JPH104973A - 組換えバキュロウイルス及びその利用 - Google Patents
組換えバキュロウイルス及びその利用Info
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- JPH104973A JPH104973A JP8181513A JP18151396A JPH104973A JP H104973 A JPH104973 A JP H104973A JP 8181513 A JP8181513 A JP 8181513A JP 18151396 A JP18151396 A JP 18151396A JP H104973 A JPH104973 A JP H104973A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子およ
びポリＡ配列を有する組換えバキュロウイルス、および
該組換えバキュロウイルスとアデノウイルスＥ２Ａ遺伝
子領域の両側に位置する同方向を向いた２つのリコンビ
ナーゼ認識配列を有する組換えアデノウイルスを動物細
胞に共感染させ、該組換えアデノウイルスの２つのリコ
ンビナーゼ認識配列間に存するＥ２Ａ遺伝子領域を切除
することを特徴とするＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウ
イルスの製造方法。 【効果】本発明の組換えバキュロウイルスを使用するこ
とにより、目的の組換えアデノウイルスの分離、精製が
容易になる。
びポリＡ配列を有する組換えバキュロウイルス、および
該組換えバキュロウイルスとアデノウイルスＥ２Ａ遺伝
子領域の両側に位置する同方向を向いた２つのリコンビ
ナーゼ認識配列を有する組換えアデノウイルスを動物細
胞に共感染させ、該組換えアデノウイルスの２つのリコ
ンビナーゼ認識配列間に存するＥ２Ａ遺伝子領域を切除
することを特徴とするＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウ
イルスの製造方法。 【効果】本発明の組換えバキュロウイルスを使用するこ
とにより、目的の組換えアデノウイルスの分離、精製が
容易になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は動物細胞感染用の組
換えバキュロウイルス及びその利用に関する。さらに詳
しくは、リコンビナーゼ遺伝子発現用組換えバキュロウ
イルスと該ウイルスを用いた遺伝子治療用組換えアデノ
ウイルスの製造法に関する。
換えバキュロウイルス及びその利用に関する。さらに詳
しくは、リコンビナーゼ遺伝子発現用組換えバキュロウ
イルスと該ウイルスを用いた遺伝子治療用組換えアデノ
ウイルスの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで遺伝子導入のウイルスベクター
としてレトロウイルスが良く用いられたが、このウイル
スは分裂している細胞にしか導入できないことや宿主細
胞の染色体に組み込まれてしまうことにより、特に遺伝
子治療においてはその安全性の観点より問題があり、そ
の応用範囲は限られていると考えられている。アデノウ
イルスベクターは、種々の動物培養細胞で１００％近い
導入効率を示すこと、またレトロウイルスと異なり積極
的な染色体組み込みの機構を持たないこと、さらに、休
止期の細胞でも遺伝子導入出来るという利点もあり、外
来遺伝子導入実験のベクターとしての応用範囲は極めて
広く、近い将来は遺伝子治療の主要技術の一つとして確
立するであろうと考えられている。
としてレトロウイルスが良く用いられたが、このウイル
スは分裂している細胞にしか導入できないことや宿主細
胞の染色体に組み込まれてしまうことにより、特に遺伝
子治療においてはその安全性の観点より問題があり、そ
の応用範囲は限られていると考えられている。アデノウ
イルスベクターは、種々の動物培養細胞で１００％近い
導入効率を示すこと、またレトロウイルスと異なり積極
的な染色体組み込みの機構を持たないこと、さらに、休
止期の細胞でも遺伝子導入出来るという利点もあり、外
来遺伝子導入実験のベクターとしての応用範囲は極めて
広く、近い将来は遺伝子治療の主要技術の一つとして確
立するであろうと考えられている。
【０００３】アデノウイルスベクターの利用は遺伝子治
療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝
子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ
直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接
欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo法として研究
が精力的に進められている。既に嚢胞性繊維症では、米
国で実際に患者への実験治療を認められており、筋ジス
トロフィー症、家族性高コレステロール血症、また脳腫
瘍等に対して活発に研究されるようになった。
療技術の一つとして、また神経系などの高度に分化した
細胞での発現研究の面で急速に普及してきている。遺伝
子治療技術としては、既に構築され機能している組織へ
直接投与することにより機能を担っている生細胞へ直接
欠損した遺伝子を補う、いわゆる in vivo法として研究
が精力的に進められている。既に嚢胞性繊維症では、米
国で実際に患者への実験治療を認められており、筋ジス
トロフィー症、家族性高コレステロール血症、また脳腫
瘍等に対して活発に研究されるようになった。
【０００４】しかし、アデノウイルスベクターはレトロ
ウイルスベクターと異なり、積極的な染色体組み込みの
機構を持たないことから、目的遺伝子の発現が一時的で
ある。その期間は１〜２週間から、長くても２ヶ月程度
である。そのため治療効果を継続させる必要がある場合
には、なるべく長期間細胞内でアデノウイルスベクター
が安定に存在し、アデノウイルスベクター中に挿入され
た目的遺伝子が発現し続けることが望ましい。そして、
最近、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子の機能を抑
制することにより、目的遺伝子の発現期間が延長するこ
とがわかってきた（Yangら、Nature Genetics,vol.7,36
2-369(1993))。
ウイルスベクターと異なり、積極的な染色体組み込みの
機構を持たないことから、目的遺伝子の発現が一時的で
ある。その期間は１〜２週間から、長くても２ヶ月程度
である。そのため治療効果を継続させる必要がある場合
には、なるべく長期間細胞内でアデノウイルスベクター
が安定に存在し、アデノウイルスベクター中に挿入され
た目的遺伝子が発現し続けることが望ましい。そして、
最近、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子の機能を抑
制することにより、目的遺伝子の発現期間が延長するこ
とがわかってきた（Yangら、Nature Genetics,vol.7,36
2-369(1993))。
【０００５】一方、本発明者らは、アデノウイルスＥ２
Ａ遺伝子領域とＬ３遺伝子領域の間に外来ヌクレオチド
を導入し得る領域が存在することを発見した。この領域
には常法によりそのまま外来ヌクレオチドを導入するこ
とができるが、一旦適当なリンカーを常法により導入し
て必要な制限酵素部位を導入した後、外来ヌクレオチド
を導入してもよい。外来ヌクレオチドとしては、動物細
胞に感染させた後その細胞内で発現することが望まれる
ポリペプチドをコードする外来遺伝子でもよく、またそ
の外来ヌクレオチドがそのまま細胞中に共存する酵素の
基質となるものであってもよい。さらに、本発明者ら
は、上記の領域に外来ヌクレオチドとしてリコンビナー
ゼの認識配列を導入することにより、動物細胞内で発現
しうるリコンビナーゼ遺伝子を挿入した動物細胞感染用
の組換えアデノウイルスベクターと併用すれば動物細胞
内でアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域を欠失さ
せることができるようなアデノウイルスベクターの系を
構築した。
Ａ遺伝子領域とＬ３遺伝子領域の間に外来ヌクレオチド
を導入し得る領域が存在することを発見した。この領域
には常法によりそのまま外来ヌクレオチドを導入するこ
とができるが、一旦適当なリンカーを常法により導入し
て必要な制限酵素部位を導入した後、外来ヌクレオチド
を導入してもよい。外来ヌクレオチドとしては、動物細
胞に感染させた後その細胞内で発現することが望まれる
ポリペプチドをコードする外来遺伝子でもよく、またそ
の外来ヌクレオチドがそのまま細胞中に共存する酵素の
基質となるものであってもよい。さらに、本発明者ら
は、上記の領域に外来ヌクレオチドとしてリコンビナー
ゼの認識配列を導入することにより、動物細胞内で発現
しうるリコンビナーゼ遺伝子を挿入した動物細胞感染用
の組換えアデノウイルスベクターと併用すれば動物細胞
内でアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域を欠失さ
せることができるようなアデノウイルスベクターの系を
構築した。
【０００６】ここに、リコンビナーゼとは、特異的なＤ
ＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配
列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結
合の全行程を行う。そこで、この酵素を発現する組換え
アデノウイルスベクターと、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に
この認識配列を同じ向きに２コピーを持つ組換えアデノ
ウイルスベクターを作製し、両組換えウイルスを細胞
（例えば、ヒト胎児腎由来の２９３細胞）に共感染させ
ると、発現したリコンビナーゼにより２つの認識配列間
の再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出
される。従って、こうして得られるＥ２Ａ遺伝子領域を
欠失した組換えアデノウイルスは、Ｅ２Ａ遺伝子領域を
含む組換えアデノウイルスに比して顕著に安定になり、
遺伝子治療に有利に使用できると期待できる。
ＮＡ組換え酵素で、数十塩基からなる特異的なＤＮＡ配
列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断・鎖の交換と結
合の全行程を行う。そこで、この酵素を発現する組換え
アデノウイルスベクターと、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側に
この認識配列を同じ向きに２コピーを持つ組換えアデノ
ウイルスベクターを作製し、両組換えウイルスを細胞
（例えば、ヒト胎児腎由来の２９３細胞）に共感染させ
ると、発現したリコンビナーゼにより２つの認識配列間
の再構成が起き、挟まれた部分が環状分子として切り出
される。従って、こうして得られるＥ２Ａ遺伝子領域を
欠失した組換えアデノウイルスは、Ｅ２Ａ遺伝子領域を
含む組換えアデノウイルスに比して顕著に安定になり、
遺伝子治療に有利に使用できると期待できる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記の方法により得ら
れる目的のＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイルスを単
離するには、最終的にリコンビナーゼ発現組換えアデノ
ウイルスと目的のＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイル
スを分離する操作が必要になる。両者はＣｓＣｌの密度
平衡遠心分離法での分離が可能であるものの、わずかな
密度の違いでの分離は高度な技術を要し、目的のＥ２Ａ
遺伝子欠失組換えアデノウイルスを分取する際、リコン
ビナーゼ発現組換えアデノウイルスが混入するおそれが
あった。
れる目的のＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイルスを単
離するには、最終的にリコンビナーゼ発現組換えアデノ
ウイルスと目的のＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイル
スを分離する操作が必要になる。両者はＣｓＣｌの密度
平衡遠心分離法での分離が可能であるものの、わずかな
密度の違いでの分離は高度な技術を要し、目的のＥ２Ａ
遺伝子欠失組換えアデノウイルスを分取する際、リコン
ビナーゼ発現組換えアデノウイルスが混入するおそれが
あった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記の問題を解決するために鋭意検討し、ヒト胎児腎由来
のアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現している２
９３細胞にリコンビナーゼを供給する方法としてバキュ
ロウイルス（ＡｃＮＰＶ）ベクターが適していることを
見出した。昆虫細胞を宿主とし、バキュロウイルスベク
ターを用いた遺伝子発現系は、ウイルスの強力な多角体
プロモーターを利用できるため、きわめて効率よく発現
産物を生成し、また多くの場合本来の生物活性を保持す
ることができる。また最近、バキュロウイルス（ＡｃＮ
ＰＶ）はヒト肝由来細胞には効率良く感染し、種々の外
来プロモーターからレポーター遺伝子が効率良く発現す
るのに対し、他の細胞には感染効率が低いことが明らか
にされた(Hofmann C. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10099-10103, 1995 ；Boyce M.F.ら、Proc.Nat
l. Acad. Sci. USA, 93, 2348-2352, 1996 ) が、本発
明者らは、２９３細胞に対しても十分な感染が見られ、
リコンビナーゼ発現組換えバキュロウイルスを感染させ
た２９３細胞中で十分量のリコンビナーゼが産生される
ことを見出した。感染２９３細胞中では、目的のＥ２Ａ
遺伝子欠失組換えアデノウイルスとリコンビナーゼ発現
組換えバキュロウイルスが混在するが、後者は２５００
０×ｇ、６０分間の遠心分離により沈澱物として回収さ
れた。一方、組換えアデノウイルスは同じ遠心条件で上
清画分に存在するため、両ウイルスは簡単に分離するこ
とができ、上記の問題を解決することができた。
記の問題を解決するために鋭意検討し、ヒト胎児腎由来
のアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現している２
９３細胞にリコンビナーゼを供給する方法としてバキュ
ロウイルス（ＡｃＮＰＶ）ベクターが適していることを
見出した。昆虫細胞を宿主とし、バキュロウイルスベク
ターを用いた遺伝子発現系は、ウイルスの強力な多角体
プロモーターを利用できるため、きわめて効率よく発現
産物を生成し、また多くの場合本来の生物活性を保持す
ることができる。また最近、バキュロウイルス（ＡｃＮ
ＰＶ）はヒト肝由来細胞には効率良く感染し、種々の外
来プロモーターからレポーター遺伝子が効率良く発現す
るのに対し、他の細胞には感染効率が低いことが明らか
にされた(Hofmann C. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10099-10103, 1995 ；Boyce M.F.ら、Proc.Nat
l. Acad. Sci. USA, 93, 2348-2352, 1996 ) が、本発
明者らは、２９３細胞に対しても十分な感染が見られ、
リコンビナーゼ発現組換えバキュロウイルスを感染させ
た２９３細胞中で十分量のリコンビナーゼが産生される
ことを見出した。感染２９３細胞中では、目的のＥ２Ａ
遺伝子欠失組換えアデノウイルスとリコンビナーゼ発現
組換えバキュロウイルスが混在するが、後者は２５００
０×ｇ、６０分間の遠心分離により沈澱物として回収さ
れた。一方、組換えアデノウイルスは同じ遠心条件で上
清画分に存在するため、両ウイルスは簡単に分離するこ
とができ、上記の問題を解決することができた。
【０００９】即ち、本発明の要旨は、（１） プロモー
ター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する
組換えバキュロウイルス、（２） リコンビナーゼ遺伝
子が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの
遺伝子である前記（１）記載の組換えバキュロウイル
ス、（３） プロモーターおよびポリＡが、サイトメガ
ロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモ
ーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプタ
ーおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーター
（ＣＡＧプロモーター）である前記（１）又は（２）記
載の組換えバキュロウイルス、（４） プロモーター、
リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換え
バキュロウイルスと、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子領域
の両側に位置する同方向を向いた２つのリコンビナーゼ
認識配列を有する組換えアデノウイルスを動物細胞に共
感染させ、該組換えアデノウイルスの２つのリコンビナ
ーゼ認識配列間に存するＥ２Ａ遺伝子領域を切除するこ
とを特徴とするＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイルス
の製造方法、（５） ２つのリコンビナーゼ認識配列の
挿入部位の一方が、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子の終止
コドンとアデノウイルスＬ３遺伝子の終止コドンの間で
あって、両遺伝子のポリＡ付加シグナルの機能を欠失し
ない範囲であることを特徴とする前記（４）記載の製造
方法、（６） リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファ
ージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である前記
（４）又は（５）記載の製造方法、（７） リコンビナ
ーゼ認識配列が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナー
ゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰのＤＮＡ配列（配列番
号：１）である前記（４）〜（６）いずれか記載の製造
方法、（８） プロモーターおよびポリＡが、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモータ
ー（ＣＡＧプロモーター）である前記（４）〜（７）い
ずれか記載の製造方法、に関する。
ター、リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する
組換えバキュロウイルス、（２） リコンビナーゼ遺伝
子が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの
遺伝子である前記（１）記載の組換えバキュロウイル
ス、（３） プロモーターおよびポリＡが、サイトメガ
ロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモ
ーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプタ
ーおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモーター
（ＣＡＧプロモーター）である前記（１）又は（２）記
載の組換えバキュロウイルス、（４） プロモーター、
リコンビナーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換え
バキュロウイルスと、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子領域
の両側に位置する同方向を向いた２つのリコンビナーゼ
認識配列を有する組換えアデノウイルスを動物細胞に共
感染させ、該組換えアデノウイルスの２つのリコンビナ
ーゼ認識配列間に存するＥ２Ａ遺伝子領域を切除するこ
とを特徴とするＥ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイルス
の製造方法、（５） ２つのリコンビナーゼ認識配列の
挿入部位の一方が、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子の終止
コドンとアデノウイルスＬ３遺伝子の終止コドンの間で
あって、両遺伝子のポリＡ付加シグナルの機能を欠失し
ない範囲であることを特徴とする前記（４）記載の製造
方法、（６） リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファ
ージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である前記
（４）又は（５）記載の製造方法、（７） リコンビナ
ーゼ認識配列が大腸菌Ｐ１ファージ由来のリコンビナー
ゼＣｒｅの基質となるｌｏｘＰのＤＮＡ配列（配列番
号：１）である前記（４）〜（６）いずれか記載の製造
方法、（８） プロモーターおよびポリＡが、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモータ
ー（ＣＡＧプロモーター）である前記（４）〜（７）い
ずれか記載の製造方法、に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】昆虫に感染して病気を起こすウイ
ルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを
遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜
翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロ
ウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒド
ラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが
核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子
量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感
染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を
埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存する
ためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必
要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来
遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖
する。
ルスであるバキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを
遺伝子としてもつエンベロープウイルスで、鱗翅目、膜
翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロ
ウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒド
ラ）と呼ばれる封入体を大量につくる一群のウイルスが
核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子
量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成され、感
染後期に大量につくられその中に多数のウイルス粒子を
埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存する
ためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必
要ないので、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来
遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖
する。
【００１１】本発明で用いられるバキュロウイルスは、
ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ カリフォル
ニカ（Autographa californica）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）
やカイコのボンビックス モリ（Bombyx mori ）ＮＰＶ
（ＢｍＮＰＶ）の２つのウイルスがベクターとして主に
用いられ、それぞれウイルスの感染、継代細胞として、
スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera frugiperda
）細胞（Ｓｆ細胞）、ＢｍＮ４細胞などが入手、購入
可能である。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖
速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞および
ヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することか
ら、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。ＡｃＮＰＶ系
のトランスファーベクターとして、本発明者らは、ｐＡ
ｃＹＭ１（Matsuura,Yら、J.Gen.Virol.,68,1233-1250,
1987) （図６）を利用した。他の多くのベクターは、Ｎ
ＥＲＣウイルス研究所（オックスフォード、ＵＫ）のポ
ッセ博士（Dr.R.D.Possee ）より入手可能である。組換
えバキュロウイルス作製のためのウイルスＤＮＡは、野
生型ウイルスまたはＬａｃＺ遺伝子を組み込んだウイル
ス（図７）のいずれでも構わないが、組換えバキュロウ
イルスの識別の容易さにより、ＬａｃＺ遺伝子を組み込
んだウイルスが好ましい。
ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ カリフォル
ニカ（Autographa californica）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）
やカイコのボンビックス モリ（Bombyx mori ）ＮＰＶ
（ＢｍＮＰＶ）の２つのウイルスがベクターとして主に
用いられ、それぞれウイルスの感染、継代細胞として、
スポドプテラ フルギペルダ（Spodoptera frugiperda
）細胞（Ｓｆ細胞）、ＢｍＮ４細胞などが入手、購入
可能である。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖
速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞および
ヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することか
ら、ＡｃＮＰＶ系のベクターが好ましい。ＡｃＮＰＶ系
