KR100882837B1 - 키틴분해효소 및 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 베큘로바이러스 발현벡터계(Baculovirus Expression Vector System)에 있어서, 외래유전자를 발현하는 재조합바이러스(recombinant virus)의 발현효율을 높이기 위해 바이러스가 코드하고 있는 키틴분해효소(chitinase) 및/또는 단백질분해효소(cathepsin) 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV)에 관한 것이다.
베큘로바이러스(baculovirus), 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus), 키틴분해효소(chitinase), 단백질분해효소(cathepsin), 재조합바이러스(recombinant virus), 누에(Bombyx mori)

Description

키틴분해효소 및 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스{Recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus lacking the virus-encoded chitinase and cathepsin genes}
도 1은 본 발명에 따른 재조합 누에 핵다각체병 바이러스들의 제작 및 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 키틴분해효소 및/또는 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스 제놈(genome)을 이용한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 산물의 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis) 상을 나타낸 것이다.
도 3은 5령 누에에서 키틴분해효소 및/또는 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스의 발현효율을 비교한 결과이다.
도 4의 a는 키틴분해효소 및 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스와 대조구 바이러스의 발현수준을 5령 누에에 접종 후 경과일수 별로 채취한 체액을 이용하여 효소활성을 비교한 결과이다.
도 4의 b는 키틴분해효소 및 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스의 발현수준을 5령 누에에 접종 후 경과일수 별로 체액을 채취하여 웨스턴 블랏(Western blot) 분석한 결과이다.
본 발명은 베큘로바이러스 발현벡터계(Baculovirus Expression Vector System)에 있어서, 외래유전자를 발현하는 재조합바이러스(recombinant virus)의 발현효율을 높이기 위해 바이러스가 코드하고 있는 키틴분해효소(chitinase) 및/또는 단백질분해효소(cathepsin) 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV)에 관한 것이다.
대부분의 베큘로바이러스 발현벡터계(Baculovirus Expression Vector System)는 오토그라파캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus; BmNPV)를 이용하고 있다. 이는 목적으로 하는 재조합바이러스의 분리가 용이하기 때문이며, 현재 AcNPV 발현벡터계[Kitts and Possee, BioTechniques, 14: 810-817 (1993); Luckow et al., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993); Je et al., Biotechnol. Lett., 23: 575-585 (2001)]가 주로 많이 이용되고 있으며, BmNPV 발현벡터계[Je et al., Biotechnol. Lett., 23: 1809-1817 (2001)] 역시 개발되어 이에 관한 연구가 활발하다.
특히, 누에와 관련하여 고등진핵생물인 누에 유충에서 직접 유용물질을 대량 생산하는 BmNPV 발현벡터계는 대장균(Escherichia coli)에서 증식이 가능하지만 상 동재조합에 의해 재조합바이러스가 제작되지 않으면 곤충세포주에서는 증식할 수 없는 특징을 가지고 있다. 또한, BmNPV를 기초로 한 발현벡터는 누에 생체를 이용하여 외래단백질을 저비용으로 안전하고 용이하게 대량으로 생산할 수 있다는 장점이 있다[Maeda, Annu. Rev. Entomol., 34: 351-372 (1989)].
최근, 새로운 BmNPV 발현벡터인 BmNPV 백미드 시스템(BmNPV bacmid system)이 개발되었는데, 이는 누에 생체에서 직접 외래단백질을 생산하기 위한 시도이다[Motohashi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 326: 564-569 (2005)].
베큘로바이러스(Baculovirus)는 바이러스의 수평전파를 용이하게 하기 위해 바이러스 감염충의 피부를 용해시킨다. 감염충의 용해는 바이러스가 코드하고 있는 단백질분해효소(cathepsin; v-cath)와 키틴분해효소(chitinase; chiA)의 활성에 의존적이다[Ohkawa et al., J. Virol., 68: 6619-6625 (1994); Slack et al., J. Gen. Virol., 76: 1091-1098 (1995); Hawtin et al., Virology, 212: 673-685 (1995); Hawtin et al., Virology, 238: 243-253 (1997)].
