KR100639088B1 - 변이형 ｌｏｘＰ 서열과 그 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 의한 이하의 (a) ∼ (c)의 성질을 갖는 변이형 loxP 서열을 사용함으로써, 동물세포를 시작으로 하는 고등진핵세포에서 효율이 높은 유전자 삽입 또는 유전자 치환을 행할 수 있다.
(a) 대장균 P1 파지 유래의 하기 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G), 4 번째 (T) 또는 5 번째 (A) 염기 중 1 개 이상의 염기 및 6 번째 (T) 또는 7 번째 (G) 염기 중 적어도 한쪽의 염기가 다른 염기로 치환되고, 스페이서 영역 이외의 영역은 임의의 염기로 치환되어 있어도 되는 서열로 이루어지고,
(b) 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 야생형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않고,
(c) 리콤비나아제 Cre의 존재하, 동일한 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어난다.
Description
본 발명은 변이형 loxP 서열과 그 응용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 야생형 loxP 서열과는 특이적 재조합 반응은 일으키지 않지만 변이형끼리에서는 특이적 재조합 반응을 일으키는 변이형 loxP 서열과, 이 변이형 loxP 서열을 사용한 유전자의 치환방법에 관한 것이다.
동물 바이러스나 고등진핵세포인 동물세포의 염색체의 특정 부위에 임의의 유전자를 삽입하는 것, 또는 특정한 유전자를 결여시키는 것은 용이하지 않다. 예컨대, 동물세포의 염색체의 특정 부위에 유전자를 삽입하는 방법으로서 일반적으로 행해지고 있는 것은, 목적 유전자를 삽입하고 싶은 염색체의 부위와 동일 서열의 DNA를 목적 유전자의 양측에 결합한 플라스미드 DNA 등으로 세포를 형질전환하고, 상동(相同)재조합에 의해 목적 유전자가 삽입된 세포를 얻는 방법이다. 그러나, 상동재조합의 빈도는 현저하게 낮고, 그 때문에 목적 유전자와 함께 약제 내성 유전자 등을 동시에 넣고, 약제에 의한 선택을 행할 필요가 있어 목적하는 세포를 얻기까지 수개월을 요한다. 또, 목적 유전자를 삽입한 재조합 동물 바이러스의 제작은 상술한 세포 염색체의 경우보다 다소 간편하지만, 그래도 예컨대 재조합 아데노 바이러스를 제작하는 경우, 목적하는 유전자를 삽입한 플라스미드 등을 사용하여 상동재조합을 행하고, 그 후 재조합 바이러스의 클론화 및 선발 및 증식을 시킬 필요가 있다 (Bett et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 91, 8802-8806(1994), Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 93, 1320-1324(1996)).
이와 같이 동물세포의 염색체의 특정 부위의 유전자 조작이나 재조합 바이러스 제작이 곤란한 원인의 하나는 빈도가 낮은 상동재조합을 사용하고 있기 때문이다. 이것에 대하여, 플라스미드나 박테리오파지의 제작에 사용하는 제한효소와 같이, DNA 서열을 특이적으로 인식하는 효소를 사용할 수 있으면 효율의 향상을 기대할 수 있다. 그와 같은 효소의 예로서 대장균의 박테리오파지 P1 유래의 리콤비나아제 Cre를 들 수 있다.
Cre는 특정한 염기서열 (loxP 서열)을 인식하고, 이 서열 사이에서 DNA 사슬의 절단, 사슬의 교환과 결합의 공정을 전부 행하는 특이적인 DNA 재조합 효소이다 (Sternberg et al., J. Mol. Biol., Vol. 150, 467-486(1981), Abremski et al., J. Biol. Chem., Vol. 259, 1509-1514(1984), Hoess et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.81, 1026-1029(1984)). 즉, 동일 DNA 분자상에 동방향의 2 개의 loxP 서열이 존재하는 경우에는 그 사이에 끼인 DNA 서열이 절단되어 환상 분자가 되고 (절단반응), 또 그 반대로 다른 DNA 분자상에 2 개의 loxP 서열이 존재하고, 그 한쪽이 환상 DNA 인 경우에는 loxP 서열을 통해 환상 DNA가 다른쪽의 DNA 분자상에 삽입된다 (삽입반응). Cre 및 loxP 서열은 박테리오파지에서 발현되었지만, 특이적인 DNA 재조합 반응은 전핵세포 뿐 아니라 진핵세포인 동물세포나 동물 바이러스에서도 기능하는 것이 알려져 있고, 절단반응의 예로서는 동물배양세포 (Sauer et al., Nucleic Acids Res., Vol.17, 147-161(1989), Kanegae et al., Gene, Vol.181, 207-212(1996)), 동물 바이러스 (Sauer et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.85, 5166-5170(1988), Anton et al., J. Virol., Vol.69, 4600-4606(1995), Kanegae et al., Nucleic Acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995)), 트랜스제닉 마우스 (Lakso et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 6232-6236(1992), Orban et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 6861-6865(1992), Gu et al., Cell, Vol. 73, 1155-1164(1993), Gu et al., Science, Vol. 265, 103-106(1994)) 등을 들 수 있다.
한편, 삽입반응을 이용하면, loxP 서열이 이미 존재하는 동물세포의 염색체나 바이러스 게놈에 임의의 유전자를 삽입하는 것이 가능한데, 그 빈도는 매우 낮아 (Fukushige et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 7905-7909(1992), Sauer et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.84, 9108-9112(1987)) 실용적이지 않다. 왜냐하면, 삽입반응과 절단반응은 가역적이고, 삽입반응에 의해 동일 DNA 분자상에 2 개의 loxP 서열이 존재하면 바로 절단반응도 일어나고, 더욱이 반응의 평형은 압도적으로 절단반응측에 치우치기 때문이다.
이 삽입반응의 빈도를 올리기 위해, 본래의 loxP 서열 (야생형)의 염기서열과는 다른 서열의 loxP 서열 (변이형)을 사용한 시도가 행해졌다. loxP 서열은 34 염기의 DNA 서열로 이루어지고, 2 개의 13 염기의 역방향 반복서열 (inverted repeat)에 끼인 8 염기의 서열은 스페이서 영역이라고 불리우며, DNA 사슬의 재조합은 스페이서 영역에서 행해지는 것이 알려져 있다 (Hoess et al., J. Mol. Biol., Vol. 181, 351-362(1985)).
이 스페이서 영역의 염기의 7 번째 염기를 G (구아닌)에서 A (아데닌)로 치환한 loxP 서열 (변이형 loxP 서열)은 야생형 loxP 서열과의 사이에서는 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않지만, 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서는 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나는 것이 나타났다 (Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)).