のトランスファーベクターとして、本発明者らは、ｐＡ
ｃＹＭ１（Matsuura,Yら、J.Gen.Virol.,68,1233-1250,
1987) （図６）を利用した。他の多くのベクターは、Ｎ
ＥＲＣウイルス研究所（オックスフォード、ＵＫ）のポ
ッセ博士（Dr.R.D.Possee ）より入手可能である。組換
えバキュロウイルス作製のためのウイルスＤＮＡは、野
生型ウイルスまたはＬａｃＺ遺伝子を組み込んだウイル
ス（図７）のいずれでも構わないが、組換えバキュロウ
イルスの識別の容易さにより、ＬａｃＺ遺伝子を組み込
んだウイルスが好ましい。
【００１２】本発明に用いられるアデノウイルスは、動
物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とする
ヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウ
イルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡで
あって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆
方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端
にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパ
ク質が共有結合しているという特異な構造をしている。
物を自然宿主とするものであり、特にヒトを宿主とする
ヒトアデノウイルスが好適に用いられる。ヒトアデノウ
イルスのゲノムは、約３６ｋｂｐの２本鎖線状ＤＮＡで
あって、ＤＮＡ鎖両端にはおよそ１００ｂｐからなる逆
方向反復塩基配列があり、そのＤＮＡ鎖両端の５’末端
にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切断加工された５５ｋのタンパ
ク質が共有結合しているという特異な構造をしている。
【００１３】本発明に用いられるアデノウイルスのゲノ
ムは、Ｅ１遺伝子領域特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失して
いることが好ましい。これは、アデノウイルスの細胞ガ
ン化活性に関与するＥ１Ａ遺伝子領域を欠失させること
により、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み込
んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。必
ずしもＥ１Ａ遺伝子領域の全てを欠失させる必要はない
が、例えば１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的
は達成される。このようにＥ１遺伝子領域を欠失してい
るアデノウイルスは、ヒト胎児腎由来細胞株２９３細胞
のようなＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現している
細胞株を除き、宿主細胞内で増殖することができないと
いう特徴を有する。また、本発明に用いられるアデノウ
イルスのゲノムは、Ｅ３遺伝子領域を欠失させてもよ
い。特に、Ｅ３遺伝子領域の７９．６〜８４．８％を欠
失させたものが好ましい。アデノウイルスの複製には不
要であるからである。
ムは、Ｅ１遺伝子領域特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失して
いることが好ましい。これは、アデノウイルスの細胞ガ
ン化活性に関与するＥ１Ａ遺伝子領域を欠失させること
により、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み込
んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。必
ずしもＥ１Ａ遺伝子領域の全てを欠失させる必要はない
が、例えば１．３〜９．３％の断片を除去すれば、目的
は達成される。このようにＥ１遺伝子領域を欠失してい
るアデノウイルスは、ヒト胎児腎由来細胞株２９３細胞
のようなＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現している
細胞株を除き、宿主細胞内で増殖することができないと
いう特徴を有する。また、本発明に用いられるアデノウ
イルスのゲノムは、Ｅ３遺伝子領域を欠失させてもよ
い。特に、Ｅ３遺伝子領域の７９．６〜８４．８％を欠
失させたものが好ましい。アデノウイルスの複製には不
要であるからである。
【００１４】ところで、実際にヒトや動物に投与した場
合、Ｅ１Ａ蛋白と同様の機能を有する蛋白が細胞中に存
在し、これによりわずかにアデノウイルス蛋白が発現す
る。これが細胞免疫を引起し、ウイルスＤＮＡを保持す
る細胞が攻撃を受け排除されることがわかっている。現
在使用されているＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠損型アデノウイルス
ベクターによる遺伝子発現が短期間である原因はここに
ある。これを防ぐためには、Ｅ２Ａ遺伝子の機能を欠失
させることが有効であることがＹａｎｇらにより明らか
にされた（Nature Genetics, vol.7, 362-369, 1993)。
これは、温度感受性のＥ２Ａ遺伝子変異株を利用したも
のであるが、動物に投与した場合、Ｅ２Ａ遺伝子の機能
発現が抑制されるものの機能発現を完全に止めることが
できない。Ｅ２Ａ遺伝子の機能発現を完全に止める手段
としてはＥ２Ａ遺伝子領域を欠失させることが考えられ
る。
合、Ｅ１Ａ蛋白と同様の機能を有する蛋白が細胞中に存
在し、これによりわずかにアデノウイルス蛋白が発現す
る。これが細胞免疫を引起し、ウイルスＤＮＡを保持す
る細胞が攻撃を受け排除されることがわかっている。現
在使用されているＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠損型アデノウイルス
ベクターによる遺伝子発現が短期間である原因はここに
ある。これを防ぐためには、Ｅ２Ａ遺伝子の機能を欠失
させることが有効であることがＹａｎｇらにより明らか
にされた（Nature Genetics, vol.7, 362-369, 1993)。
これは、温度感受性のＥ２Ａ遺伝子変異株を利用したも
のであるが、動物に投与した場合、Ｅ２Ａ遺伝子の機能
発現が抑制されるものの機能発現を完全に止めることが
できない。Ｅ２Ａ遺伝子の機能発現を完全に止める手段
としてはＥ２Ａ遺伝子領域を欠失させることが考えられ
る。
【００１５】本発明は、Ｅ２Ａ遺伝子の両端にリコンビ
ナーゼ認識配列を配置した組換えアデノウイルスとリコ
ンビナーゼ発現用バキュロウイルスを動物培養細胞に共
感染させ、細胞内で発現したリコンビナーゼによりＥ２
Ａ遺伝子欠失型感染性ウイルス粒子を作製するというも
のである。得られるＥ２Ａ遺伝子欠失型ウイルスはＥ２
Ａ遺伝子の発現が皆無であるため、目的とする遺伝子の
発現期間が大幅に延長することは間違いない。
ナーゼ認識配列を配置した組換えアデノウイルスとリコ
ンビナーゼ発現用バキュロウイルスを動物培養細胞に共
感染させ、細胞内で発現したリコンビナーゼによりＥ２
Ａ遺伝子欠失型感染性ウイルス粒子を作製するというも
のである。得られるＥ２Ａ遺伝子欠失型ウイルスはＥ２
Ａ遺伝子の発現が皆無であるため、目的とする遺伝子の
発現期間が大幅に延長することは間違いない。
【００１６】リコンビナーゼの認識配列の挿入位置は、
Ｅ２Ａ遺伝子領域の右側（図１参照）すなわちＥ３領域
内には従来から知られている領域があるが、Ｅ２Ａ遺伝
子領域の左側については、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンと
Ｌ３遺伝子の終止コドンの間であって、得られる組換え
アデノウイルスの増殖を阻害しない部位が選択される。
Ｅ２Ａ遺伝子領域やＬ３遺伝子領域の一部欠失あるいは
ポリＡ付加シグナル領域が一部欠失することになると、
得られる組換えアデノウイルスの増殖が阻害されるため
好ましくない。
Ｅ２Ａ遺伝子領域の右側（図１参照）すなわちＥ３領域
内には従来から知られている領域があるが、Ｅ２Ａ遺伝
子領域の左側については、Ｅ２Ａ遺伝子の終止コドンと
Ｌ３遺伝子の終止コドンの間であって、得られる組換え
アデノウイルスの増殖を阻害しない部位が選択される。
Ｅ２Ａ遺伝子領域やＬ３遺伝子領域の一部欠失あるいは
ポリＡ付加シグナル領域が一部欠失することになると、
得られる組換えアデノウイルスの増殖が阻害されるため
好ましくない。
【００１７】本発明に用いられるプロモーターとして
は、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺
伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ
４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝
子プロモーター、等があり、また、後者の例としては、
チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイ
ン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモー
ター等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーター
が特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイト
メガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプ
ロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセ
プターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からな
るハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターと
して特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。
その調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開
平３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行およ
び２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，Ｈ
ｉｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発
明に利用することができる。
は、動物ウイルス遺伝子プロモーターおよび動物細胞遺
伝子プロモーターが挙げられる。前者の例としてはＳＶ
４０遺伝子プロモーター、アデノウイルス主要後期遺伝
子プロモーター、等があり、また、後者の例としては、
チミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイ
ン遺伝子プロモーター、免疫グロブリン遺伝子プロモー
ター等がある。しかし本発明には、ＣＡＧプロモーター
が特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイト
メガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプ
ロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセ
プターおよびウサギβグロビン由来のポリＡ配列からな
るハイブリッドプロモーターであり、高発現ベクターと
して特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。
その調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開
平３−１６８０８７、１３頁２０行〜２０頁１４行およ
び２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ，Ｈ
ｉｎｄIII で切り出すことにより行うことができ、本発
明に利用することができる。
【００１８】本発明に用いられるリコンビナーゼは、特
異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、
この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全行程を
行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファー
ジＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）があ
る。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abre
mskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoe
ssら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質と
する。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認
識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の
２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコン
ビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、2
9、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイ
イのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これ
はＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular
and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これら
の中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが
本発明に特に好適である。
異的なＤＮＡ組換え酵素で、特定の塩基配列を認識し、
この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全行程を
行う。かかる酵素としては、大腸菌のバクテリオファー
ジＰ１がコードするもの（リコンビナーゼＣｒｅ）があ
る。これはバクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ（Abre
mskiら、J. Biol. Chem.1984、1509−1514；および Hoe
ssら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029）配列を基質と
する。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認
識配列となる。また、他のリコンビナーゼとして酵母の
２μプラスミド由来のＦＬＰ遺伝子がコードするリコン
ビナーゼが挙げられる（James R. Broarchら、Cell、2
9、227-234)。さらに、チゴサッカロマイセス・ルーイ
イのｐＳＲ１プラスミド由来のものも使用できる。これ
はＲ遺伝子にコードされる（Matsuzaki ら、Molecular
and Cellular Biology、８、955-962 (1988)) 。これら
の中では、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼが
本発明に特に好適である。
【００１９】リコンビナーゼ遺伝子は、例えば、リコン
ビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ
１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分を
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を
用いて増幅して本発明に使用することができる。その他
のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用い
て調製することができる。この場合に使用するプライマ
ーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるよ
うに選択され、さらに組換えバキュロウイルスベクター
の構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限
酵素切断配列を付加したものを使用することが好まし
い。
ビナーゼＣｒｅ遺伝子の場合は、バクテリオファージＰ
１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分を
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を
用いて増幅して本発明に使用することができる。その他
のリコンビナーゼ遺伝子の場合も同様にＰＣＲ法を用い
て調製することができる。この場合に使用するプライマ
ーは、リコンビナーゼ遺伝子の全配列がカバーされるよ
うに選択され、さらに組換えバキュロウイルスベクター
の構築の便宜のため、各プライマーの外側に適当な制限
酵素切断配列を付加したものを使用することが好まし
い。
【００２０】上記のリコンビナーゼの認識配列（基質と
なる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３
４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Ab
remskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および H
oessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法によ
り化学合成して本発明に使用することができる。
なる配列）は数十ｂｐであり、例えばｌｏｘＰ配列は３
４ｂｐであり、全て、塩基配列が知られているので（Ab
remskiら、J. Biol. Chem.1984、1509-1514 ；および H
oessら、P.N.A.S.、1984、81、1026−1029) 、常法によ
り化学合成して本発明に使用することができる。
【００２１】本発明に用いられるポリＡ配列としては、
特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来の
ものが特に好ましい。
特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来の
ものが特に好ましい。
【００２２】本発明においては、リコンビナーゼ遺伝子
をバキュロウイルスベクターに組み込む場合に、同時に
核移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。例え
ば、ＳＶ４０の核移行シグナルが利用できる。これは、
バキュロウイルスベクターにより感染細胞の細胞質内で
発現したリコンビナーゼがその認識配列を有するアデノ
ウイルスベクターに作用するには、核内に移行する必要
があり、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel
Kalderon ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からであ
る。
をバキュロウイルスベクターに組み込む場合に、同時に
核移行シグナル配列を組み込むことが好ましい。例え
ば、ＳＶ４０の核移行シグナルが利用できる。これは、
バキュロウイルスベクターにより感染細胞の細胞質内で
発現したリコンビナーゼがその認識配列を有するアデノ
ウイルスベクターに作用するには、核内に移行する必要
があり、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel
Kalderon ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からであ
る。
【００２３】本発明に使用される外来遺伝子としては、
上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）あるいはその他のプロモーターにより発現すること
ができる遺伝子であれば、特に限定されるものではな
く、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正
常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジス
トロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチ
トリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガ
ラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例
えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−
α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリ
ン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、
非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ
７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配
列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−
１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等
のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシ
ンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙
げられる。
上記のハイブリッドプロモーター（ＣＡＧプロモータ
ー）あるいはその他のプロモーターにより発現すること
ができる遺伝子であれば、特に限定されるものではな
く、有用性の観点から、ヒトの欠損遺伝子に対応する正
常遺伝子の配列（例えばアデノシンデアミナーゼ、ジス
トロフィン、低密度リポ蛋白レセプター、α−１アンチ
トリプシン、血液凝固第８因子、血液凝固第９因子、ガ
ラクトシダーゼα、もしくはβ）、サイトカイン類（例
えばインターロイキン−１〜１２、インターフェロン−
α，βもしくはγ、腫瘍壊死因子−αもしくはβ、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、エリスロポエチン、成長ホルモン、インシュリ
ン、インシュリン様成長ホルモン）、神経栄養因子類、
非自己抗原遺伝子（例えばアロＨＬＡ（ＨＬＡ−Ｂ
７））、ウィルス抗原等をコードするヌクレオチド配
列、ガン抑制遺伝子（例えば、ｐ５３、ＲＢ、ＷＴ−
１、ＮＭ２３、ＮＦ−１）、ガン遺伝子であるＲａｓ等
のアンチセンス配列、またはチミジンキナーゼやシトシ
ンデアミナーゼのような自殺遺伝子と呼ばれるものが挙
げられる。
【００２４】本発明の組換えアデノウイルスベクターに
組み込まれるプロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配
列は上流からこの順に配向していても逆の順に配向して
いてもよい。本発明において、組換えバキュロウイルス
と組換えアデノウイルスを共感染させる動物細胞として
は、ヒト、マウス、ラット等の哺乳類由来の細胞が挙げ
られ、両ウイルスが効率よく感染する細胞が用いられ
る。Ｅ１遺伝子欠失組換えアデノウイルスを用いる場合
には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現している動
物細胞が好ましく、例えば２９３細胞が挙げられる。
組み込まれるプロモーター、外来遺伝子およびポリＡ配
列は上流からこの順に配向していても逆の順に配向して
いてもよい。本発明において、組換えバキュロウイルス
と組換えアデノウイルスを共感染させる動物細胞として
は、ヒト、マウス、ラット等の哺乳類由来の細胞が挙げ
られ、両ウイルスが効率よく感染する細胞が用いられ
る。Ｅ１遺伝子欠失組換えアデノウイルスを用いる場合
には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現している動
物細胞が好ましく、例えば２９３細胞が挙げられる。
【００２５】次に、本発明の組換えアデノウイルスの製
造方法について説明する。 （１） まず、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側にある同方向を
向いた二つのリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、
外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイ
ルスの製造方法について述べる。便宜上、リコンビナー
ゼとしてはリコンビナーゼＣｒｅを、その認識配列とし
てはｌｏｘＰを、プロモーターおよびポリＡ配列として
は前記のＣＡＧプロモーターを、外来遺伝子としてはＬ
ａｃＺ遺伝子を使用する場合について述べるが、その他
のリコンビナーゼ、その認識配列、プロモーターおよび
ポリＡ配列を使用する場合も実質的に同様の手法を利用
することができる。
造方法について説明する。 （１） まず、Ｅ２Ａ遺伝子領域の両側にある同方向を
向いた二つのリコンビナーゼ認識配列、プロモーター、
外来遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えアデノウイ
ルスの製造方法について述べる。便宜上、リコンビナー
ゼとしてはリコンビナーゼＣｒｅを、その認識配列とし
てはｌｏｘＰを、プロモーターおよびポリＡ配列として
は前記のＣＡＧプロモーターを、外来遺伝子としてはＬ
ａｃＺ遺伝子を使用する場合について述べるが、その他
のリコンビナーゼ、その認識配列、プロモーターおよび
ポリＡ配列を使用する場合も実質的に同様の手法を利用
することができる。
【００２６】（ａ）（ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔの構築） ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行う。次に、得られたプラ
スミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
う。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した
後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリンカ
ーとのリガーゼ反応を行い、ＣＡＧプロモーターを含む
プラスミドｐＣＭｗＣＨ３１を取得する。元の制限酵素
部位の消失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の
後、アガロースゲル電気泳動により確認する。
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行う。次に、得られたプラ
スミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