그러나 곤충생체를 이용하여 외래단백질을 대량으로 생산하고자 할 때, 감염충의 용해는 종종 발현된 외래단백질의 손실과 발현효율의 저하를 초래한다. 이러한 문제점을 개선하기 위해서는 감염충의 용해와 관련된 단백질분해효소(v-cath) 및 키틴분해효소(chiA) 유전자가 결핍된 재조합바이러스의 제작이 요구되어진다.
상기와 같은 감염충의 용해에 따른 외래단백질의 손실과 발현효율의 저하를 해결하기 위하여, 본 발명은 감염충의 용해와 관련된 단백질분해효소 및/또는 키틴분해효소 유전자를 결핍시킨 재조합바이러스를 제작함으로써 누에 생체를 이용하여 외래단백질을 대량생산시 발현효율을 증대시키는 것을 목적으로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 키틴분해효소(chiA) 및/또는 단백질분해효소(v-cath) 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV)를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질분해효소(v-cath) 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV-v-cath -), 키틴분해효소(chiA) 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV-chiA -) 및 단백질분해효소와 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV-chiA --v-cath -)를 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 단백질분해효소 및/또는 키틴분해효소 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV 제작
1) 대조구 바이러스 RecBmNPV 제작
본 발명에서는 대조구 바이러스로써 bBpGOZA 바이러스 DNA[Je et al., Biotechnol. Lett., 23: 1809-1817 (2001)]를 이용하여 한국산 BmNPV의 다각체단백질 프로모터(promoter) 조절 하에 뽕나무하늘소 유래 셀룰라제 유전자([Lee et al., Comp. Biochem. Physiol. B, 139: 107-116 (2004)]를 발현하는 재조합 BmNPV(RecBmNPV)를 제작하였다. 재조합 BmNPV(RecBmNPV) 제작을 위해 bBpGOZA 바이러스 DNA 100 ng과 전이벡터 pBacPAK9-AgCell DNA 500 ng을 전이물질인 Lipofectin(Clonetech사)을 이용하여 리포좀매개전이(Liposome-mediated transfection)방법[O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors-A laboratory manual, W.H Freeman and Company, New York (1992)]으로 누에세포주(Bm5)에 동시전이(co-transfection) 시켰다. 전이벡터 pBacPAK9-AgCell은 pBacPAK9(Clonetech사)을 제한효소 SacI과 KpnI로 처리하여 동일한 제한효소로 절단된 뽕나무하늘소 셀룰라제 유전자를 삽입하였다. 동시전이에 의해 27℃에서 5일 동안 감염시킨 후, 곤충세포주를 수거하여 상청액내에 존재하는 재조합바이러스를 건강한 누에세포주에 재감염시켜 증식 사용하였다.
2) 전이벡터 pGemT-chiA-v-cath 제작
상기 1)에서 제작한 셀룰라제를 발현하는 RecBmNPV로부터 단백질분해효소(v-cath) 및 키틴분해효소(chiA) 유전자를 포함하는 4.3kb DNA 절편을 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭하였다.
이때 사용한 PCR 프라이머(primer)는 BmNPV 제놈 서열[Gomi et al., J. General. Virol., 80: 1323-1337 (1999); Hong et al., Arch. Virol., 145: 2351-2361 (2000)]에 근거하여 5'-AACGCGTTTGTGTGCGCTTT-3'의 전방 프라이머(F-primer,서열번호 1)와 5'-CACCAATCCGCCGGCACACACACCAG-3'의 후방 프라이머(R-primer, 서열번호 2)를 이용하였다.
또한, PCR은 94℃에서 1분, 48℃에서 1분, 72℃에서 3분 수행하였으며, 4.3kb의 PCR 산물은 pGemT 벡터(Promega사)에 클로닝하여 전이벡터 pGemT-chiA-v-cath를 제작하고, 대장균(E. coli TOP10F')(Invitrogen사)에 형질전환하였다. 상기 4.3kb PCR 산물의 염기서열 분석은 자동염기서열분석장치(Perkin-Elmer Applied Biosystems사, 모델 310)를 이용하였다.
