JP4271122B2 - カイコでの組換えタンパク質製造のためのポリヌクレオチド - Google Patents
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Description
(1) カイコ中部絹糸腺において組換えタンパク質を発現させるための発現カセットにおいて組換えタンパク質構造遺伝子と機能的に連結されるポリヌクレオチドであって、セリシン1またはセリシン2遺伝子のプロモーター領域を構成するポリヌクレオチドと、バキュロウイルスhomologous regionsを構成するポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチド。
(2) セリシン2遺伝子のプロモーター領域を構成するポリヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド配列またはその一部である前記発明(1)のポリヌクレオチド。
(3) カイコ中部絹糸腺において組換えタンパク質を発現させるための発現カセットであって、前記発明(1)または(2)のポリヌクレオチドと組換えタンパク質構造遺伝子とが連結された発現カセット。
(4) 前記発明(1)または(2)のポリヌクレオチドが有する転写活性を促進するポリヌクレオチドであって、セリシン1またはセリシン2遺伝子のプロモーター領域を構成するポリヌクレオチドと、バキュロウイルスIE1タンパク質をコードするポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチド。
(5) セリシン2遺伝子のプリモーター領域を構成するポリヌクレオチドが、配列番号1のヌクレオチド配列またはその一部である前記発明(4)のポリヌクレオチド。
(6) 前記発明(4)または(5)のポリヌクレオチドに、さらにバキュロウイルスhomologous regionsを構成するポリヌクレオチドを連結したポリヌクレオチド。
(7) 前記発明(3)の発現カセットを保有する発現ベクター。
(8) 発現カセットが、昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれている前記発明(7)の発現ベクター。
(9) 前記発明(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドを保有するベクター。
(10) ポリヌクレオチドが昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれている前記発明(9)のベクター。
(11) 前記発明(3)の発現カセットと、前記発明(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドを保有するベクター。
(12) 発現カセットとポリヌクレオチドが昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれている前記発明(11)のベクター。
(13) 前記発明(3)の発現カセットをゲノム中に保有し、組換えタンパク質を中部絹糸腺にて発現するトランスジェニックカイコ。
(14) 前記発明(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドをゲノム中に保有し、バキュロウイルスIE1タンパク質を中部絹糸腺にて発現するトランスジェニックカイコ。
(15) 前記発明(3)の発現カセットと、前記発明(4)、(5)または(6)のポリヌクレオチドをゲノム中に保有し、組換えタンパク質を中部絹糸腺にて発現するトランスジェニックカイコ。
(16) 前記発明(13)のトランスジェニックカイコの繭から、組換えタンパク質を抽出することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
(17) 前記発明(15)のトランスジェニックカイコの繭から、組換えタンパク質を抽出することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
(18) セリシン2遺伝子のプロモーター領域を構成するポリヌクレオチドであって、配列番号1のヌクレオチド配列またはその一部配列からなるポリヌクレオチド。
以下の3種類のベクターを作製し、BmNPV のhrsの一つであるhr3とBmNPVのIE1によるカイコセリシン1プロモーターの転写活性促進効果を、 遺伝子銃を用いた一過性遺伝子発現系を利用して調べた。
[1]セリシン1プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター
カイコセリシン1遺伝子の転写開始点を+1とした場合の-304〜+20の領域に対応するDNA断片を、カイコ成体腹部より抽出したゲノムDNAをテンプレートとしたPCRによって取得した。用いたプライマーは、5'-GCTAGCAGTCGAATTTCGACTACTGCG-3'(配列番号2)と5'-GCTAGCCCCGATGATAAGACGACTATG-3'(配列番号3)であり、それぞれの5'末端にNheIサイトが付加されている。得られたPCR産物をNheIで切断した後、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターpGL3-basic(Promega)のNheIサイトに挿入した。
[2]hr3とセリシン1プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター
BmNPVのhr3(塩基番号64321〜66017 : GeneBankデータベース登録番号NC_001962)を含むDNA断片を、pXINSECT-DEST38(Invitrogen)をテンプレートにしたPCRによって取得した。用いたプライマーは、5'-CGGAATCTATGTTACGGACTTC-3'(配列番号4)と5'-GAGCTCGATATCGAATTCCTGCAGCC-3'(配列番号5:5'末端にSacIサイトが付加されている)である。得られたPCR産物をSacIで切断した後、上記1)のセリシン1プロモーターを有するpGL3のセリシンプロモーターの上流にあるSacIサイトに挿入した。挿入したDNA断片の向きは、hr3の5'末端(塩基番号64321)側が、セリシン1プロモーター側になるようにした。
[3]hr3とセリシン1プロモーターの下流にIE1のORFを有するベクター
BmNPVのIE1のORF(塩基番号116981〜119482 : GeneBankデータベース登録番号NC_001962)を、pXINSECT-DEST38をテンプレートにしたPCRによって取得した。用いたプライマーは、5'-GGATCCCAACCAAACGACTATGACGC-3'(1配列番号6:5'末端にBamHIサイトが付加されている)と5'-CAGGAGTGGGCATACTCTTG-3'(配列番号7)である。得られたPCR産物を、pCR4Blunt-TOPOベクター(Invitrogen)に挿入した。次に、セリシン1プロモーターを、PCRによって、[1]のセリシン1プロモーターを有するpGL3ベクターから増幅した。用いたプライマーは、5'-GGATCCGAGCTCAGTCGAATTTCGACTACTGCG-3'(配列番号8:5'末端にBamHIサイトとSacIサイトが付加されている)と、5'-GGATCCGCTAGCCCCGATGATAAGACGACTATG-3'(配列番号9:5'末端にBamHIサイトが付加されている)である。PCR産物をBamHIで消化し、上記のIE1ORFを有したpCR4Blunt-TOPOベクターの、IE1ORFの5'末端側に存在するBamHIサイトに挿入した。最後に、[2]のhr3とセリシン1プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターをSacIで消化することにより、このベクターからhr3を切り出し、上記のセリシン1プロモーターとIE1ORFを有するベクターの、セリシン1プロモーターの5'末端側に存在するSacIサイトに挿入した。挿入した向きは、hr3の3'末端(塩基番号66017 : GeneBankデータベース登録番号NC_001962)側が、セリシン1プロモーター側になるようにした。
1) 金粒子の調製:金粒子1 mgあたり188 ngのDNA混合液を付着させた。
2) 絹糸腺採取:5令1日の幼虫から絹糸腺を取出し、Grace培地で洗浄した。
3) 遺伝子銃によるDNAの絹糸腺への導入:遺伝子銃(Helios Gene Gun; BioRad)を用いて絹糸腺にDNAの付着した金粒子を打ち込んだ。絹糸腺あたり0.02 mgの金粒子(3.8 ng DNA)を打ち込んでいる。
4) 絹糸腺の移植:絹糸腺をGrace培地で洗浄後、絹糸腺を取出した個体と同じ日令の幼虫の背側後方体腔内に移植した。絹糸腺を移植した幼虫を3日間飼育した。
5) 絹糸腺の採取:移植した絹糸腺を宿主から取出し、Grace培地で洗浄後、絹糸腺を中部絹糸腺と後部絹糸腺に分割した。
6) ルシフェラーゼ活性の測定:中部絹糸腺および後部絹糸腺をpassive lysis buffer(Promega)中でホモジナイズした後遠心し、上清中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ定量システム(Promega)を用いて測定した。
5'末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチド5'-AATTCCTTAAGCTCGAGTCGCGA-3'(配列番号10)と5'-AATTTCGCGACTCGAGCTTAAGG-3'(配列番号11)をアニーリングさせた2本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。この2本鎖オリゴヌクレオチドは、AflII、XhoI、NruIの制限酵素認識配列を有し、両末端はEcoRIサイトに連結可能な構造をしている。マーカー遺伝子として眼や神経系で発現する赤色蛍光タンパク質(DsRed)遺伝子を有するpiggyBacベクターであるpBac[3xP3-DsRed/pA](Nat. Biotechnol. 21, 52-56 (2003))のEcoRIサイトに、この2本鎖オリゴヌクレオチドを挿入し、pBac[3xP3-DsRed/pA]ベクターにAflII、XhoI、NruIの制限酵素認識配列を挿入した。
ヒトカルレティキュリンのシグナルペプチドをコードする配列を含むプライマー(5'-CACCATGGTGCTATCCGTGCCGTTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGCCGTCGCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3':配列番号16)およびEGFPの終止コドンを含むプライマー(5'-TTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3':配列番号17)を用い、pEGFP(Clontech)をテンプレートにしたPCRによって、ヒトカルレティキュリンのシグナルペプチドをコードする配列を5'末端に付加したEGFPのcDNAを作製した。得られたcDNA断片をpENTRベクター(Invitrogen)に組み込み、さらにGatewayシステムを利用してpMSG2に挿入し、分泌型EGFPを発現するベクター(pSEM2)を構築した。
