KR20200114256A

KR20200114256A - 외래단백질의 발현량과 발현시간이 증대된 배큘로바이러스

Info

Publication number: KR20200114256A
Application number: KR1020190035666A
Authority: KR
Inventors: 곽원석; 김현수; 우수동
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-10-07
Also published as: KR102272651B1

Abstract

본 발명은 외래 단백질을 본래의 형태로 장기간 과발현하기 위한 새로운 배큘로바이러스 박미드(Bacmid) 및 이를 이용한 외래 목적 단백질의 증대된 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 배큘로바이러스는 병원력이 감소된 박미드(Bacmid)를 이용하여 예방 또는 치료적 가치가 높은 외래 유용 단백질의 고유한 형태로 발현 가능함으로써 생물적 활성이나 발현량을 증대시키므로 곤충 및 곤충세포에서 예방 또는 치료목적의 항원 등의 유용 단백질을 저비용 및 고효율로 생산할 수 있다.

Description

외래단백질의 발현량과 발현시간이 증대된 배큘로바이러스{Baculovirus with increased yield of foreign protein production}

본 발명은 외래 단백질을 본래의 형태로 장기간 과발현하기 위한 새로운 배큘로바이러스 박미드(Bacmid) 및 이를 이용한 외래 목적 단백질의 증대된 생산 방법에 관한 것이다.

배큘로바이러스 발현 시스템(Baculovirus Expression System; BES)은 핵다각체병 바이러스(Nucleopolyhedrovirus; NPV)의 강력한 p10 유전자 프로모터(promoter) 또는 다각체 단백질 유전자 프로모터(polyhedrin gene promoter)를 이용하는 발현 시스템이다.

BES는 외래단백질(foreign protein)의 발현 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 고등 진핵세포인 곤충세포를 이용함으로써 발현된 외래 단백질의 생물학적 및 면역학적 활성이 뛰어나기 때문에, 대장균(E. coli), 효모(yeast), 포유동물세포(mammalian cell) 등을 이용하는 다른 발현 시스템에 비해 여러 가지 면에서 많은 장점을 가지고 있어 크게 주목받고 있다.

곤충세포에서 외래 단백질을 발현시키는 경우, 대장균 발현시스템과 유사한 수준까지 단백질을 대량 생산할 수 있고, 당부가(glycosylation), 아실화(acylation), 이황화결합(disulfide bond formation)과 같은 번역 후 수정과정(post-translational modification process)이 효과적으로 이루어져 대장균과 효모를 숙주세포로 이용한 경우와는 달리 천연형 단백질(native protein)과 유사한 정도의 생물학적 활성을 갖는 외래 단백질을 대량으로 얻을 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.

한편 포유동물세포를 사용하는 재조합 단백질 생산 방법은 인간 의약품으로서 치료적 가치가 높은 단백질을 얻을 수 있지만, 포유동물 세포의 배양 및 유지를 위해 포유동물 유래의 각종 호르몬과 생장조절물질이 다량으로 필요하므로 상당한 비용이 요구된다는 문제점이 있다.

그러나 곤충 세포를 이용하는 경우에는 포유 동물세포와 유사한 번역 후 수식과정이 이루어짐에도 저비용으로 재조합 단백질을 생산할 수 있어 더욱 경제적인 단백질 생산 방법으로 알려져 있다.

또한, 다른 발현계에 비해 가장 효율적으로 다중유전자발현(multiple gene expression)이 가능하여 다양한 단백질의 동시발현이 요구되는 바이러스 유사입자(virus-like particle)의 제작 및 생산에 널리 이용되고 있다.

현재 곤충 세포를 이용한 BES는 오토그라파켈리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica NPV; AcNPV)와 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori NPV; BmNPV)를 이용하는 두 가지 발현 시스템이 대표적이다.

하지만, BES에서 주로 이용하는 다각체 단백질 유전자 프로모터는 유용 단백질의 종류에 따라 발현수준이 다르게 나타나며, 대부분 본래 다각체 단백질 유전자 프로모터에 의해 발현되는 다각체 단백질(polyhedrin)보다 낮은 수준으로 발현된다는 단점이 있어, BES의 기술적 한계점으로 지적되고 있다.

이와 같은 한계를 극복하기 위하여 BES의 주요 구성 요소인 벡터(vector), 배큘로바이러스 게놈(genome), 세포주에 대한 개량이 이루어지고 있으며 특히, 비교적 조작이 쉬운 벡터의 개량에 대한 연구가 가장 활발히 이루어져 왔다.

주로 바이러스의 생활사 마지막 단계에 폭발적으로 전사활성을 나타내는 프로모터인 다각체 단백질 유전자 프로모터 또는 p10 유전자 프로모터와 같이 매우 느린 유전자의 프로모터(very late gene promoter)를 이용한 개량이 대부분이었다.

하지만, 병원성 바이러스라는 배큘로바이러스의 특성으로 인해 이러한 프로모터를 이용할 경우, 유용 단백질이 충분히 발현되지 못한 체 숙주 또는 숙주세포가 사멸에 이르게 되어 실제 유용 단백질의 생산량 및 생산된 단백질의 번역 후 변형과정이 기대만큼 이루어지지 못한다는 문제점이 제기되고 있다.

(001) 대한민국 등록 특허 KR 10-0353475 (002) 대한민국 등록 특허 KR 10-1812250

이에 본 발명자들은 배큘로바이러스의 게놈으로부터 병원성 인자 중 하나인 p10 유전자 및 다각체 단백질 유전자 프로모터와 전사인자를 경쟁적으로 공유하는 p10 유전자 프로모터를 제거하여 목적 유용 단백질의 발현량과 세포의 생존 시간이 증대되는 효과를 확인하였으며, 여기에 배큘로바이러스의 또 다른 병원성 인자인 키티나아제(chitinase)와 시스테인 단백질 가수분해 효소(v-cath)를 추가 제거함으로서 유용 단백질의 생산량과 세포의 생존시간이 대폭 증대되는 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 p10 유전자 프로모터 및 p10 유전자가 결실되어 외래 목적 단백질의 생산량 및 발현시간이 증대된 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 p10 유전자 프로모터, p10 유전자, 배큘로바이러스의 키티나아제(chitinase) 및 시스테인 단백질 가수분해 효소(v-cath)가 결실되어 외래 목적 단백질의 생산량 및 발현시간이 증대된 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 p10 유전자 프로모터 및 p10 유전자가 결실된 재조합 전이 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및 상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(Bacmid)를 곤충 또는 곤충세포에 도입하는 단계를 포함하는 외래 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 p10 유전자 프로모터, p10 유전자, 배큘로바이러스의 키티나아제(chitinase) 및 시스테인 단백질 가수분해 효소(v-cath)가 결실된 재조합 전이 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및 상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(Bacmid)를 곤충 또는 곤충세포에 도입하는 단계를 포함하는 외래 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 배큘로바이러스는 병원력이 감소된 박미드(Bacmid)를 이용하여 예방 또는 치료적 가치가 높은 외래 유용 단백질의 고유한 형태로 발현 가능함으로써 생물적 활성이나 발현량을 증대시키므로 곤충 및 곤충세포에서 예방 또는 치료목적의 항원 등의 유용 단백질을 저비용 및 고효율로 생산할 수 있다.

