CN114480500B - 一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种的丝胶茧为生物反应器，通过以Ser1为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFP为目的基因，构建转基因表达载体并且获得转基因家蚕。本发明根据利用piggyBac介导的家蚕遗传改良技术，利用转基因丝胶茧作为注射受体，在家蚕中部丝腺表达外源蛋白，使外源蛋白的提取和纯化更加容易，为探索开发利用丝胶茧受体表达重组蛋白提供素材基础。

Description

一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法。

背景技术

近些年来，随着生物技术的蓬勃发展，特别是近年在家蚕基因组计划的推动下，人们对丝腺高效合成与分泌丝蛋白的分子机制有了深入了解，研究者们开始对蚕丝进行结构与功能化的改造，开发蚕丝的新用途。

2000年开始，研究人员利用piggyBac转座子介导，成功建立了家蚕转基因技术，该技术可以对家蚕以及蚕丝进行遗传改造，赋予蚕丝特定的生物学性能，使得蚕丝能够应用于更多领域。同时还发现，家蚕不仅能用于产丝织绸，其丝腺还是一个理想的生物反应器，可用于生产高附加值重组外源蛋白。

家蚕丝腺是一个天然蛋白生产工厂，能够高效的合成丝蛋白。迄今，利用转基因家蚕丝腺作为生物反应器，已经表达出了20多个重组蛋白，并且在转基因家蚕丝腺中表达的重组蛋白大都具有生物学活性，表明家蚕丝腺是生产重组蛋白的理想宿主。但是，当前的转基因丝腺表达系统存在重组蛋白表达量普遍较低的问题，难以在各个指定工业领域中得到工业化量产应用。

发明内容

基于现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，所述转基因丝胶茧生物反应器的构建方法具体涉及到两种转基因丝胶茧。

依据本发明的技术方案，提供一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种的丝胶茧为生物反应器，通过以家蚕Ser1基因(SEQ ID NO.1)为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFP为目的基因(SEQ ID NO.2)，构建转基因表达载体并且获得转基因家蚕。

进一步地，转基因丝胶茧生物反应器的构建方法包括以下步骤：

步骤S1，构建丝胶茧表达载体；

步骤S2，胚胎显微注射与荧光筛选；

步骤S3，中部丝腺特异表达载体构建；

步骤S4，再一次进行胚胎显微注射与荧光筛选；

步骤S5，通过对中部丝腺进行荧光观察和分子检测，验证重组蛋白表达成功；

步骤S6，通过对茧壳形态和茧壳蛋白的分子检测，验证重组蛋白已经成功分泌。

优选地，步骤S1进一步包括步骤S11,

构建了以家蚕fibL基因[NCBI基因ID：M76430.1](SEQ ID NO.3)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，终止信号为Ser1-polyA(SEQ ID NO.5)，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3×P3-DsRed]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。

更优选地，步骤S1进一步包括步骤步骤S12，构建了以家蚕fibH基因[NCBI基因ID：NM_001113262.1](SEQ ID NO.6)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，Ser1-polyA(SEQ ID NO.5)为终止信号，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3×P3-ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。

优选地，转基因丝胶茧生物反应器的构建方法进一步包括获得转基因表达载体后，将其与辅助质粒1:1分别以浓度450ng/μL(纳克/微升)等比例混合，通过埃普多夫(Eppendorf)显微注射仪注射，以多化性家蚕Nistari为注射受体，进行转基因注射及荧光筛选。

优选地，步骤S3中部丝腺特异表达载体构建中，家蚕Ser1基因启动子序列[NCBI基因ID：AB007831.1](SEQ ID NO.1)，将上述丝腺特异性启动子与增强子Hr3序列(SEQ IDNO.7)，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列(SEQ ID NO.2)及终止信号Ser1-poly A(SEQ IDNO.5)串联形成目的基因表达框，将通过利用FseI和SpeI将骨架载体pBac[3×P3-ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。所构建的表达载体的构建均含有启动子3×P3启动的青色荧光蛋白(ECFP)基因表达框。

此外，转基因家蚕的丝腺收集包括，饲养注射受体LYS97A和S1-EGFP(LYS97A)转基因家蚕至5龄第6天(5L6D)，通过在1×PBS的缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺(ASG)、中部丝腺(MSG)、后部丝腺(PSG)，通过1.5mL(毫升)的离心管收集中部丝腺。

进一步地，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃(度)高温灭菌2-3h(小时)。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5mL的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。

优选地，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将1mL的DNA抽提Buffer(缓冲液)加入离心管中，离心机以3000rpm(每分钟转数)涡旋混匀；按100μL/mL(微升/毫升)的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。

优选地，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min(分钟)，在温度4℃环境下离心机以13400rpm离心10min，取600μL上清液至新的离心管中。

相比较于现有技术，本发明专利的一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法具有以下有益效果：

1、本发明转基因丝胶茧生物反应器的构建方法根据利用piggyBac介导的家蚕遗传改良技术，利用转基因丝胶茧作为注射受体，在家蚕中部丝腺表达外源蛋白，并探究外源蛋白在丝胶茧中是否利于提取和分离纯化，为探索开发利用丝胶茧受体表达重组蛋白提供素材基础。

2、利用本发明转基因丝胶茧生物反应器的构建方法所获得家蚕丝胶蛋白具有良好的亲水性、生物相容性和可生物降解性，其是一种理想的组织工程生物材料。

3、本发明利用遗传操作技术赋予了蚕丝新的生物学性质后，使其在作为良好的药物缓释材料的基础上，进一步获得了需借助第三方渠道而获得的各类具有药用价值的蛋白；其对将含有高附加值外源蛋白的蚕丝转化为功能性生物材料的开发应用具有重大意义。

附图说明

图1A为家蚕后部丝腺特异性的第一表达载体示意图；

图1B为家蚕后部丝腺特异性的第二表达载体示意图；

图2为后部丝腺特异表达BmY1314S97A转基因家蚕成功制作结果图；

图3-1为后部丝腺特异表达BmY1314S97A转基因家蚕丝腺示意图；

图3-2为后部丝腺特异表达BmY1314S97A转基因家蚕茧壳观察示意图；

图4为后部丝腺特异表达BmY1314S97A转基因家蚕茧壳重量调查示意图；

图5为家蚕中部丝腺特异性的表达载体示意图；

图6为中部丝腺特异表达EGFP转基因家蚕成功制作结果图；

图7为中部丝腺特异表达绿色荧光蛋白EGFP转基因家蚕的茧壳观察；

图8为中部丝腺特异表达绿色荧光蛋白转基因家蚕的分子鉴定结果图；

图9为中部丝腺特异表达绿色荧光蛋白转基因家蚕的表达分析实时荧光定量结果图；

图10为中部丝腺特异表达绿色荧光蛋白转基因家蚕的表达分析Western Blot结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术方案的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术方案的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，不应当将本发明的保护范围仅仅限制至下述具体步骤或部件或具体参数。

