KR100270928B1 - 누에 핵다각체병 바이러스 p10 유전자를 이용한 전이 벡터 및 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2(KCTC8873P)의 p10 단백질 유전자를 클로닝하고 그 유전자 구조를 분석하였으며 이를 이용하여 외래유전자 발현용 전이벡터 피비엠10을 제작하고, 그 전이벡터에 표지유전자로 베타-갈락토시다아제 유전자를 삽입하여 누에세포주에서 발현 여부를 분석한 결과, 그 전이벡터에 의한 재조합바이러스는 다각체를 형성하면서 베타-갈락토시다아제를 발현하여 전이벡터로서 기능을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명은 국내산 누에 핵다각체형 바이러스 브이비2의 p10 단백질 유전자를 이용한 전이벡터 피비엠10과 이에 의한 재조합바이러스 제작과 외래유전자 발현 및 유용물질 생산에 적용할 수 있다.

Description

누에 핵다각체병 바이러스 p10 유전자를 이용한 전이 벡터 및 제조방법
본 발명은 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2(KCTC8873P)의 p10유전자를 이용하여 외래유전자 발현을 위한 전이벡터 제작과 이를 이용한 물질생산에 관한 것이다. 곤충 베큘로바이러스 (baculoviurs)의 유전자는 감염 초기 발현 유전자와 말기 발현 유전자로 구분되어 단계적으로 발현된다 (Blissard & Rohrmann, Annu. Rev. Entomol. 35, 127-155, 1990). 마지막 단계에서 다각체 단백질과 함께 다량으로 발현되는 p10 단백질은 그 분자량이 약 10 kDa으로 감염된 세포의 핵이나 세포질에 섬유상 구조로 존재하면서 (Van der Wilk et al., J. Gen. Virol. 68, 2615-2623, 1987) 다각체의 방출에 관련하는 것으로 추정하였다(Williams et al., J. Gen. Virol. 70, 187-202, 1989). 또한 p10 단백질은 응집과 정렬, 핵의 파괴 및 망상구조 형성에 관련된 각각의 아미노산 영역을 가지고 있다고 하였다 (Van Oers et al., J. Gen. Virol. 68, 2615-2623, 1993). 이와 같은 p10 단백질의 유전자 구조분석에서 AcNPV(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus)는 282 bp로 구성되어 있으며, 이는 94개 아미노산으로 연역된다고 하였다(Kuzio et al., Virology 139, 414-418, 1984). 또한 88개 아미노산으로 구성되어있는 파밤나방 핵다각체병 바이러스(Spodoptera exigua multicapsid Nuclear Polyhedrosis Virus)의 p10 유전자와 26%의 낮은 아미노산 상동성을 보이지만 p10 단백질의 기능에는 큰 차이가 없는 결과로부터 바이러스에 따른 p10 유전자 염기서열의 다양성을 보고하였다(Zuidema et al., J. Gen. Virol. 74, 1017-1024, 1993). 한편 누에 핵다각체병 바이러스(Bombyxmori Nuclear Polyhedrosis Virus)의 p10의 구조 단백질 유전자는 210 bp로 70개 아미노산으로 연역되며 분자량은 약 7.7킬로달톤으로 추정하였다(Hu et al., J. Gen. Virol. 75, 2085-2088, 1994). 이 유전자의 염기서열은 AcNPV의 그것과 92.4%의 높은 상동성을 보였으며, C-말단의 72 bp의 유전자 결손을 확인하였다. 또한 p10 유전자는 바이러스의 감염 및 증식에 무관하며(Fraser et al., J. Virol. 47, 287-300, 1983), 더욱이 프로모터 영역과 폴리아데닐레이션 시그날 (polyadenylation singal)등 발현벡터의 구성요건을 갖추고 있다. 이와 같은 곤충 베큘로바이러스의 p10 유전자의 특성을 이용한 전이벡터 구축에 많은 연구가 보고되고 있다(O′Reilly et al., Baculovirus expression vector-A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992). 한편 베큘로바이러스의 다각체 단백질 유전자의 프로모터 조절하에 외래유전자를 발현하는 재조합 바이러스는 다각체를 형성하지 않는 특징을 가진다. 이러한 재조합 바이러스를 경구접종할 경우 유충의 소화액에 의해 쉽게 불활화되는 문제 때문에 바이러스 접종은 주로 주사기를 이용한 경피접종에 의존하고 있다.
상기와 같은 방법은 유용물질의 대량생산시 일일이 바이러스를 주사접종해야하는 번잡함과 시간이 많이 소요되는 단점이 제기되어왔다. 따라서 본 발명은 유용물질의 대량생산시 경구접종에 적합한 다각체를 형성하는 재조합 바이러스를 제작할 수 있는 새로운 전이벡터를 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자를 이용하여 제작하였으며, 이를 이용하여 효율적으로 외래유전자 발현 및 물질생산에 응용하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
제1도는 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 게놈의 제한효소 분석패턴을 나타낸 것이다.