도 1은 Bm5 세포에서의 상동 재조합에 의한 BmBacmid-Δp10 system을 제작한 모식도이다.
도 2는 PCR에 의해 BmBacmid-Δp10 및 BmBacmid-Δpcc의 구축을 확인한 사진이다:(A)ORF1629 영역 PCR;(B) 헬퍼 플라스미드 검출을 위한 전위효소 유전자 PCR;(C)Mini-F 레플리콘 영역 PCR;(D)p10 영역 PCR;(E)키티나아제 및 시스테인 프로테아제 유전자 영역 PCR.
도 3은 BmBacmid-Δp10의 DH10B 세포로의 전기천공 후 LB 플레이트상에 형성된 콜로니를 나타낸 사진이다.
도 4는 야생형 바큘로 바이러스 BmNPV-K1 및 변형된 Bacmids의 모식도이다:
(A)BmNPV-K1;(B)BpBacmid;(C)BmBacmid-Δp10;(D)BmBacmid-Δpcc.
도 5는 배큘로 바이러스 게놈에서 키티나아제와 시스테인 프로테아제 유전자의 배열에 대한 모식도이다.
도 6은 람다 재조합 시스템을 이용한 BmBacmid의 변형후의 BmBacmid-Δpcc system을 제작한 모식도이다.
도 7은 람다 재조합 시스템을 통한 BmBacmid-Δpcc의 제조후 pREDGm의 회복(curing)
pREDGm의 경화 후, 콜로니를 LB 플레이트 A 및 LB 플레이트 B에서 복제,
(A)카나마이신, 클로람페니콜, 테트라 사이클린 및 겐타 마이신을 함유하는 LB 플레이트;(B)카나마이신, 클로람페니콜 및 테트라 사이클린을 함유하는 LB 플레이트.
도 8은 배양 1 내지 12일째에 rBm-p6.9v-EGFP-wt(wt), rBm-p6.9v-EGFP-Δp10(Δp10), rBm-p6.9v-EGFP Δpcc)로 감염된 Bm5 세포의 감염된 형광 현미경 사진이다.
도 9는 EGFP의 형광 강도를 나타낸 그래프이다:
Bm5 세포를 각각의 재조합 바이러스로 M.O.I. 5 마리가 감염 후 1 일에서 12 일 사이에 수확됨, 형광 분광계를 사용하여 세포 추출물의 형광 강도를 측정하였음, 막대는 평균±SE(n=3)를 나타냄, wt, rBm-p6.9v-EGFP-wt; Δp10, rBm-p6.9v-EGFP-Δp10; Δpcc, rBm-p6.9v-EGFP.
도 10은 WT BmNPV-K1 및 변형된 BmBacmids의 BV 성장 곡선의 비교한 그래프이다.
도 11은 WT BmNPV-K1 또는 변형된 BmBacmid 바이러스로 감염된 Bm5 세포의 생존률의 사이를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 발현 벡터의 개량과 함께 배큘로바이러스 자체에 존재하며 재조합 단백질 발현효율 및 안정성에 영향을 미칠 뿐만 아니라 숙주에 병원성을 나타내는 유전자의 제거를 위해 배큘로바이러스의 게놈 또한 개량하였다. 재조합 단백질의 발현에 이용되는 주요 프로모터인 polyhedrin promoter와 함께 very late promoter에 속하며 전사인자를 공유한다고 알려져 있는 p10 유전자 및 그 프로모터의 제거를 통해 재조합 단백질의 생산량 증대 및 숙주세포의 생존률 향상을 확인하였다.

또한, 재조합 단백질의 분해를 야기함으로써 안정성 저하를 통해 생산량을 감소시키는 시스테 인단백질 가수분해 효소(cysteine protease, V-cath)와 숙주에 병원성 인자로 작용하며, 소포체 수송 억제 유전자로 알려진 키티나아제(chitinase) 유전자의 제거를 통해 재조합 단백질의 생산량을 증대시켰을 뿐만 아니라 바이러스 감염세포의 사멸을 지연시켜 재조합 단백질의 생산 시간 또한 증대시켰고, 5령 누에 유충에서도 생존시간을 매우 증대시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 세포 생존률의 증대에 따라 재조합 단백질의 생산 시간을 연장시킴으로써 기존에 비해 더 높은 수율을 기대 할 수 있을 것으로 여겨지며, 특히 구조단백질의 발현 후 조립(assembly) 및 세포의 세포막을 둘러싸고 방출되는 외막형 바이러스(envelpoed virus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle :VLP)생산에 매우 유용한 도구가 될 수 있다.

본 발명은 p10 유전자 프로모터 및 p10 유전자가 결실되어 외래 목적 단백질의 생산량 및 발현시간이 증대된 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.

상기 p10 유전자 프로모터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것이다.

상기 p10 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것이다.

상기 배큘로바이러스의 키티나아제(chitinase)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되고, 서열번호 5의 아마노산 서열로 표시되는 것이다.

상기 시스테인 단백질 가수분해 효소(v-cath)는 서열번호 6의 염기서열로 표시되고, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 벡터는 p10 유전자 프로모터를 이용하여 다각체 단백질을 발현하는 봉입체 형성(occlusion body positive) 재조합 BmNPV를 제작하는데 이용하는 BpGOZA 박미드(bacmid)를 기반으로 하여 Bac-to-Bac system을 도입한 BpBacmid의 바이러스 DNA와 p10 유전자 프로모터의 상류영역 서열부터 p10 유전자의 하류영역까지 서열 중 p10 유전자 프로모터 및 그 유전자가 제거된 재조합 전이벡터 BmBacmid-Δp10를 제작할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 곤충은 누에나방(Bombyx mori), 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 및 벌집나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) 또는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예 있어서, 상기 벡터는 배큘로바이러스의 시스테인단백질가수분해 효소 유전자 및 키티나아제 유전자는 lef-7 유전자의 ORF(open reading frame)와 gp64 유전자의 ORF 사이에 존재하며 41내지 122 bp의 짧은 서열의 양방향성 프로모터를 중심으로 하여 서로 반대방향으로 존재한다(Michale, 2011). 따라서 lambda red recombination system을 이용하여 시스테인 단백질 가수분해 효소 유전자 및 키티나아제 유전자를 동시에 제거할 수 있으며, 키티나아제 유전자의 주변 유전자인 lef-7의 예상 프로모터 서열과 시스테인단백질가수분해 효소 유전자의 주변 유전자인 gp64의 poly A 서열에 손상이 되지 않도록 제거 위치를 설정한 뒤 이들 유전자를 제거하여 BmBacmid-Δpcc를 제작할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

< 실시예 1> 재료 및 방법

<1-1> 바이러스 및 세포주

Bombyx mori의 난소에서 유래한 세포주인 Bm5 세포는 TC-100 insect medium(Welgene, Korea)에 fetal bovine serum(FBS)(Welgene, Korea)을 10% 첨가하여 27℃ 항온기에서 정치배양하며 실험에 사용하였다. trypan blue 염색을 통하여 세포를 계수하였고, 계대배양은 세포배양용 T-25 플라스크(25 cm²)당 2.0 × 106 세포로 하여 4일 간격으로 재분주하였다. 곤충 바이러스는 한국에서 분리된 야생주(wild type)로써 BmNPV-K1 strain을 Bm5 세포에 접종하여 증식 후 실험에 사용하였다.

<1-2> 재조합 BmNPV 제작

재조합 전이벡터를 DH10BmBac 또는 DH10Bm-ΔP10 또는 DH10Bm-ΔPCC competent 세포 내로 형질전환시키고, DH10BmBac 및 DH10Bm-ΔP10의 경우 gentamicin(10 μg/mL), kanamycin(40 μg/mL), tetracycline(10 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate, DH10Bm-ΔPCC의 경우 chloramphenicol(30 μg/mL), gentamicin(10 μg/mL), kanamycin(40 μg/mL), tetracycline(10 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate를 이용하여 24시간 이상 37℃에서 암배양 후 하얀색 콜로니를 선별하여 배양하고 PureLink® HiPure Plasmid Miniprep Kit(ThermoFisher, USA)를 이용하여 추출하였다. LacZ 유전자 내 att-Tn7으로 목적 유전자의 전이를 확인하기 위하여 AccuPower® ProFi Taq PCR Premix(Bioneer Co., Daejeon, Korea)와 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

프라이머	서열번호	서열
M13F(-40)	8	5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’
M13R(-40)	9	5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’

<1-3> 재조합 BmNPV 순화

재조합 BmNPV의 순화는 plaque assay(O’Reilly et al., 1992) 방법으로 수행하였다. Bm5 세포를 2.0×10⁶개로 60 mm dish(SPL Co. Ltd., Pocheon, Korea)에 분주하고, 재조합 BmNPV의 생성이 확인된 세포배양 배지를 10^-4 ∼ 10^-6으로 희석하여 접종 후 4시간 동안 정치배양 하였다. 이후, 5% SeaPlaque^ⓡAgarose(Lonza, Basel, Switzerland)를 멸균하여 녹인 후, 45℃ water bath에서 정치시키고 세포배양 배지와 혼합하여 최종적으로 0.5% agarose가 되도록 준비하였다. 4시간의 바이러스 접종 후, 접종액을 완전히 제거하고 준비한 agarose gel을 감염 세포 위에 3 mL씩 overlay한 뒤 27℃에서 배양하며 3일 후부터 plaque의 생성유무를 관찰하였다. 생성된 plaque은 마이크로피펫(micropipette)을 이용하여 분리한 후 세포배양 배지 100 μL에 첨가하고 vortexing하여 혼합액을 24 well plate에 접종하였다. 접종 3일 후, 재조합 바이러스의 생성이 확인된 세포를 수거하여 바이러스 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 재조합 바이러스의 순수성을 확인하였다. 바이러스의 순수성을 확인하기 위한 PCR은 목적 유전자가 전이되는 위치에서 표 1의 프라이머를 이용하여 삽입을 확인하였다.

