주되었다(멸종은 2 주 연속 무산란으로 정의됨).
실시예 4: OX3864 전이유전자의 검출 프로토콜
이 분석은 다양한 OX3864 곤충 샘플(현장, 대량 사육 및 실험실)에서 OX3864 전이유전자의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되었다. 동일한 프로토콜을 사용하여 시간이 지남에 따라 OX3864 전이유전자의 안정성의 증거를 제공할 수도 있다. 시간 경과에 따른 OX3864 전이유전자의 성공적인 증폭은, 하나의 프라이머가 전이유전자를 어닐링하고, 다른 하나는 플랭킹 게놈 서열을 어닐링하므로, 안정성의 증거를 제공하고, 따라서 전이유전자의 동원은 음성 PCR을 초래한다.
a. 재료
Purelink 게놈 추출 키트(Invitrogen에서 제공)
BioTaq DNA 중합효소(PCR Biosystems)
프라이머- 섹션 C에 기술됨(Life Technologies에서 합성)
10x 소혈청알부민(BSA, New England Biolabs)
Smart Ladder 200bp-10kb(Eurogentec)
Milli-Q 탈이온 순수
아가로스(Web Scientific)
트리스-아세테이트-EDTA 용액(10x TAE)
브롬화에티듐(Ethidium Bromide)
6x 겔 로딩 용액(30% 글리세롤, 0.25% 브로모페놀 블루 함유)
b. 장비
Biometra Thermocyclers(T3000)
길슨 피펫,
피펫 팁,
96-웰 마이크로-티터 플레이트 또는 0.2ml PCR 튜브, 접착 플레이트 리드 도는 8 웰 스트립 리드,
2 ml 미세 원심분리기 튜브,
겔 전기영동 탱크, 전원함, 캐스트 및 콤.
자외선(UV) 시각화 시스템.
c. 방법
i. 게놈 DNA 추출
게놈 DNA는 Invitrogen Purelink 게놈 추출 키트를 사용하여 아래의 프로토콜(TD/SOP/00142에서도 발견됨)에 따라 개별 곤충으로부터 분리하였다.
1. 각 라벨의 지침에 따라 PureLink™ 게놈 세척 완충액 1 및 PureLink™ 게놈 세척 완충액 2에 96-100% 에탄올을 첨가한다. 잘 혼합한다. 에탄올이 첨가된 라벨을 표시한다. 실온에서 에탄올에 두 세척 완충액을 보관한다.
2. 수조 또는 열 블록을 55℃로 설정한다.
3. 180 μl PureLink™ 게놈 Genomic 절단 완충액 및 20 μl 단백분해효소 K를 각 복부 풀에 첨가한다. 곤충 샘플을 멸균 페슬(sterile pestle)로 분해한다. 사용 후, 세척 및 고압 살균 이전에 페슬을 적어도 24 시간 동안 Virkon 비이커에 넣는다. 조직이 완충액 혼합물에 완전히 침지되었는지 확인한다.
4. 용해가 완료될 때까지 가끔씩 와동(vortexing)시키면서 55℃에서 배양한다(1 내지 4 시간). 밤새 절단을 수행할 수 있다.
5. 미립자 물질을 제거하기 위해, 용해물을 상온에서 3 분 동안 최대 속도로 원심 분리한다. 상층액을 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮긴다.
6. 용해물에 20 μl RNase A를 첨가하고 잠시 와동시켜 잘 혼합하고, 2 분 동안 실온에서 배양한다.
7. 200 μl PureLink ™ 게놈 용해/결합 완충액을 첨가하고 와동시켜 잘 혼합하여 균질한 용액을 만든다.
8. 용해물에 200 μl 96-100% 에탄올을 첨가한다. 와동시켜 잘 혼합하여 균질한 용액을 만든다. 용해/결합 완충액 및 100% 에탄올을 첨가하기 전에 혼합시킬 수 있다.
9. 키트로부터 수집 튜브에서 PureLink™ 스핀 컬럼을 제거한다. PureLink™ 게놈 용해/결합 완충액 및 에탄올로 제조한 용해물(~ 640 μl)을 스핀 컬럼에 첨가한다.