本发明公开了一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种丝胶茧系统，以该丝胶茧为生物反应器，通过以家蚕Ser1基因(SEQ ID NO.1)为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFP(SEQ IDNO.2)为目的基因，构建转基因表达载体并且成功获得转基因家蚕。所选择的丝胶茧生物反应器的丝胶含量达到96.28％或其上，利用该品系在家蚕中部丝腺中表达荧光蛋白。经检测，成功在该转基因家蚕品系丝胶茧中检测到绿色荧光蛋白。

此外，本发明转基因丝胶茧生物反应器的构建方法利用piggyBac介导的家蚕遗传改良技术，利用转基因丝胶茧作为注射受体，在家蚕中部丝腺表达外源蛋白，并探究外源蛋白在丝胶茧中是否利于提取和分离纯化，为探索开发利用丝胶茧受体表达重组蛋白提供素材基础。

本发明转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其包括以下步骤：

步骤S1，丝胶茧表达载体构建，其构建2种家蚕后部丝腺特异表达表达的载体。步骤S1进一步包括以下步骤：

步骤S11，载体目的基因表达框以家蚕fibL基因为启动子[NCBI基因ID：M76430.1](SEQ ID NO.3)，目的基因为BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)的基因序列(SEQ ID NO.4)；Ser1-polyA为终止信号(SEQ ID NO.5)，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了DsRed(红色荧光蛋白)序列组成；随后在3×P3-DsRed序列(SEQ ID NO.8)5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。

步骤S12，载体目的基因表达框以家蚕fibH基因为启动子[NCBI基因ID：NM_001113262.1](SEQ ID NO.6)，目的基因BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)的基因序列(SEQ ID NO.4)；Ser1-polyA(SEQ ID NO.5)为终止信号，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.11)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了ECFP(青色荧光蛋白)序列组成；随后在3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.11)5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。

步骤S2，胚胎显微注射与荧光筛选，通过将上述转基因表达载体通过家蚕胚胎显微注射，分别获得一种眼睛发红色荧光和一种眼睛发绿光的转基因家蚕。

通过表型观察和调查，发现fibL启动子驱动后部丝腺特异表达BmY1314S97A的转基因家蚕的蚕茧为纯丝胶茧，进而选择作为注射丝胶茧生物反应器的受体。

步骤S3，中部丝腺特异表达载体构建；所述载体目的基因表达框包括：增强子Hr3序列(SEQ ID NO.7)，家蚕Ser1基因启动子(SEQ ID NO.1)，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列(SEQ ID NO.2)，Ser1-polyA(SEQ ID NO.5)为终止信号，将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该骨架载体由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.11)，该序列是由3倍重复的P3启动子(眼睛和神经特异的启动子)驱动表达了ECFP(青色荧光蛋白)序列组成；随后在3×P3-ECFP序列(SEQ ID NO.11)5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂(SEQ ID NO.9)和piggyBac左臂(SEQ ID NO.10)。

步骤S4，再一次进行胚胎显微注射与荧光筛选；通过将家蚕Ser1基因启动子驱动中部丝腺特异表达增强型绿色荧光蛋白EGFP表达载体以上述注射受体进行再一次家蚕胚胎显微注射，获得眼睛即发红色荧光也发绿色荧光的转基因家蚕。

步骤S5，通过对中部丝腺进行荧光观察和分子检测，验证重组蛋白表达成功。

步骤S6，通过对丝腺蛋白的分子检测和茧壳形态的表型观察，验证重组蛋白已经成功分泌。

在以下优选实施例中，在本发明的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法及其应用中，各个步骤进一步包括更多的技术要素，具体如下：

实施例1，其为步骤S1家蚕后部丝腺特异性的表达载体的构建。其中，如图1A和图1B所示：

步骤S11，具体包括：构建了以家蚕fibL基因[NCBI基因ID：M76430.1](SEQ IDNO.3)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，终止信号为Ser1-polyA(SEQ ID NO.5)，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3×P3-DsRed]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。所构建家蚕丝腺特异性表达载体含有启动子3×P3启动的红色荧光蛋白(DsRed)基因表达框，其在家蚕眼和神经特异表达的红色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。具体如图1B所示。

步骤S12，具体包括：构建了以家蚕fibH基因[NCBI基因ID：NM_001113262.1](SEQID NO.6)为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点(BmY1314S97A)(SEQ ID NO.4)为目的基因，Ser1-polyA(SEQ ID NO.5)为终止信号，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac[3×P3-ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。所构建家蚕丝腺特异性表达载体含有启动子3×P3启动的青色荧光蛋白(ECFP)基因表达框，其在家蚕眼和神经特异表达的绿色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。具体如图1A所示。

实施例2，其为转基因家蚕的制作：

如图2所示转基因注射及荧光筛选：获得附图1A和图1B所示的转基因表达载体后，将其与辅助质粒(A4Helper)1:1分别以浓度450ng/μL混合，通过Eppendorf(埃普多夫)显微注射仪注射，以多化性家蚕(其为一年内可以饲养多批次蚕种材料)Nistari为注射受体，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4度放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用Eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的G0代(注射第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的G0代(注射第一代)蚕蛾，通过自交或回交得到G1(注射第二代)代蚕卵，用Olympus(奥林匹斯)荧光显微镜筛选，分别得到绿色荧光的转基因蚕并命名为HYS97A及红色荧光的转基因阳性家蚕并命名为LYS97A。并通过饲养一代后正常保种。

实施例3，其包括HYS97A和LYS97A丝腺形态学观察及茧壳观察，如图3-1、图3-2和图4所示：

步骤S11，饲养野生型家蚕Nistari、HYS97A和LYS97A转基因家蚕至五龄第一天(5L1D)，此时通过荧光筛选获得了只发红色荧光的转基因家蚕LYS97A和只发绿色荧光的转基因家蚕HYS97A，随后继续饲养至五龄第六天(5L6D)，通过在1×PBS的缓冲液中解剖并观察野生型家蚕Nistari、HYS97A和LYS97A转基因家蚕丝腺，并拍照(如图3-1)。