<1-4> 배큘로바이러스 정량

순수성이 확인된 재조합 바이러스의 역가(titer)를 end-point dilution assay(TCID50) 방법을 사용하여 측정하였다. 96 well plate에 2.0×10⁴ cell/90 μL의 곤충 세포를 분주하고, 바이러스 배양액을 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8 농도로 희석한 후, 각 희석 농도의 바이러스 접종액을 12개의 well에 10 μL씩 접종하여 27℃에서 5일 배양한 후, 위상차 현미경을 이용하여 감염된 well 개수와 감염되지 않은 well 개수의 비율로부터 mL당 p.f.u.(plaque forming unit)을 계산하였다.

<1-5> 배큘로바이러스 DNA 추출

바이러스 DNA의 분리를 위해 각 재조합 바이러스에 감염된 세포를 1,000 × g로 5분 동안 원심분리하여 상층액에 존재하는 BV를 수거하고 20% PEG solution(20% Polyethylene Glycol 8000, 0.5M NaCl)을 1:1 Volume으로 혼합하여 ice에서 30분 정치하고 10,000×g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 침전된 BV를 얻었다. 그 후 500 μL의 lysis buffer(50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 5% β-mercaptoethanol, 4% SDS, pH 8.0)를 첨가하여 15초간 vortexing하고 상온에서 10분간 방치하였다. 그 후, 12,000×g으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하고, phenol과 isoamyl alcohol(IAA) 처리 과정을 수행하였다. 3 M sodium acetate를 최종 부피의 1/10로, 99% 냉에탄올을 2배 부피로 첨가하여 -70℃에서 30분간 방치한 후, 12,000×g으로 15분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 70% ethanol로 세척하고 건조한 뒤 멸균수에 녹여서 실험에 이용하였다.

<1-6> SDS-PAGE 및 Western blot analysis

각 재조합 BmNPV가 접종된 Bm5 세포를 1,000 × g로 5분 동안 원심분리하여 침전된 세포를 수거하고 PBS로 세척하였다. 세포 침전물은 세포 침전물은 0.1 % PBS-T buffer(PBS with 0.1 % Triton X-100)에 부유시키고 protease inhibitor cocktail(Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)을 최종부피의 1%가 되게 첨가하고 얼음에 30분간 방치 후, 5X SDS-PAGE loading sample buffer(312.5 mM Tris-HCl, 50% glycerol, 5% β-mercaptoethanol, 10% SDS, 0.1 % bromophenol blue, pH 6.8)를 첨가하여 100℃에서 10분간 가열하고 12,000 × g에서 10분간 원심분리하여 시료를 제작하였다. SDS-PAGE 시료는 10 %와 12 % SDS-polyacrylamide gel에서 125V의 전압에서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, gel은 Coomassie brilliant blue solution(1 g coomassie brilliant blue, 450 mL methanol, 100 mL glacial acetic acid with 450 mL distilled water)으로 상온에서 1시간 동안 염색하고, destaining solution(400 mL methanol, 100 mL glacial acetic acid with 500 mL distilled water)으로 탈색하여 관찰하였다. Western blot analysis를 위하여 SDS-PAGE gel을 nitrocellulose membrane(Pall Corp, New York, USA)에 15V의 전압으로 1시간 동안 transfer하였고, blocking을 위하여 TBS-T(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20, pH 7.4)에 녹인 5% skim milk를 1시간 처리하였다. EGFP에 특이적인 anti-GFP 항체(Cell signaling, USA)는 TBS-T에 희석하여 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-mouse IgG) 또한 TBS-T에 희석하여 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 최종적으로 membrane에 Western HRP substrate(Merck Millipore, Burlington, USA)를 처리하고 Azure c300 Western Blot Chemiluminescent Blot Imaging System(Azure biosystem, Dublin, USA)으로 이미지를 촬영하여 특이적인 밴드를 관찰하였다.

<1-7> 형광 현미경 관찰

재조합 BmNPV에 의한 형광단백질의 발현 확인을 위해 형광현미경 Sundew MCX1600(micros, Sankt Veit an der Glan, Austria)을 사용하여 관찰하였다. 녹색형광단백질 EGFP는 488㎚에서 최고의 파장과 510㎚에서 최고의 방출파장을 나타내며 형광현미경상에서 방출되는 청색광(Max 470㎚)이 녹색광(510㎚)으로 변환되어 형광을 관찰할 수 있었다. 형광현미경 관찰 후 INFINITY software Program을 이용하여 발현된 형광사진을 촬영하였다.

<1-8> 형광 광도 측정

EGFP 과발현 재조합 BmNPV를 5 M.O.I.로 접종 한 Bm5 세포를 1일부터 6일까지 24시간 간격으로 수거한 뒤 1000×g로 5분 동안 원심분리하여 phosphate buffed saline(PBS)으로 세척하였다. 침전된 세포에 RIPA buffer를 1mL 첨가하고 얼음에 30분간 방치 후 2mL의 PBS를 첨가하였다. 측정시료는 최소 3mL을 사용하고 488㎚의 excitation filter와 510㎚의 emission filter에서 K2™ fluorescence spectrometer(ISS inc., USA)로 형광 광도를 측정하였다.

<1-9> p10 promoter 및 유전자 제거

배큘로바이러스의 p10 promoter 및 유전자의 제거를 위해 p10 promoter 상류

500bp 영역은 배큘로바이러스 DNA를 주형으로 AccuPower® ProFi Taq PCR Premix(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 하기 표 2의 p10-5'-F와 p10-5'-R를 10 pmole 첨가하였고, 반각응 용액의 최종 부피는 멸균수를 사용하여 20 μL로 맞춘 후 Thermal Cycler(TaKaRa, Kusatsu, Japan)로 PCR을 수행하였다. pMD20-T vector(TaKaRa, Kusatsu, Japan)로의 클로닝은 이전의 실험과 동일한 방법으로 수행하였다.

pMD20-T vector(TaKaRa, Kusatsu, Japan)에 클로닝된 p10 promoter 상류 500 bp 영역을 제한효소(Kpn I/Hind III)을 이용하여 pBlueScript II SK(+) 벡터에 ligation 반응 후 DH5α competent 세포 내로 형질전환 시키고 ampiciline이 처리된 LB plate에서 배양하였다. 콜로니를 선발하여 ampiciline이 첨가된 LB medium에서 배양 후 재조합 플라스미드를 추출한 뒤, pBlue-p10-5'으로 명명하였다. 그 후 p10 유전자 하류 500 bp 영역은 하기 표 2의 p10-3'-F와 p10-3'-R를 10 pmole 첨가하였고, 반응 용액의 최종 부피는 멸균수를 사용하여 20 μL로 맞춘 후 Thermal Cycler(TaKaRa, Kusatsu, Japan)로 PCR을 수행하였다. pMD20-T vector(TaKaRa, Kusatsu, Japan)로의 클로닝은 이전의 실험과 동일한 방법으로 수행하였다. pMD20-T vector(TaKaRa, Kusatsu, Japan)에 클로닝된 p10 유전자 하류 500 bp 영역을 제한효소(Pst I/Spe I)을 이용하여 pBlue-p10-5' 벡터에 ligation 반응 후 DH5α competent 세포 내로 형질전환시키고 ampiciline이 처리된 LB plate에서 배양하였다. 콜로니를 선발하여 ampiciline이 첨가된 LB medium에서 배양 후 재조합 플라스미드를 추출한 뒤, pBm101-ΔP10으로 명명하였다. 제작된 모든 재조합 플라스미드는 COSMOgenetech(Daejeon, Korea)사에 의뢰한 염기서열 분석을 통해 서열을 최종 확인하였다.

제작된 pBm101-ΔP10 500 ng와 BpBacmid DNA(Lee, 2018) 100 ng을 100 μL의 TC-100 insect medium(Welgene, Korea)에 혼합하고, transfection reagent인 Cellfectin II(Invitrogen, Carlsbad, USA) 8 μL를 medium에 첨가하여 각각의 혼합액(mixture)을 재혼합하여 27℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 6well plate에 1×10⁶cell/mL로 분주된 Bm5 세포에 접종하여 동시 형질주입(co-transfection)하였다. 접종 3일 후부터 위상차 현미경을 이용하여 재조합 BmNPV의 감염 양상을 확인하였으며, 이전의 실험과 동일한 방법으로 plaque assay를 수행하여 다각체가 형성되지 않는 배큘로바이러스의 plaque를 선발하여 실험에 이용하였다.