10. 컬럼을 상온에서 1 분 동안 10,000 × g로 원심 분리한다. 수집 튜브를 폐기하고, 키트와 함께 제공된 깨끗한 PureLink™ 수집 튜브에 스핀 컬럼을 넣는다.
11. 에탄올로 제조한 500 μl 세척 완충액 1을 컬럼에 첨가한다. 컬럼을 상온에서 1 분 동안 10,000 × g로 Xg에서 원심 분리한다. 수집 튜브를 폐기하고, 키트와 함께 제공된 깨끗한 PureLink™ 수집 튜브에 스핀 컬럼을 넣는다.
12. 에탄올로 제조한 500 μl 세척 완충액 2를 컬럼에 첨가한다. 컬럼을 상온에서 3 분 동안 최대 속도로 원심 분리한다. 통과액을 폐기하고, 10,000 × g에서 1 분 동안 다시 회전시킨다.
13. 스핀 컬럼을 멸균 1.5-ml 미세 원심 분리 튜브에 넣는다. 100 μl의 PureLink™ 게놈 용출 완충액을 컬럼에 첨가한다.
14. 1 분 동안 실온에서 배양한다. 컬럼을 상온에서 1 분 동안 최대 속도로 원심 분리한다.
16. 컬럼을 제거하고 폐기한다. 원하는 하류 응용을 위해 DNA를 사용하거나 4℃(단기) 또는 -20℃(장기)에서 정제된 DNA를 보관한다.
17. 실험 장부에 모든 세부 사항을 기록한다.
ii. PCT 프로토콜
프라이머는 Oxitec 카탈로그에 나온다: 숫자는 Oxitec 내부 프라이머 카탈로그를 참조하며 Life Technologies에 의해 현장에서 합성된다
전이유전자 특이적 및 Actin 4 내인성 유전자 서열을 PCR BIO 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 다음과 같이 증폭시켰다:
OX3864 전이유전자 프라이머:
1087)FRTNheF(GGTGTGGCTAGCTCGAAGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCC; 서열번호 7) 및 1272) 3864FRTF1F(CAACGAGTGACAGCAATGATATTCCTTAC; 서열번호 6)는 532bp의 산물을 생성한다. FRTnheF는 전이유전자를 어닐링하는 반면, 3864FRTFlF는 전이유전자를 플랭킹하는 게놈 서열을 어닐링한다. 이 프라이머 세트는 OX3864 형질 전이유전자를 포함하는 샘플만을 증폭한다.
Adh 대조군 프라이머:
세라티티스 카피타타 게놈 DNA의 증폭을 확인하기 위해 프라이머 세트를 내부 대조군으로 포함하였다. 프라이머는 491bp 산물을 생성하는 1131)CcAdh2RTF(GAAAGCTGTTCGGGCTTCAGGC; 서열번호 8) 및 1132)CcAdh2RTR(CTTGGAGGTGATGTCGAATTTGGTG; 서열번호 9)이다.
아래에 나타난 순서대로, 미세 원심 분리 튜브에 다음의 성분을 첨가하여 PCR 마스터 믹스를 제조하였다(피펫 오류를 보상하기 위해 샘플 및 1 내지 5 추가분의 수에 대해 충분):
x (n+1)
H2O 12.3 μl
Biotaq 완충액 4 μl
10xBSA 0.5 μl
프라이머1087 또는 1131 0.5μl
프라이머 1272 또는 1132 0.5μl
Biotaq 중합효소 0.2 μl
18 μl 마스터 믹스를 96 웰 플레이트의 각각의 PCR 튜브 또는 웰로 피펫팅하였다.
2 μl gDNA 템플릿을 첨가하였다.
템플릿은 OX3864 동형접합 gDNA 샘플의 공지된 양성 대조군(대량 사육 스톡으로부터 또는 이전에 양성으로 보임), 야생형 gDNA 샘플의 음성 대조군 및 milli-Q 음성 대조군을 포함한다.
PCR은 다음 프로그램을 사용하여 Biometra T3000 thermocycler상에서 수행하였다:
1. 94℃ 2 분
2. 94℃ 15 초
3. 60℃ 30 초(각 사이클마다 0.5℃씩 온도 감소)
4. 72℃ 15 초 단계 2 x 10 사이클로 이동
5. 94℃ 15 초
6. 55℃ 30 초
7. 72℃ 15 초 단계 5 x 25 사이클로 이동
8. 72℃ 7 분
9. 4℃ 유지.