또, 어느 DNA 분자의 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열의 사이에 존재하는 유전자를 다른 DNA 분자상에 존재하는 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열의 사이에 삽입 또는 치환하는 시도가 행해졌다. 그 예로서, 플라스미드 벡터상의 유전자의 박테리오파지상의 유전자와의 치환 (Waterhouse et al., Nucleic Acids Res., Vol.21, 2265-2266(1993)), 파지미드 벡터상의 유전자의 플라스미드 벡터로의 삽입 (Tsurushita et al., Gene, Vol.172, 59-63(1996)), 플라스미드 벡터상의 유전자의 동물세포 염색체상의 유전자와의 치환 (Bethke et al., Nucleic Acids Res., Vol.25, 2828-2834(1997)) 등을 들 수 있다.
그러나, 이들 시도는 단 1 종류의 변이형 loxP 서열, 즉 스페이서 영역의 염기의 7 번째 염기를 G (구아닌)에서 A (아데닌)로 치환한 loxP 서열 (변이형 loxP 서열) 만을 사용하여 행해지고 있고, 상기 서열의 변이형 loxP 서열이 야생형 loxP 서열과의 사이에서 재조합 반응을 일으키지 않으므로 바람직한지는 명확하지않다. 또한, 상기 3 건의 시도는 모두 약제 내성 유전자 그 자체나, 또는 목적 유전자와 함께 약제 내성 유전자를 삽입하고, 목적하는 재조합이 생긴 DNA 분자를 갖는 재조합체만이 약제 내성을 획득하여 증폭된다는 실험계가 사용되고 있기 때문에, loxP 서열의 변이가 불충분하여 야생형 loxP 서열과 반응이 일어나고, 실제의 유전자 삽입 (유전자 치환)의 효율이 저하되어 있어도 약제선택이라는 바이어스가 걸려 있으므로, 겉보기상의 반응효율은 높게 표시되어 있을 가능성이 있다.
실제, 본 발명자들이 고안한 직접적 또한 정량적인 측정방법에서는 7 번째 염기를 G에서 A로 치환한 변이형 loxP 서열은 약 5 %의 빈도로 야생형 loxP 서열과의 사이에서 재조합 반응이 일어나고, loxP 서열의 변이가 불충분한 것이 확인되었다.
이와 같이, 종래의 기술에서는 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 사용하고, 동물세포의 염색체에 존재하는 유전자 치환을 행하는 기술이 고안은 되어 있지만, 그 효율은 충분하지 않았다.
도 1은 야생형 loxP 서열의 합성 DNA의 구조를 나타내는 도면이다. (s)는 센스사슬을, (a)는 안티센스사슬을 나타낸다.
도 2는 합성된 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 스페이서 영역의 서열 (센스사슬)을 나타낸다.
도 3은 합성된 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 스페이서 영역의 서열 (안티센스사슬)을 나타낸다.
도 4는 합성된 2 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 스페이서 영역의 서열 (센스사슬)을 나타낸다.
도 5는 합성된 2 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 스페이서 영역의 서열 (안티센스사슬)을 나타낸다.
도 6은 직쇄상 DNA를 기질로 한 경우의 변이형 loxP 서열 사이에서의 리콤비나아제 Cre 의존 재조합 반응을 나타내는 모식도이다. 「M」은 변이형 loxP 서열을 의미하고, 문자상의 화살표는 loxP 서열의 방향을 나타낸다. 숫자는 BsaHI 절단된 경우의 단편의 길이 (bp)를 나타낸다.
도 7은 플라스미드 pBRwt의 구조를 나타내는 모식도이다. 「L」은 야생형 loxP 서열을 의미하고, 문자상의 화살표는 loxP 서열의 방향을 나타낸다. ApR은 앰피실린 내성 유전자, ori는 대장균의 복제 오리진을 나타낸다.
도 8은 한쪽 말단에서 야생형 loxP 서열이, 다른쪽 말단에서 변이형 loxP 서열이 각 1 개 결합한 직쇄상 DNA를 나타내는 모식도이다. 「M」은 변이형 loxP 서열을, 「L」은 야생형 loxP 서열을 의미하고, 문자상의 화살표는 loxP 서열의 방향을 나타낸다 (이하의 도면에서도 동일함). 또, 하향의 화살표는 BsaHI 사이트를 나타내고, 숫자는 BsaHI 절단 단편의 길이 (bp)를 나타낸다.
도 9는 플라스미드 pBLA 변이체의 구조를 나타내는 모식도이다. 굵은선 부분은 pBR322 유래이고, 가는선 부분은 아데노 바이러스 유래이다.
도 10은 직쇄상 DNA를 기질로 한 경우의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서의 리콤비나아제 Cre 의존 재조합 반응을 나타내는 모식도이다. 가는 화살표는 DraI 사이트를 나타낸다.
도 11은 플라스미드 puLwL (A), 플라스미드 puLwM (B) 및 플라스미드 puMwL (C)의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 12는 플라스미드 puLwM의 구축에 사용한 변이형 합성 DNA의 서열을 나타내는 도면이다. 중앙의 하선부가 loxP 서열 (34 bp), 이중 하선부가 스페이서 영역 (8 bp) 이고, 변이를 도입한 염기는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
도 13은 플라스미드 puMwL의 구축에 사용한 변이형 합성 DNA의 서열을 나타내는 도면이다. 중앙의 하선부가 loxP 서열 (34 bp), 이중 하선부가 스페이서 영역 (8 bp) 이고, 변이를 도입한 염기는 굵은 글씨로 표시되어 있다.
도 14는 플라스미드 pCALwL (D) 및 플라스미드 pCALwM (E)의 구조를 나타내는 모식도이다. CAPro는 CAG 프로모터, GpA는 β-글로빈 폴리 A 서열을 나타낸다.
도 15는 플라스미드 puLZM (F) 및 플라스미드 puMOL (G)의 구조를 나타내는 모식도이다. SpA는 SV40의 ori 및 폴리 A 서열을 나타낸다.
도 16은 플라스미드 puLZMOL (H) 및 플라스미드 puALZMOL (I)의 구조를 나타내는 모식도이다. TpA는 티미딘키나아제의 폴리 A 서열을 나타낸다.
도 17은 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열의 조합에 의해 플라스미드 DNA (환상 DNA) 상에 존재하는 lacZ 유전자를 아데노 바이러스 게놈상에 삽입할 수 있는 것을 나타내기 위한 실험의 모식도이다.
도 18은 플라스미드 pCALwMds (A), 플라스미드 pCALhmBMds (B) 및 플라스미드 pCALGFBMds (C)의 구조를 나타내는 모식도이다. hmB는 하이그로마이신 B 내성 유전자, GFB는 GFP와 블레오마이신 내성 유전자와의 융합 유전자를 나타낸다.
도 19는 아데노 바이러스 게놈상의 유전자의 치환실험의 결과를 나타내는 도면이다. Cre 발현 재조합 아데노 바이러스를 moi=15로 표적용 재조합 아데노 바이러스를 moi=9로 CV-1 세포에 감염시켰다. 공여용 재조합 아데노 바이러스의 moi=60 에서는 약 60 %, moi=100 에서는 약 90 %의 세포가 파랗게 염색되었다.