프라이머	서열번호	서열
p10-5'-F	10	5' - GGT ACC TGT CAT TTA TTA ATT TGG ATG A - 3'
p10-5'-R	11	5' - AAG CTT TTA ACT ATA ATA TAT TGT GTT GGG T- 3'
p10-3'-F	12	5' - CTG CAG ATG AAT CGT TTT TAA AAT AAC A - 3'
p10-3'-R	13	5' - ACT AGT GAA GAA CAC ACG ATC ATG G - 3'

<1-10> Bacmid 제작

배큘로바이러스의 chitinase 유전자 및 cystein protease(v-cath)유전자의 제거를 위하여, red recombinase를 발현하는 pREDKI(addgene #51626)에 gentamicin 저항성 유전자를 도입하여 pREDGm을 제작하였다. 그 후 DH10Bm-ΔP10 competent 세포 내로 형질전환 시키고 gentamicin(10 μg/mL), kanamycin(40 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate를 이용하여 24시간 이상 30℃에서 암배양 후 파란색 콜로니를 선별하여 배양한 다음, araBAD promoter의 induction을 통한 red recombinase의 발현을 위해 L-arabinose가 0.1 M 첨가된 SOB 배지를 이용하여 30℃에서 OD600= 0.6 a.b.s.까지 배양 후 electro-competent cell을 제작하였다. 제거 대상 유전자의 ORF를 파괴하고 chloramphenicol 저항성 유전자와 promoter를 삽입하기 위해 pIDC 플라스미드로부터 AccuPower® ProFi Taq PCR Premix(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 표 3의 Cm-F primer와 Cm-R primer를 10 pmole 첨가하였고, 반응 용액의 최종 부피는 멸균수를 사용하여 20 μL로 맞춘 후 Thermal Cycler(TaKaRa, Kusatsu, Japan)로 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 pMD20-T vector(TaKaRa, usatsu, Japan)로의 클로닝을 통해 pMD20-CmR을 제작하였다. 그 후 배큘로바이러스의 DNA에서 AccuPower® ProFi Taq PCR Premix(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 표4의 Chitinase-F primer와 Cystein-R primer를 10 pmole 첨가하였고, 반응 용액의 최종 부피는 멸균수를 사용하여 20 μL로 맞춘 후 PCR을 수행하였다. PCR 산물은 pMD20-T vector(TaKaRa, Kusatsu, Japan)로의 클로닝을 통해 pMD20-CC를 제작하였다. pMD20-CC에 제한효소(Aat II/Apa I)을 이용하여 벡터를 제작하고 pMD20-CmR으로부터 동일한 제한효소를 처리하여 얻은 chloramphenicol 저항성 유전자와 promoter 서열을 ligation 반응하였다. Ligation 반응 후 DH5α competent 세포 내로 형질전환 시키고 chloramphenicol이 처리된 LB plate에서 배양하였다. 콜로니를 선발하여 chloramphenicol이 첨가된 LB medium에서 배양 후 재조합 플라스미드를 추출한 뒤, pMD20-Partial-CC-CmR으로 명명하였다. 그 후 pMD20-Partial-CC-CmR에서 AccuPower® Pfu PCR PreMix(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 표 3의 Chitinase-F primer와 Cystein-R primer로 하여 PCR을 수행하였다. PCR을 통해 얻어진 부분 절단된 chitinase 유전자와 cysteine protease 유전자 사이에 chloramphenicol 저항성 유전자와 promoter를 포함하는 PCR 산물 0.5μg을 pREDGm을 가지는 DH10Bm-ΔP10세포에 2.8 kV 전압으로 전기천공법(electroporation)을 통해 형질전환 하였다. 그 후 SOC배지를 이용하여 37℃에서 4시간 배양 후 chloramphenicol(5 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate를 이용하여 24시간 이상 37℃에서 암배양 후 파란색 콜로니를 선별하였다. Bacmid DNA에서 제거대상 유전자들의 ORF 파괴 및 chloramphenicol 저항성 유전자와 promoter의 삽입 여부는 표 3의 Chitinase-F와 Cystein-R을 이용한 PCR을 통해 재검정 하였다.

프라이머	서열번호	서열
Cm-F	14	5' - GAC GTC ATA GAT CTG GGC CAA CTT TTG G -3'
Cm-R	15	5' - GGG CCC CAG GCG TTT AAG GGC ACC AAT AAC- 3'
Chitinase-F	16	5' - CTG CAG TTG AGC AAG TCG CCG TTA TCG GC- 3'
Cystein-R	17	5' - GAA TTC CGA CAA AAT CAC AAT CGA TCA TTT G - 3'

<1-11> Budded virus( BV ) 생산량 검정

6 well plate에 1×10⁶ cell/mL로 분주된 Bm5 세포에 각각의 BV를 5 M.O.I.로 1시간 동안 감염 후 새로운 배지로 교체해주었다. 그 후 6일차 까지 1일 간격으로 각 well의 세포를 수거하며 1,000×g, 4℃에서 5분간 원심분리 하여 상층에 존재하는 BV를 얻었다. BV의 역가 측정은 End-point dilution assay(TCID50) 방법을 이용하였다.

<1-12> 세포 생존율 검정

6 well plate에 1×10⁶ cell/mL로 분주된 Bm5 세포에 각각의 BV를 5 M.O.I.로 1시간 동안 감염 후 새로운 배지로 교체해주었다. 그 후 6일차 까지 1일 간격으로 각 well의 세포를 수거하여 Trypan blue 염색을 통해 세포 계수 및 생존률 측정을 수행하였다.

<1-13> 생물검정

배큘로바이러스 BV를 50 μL의 TC-100 배지에 1×10⁵ p.f.u.가 되도록 희석한 후 1 mL 주사기를 이용하여 10마리의 4령 누에에 주사 접종하였으며 음성 대조군의 경우 TC-100 배지만 주사 접종하였다. 그 후 평균 생존 시간을 확인하기 위해 1일 간격으로 생존 여부를 관찰하고 기록하였다. 실험은 총 3반복으로 수행하였다.

< 실시예 2> 재조합 단백질의 생산량 증대를 위한 새로운 BmBacmid 제작

<2-1> 유전자 제거를 통한 새로운 BmBacmid 제작

① p10 promoter 및 유전자가 제거된 BmBacmid - Δp10 제작

p10 promoter를 이용하여 polyhedrin을 발현하는 occlusion body positive 재조합 BmNPV를 제작하는데 이용하는 BpGOZA를 기반으로 하여 Bac-to-Bac system을 도입한 BpBacmid(Lee , 2018)의 바이러스 DNA와 p10 promoter의 상류영역 서열부터 p10 유전자의 하류영역까지 서열 중 p10 promoter 및 유전자가 제거된 재조합 전이벡터 pBm101-ΔP10을 Bm5 세포에 동시 형질주입(co-transfection) 후 감염양상을 확인하고 BV를 수거하였다. 그 후 plaque assay를 수행하고 현미경 관찰을 통해 다각체가 형성되지 않는 plaque를 선발하였다(도 1). 그 후 p10 promoter 및 유전자의 유무를 PCR을 통해 재검정 한 뒤(도 2), BmBacmid-Δp10을 제작 완료하였다. BmBacmid-Δp10 DNA를 DH10B electro-competent 세포에 형질전환 후 파란색 콜로니를 선발한 뒤(도 3) 배양하고, 이를 이용하여 electro competent 세포를 제작한 뒤 transposition helper plasmid인 pMON7124 로 형질전환 후 다시 파란색 콜로니 선발을 통해 배양하였다. 배양된 콜로니를 이용하여 ORF1629 영역(도 2A) helper plasmid 유무(도 2B), Mini-F 영역(도 2C), p10 유전자 영역(도 2D)에 대한 PCR 검정을 통해 BmBacmid-Δp10 및 helper plasmid의 존재 여부를 재검정하고 BmBacmid-Δp10에 대한 Bacmid system을 제작 완료 하였다(도 4).