カイコセリシン2遺伝子の5'上流域配列については、転写開始点を+1とした場合の塩基番号-80〜+60までの配列のみが報告されており(Gene 86, 177-184, 1990)、この配列のさらに上流域の配列は未だ知られていない。そこで、セリシン2遺伝子の配列が決定されていない5'上流領域を、非対称PCRによってカイコゲノムDNAより増幅し、配列決定を行った。非対称PCR法とは、既知の配列に対してはその配列に特異的なプライマーをアニーリングさせ、未知の配列に対してはdegenerate randomプライマーをアニーリングさせてPCRを行なうことにより、既知配列に隣接する未知配列を取得する手法である。目的としない配列の増幅を防ぐために、既知配列特異的プライマーをnestedプライマーにして、複数回PCRを行い、増幅産物を純化する。セリシン2遺伝子の既知の配列は、Michailleらの論文(Gene 86, 177-184, 1990)に記載されている、転写開始点の塩基を+1とした時の、塩基番号-80から塩基番号+60までの塩基配列を参考にして、配列特異的なnestedプライマーとして、GSP-A(5'-TGGGATCTTCATGATGACTCGTGTGGCTC-3':配列番号18)、GSP-B(5'-GACAGACCACCTTTATATAGCCGGTGCCAC-3':配列番号19)、GSP-C(5'-GACAGTGCACGTCGGTCAAACTGTGTCAAC-3':配列番号20)の3つのプライマーを設計した。テンプレートは、カイコ成虫の腹部から抽出したゲノムDNA 100 ngを用いた。非対称PCRの反応は、APAgene Locator Kit(Bio S&T Inc.)を使用して行なった。degenerate randomプライマー、酵素、基質等はkitに付属のものを使用し、また、反応条件は全てkit付属のプロトコルに従った。その結果、約1.5 kbのDNA断片を増幅することができた。この増幅産物を、pCR4Blunt-TOPOベクター(Invitrogen)にサブクローニングし、ジデオキシ法によって塩基配列を決定した。塩基配列を配列番号1に示す。
Claims (15)
- カイコ中部絹糸腺において組換えタンパク質を発現させるための発現カセットにおいて組換えタンパク質構造遺伝子と機能的に連結されるポリヌクレオチドであって、セリシン1遺伝子のプロモーター領域を構成するポリヌクレオチドと、バキュロウイルスhomologous regionsを構成するポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチド。
- カイコ中部絹糸腺において組換えタンパク質を発現させるための発現カセットであって、請求項1のポリヌクレオチドと組換えタンパク質構造遺伝子とが連結された発現カセット。
- 請求項1のポリヌクレオチドが有する転写活性を促進するポリヌクレオチドであって、セリシン1遺伝子のプロモーター領域を構成するポリヌクレオチドと、バキュロウイルスIE1タンパク質をコードするポリヌクレオチドが機能的に連結されたポリヌクレオチド。
- 請求項3のポリヌクレオチドに、さらにバキュロウイルスhomologous regionsを構成するポリヌクレオチドを連結したポリヌクレオチド。
- 請求項2の発現カセットを保有する発現ベクター。
- 発現カセットが、昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれている請求項5の発現ベクター。
- 請求項3または4のポリヌクレオチドを保有するベクター。
- ポリヌクレオチドが昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれている請求項7のベクター。
- 請求項2の発現カセットと、請求項3または4のポリヌクレオチドを保有するベクター。
- 発現カセットとポリヌクレオチドが昆虫由来DNA型トランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれている請求項9のベクター。
- 請求項2の発現カセットをゲノム中に保有し、組換えタンパク質を中部絹糸腺にて発現するトランスジェニックカイコ。
- 請求項3または4のポリヌクレオチドをゲノム中に保有し、バキュロウイルスIE1タンパク質を中部絹糸腺にて発現するトランスジェニックカイコ。
- 請求項2の発現カセットと、請求項3または4のポリヌクレオチドをゲノム中に保有し、組換えタンパク質を中部絹糸腺にて発現するトランスジェニックカイコ。
- 請求項11のトランスジェニックカイコの繭から、組換えタンパク質を抽出することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
- 請求項13のトランスジェニックカイコの繭から、組換えタンパク質を抽出することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
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