제2도는 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자의 염기서열을 분석한 것이다.
제3도는 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자를 이용한 전이 벡터 피비엠10(pBm10)의 모식도를 나타낸 것이다.
제4도는 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자 전이벡터(pBm10)를 이용하여 외래유전자로서 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase)를 발현한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자를 이용한 전이 벡터 피비엠10(pBm10)과 이를 이용한 재조합바이러스 제작과 외래유전자의 발현 및 물질 대량생산에 대하여 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이 실시예들에 의해서 본발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
[국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 게놈의 제한효소 분석]
p10 유전자의 클로닝과 동시감염에 사용한 야생형 바이러스는 국내 양잠농가로부터 수집한 핵다각체병 바이러스를 한계희석법으로 5회 실시하여 단주화한 브이브2를 사용하였다. 누에 유충을 이용한 바이러스 증식은 배양세포 비엠엔-4 (BmN-4)에서 증식한 배양 상청액을 수거하고 100배 희석하여 접종액으로 하였다. 누에 접종은 12시간 절식시킨 5령 2일째 누에에 50㎕씩 경피접종하였다. 이후 표준 사육법에 준하여 사육하면서 전형적인 바이러스 감염증상을 나타내는 누에의 배발을 잘라 체액을 채취하였다. 다각체로부터 바이러스 DNA 추출은 마에다 (Maeda, Invertebrate cell system and applications, CRC press, Boca Raton, Fla. pp. 167-182, 1989)의 방법에 따라 수행하였다. 추출된 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2 게놈유전자는 여러 가지 제한효소 절단으로 일본 누에 핵다각체병 바이러스의 게놈 유전자와 절단 패팅을 비교하였다.
제1도는 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2와 일본 누에 핵다각체병 바이러스 (P6E) 간의 게놈유전자의 제한효소 절단 패턴(레인 1, EcoRI; 레인 2, BamHI; 레인 3, PstI; 레인 4, HindIII)을 분석한 것이다.
제1도에 나타난 바와 같이 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 게놈유전자 절단 패턴은 일본 누에 핵다각체병 바이러스의 그것과 뚜렷하게 차이를 보임으로서 국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2는 새롭게 분리된 누에 핵다각체병 바이러스임을 보여주고 있다.
[실시예 2]
[국내산 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자 클로닝 및 염기서열 분석]
누에 핵다각체병 바이러스 브이비2로부터 p10 단백질 유전자를 클로닝하기 위해 마에다가 진뱅크(GenBank)에 등록한 일본 누에 핵다각체병 바이러스 티3(T3)의 염기서열(등록번호 L33180)을 참고로 프라이머(primer)를 설계하였다. 즉 p10유전자의 5’ 영역 부위의 클로닝에 사용한 센서 프라이머(sense primer)는 5‘-GGGGCCAAATATTGACTCGTTG-3′ 이며, 안티센서 (antisense primer)는 5‘-TCCCCCGGGATGATAGTAAATAA AATGT-3′로 하여 PCR (Polymerase Chain Reaction) 분석을 수행하였다. PCR 분석 산물은 0.7% 아가로스 젤 (agarose gel) 전기영동으로 확인한 다음 핀포인터 벡터 (Pinpoint XaI-T 벡터, Promega사제품)에 클로닝하였다.
또한 p10 유전자 3′ 영역 부위의 클로닝에 사용한 센서 프라이머(sense primer)는 5‘-TCCCCCGGGTCAAAGCCTAACGTTTTG-3′이며, 안티센서 프라이머(antisense primer)는 5’-GCGAGCTCAGAGACTAGAGTG-3′를 각각 합성하여 피시알 분석을 하였다. 예상되는 1.9 kb의 PCR 증폭산물은 0.7% 아가로스겔 전기영동으로 확인한 후 피젬티(pGEM-T) 벡터에 클로닝하였다.
누에 핵다각체병 바이러스 브이비2 P10 유전자의 염기서열 분석을 위해 PCR로 P10 유전자의 구조부위를 클로닝하였다. PCR 반응에 사용한 센서프라이머는 5‘-ATGCATTTGAGGATGCC-3′를, 안티센서 프라이머는 5’-CAAACACAATTGTGGCG-3′였으며, PCR 산물은 0.7% 아가로스 겔에서 예상되는 크기와 증폭여부를 확인한 후 피젬티(pGEM-T) 벡터에 클로닝하고 선발한 재조합 플라스미드를 염기서열 분석에 사용하였다. 염기서열 분석은 디데옥시 체인터미네이션(dideoxy chain termination)방법으로 수행하였다 (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467, 1977).