う。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断した
後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリンカ
ーとのリガーゼ反応を行い、ＣＡＧプロモーターを含む
プラスミドｐＣＭｗＣＨ３１を取得する。元の制限酵素
部位の消失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の
後、アガロースゲル電気泳動により確認する。
【００２７】 ｐＡｄｅｘ１ｃの構築 Ｅ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末
端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７Ｄ）、
５型アデノウイルスＤＮＡにＢａｍＨＩリンカーを結合
させた後ＨｉｎｄIII 消化して得られるフラグメント
（２．８ｋｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％
に当たる）をｐＵＣ１９に挿入して得られるプラスミド
（ｐＵＡＦ０−８）、およびアデノウイルスＤＮＡをＨ
ｉｎｄIII 消化して得られる３．４ｋｂフラグメント
（アデノウイルスゲノムの左側末端の８−１７％に当た
る）をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入して得られ
るプラスミド（ｐＵＡＦ８−１７）とを調製し、ついで
ｐＵＡＦ０−８由来の４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｃｌａ
Ｉフラグメントと、ｐＵＡＦ８−１７由来の２．９ｋｂ
のＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをつなぎ、ｐＵ
Ｃ１９のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 部位へ挿入してｐＵ
ＡＦ０−１７Ｄを得る。
端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７Ｄ）、
５型アデノウイルスＤＮＡにＢａｍＨＩリンカーを結合
させた後ＨｉｎｄIII 消化して得られるフラグメント
（２．８ｋｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％
に当たる）をｐＵＣ１９に挿入して得られるプラスミド
（ｐＵＡＦ０−８）、およびアデノウイルスＤＮＡをＨ
ｉｎｄIII 消化して得られる３．４ｋｂフラグメント
（アデノウイルスゲノムの左側末端の８−１７％に当た
る）をｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入して得られ
るプラスミド（ｐＵＡＦ８−１７）とを調製し、ついで
ｐＵＡＦ０−８由来の４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｃｌａ
Ｉフラグメントと、ｐＵＡＦ８−１７由来の２．９ｋｂ
のＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをつなぎ、ｐＵ
Ｃ１９のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 部位へ挿入してｐＵ
ＡＦ０−１７Ｄを得る。
【００２８】さらに、５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓ
ｔ１１０７とＥｃｏＲＩで消化し２１．６ｋｂのフラグ
メントを得る。また、アデノウイルスゲノム由来のｐＸ
２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋ
ｂ）を調製する。一方、charomid９−１１(I. Saito &
G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83,
p8664-8668, 1986) をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーショ
ンする。ついでそのＥｃｏＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカ
ーを挿入し、シャロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１を調製
する。
ｔ１１０７とＥｃｏＲＩで消化し２１．６ｋｂのフラグ
メントを得る。また、アデノウイルスゲノム由来のｐＸ
２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋ
ｂ）を調製する。一方、charomid９−１１(I. Saito &
G. Stark, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83,
p8664-8668, 1986) をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化
し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーショ
ンする。ついでそのＥｃｏＲＩ部位へＢａｍＨＩリンカ
ーを挿入し、シャロミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１を調製
する。
【００２９】上記のｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−
Ｂｓｔ１１０７フラグメント（２．９ｋｂ）とアデノウ
イルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（２１．６ｋｂ）とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩ
フラグメント（６．５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６
Ｉで消化したｃｈｄＲＢＲ７−１１とライゲーションす
る。その後、in vitroパッケージングし、ＤＨ５αへ感
染させる。形質転換株から目的のフラグメントをもつも
のを単離し、ｐＡｄｅｘ１ｃと名づける。
Ｂｓｔ１１０７フラグメント（２．９ｋｂ）とアデノウ
イルスゲノムのＢｓｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（２１．６ｋｂ）とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩ
フラグメント（６．５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６
Ｉで消化したｃｈｄＲＢＲ７−１１とライゲーションす
る。その後、in vitroパッケージングし、ＤＨ５αへ感
染させる。形質転換株から目的のフラグメントをもつも
のを単離し、ｐＡｄｅｘ１ｃと名づける。
【００３０】 カセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの
構築 ＣｌａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
Ａｄｅｘ１ｃと、５’末端リン酸化を施した下記の合成
リンカー（１）（配列番号：２）（ＳｗａＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩで消化する。
この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＳｗａ
Ｉ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造
のコスミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ
ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、リ
ンカー由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
でライゲーションを行い、セルフアニーリングによる環
状化を行う。ついでイン・ビトロ・パッケージングを行
い、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢ
ａｍＨＩおよびＮｒｕＩ同時消化により確認する。目的
とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入
された場合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認によ
り目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図
１）を取得する。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
構築 ＣｌａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
Ａｄｅｘ１ｃと、５’末端リン酸化を施した下記の合成
リンカー（１）（配列番号：２）（ＳｗａＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＳａｌＩ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩで消化する。
この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＳｗａ
Ｉ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造
のコスミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ
ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけ、リ
ンカー由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
でライゲーションを行い、セルフアニーリングによる環
状化を行う。ついでイン・ビトロ・パッケージングを行
い、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢ
ａｍＨＩおよびＮｒｕＩ同時消化により確認する。目的
とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入
された場合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認によ
り目的とするカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図
１）を取得する。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
【００３１】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡ
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのライゲーションを行う。リガーゼを熱失活させた
後、Ｐｓｐ１４０６Ｉで消化する。この切断はリンカー
が複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を切
り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個連
結した構造の断片を得るために行う。このあと、反応液
をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣｌａ
Ｉで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍ
ｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤＮＡ
断片と前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼでライゲーションさせる。リガーゼを熱失活させた
後、ＣｌａＩを添加し、セルフアニーリングにより生じ
た環状コスミドを切断する。ついで、イン・ビトロ・パ
ッケージングに用いる。
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのライゲーションを行う。リガーゼを熱失活させた
後、Ｐｓｐ１４０６Ｉで消化する。この切断はリンカー
が複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を切
り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個連
結した構造の断片を得るために行う。このあと、反応液
をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣｌａ
Ｉで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍ
ｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤＮＡ
断片と前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼでライゲーションさせる。リガーゼを熱失活させた
後、ＣｌａＩを添加し、セルフアニーリングにより生じ
た環状コスミドを切断する。ついで、イン・ビトロ・パ
ッケージングに用いる。
【００３２】更に、各コロニーから調製したコスミドＤ
ＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ同時消化により
確認する。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ
と４．８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７及び
２．５ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とする
カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得する。
ＮＡの構造をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ同時消化により
確認する。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐ
と４．８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７及び
２．５ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とする
カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得する。
【００３３】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
ＡｄｅｘｌｐＣＡｗを、5'末端リン酸化を施した下記の
合成リンカー（２）（配列番号：３）（ＣｌａＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を
含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反
応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、
ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させる。この
切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰａｃＩ断
片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコ
スミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃ
ｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー
由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む
反応液中で一晩結合させ、セルフアニーリングによる環
状化を行う。リガーゼを熱失活させた後、イン・ビトロ
・パッケージングに用いる。次に、各コロニーから調製
したコスミドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同
時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場
合５５２ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの
断片を生じる。これを確認することにより目的とするカ
セットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得す
る。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩで切断した後エタノール沈澱により回収したｐ
ＡｄｅｘｌｐＣＡｗを、5'末端リン酸化を施した下記の
合成リンカー（２）（配列番号：３）（ＣｌａＩ、Ｘｂ
ａＩ、ＳｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を
含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反
応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた後、
ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させる。この
切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰａｃＩ断
片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された構造のコ
スミドを得るために行う。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃ
ｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー
由来の小断片を除去した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む
反応液中で一晩結合させ、セルフアニーリングによる環
状化を行う。リガーゼを熱失活させた後、イン・ビトロ
・パッケージングに用いる。次に、各コロニーから調製
したコスミドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同
時消化により確認する。目的とする方向に挿入された場
合５５２ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの
断片を生じる。これを確認することにより目的とするカ
セットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得す
る。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
【００３４】（ｂ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その
１）ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製 ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔをＢａｍＨＩで切断した後、熱処
理によりＢａｍＨＩを失活させる。次にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより一晩結合させる。次いでこの反応混液を用い
て大腸菌ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得る。
１）ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製 ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔをＢａｍＨＩで切断した後、熱処
理によりＢａｍＨＩを失活させる。次にＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより一晩結合させる。次いでこの反応混液を用い
て大腸菌ＤＨ５α（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得る。
【００３５】 ｐＡ６０Ｘ９９の作製（アデノウイル
ス以外のＸｂａＩ部位の除去） ｐＡ６０Ｘ９９ＸをＸｂａＩ処理し、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位のうち１ヶ
所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲ
ルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回
収する。次に、この断片をＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造
製）で両末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製する。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩ
およびＸｂａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片すなわ
ちプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図３）を得る。
ス以外のＸｂａＩ部位の除去） ｐＡ６０Ｘ９９ＸをＸｂａＩ処理し、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位のうち１ヶ
所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲ
ルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回
収する。次に、この断片をＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造
製）で両末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製する。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩ
およびＸｂａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片すなわ
ちプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図３）を得る。
【００３６】 ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の作製（ＢｓｒＧ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏｌで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵
素（宝酒造製）で両末端を平滑化する。その後フェノー
ル：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノー
ル沈澱する。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ６０
μｌに溶解する。これと５’末端リン酸化ＫｐｎＩリン
カー（宝酒造製）、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを
含むリガーゼ反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合
させる。次に、Ａｓｐ７１８（ベーリンガー製）で消化
する。反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰ
を含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電
気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏｌで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵
素（宝酒造製）で両末端を平滑化する。その後フェノー
ル：クロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノー
ル沈澱する。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ６０
μｌに溶解する。これと５’末端リン酸化ＫｐｎＩリン
カー（宝酒造製）、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを
含むリガーゼ反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合
させる。次に、Ａｓｐ７１８（ベーリンガー製）で消化
する。反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰ
を含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電
気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
【００３７】なお、上記のｐＵＬＬ２ｒは以下のように
して調製する。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得る。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCG
AGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGC
TCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
して調製する。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得る。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCG
AGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGC
TCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
【００３８】一方、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９（１０μ
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。このＤ
ＮＡ断片と前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断
片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反
応液中で一晩結合させる。これに滅菌水、ＢｓｒＧＩ反
応ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で１０分間インキュベー
トすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＢｓｒＧ
Ｉで処理してセルフアニーリングにより生じた環状のｐ
Ａ６０Ｘ９９を切断する。次いでこの反応混液１０μｌ
を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製する。
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。このＤ
ＮＡ断片と前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断
片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ反
応液中で一晩結合させる。これに滅菌水、ＢｓｒＧＩ反
応ｂｕｆｆｅｒを加え、７０℃で１０分間インキュベー
トすることによりリガーゼを熱失活させた後、ＢｓｒＧ
Ｉで処理してセルフアニーリングにより生じた環状のｐ
Ａ６０Ｘ９９を切断する。次いでこの反応混液１０μｌ
を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転
換体からプラスミドＤＮＡを調製する。
【００３９】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得す
る。
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得す
る。
【００４０】 ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の作製（Ｘｂａ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏＩを含む反応系１００μｌ中で切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平
滑化する。ついで、フェノール：クロロホルム（１：
１）処理を施した後、エタノール沈澱する。沈澱物を遠
心分離により取得し、ＴＥに溶解する。これと５’末端
リン酸化ＳｐｅＩリンカー（宝酒造製）、ＡＴＰおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。
さらに、ＳｐｅＩを加え消化した後、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒをＸｈｏＩを含む反応系１００μｌ中で切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）で両末端を平
滑化する。ついで、フェノール：クロロホルム（１：
１）処理を施した後、エタノール沈澱する。沈澱物を遠
心分離により取得し、ＴＥに溶解する。これと５’末端
リン酸化ＳｐｅＩリンカー（宝酒造製）、ＡＴＰおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させる。
さらに、ＳｐｅＩを加え消化した後、反応混液をアガロ
ースゲル電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ
断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤ
ＮＡ断片を回収する。
【００４１】一方、ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を、ＸｂａＩで
切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２
３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳
動によりゲルからＤＮＡを回収する。このＤＮＡ断片と
前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片、ＡＴＰお
よびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させ、ついでこれをＸｂａＩで処
理し、セルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ
６０Ｘ９９を切断する。この反応混液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを調製する。
切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、２
３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳
動によりゲルからＤＮＡを回収する。このＤＮＡ断片と
前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片、ＡＴＰお
よびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液中で一晩結合させ
る。リガーゼを熱失活させ、ついでこれをＸｂａＩで処
理し、セルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ
６０Ｘ９９を切断する。この反応混液を用いて大腸菌Ｄ
Ｈ５αを形質転換し、得られた形質転換体からプラスミ
ドＤＮＡを調製する。
【００４２】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得する。
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動する。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得する。
【００４３】 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを、Ｃｓｐ４５Ｉ（東洋紡製）で
切断し、次いで、同反応液中でＢａｍＨＩ、さらにＥｃ
ｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によるチ
ェックを行う。２１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り
出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
なお、Ｃｓｐ４５１およびＥｃｏＲＩによる切断は２１
ｋｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収する際、他の断片が
混入するのを防ぐためである。
切断し、次いで、同反応液中でＢａｍＨＩ、さらにＥｃ
ｏＲＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動によるチ
ェックを行う。２１ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り
出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。
なお、Ｃｓｐ４５１およびＥｃｏＲＩによる切断は２１
ｋｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収する際、他の断片が
混入するのを防ぐためである。
【００４４】ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩで切断
した後、フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過する。回収したＤＮＡ断片と前述の２１ｋ
ｂのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含
む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた
後、これをイン・ビトロ・パッケージングに用いる。
した後、フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過する。回収したＤＮＡ断片と前述の２１ｋ
ｂのＤＮＡ断片、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含
む反応液中で一晩結合させる。リガーゼを熱失活させた
後、これをイン・ビトロ・パッケージングに用いる。
【００４５】即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージ
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ製）を用い、残りは−８０℃に凍結する。ギガバック
ＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低い
のでインサートが入って大きくなったコスミドをある程
度選択することができる。本発明では、１０個のコロニ
ーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的のクロ
ーン（ウイルスゲノムが正しく連結されたクローン）を
容易に得ることができる。コスミドの扱い方について
は、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：183-187, 1989)
に従って行う。
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ製）を用い、残りは−８０℃に凍結する。ギガバック
ＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパッケージ効率が低い
のでインサートが入って大きくなったコスミドをある程
度選択することができる。本発明では、１０個のコロニ
ーを拾えば大半はインサートを含んでおり、目的のクロ
ーン（ウイルスゲノムが正しく連結されたクローン）を
容易に得ることができる。コスミドの扱い方について
は、常法（斎藤 泉他、実験医学：７：183-187, 1989)
に従って行う。
【００４６】パッケージングされたコスミドを大腸菌Ｄ
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）に感染させる。即ち、Ａ
ｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートとＡｐ+ ＬＢ
（ｐｏｏｌ）に各種の濃度で接種し、一晩培養する。ｐ
ｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制限
酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの割
合を調べる。コロニーは丸ごと寒天ごと取りＡｐ+ ＬＢ
で一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製する。次
に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＤ
ｒａＩ切断により確認する。目的とする方向に挿入され
た場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入された場合１．４ｋｂ
の断片を生じる。これにより目的とするカセットコスミ
ドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得する。
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）に感染させる。即ち、Ａ
ｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートとＡｐ+ ＬＢ
（ｐｏｏｌ）に各種の濃度で接種し、一晩培養する。ｐ
ｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制限
酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの割
合を調べる。コロニーは丸ごと寒天ごと取りＡｐ+ ＬＢ
で一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを調製する。次
に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＤ
ｒａＩ切断により確認する。目的とする方向に挿入され
た場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入された場合１．４ｋｂ
の断片を生じる。これにより目的とするカセットコスミ
ドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得する。
【００４７】（ｃ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その
２）ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＵＣＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。同
様の操作によりｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
により切断し、２．７ｋｂの断片を回収する。次に両断
片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次い
でこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、
得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目
的とするプラスミドｐＵＣＡ６０６５を得る。
２）ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＵＣＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。同
様の操作によりｐＵＣ１９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ
により切断し、２．７ｋｂの断片を回収する。次に両断
片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴ
Ｐ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次い
でこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、
得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、目
的とするプラスミドｐＵＣＡ６０６５を得る。
【００４８】 ｐ２ＬＡ６０６５の作製 ｐＵＣＡ６０６５をＢａｍＨＩおよびＡｆｌIII で切断
し、７８０ｂｐの断片を調製し、また、同プラスミドを
ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで切断し、３．６ｋｂの断
片を調製する。これら両断片とｌｏｘＰ配列を含む下記
のリンカーＤＮＡ（配列番号：５）を混合しリガーゼ反
応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を
用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤＮＡが１
つ挿入された、目的とするプラスミドｐ２ＬＡ６０６５
を得る。 5'-CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTA
TACGAAG TTATACGCGT 3'-ATTAAA TTTAGAGCTC TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGC
TTC AATATGCGCA ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCA
AATG CTTTTATTT-3' TAAATTTACA TTTTTATTAC ATGATCTCTG TGAAAGTTAT TTCCGT
TTAC GAAAATAAAC ATG-5'
し、７８０ｂｐの断片を調製し、また、同プラスミドを
ＢａｍＨＩおよびＢｓｒＧＩで切断し、３．６ｋｂの断
片を調製する。これら両断片とｌｏｘＰ配列を含む下記
のリンカーＤＮＡ（配列番号：５）を混合しリガーゼ反
応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反応混液を
用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤＮＡが１
つ挿入された、目的とするプラスミドｐ２ＬＡ６０６５
を得る。 5'-CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTA
TACGAAG TTATACGCGT 3'-ATTAAA TTTAGAGCTC TATTGAAGCA TATTACATAC GATATGC
TTC AATATGCGCA ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCA
AATG CTTTTATTT-3' TAAATTTACA TTTTTATTAC ATGATCTCTG TGAAAGTTAT TTCCGT
TTAC GAAAATAAAC ATG-5'
【００４９】 ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９の作製 ｐ２ＬＡ６０６５をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ（あるい
はＢｇｌＩ）により切断し、１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９を得
る。
はＢｇｌＩ）により切断し、１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９を得
る。
【００５０】 ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ作製の際のと同様の操作
により、ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔを作製する。
により、ｐＡ２ＬＡ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔを作製する。
【００５１】（ｄ）（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築その
３）ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＨＳＧＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。ｐ
ＨＳＧ２９９（宝酒造）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩに
より切断し、同様の操作により２．７ｋｂの断片を回収
する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加
え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、目的とするプラスミドｐＨＳＧＡ６０６５
を得る。
３）ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＨＳＧＡ６０６５の作製 ｐＡ６０Ｘ９９をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにより切断
し、反応混液をアガロースゲル電気泳動し、ＢｓｒＧＩ
部位を含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収する。ｐ
ＨＳＧ２９９（宝酒造）をＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩに
より切断し、同様の操作により２．７ｋｂの断片を回収
する。次に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加
え、さらにＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結
合させる。次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５α
を形質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを調製し、目的とするプラスミドｐＨＳＧＡ６０６５
を得る。
【００５２】 ｐ２ＬＤ６０６５の作製 ｐＨＳＧＡ６０６５をＢｓｒＧＩおよびＤｒａＩで切断
し４．４ｋｂの断片を調製し、これとｌｏｘＰ配列を含
む下記のリンカーＤＮＡ（配列番号：６）を混合し、リ
ガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反
応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた
形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤ
ＮＡが１つ挿入された目的とするプラスミドｐ２ＬＤ６
０６５を得る。 5'-GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGC
GCCGATT TAAATCTCGA 3'-TGAGAG CCCACTAATA AATGGGGGTG GGAACGGCAG ACGCGGC
TAA ATTTAGAGCT GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTA
AATC CGTTT-3' CTATTGAAGC ATATTACATA CGATATGCTT CAATATGCGC ATAAAT
TTAG GCAAA-5'
し４．４ｋｂの断片を調製し、これとｌｏｘＰ配列を含
む下記のリンカーＤＮＡ（配列番号：６）を混合し、リ
ガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらにＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。次いでこの反
応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた
形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、リンカーＤ
ＮＡが１つ挿入された目的とするプラスミドｐ２ＬＤ６
０６５を得る。 5'-GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGC
GCCGATT TAAATCTCGA 3'-TGAGAG CCCACTAATA AATGGGGGTG GGAACGGCAG ACGCGGC
TAA ATTTAGAGCT GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTA
AATC CGTTT-3' CTATTGAAGC ATATTACATA CGATATGCTT CAATATGCGC ATAAAT
TTAG GCAAA-5'
【００５３】 ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９の作製 ｐ２ＬＤ６０６５をＢａｍＨＩおよびＳｆｉＩ（あるい
はＢｇｌＩ）により切断し１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９を得
る。
はＢｇｌＩ）により切断し１．５ｋｂの断片を調製す
る。また、ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９をＢａｍＨＩおよびＳ
ｆｉＩにより切断し、約２２ｋｂの断片を調製する。次
に両断片をリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ中に加え、さらに
ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、一晩結合させる。
次いでこの反応混液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９を得
る。
【００５４】 ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ作製の際のと同様の操作
により、ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔを作製する。
により、ｐＡ２ＬＤ３Ｌ６０９９とｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔからｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔを作製する。
【００５５】（ｅ）アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複
合体（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ（I. S
aito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))ま
たはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５ ｄｌ
ＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）に、Ａｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染させ、培
養を行う。調製方法は、特開平８−８４５８９号公報
（１４欄８行〜１５欄８行）に記載されている。得られ
たＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｄｅｘ１ＣＡ
ＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣを、次のステップのｌｏｘ
Ｐ挿入組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＡｇ
ｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム
でゲル濾過後、−８０℃に保存する。
合体（Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製 アデノウイルスＤＮＡとしては、Ａｄ５ ｄｌＸ（I. S
aito et al., J.Virology, vol.54, 711-719 (1985))ま
たはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺを用いる。Ａｄ５ ｄｌ
ＸをＨｅＬａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）に、Ａｄｅｘ
１ＣＡＮＬａｃＺを２９３細胞にそれぞれ感染させ、培
養を行う。調製方法は、特開平８−８４５８９号公報
（１４欄８行〜１５欄８行）に記載されている。得られ
たＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｄｅｘ１ＣＡ
ＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣを、次のステップのｌｏｘ
Ｐ挿入組換えアデノウイルス作成のため、充分量のＡｇ
ｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム
でゲル濾過後、−８０℃に保存する。
【００５６】（ｆ）ｌｏｘＰ挿入組み換えアデノウイル
スの作製 なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端にＳ
Ｖ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。 −１．（Ａｄ５ｄｌＸ２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３
ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇｅ
Ｉで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇ
ｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−Ｔ
ＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。
スの作製 なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端にＳ
Ｖ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意する。 −１．（Ａｄ５ｄｌＸ２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３
ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇｅ
Ｉで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡｇ
ｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−Ｔ
ＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。
【００５７】−２．（Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３Ｌまたは
Ａｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。
Ａｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＡ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。
【００５８】−３．（Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌまたは
Ａｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。
Ａｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡＮＬａｃＺの作製） 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコスミド
ｐＡｄｅｘ２ＬＤ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡｇ
ｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたはＡ
ｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−
ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシア
製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カル
シウム法でトランスフェクションを行う。
【００５９】 −１〜−３の組換えウイルスの分
離と高力価ウイルス液の作製は、特開平８−８４５８９
号１５欄３６行〜１６欄３５行に記載の方法に従う。た
だし、判定期間を１５〜２５日に変更したことを除く。
離と高力価ウイルス液の作製は、特開平８−８４５８９
号１５欄３６行〜１６欄３５行に記載の方法に従う。た
だし、判定期間を１５〜２５日に変更したことを除く。
【００６０】ここで得られるｌｏｘＰ挿入組換えアデノ
ウイルスＡｄ５ｄｌＸ２Ｌ３Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３
Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌ等と、目的の外来遺伝子発
現ユニットを含むコスミドを用いて、公知の組換えアデ
ノウイルス作製方法、例えばＣＯＳ−ＴＰＣ法（「実験
医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入と
発現・解析法、羊土社 (１９９４) 、４３〜５８頁）に
従って、目的の外来遺伝子発現ユニットとｌｏｘＰが挿
入された組換えアデノウイルスを作製することができ
る。
ウイルスＡｄ５ｄｌＸ２Ｌ３Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＡ３
Ｌ、Ａｄ５ｄｌＸ２ＬＤ３Ｌ等と、目的の外来遺伝子発
現ユニットを含むコスミドを用いて、公知の組換えアデ
ノウイルス作製方法、例えばＣＯＳ−ＴＰＣ法（「実験
医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺伝子導入と
発現・解析法、羊土社 (１９９４) 、４３〜５８頁）に
従って、目的の外来遺伝子発現ユニットとｌｏｘＰが挿
入された組換えアデノウイルスを作製することができ
る。
【００６１】（２） 次に、プロモーター、リコンビナ
ーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えバキュロウ
イルスの製造方法について説明する。以下に、リコンビ
ナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を使用
した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ遺伝子
の場合もほぼ同様である。
ーゼ遺伝子およびポリＡ配列を有する組換えバキュロウ
イルスの製造方法について説明する。以下に、リコンビ
ナーゼ遺伝子としてリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子を使用
した場合について述べるが、他のリコンビナーゼ遺伝子
の場合もほぼ同様である。
【００６２】 特開平８−８４５８９号１２欄１８行
〜１４欄７行に記載の方法により、ＣＡＧプロモーター
のクローニング部位にＣｒｅ遺伝子を挿入したカセット
コスミドを作製し、制限酵素ＰｍｅＩで消化し発現ユニ
ットを含む断片を回収する。ベクターｐＡｃＹＭ１をＥ
ｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化しポリヘドリンプロモータ
ー領域を取り除き、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化
し、さらにアルカリフォスファターゼ処理を施した後、
前述の断片と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合さ
せ、この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドを得る。 前記プラスミドと直鎖状バキュロウイルスＤＮＡを
混合して、リポフェクチン法によりＳｆ細胞にトランス
フェクションし、３日後の上清を適当に希釈してプラー
クアッセイする。プラークアッセイを繰り返すことによ
り、純化したクローンを得る。 純化したウイルスクローンを次第にスケールアップ
して増やし、高い感染価のストックを調製する。次に、
ショ糖密度勾配遠心分離法により目的のＣｒｅ発現用組
換えバキュロウイルスを精製する。 （３） 最後に、Ｅ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイル
スの製造方法について説明する。 （１）−および（２）−のウイルスをそれぞれ
ｍｏｉ＝１０および１００で２９３細胞に感染させ、培
養を行う。４日めに細胞を回収し、前述の方法によりＤ
ＮＡを回収する。 ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が
切り出された構造を有するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａ
ｃＺの生成を次の方法で確認する。回収したＤＮＡをＳ
ｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動し、ｌｏｘＰで挟まれた
領域が切り出されて生じる４．７ｋｂのバンドとＡｄｅ
ｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ、およびＡｄｅｘｄ１２３Ｃ
ＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋｂの
バンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウイル
ス中のＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの比率を求め
る。
〜１４欄７行に記載の方法により、ＣＡＧプロモーター
のクローニング部位にＣｒｅ遺伝子を挿入したカセット
コスミドを作製し、制限酵素ＰｍｅＩで消化し発現ユニ
ットを含む断片を回収する。ベクターｐＡｃＹＭ１をＥ
ｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化しポリヘドリンプロモータ
ー領域を取り除き、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化
し、さらにアルカリフォスファターゼ処理を施した後、
前述の断片と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合さ
せ、この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製
し、目的とするプラスミドを得る。 前記プラスミドと直鎖状バキュロウイルスＤＮＡを
混合して、リポフェクチン法によりＳｆ細胞にトランス
フェクションし、３日後の上清を適当に希釈してプラー
クアッセイする。プラークアッセイを繰り返すことによ
り、純化したクローンを得る。 純化したウイルスクローンを次第にスケールアップ
して増やし、高い感染価のストックを調製する。次に、
ショ糖密度勾配遠心分離法により目的のＣｒｅ発現用組
換えバキュロウイルスを精製する。 （３） 最後に、Ｅ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイル
スの製造方法について説明する。 （１）−および（２）−のウイルスをそれぞれ
ｍｏｉ＝１０および１００で２９３細胞に感染させ、培
養を行う。４日めに細胞を回収し、前述の方法によりＤ
ＮＡを回収する。 ｌｏｘＰで挟まれた領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が
切り出された構造を有するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａ
ｃＺの生成を次の方法で確認する。回収したＤＮＡをＳ
ｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動し、ｌｏｘＰで挟まれた
領域が切り出されて生じる４．７ｋｂのバンドとＡｄｅ
ｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ、およびＡｄｅｘｄ１２３Ｃ
ＡＮＬａｃＺにおいて共通して見られる４．４５ｋｂの
バンドの濃さの比較から、回収した組換えアデノウイル
ス中のＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの比率を求め
る。
【００６３】本発明の方法により上記のようにして得ら
れる、目的の外来遺伝子発現ユニットを有し、Ｅ２Ａ遺
伝子の機能が完全に欠失した本発明の組換えアデノウイ
ルスの高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入
（中枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投
与、経気道投与、経皮投与等の投与方法により感染さ
せ、遺伝病を含む各種疾患の治療に用いることができ
る。
れる、目的の外来遺伝子発現ユニットを有し、Ｅ２Ａ遺
伝子の機能が完全に欠失した本発明の組換えアデノウイ
ルスの高力価ウイルス溶液は、適宜希釈して局所注入
（中枢神経系・門脈など）、経口（腸溶剤を用いる）投
与、経気道投与、経皮投与等の投与方法により感染さ
せ、遺伝病を含む各種疾患の治療に用いることができ
る。
【００６４】
【実施例】以下、実施例、参考例により本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。なお、実施例中のファー
ジ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞
などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら
編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laborat
ory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限
酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指
示書に従って使用した。
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。なお、実施例中のファー
ジ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞
などを取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis ら
編、第２版（１９８9 ）、Cold Spring Harbor Laborat
ory 」に記載の方法に準じて行った。また、ＤＮＡ制限
酵素および修飾酵素は、宝酒造、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社又はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社から購入し、製造者指
示書に従って使用した。
【００６５】実施例１（ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔの構築） ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＭｗＣＨ
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行った。次に、得られたプ
ラスミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素に
より平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
った。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断し
た後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリン
カーとのリガーゼ反応を行った。元の制限酵素部位の消
失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。
３１の構築 ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ni
waら、Gene、108 、193-200(1990) ）をＥｃｏＲＩで切
断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＳｗａＩ
リンカーとのリガーゼ反応を行った。次に、得られたプ
ラスミドをＳａｌＩで切断した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素に
より平滑化し、ＣｌａＩリンカーとのリガーゼ反応を行
った。さらに、得られたプラスミドをＰｓｔＩで切断し
た後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑化し、ＸｈｏＩリン
カーとのリガーゼ反応を行った。元の制限酵素部位の消
失および各リンカーの挿入は各制限酵素切断の後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。
【００６６】 ｐＡｄｅｘ１ｃの構築 （ｉ）Ｅ１遺伝子領域を欠失したアデノウイルスゲノム
左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７
Ｄ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＳ１処理して平滑末端と
し、その平滑末端にＢａｍＨリンカーを結合させ、その
後ＨｉｎｄIII 消化し、目的のフラグメント（２．８ｋ
ｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）
をアガロースゲル電気泳動で分離・回収し、ＢａｍＨＩ
／ＨｉｎｄIII 消化したｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られた目的のプラスミドを
ｐＵＡＦ０−８と名づけた。
左側末端の１７％を含むプラスミド（ｐＵＡＦ０−１７
Ｄ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＳ１処理して平滑末端と
し、その平滑末端にＢａｍＨリンカーを結合させ、その
後ＨｉｎｄIII 消化し、目的のフラグメント（２．８ｋ
ｂ、アデノウイルスゲノムの左側末端の８％に当たる）
をアガロースゲル電気泳動で分離・回収し、ＢａｍＨＩ
／ＨｉｎｄIII 消化したｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られた目的のプラスミドを
ｐＵＡＦ０−８と名づけた。
【００６７】（ii）アデノウイルスＤＮＡをＨｉｎｄII
I 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、目的の
３．４ｋｂのフラグメント（アデノウイルスゲノムの左
側末端の８−１７％に当たる）をゲルから回収し、ｐＵ
Ｃ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入した（ｐＵＡＦ８−１
７と命名）。ｐＵＡＦ０−８の塩基番号（ここでいう塩
基番号はアデノウイルスＤＮＡ由来）４５４番目のＰｖ
ｕII部位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変
換した。そして、このプラスミドをＢａｍＨＩ／Ｃｌａ
Ｉ消化し、４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ８
−１７の塩基番号３３２８番目のＢｇｌII部位をＣｌａ
Ｉリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そしてこ
のプラスミドをＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ消化し、２．９
ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ０−８由来の４５
４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡ
Ｆ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩ
フラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られたプラスミドをｐＵＡ
Ｆ０−１７Ｄと命名した。このプラスミドはＥ１遺伝子
領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％
を含む。
I 消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、目的の
３．４ｋｂのフラグメント（アデノウイルスゲノムの左
側末端の８−１７％に当たる）をゲルから回収し、ｐＵ
Ｃ１９のＨｉｎｄIII 部位へ挿入した（ｐＵＡＦ８−１
７と命名）。ｐＵＡＦ０−８の塩基番号（ここでいう塩
基番号はアデノウイルスＤＮＡ由来）４５４番目のＰｖ
ｕII部位をＣｌａＩリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変
換した。そして、このプラスミドをＢａｍＨＩ／Ｃｌａ
Ｉ消化し、４５４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ８
−１７の塩基番号３３２８番目のＢｇｌII部位をＣｌａ
Ｉリンカーを用いてＣｌａＩ部位に変換した。そしてこ
のプラスミドをＨｉｎｄIII ／ＣｌａＩ消化し、２．９
ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動で回収した。ｐＵＡＦ０−８由来の４５
４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントと、ｐＵＡ
Ｆ８−１７由来の２．９ｋｂのＨｉｎｄIII −ＣｌａＩ
フラグメントをつなぎ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／Ｈｉ
ｎｄIII 部位へ挿入した。得られたプラスミドをｐＵＡ
Ｆ０−１７Ｄと命名した。このプラスミドはＥ１遺伝子
領域を欠失したアデノウイルスゲノム左側末端の１７％
を含む。
【００６８】（iii)アデノウイルスゲノムのＢｓｔ１１
０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目
的の２１．６ｋｂのフラグメントを回収した。
０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）の調製 ５型アデノウイルスＤＮＡをＢｓｔ１１０７とＥｃｏＲ
Ｉで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した後、目
的の２１．６ｋｂのフラグメントを回収した。
【００６９】（iv）アデノウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ
−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）の調製 ｐＸ２Ｓ（I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 5
4, p711-719, 1985)のＳａｌＩ部位をＳｗａＩリンカー
を用いてＳｗａＩ部位へ変換しｐＸ２Ｗを得た。ｐＸ２
ＷをＥｃｏＲＩとＳｗａＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動で分離した後、目的の６．５ｋｂのフラグメント
を回収した。
−ＳａｌＩフラグメント（６．５ｋｂ）の調製 ｐＸ２Ｓ（I. Saito et. al., J. of Virology, vol. 5
4, p711-719, 1985)のＳａｌＩ部位をＳｗａＩリンカー
を用いてＳｗａＩ部位へ変換しｐＸ２Ｗを得た。ｐＸ２
ＷをＥｃｏＲＩとＳｗａＩで消化し、アガロースゲル電
気泳動で分離した後、目的の６．５ｋｂのフラグメント
を回収した。
【００７０】（ｖ）シャロミド（ｃｈｄＲＢＲ７−１
１）の調製 charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のＫ
ｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを除くため、charomid９
−１１をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーションした。これ
を用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、char
omid６−１１と名づけた。charomid６−１１のＥｃｏＲ
Ｉ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、得られたシャロ
ミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１と名づけた。
１）の調製 charomid９−１１(I. Saito & G. Stark, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p8664-8668, 1986) のＫ
ｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩを除くため、charomid９
−１１をＡｓｐ７１８とＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎ
ｏｗ酵素で平滑化後、セルフライゲーションした。これ
を用いて形質転換し、目的のシャロミドを単離し、char
omid６−１１と名づけた。charomid６−１１のＥｃｏＲ
Ｉ部位へＢａｍＨＩリンカーを挿入し、得られたシャロ
ミドをｃｈｄＲＢＲ７−１１と名づけた。
【００７１】（vi）ｐＡｄｅｘ１ｃの調製 ｐＵＡＦ０−１７ＤのＢａｍＨＩ−Ｂｓｔ１１０７フラ
グメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓ
ｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）
とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．
５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄ
ＲＢＲ７−１１とライゲーションした。その後、in vit
roパッケージングし、大腸菌ＤＨ５αへ感染させた。形
質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、
ｐＡｄｅｘ１ｃと名づけた。
グメント（２．９ｋｂ）とアデノウイルスゲノムのＢｓ
ｔ１１０７−ＥｃｏＲＩフラグメント（２１．６ｋｂ）
とｐＸ２ＷのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩフラグメント（６．
５ｋｂ）をＥｃｏＲＩとＥｃｌ３６Ｉで消化したｃｈｄ
ＲＢＲ７−１１とライゲーションした。その後、in vit
roパッケージングし、大腸菌ＤＨ５αへ感染させた。形
質転換株から目的のフラグメントをもつものを単離し、
ｐＡｄｅｘ１ｃと名づけた。
【００７２】 カセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの
構築 ＣｌａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘ１ｃ（１μｇ）と、５’末端
リン酸化を施した下記の合成リンカー（１）（配列番
号：２）０．０１μｇ（ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩
結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすること
によりリガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩ（２０ｕｎ
ｉｔ）を添加し、反応させた。この切断はリンカーが複
数個挿入されたものからＳｗａＩ断片を切り出し、リン
カーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために
行った。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除
去した後、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させ、セルフアニー
リングにより環状化を行った。７０℃で１０分間インキ
ュベートすることによりリガーゼを熱失活させ、１μｌ
をイン・ビトロ・パッケージングに用いた。次に、各コ
ロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩ
およびＮｒｕＩ同時消化により確認した。目的とする方
向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入された場
合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認により目的と
するカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図１）を取得
した。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
構築 ＣｌａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘ１ｃ（１μｇ）と、５’末端
リン酸化を施した下記の合成リンカー（１）（配列番
号：２）０．０１μｇ（ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、Ｓａｌ
Ｉ、ＮｒｕＩ部位を含む）を混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で一晩
結合させた。７０℃で１０分間インキュベートすること
によりリガーゼを熱失活させた後、ＳｗａＩ（２０ｕｎ
ｉｔ）を添加し、反応させた。この切断はリンカーが複
数個挿入されたものからＳｗａＩ断片を切り出し、リン
カーが１個のみ挿入された構造のコスミドを得るために
行った。次に、反応液をＳｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ製）にかけ、リンカー由来の小断片を除
去した後、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量１８μｌ）中で一晩結合させ、セルフアニー
リングにより環状化を行った。７０℃で１０分間インキ
ュベートすることによりリガーゼを熱失活させ、１μｌ
をイン・ビトロ・パッケージングに用いた。次に、各コ
ロニーから調製したコスミドＤＮＡの構造をＢａｍＨＩ
およびＮｒｕＩ同時消化により確認した。目的とする方
向に挿入された場合４８３ｂｐ、逆方向に挿入された場
合、４６４ｂｐの断片を生じる。この確認により目的と
するカセットコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（図１）を取得
した。 合成リンカー （１） 5'-CGATTTAAATCGATTGTCGACTCGCGA-3' 3'-TAAATTTAGCTAACAGCTGAGCGCTGC-5'
【００７３】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡ
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのリガーゼ反応を行った。７０℃で１０分間インキュ
ベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、Ｐｓ
ｐ１４０６Ｉを添加し、反応させた。この切断はリンカ
ーが複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を
切り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個
連結した構造の断片を得るために行った。このあと、反
応液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルか
らＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣ
ｌａＩで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌ
ｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤ
ＮＡ断片１μｇと前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片０．１
μｇをＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終
容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間
インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた
後、これの１／４量にＣｌａＩを添加し（最終容量２０
μｌ）、セルフアニーリングにより生じた環状コスミド
を切断した。１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに
用いた。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡ
の構造をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ同時消化により確認し
た。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐと４．
８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７および２．５
ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とするカセッ
トコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得した。
ｗの構築 で構築したプラスミドｐＣＭｗＣＨ３１をＨｉｎｄII
I およびＣｌａＩで同時消化し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によ
り平滑化し、5'末端リン酸化を施したＰｍｅＩリンカー
とのリガーゼ反応を行った。７０℃で１０分間インキュ
ベートすることによりリガーゼを熱失活させた後、Ｐｓ
ｐ１４０６Ｉを添加し、反応させた。この切断はリンカ
ーが複数個挿入されたものからＰｓｐ１４０６Ｉ断片を
切り出し、リンカーがＤＮＡ断片の両端にそれぞれ１個
連結した構造の断片を得るために行った。このあと、反
応液をアガロースゲル電気泳動に供し、２．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルか
らＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＡｄｅｘｌｃｗをＣ
ｌａＩで切断した後、生じた小断片をＳｐｕｎ ｃｏｌ
ｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により除去した後のＤ
ＮＡ断片１μｇと前述の２．３ｋｂのＤＮＡ断片０．１
μｇをＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終
容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分間
インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させた
後、これの１／４量にＣｌａＩを添加し（最終容量２０
μｌ）、セルフアニーリングにより生じた環状コスミド
を切断した。１μｌをイン・ビトロ・パッケージングに
用いた。次に、各コロニーから調製したコスミドＤＮＡ
の構造をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ同時消化により確認し
た。目的とする方向に挿入された場合４８３ｂｐと４．
８ｋｂ、逆方向に挿入された場合、２．７および２．５
ｋｂの断片を生じる。この確認により目的とするカセッ
トコスミドｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗを取得した。
【００７４】 カセットコスミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗ
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗ（１μｇ）と、5'
末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（２）（配列
番号：３）（０．０１μｇ）（ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を含む）を
混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最
終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分
間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させ
た後、ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させ
た。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰ
ａｃＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された
構造のコスミドを得るために行った。次に、反応液をＳ
ｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にか
け、リンカー由来の小断片を除去した後、ＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で
一晩結合させ、セルフアニーリングによる環状化を行っ
た。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリ
ガーゼを熱失活させた１μｌをイン・ビトロ・パッケー
ジングに用いた。次に、各コロニーから調製したコスミ
ドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同時消化によ
り確認した。目的とする方向に挿入された場合５５２ｂ
ｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの断片を生じ
る。これを確認することにより目的とするカセットコス
ミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得した。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
ｔ（細胞工学、Vol.１３、No.8、Ｐ７５９）の構築 ＳｗａＩ（２０ｕｎｉｔ）で切断した後エタノール沈澱
により回収したｐＡｄｅｘｌｐＣＡｗ（１μｇ）と、5'
末端リン酸化を施した下記の合成リンカー（２）（配列
番号：３）（０．０１μｇ）（ＣｌａＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ｐｅＩ、ＰａｃＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ部位を含む）を
混合し、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最
終容量１８μｌ）中で一晩結合させた。７０℃で１０分
間インキュベートすることによりリガーゼを熱失活させ
た後、ＰａｃＩ（２０ｕｎｉｔ）を添加し、反応させ
た。この切断はリンカーが複数個挿入されたものからＰ
ａｃＩ断片を切り出し、リンカーが１個のみ挿入された
構造のコスミドを得るために行った。次に、反応液をＳ
ｐｕｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にか
け、リンカー由来の小断片を除去した後、ＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中で
一晩結合させ、セルフアニーリングによる環状化を行っ
た。７０℃で１０分間インキュベートすることによりリ
ガーゼを熱失活させた１μｌをイン・ビトロ・パッケー
ジングに用いた。次に、各コロニーから調製したコスミ
ドＤＮＡの構造をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ同時消化によ
り確認した。目的とする方向に挿入された場合５５２ｂ
ｐ、逆方向に挿入された場合、５６８ｂｐの断片を生じ
る。これを確認することにより目的とするカセットコス
ミドｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（図２）を取得した。 合成リンカーの構造 （２） 5'-ATCGATTCTAGACTAGTTTAATTAATTTAAATCGAT-3' 3'-TAGCTAAGATCTGATCAAATTAATTAAATTTAGCTA-5'
【００７５】実施例２（ｌｏｘＰ挿入コスミドの構築） ｐＡ６０Ｘ９９Ｘの作製 ｐＡｄｅｘｌＣＡｗｔ（０．５μｇ）をＢａｍＨＩ（１
５ｕｎｉｔ）を含む反応系２０μｌ中で切断した後、熱
処理（７０℃、１５分間）によりＢａｍＨＩを失活させ
た。次にその１／４量を用いリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ
中でＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量２０
μｌで一晩結合させた。次いでこの反応混液１０μｌを
用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミ
ドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得た。
５ｕｎｉｔ）を含む反応系２０μｌ中で切断した後、熱
処理（７０℃、１５分間）によりＢａｍＨＩを失活させ
た。次にその１／４量を用いリガーゼ反応ｂｕｆｆｅｒ
中でＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、最終容量２０
μｌで一晩結合させた。次いでこの反応混液１０μｌを
用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを調製し、目的とするプラスミ
ドｐＡ６０Ｘ９９Ｘを得た。
【００７６】 ｐＡ６０Ｘ９９の作製（アデノウイル
ス以外のＸｂａＩ部位を除去する） ｐＡ６０Ｘ９９Ｘ（５μｇ）をＸｂａＩ（１０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系５０μｌ中で５分間反応させ、反応混
液をアガロースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位
のうち１ヶ所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮ
Ａ断片を回収した。次に、この断片０．２μｇをＫｌｅ
ｎｏｗ酵素（宝酒造製）５ｕｎｉｔを含む反応系５０μ
ｌ中で反応させ両末端を平滑化し、さらに、これの１／
５量、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量２０μｌ）中で一晩結合させた。次いでこの
反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し
た。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩおよびＸｂ
ａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片を生じる、すなわ
ち図１の構造を有するプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図
３）を得た。
ス以外のＸｂａＩ部位を除去する） ｐＡ６０Ｘ９９Ｘ（５μｇ）をＸｂａＩ（１０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系５０μｌ中で５分間反応させ、反応混
液をアガロースゲル電気泳動し、２ヶ所のＸｂａＩ部位
のうち１ヶ所のみで切断された２３．８ｋｂのＤＮＡ断
片を含むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮ
Ａ断片を回収した。次に、この断片０．２μｇをＫｌｅ
ｎｏｗ酵素（宝酒造製）５ｕｎｉｔを含む反応系５０μ
ｌ中で反応させ両末端を平滑化し、さらに、これの１／
５量、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む反応液
（最終容量２０μｌ）中で一晩結合させた。次いでこの
反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換
し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し
た。これらのプラスミドＤＮＡをＢｓｒＧＩおよびＸｂ
ａＩで同時消化し、６．２ｋｂの断片を生じる、すなわ
ち図１の構造を有するプラスミドｐＡ６０Ｘ９９（図
３）を得た。
【００７７】 ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の作製（ＢｓｒＧ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（３０μｇ）をＸｈｏｌ（１５０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１２５μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）１２ｕｎｉｔを含む
反応系中で両末端を平滑化し、その後フェノール：クロ
ロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱し
た。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液
（ＴＥ）６０μｌに溶解した。次に、これの１／２量と
５’末端リン酸化ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）０．２
μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ
反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させた。次
に、熱処理（７０℃、１５分間）によりリガーゼを失活
させた後、Ａｓｐ７１８（１００ｕｎｉｔ）を含む反応
系８０μｌ中で消化した。反応混液をアガロースゲル電
気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含む
ゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を
回収した。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（３０μｇ）をＸｈｏｌ（１５０ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１２５μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）１２ｕｎｉｔを含む
反応系中で両末端を平滑化し、その後フェノール：クロ
ロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱し
た。沈澱物を遠心分離により取得し、１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．５）に１ｍＭのＥＤＴＡを添加した溶液
（ＴＥ）６０μｌに溶解した。次に、これの１／２量と
５’末端リン酸化ＫｐｎＩリンカー（宝酒造製）０．２
μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼを含むリガーゼ
反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結合させた。次
に、熱処理（７０℃、１５分間）によりリガーゼを失活
させた後、Ａｓｐ７１８（１００ｕｎｉｔ）を含む反応
系８０μｌ中で消化した。反応混液をアガロースゲル電
気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含む
ゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を
回収した。
【００７８】なお、上記のｐＵＬＬ２ｒは以下のように
して調製した。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得た。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCG
AGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGC
TCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
して調製した。ｐＵＣ１１９（宝酒造製）を制限酵素Ｅ
ｃｌ１３６IIで切断し、アルカリホスファターゼ処理を
施した後、末端にＭｌｕＩ部位およびＸｈｏＩ部位を有
しこれが連結するとＮｒｕＩ部位を生じるように設計さ
れているｌｏｘＰ配列を含む下記の合成ＤＮＡ断片（配
列番号：４）とのligation反応を行い該合成ＤＮＡ断片
が２つ挿入されたプラスミドｐＵＬＬ２ｒを得た。 5'-CGAACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTCG
AGTCG-3' 3'-GCTTGCGCATATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAGAGC
TCAGC-5' （下線部分の配列がｌｏｘＰ部位である。）
【００７９】一方、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９（１０μ
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量２５μｌ）中で
一晩結合させた。これの１／２量に滅菌水、ＢｓｒＧＩ
反応ｂｕｆｆｅｒを加えて１８μｌとしてから、７０℃
で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱
失活させた。さらに、２０ｕｎｉｔのＢｓｒＧＩを加え
（最終容量２０μｌ）３７℃で１時間反応させることに
よりセルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ６０Ｘ
９９を切断した。次いでこの反応混液１０μｌを用いて
大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製した。
ｇ）をＢｓｒＧＩ（５０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μ
ｌ中で切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳動
し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、
電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片を回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含むリガーゼ反応液（最終容量２５μｌ）中で
一晩結合させた。これの１／２量に滅菌水、ＢｓｒＧＩ
反応ｂｕｆｆｅｒを加えて１８μｌとしてから、７０℃
で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱
失活させた。さらに、２０ｕｎｉｔのＢｓｒＧＩを加え
（最終容量２０μｌ）３７℃で１時間反応させることに
よりセルフアニーリングにより生じた環状のｐＡ６０Ｘ
９９を切断した。次いでこの反応混液１０μｌを用いて
大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、得られた形質転換体から
プラスミドＤＮＡを調製した。
【００８０】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得し
た。
め、ＡｐａＩとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および２１９ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３３４および２５１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＮｒｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入さ
れた場合５７３ｂｐ、逆方向に挿入された場合、５３３
ｂｐの断片が生じる。さらに、ＤｒａＩとＫｐｎＩで同
時消化した場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入
された場合３２０ｂｐ、２つ挿入された場合、３８４ｂ
ｐの断片が生じる。これら３種の条件をすべて満たす、
すなわち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された
目的のプラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（図４）を取得し
た。
【００８１】 ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の作製（Ｘｂａ
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（２０μｇ）をＸｈｏＩ（１００ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）８ｕｎｉｔを含む反
応系において両末端を平滑化し、その後フェノール：ク
ロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱
した。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ３０μｌに
溶解した。これの全量と５’末端リン酸化ＳｐｅＩリン
カー（宝酒造製）０．４μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結
合させ、７０℃で１０分間インキュベートすることによ
りリガーゼを熱失活させた。さらに、ＳｐｅＩ（５４ｕ
ｎｉｔ）を加え消化した後、反応混液をアガロースゲル
電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含
むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片
を回収した。
Ｉ部位へのｌｏｘＰの挿入） ｐＵＬＬ２ｒ（２０μｇ）をＸｈｏＩ（１００ｕｎｉ
ｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断した後、熱処理
（７０℃、１５分間）によりＸｈｏＩを失活させた。続
いてＫｌｅｎｏｗ酵素（宝酒造製）８ｕｎｉｔを含む反
応系において両末端を平滑化し、その後フェノール：ク
ロロホルム（１：１）処理を施した後、エタノール沈澱
した。沈澱物を遠心分離により取得し、ＴＥ３０μｌに
溶解した。これの全量と５’末端リン酸化ＳｐｅＩリン
カー（宝酒造製）０．４μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む反応液（最終容量５０μｌ）中で一晩結
合させ、７０℃で１０分間インキュベートすることによ
りリガーゼを熱失活させた。さらに、ＳｐｅＩ（５４ｕ
ｎｉｔ）を加え消化した後、反応混液をアガロースゲル
電気泳動し、ｌｏｘＰを含む６４ｂｐのＤＮＡ断片を含
むゲルを切り出し、電気泳動によりゲルからＤＮＡ断片
を回収した。
【００８２】一方、ｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９（１０μｇ）
を、ＸｂａＩ（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ
において切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳
動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡを回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含む反応液（最終容量１６μｌ）中で一晩結合
させた。これに５倍希釈したＴＥ１４μｌを加え、７０
℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを
熱失活させた。次いでこれの１／４量に２０ｕｎｉｔの
ＸｂａＩを添加し（最終容量２０μｌ）、セルフアニー
リングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を切断し
た。この反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製した。
を、ＸｂａＩ（１００ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ
において切断した後、反応混液をアガロースゲル電気泳
動し、２３．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出
し、電気泳動によりゲルからＤＮＡを回収した。このＤ
ＮＡ断片０．５μｇと前述のｌｏｘＰを含む６４ｂｐの
ＤＮＡ断片０．００５μｇ、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを含む反応液（最終容量１６μｌ）中で一晩結合
させた。これに５倍希釈したＴＥ１４μｌを加え、７０
℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを
熱失活させた。次いでこれの１／４量に２０ｕｎｉｔの
ＸｂａＩを添加し（最終容量２０μｌ）、セルフアニー
リングにより生じた環状のｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９を切断し
た。この反応混液１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製した。
【００８３】挿入されたｌｏｘＰの方向を確認するた
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得した。
め、ＢｇｌIIとＭｌｕＩの同時消化を行い、反応混液を
アガロースゲル電気泳動した。目的とする方向に挿入さ
れた場合、３６６および５０３ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、３９８および４７１ｂｐの断片が生じる。ま
た、ＡｐａＩとＭｌｕＩで同時消化した場合、目的とす
る方向に挿入された場合６６０ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合、６２８ｂｐの断片が生じる。ＥｃｏＮＩとＭｌ
ｕＩで消化した場合、目的とする方向に挿入された場合
３１１ｂｐ、逆方向に挿入された場合、３４３ｂｐの断
片が生じる。さらに、ＨｐａＩとＳａｃＩで同時消化し
た場合、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された場
合３９７ｂｐ、２つ挿入された場合、４６１ｂｐの断片
が生じる。これら４種の条件をすべて満たす、すなわ
ち、目的とする方向にｌｏｘＰが１つ挿入された目的の
プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（図５）を取得した。
【００８４】 ｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔの作製 ｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔ（１０μｇ）を、Ｃｓｐ４５Ｉ
（４０ｕｎｉｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断し、
次いで、同反応液中にＢａｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）、さ
らにＥｃｏＲＩ（４０ｕｎｉｔ）を順次添加した。２１
ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によ
りゲルからＤＮＡ断片を回収した。なお、Ｃｓｐ４５１
およびＥｃｏＲＩによる切断は２１ｋｂのＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片を回収する際、他の断片が混入するのを防ぐた
めである。
（４０ｕｎｉｔ）を含む反応系１００μｌ中で切断し、
次いで、同反応液中にＢａｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）、さ
らにＥｃｏＲＩ（４０ｕｎｉｔ）を順次添加した。２１
ｋｂのＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、電気泳動によ
りゲルからＤＮＡ断片を回収した。なお、Ｃｓｐ４５１
およびＥｃｏＲＩによる切断は２１ｋｂのＢａｍＨＩＤ
ＮＡ断片を回収する際、他の断片が混入するのを防ぐた
めである。
【００８５】ｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９（５μｇ）を、Ｂａ
ｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断
した後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過した。回収したＤＮＡ断片０．５μｇと前
述の２１ｋｂのＤＮＡ断片０．５μｇ、ＡＴＰおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中
で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートす
ることによりリガーゼを熱失活させた後、１μｌをイン
・ビトロ・パッケージングに用いた。
ｍＨＩ（３０ｕｎｉｔ）を含む反応系５０μｌ中で切断
した後フェノール：クロロホルム（１：１）処理を施
し、水層をＴＥで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５に
よりゲル濾過した。回収したＤＮＡ断片０．５μｇと前
述の２１ｋｂのＤＮＡ断片０．５μｇ、ＡＴＰおよびＴ
４ＤＮＡリガーゼを含む反応液（最終容量１８μｌ）中
で一晩結合させた。７０℃で１０分間インキュベートす
ることによりリガーゼを熱失活させた後、１μｌをイン
・ビトロ・パッケージングに用いた。
【００８６】即ち、ラムダ・イン・ビトロ・パッケージ
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍
結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパ
ッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなっ
たコスミドをある程度選択することができる。本実験で
は、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含ん
でおり、目的のクローン（ウイルスゲノムが正しく連結
されたクローン）を容易に得ることができた。コスミド
の扱い方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：
７：183-187, 1989)に従って行った。
ングキットであるギガバックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社製）を１／４スケールで用い、残りは−８０℃に凍
結した。ギガバックＸＬは４２ｋｂ以下のコスミドのパ
ッケージ効率が低いのでインサートが入って大きくなっ
たコスミドをある程度選択することができる。本実験で
は、１０個のコロニーを拾えば大半はインサートを含ん
でおり、目的のクローン（ウイルスゲノムが正しく連結
されたクローン）を容易に得ることができた。コスミド
の扱い方については、常法（斎藤 泉他、実験医学：
７：183-187, 1989)に従って行った。
【００８７】パッケージングされたコスミドを大腸菌Ｄ
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に感染させた。即ち、３枚
のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌの
Ａｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／
２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制
限酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの
割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍ
ｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮ
Ａを調製した。次に、各コロニーから調製したコスミド
ＤＮＡの構造をＤｒａＩ切断により確認した。目的とす
る方向に挿入された場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合１．４ｋｂの断片を生じる。これにより目的とす
るカセットコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得
した。
Ｈ５α（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に感染させた。即ち、３枚
のＡｐ+ （アンピシリン添加）寒天プレートと５ｍｌの
Ａｐ+ ＬＢ（ｐｏｏｌ）にそれぞれ１／２００量、１／
２０量、１／２量、残り全量を接種し、一晩培養した。
ｐｏｏｌのｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを抽出・調製し、制
限酵素ＤｒａＩ切断によりインサートがはいったものの
割合を調べた。コロニーは丸ごと寒天ごと取り１．５ｍ
ｌのＡｐ+ ＬＢで、一晩培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮ
Ａを調製した。次に、各コロニーから調製したコスミド
ＤＮＡの構造をＤｒａＩ切断により確認した。目的とす
る方向に挿入された場合８９１ｂｐ、逆方向に挿入され
た場合１．４ｋｂの断片を生じる。これにより目的とす
るカセットコスミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔを取得
した。
【００８８】実施例３ （アデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白複合体（Ａｄ５ ｄ
ｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ
ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製）アデノウイルスＤＮＡとし
ては、Ａｄ５ ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology,
vol.54, 711-719 (1985))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａ
ｃＺを用いた。特開平８−８４５８９号公報１４欄１２
行〜１５欄８行に記載の方法で、アデノウイルスＤＮＡ
−末端蛋白複合体の調製を行った。得られたＡｄ５ｄｌ
ＸおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣ
を、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のため、
充分量のＡｇｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２５カラムでゲル濾過後、−８０℃に保存した。
ｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ
ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製）アデノウイルスＤＮＡとし
ては、Ａｄ５ ｄｌＸ（I. Saito et al., J.Virology,
vol.54, 711-719 (1985))またはＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａ
ｃＺを用いた。特開平８−８４５８９号公報１４欄１２
行〜１５欄８行に記載の方法で、アデノウイルスＤＮＡ
−末端蛋白複合体の調製を行った。得られたＡｄ５ｄｌ
ＸおよびＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ−ＴＰＣ
を、第３ステップの組換えアデノウイルス作成のため、
充分量のＡｇｅＩで２時間切断し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ２５カラムでゲル濾過後、−８０℃に保存した。
【００８９】なお、ＤＮＡ−ＴＰＣは制限酵素による切
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできない。濃縮法は塩化セシウム
平衡遠心分離しかないのでなるべく濃厚状態に保った。
１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ
−ＴＰＣを得ることができた。一部を分取し、泳動用Ｂ
ＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０μｌ加えた後に、１μｌのプ
ロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１
０分間反応させて末端蛋白を消化した。フェノール抽出
し、上清をアガロースゲル電気泳動で分離し、完全切断
を確認した。ＡｇｅＩ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素
ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注
し−８０℃に保存した。
断、透析、ゲル濾過はできるが電気泳動・フェノール処
理・エタノール沈澱はできない。濃縮法は塩化セシウム
平衡遠心分離しかないのでなるべく濃厚状態に保った。
１０Ｒｏｕｘの感染細胞から約３００μｇ程度のＤＮＡ
−ＴＰＣを得ることができた。一部を分取し、泳動用Ｂ
ＰＢ ｂｕｆｆｅｒを１０μｌ加えた後に、１μｌのプ
ロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で１
０分間反応させて末端蛋白を消化した。フェノール抽出
し、上清をアガロースゲル電気泳動で分離し、完全切断
を確認した。ＡｇｅＩ切断ＤＮＡ−ＴＰＣ中の制限酵素
ｂｕｆｆｅｒを、遠心ゲル濾過によって除いた後、分注
し−８０℃に保存した。
【００９０】実施例４ （ｌｏｘＰ挿入組み換えアデノウイルス（Ａｄ５ｄｌＸ
２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ）の作
製）なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端
にＳＶ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコス
ミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡ
ｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたは
ＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ
−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシ
ア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カ
ルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシ
ャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続
けた。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交
換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０
倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が
各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１
０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播い
た。
２Ｌ３ＬまたはＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａｃＺ）の作
製）なお、ＮＬａｃＺは大腸菌ＬａｃＺ遺伝子のＮ末端
にＳＶ４０の核移行シグナルを付加したものである。 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６
ｃｍ、１０ｃｍシャーレ各１枚用意した。 発現ユニットを組み込んだｌｏｘＰを挿入したコス
ミドｐＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡｗｔ ＤＮＡの８μｇとＡ
ｇｅＩで切断したＡｄ５ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣまたは
ＡｇｅＩで切断したＡｄｅｘ１ＣＡＮＬａｃＺ ＤＮＡ
−ＴＰＣの１μｇを混合し、セルフェクト（ファルマシ
ア製）キットを用いて、６ｃｍシャーレ１枚にリン酸カ
ルシウム法でトランスフェクションを行った。６ｃｍシ
ャーレのメディウムの上から混合液を滴下し、培養を続
けた。一晩培養（約１６時間）し、午前中に培養液を交
換し、夕方、コラーゲンコート９６穴３枚（原液・１０
倍希釈・１００倍希釈）に、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥを用
い、各ウエル当たり０．１ｍｌでまき直した。細胞数が
各プレートで大きく違わないように、希釈２枚分には１
０ｃｍシャーレの２９３細胞を１／３ずつ混ぜて播い
た。
【００９１】 ３〜４日後と８〜１０日後に、各ウエ
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９
３細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れた。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存した。 １５〜２５日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心分離して
得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−
８０℃に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエ
ルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからで
ある。
ルに５０μｌの１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥを加えた。２９
３細胞がやせてきたら早めに加えた。ウイルスが増殖し
細胞が死滅したウエルが７〜２０日の間に現れた。ウエ
ルの細胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペッ
トで培養液（死細胞ごと）を滅菌した１．５ｍｌチュー
ブに無菌的に移して、ドライアイスで急凍して−８０℃
に保存した。 １５〜２５日で判定は終了した。比較的遅く細胞が
死んだウエルから回収した培養液チューブを約１０個選
び、超音波破砕後、５０００ｒｐｍ１０分遠心分離して
得られた上清を１次ウイルス液（first seed）として−
８０℃に保存した。早めにウイルス増殖が起こったウエ
ルは複数のウイルス株の混合感染の可能性が高いからで
ある。
【００９２】 ２４穴プレートに２９３細胞を用意
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００
ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てて細胞だけを−
８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス
株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全
ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell
DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM E
DTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの
10%SDSを加えた。
し、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ（０．４ｍｌ／ウエル）と１次
ウイルス液１０μｌをそれぞれ２ウエルずつ添加した。 約３日で細胞が完全に死滅したら、１ウエルは１次
ウイルス液作製と同様に超音波破砕と遠心分離で上清を
得、これを２次ウイルス液(second seed) として−８０
℃に保存した。他の１ウエルの死滅した細胞を５０００
ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てて細胞だけを−
８０℃に保存した（セルパック）。１０種類のウイルス
株のセルパックが集まったら以下の方法で感染細胞の全
ＤＮＡを抽出した。セルパックには、４００μｌのcell
DNA用TNE (50mM Tris-HCl pH7.5, 100mM NaCl, 10mM E
DTA)、４μｌのproteinaseK (10mg/ml) および４μｌの
10%SDSを加えた。
【００９３】 ５０℃で１時間処理した後、フェノー
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があ
るので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示す
クローンを選択する。説明できないバンドが薄く見える
クローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があ
るので廃棄した。
ル・クロロホルム抽出２回、クロロホルム抽出２回、つ
いでエタノール沈澱により得られた核酸をＲＮａｓｅを
２０μｇ／ｍｌ含む５０μｌのＴＥに溶かした。その１
５μｌを発現ユニットを切断する酵素の中で認識配列に
ＣＧを含む酵素であるＸｈｏＩで切断し、発現コスミド
カセットのＸｈｏＩ切断と共に、１５ｃｍ位の長さのア
ガロースゲルで一晩電気泳動を行い、パターンを比較し
た。ＸｈｏＩは挿入したｌｏｘＰ配列内に認識部位があ
るので、ｌｏｘＰが２個挿入された切断パターンを示す
クローンを選択する。説明できないバンドが薄く見える
クローンは、欠失のあるウイルスとの混合の可能性があ
るので廃棄した。
【００９４】実施例５ （Ｃｒｅ発現バキュロウイルスの作製） （１）Ｓｆ細胞の培養 Ｓｆ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）は、Ｇｒａｃｅ’
ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に１３％のＢａｃｔｏＴｒｙｐ
ｔｏｓｅＢｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社）を２％とウシ胎児
血清を１０％添加した培地中、２６．５°Ｃで培養し
た。必要に応じて無血清培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ４００（Ｌ
ＲＨバイオサイエンシーズ社）なども使用可能である。
培養ボトルはガラス製のボトル（フラット社製ＭＡボト
ル）中で行い、継代にはトリプシンを使用せず、泡立て
ないようにボトルを揺すって細胞を剥がした。
ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ社）に１３％のＢａｃｔｏＴｒｙｐ
ｔｏｓｅＢｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社）を２％とウシ胎児
血清を１０％添加した培地中、２６．５°Ｃで培養し
た。必要に応じて無血清培地Ｅｘ−ｃｅｌｌ４００（Ｌ
ＲＨバイオサイエンシーズ社）なども使用可能である。
培養ボトルはガラス製のボトル（フラット社製ＭＡボト
ル）中で行い、継代にはトリプシンを使用せず、泡立て
ないようにボトルを揺すって細胞を剥がした。
【００９５】（２）バキュロウイルスＤＮＡの調製 トランスフェクションに用いるバキュロウイルスＤＮＡ
は野生型ではなく、ＬａｃＺ遺伝子を組み込んだものを
ＬａｃＺ遺伝子領域内で１ヶ所ＳａｕＩで切断して直鎖
状にしたものを用いた。これにより、組換えウイルスの
出現効率を飛躍的に向上することができるばかりでな
く、組換えウイルスの選別が容易にできた（図７）。Ｌ
ａｃＺ遺伝子を組み込んだ組換えウイルスＡｃＲＰ２３
１ａｃＺ（ＬａｃＺ遺伝子を多角体プロモーターの下流
に接続、ポッセ博士（Dr. R. D. Possee，NERC Institu
te of Virology,UK ）から分与）感染後、２〜３日の培
養液（２００ｍｌ）を５０００×ｇ、１０分間遠心分離
し、その上清液を２５０００×ｇ、６０分間遠心分離し
てペレットを回収し、次にこれを５０％のショ糖クッシ
ョンにのせ、ウイルスをペレットダウンし、１．６ｍｌ
のＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊後、０．４ｍｌのｌ
ｙｓｉｓ緩衝液（１０％ sodium N-lauroyl sarcosinat