도 20은 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열의 조합에 의해 플라스미드 DNA (환상 DNA) 상에 존재하는 lacZ 유전자를 세포의 염색체상의 유전자에 삽입할 수 있는 것을 나타내기 위한 실험의 모식도이다.
도 21은 세포의 염색체상의 유전자 치환실험의 결과를 나타내는 도면이다. 하이그로마이신 B 내성의 임의의 6 주의 표적 세포 (C3, C7, C8, C11, C19, C28)에 각각 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 AxCANCre를 moi=5 로, 공여용 재조합 아데노 바이러스 AxALZMOL을 moi=10, 30, 100, 300 으로 동시에 1 시간 감염시켰다. 세포주에 따라 빈도는 다른데, 공여용 재조합 아데노 바이러스를 moi=100 으로 감염한 경우, 10 % (C19) 내지 30 % (C8)의 세포가 파랗게 염색되었다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
이하에 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명에서의 변이형 loxP 서열이란, 야생형 loxP 서열의 스페이서 영역의 특정 염기를 본래와는 다른 염기로 치환하고, 그 치환에 의해 리콤비나아제 Cre에 의한 특이적 DNA 재조합 반응에서의 기질특이성이 변화하는 서열을 가리키고, 기질특이성에 영향을 주지 않는 다른 염기의 치환을 포함하고 있어도 된다. 여기서 말하는 기질특이성이란, 예컨대 야생형 loxP 서열, 변이형 loxP 서열 1, 변이형 loxP 서열 2의 3 종류의 loxP 서열이 존재하는 경우, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 1, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 2, 변이형 loxP 서열 1 과 변이형 loxP 서열 2의 각각의 조합에서는 Cre에 의한 특이적 DNA 재조합 반응이 실질적으로 일어나지 않는 것을 말한다. 본 기질특이성의 정도는 후술하는 유전자 치환방법을 실시하는데 있어서 충분하면 된다.
이 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 미리 세포의 염색체에 넣어 두고, 동일 조합의 2 개의 loxP 서열 사이에 임의의 유전자가 존재하는 환상 DNA를 리콤비나아제 Cre와 함께 세포에 도입함으로써, 먼저 변이형 loxP 서열끼리, 또는 야생형 loxP 서열끼리에 의한 삽입반응에 의해 loxP 서열이 4 개 존재하는 중간체가 생성되고, 이어서 삽입반응과는 다른 조합의 loxP 서열 사이 (삽입반응이 야생형 loxP 서열 사이이면 변이형 loxP 서열 사이)에서 절단반응이 일어남으로써, 환상 DNA의 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열 사이의 임의의 유전자가 세포의 염색체의 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열 사이에 삽입된다. 또, 세포의 염색체의 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열 사이에 다른 유전자가 존재하는 경우에는 상기 반응에 의해 이 유전자는 염색체로부터 제거되고, 환상 DNA에 삽입되어 있는 유전자로 치환된다. 따라서, 세포의 염색체에 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열이 존재하면, 그 부위에 임의의 유전자를 효율적으로 도입하는 것이 가능하게 된다. 또, 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열의 조합 대신에, 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않는 2 개의 변이형 loxP 서열을 사용할 수도 있다.
본 발명의 변이형 loxP 서열은 이하와 같이 하여 발견되었다.
loxP 서열의 기질특이성이 변화한 변이형 loxP 서열로서는 스페이서 영역의 염기의 7 번째 염기가 G에서 A로 치환된 서열이 알려져 있다 (Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)). 그 어세이(assay)법에서는 앰피실린 내성 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 갖는 플라스미드의 카나마이신 내성 유전자의 양측에 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 삽입하고, 얻어진 플라스미드로 Cre 발현 대장균을 형질전환하였다. 그리고, 앰피실린 내성을 획득한 대장균을 선별후, 카나마이신 내성의 유무 (2 개의 loxP 서열 사이에서 재조합이 일어나면 카나마이신 내성을 상실)로 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이의 재조합 반응의 정도를 판단하고 있다. 즉, 1 분자의 플라스미드에서의 Cre에 의한 재조합 반응의 결과를 몇억배나 증폭하고, 더욱이 약제에 의한 선별을 행하고 있으므로, 실제의 재조합 반응을 어느 정도 반영하고 있는지는 명확하지는 않다.
그래서 본 발명자들은 보다 직접적이고 정량적인 어세이 방법을 확립하고, Cre에 의한 재조합 반응에 필수인 loxP 서열내의 염기를 동정하였다. 먼저 그 어세이법을 간단하게 설명한다. 8 염기의 스페이서 영역의 모든 염기를 1 염기씩, 가능한 모든 염기로 치환한 변이형 loxP 서열 (계 24 종류) 및 야생형 loxP 서열을 포함하는 DNA를 통상의 방법에 의해 합성하고, 적당한 길이의 DNA 단편, 예컨대 플라스미드 pBR322를 제한효소로 절단하고 직쇄상으로 한 DNA 단편의 양끝에 야생형 loxP 서열 및 변이형 loxP 서열을 결합시킨 DNA 단편을 기질로서 사용하였다. 이 기질 DNA를 in vitro의 무세포계에서 Cre 단백과 반응시켜 재조합 반응을 행하고, 적당한 제한효소로 절단한 후 전기영동함으로써 변이형 loxP 서열의 야생형 loxP 서열과의 재조합 반응의 효율을 정량적으로 측정하였다. 그 결과, 이하에 나타내는 결과가 얻어졌다 ;
(1) 스페이서 영역의 1 번째 또는 8 번째 염기를 치환해도 야생형 loxP 서열과 반응한다 ;
(2) 2 번째, 3 번째, 4 번째 또는 5 번째 염기를 치환하면, 반응은 대부분 중간체에서 멈추고, 최종단계까지는 거의 진행하지 않는다. 그 정도는 치환개소에 따라 약간 차이가 있고, 5 번째의 치환에서는 극히 일부 최종단계까지 진행한다 ;
(3) 6 번째 염기를 치환하면, 중간체는 거의 생기지 않지만, 반응은 일부 최종단계까지 진행한다. 반응이 최종단계까지 진행하는 비율은 5 번째 또는 7 번째 염기를 치환한 경우보다도 많다. 또 치환하는 염기의 종류에 따라 반응의 진행도는 다르고, 본래의 염기인 T를 A로 치환하면, C 또는 G로 치환한 경우보다 반응이 최종단계까지 진행하는 비율이 높다 ;
(4) 7 번째 염기를 치환하면, 중간체는 거의 생기지 않지만, 반응은 극히 일부 최종단계까지 진행한다. 종래 보고되어 있는 것은 이 7 번째 염기의 G에서 A 로의 치환인데, 이 치환을 행해도 반응은 약 5 %의 빈도로 최종단계까지 진행하였다. 이 빈도는 본 발명의 목적인 유전자 치환을 행하기에는 너무 높은 값이다. 왜냐하면, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서 5 % 나 되는 빈도로 재조합 반응이 일어나면, Cre에 의한 절단반응에 의해 2 개의 loxP 서열 (야생형 및 변이형) 사이에 존재하는 유전자가 결실될 가능성이 있기 때문이다.