8 μl의 PCR 산물을 1.5 μl 겔 로딩 완충액(0.25 % 브로모페놀 블루를 포함하는 30% 글리세롤)과 혼합하고, 시각화를 위해 25 분 동안 120 V에서 1 % 아가로스 겔(아래 참조)에서 수행하였다. Eurogentec Smart Ladder를 젤의 각각의 단부에 로딩하였다. Uvitec 겔 시각화 시스템을 사용하여 젤을 시각화하고 촬영하였다.
iii. 아가로스 겔 제조
1 g 아가로스를 100 ml 1 x TAE 완충액과 혼합하고, 약 2 분 동안 마이크로웨이브로 용해시키고, 30 초 동안 차가운 흐르는 물에서 냉각시키고, 1.5 μl의 1%에 브롬화에티듐을 첨가한 후, 캐스트에 부어 놓았다.
참조문헌
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Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu 180 185 190 Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Pro Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile 210 215 220 Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly 225 230 235 240 Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg 245 250 255 Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His 260 265 270 Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp 275 280 285 Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe 290 295 300 Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe 305 310 315 320 Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly 325 330 335 Gly <210> 30 <211> 313 <212> DNA <213> Ceratitis capitata <400> 30 ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc 60 tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga 120 gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac 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Claims (43)

  1. 제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서,
    i) 제 1 유전자 발현 시스템은 다음 성분을 포함하고; 제 1 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 1 우성 치사 유전자, 제 1 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자, 및 제 1 스플라이스 제어 서열,
    ii) 제 2 유전자 발현 시스템은 다음 성분을 포함하고; 제 2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 2 우성 치사 유전자, 제 2 활성화 전사 인자를 코딩하는 유전자, 및 제 2 스플라이스 제어 서열을 포함하고,
    상기 활성화 전사 인자 각각은, 상기 전사 인자 둘 모두가 발현될 때 상기 프로모터 둘 모두가 활성화되는 경우, 상기 프로모터 중 적어도 하나를 활성화시킬 수 있고,
    제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 각각은 대체 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 각각 제 1 및 제 2 우성 치사 유전자의 암컷-특이적 발현을 매개하고,
    제 1 및 제 2 활성화 전사 인자 각각의 전사활성화(transactivation) 활성은 각각 제 1 및 제 2 외인성 조절 인자에 의해 억제될 수 있고, 상기 제 1 외인성 제어 인자는 상기 제 2 외인성 제어 인자와 동일하거나 상이하고, 및
    상기 제 1 유전자 발현 시스템의 상기 성분 각각은 상기 제 2 유전자 발현 시스템의 상기 성분과 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 전사활성화 인자가 또한 상기 우성 치사 유전자에 의해 부여하는 치사 효과를 제공하도록, 제 1 활성화 전사 인자는 제 1 우성 치사 유전자의 유전자 산물이고 및/또는 제 2 활성화 전사 인자는 제 2 우성 치사 유전자의 유전자 산물인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는, 기능성 단백질을 코딩하는 mRNA 및 비기능성 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 mRNA를 생성하기 위해, 스플라이소좀(spliceosome)과 함께, 각각의 우성 치사 유전자의 RNA 전사체의 스플라이싱을 매개함으로써 각각의 우성 치사 유전자의 암컷-특이적 발현을 매개하고, 비기능성 단백질을 코딩하는 mRNA는 암컷에서 생성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 프로모터 각각은 상기 프로모터를 활성화시킬 수 있는 활성화 전사 인자의 부재 하에 실질적으로 비활성인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 치사 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 tTA 또는 tTAV 유전자 변이체, 바람직하게는 tTAV 유전자 변이체인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  6. 제 5 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 치사 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 tTAV(서열번호 26), tTAV2(서열번호 27) 및 tTAV3(서열번호 28) 중 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는 독립적으로 tra 인트론, dsx 유전자 또는 Actin -4 유전자에서 유래하고, 바람직하게는 tra 인트론에서 유래하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는 Tephritid에서 유래하고, 바람직하게는 세라티티스(Ceratitis) 속, 박트로세라(Bactrocera) 속, 아나스트레파(Anastrepha) 속 및 라골레티스(Rhagoletis) 속 중 하나에서 유래하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  9. 