3) 단백질분해효소(v-cath) 유전자가 결핍된 재조합 바이러스 RecBmNPV-v-cath - 제작
단백질분해효소(v-cath) 유전자가 결핍된 재조합 바이러스 RecBmNPV-v-cath -를 제작하기 위하여, 상기 2)에서 제작한 pGemT-chiA-v-cath 전이벡터를 제한효소 XbaI과 XhoI로 처리하여 단백질분해효소 유전자(v-cath)를 제거하고 초록색형광단백질(GFP) 유전자로 대체하여 재조합 전이벡터 pGemT-chiA-GFP를 제작하였다.
재조합 전이벡터 pGemT-chiA-GFP(500 ng)는 상기 1)에서 제작한 셀룰라제를 발현하는 RecBmNPV DNA(100 ng)와 함께 Lipofectin(Clonetech사)을 이용하여 누에 세포주(Bm5)에 동시전이(co-transfection) 시켰다. 5일 후 배양액을 수거하여 단백질분해효소(v-cath) 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV(RecBmNPV-v-cath -)를 플라크 어 세이(plaque assay)[O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors-A laboratory manual, W.H Freeman and Company, New York (1992)]에 의해 분리하고, PCR 분석을 통해 확인하였다.
단백질분해효소 (v-cath) 유전자의 결핍 유무를 확인하기 위한 PCR 프라이머는 5'-ATGTTGTACAAATTGTTAAACGTTTTG-3'(전방 프라이머 F1-primer, 서열번호 3)와 5'-TTACAGTTCATCTTTAGGTTTAAACTG-3'(후방 프라이머 R1-primer, 서열번호 4)를 이용하였다.
PCR 템플레이트(template)로 사용한 바이러스 DNA는 감염된 세포로부터 제놈분리키트(Promega사)를 이용하여 분리하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분, 51℃에서 1분, 72℃에서 2분 수행하였으며, PCR 산물은 상기 2)의 방법처럼 클로닝하고, 염기서열을 분석하였다.
4) 키틴분해효소(chiA) 유전자가 결핍된 재조합 바이러스 RecBmNPV-chiA - 제작
키틴분해효소(chiA) 유전자가 결핍된 재조합 바이러스(RecBmNPV-chiA -)를 제작하기 위하여, 상기 2)에서 제작한 pGemT-chiA-v-cath 전이벡터를 제한효소 KpnI과 SmaI로 처리하여 키틴분해효소 유전자(chiA)를 제거하고 루시페라제(luciferase) 유전자로 대체하여 재조합 전이벡터 pGemT-v-cath-Luci를 제작하였다.
재조합 전이벡터 pGemT-v-cath-Luci는 상기 1)에서 제작한 셀룰라제를 발현 하는 RecBmNPV DNA와 함께 Lipofectin(Clonetech사)을 이용하여 누에 세포주(Bm5)에 동시전이(co-transfection) 시키고, 키틴분해효소(chiA) 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV (RecBmNPV-chiA -)를 분리하였다.
키틴분해효소(chiA) 유전자의 결핍 유무를 확인하기 위한 PCR 프라이머는 5'-GGAAACGGCGACCACCAACCACAA-3'(전방 프라이머 F2-primer, 서열번호 5)와 5'-TTAATAAATGACTGCAGTAGACGC-3'(후방 프라이머 R2-primer, 서열번호 6)를 이용하고, 그 외 상기 3)과 같은 방법으로 분석하였다.