제2도는 작성한 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2 p10 유전자를 포함한 주변부위의 620 bp의 염기서열을 분석한 것이다.
제2도에서 나타난 바와 같이 p10 유전자의 구조영역은 210개 뉴클레오티드로 구성되어 있고, 프로모터 영역에는 베큘로바이러스 말기유전자의 공통적인 전사개시에 관련된 TAAG는 번역개시점으로부터 -71 bp 상류에 위치하고 있었으며, 잠정적인 폴리아데닐레이션 시그날(polyadenylation signal)은 종결 코돈(codon)으로부터 71bp 및 140bp 하류에 존재하였다.
[실시예 3]
[누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 p10 유전자를 이용한 전이벡터 피비엠10(pBm10)의 작성]
다각체를 형성하면서 p10 유전자의 프로모터 조절하에 외래 유전자를 발현하는 재조합 바이러스를 제작하기 위한 새로운 전이벡터 구축은 p10 유전자의 5‘ 영역 부위의 배열은 핀포인터(Pinpoint XalT-5′f)벡터에 제한효소 HaeIII와 BglII로 처리하여 3 kb의 유전자 단편을 얻었다. 이 유전자를 제한효소 KpnI으로 처리하고 티4폴리머라제(T4 polymerase)로 블란트 말단(blunt end)을 만든후 제한효소 BamHI으로 절단한 피블루스크립트 에스케이플러스 (pBluescript SK+)벡터에 연결반응시켜 약 5.9 kb의 재조합플라스미드 (pSK-5′f)를 선발하였다. 또한 p10 유전자의 3’영역 부위의 배열은 벡터 (pGEM-3′f)에 제한효소 Sma I 및 Sac I을 처리하여 얻은 2.0 kbp의 유전자 단편을 Sma I 및 Sac I으로 절단한 벡터 (pSK-5f′)에 연결반응시켜 7.9 kbp의 피비엠10(pBm10)전이벡터를 구축하였다.
구축한 피비엠10 전이벡터의 제한효소 위치를 결정하기 위해 각종 제한효소를 처리하고 0.7% 아가로스겔 전기영동으로 절단된 유전자 단편의 크기를 측정하여 전이벡터의 제한효소 지도를 작성하였다.
그 결과는 제3도에 나타나 있다. 외래 유전자의 클로닝 위치인 Sma I은 p10 유전자의 5’ 및 3‘ 영역 배열의 경계부위에 존재하였으며, 이 위치를 기준으로 BamH I은 200bp, HindIII는 230 bp, Xba I은 800 bp, Kpn I은 1.3 kbp 및 7.2 kbp, Sac I은 2.0 kbp, EcoRV는 6.5 kbp, Cla I은 7.1 kbp, Xho I은 7.7 kbp 하류에 각각 위치하고 있다.
또한 제3도에서 전이벡터의 p10 유전자의 번역 개시점인 ATG의 AT와 G 염기 사이에 CCCGG 염기배열이 삽입되어 새로운 Sma I 제한효소 위치가 생성되어 p10 그 자체 단백질은 발현되지 않으며, 더욱이 생성된 Sma I 위치에 번역개시점을 포함한 외래 유전자를 삽입시킴으로서 외래유전자는 p10 유전자 프로모터 조절하에 비융합형으로 발현시킬 수 있음을 나타낸다. 상기와 같이 제작한 전이 벡터 피비엠 10은 칼슘클로라이드(CaCl2) 방법(Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110, 1972)으로 Escherichia coli에 삽입시켜 Escherichea coli JM109/pBm10으로 명명하고 1998. 2. 23일 한국생명공학연구소에 기탁하여 수탁번호 KCTC8872P를 부여 받았다.