그리고, 여기에서 말하는 중간체란, 이본쇄 DNA 중 한쪽의 사슬은 재조합되어 있지만 다른쪽은 재조합되어 있지 않은, 소위 홀리데이 구조 (Holliday-structure, Hoess et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 84, 6840-6844(1987))의 상태를 의미한다. 2 개의 loxP 서열 사이에서의 재조합 반응은 먼저 스페이서 영역의 하측 사슬의 7 번째와 8 번째 염기의 사이가 절단되어 재결합한 후, 상측 사슬의 1 번째와 2 번째 염기의 사이가 절단되어 재결합함으로써 반응이 완료되는 것이 알려져 있다 (Guo et al., Nature, Vol. 389, 40-46(1997)). 따라서, 2 번째에서 5 번째까지의 염기의 치환은, 6 번째 7 번째 염기의 치환과는 질적으로 다르고, 전자는 하측 사슬의 재조합은 일어나지만 상측 사슬의 재조합이 일어나지 않고 중간체에서 반응이 멈춘 것, 후자는 하측 사슬의 재조합 빈도는 낮은 것이 그 일부에서 재조합 반응이 일어나고, 반응이 최종단계까지 진행한 것인 것이 명확해졌다.
다음으로, 동일한 어세이 방법에서, 동일 서열의 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서의 재조합 반응을 검토하였다. 치환개소 및 치환한 염기의 종류에 따라 반응성에 차이는 있지만, 2 번째에서 7 번째 염기 중 1 염기를 치환한 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서 Cre에 의한 특이적인 재조합 반응이 관찰되었다. 그 반응의 정도의 차이는 치환개소보다도 치환한 염기의 종류에 의존하고 있었다. 예컨대, 3 번째 염기 (G)의 C 로의 치환, 및 7 번째 염기 (G)의 T 로의 치환은 다른 2 종류의 염기로 치환한 경우보다도 명확하게 반응성이 나빴다.
따라서, 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G) 및 4 번째 (T) 염기에서 선택되는 1 개의 염기가 다른 염기로 치환된 서열의 변이형 loxP 서열 및 이 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA는 본 발명에 포함된다.
또, 이상의 결과로부터, 질적으로 다른 염기의 치환개소, 즉 2 번째에서 5 번째의 임의의 개소와 6 번째 또는 7 번째를 2 개 이상 조합함으로써, 1 염기만의 치환과는 다르고, 매우 높은 특이성을 가지며, 동일한 변이형 loxP 서열끼리에서는 1 염기 치환에 필적하는 재조합 효율을 갖는 변이형 loxP 서열이 얻어지는 것이 예상되었다.
그래서, 다음으로 2 번째에서 5 번째의 임의의 1 염기의 치환과 7 번째 염기의 치환을 조합한 변이형 loxP 서열에 대하여, 야생형 loxP 서열과의 재조합 반응효율, 및 동일 서열의 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서의 재조합 반응의 효율을 검토하였다. 2 염기 치환한 변이형 loxP 서열의 대부분은 야생형 loxP 서열과의 조합에서는 재조합 반응은 최종단계까지 전혀 진행하지 않고, 1 염기만의 치환보다도 기질특이성이 명확하게 상승하였다. 그러나, 동일 서열의 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서의 재조합 반응의 효율은 서열에 따라 크게 다르고, 전혀 반응하지 않는 서열도 있었는데, 다음에 나타내는 변이형 loxP 서열은 실용상 충분한 재조합 효율을 나타냈다. T2C/G7A (#2171, 서열번호: 26), T2A/G7A (#2271, 서열번호: 29), T2A/G7C (#2272, 서열번호: 30), G3A/G7A (#3171, 서열번호: 35), G3T/G7A (#3371, 서열번호: 39), T4C/G7A (#4171, 서열번호: 42), A5G/G7A (#5171, 서열번호: 49). 그 중에서도 T2A/G7C (#2272) 및 A5G/G7A (#5171)의 반응효율은 매우 높았다. 그리고, 숫자는 치환하는 염기의 장소, 숫자 앞의 염기는 치환전의 염기, 숫자 뒤의 염기는 치환후의 염기를 나타낸다. 예컨대, T2C/G7A는 2 번째 염기를 T에서 C 로, 7 번째 염기를 G에서 A로 치환한 서열을 나타낸다. 또, 괄호내의 번호 및 서열번호의 관계는 후기의 표 2에 나타나 있다.
이와 같이, 야생형 loxP 서열의 스페이서 영역의 2 개의 염기를 동시에 치환한 변이형 loxP 서열은 야생형 loxP 서열과는 재조합 반응을 일으키지 않고, 2 개의 변이형 loxP 서열끼리에서는 높은 효율로 재조합 반응이 일어난 것으로부터, 1 염기만 치환한 loxP 서열보다도 더욱 기질특이성이 증가한 것이 명확해졌다.
따라서, 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G), 4 번째 (T) 또는 5 번째 (A) 염기 중 적어도 1 개의 염기 및 6 번째 (T) 또는 7 번째 (G) 염기 중 적어도 한쪽의 염기가 다른 염기로 치환된 변이형 loxP 서열 및 이 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA는 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명자들은 다른 서열의 변이형 loxP 서열의 사이에서 재조합 반응이 일어나는지를 검토하였다. 그 예로서 T2C/G7A (#2171) 과 T2A/G7C (#2272)를 드는데, 이들 2 종의 변이형 loxP 서열 사이에서는 재조합 반응은 전혀 일어나지 않았다. 이것은 야생형 loxP 서열, 변이형 loxP 서열 1, 변이형 loxP 서열 2의 적어도 3 종류의 기질특이성이 다른 loxP 서열을 발견한 것을 의미하고, 후술하는 유전자 치환을 행하는데 있어서 유용하다.
다음으로, 본 발명의 변이형 loxP 서열을 사용한 유전자 치환의 방법 및 그 응용에 대하여 설명한다.
본 발명의 유전자 치환방법은 야생형 loxP 서열, 유전자 A 및 변이형 loxP 서열을 이 순서로 갖는 DNA (a) 와, 야생형 loxP 서열, 변이형 loxP 서열을 이 순서로 갖는 환상 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키고, DNA (a) 중의 유전자 A를 유전자 B로 치환하는 것으로 이루어진다. 여기에서, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열은 Cre 의존 재조합 반응은 일어나지 않고, 유전자 A 및 유전자 B는 서로 다른 임의의 유전자이다.