5) 단백질분해효소(v-cath)와 키틴분해효소(chiA) 유전자가 동시에 결핍된 재조합 바이러스 RecBmNPV-chiA --v-cath - 제작
단백질분해효소(v-cath)와 키틴분해효소(chiA) 유전자가 동시에 결핍된 재조합 바이러스 RecBmNPV-chiA --v-cath -를 제작하기 위하여, 상기 2)에서 제작한 pGemT-chiA-v-cath 전이벡터 중 단백질분해효소(v-cath) 유전자는 초록색형광단백질(GFP) 유전자로, 키틴분해효소(chiA) 유전자는 루시페라제(luciferase) 유전자로 동시에 대체하여, 재조합 전이벡터 pGemT-Luci-GFP를 제작하였다.
이어, 상기 3) 및 4)와 같은 방법으로 하여, 최종적으로 단백질분해효소(v-cath)와 키틴분해효소(chiA) 유전자가 동시에 결핍된 재조합 바이러스 RecBmNPV-chiA --v-cath -를 분리하였다.
이상의 결과에서, 대조구 바이러스로 제작된 셀룰라제를 발현하는 재조합 바이러스(RecBmNPV)와 뮤턴트(mutant) 바이러스로 셀룰라제를 발현하면서 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 바이러스(RecBmNPV-v- cath -), 셀룰라제를 발현하면서 키틴분해효소 유전자가 결핍된 재조합 바이러스(RecBmNPV-chiA -) 및 셀룰라제를 발현하면서 단백질분해효소와 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 재조합 바이러스(RecBmNPV-chiA --v-cath -)를 제작하고, 그의 제놈(genome) 구조를 도 1에 모식화하였다.
[실시예 2] 단백질분해효소 및/또는 키틴분해효소 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV의 제놈의 PCR 분석
상기 실시예 1에서 제작한 3종의 재조합 BmNPV들(RecBmNPV-v-cath -, RecBmNPV-chiA - 및 RecBmNPV-chiA --v-cath -)로부터 단백질분해효소(v-cath) 유전자 및/또는 키틴분해효소(chiA) 유전자의 결핍 유무를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 언급된 단백질분해효소 유전자(서열번호 3의 F1 프라이머 및 서열번호 4의 R1 프라이머) 및 키틴분해효소 유전자(서열번호 5의 F2 프라이머 및 서열번호 6의 R2 프라이머)의 특이 PCR 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하고, 상기 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의해 분석하였다(도 2).
그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 대조구 바이러스인 RecBmNPV에서는 단백질분해효소(레인 2) 및 키틴분해효소(레인 3) 유전자가 존재하는 반면, 단백질분해효소 유전자가 결핍된 RecBmNPV-v-cath -에서는 단백질분해효소 유전자는 증폭되지 않았고(레인 4) 키틴분해효소 유전자(레인 5)는 증폭되었다. 키틴분해효소 유전자가 결핍된 RecBmNPV-chiA -에서는 단백질분해효소 유전자(레인 6)는 증폭된 반면 키틴분해효소 유전자는 증폭되지 않았다(레인 7). 또한, 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 RecBmNPV-chiA --v-cath -에서는 두 유전자 모두 증폭되지 않았다(레인 8 및 9).
이러한 결과들은 상기의 3종의 뮤턴트(mutant) 재조합 BmNPV들로부터 단백질분해효소(v-cath) 유전자 및/또는 키틴분해효소(chiA) 유전자가 분명히 결핍되었음을 증명한다.
[실시예 3] 단백질분해효소 및/또는 키틴분해효소 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV의 발현효율 비교
상기 실시예 1에서 제작된 RecBmNPV들은 Bm5 세포주에서 증식시켜 바이러스 농도를 플라크 포밍 유니트(plaque forming unit; p.f.u.)로 결정하였다 [O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors-A laboratory manual, W.H Freeman and Company, New York (1992)].