e, 1mM EDTA)を加え、６０℃で２０分間加熱した。これ
を臭化エチジウム溶液〔ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中に
１００μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを溶解〕で溶かした５
４％ＣｓＣｌに重層し、１０００００×ｇで１８時間遠
心分離した。開鎖状、閉鎖状の２本のバンドが認められ
るが、両方とも回収し、水飽和ブタノールで臭化エチジ
ウムを除き、ＴＥ緩衝液で一晩０℃で透析した。次に、
この精製ウイルスＤＮＡをＳａｕＩで切断して直鎖状に
した。
は野生型ではなく、ＬａｃＺ遺伝子を組み込んだものを
ＬａｃＺ遺伝子領域内で１ヶ所ＳａｕＩで切断して直鎖
状にしたものを用いた。これにより、組換えウイルスの
出現効率を飛躍的に向上することができるばかりでな
く、組換えウイルスの選別が容易にできた（図７）。Ｌ
ａｃＺ遺伝子を組み込んだ組換えウイルスＡｃＲＰ２３
１ａｃＺ（ＬａｃＺ遺伝子を多角体プロモーターの下流
に接続、ポッセ博士（Dr. R. D. Possee，NERC Institu
te of Virology,UK ）から分与）感染後、２〜３日の培
養液（２００ｍｌ）を５０００×ｇ、１０分間遠心分離
し、その上清液を２５０００×ｇ、６０分間遠心分離し
てペレットを回収し、次にこれを５０％のショ糖クッシ
ョンにのせ、ウイルスをペレットダウンし、１．６ｍｌ
のＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊後、０．４ｍｌのｌ
ｙｓｉｓ緩衝液（１０％ sodium N-lauroyl sarcosinat
e, 1mM EDTA)を加え、６０℃で２０分間加熱した。これ
を臭化エチジウム溶液〔ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中に
１００μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを溶解〕で溶かした５
４％ＣｓＣｌに重層し、１０００００×ｇで１８時間遠
心分離した。開鎖状、閉鎖状の２本のバンドが認められ
るが、両方とも回収し、水飽和ブタノールで臭化エチジ
ウムを除き、ＴＥ緩衝液で一晩０℃で透析した。次に、
この精製ウイルスＤＮＡをＳａｕＩで切断して直鎖状に
した。
【００９６】（３）Ｃｒｅ発現バキュロウイルスの作製 ＣＡＧプロモーターのクローニング部位にＣｒｅ遺伝子
を挿入したカセットコスミド（特開平８−８４５８９号
公報）をＰｍｅＩで消化し発現ユニットを含む断片を回
収した。ベクターｐＡｃＹＭ１ (J. Gen. Virol. 68, 1
233-1250, 1987) （図６）をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで
消化し、ポリヘドリンのプロモーター領域を取り除き、
Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化し、さらにアルカリホ
スファターゼ処理を施した後、前述の断片と混合し、Ｔ
４リガーゼ（宝酒造）を用いてリガーゼ反応を行った。
さらに、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（AT
CC53323)を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換株を拾
い、目的のプラスミドを得た。このプラスミド１μｇと
（２）で得た直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ２０ｎｇを
滅菌水を加えて８μｌにした。それに滅菌水で２倍希釈
したリポフェクチン（Gibco 社）を等量加えて室温で１
５分間静置後、血清無添加のGrace's 培地（Gibco 社）
に置き換えた１×１０6 個のＳｆ細胞へ接種し培養し
た。２４時間後、通常の１０％ＦＣＳ添加培地に交換し
た（「実験医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺
伝子導入と発現・解析法、羊土社（１９９４）、１４２
〜１５０頁）。
を挿入したカセットコスミド（特開平８−８４５８９号
公報）をＰｍｅＩで消化し発現ユニットを含む断片を回
収した。ベクターｐＡｃＹＭ１ (J. Gen. Virol. 68, 1
233-1250, 1987) （図６）をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで
消化し、ポリヘドリンのプロモーター領域を取り除き、
Ｋｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化し、さらにアルカリホ
スファターゼ処理を施した後、前述の断片と混合し、Ｔ
４リガーゼ（宝酒造）を用いてリガーゼ反応を行った。
さらに、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（AT
CC53323)を形質転換した。アンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転換株を拾
い、目的のプラスミドを得た。このプラスミド１μｇと
（２）で得た直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ２０ｎｇを
滅菌水を加えて８μｌにした。それに滅菌水で２倍希釈
したリポフェクチン（Gibco 社）を等量加えて室温で１
５分間静置後、血清無添加のGrace's 培地（Gibco 社）
に置き換えた１×１０6 個のＳｆ細胞へ接種し培養し
た。２４時間後、通常の１０％ＦＣＳ添加培地に交換し
た（「実験医学別冊」バイオマニュアルシリーズ４、遺
伝子導入と発現・解析法、羊土社（１９９４）、１４２
〜１５０頁）。
【００９７】（４）組換えウイルスの選別 トランスフェクションして３日後、１×１０6 個のＳｆ
細胞を３５ｍｍのディッシュに用意し、適当に希釈した
ウイルス液を接種する。１時間吸着後、ウイルス液を捨
て、重層寒天培地を２ｍｌ加える。重層した培地が固ま
った後、１ｍｌの培養液をさらに重層した。２７℃で３
〜４日間培養後、０．０１％ニュートラルレッドおよび
０．０４％ Ｘ−ｇａｌを添加したＰＢＳを１．０ｍｌ
加えて染色した後、白いプラークをキャピラリーで抜き
取り（親ウイルスは青色）、少量の培養液に浮遊させ
た。これをよく攪拌してウイルスを溶出させ、軽く遠心
分離後、上清液を希釈してプラークアッセイを行った。
同一ディッシュ中に青いプラークがなくなるまで繰り返
し、純化したクローンＡｃＣＡＮＣｒｅを得た（図
７）。
細胞を３５ｍｍのディッシュに用意し、適当に希釈した
ウイルス液を接種する。１時間吸着後、ウイルス液を捨
て、重層寒天培地を２ｍｌ加える。重層した培地が固ま
った後、１ｍｌの培養液をさらに重層した。２７℃で３
〜４日間培養後、０．０１％ニュートラルレッドおよび
０．０４％ Ｘ−ｇａｌを添加したＰＢＳを１．０ｍｌ
加えて染色した後、白いプラークをキャピラリーで抜き
取り（親ウイルスは青色）、少量の培養液に浮遊させ
た。これをよく攪拌してウイルスを溶出させ、軽く遠心
分離後、上清液を希釈してプラークアッセイを行った。
同一ディッシュ中に青いプラークがなくなるまで繰り返
し、純化したクローンＡｃＣＡＮＣｒｅを得た（図
７）。
【００９８】（５）組換えバキュロウイルスＡｃＣＡＮ
Ｃｒｅの大量調製 純化したウイルスＡｃＣＡＮＣｒｅを次第にスケールア
ップして増やし、高い感染価のストックウイルスを調製
した（１０7 〜１０8 pfu/ml)。次に、実施例５（２）
に記述した方法により、組換えバキュロウイルスＡｃＣ
ＡＮＣｒｅを精製した。即ち、組換えウイルス感染後、
２〜３日の培養液を５０００×ｇ、１０分間遠心分離
し、その上清を２５０００×ｇ、６０分間遠心分離して
ペレットを回収し、次にこれを５０％のショ糖クッショ
ンにのせ、ウイルスをペレットダウンし、適量のＴＥ緩
衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。このウイルス液は４℃
で数年間保存が可能である。
Ｃｒｅの大量調製 純化したウイルスＡｃＣＡＮＣｒｅを次第にスケールア
ップして増やし、高い感染価のストックウイルスを調製
した（１０7 〜１０8 pfu/ml)。次に、実施例５（２）
に記述した方法により、組換えバキュロウイルスＡｃＣ
ＡＮＣｒｅを精製した。即ち、組換えウイルス感染後、
２〜３日の培養液を５０００×ｇ、１０分間遠心分離
し、その上清を２５０００×ｇ、６０分間遠心分離して
ペレットを回収し、次にこれを５０％のショ糖クッショ
ンにのせ、ウイルスをペレットダウンし、適量のＴＥ緩
衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。このウイルス液は４℃
で数年間保存が可能である。
【００９９】実施例６ （Ｅ２Ａ遺伝子欠失組換えアデノウイルスの作製と構造
確認）組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮ
ＬａｃＺおよびＣｒｅ発現バキュロウイルスＡｃＣＡＮ
Ｃｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１０および１００で２９３細
胞に感染させ、培養を行った。なお、Ｃｒｅ発現バキュ
ロウイルスＡｃＣＡＮＣｒｅが産生するＮＣｒｅは、Ｎ
ＬａｃＺと同様、ＳＶ４０の核移行シグナルをＣｒｅの
Ｎ末端に付加したものである。４日目に細胞を回収し、
前述の方法によりＤＮＡを調製した。ｌｏｘＰで挟まれ
た領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が切り出された構造を有
するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの生成を次の方法
で確認した。
確認）組み換えアデノウイルスＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮ
ＬａｃＺおよびＣｒｅ発現バキュロウイルスＡｃＣＡＮ
Ｃｒｅをそれぞれｍｏｉ＝１０および１００で２９３細
胞に感染させ、培養を行った。なお、Ｃｒｅ発現バキュ
ロウイルスＡｃＣＡＮＣｒｅが産生するＮＣｒｅは、Ｎ
ＬａｃＺと同様、ＳＶ４０の核移行シグナルをＣｒｅの
Ｎ末端に付加したものである。４日目に細胞を回収し、
前述の方法によりＤＮＡを調製した。ｌｏｘＰで挟まれ
た領域（Ｅ２Ａ遺伝子を含む）が切り出された構造を有
するＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺの生成を次の方法
で確認した。
【０１００】ＳｍａＩ消化 ＳｍａＩ消化の後、ゲル電気泳動した結果、ｌｏｘＰで
挟まれた領域が切り出されて生じる４．７ｋｂの断片が
認められた。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａ
ｃＺ、およびＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺにおいて
共通して見られる４．４５ｋｂのバンドの濃さの比較か
ら、回収した組換えアデノウイルス中の約１０％がＡｄ
ｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺであることが分かった。
挟まれた領域が切り出されて生じる４．７ｋｂの断片が
認められた。このバンドとＡｄｅｘ２Ｌ３ＬＣＡＮＬａ
ｃＺ、およびＡｄｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺにおいて
共通して見られる４．４５ｋｂのバンドの濃さの比較か
ら、回収した組換えアデノウイルス中の約１０％がＡｄ
ｅｘｄ１２３ＣＡＮＬａｃＺであることが分かった。
【０１０１】実施例７ （ＬａｃＺ発現バキュロウイルスＡｃＣＡＬａｃＺ（Ｃ
ＡＧプロモーター制御下）の作製および２９３細胞への
導入） （１）バキュロウイルスＤＮＡの調製 実施例５（２）と同様の方法でバキュロウイルスＤＮＡ
を調製した。
ＡＧプロモーター制御下）の作製および２９３細胞への
導入） （１）バキュロウイルスＤＮＡの調製 実施例５（２）と同様の方法でバキュロウイルスＤＮＡ
を調製した。
【０１０２】（２）組換えバキュロウイルスＡｃＣＡＬ
ａｃＺの作製 ＣＡＧプロモーターのクローニング部位にＬａｃＺ遺伝
子を挿入したカセットコスミド pAdexl CALacZ（特開平
８−８４５８９号公報）をＰｍｅＩで消化し発現ユニッ
トを含む断片を回収した。ベクターpAcYM1 (J. Gen. Vi
rol. 68, 1233-1250, 1987) （図６）をＥｃｏＲＶとＢ
ａｍＨＩで消化し、ポリヘドリンのプロモーター領域を
取り除きＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化し、さらにア
ルカリホスファターゼ処理を施した後、前述の断片と混
合し、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を用いてリガーゼ反応を
行った。さらに、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０
９株（ATCC53323)を形質転換した。アンピシリン（１０
０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転
換株を拾い、目的のプラスミドを得た。このプラスミド
１μｇと（１）で得た直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ２
０ｎｇを滅菌水を加えて８μｌにした。それに滅菌水で
２倍希釈したリポフェクチン（Gibco 社）を等量加えて
室温で１５分間静置後、血清無添加のGrace's 培地（Gi
bco 社）に置き換えた１×１０6 個のＳｆ細胞へ接種し
培養した。２４時間後、通常の１０％ＦＣＳ添加培地に
交換した。図７においてＣｒｅ遺伝子のかわりにＬａｃ
Ｚ遺伝子を用いた。
ａｃＺの作製 ＣＡＧプロモーターのクローニング部位にＬａｃＺ遺伝
子を挿入したカセットコスミド pAdexl CALacZ（特開平
８−８４５８９号公報）をＰｍｅＩで消化し発現ユニッ
トを含む断片を回収した。ベクターpAcYM1 (J. Gen. Vi
rol. 68, 1233-1250, 1987) （図６）をＥｃｏＲＶとＢ
ａｍＨＩで消化し、ポリヘドリンのプロモーター領域を
取り除きＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて平滑化し、さらにア
ルカリホスファターゼ処理を施した後、前述の断片と混
合し、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を用いてリガーゼ反応を
行った。さらに、この反応混液を用いて大腸菌ＪＭ１０
９株（ATCC53323)を形質転換した。アンピシリン（１０
０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ寒天プレートから形質転
換株を拾い、目的のプラスミドを得た。このプラスミド
１μｇと（１）で得た直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ２
０ｎｇを滅菌水を加えて８μｌにした。それに滅菌水で
２倍希釈したリポフェクチン（Gibco 社）を等量加えて
室温で１５分間静置後、血清無添加のGrace's 培地（Gi
bco 社）に置き換えた１×１０6 個のＳｆ細胞へ接種し
培養した。２４時間後、通常の１０％ＦＣＳ添加培地に
交換した。図７においてＣｒｅ遺伝子のかわりにＬａｃ
Ｚ遺伝子を用いた。
【０１０３】（３）組換えウイルスの選別 実施例５（４）と同様の方法で、純化したクローンＡｃ
ＣＡＬａｃＺを得た。
ＣＡＬａｃＺを得た。
【０１０４】（４）LacZ発現バキュロウイルスＡｃＣＡ
ＬａｃＺの２９３細胞への導入 ９６穴プレートに２９３細胞をまき、１ウエルあたり約
１０5 細胞になった時点でLacZ発現バキュロウイルスＡ
ｃＣＡＬａｃＺを moi 1、１０、１００、５００になる
ように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最
終容量１００μＬになるように培地を添加し、３７℃で
２日間インキュベートした後、Ｘ-gal染色を行った。顕
微鏡下で青色に染まっている細胞と染まっていない細胞
を数えることによりLacZ発現バキュロウイルスベクター
導入効率を算出した。 ｍｏｉ １ １０ １００ ５００ 効率（％） ３ ４０ １００ １００
ＬａｃＺの２９３細胞への導入 ９６穴プレートに２９３細胞をまき、１ウエルあたり約
１０5 細胞になった時点でLacZ発現バキュロウイルスＡ
ｃＣＡＬａｃＺを moi 1、１０、１００、５００になる
ように添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最
終容量１００μＬになるように培地を添加し、３７℃で
２日間インキュベートした後、Ｘ-gal染色を行った。顕
微鏡下で青色に染まっている細胞と染まっていない細胞
を数えることによりLacZ発現バキュロウイルスベクター
導入効率を算出した。 ｍｏｉ １ １０ １００ ５００ 効率（％） ３ ４０ １００ １００
【０１０５】
【発明の効果】本発明の組換えバキュロウイルスを使用
することにより、目的の組換えアデノウイルスの分離、
精製が容易になる。
することにより、目的の組換えアデノウイルスの分離、
精製が容易になる。
【０１０６】
配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATAACTTCGT ATAGCATACA TTATACGAAG TTAT 34
【０１０７】配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成された任意のＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGATTTAAAT CGATTGTCGA CTCGCGA 27
【０１０８】配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成された任意のＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATCGATTCTA GACTAGTTTA ATTAATTTAA ATCGAT 36
【０１０９】配列番号：４ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 52
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGAACGCGTA TAACTTCGTA TAGCATACAT TATACGAAGT TATCTCGAGT CG 52
【０１１０】配列番号：５ 配列の長さ：１１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT 60 ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT 119
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CATGTAATTT AAATCTCGAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATACGCGT 60 ATTTAAATGT AAAAATAATG TACTAGAGAC ACTTTCAATA AAGGCAAATG CTTTTATTT 119
【０１１１】配列番号：６ 配列の長さ：１１５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（一部Genomic DNA を含む任意の
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA 60 GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT 115
ＤＮＡ） ハイポセティカル配列：ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源：大腸菌ファージＰ１ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTACACTCTC GGGTGATTAT TTACCCCCAC CCTTGCCGTC TGCGCCGATT TAAATCTCGA 60 GATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TATTTAAATC CGTTT 115
【図１】図１は、コスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗの構造を示
す概念図である。
す概念図である。
【図２】図２は、コスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔの構造
を示す概念図である。
を示す概念図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＡ６０Ｘ９９の構造を示
す概念図である。
す概念図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＡ２Ｌ６０Ｘ９９の構造
を示す概念図である。
を示す概念図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＡ２Ｌ３Ｌ６０９９の構
造を示す概念図である。
造を示す概念図である。
【図６】図６は、プラスミドｐＡｃＹＭ１の構造を示す
概念図である。
概念図である。
【図７】図７は、トランスファーベクターの作製とＬａ
ｃＺを組み込んだ直鎖状バキュロウイルスＤＮＡを用い
る組換えバキュロウイルスの選別方法を示す概略図であ
る。
ｃＺを組み込んだ直鎖状バキュロウイルスＤＮＡを用い
る組換えバキュロウイルスの選別方法を示す概略図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 斎藤 泉 東京都渋谷区代々木２丁目37番15−412号 (72)発明者 宮村 達男 東京都杉並区浜田山４丁目21番22−113号
Claims (8)
- 【請求項１】 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子お
よびポリＡ配列を有する組換えバキュロウイルス。 - 【請求項２】 リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファ
ージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である請求項
１記載の組換えバキュロウイルス。 - 【請求項３】 プロモーターおよびポリＡが、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモータ
ー（ＣＡＧプロモーター）である請求項１又は２記載の
組換えバキュロウイルス。 - 【請求項４】 プロモーター、リコンビナーゼ遺伝子お
よびポリＡ配列を有する組換えバキュロウイルスと、ア
デノウイルスＥ２Ａ遺伝子領域の両側に位置する同方向
を向いた２つのリコンビナーゼ認識配列を有する組換え
アデノウイルスを動物細胞に共感染させ、該組換えアデ
ノウイルスの２つのリコンビナーゼ認識配列間に存する
Ｅ２Ａ遺伝子領域を切除することを特徴とするＥ２Ａ遺
伝子欠失組換えアデノウイルスの製造方法。 - 【請求項５】 ２つのリコンビナーゼ認識配列の挿入部
位の一方が、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子の終止コドン
とアデノウイルスＬ３遺伝子の終止コドンの間であっ
て、両遺伝子のポリＡ付加シグナルの機能を欠失しない
範囲であることを特徴とする請求項４記載の製造方法。 - 【請求項６】 リコンビナーゼ遺伝子が大腸菌Ｐ１ファ
ージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの遺伝子である請求項
４又は５記載の製造方法。 - 【請求項７】 リコンビナーゼ認識配列が大腸菌Ｐ１フ
ァージ由来のリコンビナーゼＣｒｅの基質となるｌｏｘ
ＰのＤＮＡ配列（配列番号：１）である請求項４〜６い
ずれか記載の製造方法。 - 【請求項８】 プロモーターおよびポリＡが、サイトメ
ガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロ
モーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプ
ターおよびポリＡ配列からなるハイブリッドプロモータ
ー（ＣＡＧプロモーター）である請求項４〜７いずれか
記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8181513A JPH104973A (ja) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | 組換えバキュロウイルス及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8181513A JPH104973A (ja) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | 組換えバキュロウイルス及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH104973A true JPH104973A (ja) | 1998-01-13 |
Family
ID=16102080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8181513A Pending JPH104973A (ja) | 1996-06-20 | 1996-06-20 | 組換えバキュロウイルス及びその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH104973A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999059639A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Preparations solides pour administration orale de medicaments relatifs a des genes |
-
1996
- 1996-06-20 JP JP8181513A patent/JPH104973A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999059639A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Preparations solides pour administration orale de medicaments relatifs a des genes |
| US6794367B1 (en) | 1998-05-19 | 2004-09-21 | Hisamitsu Pharmaceutical, Inc. | Solid preparations for oral administration of drugs relating to genes |
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Legal Events
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