步骤S12，饲养野生型家蚕Nistari、LYS97A和LYS97A转基因家蚕至上蔟第7天，上蔟环境处于通风良好，温度25℃，分别对茧壳进行形态学观察(如图3-2)和茧重调查(如图4)，发现其均为丝胶茧，后续选用LYS97A作为丝胶茧生物反应器受体。

实施例4，其将丝胶茧作为注射受体，在中部丝腺特异激活表达荧光蛋白EGFP载体构建如图5所示：

其具体包括：家蚕Ser1基因启动子序列[NCBI基因ID：AB007831.1](SEQ IDNO.1)，将上述丝腺特异性启动子与增强子Hr3序列(SEQ ID NO.7)，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列(SEQ ID NO.2)及终止信号Ser1-poly A(SEQ ID NO.5)串联形成目的基因表达框，将通过利用FseI和SpeI将骨架载体pBac[3×P3-ECFP]和目的基因表达框切开，通过T4链接酶进行链接。所构建的表达载体的构建均含有启动子3×P3启动的青色荧光蛋白(ECFP)基因表达框，其在家蚕眼和神经特异表达的绿色荧光蛋白将作为阳性转基因家蚕的筛选标记。

实施例5，其为步骤S1丝胶茧生物反应器转基因家蚕的制作，如图6所示：

转基因注射及荧光筛选：获得图5所示的转基因表达载体后，将其与辅助质粒(A4Helper)1:1分别以浓度450ng/μL混合，通过Eppendorf(埃普多夫)显微注射仪注射，以转基因家蚕LYS97A(丝胶茧)为注射受体，眼部神经发红色荧光，注射前需要将蚕蛾交配6小时，4℃放置一天后拿出室温产卵，取刚产卵一小时的胚胎，将其用浆糊粘在玻璃片上，使用Eppendorf显微注射仪注射，通过无毒胶水将其封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，将孵化出的G0代(注射第一代)蚁蚕用桑叶饲养至化蛾，获得的G0代(注射第一代)蚕蛾，通过自交或回交得到G1代(注射第二代)蚕卵，用Olympus(奥林匹斯)荧光显微镜筛选，得到眼睛即发红色荧光又发绿色荧光的转基因蚕并命名为S1-EGFP(LYS97A)，如图6所示并通过饲养一代后正常保种。

实施例6，步骤S1丝胶茧生物反应器转基因家蚕的茧壳观察。

将实施例5中的S1-EGFP(LYS97A)转基因家蚕置于25℃，相对湿度65％的环境中饲养至上蔟第7天，上蔟环境通风良好，温度为25℃，采茧，将茧壳置于手持荧光设备下拍照，结果如图7所示，在丝胶茧中成功表达荧光蛋白EGFP。

实施例7，其为S1-EGFP(LYS97A)转基因家蚕的基因组鉴定，其具体包括以下步骤：

步骤S1，转基因家蚕的丝腺收集；

饲养注射受体LYS97A和S1-EGFP(LYS97A)转基因家蚕5龄第6天(5L6D)，通过在1×PBS的缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺，通过1.5mL的离心管收集中部丝腺。

步骤S2，将上述收集的中部丝腺进行基因组的提取，提取步骤如下：

步骤S21，将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2-3小时。在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理。预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5mL的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。

步骤S22，将1mL的DNA抽提Buffer(缓冲液)加入离心管中，离心机以3000rpm涡旋混匀。按100μL/mL的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。

步骤S23，将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10min，随后4℃、13400rpm离心10min，取600μL上清液至新的离心管中。

步骤S24，将600μL Tris酚/氯仿，充分旋转振荡10min，在温度4℃环境下离心机以13400rpm离心10min，将上清转移至新的离心管中。

步骤S25，将于上清等体积的氯仿，充分旋转振荡10min，随后，4℃、13400rpm离心10min，收集上清液。

步骤S26，将在4℃预冷的无水乙醇等体积加入离心管中，轻轻上下颠倒直至出现均匀的白色絮状沉淀后静置5min。

步骤S27，用无菌枪头小心挑出沉淀后转移至新的1.5mL离心管中，加入4℃预冷的75％乙醇清洗1-2次，4℃、13400rpm离心10min，弃上清液。

步骤S28，打开离心管盖子，室温静置至乙醇挥发殆尽，加入30-50μL EB缓冲液溶解DNA沉淀。

步骤S29，利用分光光度计检测DNA纯度及浓度及琼脂点凝胶电泳检验后置于-80℃长期保存备用。

步骤S3，基因组PCR：

步骤S31，利用Primer5软件设计S1-EGFP引物，该引物由华大基因合成，引物合成后加超纯水溶解稀释后4℃保存。

步骤S32，以上述提取的基因组为模板进行PCR扩增目的片段，反应体系如下：

基因组DNA 1μL；

脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 0.8μL；

高保真热稳定性DNA聚合酶(HiFi Taq Enzyme) 0.1μL；

正反向引物 各0.2μL；

缓冲液(BufferⅠ) 1μL；

双蒸水(ddH2O) 6.7μL；

一共(Total) 10μL；

PCR扩增条件如下：

94℃预变性 5min；

94℃变性 30s；

50℃退火 30s；

72℃延伸 30s；

重复35个循环，72℃10min；

步骤S33，上述反应结束后，制备1％的琼脂糖凝胶，取5μL PCR扩增产物进行电泳检测，电泳结果如图8所示。图8示出2种基因组PCR产物对比。第一泳道为阳性对照LYS97A的中部丝腺PCR产物，第2-5泳道为相同品种S1-EGFP(LYS97A)的四个不同家蚕个体中部丝腺PCR产物。

实施例8

步骤S1，中部丝腺RNA的提取。其具体包括以下步骤：

步骤S11，解剖获取LYS97A和S1-EGFP(LYS97A)五龄幼虫第6天(5L6D)的中部丝腺，分别放入经液氮预冷的研钵，加入液氮迅速研磨成粉，取适量粉末转移至新的无RNA酶的1.5mL离心管中。

步骤S12，将1mL的Trizol溶液(新型总RNA抽提试剂)加入离心管中，大速涡旋振荡至充分混匀。将离心管置于冰上10min后4℃、12500rpm离心10min。

步骤S13，将上清液转移至新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入250μL氯仿，大速涡旋震荡15s，冰上静置10min后4℃、12500rpm离心10min，取上清液。

步骤S14，重复上一步操作。

步骤S15，将上层水相转移至新的无RNA酶的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒使其充分混匀。4℃、12500rpm离心15min。