또 본 발명의 유전자 치환방법은 서로 다른 서열을 갖는 2 개의 변이형 loxP 서열 (변이형 loxP 서열 1 및 변이형 loxP 서열 2) 및 유전자 A를 변이형 loxP 서열 1/유전자 A/변이형 loxP 서열 2의 순서로 갖는 DNA (a) 와, 변이형 loxP 서열 1, 유전자 B 및 변이형 loxP 서열 2를 이 순서로 갖는 환상 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키고, DNA (a) 중의 유전자 A를 유전자 B로 치환하는 것으로 이루어진다. 여기에서, 변이형 loxP 서열 1 과 변이형 loxP 서열 2는 Cre 의존 재조합 반응은 일어나지 않고, 유전자 A 및 유전자 B는 서로 다른 임의의 유전자이다.
유전자 치환의 방법은 기본적으로 다음과 같이 하여 행한다. 그 예로서, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 사용한 방법에 대해 설명하는데, 변이형 loxP 서열 1 과 변이형 loxP 서열 2를 사용하는 경우도 동일하다. 또, 동물세포의 염색체의 유전자를 치환하는 경우를 예로서 설명하는데, 본 방법은 동물세포의 염색체에 한정되지 않고, 동물 바이러스의 게놈이나, 식물세포, 효모 또는 세균 등의 미생물의 염색체나, 박테리오파지 등에도 적용할 수 있다.
먼저, 동물세포의 염색체에 미리 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 삽입해 둔다. 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에는 임의의 유전자 A가 존재해도 되고, 이 경우에는 유전자 치환이 되며, 유전자 A가 존재하지 않는 경우에는 유전자 삽입이 된다.
한편, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 삽입한 환상 DNA 분자의 2 개의 loxP 서열 사이에, 도입하고자 하는 유전자 B를 삽입해 둔다. 이 환상 DNA 분자는, 예컨대 플라스미드 DNA 나 이본쇄 환상 DNA 바이러스와 같이 미리 환상 분자가 된 것을 사용해도 되고, 또 어떠한 조작에 의해 세포내에 도입후, 환상 분자가 되는 것을 사용해도 된다. 이 유전자 B와 야생형 및 변이형 loxP 서열이 존재하는 환상 DNA 분자를 공지된 방법에 의해 상술한 세포내에 도입하고, 동시에 공지된 방법에 의해 Cre 단백을 세포내에서 발현시킴으로써 환상 DNA 분자상의 유전자 B가 세포의 염색체상의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열의 사이에 삽입된다. 그 때, 세포의 염색체상의 2 개의 loxP 서열의 사이에 유전자 A가 존재하는 경우에는 이 유전자 A가 제거되고 유전자 B가 삽입되는 유전자 치환이 된다. 염색체상의 2 개의 loxP 서열 사이에 유전자가 존재하지 않는 경우에는 유전자 삽입이 된다. 또한, 환상 DNA의 2 개의 loxP 서열 사이에 유전자가 존재하지 않는 경우에는 염색체상의 유전자 A를 제거할 수 있다. 더욱이, 유전자 A를 제거해도 염색체상에는 2 개의 loxP 서열은 존재하므로, 2 개의 loxP 서열 사이에 임의의 유전자 C를 갖는 다른 환상 DNA 분자를 사용함으로써 다시 이 염색체상의 2 개의 loxP 서열 사이에 유전자를 도입할 수 있다.
동물세포에 환상 DNA 분자를 도입하는 방법은 일반적으로 사용되고 있는 방법을 사용할 수 있다. 그 예로서, 일렉트로포레이션법, 인산칼슘 공침전법, DEAE-덱스트란법, 리포펙션법, 유전자총 등의 물리화학적 방법이나, 환상 DNA 바이러스 등을 들 수 있다. 환상 DNA 바이러스의 예로서는 파피로마 바이러스나 SV40 등을 들 수 있다. 또, 세포내에 도입후, 환상 분자로 하는 방법의 예로서는 리콤비나아제를 사용하는 방법을 들 수 있고, 그 리콤비나아제로서는 효모의 2 ml 플라스미드 유래의 FLP 나 치고사카로마이세스ㆍ루이이 (Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드 유래의 R, 그리고 Cre 등을 들 수 있다.
동물세포의 염색체에 미리 2 개의 loxP 서열을 삽입하려면, 예컨대 2 개의 loxP 서열이 존재하는 플라스미드 DNA 등을 사용하여 세포를 형질전환하면 된다. 형질전환시의 유전자 도입방법은 상술한 물리화학적 방법으로 행할 수 있다. 또한, 레트로 바이러스나 아데노 수반 바이러스, HIV 등의 바이러스 게놈을 세포의 염색체에 삽입하는 성질을 갖는 바이러스를 사용해도 된다.
동물세포 내에서 Cre를 발현시키는 방법은 Cre의 유전자를 코드하는 DNA 나 RNA를 세포에 도입후, 세포내에서 Cre 단백을 발현시키는 방법이나, Cre 단백 그 자체를 세포내에 도입하는 방법을 사용할 수 있다. 전자의 예로서는 Cre의 유전자를 코드하는 DNA 나 RNA를 상술한 물리화학적 방법으로 세포에 도입하는 방법이나, 바이러스 벡터를 사용하는 방법을 들 수 있다. 바이러스 벡터로서는 아데노 바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, EB 바이러스 등을 들 수 있는데, 그 유전자 도입효율이 높은 것으로부터 아데노 바이러스를 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 변이형 loxP 서열을 사용한 동물세포 염색체상에서의 유전자 치환법의 이점은 그 효율이 높다는 것과 염색체의 특정 부위에 유전자를 삽입할 수 있는 것이다. 특히 후자는 형질전환세포를 취득하는데 있어서는 매우 중요하다. 왜냐하면, DNA를 사용한 통상의 형질전환법 (상동재조합 이외) 이나, 레트로 바이러스나 아데노 수반 바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용한 방법에서는 염색체상에서의 목적 유전자의 삽입부위는 랜덤하므로, 삽입부위에 따라 목적 유전자의 발현량 및 그 염색체에서의 안정성에 큰 차이가 있기 때문이다. 그 때문에, 예컨대 목적 유전자를 안정하게 (장기간), 더욱이 고발현하는 형질전환세포주를 얻기 위해서는 매우 많은 세포주를 스크리닝해야 한다. 더욱이, 1 유전자마다, 즉 1 회의 형질전환마다 이 스크리닝을 반복해야 한다. 그것에 비교하여 본 발명에 의한 방법에서는 2 개의 loxP 서열에 끼인 어느 유전자의 발현을 지표로 하여 그 발현량이 높고 안정된 세포주를 일단 취득하면, 임의의 어느 유전자를 도입해도 유전자의 발현이 높고 안정된 세포주를 용이하게 취득할 수 있다. 더욱이, 그 효율은 매우 높으므로, 통상 필요한 약제선택의 조작이 필요 없고, 세포의 클론화의 조작만으로 목적하는 세포주를 단기간에 취득할 수 있다. 대상으로 하는 세포주에 특별히 제한은 없지만, 트랜스제닉 동물의 제작에 사용하는 ES 세포 등의 형질전환에는 특히 유효하다.