② p10 promoter 및 유전자, cysteine protease(v- cath ) 및 chitinase가 제거된 BmBacmid-Δpcc 제작

배큘로바이러스의 cysteine protease 유전자 및 chitinase 유전자는 lef-7 유전자의 ORF와 gp64 유전자의 ORF 사이에 존재하며 41내지 122 bp의 짧은 서열의 양방향성 promoter를 중심으로 하여 서로 반대방향으로 존재한다(도 5). 따라서 lambda red recombination system을 이용하여 cysteine protease 유전자 및 chitinase 유전자를 동시에 제거할 수 있으며, chitinase 유전자의 주변 유전자인 lef-7의 예상 promoter 서열과 cysteine protease 유전자의 주변 유전자인 gp64의 polyA 서열에 손상이 되지 않도록 제거 위치를 설정한 뒤 이들 유전자를 제거하였다. Red recombinase를 발현하는 pREDGm을 DH10Bm-ΔP10 competent 세포 내로 형질전환시키고 파란색 콜로니를 선발한 뒤, 배양된 콜로니를 이용하여 electro competent 세포를 제작하였다. 그 후 cysteine protease 유전자 및 chitinase 유전자의 양방향성 promoter 및 유전자 서열을 제한효소(Aat II/Apa I) 처리를 통해 제거하고 chloramphenicol 저항성 유전자와 프로모터 서열을 삽입하여 제작한 pMD20-Partial-CC-CmR 으로부터 PCR을 통해 얻어진 산물을 형질전환한 뒤, chloramphenicol(5 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate에서 배양된 파란색 콜로니를 선발하고 PCR을 통해 cysteine protease 유전자 및 chitinase 유전자의 ORF 결손 여부를 재확인 하여(도 2) BmBacmid-Δpcc 제작 및 선발을 완료 하였다(도 6). 그 후 bacmid system의 완성을 위하여 pREDGm의 plasmid curing을 수행하였으며 chloramphenicol(5 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate 와 gentamicin(10 μg/mL), chloramphenicol(5 μg/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate에서 duplicate assay를 통해 gentamicin 배지에서 자라지 못하는 pREDGm이 제거된 콜로니를 선발한 뒤(도 7) PCR을 통해 재확인 하였다(도 2). 그 후 electro competent 세포를 제작한 뒤 transposition helper plasmid인 pMON7124를 형질전환 후 다시 파란색 콜로니 선발을 통해 배양하였다. 배양된 콜로니를 이용하여 PCR을 통해 BmBacmid-Δpcc 및 helper plasmid의 존재 여부를 재검정하고 BmBacmid-Δpcc에 대한 Bacmid system인 DH10Bm-Δpcc를 제작 완료하였다(도 6).

③ 재조합 단백질 생산 최적 BmBacmid 선발

p10 유전자 및 p10 유전자 promoter가 제거된 BmBacmid-Δp10과 여기에 cysteine protease와 chitinase가 추가 제거된 BmBacmid-Δpcc의 단백질 생산 효율 증대 효과를 검정하기 위하여 과발현 벡터 선발에서 가장 높은 발현량을 나타내었던 pBm-p6.9v-EGFP를 이용해 재조합 바이러스를 제작하였다. pBm-p6.9v-EGFP를 DH10BmBacmid(Lee, 2018), DH10BmBacmid-Δp10 및 DH10BmBacmid-Δpcc competent 세포에 형질전환시키고 배양액을 kanamycin, tetracycline, gentamicin, X-gal 및 IPTG가 처리된 LB plate에 도말하여 하얀색 콜로니를 선발하여 배양하였다 그 후 추가적인 순수분리를 위하여 동일한 조성의 LB plate에 streak을 진행한 뒤 배양하고 다시 하얀색 콜로니를 선발하였다. 하얀색 콜로니는 전이벡터의 목적유전자 서열이 BmBacmid의 LacZα-att Tn7으로 전이가 이루어지므로 LacZα의 발현이 불가능하며, 전이가 발생하지 않은 경우 LacZα의 정상적 발현으로 인해 파란색 콜로니를 형성한다. 따라서 최종 선별된 하얀색 콜로니를 배양한 뒤 재조합 BmBacmid DNA를 추출하였으며, 추출된 DNA의 목적 유전자에 의한 재조합 여부를 재확인하기 위해 LacZα서열 내에 존재하는 M13 F와 M13 R primer site를 이용한 PCR을 통해 재조합 여부를 최종 확인하였다. 전이가 발생하지 않은 경우 약 300 bp의 밴드를 형성하게 되며, 전이가 발생한 경우 Tn7 R에서 Tn7 L 사이의 서열에 300 bp가 추가된 크기의 밴드가 형성됨에 따라 pBm-p6.9v-EGFP에 대한 특이적 밴드가 관찰되어 정상적인 전이에 의한 재조합 BmBacmid가 제작되었음을 확인하였다. 그 후 각각의 재조합 BmBacmid DNA를 Bm5 세포내로 전이하고, 바이러스 감염 양상이 나타날 때까지 형광현미경을 통해 관찰한 뒤, 감염양상이 나타나는 세포의 배지를 수거하여 새로운 Bm5 세포에서 BV의 대량증식 과정을 거친 후 각각의 재조합 바이러스를 rBm-p6.9v-EGFP-wt, rBm-p6.9v-EGFP-Δp10, rBm-p6.9v-EGFP으로 명명하였으며, 역가 측정 후 실험에 이용하였다.

제작된 다양한 형태의 BmBacmid별 EGFP 발현증대 효과를 비교하기 위하여 Bm5 세포에 재조합 BmNPV를 접종하고 1일차부터 12일차 까지 1일 간격으로 형광 현미경 관찰을 수행하고 세포를 수거하여 형광광도 측정을 수행하였다. 형광현미경 관찰 결과 rBm-p6.9v-EGFP-wt에 감염된 Bm5 세포의 경우 감염 3일차에 가장 많은 수의 EGFP 발현 세포를 확인할 수 있었으며, 그 이후 시간이 지날수록 바이러스에 의한 세포 용해가 발생하였다. rBm-p6.9v-EGFP-Δp10에 감염된 Bm5 세포의 경우 감염 4일차에서 가장 많은 수의 EGFP 발현 세포를 확인할 수 있었으며 rBm-p6.9v-EGFP-wt에 비해 1일 이후 세포 용해가 나타났다. 따라서 p10 유전자 및 p10 유전자의 promoter 제거만으로도 Bm5 세포에 대한 바이러스의 병원력이 감소하였음을 확인하였다. rBm-p6.9v-EGFP에 감염된 Bm5 세포의 경우 다른 BmBacmid 형태와 달리 3-6일차에 매우 많은 수의 EGFP 발현 세포를 확인할 수 있었으며, 바이러스에 의한 세포 용해 또한 매우 느리게 발생하여 감염 12일차에도 많은 수의 세포에서 EGFP 발현을 확인할 수 있었다(도 8).

1일 간격으로 수거된 Bm5 세포를 이용한 형광광도 측정에서도 형광현미경 관찰결과와 유사하게 rBm-p6.9v-EGFP-wt에 감염된 Bm5 세포의 경우 감염 2일차까지 가장 빠르고 높은 활성의 EGFP를 확인할 수 있었으며, 3일차에서 EGFP 활성의 정점을 나타내었고 그 이후 세포 용해에 따른 급격한 EGFP의 활성 저하를 확인하였다(도 9). rBm-p6.9v-EGFP-Δp10에 감염된 Bm5 세포의 경우 1-2일차를 제외한 거의 모든 일차에서 대조군으로 이용된 rBm-p6.9v-EGFP-wt에 비해 높은 EGFP의 활성을 확인할 수 있었으며, 감염 4일차 이후 세포 용해에 따른 급격한 EGFP 활성 저하현상을 나타내어 약 1일의 세포 생존률 증대 효과를 확인하였다. p10 유전자 promoter의 제거를 통해 polyhedrin gene promoter와의 전사인자 경쟁 요인을 제거함으로써 polyhedrin gene promoter의 전사인자 독점으로 인해 약 3배 발현량 증대 효과가 나타난 것으로 여겨지며, 병원성 인자로 알려져 있는 p10 유전자의 제거를 통해 감염 세포의 생존률 증대 효과가 나타난 것으로 여겨진다(도 9). rBm-p6.9v-EGFP에 감염된 Bm5 세포의 경우 형광광도 측정 결과에서도 다른 BmBacmid 형태와 달리 매우 높은 수준의 EGFP 활성을 확인할 수 있었으며, 감염 12일 차에도 rBm-p6.9v-EGFP-wt의 3일차와 거의 유사한 활성 수준을 나타냈다. 모든 일차에서 다른 BmBacmid에 비해 월등히 높은 EGFP 활성을 나타내었으며, 특히 EGFP의 활성이 정점을 나타내는 5일차 결과와 rBm-p6.9v-EGFP-Δp10의 4일차 결과와의 비교에서 약 1.2배 상승률을 나타내었고, rBm-p6.9v-EGFP-wt의 3일차 결과와의 비교에서 약 3.2배 상승률을 나타냄으로써 단백질 발현효율 증진에 대한 cysteine protease 및 chitinase의 제거 효과를 확인할 수 있었으며, 감염 6일차 이후 세포의 용해가 발생하였으므로 rBm-p6.9v-EGFP-wt 대비 약 4일의 생존률 증대 효과를 나타내었다.