5령 1일째의 누에 유충에 각각의 RecBmNPV를 유충 당 1 × 105 p.f.u.를 주사하였다. 누에 유충에 바이러스 주사는 주사용액의 손실을 최소화하기 위하여 얼음에 누에 유충을 기절시킨 뒤 체강에 주사하였다. 주사 후 5일째 누에 체액을 채취하여 체액 내 발현된 셀룰라제의 효소 활성을 조사하여 발현효율을 비교하였다. 이 때 효소 활성은 채취된 체액에 0.1 M 아세테이트 (acetate) 완충액 (pH 6.0)에 2% (w/v) 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose)가 포함된 기질용액을 섞어 50℃에서 1시간 동안 처리한 후 디니트로살리실릭 리에이전트(dinitrosalicylic reagent) 방법[Miller, Anal. Chem., 31: 426-428 (1959)]에 의해 활성을 조사하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 대조구인 셀룰라제를 발현하는 재조합 BmNPV(RecBmNPV)에 의해 발현된 셀룰라제 효소 활성을 100%로 환산하였을 때, 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV(RecBmNPV-v- cath -)에서 11%, 키틴분해효소 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV(RecBmNPV-chiA -)에서 10% 그리고 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 재조합 BmNPV(RecBmNPV-chiA --v-cath -)에서 셀룰라제 발현은 17% 증가되었다.
[실시예 4] 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자가 결핍된 재조합 BmNPV (RecBmNPV-chiA --v-cath -)의 접종 후 경과일수에 따른 발현수준
상기 실시예 3에서 발현효율이 17% 정도 증가된 결과를 보인 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 재조합 BmNPV (RecBmNPV-chiA --v-cath -)의 접종 후 경과일수에 따른 발현수준을 대조구 바이러스인 재조합 BmNPV(RecBmNPV)와 비교하였다.
상기 실시예 3과 같은 방법으로 5령 1일째의 누에 유충에 RecBmNPV와 RecBmNPV-chiA --v-cath -를 각각 유충 당 1 × 105 p.f.u.를 주사하고, 1일 간격으로 누에 체액을 채취하여 체액 내 발현된 셀룰라제의 효소 활성을 조사하여 접종 후 경과일수에 따른 발현수준을 비교하였다. 효소 활성은 1일 간격으로 채취된 각각의 체액에 실시예 3과 같이 0.1 M 아세테이트(acetate) 완충액 (pH 6.0)에 2% (w/v) 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose)가 포함된 기질용액을 섞어 50℃에서 1시간 동안 처리한 후 디니트로살리실릭 리에이전트(dinitrosalicylic reagent) 방법[Miller, Anal. Chem., 31: 426-428 (1959)]에 의해 활성을 조사하였다.
그 결과, 도 4a에서 볼 수 있는 바와 같이 발현 수준은 대조구인 RecBmNPV에서 발현된 셀룰라제 활성에 비해 RecBmNPV-chiA --v-cath -에서 접종 후 3일에 10%, 4일에 12%, 5일에 17% 증가되었다. 특히 대조구인 RecBmNPV의 경우 접종 후 4일에 체액 ml 당 2894 유니트(U), 5일에 2899 U로 뚜렷한 증가를 보이지 않는 반면, RecBmNPV-chiA --v-cath -에서는 접종 후 4일에 3241 U, 접종 후 5일에 3392 U로 발현수준에 있어서 뚜렷한 차이를 보여, 바이러스가 코드하고 있는 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자의 결핍에 따른 발현수준의 증대효과를 나타내고 있다.
한편, 도 4b는 RecBmNPV-chiA --v- cath -의 접종 후 경과일수에 다른 누에 체액에서 발현된 셀룰라제의 웨스턴 블랏(Western blot) 분석 결과이다. 웨스턴 블랏 분석을 위해 우선 접종 후 1일 간격으로 채취된 체액 0.5 ㎕를 Laemmli 방법 [Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970)]에 따라 10% 에스디에스 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행한 뒤, Towbin 등[Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354 (1979)]의 방법에 따라 겔로부터 단백질 시료를 20% 메타놀(methanol)에 25 mM의 트리스(Tris)와 192 mM의 글리신(glycine)이 포함된 pH 8.3의 전이완충용액을 이용하여 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 전이시키고, 1% 비에스에이(Bovine Serum Albumin; BSA) 용액에서 2시간 동안 처리한 후, 생쥐에서 제작된 셀룰라제 항체[Lee et al., Comp. Biochem. Physiol. B, 139: 107-116 (2004)]를 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 그 후 2차 항체[anti-mouse IgG horseradish peroxidase (HRP) conjugated]와 에이치알피-스트렙타비딘 복합체 (HRP-streptavidin complex)를 결합시키고, ECL 검출 시약(Amersham Pharmacia Biotech사) 처리 후 X-ray 필름에 조사하였다.