본 발명에 의한 동물세포 염색체의 유전자 치환방법은 배양세포 뿐만 아니라 동물개체에 대해서도 적용할 수 있다. 특정한 외래 유전자를 동물개체에서 발현시키는 방법으로서 트랜스제닉 동물의 기술이 존재하는데, 목적하는 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물의 제작에는 매우 시간이 걸린다. 왜냐하면, 통상의 방법으로 트랜스제닉 동물을 제작하기 위해서는 먼저 목적 유전자를 발현하는 ES 세포 등을 제작하고, 이어서 이 ES 세포 등을 상상 임신 임부의 배에서 발생시키고, 태어난 아이를 목적 유전자의 발현을 지표로 스크리닝하고, 추가로 목적 유전자를 발현하고 있는 동물개체를 교배시켜 비로소 다수의 트랜스제닉 동물이 얻어진다는 복잡한 조작이 필요하기 때문이다. 통상 이들 조작에는 반년에서 1 년을 요한다. 본 발명의 방법을 사용하면, 일단 유전자 도입용 트랜스제닉 동물을 제작하면, 개개의 유전자에 따른 트랜스제닉 동물의 제작은 불필요하게 된다. 유전자 도입용 트랜스제닉 동물이란, 염색체에 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 삽입한 동물로, 그 제작은 종래의 트랜스제닉 동물 제작과 동일한 방법으로 행하며, 약제에 의한 선택을 위해 2 개의 loxP 서열 사이에 네오마이신 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자를 삽입해 두어도 된다. 이 유전자 도입용 동물에 (a) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 목적 유전자를 삽입한 환상 DNA 분자, 및 (b) Cre 단백을 도입함으로써 (a) (b) 양자가 도입된 조직이나 세포에서 목적 유전자가 염색체에 삽입되며, 그 유전자를 발현시킬 수 있다. 동물개체로의 (a) (b)의 도입은 리포솜법이나 바이러스 벡터, 유전자총 등 기존의 방법으로 충분히 행할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면, 다른 유전자를 도입하는 경우라도 유전자에 따른 환상 DNA 분자 (a)를 사용하는 것만으로 되고, 매우 시간이 걸리는 트랜스제닉 동물의 제작을 행할 필요가 없다. 또한, (a) (b) 양자를 국소적으로 도입하는 것만으로 목적하는 장기나 조직에만 목적 유전자를 삽입할 수도 있다.
본 발명은 재조합 바이러스의 제작에도 사용할 수 있다. 바이러스로서 DNA 바이러스를 들 수 있고, DNA 바이러스로서 아데노 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, EB 바이러스, 사이트메갈로 바이러스 등의 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 카나리아폭스 바이러스 등의 폭스 바이러스, 곤충의 배큐로 바이러스 등을 들 수 있다. 또, 바이러스로서 RNA 바이러스를 들 수 있고, 특히 레트로 바이러스가 바람직하다. 왜냐하면, 레트로 바이러스 벡터를 제작하는 경우, 역가가 높은 바이러스 생산 세포를 각 유전자를 생산하는 레트로 바이러스 벡터마다 선택하고 있는데, 본 법을 사용함으로써 한 번 마커 유전자를 발현하는 바이러스 고생산 세포주를 수립해 두면, 이 세포주 염색체상의 마커 유전자를 목적 유전자와 치환함으로써 고생산주를 용이하게 얻을 수 있다고 생각되기 때문이다.
본 발명의 방법에 의한 재조합 바이러스 제작의 구체적인 방법을 재조합 아데노 바이러스의 제작을 예로서 설명한다. 종래의 기술에서의 재조합 아데노 바이러스의 제작방법은 아데노 바이러스 게놈 및 목적 유전자를 삽입한 플라스미드 벡터나 코스미드 벡터 등으로 293 세포 등의 세포를 형질전환하고, 상동재조합에 의해 생긴 재조합 바이러스를 클론화한 후, 목적하는 바이러스를 선별하여 증식시키는 방법이며, 이것에는 장기간의 작업이 필요하다. 본 발명에 의한 방법에서는 효율이 낮은 상동재조합을 개재시키지 않으므로, 단기간에 목적하는 재조합 바이러스를 제작할 수 있다. 즉, 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 삽입한 유전자 도입용 아데노 바이러스를 먼저 제작해 두고, 이어서 이 바이러스를 293 세포 등 재조합 아데노 바이러스 제작에 적합한 세포에 감염시키고, 동시에 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 목적 유전자를 삽입한 플라스미드 DNA를 상기 세포에 도입함과 동시에 Cre 단백을 발현시킴으로써, 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열 사이에 목적 유전자가 삽입된 재조합 바이러스가 고빈도로 얻어진다. 이 경우, 유전자 도입용 아데노 바이러스는 Cre에 의한 재조합에 의해 loxP 서열에 끼인 패키징 서열이 제거되도록 제작하고, 플라스미드 DNA 로부터 목적 유전자와 동시에 패키징 서열을 더해 치환함으로써 목적 바이러스가 선택적으로 얻어지도록 해도 된다. Cre 단백은 플라스미드 DNA의 형태로 도입해도 되고, 또 미리 세포를 형질전환하고, Cre 단백을 항상 또는 어떠한 유도에 의해 발현하도록 해 두어도 된다.
이하에 상기 방법을 보다 상세하게 설명한다. 외래 유전자 A가 외래 유전자 B로 치환된 재조합 아데노 바이러스를 제작하는 경우에 대하여 설명한다. 유전자 도입용 재조합 아데노 바이러스 구조의 예로서 아데노 바이러스 좌단 역방향 반복서열 (inverted terminal repeat : ITR)/야생형 loxP 서열/패키징 서열/야생형 loxP 서열/유전자 A/변이형 loxP 서열의 순서로 loxP 서열을 삽입한 아데노 바이러스를 들 수 있다. 여기에서, 야생형 loxP 서열/유전자 A의 단편은 E1 결실부위에 삽입된다. 외래 유전자 B 삽입용 플라스미드 DNA의 예로서는 야생형 loxP 서열/패키징 서열/유전자 B/변이형 loxP 서열의 구조를 갖는 플라스미드를 들 수 있다. 이들 유전자 도입용 아데노 바이러스와 외래 유전자 B 삽입용 플라스미드 DNA를 동시에 또는 순차적으로, Cre 단백을 발현시키도록 한 293 세포 등의 세포에 도입하면, 유전자 도입용 아데노 바이러스에서는 2 개의 야생형 loxP 서열에 끼인 패키징 서열이 제거됨과 동시에, 야생형 loxP 서열/유전자 A/변이형 loxP 서열의 부분이 플라스미드 유래의 야생형 loxP 서열/패키징 서열/유전자 B/변이형 loxP 서열로 치환된 재조합 아데노 바이러스가 생성된다. 유전자 치환되지 않은 유전자 도입용 아데노 바이러스는 반응효율이 높은 2 개의 야생형 loxP 서열 사이의 통상의 「절단반응」에 의해 패키징 서열이 제거되어 있기 때문에, 바이러스 DNA는 복제하지만 바이러스 입자 (virion) 내에 DNA가 패키징되지 않아 바이러스로서는 복제하지 않는다. 한편, 유전자 치환된 아데노 바이러스는 패키징 서열을 가지므로, 바이러스로서 복제할 수 있기 때문에, 「유전자 B」로 치환된 재조합 아데노 바이러스가 고빈도로 얻어진다.