步骤S16，弃上清，加入1mL 4℃预冷的75％的乙醇洗涤沉淀。4℃、13000rpm离心15min。

步骤S17，弃上清，利用移液枪小心吸走沉淀周围残留的液体，室温静置干燥至乙醇挥发殆尽。

步骤S18，将适量的DEPC水加入离心管中溶解RNA沉淀，室温静置至沉淀溶解完毕。

步骤S19，利用分光光度计检测RNA的纯度及浓度后进行适当稀释，-80℃长期保存备用。

步骤S2，体外反转合成cDNA。

根据TaKaRa体外反转录试剂盒操作说明书。进行如下操作：

步骤S21，基因组的消化，具体消化体系如下：

将体系吹打混匀，置于室温消化5min后进行反转录PCR。

步骤S22，反转录PCR体系如下；

将上述体系加入步骤S21的消化产物中，轻轻吹打混匀，放于PCR仪中进行反转，37℃15min，85℃5s，反转完毕后的cDNA产物保存在-20℃备用。

步骤S3，实时荧光定量PCR。

进行荧光定量PCR前将cDNA稀释5倍后进行下一步操作。

步骤S31，EGFP基因的定量引物设计如下：

F:CAGTGCTTCAGCCGCTACCC R:AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT

步骤S32，荧光定量反应体系及扩增程序如下：

荧光定量PCR扩城程序如下：

步骤S33，数据收集、分析及绘图。

程序结束后，导出含有数据的Excel表格，采用相对定量法对所得数据进行分析。最后采用Graph Pad Prism 5绘制图表，结果如图9所示。S1-EGFP(LYS97A)中部丝腺中GFP的转录水平显著高于WT(LYS97A)。

实施例9丝胶茧生物反应器转基因家蚕丝腺的蛋白检测，其包括以下步骤：

步骤S1，丝胶茧生物反应器转基因家蚕丝腺的蛋白提取，其具体包括以下步骤：

步骤S11，饲养LYS97A和S1-EGFP(LYS97A)转基因家蚕至5L6D，通过在1×PBS的缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水)中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺，通过1.5mL的离心管收集中部丝腺。

步骤S12，将约1g的中部丝腺剪碎后置于无菌的1.5mL离心管中，向离心管中加入500μL PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)，4℃溶解过夜。14000rpm离心15min，取上清液，得到丝腺蛋白溶液。

步骤S2，Western blot检测

步骤S21，组装制胶装置，检查是否漏水。将12％的分离胶灌入制胶板中，加入双蒸水压平胶面且防止空气于胶面接触。待分离胶凝固后，倒掉上层水相，灌入5％浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后即可使用。蛋白样品与5×SDS Loading Buffer(上样缓冲液)混合后，100℃沸水煮10min使充分蛋白变性，冷却至室温备用。

步骤S22，将蛋白样品瞬离10-20s后取上清上样，电泳以恒流10mA进行至样品进入分离胶中后，电压换为15mA或20mA。跑胶时间根据蛋白大小而定。将电泳完毕后的蛋白胶根据蛋白分子量大小进行修剪后转移至转膜缓冲液(Transfer Buffer)中。随后，根据蛋白胶的大小剪裁同样大小的PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)并放入100％甲醇中活化(5-10s)。按照顺序为：滤纸-PVDF膜-蛋白胶-滤纸放置，保证蛋白胶和PVDF膜之间无气泡后采用湿转以200mA恒定电流转25min。由于湿转过程会产生热量，所以转膜过程需使用冰浴防止温度过高或在4℃冰库内进行。转膜结束，将PVDF膜置于1×TBST缓冲液(Tris-HCl缓冲盐溶液和非离子型去污剂)中适当清洗2-5min，清洗完毕后将膜浸泡于5％的脱脂奶粉溶液中4℃封闭过夜或置于水平摇床上37℃封闭1小时。分别用TBST按照1000:1稀释GFP一抗和Tubulin一抗，将膜从封闭液内取出后迅速置于一抗杂交液中，37℃2小时或4℃过夜孵育抗体。一抗孵育结束后，将PVDF膜置于1×TBST中清洗3次，每次10min。回收一抗(若短期内再次使用，回收后保存于4℃，若短期内不再使用需在-20℃长期存)。封闭液1000:1对二抗进行稀释，将PVDF膜转移至二抗杂交液中，置于水平摇床室温孵育1.5-2小时。1×TBST对膜进行清洗3次，每次5-10min。回收二抗保存于-20℃。根据说明书配制蛋白显影液(现配现用)，将膜取出，平铺在干净的保鲜膜上，将ELC(增强型化学发光试剂)显影液均匀滴在PVDF膜上，利用化学发光成像系统进行曝光，如图10所示。S1-EGFP(LYS97A)中部丝腺蛋白溶液在Westernblot中检测到了一条分子量大小约为27kDa的特异条带，与蛋白分子量预测大小一致。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

本发明中涉及的序列表如下：

SEQ ID NO.1家蚕Ser1基因启动子

gtcgacgaaaacagcacacacactacataccatgtatttgacgcacacacgcatgtatactatttattgtcaaacttttgttcttgacgtctgtgttcaaactgagaatagattaaatattgtttgtctttattaatattttttaatagtgtagtcttggcgaaatttgtgattataaaagtataaaatacaatcataatagtgtacgaacttacaattccaattaattatagtcgaatttcgactactgcgggacctctagtattaataattctctttaaaaaaaaacagagcatcaaatactgcacaaatgtcaagcgggtctcaacgagccatgaataaattagaaatcaattaataacataaaataggcaaacaaaataaaaccatttacatagagaacgtttgttgaacaaaaacaataacttgtatacattgtttgcacaaatgtttgaagcgaaaatttattactctctacgtaagcttgatcaaacttcgttttcgtataaaacgcgttggcccaaccactttggcatagtcgtcttatcatcgggtctctaaggatcaagcgatccaaagaccgccaac