제 8 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는 세라티티스 카피타타(Ceratitis capitata)에서 유래하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  10. 제 8 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 스플라이스 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는 세라티티스 카피타타에서 유래하고, 다른 하나의 스플라이스 제어 서열은 상이한 종에서 유래하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 중 하나 또는 둘 모두는 각각의 프로모터에 결합된 인핸서(enhancer)를 포함하고, 적어도 하나의 활성화 전사 인자는 각각의 인핸서에 작용하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  12. 제 11 항에 있어서,
    인핸서, 또는 인핸서 중 하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 tetO의 반복을 포함하는 tetO 요소인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 또는 각각의 인핸서는 독립적으로 tetOx7 , tetOx14 또는 tetOx21인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 프로모터 중 하나 또는 둘 모두는 적어도 배아 발육 단계 동안 발현되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 프로모터 중 하나 또는 둘 모두는 최소 프로모터인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 프로모터 각각은 독립적으로 Hsp70 또는 sryα이고, 바람직하게 하나는 Hsp70이고 다른 하나는 sryα인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 및 제 2 유전자 발현 시스템 중 하나는 제 3 우성 치사 유전자 및 제 3 우성 유전자에 작동 가능하게 연결되는 제 3 프로모터를 포함하고, 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터를 활성화시킬 수 있는 활성화 전사 인자는 또한 제 3 프로모터를 활성화시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  18. 제 17 항에 있어서, 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 종속할 때,
    상기 유전자 발현 시스템은 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터에 결합된 인핸서를 더 포함하고, 제 3 프로모터는 또한 상기 인핸서와 결합되며, 바람직하게 상기 유전자 발현 시스템의 프로모터는 상기 인핸서의 일단에 결합되고 제 3 프로모터는 상기 인핸서의 타단에 결합되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    제 3 우성 치사 유전자는 VP16이고, 제 3 프로모터는 Hsp70 또는 sry α인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 마커를 더 포함하고, 바람직하게 유전자 마커는 형광 마커이고, 더욱 바람직하게 유전자 마커는 DsRed2인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 우성 치사 유전자는 tTAV(서열번호 26)이고, 제 1 활성화 전사 인자는 tTAV 유전자 산물이고, 제 1 프로모터는 Hsp70이고, 제 1 스플라이스 제어 서열은 Cctra이고,
    제 2 우성 치사 유전자는 tTAV3(서열번호 28)이고, 제 2 활성화 전사 인자는 tTAV3 유전자 산물이고, 제 2 프로모터는 sry α이며, 제 2 스플라이스 제어 서열은 Bztra이고,
    제 1 유전자 발현 시스템은 제 1 프로모터에 결합된 제 1 인핸서를 더 포함하고, 제 1 인핸서는 tetOx7이고,
    제 2 유전자 발현 시스템은 제 2 프로모터에 결합된 제 2 인핸서를 더 포함하고, 제 2 인핸서는 tetOx14이고,
    폴리뉴클레오티드 서열은 제 3 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 제 3 우성 치사 유전자를 더 포함하고, 제 3 프로모터는 제 2 인핸서에 결합되고, 제 3 우성 치사 유전자는 VP16이고 제 3 프로모터는 Hsp70이고, 제 2 프로모터는 제 2 인핸서의 일단에 결합되고 제 3 프로모터는 제 2 인핸서의 타단에 결합되며,
    폴리뉴클레오티드 서열은 DsRed2인 제 1 유전자 마커를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 절지동물을 형질전환시키기 위한 유전자 구조물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    유전자 구조물은 적어도 두 쌍의 대향하는 트랜스포존 역 반복(inverted repeat)을 형성하는 적어도 4 개의 트랜스포존 역 반복을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 두 쌍의 대향하는 트랜스포존 역 반복 사이에 위치함으로써, 상기 쌍의 전이효소(transposase)의 또는 전이효소들에 의한 절제(excision)가 호스트 게놈에서 트랜스포존 역 반복을 플랭킹(flanking)하지 않고, 계내에서(in situ), 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 호스트 게놈 내에 통합되게 하는데 효과적인 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 트랜스포존 역 반복 각각은 최소 말단 역 반복이고, 바람직하게 트랜스포존 역 반복은 클래스 II 전이 인자(Class II transposable elements), 더욱 바람직하게는 piggyBac인 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    4 개의 트랜스포존 역 반복을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    4 개의 트랜스포존 역 반복은 제 1 및 제 2 쌍의 대향하는 역 반복을 형성하고,