유전자 도입용 아데노 바이러스의 변이형 loxP 서열의 삽입위치는 외래 유전자 A의 바로 옆이어도 되고, 유전자 A 로부터 떨어진 아데노 바이러스 게놈내이어도 된다. 후자의 삽입위치의 예로서는 L3 유전자와 E2A 유전자 사이의 비번역영역, E3 유전자의 결실부위, E4 유전자의 상류 영역과 우측 ITR의 사이 등을 들 수 있다. 이들 위치에 변이형 loxP 서열을 삽입하여 유전자 치환을 행하는 경우, 생성되는 아데노 바이러스 DNA가 바이러스 입자 (virion)에 효율적으로 패키징되도록, 목적 유전자 삽입용 플라스미드의 야생형 loxP 서열/변이형 loxP 서열 사이의 DNA의 사이즈를 조절할 필요가 있는데, 유전자 치환된 재조합 아데노 바이러스는 바이러스의 복제에 필수인 유전자를 결실하고 있으므로, 유전자 치료용 벡터로서 사용하는 경우, 현재의 아데노 바이러스 벡터에서 문제가 되고 있는 부작용을 경감시킬 수 있다고 생각된다.
본 발명의 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA는 의약으로서 유전자 치료에도 사용할 수 있다. 그 방법을 이하에 설명한다.
먼저, 인간 세포의 염색체에 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 미리 삽입한다. 그를 위해, 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 갖는 DNA가 의약품으로서 사용된다. 상기 DNA 는, 예컨대 레트로 바이러스나 아데노 수반 바이러스 (AAV) 등의 바이러스 벡터중에 포함되는 형태로 투여된다. 그 중에서도, AAV를 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 레트로 바이러스에 의한 유전자 도입은 염색체에 랜덤하게 삽입되는데, AAV에서는 염색체의 특정 부위 (제 19 번 염색체의 AAV-S1 영역)에 삽입되는 확률이 높기 때문이다. 이 염색체의 특정 부위로의 유전자 도입에는 AAV가 코드하는 바이러스 유전자 (Rep)가 필수인데, 현재 사용되고 있는 AAV 벡터에서는 AAV 유전자의 대부분이 제거되어 있으므로, 염색체로의 특이적 조입 기구는 상실되어 있다. 그러나, 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 합해도 불과 100 염기가 채 되지 않으므로, AAV의 전체 바이러스 유전자를 유지한 채, 2 개의 loxP 서열을 삽입한 바이러스를 제작할 수 있다. 그 삽입위치는 AAV 유전자의 양단에 존재하는 역방향 반복서열 (inverted terminal repeat : ITR)의 각각 바로 내측이 바람직하다. 이 2 개의 loxP 서열을 삽입한 AAV를 인간에 투여함으로써 염색체에 2 개의 loxP 서열을 삽입할 수 있다.
이어서, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 목적 유전자를 삽입한 환상 DNA 분자로 이루어지는 의약과, Cre 단백 또는 Cre 유전자를 코드하는 DNA 분자를 투여함으로써 염색체상에 존재하는 2 개의 loxP 서열 사이에 끼인 AAV 유전자가 제거되며, 목적 유전자로 치환된다. 의약으로서의 환상 DNA 분자와 Cre 단백 또는 Cre 유전자를 코드하는 DNA 분자를 인간 세포에 도입하는 방법으로서는 바이러스 벡터나 리포솜 벡터 등 기존의 유전자 치료에 사용되고 있는 벡터를 사용하는 방법을 들 수 있다.
이와 같이 하여 염색체에 유전자가 삽입된 인간 세포에서는 목적 유전자의 양단에 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열이 존재하고, 또한 그 외측에 AAV의 ITR 이 존재할 뿐, AAV의 구조 유전자는 전혀 존재하지 않으므로, AAV 유래의 단백이 발현하여 항원이 되지도 않고, 목적 유전자의 발현이 장기간 안정하게 지속하는 것을 기대할 수 있다. 또, 삽입한 유전자가 필요 없게 된 경우, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 유전자가 존재하지 않는 환상 DNA 분자를 투여함으로써 삽입한 유전자를 염색체로부터 제거할 수 있다. 또한, 그 후 다시 염색체로의 유전자의 삽입이 필요해진 경우, 2 개의 loxP 서열이 염색체상에 남아 있으므로, 상술한 방법으로 임의의 유전자를 삽입할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA는 염색체로의 유전자를 삽입 및 제거를 자유롭게 할 수 있는 유전자 치료를 위한 의약으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA를 의약으로서 사용하는 경우, 이 DNA의 세포내로의 도입방법으로서는 바이러스 벡터에 의한 것, 및 그 외의 것으로 크게 구별된다 (닛케이 사이언스, 1994 년 4 월호, 20-45 면, 월간약사, 36(1), 23-48 (1994), 및 이들의 인용문헌 등). 본 발명의 의약에서는 어떤 방법도 적용할 수 있다.
바이러스 벡터에 의한 도입방법으로서는, 예컨대 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, 신비스 외의 RNA 바이러스 등에 본 발명의 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA 또는 대응하는 RNA를 넣어 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스 등을 사용한 방법이 특히 바람직하다.
그 외의 도입방법으로서는 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 유전자총법 등을 들 수 있고, 리포솜법이 특히 바람직하다.
또, 본 발명의 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA를 실제로 의약으로서 작용시키기 위해서는 상기 DNA를 직접 체내에 도입하는 In Vivo 법, 및 인간으로부터 어느 종류의 세포를 채취하여 체외에서 상기 DNA를 상기 세포에 도입하여 그 세포를 체내로 되돌리는 Ex Vivo 법이 있다 (닛케이 사이언스, 1994 년 4 월호, 20-45 면, 월간약사, 36(1), 23-48 (1994), 및 이들의 인용문헌 등). 본 발명의 의약에서는 치료목적의 질환, 표적장기 등에 따라 적당히 어느 방법을 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 의약에서, In Vivo 법에 의해 투여하는 경우에는 치료목적의 질환, 표적장기 등에 따른 적당한 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 예컨대, 정맥, 동맥, 피하, 근육내 등에 투여하거나, 또는 신장, 간장, 폐, 뇌, 신경 등의 질환의 대상부위에 직접 투여할 수 있다.