SEQ ID NO.2 EGFP基因序列

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag

SEQ ID NO.3家蚕fibL基因启动子

tgcatattggacatcccttttcttgacatcgtataaattcggtaattctcggtacggttcgtaaagttcacctgcggctatattccgactcgccaagttacgtcagtcgtattgtaatgagcgatttagtgggcaacttcattctgttaattttgtgtcacggtgcgcgcgcatcgtaaaacttcactctcatagatttttcataacgcgcctaaagaagtataacttcaataatttaaatttaaaaaaaaacatgcatagaataattatatgaattatttaaaatgtcatttaccgacattgacataacagacgacgttaacactacaaaacattttaattccacattgttacatattcaacagttaaatttgcgttaattctcgatgcgaacaaatataagaacaatcggatcaattagatcgctttgtttcgaacaacacttagtttaactagaggcgtacacctcaagaaatcatcttcattagaaactaaaccttaaaatcgcaataataaagcatagtcaattttaactgaaatgcaaagtcttttgaacgttagatgctgtcagcgttcgttggtacagttgtttgatatttattttaattgtctttttatatataaatagtggaacattaatcacggaatcctgtatagtatataccgattggtcacataacagaccactaa

SEQ ID NO.4 BmY1314S97A

atggctctcaactcggacggtgaacagaaatcgaacctggtcctccgcgtggaccgggattcagactctgtattacaatcgttgttcgacacagtgctcaagccagactcaaagcgaccgctacaggtgcctcttcgtatgcgacagcttcccaagtcattctttaacccgccgtcgaccggttccaagtcgccatcagtgtctcactcgcgagaaaactcggctgattcggcattcggatcatcgtctgcaactggcacctctacagtttcccattcacgggcacatgcttcaccagcaagcttgcaacaaacttacaccgcaggccaacagagtcaacaaccaccgttgcatcatcaacacacgaaacaaagatcttatgatgttggtacacatattccagacgatcttggacccttaccagcaggctgggagcaagctcgtactccagaaggacaaatatattatttgaatcacataacaaaaacgacgacatgggatgatccgcggaaaactctcgcagcgcagaacgtggccaacactgtccagcatcaagccgccgaagccctgctcaatcagaacgcacaacgaaccattaccaacacagccacacctgcagcgaagagtacaagtaatacgacaacagatcctttagggccactgccggaaggctgggagcaggccacgacagcggaaggcgaaatctacttcattaatcacgcagctcgtaccacgtcctggttcgatcccagaataccgcaacatttgcaacgtacgccagtgggtgcaaccggcgtggcggggggaggctgggccaacgcgtccattcaagcttgtcaacagaaacttcgactccagtcgttgcagctcgaaagggactgcctcaagcagcgccaacaggagatcagactccaacaagaactgatggcccggcaggcgtcttctatcgtatcgtctttggcgagcagtacaggtgcggtggcgagtactgaattgcccttggacccttttctgcctgggctgacggatcatcagcgccaagaatcagccgatagcgggctcggcatggcagtcccacagtcctattccatgccgctcacgcctgaggacttcctctccggcatgggcgatcgcatggactgcaccagcgaggccggagccaacatggactccacggacatcacgctcggcgacaacataggctccactgatgacttgctgaacgagttcactaacgatatactcctggatgacgtgcaatcgctcataaattcaacaccgagcaaatctgacaacgtactcacgtggctgtaa

SEQ ID NO.5终止信号Ser1-polyA

tacaactaaacacgacttggagtattccttgtagtgtttaagattttaaatcttacttaatgacttcgaacgattttaacgataactttctctttgtttaactttaatcagcatacataaaaagccccggttttgtatcgggaagaaaaaaaatgtaattgtgttgcctagataataaacgtattatcaaagtgtgtggttttcctttaccaaagacccctttaagatgggcctaatgggcttaagtcgagtcctttccgatgtgttaaatacacatttattacactgatgcgtcgaatgtacacttttaataggatagctccactaaaaattattttatttatttaatttgttgcaccaaaactgatacattgacgaa

SEQ ID NO.6家蚕fibH基因启动子

cctgcgtgatcaggaaaaatgtggaaagcttaacgattttgtcacattttacttatcacaacttgtttttataataattcgcttaaatgagcagctattacttaatctcgtagtggtttttgacaaaatcagcttctttagaactaaaatatcatttttttcgtaatttttttaatgaaaaatgctctagtgttatacctttccaaaatcaccattaattaggtagtgtttaagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagcatcagttcggttccaactctcaag

SEQ ID NO.7增强子Hr3序列

cagcgtcgtgaaaagaggcaatgacaaatacaaaacgacgtatgagcagacccgtcgccaagacgggtctacctctaagatgatgtcatttgttttttaaaactaactcgctttacgagtagaattctacgtgtaaaacataatcaagagatgatgtcatttgtttttcaaaaccaaactcgctttacgagtagaattctacgtgtaaaacacaatcaaaagatgatgtcattcgtttttcaaaaccgaatttaagaaatgatgtcatttgtttttcaaaaccaaactcgctttacgagcagaattctacgtgtaaaacacaatcaagagatgatgtcatttgtttttcaaaactgaatgatgtcatttgtttttcaaaactaaacttgctttgcgagtagaattctacgtgtaaaacacagtcaagagatgatgtcatttgtttttcaaaactgaaccggctttacgagtagaattctacttgtaaaacataatcaagagatgatgtcatttgtttttcaaaactgaactggctttacgagtagaattctacgtgtaaaacataatcaagagatgatgtcatcattaaactgatgtcattttatacacgattgttaacatgtttaataatgactaatttgtttttccaaattaaactcgctttacgagtagaattctacttgtaacgcacgattaagtatgaatcataagctgatgtcatttgttttcgacataaaatgtttatacaatggaatcttcttgtaaattatccaaataatataatttatccgattctacgttacatttaaattcgttgttatcgtacaattcttcaggacacgccatgtattggtcatttttagcgtgcaaccaacgattgtatttgacgccgtcgttggattgcgtgttcaggttggcgtacacgtgactgggcacggcttcttttt

SEQ ID NO.8 3×P3-DsRed序列

gcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatcggggtaccgctagagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggtcgccaccatggtgcgctcctccaagaacgtcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggcaccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggccacaacaccgtgaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctgcttcatctacaaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagatccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagtccatctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggactccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgccaccacctgttcctgtagtcataatcagccataccacatttgtag