    4 개의 트랜스포존 역 반복은 piggyBac 역 반복이고,
    제 1 쌍은 폴리뉴클레오티드 서열 근위의 내부 3' piggyBac 말단 및 폴리뉴클레오티드 서열 원위의 외부 5' piggyBac 말단으로 구성되고, 및
    제 2 쌍은 폴리뉴클레오티드 서열 근위의 내부 5' piggyBac 말단 및 폴리뉴클레오티드 서열 원위의 외부 3' piggyBac 말단으로 구성되고,
    바람직하게, 내부 3' piggyBac 말단은 서열번호 32로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되고,
    외부 5' piggyBac 말단은 서열번호 30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되고,
    내부 5' piggyBac 말단은 서열번호 30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되고,
    외부 3' piggyBac 말단은 서열번호 31로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  28. 제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 한 쌍의 대향하는 트랜스포존 역 반복의 트랜스포존 역 반복 사이에 적어도 하나의 유전자 마크를 포함하고, 바람직하게 적어도 두 쌍의 대향하는 반복 각각의 역 반복 사이에 적어도 하나의 유전자 마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  29. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기술된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 절지동물.
  30. 제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 기술된 유전자 구조물을 포함하는 절지동물.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    절지동물은 과실파리과(Tephritidae), 초파리과(Drosophilidae), 깜장파리과(Lonchaeidae), 날개무늬파리과(Pallopteridae), 알락파리과(Platystomatidae), 파이로고티다에(Pyrogotidae), 라차디이다에(Richardiidae) 또는 울리디이다에(Ulidiidae)이고, 바람직하게는 과실파리과인 것을 특징으로 하는 절지동물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    절지동물은 세라티티스 속이고, 바람직하게는 세라티티스 카피타타인 것을 특징으로 하는 절지동물.
  33. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    절지동물은 서열번호 2 또는 서열번호 3, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 절지동물.
  34. 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기술된 절지동물을 검출하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은,
    i) 곤충에서 분리된 DNA 샘플을 형질전환된 곤충에 특이적인 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계, 상기 쌍의 제 1 프라이머는 곤충 유전자 구조물의 뉴클레오티드 서열에 특이적이고, 상기 쌍의 제 2 프라이머는 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 게놈 뉴클레오티드 서열에 특이적이고,
    ii) DNA 샘플을 증폭시키는 단계; 및
    iii) 증폭된 DNA를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 제 33 항에 종속할 때,
    제 1 프라이머는 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오티드를 갖고, 제 2 프라이머는 서열번호 7로 표시되는 뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34 항에 있어서, 제 33 항에 종속할 때,
    제 1 프라이머는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드를 갖고, 제 2 프라이머는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 34 항에 있어서, 제 33 항에 종속할 때,
    제 1 프라이머는 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오티드를 갖고, 제 2 프라이머는 서열번호 11로 표시되는 뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    단계 i)은 PCR 증폭 산물의 검출을 위해 DNA 샘플을 단계 ii)에서 생성된 PCR 증폭 산물에 특이적인 프로브와 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 바람직하게 프로브는 리포터 분자(reporter molecule) 및 켄처 분자(quencher molecule)를 포함하며, 상기 프로브가 상기 PCR 증폭 산물에 어닐링될 때, 리포터 분자는 PCR 증폭 동안 Taq 중합효소에 의해 프로브로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    프로브는 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 10 또는 서열번호 11 중 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제 34 항에 기술된 방법에서 사용하기 위한 프라이머.
  41. 서열번호 10 또는 서열번호 11로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제 38 항에 기술된 방법에서 사용하기 위한 프라이머.
  42. 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제 38 항 또는 제 39 항에 기술된 방법에서 사용하기 위한 프라이머.
  43. 절지동물 개체군을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제 29 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 기술된 절지동물을 방사하는 단계를 포함하고, 절지동물은 세라티티스 카피타타인 것을 특징으로 하는 방법.
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