[실시예 4]
[전이 벡터 피비엠10 (pBm10)을 이용하여 외래유전자로서 베타-갈락토시다아제 (β-galactosidase) 발현]
구축한 피비엠10(pBm10) 전이벡터를 이용한 외래유전자 발현 검정은 표지 유전자로 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) 유전자를 도입하여 수행하였다. 즉 피에스브이-베타-갈락토시다아제 (pSV-β-galactosidase) 벡터 (Promega사 제품)를 Stu I 과 BamH I으로 절단하여 3.7 kb의 베타-갈락토시다아제 유전자를 회수하였다. 이 유전자를 Sma I 과 BamH I으로 절단한 피비엠10 전이벡터에 연결반응시켰다. 이 벡터를 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2 바이러스 DNA와 함께 비엠엔4(BmN-4) 누에세포에 동시감염 시키고, 엑스-갈(X-gal) 염색하여 베타-갈락토시다아제 발현 재조합 바이러스를 선발하였다. (Kitts & Possee, Biotechniques, 14, 810-817, 1993). 동시감염에 사용한 곤충배양세포는 6×105세포/㎖ 농도로 조정하여 6 웰(well) 플레이트에 각 웰 당 1.5㎖씩 분주한 후 하룻밤 배양한 것을 사용하였다. 디엔에이 전이는 야생형 바이러스 디엔에이와 전이벡터 디엔에이를 리포좀 방법(POTAP, Boehringer Manheim 사 제품)을 사용하여 제조회사의 방법에 따라 수행하였다. 이후 27℃ 항온기에서 5∼7일간 배양하면서 바이러스 감염 세포의 병징으로부터 전이여부를 확인하였다. 바이러스 감염이 확인된 세포배양액을 원심분리하여 상청액을 수거한 후 이를 재조합 바이러스 선발을 위한 바이러스 접종 원액으로 하였다. 재조합 바이러스 선발은 한계 희석법 (O‘Reilly et al, Baculovirus expression vector-A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992)으로 수행하였다. 즉 10-3∼10-7농도로 조정한 바이러스 접종액을 96 웰 플레이트에 분주한 후 5∼7일간 배양하였다. 이렇게 얻은 재조합 바이러스가 감염된 배양세포에서의 베타-갈락토시다아제 발현 양상은 인시투 (in situ) 염색 방법 (O‘Reilly et al, Baculovirus expression vector-A laboratory manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992)으로 수행하였다.
제4도에서 선발한 재조합 바이러스는 다각체를 형성하면서 표지 유전자로 사용한 베타-갈락토시다아제를 발현하는 것을 확인할 수 있다 (C). 이는 발현벡터로서 그 기능을 가지고 있음을 보여준다.
누에는 비단 생산 뿐만 아니라 최근에는 누에가루 및 동충하초 생산에도 많이 이용되고 있다. 이러한 누에는 충체가 크고 연중 대량사육이 가능하기 때문에 베큘로바이러스 (Baculovirus)를 이용한 재조합 단백질 대량생산 뿐만 아니라 형질전환 누에 창출에 연구의 초점이 맞춰지고 있다. 본 발명은 곤충 베큘로바이러스인 누에 핵다각체병 바이러스의 p10 유전자를 클로닝하여 유전자 구조를 해석하고 그 유전자의 강력한 프로모터를 이용하여 외래유전자 발현용 전이벡터를 제작하였으며, 외래유전자로서 β-galactosidase를 발현함으로서 그 전이벡터의 외래유전자 발현 기능을 확인하였다.
따라서 본 발명의 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2의 피10 유전자 발현 벡터는 생물공학과 곤충 바이오텍에 있어서 유용물질 대량생산 수단으로 활용할 수 있으며, 특히 발현효율을 고려하여 누에 생체를 이용할 경우에 유용하다.

Claims (5)

  1. 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2(KCTC8873P)의 p10단백질 유전자를 이용한 전이벡터 피비엠10(pBm10).
  2. 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2(KCTC8873P)의 p10단백질 유전자의 5‘ 영역 부위의 비열은 핀포인터 (Pinpoint XalT-5′f) 벡터에 제한효소 HaeIII와 BglII로 처리하여 3kb의 유전자 단편을 얻고, 이 유전자를 제한효소 Kpn I으로 처리하고 티4 폴리머라제(T4 polymerase)로 블란트 말단(blunt end)을 만든후 제한효소 BamH I으로 절단한 피블루스크립트 에스케이플러스(pBluescript SK+) 벡터에 연결반응시켜 약 5.9 kb의 재조합플라스미드(pSK-5′f)를 선발하고, 또한 p10 유전자의 3’ 영역 부위의 배열은 벡터 (pGEM-3′f)에 제한효소 Sma I 및 Sac I을 처리하여 얻은 2.0 kbp의 유전자 단편을 Sma I 및 sac I으로 절단한 벡터 (pSK-5f′)에 연결반응시켜 구축한 피비엠10 (pBm10) 전이벡터 제조방법.
  3. 제1항의 전이 벡터 피비엠10을 이용하여 재조합 바이러스를 제조하는 방법.
  4. 제1항의 전이 벡터 피비엠10을 도입시킨 Escherichia coli JM109/pBm10(KCTC 8872P).
  5. 제1항에 있어서, 외래유전자를 발현시켜 유용물질을 생산하는데 사용됨을 특징으로 하는 누에 핵다각체병 바이러스 브이비2(KCTC8873P)와 p10단백질 유전자를 이용한 전이 벡터 피비엠10(pBm10)으로 외래유전자를 발현시켜 유용물질을 생산하는 용도에 사용됨을 특징으로 하는 누에 핵다각체병 바이러스 유전자를 이용한 전이벡터 및 이의 용도.
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