SEQ ID NO.9 piggyBac右臂

ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttaaacattctctcttttacaaaaataaacttattttgtactttaaaaacagtcatgttgtattataaaataagtaattagcttaacttatacataatagaaacaaattatacttattagtcagtcagaaacaactttggcacatatcaatattatgctctcgacaaataacttttttgcattttttgcacgatgcatttgcctttcgccttattttagaggggcagtaagtacagtaagtacgttttttcattactggctcttcagtactgtcatctgatgtaccaggcacttcatttggcaaaatattagagatattatcgcgcaaatatctcttcaaagtaggagcttctaaacgcttacgcataaacgatgacgtcaggctcatgtaaaggtttctcataaattttttgcgactttggaccttttctcccttgctactgacattatggctgtatataataaaagaatttatgcaggcaatgtttatcattccgtacaataatgccataggccacctattcgtcttcctactgcaggtcatcacagaacacatttggtctagcgtgtccactccgcctttagtttgattataatacataaccatttgcggtttaccggtactttcgttgatagaagcatcctcatcacaagatgataataagtataccatcttagctggcttcggtttatatgagacgagagtaaggggtccgtcaaaacaaaacatcgatgttcccactggcctggagcgactgtttttcagtacttccggtatctcgcgtttgtttgatcgcacggttcccacaatggttt

SEQ ID NO.10 piggyBac左臂

agatctgacaatgttcagtgcagagactcggctacgcctcgtggactttgaagttgaccaacaatgtttattcttacctctaatagtcctctgtggcaaggtcaagattctgttagaagccaatgaagaacctggttgttcaataacattttgttcgtctaatatttcactaccgcttgacgttggctgcacttcatgtacctcatctataaacgcttcttctgtatcgctctggacgtcatcttcacttacgtgatctgatatttcactgtcagaatcctcaccaacaagctcgtcatcgctttgcagaagagcagagaggatatgctcatcgtctaaagaactacccattttattatatattagtcacgatatctataacaagaaaatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaaatcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg

SEQ ID NO.11 3×P3-ECFP序列

gcaaagtgaacacgtcgctaagcgaaagctaagcaaataaacaagcgcagctgaacaagctaaacaatcggggtaccgctagagtcgacggtacgatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctggggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacatcagccacaacgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaactctagatcataatcagccataccacatttgtag

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法

<141> 2022-03-04

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 1

gtcgacgaaa acagcacaca cactacatac catgtatttg acgcacacac gcatgtatac 60

tatttattgt caaacttttg ttcttgacgt ctgtgttcaa actgagaata gattaaatat 120

tgtttgtctt tattaatatt ttttaatagt gtagtcttgg cgaaatttgt gattataaaa 180

gtataaaata caatcataat agtgtacgaa cttacaattc caattaatta tagtcgaatt 240

tcgactactg cgggacctct agtattaata attctcttta aaaaaaaaca gagcatcaaa 300

tactgcacaa atgtcaagcg ggtctcaacg agccatgaat aaattagaaa tcaattaata 360

acataaaata ggcaaacaaa ataaaaccat ttacatagag aacgtttgtt gaacaaaaac 420

aataacttgt atacattgtt tgcacaaatg tttgaagcga aaatttatta ctctctacgt 480

aagcttgatc aaacttcgtt ttcgtataaa acgcgttggc ccaaccactt tggcatagtc 540

gtcttatcat cgggtctcta aggatcaagc gatccaaaga ccgccaac 588

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 维多利亚水母(Aequorea victoria)

<400> 2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

<210> 3

<211> 690

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 3

tgcatattgg acatcccttt tcttgacatc gtataaattc ggtaattctc ggtacggttc 60

gtaaagttca cctgcggcta tattccgact cgccaagtta cgtcagtcgt attgtaatga 120

gcgatttagt gggcaacttc attctgttaa ttttgtgtca cggtgcgcgc gcatcgtaaa 180

acttcactct catagatttt tcataacgcg cctaaagaag tataacttca ataatttaaa 240

tttaaaaaaa aacatgcata gaataattat atgaattatt taaaatgtca tttaccgaca 300

ttgacataac agacgacgtt aacactacaa aacattttaa ttccacattg ttacatattc 360

aacagttaaa tttgcgttaa ttctcgatgc gaacaaatat aagaacaatc ggatcaatta 420

gatcgctttg tttcgaacaa cacttagttt aactagaggc gtacacctca agaaatcatc 480

ttcattagaa actaaacctt aaaatcgcaa taataaagca tagtcaattt taactgaaat 540

gcaaagtctt ttgaacgtta gatgctgtca gcgttcgttg gtacagttgt ttgatattta 600

ttttaattgt ctttttatat ataaatagtg gaacattaat cacggaatcc tgtatagtat 660

ataccgattg gtcacataac agaccactaa 690

<210> 4

<211> 1314

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 4

atggctctca actcggacgg tgaacagaaa tcgaacctgg tcctccgcgt ggaccgggat 60

tcagactctg tattacaatc gttgttcgac acagtgctca agccagactc aaagcgaccg 120

ctacaggtgc ctcttcgtat gcgacagctt cccaagtcat tctttaaccc gccgtcgacc 180

ggttccaagt cgccatcagt gtctcactcg cgagaaaact cggctgattc ggcattcgga 240

tcatcgtctg caactggcac ctctacagtt tcccattcac gggcacatgc ttcaccagca 300

agcttgcaac aaacttacac cgcaggccaa cagagtcaac aaccaccgtt gcatcatcaa 360

cacacgaaac aaagatctta tgatgttggt acacatattc cagacgatct tggaccctta 420

ccagcaggct gggagcaagc tcgtactcca gaaggacaaa tatattattt gaatcacata 480

acaaaaacga cgacatggga tgatccgcgg aaaactctcg cagcgcagaa cgtggccaac 540

actgtccagc atcaagccgc cgaagccctg ctcaatcaga acgcacaacg aaccattacc 600

aacacagcca cacctgcagc gaagagtaca agtaatacga caacagatcc tttagggcca 660

ctgccggaag gctgggagca ggccacgaca gcggaaggcg aaatctactt cattaatcac 720

gcagctcgta ccacgtcctg gttcgatccc agaataccgc aacatttgca acgtacgcca 780

gtgggtgcaa ccggcgtggc ggggggaggc tgggccaacg cgtccattca agcttgtcaa 840

cagaaacttc gactccagtc gttgcagctc gaaagggact gcctcaagca gcgccaacag 900

gagatcagac tccaacaaga actgatggcc cggcaggcgt cttctatcgt atcgtctttg 960

gcgagcagta caggtgcggt ggcgagtact gaattgccct tggacccttt tctgcctggg 1020

ctgacggatc atcagcgcca agaatcagcc gatagcgggc tcggcatggc agtcccacag 1080

tcctattcca tgccgctcac gcctgaggac ttcctctccg gcatgggcga tcgcatggac 1140

tgcaccagcg aggccggagc caacatggac tccacggaca tcacgctcgg cgacaacata 1200

ggctccactg atgacttgct gaacgagttc actaacgata tactcctgga tgacgtgcaa 1260

tcgctcataa attcaacacc gagcaaatct gacaacgtac tcacgtggct gtaa 1314

<210> 5

<211> 379

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 5

tacaactaaa cacgacttgg agtattcctt gtagtgttta agattttaaa tcttacttaa 60

tgacttcgaa cgattttaac gataactttc tctttgttta actttaatca gcatacataa 120

aaagccccgg ttttgtatcg ggaagaaaaa aaatgtaatt gtgttgccta gataataaac 180

gtattatcaa agtgtgtggt tttcctttac caaagacccc tttaagatgg gcctaatggg 240

cttaagtcga gtcctttccg atgtgttaaa tacacattta ttacactgat gcgtcgaatg 300

tacactttta ataggatagc tccactaaaa attattttat ttatttaatt tgttgcacca 360

aaactgatac attgacgaa 379

<210> 6

<211> 1126

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori)

