JP4288389B2 - BmNPVシャトルベクター - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、蚕に組換え遺伝子を発現させるためのBmNPVシャトルベクターに関する。
【0002】
【従来の技術】
組み換えバキュロウイルスは、昆虫の培養細胞や幼虫固体において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして広く利用されるようになった。組み換えバキュロウイルスにおいて、ポリヘドリンプロモーターの下流に置かれた外来遺伝子は、ウイルスの感染後期に多量に発現する。ほとんどの場合、発現した組み換えタンパク質に対し、そのプロセシング、修飾、局在化などが本来のタンパク質と機能的に近い状態で行なわれる。
【0003】
組み換えバキュロウイルスは、従来法では2つのステップで作られる。まず、トランスファーベクター内のバキュロウイルスプロモーターの下流に、外来遺伝子をクローニングする。つぎに、外来遺伝子を含有するトランスファーベクターを野生株のバキュロウイルスDNAと共に昆虫細胞にコトランフフェクションし、トランスファーベクターとバキュロウイルスDNAとの相同組み換えを行なうことによって、外来遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスが得られる。しかしながらこの方法では、目的とする組み換えウイルスは0.1〜1%しか得られず、大量の野生株のウイルスが含まれる。そこで、DNAを直鎖状にしたり、さらにはウイルスの生育に必要な遺伝子の一部を欠損させたウイルスDNAと相同組み換えを行なうことによって、目的外の組み換えウイルスの出現率を著しく減らし、目的ウイルスの割合を飛躍的に向上させたが(非特許文献1および非特許文献2)、目的ウイルスの出現数は変わらない。さらに、得られたプラーク中には野生株のウイルスも多少含まれているため、組み換えウイルスのみを得るためには純化の作業が必要となる。また、タンパク質発現に必要なウイルス量を得るためには、ウイルスの増幅が必要となり、プラークアッセイによるウイルスの純化やウイルスの増幅が欠かせない。
【0004】
近年、組み換えバキュロウイルス作製のための、速くて効率のよい方法が開発された(非特許文献3)。これは、E.coli内で増幅するバキュロウイルスのシャトルベクター(バクミド(bacmid))へ発現カセットを部位特異的に転位させることが基礎となっている。バクミドは、コピー数の少ないmini−Fレプリコン、バクテリアトランスポゾンTn7の付着部位、カナマイシン耐性マーカー遺伝子、pUC由来のlacZαを含有する。Tn7の付着部位は、lacZαのコドンのフレームが本来のフレームからずれないよう、LacZα遺伝子内に挿入されている。
【0005】
現在知られているバクミドは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)をバックボーンとする大きなプラスミドとして大腸菌細胞内で増幅し、カナマイシン耐性を有する。また、バクミドがlacZ遺伝子を有しているため、大腸菌のコロニーは5−ブロモ−3−インドリル−β−D−ガラクトシドおよびIPTGの存在下で青色を呈する。組み換えバクミドは、ヘルパープラスミドから供給されるトランスポゼースにより、外来遺伝子を供給するためのドナープラスミド上のmini−Tn7が、バクミド上のTn7付着部位に転位することによって作製される。現在市販されているドナープラスミド上のmini−Tn7は、ゲンタマイシン耐性遺伝子、AcNPVからのポリヘドリンプロモーター、クローニング部位、SV40poly(A)からなる発現カセットをTn7の左右のアームのあいだにもっている。発現させる遺伝子は、ドナープラスミド上のポリヘドリンプロモーターの下流のクローニング部位に挿入される。
【0006】
mini−Tn7がバクミド上のmini−attTn7付着部位に挿入されるとlacZαペプチドの発現を崩壊させる。したがって、組み換えバクミドを含むコロニーは白色である。
【0007】
組み換えバクミドDNAは、スモールスケールでの宿主細胞の培養から短時間に分離され、昆虫細胞へのトランスフェクションに使用し得る。トランスフェクションした昆虫細胞から集めたウイルスのストックは、その後のタンパク質発現、精製、解析に使われる。
【0008】
外来の組換えタンパク質の大量発現を念頭に置いた場合、昆虫の幼虫固体を使うことが非常に有効である。とくに蚕幼虫は体が大きいため、他の昆虫と比べて極めて多量のタンパク質を得ることができる。また、蚕幼虫を飼育するためのノウハウも確立されており、扱い易い昆虫である。しかしながら前術したように、バクミドはAcNPVをバックボーンとしているため、AcNPVが感染することのできない蚕幼虫に対しては、前記バクミドを適用することができなかった。