따라서 BmNPV의 p10/cysteine protease/chitinase를 제거한 형태의 BmBacmid에서 가장 높은 EGFP의 발현 및 세포 사멸의 지연을 확인함으로써 외래 유용 단백질의 생산에 가장 효율적인 BmBacmid 임을 확인하였다. 기존 AcMNPV의 p10/cysteine protease/chitinase를 제거한 형태의 bacmid의 경우 EGFP의 발현량 증대 효과는 확인하였지만, 오히려 p10의 제거를 통해 세포의 생존률이 감소하는 현상이 보고되었으나(Hitchman et al., 2010), 본 연구결과에서는 BmNPV의 p10/cysteine protease/chitinase 유전자의 제거를 통해 EGFP 발현량 및 세포의 생존률 모두 증대되는 효과를 처음으로 제시하였다(도 9).

< 실시예 3> 새로운 BmBacmid의 특성 분석

배큘로바이러스 발현 벡터 시스템의 목적 단백질 생산량을 증대시키기 위하여 BmBacmid로부터 p10 유전자 promoter 및 p10 유전자, cysteine protease 유전자 및 chitinase 유전자의 제거를 수행하였다. 최종적으로 완성된 BmBacmid-Δpcc은 야생형과 유사한 GOZA system을 이용한 재조합 BmNPV에 비해 약 3.2배 높은 수준의 재조합 단백질 생산량과 바이러스 감염 세포의 생존률이 약 48시간 지연되는 효과를 나타내었다. 따라서 이러한 효과들이 정상적인 바이러스의 증식에도 어떤 영향을 줄 수 있을 가능성에 대해 추가적으로 조사하였다. 이를 위해 BmBacmid-Δpcc의 정상적인 BV 증식 여부와 더불어, BmBacmid-Δpcc를 통해 제작된 재조합 BmNPV에 감염된 세포 및 유충의 일차별 생존률을 평가함으로써 재조합 단백질 발현을 위한 BmBacmid-Δpcc 시스템의 구축을 완료 하고자 하였다.

<3-1> BmBacmid 개량에 따른 BV 생산량 검정

① BmBacmid의 BV 생산에 대한 영향

제작된 다양한 형태의 BmBacmid별 BV 생산량을 비교하기 위하여 Bm5 세포에 재조합 BmNPV를 접종하고 24시간부터 144시간까지 24시간 간격으로 바이러스를 수거하여 일차별 BV의 생산량을 측정하였다. 대조군으로 이용된 야생주 배큘로바이러스인 BmNPV-K1의 경우 접종 72시간 차까지 급격한 BV의 생산을 통해 약 2 ×10⁸pfu/mL의 역가를 나타내었으며, 그 이후 96시간차에 역가의 정점을 나타낸 후 서서히 감소하는 양상을 나타내었다(도 10). 그 외 GOZA system을 이용한 재조합 BmNPV, BmBacmid-Δp10와 BmBacmid-Δpcc에 의한 각 재조합 BmNPV의 경우 대조군에 비해 약간 낮은 수준의 역가를 나타내었으나 72시간차까지 급격한 BV 생산량을 나타내었고, 그 이후 서서히 증가하는 추세를 나타내었다(도 10). 결국 감염 120시간차에 이르러 야생주와 거의 유사한 수준의 역가를 나타냄으로써 BmBacmid-Δpcc의 숙주세포에 대한 낮은 병원력은 BV의 생산량과는 무관하며 병원성 유전자의 제거에 의한 효과임을 확인하였다.

<3-2> BmBacmid의 병원력 검정

① Bm5 세포에 대한 병원력 검정

BmBacmid-Δp10, BmBacmid-Δpcc및 Vankyrin-1을 발현하는 BmBacmid-Δpcc-VV의 병원력 약화 및 세포의 생존률 증대 효과를 검증하기 위하여 야생주 배큘로바이러스인 BmNPV-K1에 감염된 세포 및 배큘로바이러스 비접종 세포와 비교 평가를 실시하였다. Bm5 세포에 각 바이러스를 접종하고 1일 간격으로 7일차까지 세포를 수거하여 trypan blue 염색을 수행하고, hemocytometer를 이용하여 Bm5 세포의 생존률을 측정하였다. 배큘로바이러스 비접종 세포인 Bm5 세포의 경우 6일차까지 약 90%대의 생존률을 나타낸 뒤 배양배지의 양분 고갈 및 증식 공간의 부족 등의 이유로 7일차부터 생존률 감소 현상을 나타내었다(도 11). BmNPV-K1에 감염된 세포의 경우 감염 3일차까지 약 90-80 %의 생존률을 나타낸 뒤 급격한 하락을 보였고 7일차에 20 % 미만의 생존률을 나타내었다(도 11). 또한, 야생주 배큘로바이러스와 거의 유사한 형태의 GOZA 바이러스 역시 BmNPV-K1과 매우 흡사한 양상을 보였다. 반면, BmBacmid-Δp10의 경우 이들 바이러스에 비해 더 늦은 6일차 까지 80% 이상의 생존률을 보인 뒤 급격히 하락하였다. 특히, BmBacmid-Δpcc 및 BmBacmid-Δpcc-vv의 경우 감염 6일차에 약 85%의 높은 생존률을 보였고 7일차에 약간의 하락을 나타냈으나 여전히 70% 이상의 높은 생존률을 보였다(도 11). 이러한 결과는 바이러스 비접종 세포의 7일차 생존률이 약 82%인 것을 감안할 때 매우 높은 생존률이며, BmNPV-K1에 비해서는 약 50% 높은 생존율이었다. 따라서 배큘로바이러스의 병원성 유전자인 p10 유전자 및 chitinase의 제거를 통해 상당한 수준의 병원력을 상실하였음을 나타내는 결과이다. 이는 세포 생존률의 증대에 따라 재조합 단백질의 생산 시간을 연장시킴으로써 기존에 비해 더 높은 수율을 기대할 수 있을 것으로 여겨지며, 특히 세포의 세포막을 둘러싸고 방출되는 외막형 바이러스(envelpoed virus)의 바이러스 유사입자(virus-like particle :VLP)생산에 매우 유용한 도구가 될 수 있음을 입증하는 결과이다.

② 누에 유충에 대한 병원력 검정

BmBacmid-Δp10, BmBacmid-Δp10-VV, BmBacmid-Δpcc및 BmBacmid-Δpcc-VV의 병원력을 누에 유충에서도 확인하기 위해 위 실험과 동일한 바이러스들을 TC-100 배지에 1 × 10⁵ p.f.u.가 되도록 희석한 후 1 mL 주사기를 이용하여 10마리의 5령 누에에 주사 접종하고 평균 생존시간을 측정하였다. 그 결과 바이러스를 접종하지 않은 무처리 누에의 경우 7-8일차에 모두 고치를 틀고 용화 되었으며 BmNPV-K1에 감염된 누에의 경우 평균 120.0시간, GOZA 바이러스에 감염된 누에는 140.8시간, BmBacmid-Δp10의 경우 166.4시간, BmBacmid-Δp10-VV의 경우 187.2시간 BmBacmid-Δpcc의 경우 201.6시간, BmBacmid-Δpcc-VV의 경우 193.6시간으로 나타나 Bm5 세포에서의 결과와 거의 유사하게 BmBacmid-Δpcc와 BmBacmid-Δpcc-VV가 매우 낮은 병원력을 나타냈으며 가장 긴 생존시간을 보인 BmBacmid-Δpcc 감염 누에의 경우 BmNPV-K1에 비해 약 82시간의 생존시간 증대 효과를 보임으로써 세포뿐만 아니라 누에 유충을 이용한 재조합 단백질의 생산 또는 바이러스 유사입자 생산에 매우 효율적인 발현 시스템임을 재확인하는 결과였다(표 4).