그 결과, 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이 도 4a에서 보여진 셀룰라제 활성의 증가와 마찬가지로, RecBmNPV-chiA --v-cath -에 의해 발현된 셀룰라제가 누에 체 액에 분비되어 증가함을 웨스턴 블랏 분석에서 단백질 밴드(band)의 시그날(signal) 증대로 확인되었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 단백질분해효소 및/또는 키틴분해효소가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스들은 누에 생체에서 외래단백질의 대량생산 등에 유용하게 이용될 수 있다.
<110> JIN, byungrae <120> Recombinant bombyx mori nyclear polyhedrosis virus lacking the virus-encoded chitinase or cathespsin genes <130> YPD/200603-0050 <140> 10-2006-0030999 <141> 2006-04-05 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-primer <400> 1 aacgcgtttg tgtgcgcttt 20 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-primer <400> 2 caccaatccg ccggcacaca caccag 26 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1-primer <400> 3 atgttgtaca aattgttaaa cgttttg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1-primer <400> 4 ttacagttca tctttaggtt taaactg 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2-primer <400> 5 ggaaacggcg accaccaacc acaa 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2-primer <400> 6 ttaataaatg actgcagtag acgc 24

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 1) 셀룰라제 유전자를 발현하는 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV)를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계　１）의 재조합 바이러스(RecBmNPV)로부터 단백질분해효소(cathepsin: v-cath) 및 키틴분해효소(chitinase: chiA) 유전자를 포함하는 4.3kb DNA 절편을 PCR 증폭하고, 이 PCR 산물을 pGemT 벡터에 클로닝하여 전이벡터(pGemT-chiA-v-cath)를 제조하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 전이벡터(pGemT-chiA-v-cath)를 제한효소 Xbal과 Xhol로 처리하여 단백질분해효소(v-cath) 유전자를 제거하고 초록색형광단백질(GFP) 유전자로 대체하여 재조합 전이벡터(pGemT-chiA-GFP)를 제조하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 재조합 전이벡터(pGemT-chiA-GFP)와 상기 1)의 재조합 바이러스(RecBmNPV)를 누에 세포주(Bm5)에 동시전이(co-transfection)시켜 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질분해효소 유전자가 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV-v-cath -)의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 1) 셀룰라제 유전자를 발현하는 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV)를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계　１）의 재조합 바이러스(RecBmNPV)로부터 단백질분해효소(cathepsin: v-cath) 및 키틴분해효소(chitinase: chiA) 유전자를 포함하는 4.3kb DNA 절편을 PCR 증폭하고, 이 PCR 산물을 pGemT 벡터에 클로닝하여 전이벡터(pGemT-chiA-v-cath)를 제조하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 전이벡터(pGemT-chiA-v-cath) 중 단백질분해효소(v-cath) 유전자는 제한효소 Xbal과 Xhol로 처리하여 초록색형광단백질(GFP) 유전자로, 키틴분해효소(chiA) 유전자는 제한효소 KpnI과 SmaI로 처리하여 루시페라제(Luci) 유전자로 동시에 대체하여, 재조합 전이벡터(pGemT-Luci-GFT)를 제조하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 재조합 전이벡터(pGemT-Luci-GFT)와 상기 1)의 재조합 바이러스(RecBmNPV)를 누에 세포주(Bm5)에 동시전이(co-transfection)시켜 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 재조합 바이러스를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질분해효소 및 키틴분해효소 유전자가 동시에 결핍된 재조합 누에 핵다각체병 바이러스(RecBmNPV-chiA --v-cath -)의 제조방법.
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