<400> 6

cctgcgtgat caggaaaaat gtggaaagct taacgatttt gtcacatttt acttatcaca 60

acttgttttt ataataattc gcttaaatga gcagctatta cttaatctcg tagtggtttt 120

tgacaaaatc agcttcttta gaactaaaat atcatttttt tcgtaatttt tttaatgaaa 180

aatgctctag tgttatacct ttccaaaatc accattaatt aggtagtgtt taagcttgtt 240

gtacaaaact gccacacgca tttttttctc cactgtaggt tgtagttacg cgaaaacaaa 300

atcgttctgt gaaaattcaa acaaaaatat tttttcgtaa aaacacttat caatgagtaa 360

agtaacaatt catgaataat ttcatgtaaa aaaaaaatac tagaaaagga atttttcatt 420

acgagatgct taaaaatctg tttcaaggta gagatttttc gatatttcgg aaaattttgt 480

aaaactgtaa atccgtaaaa ttttgctaaa catatattgt gttgttttgg taagtattga 540

cccaagctat cacctcctgc agtatgtcgt gctaattact ggacacattg tataacagtt 600

ccactgtatt gacaataata aaacctcttc attgacttga gaatgtctgg acagatttgg 660

ctttgtattt ttgatttaca aatgtttttt tggtgattta cccatccaag gcattctcca 720

ggatggttgt ggcatcacgc cgattggcaa acaaaaacta aaatgaaact aaaaagaaac 780

agtttccgct gtcccgttcc tctagtggga gaaagcatga agtaagttct ttaaatatta 840

caaaaaaatt gaacgatatt ataaaattct ttaaaatatt aaaagtaaga acaataagat 900

caattaaatc ataattaatc acattgttca tgatcacaat ttaatttact tcatacgttg 960

tattgttatg ttaaataaaa agattaattt ctatgtaatt gtatctgtac aatacaatgt 1020

gtagatgttt attctatcga aagtaaatac gtcaaaactc gaaaattttc agtataaaaa 1080

ggttcaactt tttcaaatca gcatcagttc ggttccaact ctcaag 1126

<210> 7

<211> 947

<212> DNA

<213> 家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)

<400> 7

cagcgtcgtg aaaagaggca atgacaaata caaaacgacg tatgagcaga cccgtcgcca 60

agacgggtct acctctaaga tgatgtcatt tgttttttaa aactaactcg ctttacgagt 120

agaattctac gtgtaaaaca taatcaagag atgatgtcat ttgtttttca aaaccaaact 180

cgctttacga gtagaattct acgtgtaaaa cacaatcaaa agatgatgtc attcgttttt 240

caaaaccgaa tttaagaaat gatgtcattt gtttttcaaa accaaactcg ctttacgagc 300

agaattctac gtgtaaaaca caatcaagag atgatgtcat ttgtttttca aaactgaatg 360

atgtcatttg tttttcaaaa ctaaacttgc tttgcgagta gaattctacg tgtaaaacac 420

agtcaagaga tgatgtcatt tgtttttcaa aactgaaccg gctttacgag tagaattcta 480

cttgtaaaac ataatcaaga gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tggctttacg 540

agtagaattc tacgtgtaaa acataatcaa gagatgatgt catcattaaa ctgatgtcat 600

tttatacacg attgttaaca tgtttaataa tgactaattt gtttttccaa attaaactcg 660

ctttacgagt agaattctac ttgtaacgca cgattaagta tgaatcataa gctgatgtca 720

tttgttttcg acataaaatg tttatacaat ggaatcttct tgtaaattat ccaaataata 780

taatttatcc gattctacgt tacatttaaa ttcgttgtta tcgtacaatt cttcaggaca 840

cgccatgtat tggtcatttt tagcgtgcaa ccaacgattg tatttgacgc cgtcgttgga 900

ttgcgtgttc aggttggcgt acacgtgact gggcacggct tcttttt 947

<210> 8

<211> 831

<212> DNA

<213> 香菇珊瑚(Discosoma sp)

<400> 8

gcaaagtgaa cacgtcgcta agcgaaagct aagcaaataa acaagcgcag ctgaacaagc 60

taaacaatcg gggtaccgct agagtcgacg gtaccgcggg cccgggatcc accggtcgcc 120

accatggtgc gctcctccaa gaacgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcgcatg 180

gagggcaccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 240

gagggccaca acaccgtgaa gctgaaggtg accaagggcg gccccctgcc cttcgcctgg 300

gacatcctgt ccccccagtt ccagtacggc tccaaggtgt acgtgaagca ccccgccgac 360

atccccgact acaagaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac 420

ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggctgcttc 480

atctacaagg tgaagttcat cggcgtgaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag 540

aagaccatgg gctgggaggc ctccaccgag cgcctgtacc cccgcgacgg cgtgctgaag 600

ggcgagatcc acaaggccct gaagctgaag gacggcggcc actacctggt ggagttcaag 660

tccatctaca tggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggct actactacgt ggactccaag 720

ctggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg agcagtacga gcgcaccgag 780

ggccgccacc acctgttcct gtagtcataa tcagccatac cacatttgta g 831

<210> 9

<211> 1051

<212> DNA

<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)