【0009】
【非特許文献1】
キッツ(Kitts)ら1990年、Nucleic Acids Res.、第18巻、p.5667
【非特許文献2】
ハーティグ(Hartig)ら、1992年、J. Virol. Methods、第38巻、p.61
【特許文献3】
ルクノウ(Luckow)ら、1993年、J. Virol.、第67巻、p.4566
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蚕用の組換えバキュロウイルスを容易に作製するために使用する、BmNPVシャトルベクターを提供することを目的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため、本発明は、(1)miniFレプリコン、(2)BmNPV DNAおよび(3)トランスポゾン(Tn)の付着部位を含むlacZα遺伝子からなる、BmNPVシャトルベクターを提供する。
【0012】
本発明はまた、BmNPVシャトルベクターを含有する大腸菌株を提供する。
【0013】
【発明の実施の形態】
本発明のBmNPVシャトルベクターは、miniFレプリコン、BmNPVDNAおよびトランスポゾン(Tn)の付着部位を含むlacZα遺伝子からなる。
【0014】
本発明においてminiFレプリコン(配列番号1)は、大腸菌DH5αF′IQより分離したプラスミド由来の、複製に必要な領域を意味する。本発明のBmNPVシャトルベクターにおいて、miniFレプリコンは、ccdA、ccdB、resDおよびrepEの各遺伝子ならびに4ヶ所のリピートユニットを含有する。
【0015】
本明細書において、BmNPVは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)を意味し、BmNPV DNAは、BmNPVのDNA配列を意味する。
【0016】
LacZ遺伝子は、本明細書において、外来遺伝子がシャトルベクター上に挿入されたことを確認するために用いられる。
【0017】
本明細書において、トランスポゾン(Tn)の付着部位とは、ドナーベクター内のトランスポゼース認識配列に挟まれた外来遺伝子を、転位酵素トランスポゼースによりシャトルベクター内の標的部位に挿入させるための配列である。トランスポゾンの付着部位としては、Tn7の付着部位mini-attTn7(CCCCG:配列番号2)、Tn3の付着部位およびTn4の付着部位などが挙げられる。
【0018】
本発明のBmNPVシャトルベクターはさらに、薬剤耐性遺伝子を含有してもよい。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子など、当業者により適宜選択することができる。
【0019】
本発明のBmNPVシャトルベクターは、たとえば、以下のようにして得ることができる。
(i)pUC-4KをPst Iで消化しカナマイシン耐性遺伝子(Kan:1240bp)を取り、pBluescriptII SK(+)のPst Iサイトに入れ、カナマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドを構築する。
(ii)F−レプリコンをF′プラスミドから取り出し、(i)で構築したカナマイシン耐性遺伝子に連結し、Kan−miniFレプリコン配列を得る。
(iii)mini-attTn7を得る。すなわち、pMON7134からPCRによりmini-attTn7を増幅した。増幅した断片をpBCSKPのLacZα遺伝子のEcoRI-SalI部位に挿入し、LacZα−mini-attTn7−LacZα配列を得る。
(iv)前記(iii)で構築したLacZα−mini-attTn7−LacZα遺伝子を、前記(ii)で構築したKan−miniFレプリコンに連結させ、Kan−miniFレプリコン−LacZα−mini-attTn7−LacZαの配列を得る。
(v)前記(iv)で構築した配列をBmNPV用トランスファーベクター(pBK283、ポリヘドリンプロモーターを欠損しているベクター)に挿入し、miniFレプリコン−LacZα−mini-attTn7−LacZαが含まれるBmNPV用トランスファーベクターを得ることができる。
【0020】
このようにして得られたBmNPV用トランスファーベクターを、通常の方法でBmNPV DNAに組込むことによって、本発明のBmNPVシャトルベクターを得ることができる。さらに、通常の方法によって、得られたBmNPVシャトルベクターで大腸菌を形質転換させることにより、BmNPVシャトルベクターを含有する大腸菌株を得ることができる。
【0021】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【0022】