바이러스	ST50(h)	95% confidence interval(h)
바이러스	ST50(h)	Lower	Upper
Control silkworms	192.0^a*	187.2	196.8
BmNPV-K1	120.0^d	105.6	129.6
GOZA	140.8^c	139.2	144.0
BmBacmid-Δp10	166.4^b	144.0	182.4
BmBacmid-Δp10-VV	187.2^a	182.4	192.0
BmBacmid-Δpcc	201.6^a	196.8	206.4
BmBacmid-Δpcc-VV	193.6^a	182.4	201.6

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Baculovirus with increased yield of foreign protein production <130> PN1903-146 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 110 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> p10 promoter DNA seq <400> 1 gacctttaat tcaacccaac acaatatatt acagctaaat aagaattatt attaaattat 60 ttgtatatta attaaaatct tatactgtaa attacatttt atttactatc 110 <210> 2 <211> 285 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> p10 gene DNA seq <400> 2 atgtcaaagc ctaacgtttt gacgcaaatt ttagacgccg ttacggaaac taacacaaag 60 gttgacagtg ttcaaactca gttaaacggg ctggaagaat cattccagct tttggacggt 120 ttgcccgctc aattgaccga tcttaacact aagatctcag aaattcaatc catattgacc 180 ggcgacattg ttccggatct tccagactca ctaaagccta agctgaaaag ccaagctttt 240 gaactcgatt cagacgctcg tcgtggtaaa cgcagttcca agtaa 285 <210> 3 <211> 94 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> p10 gene A.A. seq <400> 3 Met Ser Lys Pro Asn Val Leu Thr Gln Ile Leu Asp Ala Val Thr Glu 1 5 10 15 Thr Asn Thr Lys Val Asp Ser Val Gln Thr Gln Leu Asn Gly Leu Glu 20 25 30 Glu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Gly Leu Pro Ala Gln Leu Thr Asp Leu 35 40 45 Asn Thr Lys Ile Ser Glu Ile Gln Ser Ile Leu Thr Gly Asp Ile Val 50 55 60 Pro Asp Leu Pro Asp Ser Leu Lys Pro Lys Leu Lys Ser Gln Ala Phe 65 70 75 80 Glu Leu Asp Ser Asp Ala Arg Arg Gly Lys Arg Ser Ser Lys 85 90 <210> 4 <211> 1659 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> chitinase gene DNA seq <400> 4 atgttgtaca aattgttaaa cgttttgtgg ttggtggtcg ccgtttccaa cgcgattccc 60 ggcacgccgg tgatcgattg ggccgaacgc aattatgcgc tcgtaaaaat aaattacgag 120 gccaccgctt acgaaaattt aataaagctc aaagaacaag tcgacgttca cgtcagttgg 180 aacgtatgga acggcgacat tggcgacata gcgtacgtgt tctttgacga gcagcaggta 240 tggaaaggcg acgccgacag taaaagggct accattaatg ttattgtgag cgggcaattt 300 aacatgcgtg tcaaactttg caatgaggac ggctgttcca taagcgatcc cgtgttggtc 360 aaaatcgcag acaccgacgg cggtcatctg gcgccgctcg aatacacatg gctggaaaac 420 aacaaacccg gcagaagaga ggataaaatt gtcgctgcgt actttgtcga gtggggtgtg 480 tacgggcgca gctttcccgt agacaaagtt cccttgccaa atttatcgca cttgttgtac 540 ggtttcatac ccatctgcgg cggcgatgga ataaacgacg ccctcaaaac aatacccgga 600 agttttgaag ctctgcaacg atcgtgcagg ggacgcgaag atttcaaagt tgccatccac 660 gatccgtggg ccgccgtaca aaaaccccaa aagggcgtgt ccgcttggaa cgaaccgtac 720 aaaggcaatt ttggacaatt gatggcggcg aaattagcaa acccacatct aaaaattctt 780 ccttcaatag gaggctggac tctgtcggac ccattctatt tcatgcacga cgttgaaaaa 840 agaaacgttt ttgtagagtc ggttaaggaa tttttgcaag tgtggaaatt ttttgatggt 900 gtagacgtcg attgggaatt tccgggcggc aaaggggcta acccgtcgct gggcgatgcg 960 gagcgtgacg ccaaaacata cattctgttg ttggatgagc tgcgcgaaat gctagacgac 1020 ctcgaagtgc aaaccggcag ggtttacgaa ttaacaagcg ctataagcgc gggctacgac 1080 aagattgccg tggtaaacta cgccgaagcg caaaagtcat tagacaaaat atttctcatg 1140 acttacgatt ttaaaggggc ttggtcaaac acggatttgg gctaccaaac aacagtctac 1200 gcgccaagtt ggaactcgga agagctgtac actacacatt acgctgtcga tgcgttactg 1260 gaacaaggcg tcgatcccaa caaaataatt gtgggcgtcg ccatgtacgg ccgcggctgg 1320 accggcgtaa caaattatac gaatggcaat tatttttccg gcactggcaa cgggccggtg 1380 tcgggcacgt gggaggacgg tgttgtagat tatcgtcaaa ttcaaaaaga tctcaacaat 1440 tatgtgtaca cgtttgacag cgccgctcaa gcgtcgtacg ttttcgataa aagtaaaggc 1500 gatttgattt cgtttgacag cgtcgactct gtgttaggaa aagttaaata tgtcgaccga 1560 aataaattgg gcggcttgtt tgcttgggag attgatgccg ataacggcga cttgctcaac 1620 gcgatgaacg cacagtttaa acttagagat gaactgtaa 1659 <210> 5 <211> 552 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> chitinase gene A.A. seq <400> 5 Met Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Val Ala Val Ser 1 5 10 15 Asn Ala Ile Pro Gly Thr Pro Val Ile Asp Trp Ala Glu Arg Asn Tyr 20 25 30 Ala Leu Val Lys Ile Asn Tyr Glu Ala Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Ile 35 40 45 Lys Leu Lys Glu Gln Val Asp Val His Val Ser Trp Asn Val Trp Asn 50 55 60 Gly Asp Ile Gly Asp Ile Ala Tyr Val Phe Phe Asp Glu Gln Gln Val 65 70 75 80 Trp Lys Gly Asp Ala Asp Ser Lys Arg Ala Thr Ile Asn Val Ile Val 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Asn Met Arg Val Lys Leu Cys Asn Glu Asp Gly Cys 100 105 110 Ser Ile Ser Asp Pro Val Leu Val Lys Ile Ala Asp Thr Asp Gly Gly 115 120 125 His Leu Ala Pro Leu Glu Tyr Thr Trp Leu Glu Asn Asn Lys Pro Gly 130 135 140 Arg Arg Glu Asp Lys Ile Val Ala Ala Tyr Phe Val Glu Trp Gly Val 145 150 155 160 Tyr Gly Arg Ser Phe Pro Val Asp Lys Val Pro Leu Pro Asn Leu Ser 165 170 175 His Leu Leu Tyr Gly Phe Ile Pro Ile Cys Gly Gly Asp Gly Ile Asn 180 185 190 Asp Ala Leu Lys Thr Ile Pro Gly Ser Phe Glu Ala Leu Gln Arg Ser 195 200 205 Cys Arg Gly Arg Glu Asp Phe Lys Val Ala Ile His Asp Pro Trp Ala 210 215 220 Ala Val Gln Lys Pro Gln Lys Gly Val Ser Ala Trp Asn Glu Pro Tyr 225 230 235 240 Lys Gly Asn Phe Gly Gln Leu Met Ala Ala Lys Leu Ala Asn Pro His 245 250 255 Leu Lys Ile Leu Pro Ser Ile Gly Gly Trp Thr Leu Ser Asp Pro Phe 260 265 270 Tyr Phe Met His Asp Val Glu Lys Arg Asn Val Phe Val Glu Ser Val 275 280 285 Lys Glu Phe Leu Gln Val Trp Lys Phe Phe Asp Gly Val Asp Val Asp 290 295 300 Trp Glu Phe Pro Gly Gly Lys Gly Ala Asn Pro Ser Leu Gly Asp Ala 305 310 315 320 Glu Arg Asp Ala Lys Thr Tyr Ile Leu Leu Leu Asp Glu Leu Arg Glu 325 330 335 Met Leu Asp Asp Leu Glu Val Gln Thr Gly Arg Val Tyr Glu Leu Thr 340 345 350 Ser Ala Ile Ser Ala Gly Tyr Asp Lys Ile Ala Val Val Asn Tyr Ala 355 360 365 Glu Ala Gln Lys Ser Leu Asp Lys Ile Phe Leu Met Thr Tyr Asp Phe 370 375 380 Lys Gly Ala Trp Ser Asn Thr Asp Leu Gly Tyr Gln Thr Thr Val Tyr 385 390 395 400 Ala Pro Ser Trp Asn Ser Glu Glu Leu Tyr Thr Thr His Tyr Ala Val 405 410 415 Asp Ala Leu Leu Glu Gln Gly Val Asp Pro Asn Lys Ile Ile Val Gly 420 425 430 Val Ala Met Tyr Gly Arg Gly Trp Thr Gly Val Thr Asn Tyr Thr Asn 435 440 445 Gly Asn Tyr Phe Ser Gly Thr Gly Asn Gly Pro Val Ser Gly Thr Trp 450 455 460 Glu Asp Gly Val Val Asp Tyr Arg Gln Ile Gln Lys Asp Leu Asn Asn 465 470 475 480 Tyr Val Tyr Thr Phe Asp Ser Ala Ala Gln Ala Ser Tyr Val Phe Asp 485 490 495 Lys Ser Lys Gly Asp Leu Ile Ser Phe Asp Ser Val Asp Ser Val Leu 500 505 510 Gly Lys Val Lys Tyr Val Asp Arg Asn Lys Leu Gly Gly Leu Phe Ala 515 520 525 Trp Glu Ile Asp Ala Asp Asn Gly Asp Leu Leu Asn Ala Met Asn Ala 530 535 540 Gln Phe Lys Leu Arg Asp Glu Leu 545 550 <210> 6 <211> 972 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cysteine protease gene DNA seq <400> 6 atgaacaaaa ttttgtttta tttgtttgtg tacgccgttg taaagagcgc ggcctacgat 60 cctttgaaag cgcctaatta ttttgaagaa tttgttcatc gattcaacaa aaattatagt 120 agcgaagttg aaaaattgcg aagattcaaa attttccaac acaatttaaa tgaaattatc 180 aataaaaacc aaaacgattc ggccaaatat gaaataaaca aattctcgga tttgtccaaa 240 gacgaaacta tcgcaaaata cacaggtctg tctttgccta ctcagactca aaatttttgc 300 aaggtcatac tcttagacca gccgccgggt aaagggcccc ttgaatttga ctggcgtcgt 360 ctcaacaaag tcactagcgt aaaaaatcag ggcatgtgtg gcgcctgctg ggcgtttgcc 420 actctggcta gtttggaaag tcaatttgca atcaaacata accagttgat taatctgtcg 480 gagcagcaaa tgatcgattg tgattttgtc gacgctggct gtaacggcgg cttgttgcac 540 acagcgttcg aagccatcat taaaatgggc ggcgtacagc tggaaagcga ctatccatac 600 gaagcagaca ataacaattg ccgtatgaac tccaataagt ttctagttca agtaaaagat 660 tgttatagat acattaccgt gtacgaggaa aaacttaaag atttgttacg ccttgtcggc 720 cctattccta tggccataga cgctgccgac attgttaact ataaacaggg tattataaaa 780 tattgtttcg acagcggtct aaaccatgcg gttcttttag tgggttatgg tgttgaaaac 840 aacattccat attggacctt taaaaacact tggggcacgg attggggaga ggacggattt 900 ttcagggtac aacaaaacat aaacgcctgt ggtatgagaa acgaacttgc gtctactgca 960 gtcatttatt aa 972 <210> 7 <211> 323 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Cysteine protease gene A.A. seq <400> 7 Met Asn Lys Ile Leu Phe Tyr Leu Phe Val Tyr Ala Val Val Lys Ser 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asp Pro Leu Lys Ala Pro Asn Tyr Phe Glu Glu Phe Val 20 25 30 His Arg Phe Asn Lys Asn Tyr Ser Ser Glu Val Glu Lys Leu Arg Arg 35 40 45 Phe Lys Ile Phe Gln His Asn Leu Asn Glu Ile Ile Asn Lys Asn Gln 50 55 60 Asn Asp Ser Ala Lys Tyr Glu Ile Asn Lys Phe Ser Asp Leu Ser Lys 65 70 75 80 Asp Glu Thr Ile Ala Lys Tyr Thr Gly Leu Ser Leu Pro Thr Gln Thr 85 90 95 Gln Asn Phe Cys Lys Val Ile Leu Leu Asp Gln Pro Pro Gly Lys Gly 100 105 110 Pro Leu Glu Phe Asp Trp Arg Arg Leu Asn Lys Val Thr Ser Val Lys 115 120 125 Asn Gln Gly Met Cys Gly Ala Cys Trp Ala Phe Ala Thr Leu Ala Ser 130 135 140 Leu Glu Ser Gln Phe Ala Ile Lys His Asn Gln Leu Ile Asn Leu Ser 145 150 155 160 Glu Gln Gln Met Ile Asp Cys Asp Phe Val Asp Ala Gly Cys Asn Gly 165 170 175 Gly Leu Leu His Thr Ala Phe Glu Ala Ile Ile Lys Met Gly Gly Val 180 185 190 Gln Leu Glu Ser Asp Tyr Pro Tyr Glu Ala Asp Asn Asn Asn Cys Arg 195 200 205 Met Asn Ser Asn Lys Phe Leu Val Gln Val Lys Asp Cys Tyr Arg Tyr 210 215 220 Ile Thr Val Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Asp Leu Leu Arg Leu Val Gly 225 230 235 240 Pro Ile Pro Met Ala Ile Asp Ala Ala Asp Ile Val Asn Tyr Lys Gln 245 250 255 Gly Ile Ile Lys Tyr Cys Phe Asp Ser Gly Leu Asn His Ala Val Leu 260 265 270 Leu Val Gly Tyr Gly Val Glu Asn Asn Ile Pro Tyr Trp Thr Phe Lys 275 280 285 Asn Thr Trp Gly Thr Asp Trp Gly Glu Asp Gly Phe Phe Arg Val Gln 290 295 300 Gln Asn Ile Asn Ala Cys Gly Met Arg Asn Glu Leu Ala Ser Thr Ala 305 310 315 320 Val Ile Tyr <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13F(-40) <400> 8 gttttcccag tcacgac 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13R(-40) <400> 9 caggaaacag ctatgac 17 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p10-5'-F <400> 10 ggtacctgtc atttattaat ttggatga 28 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p10-5'-R <400> 11 aagcttttaa ctataatata ttgtgttggg t 31 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p10-3'-F <400> 12 ctgcagatga atcgttttta aaataaca 28 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p10-3'-R <400> 13 actagtgaag aacacacgat catgg 25 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cm-F <400> 14 gacgtcatag atctgggcca acttttgg 28 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cm-R <400> 15 gggccccagg cgtttaaggg caccaataac 30 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chitinase-F <400> 16 ctgcagttga gcaagtcgcc gttatcggc 29 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cystein-R <400> 17 gaattccgac aaaatcacaa tcgatcattt g 31