<400> 9

ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 60

atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 120

tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 180

tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa aacttttaaa 240

cattctctct tttacaaaaa taaacttatt ttgtacttta aaaacagtca tgttgtatta 300

taaaataagt aattagctta acttatacat aatagaaaca aattatactt attagtcagt 360

cagaaacaac tttggcacat atcaatatta tgctctcgac aaataacttt tttgcatttt 420

ttgcacgatg catttgcctt tcgccttatt ttagaggggc agtaagtaca gtaagtacgt 480

tttttcatta ctggctcttc agtactgtca tctgatgtac caggcacttc atttggcaaa 540

atattagaga tattatcgcg caaatatctc ttcaaagtag gagcttctaa acgcttacgc 600

ataaacgatg acgtcaggct catgtaaagg tttctcataa attttttgcg actttggacc 660

ttttctccct tgctactgac attatggctg tatataataa aagaatttat gcaggcaatg 720

tttatcattc cgtacaataa tgccataggc cacctattcg tcttcctact gcaggtcatc 780

acagaacaca tttggtctag cgtgtccact ccgcctttag tttgattata atacataacc 840

atttgcggtt taccggtact ttcgttgata gaagcatcct catcacaaga tgataataag 900

tataccatct tagctggctt cggtttatat gagacgagag taaggggtcc gtcaaaacaa 960

aacatcgatg ttcccactgg cctggagcga ctgtttttca gtacttccgg tatctcgcgt 1020

ttgtttgatc gcacggttcc cacaatggtt t 1051

<210> 10

<211> 679

<212> DNA

<213> 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)

<400> 10

agatctgaca atgttcagtg cagagactcg gctacgcctc gtggactttg aagttgacca 60

acaatgttta ttcttacctc taatagtcct ctgtggcaag gtcaagattc tgttagaagc 120

caatgaagaa cctggttgtt caataacatt ttgttcgtct aatatttcac taccgcttga 180

cgttggctgc acttcatgta cctcatctat aaacgcttct tctgtatcgc tctggacgtc 240

atcttcactt acgtgatctg atatttcact gtcagaatcc tcaccaacaa gctcgtcatc 300

gctttgcaga agagcagaga ggatatgctc atcgtctaaa gaactaccca ttttattata 360

tattagtcac gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga 420

acatgaaata acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa 480

tcatgcgtca ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat 540

tgacaagcac gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga 600

cggattcgcg ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac 660

gcagactatc tttctaggg 679

<210> 11

<211> 867

<212> DNA

<213> 维多利亚水母(Aequorea victoria)

<400> 11

gcaaagtgaa cacgtcgcta agcgaaagct aagcaaataa acaagcgcag ctgaacaagc 60

taaacaatcg gggtaccgct agagtcgacg gtacgatcca ccggtcgcca ccatggtgag 120

caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 180

aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 240

gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 300

caccctgacc tggggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 360

cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 420

cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 480

catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 540

gtacaactac atcagccaca acgtctatat caccgccgac aagcagaaga acggcatcaa 600

ggccaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 660

ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 720

cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 780

gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaactctaga 840

tcataatcag ccataccaca tttgtag 867

Claims (6)

1.一种转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，其通过转基因技术获得两种丝胶茧系统，选取丝胶茧中丝胶含量较多的一种丝胶茧为生物反应器，通过以家蚕Ser1基因SEQ ID NO .1为启动子，增强型绿色荧光蛋白EGFPSEQ ID NO .2为目的基因，构建转基因表达载体并且获得转基因家蚕；

所述转基因丝胶茧生物反应器的构建方法包括以下步骤：

步骤S1，构建丝胶茧表达载体；

步骤S2，胚胎显微注射与荧光筛选；

步骤S3，中部丝腺特异表达载体构建；

步骤S4，再一次进行胚胎显微注射与荧光筛选；

步骤S5，通过对中部丝腺进行荧光观察和分子检测，验证重组蛋白表达成功；

步骤S6，通过对茧壳形态和茧壳蛋白的分子检测，验证重组蛋白已经成功分泌；

步骤S1 包括步骤S11和步骤S12：

步骤S11：构建了以家蚕fibL基因SEQ ID NO .3为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点BmY1314S97A SEQ ID NO .4为目的基因，终止信号为Ser1-polyASEQ ID NO .5，串联形成目的基因表达框，利用AscI将骨架载体pBac和目的基因表达框切开，通过T4连接酶进行连接；

步骤S12：构建了以家蚕fibH基因SEQ ID NO .6为启动子，BmY1314突变其第97位氨基酸位点SEQ ID NO .4为目的基因，Ser1-polyA SEQ ID NO .5为终止信号，串联形成目的基因表达框，通过利用AscI将骨架载体pBac和目的基因表达框切开，通过T4连接酶进行连接；

步骤S3 中部丝腺特异表达载体构建中，家蚕Ser1基因启动子序列为SEQ ID NO .1，将上述丝腺特异性启动子SEQ ID NO .1与增强子Hr3序列SEQ ID NO .7、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因序列SEQ ID NO .2及终止信号Ser1-poly A SEQ ID NO .5串联形成目的基因表达框，利用FseI和SpeI将骨架载体pBac和目的基因表达框切开，通过T4连接酶进行连接，所构建的表达载体均含有启动子3×P3启动的青色荧光蛋白ECFP基因表达框。

2.依据权利要求1所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，步骤S2进一步包括获得转基因表达载体后，将其与辅助质粒分别以浓度450 ng/μL等比例混合，通过Eppendorf 显微注射仪注射，以多化性家蚕Nistari为注射受体，进行转基因注射及荧光筛选。

3.依据权利要求2所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，转基因家蚕的丝腺收集包括，饲养注射受体发红色荧光的和既发红色荧光又发绿色荧光的转基因家蚕五龄第6天，通过在1×PBS缓冲液中解剖家蚕丝腺，并将丝腺分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺，通过1.5mL的离心管收集中部丝腺。

4.依据权利要求3所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将研钵及研磨棒进行清洗后，置于烘箱中180℃高温灭菌2-3小时；在研磨操作进行前需对丝腺、研钵及研磨棒进行液氮预冷处理；预冷后对丝腺进行研磨至粉末后转移至1.5 mL的离心管中，保存于液氮或-80℃备用。

5.依据权利要求3所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将1 mL的DNA抽提缓冲液加入离心管中，离心机以3000 rpm涡旋混匀；按100 µL/mL的工作浓度加入RNA酶，置于37℃恒温水浴锅中消化1小时后加入蛋白酶K，55℃水浴消化过夜。

6.依据权利要求3所述的转基因丝胶茧生物反应器的构建方法，其特征在于，将收集的中部丝腺进行基因组提取，提取步骤包括将等体积的Tris饱和酚添加至离心管中后充分旋转振荡10 min，在温度4℃环境下离心机以13400 rpm离心10 min，取600 µL上清液至新的离心管中。