【実施例】
実施例1
(miniFレプリコン、カナマイシン耐性遺伝子、およびTn7の付着部位を含むlacZα遺伝子を含有するトランスファーベクターの作製)
miniFレプリコン、カナマイシン耐性遺伝子、およびTn7の付着部位を含むlacZα遺伝子を含有するDNA領域(約8.4Kbp。以下、「miniF−kan.」と称する)を得るために、以下の操作を実施した。すなわち、AcNPVバクミドを含有するDH10Bac(インビトロジェン製)をLB培地(トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、pH7.2)において27℃で培養し、アルカリ−SDS法によりAcNPVバクミドを抽出した。得られたAcNPVバクミド200pgを鋳型とし、DNAポリメラーゼ(タカラ製)2.5U、0.2mMのdNTPs(タカラ製)、下記フォワードプライマー1およびリバースプライマー1を各0.5pmolならびに蒸留水を混合し、全量50μlのPCR用反応液を調製した。ついで、PCR用反応溶液を、PCR用反応溶液を、95℃で2分間インキュベーションしたのち、95℃で30秒間、58℃で30秒間および72℃で8.5分間を1サイクルとしてこれを25サイクル行ない、ついで72℃で8.5分間インキュベーションすることによりPCRを実施し、PCR産物としてminiF−kan.を得た。
フォワードプライマー1:5′−TTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGC−3′(配列番号3)
リバースプライマー1:5′−TTGCCGGGTCCCAGGAAAGGAT−3′(配列番号4)
【0023】
PCRによって得られたminiF−kan.の両末端は、T4ポリメラーゼ(タカラ製)により平滑にし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(東洋紡製)によりリン酸化した。
【0024】
BmNPV用トランスファーベクターpBK283(フナコシ製)を制限酵素KpnIで切断したのち、Bal31で約150bp削りポリヘドリンプロモーターを取り除き、T4ポリメラーゼによって削り口を平滑にした。平滑末端にしたトランスファーベクターに前記miniF−kan.をライゲーションし、これを用いてDH5αを形質転換した。ついで、形質転換体を培地(TNM−FH(シグマ製)+10%FBS(シグマ製)+0.5%Antibiotic-Antimyotic(ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンを含有;インビトロジェン製)において27℃で培養したのちにプラスミドDNAを抽出することにより、miniFレプリコン、カナマイシン耐性遺伝子およびlacZα遺伝子を含有するトランスファーベクター(以下、「pBK283/miniF−kan」と称する)を得た。
【0025】
(BmNPV DNAとpBK283/miniF−kanとの相同組み換え)BmNPV DNAにminiF−kan.を組み込むために、BmNPV DNAとpBK283/miniF−kanとのあいだで相同組み換えを行なった。すなわち、BmNPVの直鎖DNA(フナコシ製)1μg、pBK283/miniF−kan.5μg、リポフェクチン(インビトロジェン製)20μlおよび蒸留水を混合することにより合計275μlのリポフェクション用DNA溶液を調製した。該DNA溶液用いて蚕の培養細胞Bm5(韓国ソウル大学、B. K. Kim教授より分譲)に共トランスフェクションした。ついで、形質転換したBm5から、miniF−kan.が組み込まれた組み換えBmNPV(以下、「BmNPV/miniF−kan.」と称する)と、組み換えの起こっていないBmNPVとの混合物を得た。
【0026】
ついで、得られた混合物をPEG沈殿法により精製したのち、DNaseI処理によって細胞外に混在しているトランスファーベクターを分解し、細胞内に存在したBmNPV/miniF−kan.、トランスファーベクターおよび組み換えの起こっていないBmNPV DNAの混合物を得た。得られたウイルス混合物にPEG沈殿法を実施し、ウイルス混合物からDNaseIを除去した。ついで、プロテイナーゼK処理、フェノール/クロロフォルム処理、クロロフォルム抽出およびエタノール沈澱法による処理によって、ウイルス混合物をさらに精製した。
【0027】
(組み換えBmNPV DNA(BmNPVシャトルベクター)の選択)