Claims

p10 유전자 프로모터 및 p10 유전자가 결실되어 외래 목적 단백질의 생산량 및 발현시간이 증대된 재조합 배큘로바이러스.
p10 유전자 프로모터, p10 유전자, 배큘로바이러스의 키티나아제(chitinase) 및 시스테인 단백질 가수분해 효소(v-cath)가 결실되어 외래 목적 단백질의 생산량 및 발현시간이 증대된 재조합 배큘로바이러스.
p10 유전자 프로모터 및 p10 유전자가 결실된 재조합 전이 벡터를 제조하는 단계;
상기 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및
상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(Bacmid)를 곤충 또는 곤충세포에 도입하는 단계를 포함하는 외래 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 곤충 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 외래 목적 단백질을 생산하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 곤충은 누에나방(Bombyx mori), 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 및 벌집나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 외래 목적 단백질을 생산하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) 또는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)인 것인 외래 목적 단백질을 생산하는 방법.
p10 유전자 프로모터, p10 유전자, 배큘로바이러스의 키티나아제(chitinase) 및 시스테인 단백질 가수분해 효소(v-cath)가 결실된 재조합 전이 벡터를 제조하는 단계;
상기 재조합 전이 벡터에 외래 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; 및
상기 클로닝된 재조합 전이 벡터 및 백미드(Bacmid)를 곤충 또는 곤충세포에 도입하는 단계를 포함하는 외래 목적 단백질을 대량으로 생산하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 곤충 세포는 BT1-Tn-5B1-4 세포, Hi5 세포, LD652Y 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, Kc1 세포, SL2 세포, Bm5 세포, BmN 세포 및 모기(mosquito) 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 외래 목적 단백질을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 곤충은 누에나방(Bombyx mori), 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 및 벌집나방(Galleria mellonella)으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 외래 목적 단백질을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) 또는 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)인 것인 외래 목적 단백질을 생산하는 방법.