BmNPV/miniF−kan.はカナマイシン耐性遺伝子を含有するため、前記ウイルス混合物を大腸菌内に導入し、カナマイシンを含有する培地において大腸菌を培養することにより、BmNPV/miniF−kan.を含有する形質転換体を選択した。すなわち、精製したウイルス混合物のDNA0.05μgとELECTRO MAX DH10B competent cell(インビトロジェン製)25μlとを混合し、エレクトロポレーションを実施した。ついで、カナマイシン(Wako製)を50μg/μl含有するLB培地において形成されたコロニーを選択することによって、BmNPV/miniF−kan.を含有する形質転換体を得た。さらに、アンピシリン耐性遺伝子を含有するトランスベクターの混入がないことを確認するために、アンピシリン(Wako製)を50μg/μl含有するLB培地において、選択した形質転換体のコロニーを37℃で培養することによって、アンピシリン耐性でないもの形質転換体を選択した。ABI PRISM Miniprep Kit(アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems)製)を用いて、選択された形質転換体よりBmNPV/miniF−kan.を抽出した。
【0028】
(BmNPVシャトルベクターのトランスフォーメーション)
BmNPVシャトルベクターを有する大腸菌を作製するため、以下のようにしてBmNPV/miniF−kan.によるトランスフォーメーションを実施した。
【0029】
DH10Bacをカナマイシンを含有しないテトラサイクリン(WAKO製)10μg/mlのみのLB培地において37℃で培養することによりAcNPVバクミドを落とし、その大腸菌(DH10B+ヘルパープラスミド)に、BmNPV/miniF−kan.をエレクトロポレーションした。ついで、得られた大腸菌からなるコンピテントセルを作製した。
【0030】
試験例1
(トランスポジション)
BmNPVシャトルベクターのシステムが完成したことを確認するため、以下のようにしてトランスポジションを行なった。
【0031】
クローニングベクターpENTR TOPO(インビトロジェン製)にGFP遺伝子をクローニングし、得られたベクターで実施例1で作製したコンピテントセルを形質転換した。ついで、カナマイシン50μg/ml、テトラサイクリン10μg/ml、ゲンタマイシン(インビトロジェン製)7μg/ml、Bluo−gal(WAKO製)100μg/mlおよびIPTG(WAKO製)40μg/mlを含有するLB培地において37℃で形質転換体を培養した。トランスポジションの行なわれた組み換えBmNPVシャトルベクターを含有するコロニーは、青白選択によって選択された。
【0032】
トランスポジションの行なわれた組み換えBmNPVシャトルベクターDNAを、アルカリ−SDS法およびイソプロプロパノール沈殿法によって分離した。
【0033】
試験例2
(組み換えウイルスの作製)
試験例1で得られたBmNPVシャトルベクターDNAを用いて組み換えウイルスの作製が可能であるか否かを、以下のようにして確認した。
【0034】
BmNPVシャトルベクターDNAをBm5細胞にトランスフェクションした。ついで、培地(TNM−FH+10%FBS+0.5%Antibiotic-Antimyotic)において27℃でBm5細胞を培養し、蛍光顕微鏡を用いてGFPの蛍光を観察することにより、組換えウイルスが作製されたことを確認した。
【0035】
【発明の効果】
本発明により、BmNPVシャトルベクターが提供された。
【0036】
このシステムによって、BmNPVの組み換えウイルスも迅速かつ効率よく作製することができる。したがって、組み換えBmNPVを用いた蚕によるタンパク質の大量発現が、今まで以上に簡便になった。
【0037】
【配列表】
Claims (3)
- (i)薬剤耐性遺伝子−miniFレプリコン−LacZα−mini-attTn7−LacZαの配列を得る工程、
(ii)BmNPV用トランスファーベクターから制限酵素Bal 31処理によりポリヘドリンプロモーターを削る工程、
(iii)(ii)で得られたポリヘドリンプロモーター欠損BmNPV用トランスファーベクターに(i)で得られた薬剤耐性遺伝子−miniFレプリコン−LacZα−mini-attTn7−LacZαの配列を挿入し、miniFレプリコン−LacZα−mini-attTn7−LacZαが含まれるBmNPV用トランスファーベクターを得る工程、および
(iv)(iii)で得られたBmNPV用トランスファーベクターをBmNPV DNAに組込む工程
を含む、BmNPVシャトルベクターの製造方法。 - 前記BmNPV用トランスファーベクターがpBK283である請求項1記載の方法。
- 前記(ii)のポリヘドリンプロモーターを削る工程が、制限酵素Kpn IによりBmNPV用トランスファーベクターpBK283を切断し、ついで制限酵素Bal 31処理により150Kb削ることによりなされる請求項2記載の方法。
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