또, Ex Vivo 법에 의한 경우에는 통상법에 준하여 인간의 세포 (예컨대, 림프구, 조혈간세포 등)를 채취하고, 그것에 본 발명의 의약을 감작시켜 유전자 도입을 행한 후, 그 세포를 인간으로 되돌리는 것이 행해진다.
In Vivo 법에 의해 투여하는 경우에는 여러 가지의 제제형태 (예컨대, 액제 등)를 취할 수 있는데, 일반적으로는 유효성분인 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA를 함유하는 주사제 등이 된다. 또, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가해도 된다. 당해 주사제 등은 통상법에 의해 조제할 수 있고, 예컨대 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA를 적절한 용제 (예컨대, 멸균된 물, 완충액, 생리식염수 등)에 용해한 후, 필터 등으로 여과하여 멸균하고, 이어서 무균적인 용기에 충전함으로써 조제할 수 있고, 또 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA 대신에, 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA를 넣은 바이러스 벡터를 제제화해도 된다. 또한, 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA를 포매(包埋)한 리포솜 (또는 HJV-리포솜)에서는 현탁제, 동결제, 원심분리농축 동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.
제제중의 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA의 함량은 치료목적의 질환, 표적장기, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적당히 조제할 수 있는데, 통상 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA 로서 0.0001 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ ∼ 10 ㎎ 이고, 이것을 수일 내지 수월에 1 회 투여하는 것이 적당하다.
이상은 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열의 조합, 또는 변이형 loxP 서열 1 과 변이형 loxP 서열 2의 조합의 2 개의 loxP 서열을 사용한 경우의 유전자 치환의 방법의 설명인데, 기질특이성이 다른 3 개 이상의 loxP 서열을 사용함으로써 유전자 치환방법의 응용범위를 더욱 넓히는 것이 가능하다. 기질특이성이 다른 3 개의 loxP 서열의 조합으로서, 예컨대 야생형 loxP 서열과 2 개의 변이형 loxP 서열의 조합, 3 개의 변이형 loxP 서열의 조합 등을 들 수 있다. 본 방법을 야생형 loxP 서열, 변이형 loxP 서열 1, 변이형 loxP 서열 2의 3 개의 다른 loxP 서열이 동일 DNA 상에 존재하는 경우를 예로서 설명한다. 야생형 loxP 서열/유전자 A/변이형 loxP 서열 1/유전자 B/변이형 loxP 서열 2를 이 순서로 갖는 DNA (a) 에, 야생형 loxP 서열/유전자 C/변이형 loxP 서열 1을 갖는 환상 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키면, DNA (a) 중의 유전자 A를 유전자 C로 치환할 수 있다. 한편, 환상 DNA (b) 대신에, 변이형 loxP 서열 1/유전자 D/변이형 loxP 서열 2를 갖는 환상 DNA (c)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키면, DNA (a) 중의 유전자 B를 유전자 D로 치환할 수 있다. 즉, 다른 환상 DNA를 사용하는 것만으로 DNA (a)에 존재하는 복수의 유전자 중 목적하는 유전자만을 임의의 유전자로 치환할 수 있다.
다음으로 본 발명의 변이형 loxP 서열을 사용한 유전자 치환의 구체예에 대하여 설명한다. 이하의 예에서, 변이형 loxP 서열은 모두 스페이서 영역의 2 번째 염기를 T에서 C로, 7 번째 염기를 G에서 A로 치환한 서열 (서열번호: 26)을 사용하였다.
(1) 아데노 바이러스 게놈에 존재하는 유전자의 치환
치환하는 유전자의 예로서 대장균 lacZ 유전자를 사용하고, 환상 DNA 분자상의 lacZ 유전자를 아데노 바이러스 게놈의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 삽입하는 계에서 본 발명의 변이형 loxP 서열의 유효성을 확인하였다.
먼저, 유전자 치환되는 측의 아데노 바이러스, 즉 표적용 아데노 바이러스로서 E1 유전자 및 E3 유전자를 결실시킨 아데노 바이러스 5 형의 E1 유전자 결실부위에 CAG 프로모터/야생형 loxP 서열/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열을 그 전사방향이 좌향 (아데노 바이러스 E1 유전자의 전사방향과 역방향) 이 되도록 삽입한 재조합 아데노 바이러스 (AxCALwM)를 제작하였다. 그리고, 여기에 말하는 CAG 프로모터란, 고발현 벡터로서 일본 공개특허공보 평3-168087 호에 개시되어 있는 것이다.
lacZ 유전자를 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 삽입한 환상 DNA 분자는 야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열의 구조를 갖는 플라스미드 DNA로 하여 트랜스펙션에 의해 직접 세포에 도입해도 된다. 그러나, 트랜스펙션에 의한 세포로의 유전자 도입효율은 수 10 %에 머물고, 모든 세포에는 목적 DNA를 도입할 수 없으므로, 아데노 바이러스 벡터를 사용하여 Cre 의존적으로 세포내에서 환상 DNA 분자로 하는 방법에 의해 거의 모든 세포에 환상 DNA 분자를 도입하였다. 그를 위해, E1 유전자 및 E3 유전자를 결실시킨 아데노 바이러스 5 형의 E1 유전자 결실부위에 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘키나아제 (TK) 유전자의 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열을 그 전사방향이 좌향이 되도록 삽입한 재조합 아데노 바이러스 (AxALZMOL)를 제작하였다. 이 재조합 바이러스 AxALZMOL을 공여용 아데노 바이러스라고 부른다. AxALZMOL에 Cre 단백을 작용시키면, 2 개의 야생형 loxP 서열 사이에서 재조합 반응이 일어나고, 야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열 구조의 환상 DNA 분자가 생성된다. 그리고, TK 유전자의 폴리 A 서열은 미동정의 아데노 바이러스 유래의 프로모터로부터 lacZ 유전자의 전사가 일어나지 않도록 하기 위해 삽입하였다. 또, Cre 단백은 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 AxCANCre (카네가에 등, Nucleic Acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995))에 의해 공급하였다.
다음으로, 이들 3 종류의 재조합 아데노 바이러스를 사용하여, 아데노 바이러스 게놈에 존재하는 유전자의 치환 (삽입) 실험을 행하였다. 공여용 아데노 바이러스 AxALZMOL, 표적용 아데노 바이러스 AxCALwM, 및 Cre 발현 아데노 바이러스 AxCANCre를 동물배양세포 (CV-1 세포 또는 COS-1 세포)에 동시에 감염시켰다. 공여용 아데노 바이러스 AxALZMOL 및 생성된 환상 DNA 분자는 lacZ 유전자를 갖지만 프로모터가 존재하지 않으므로 lacZ 유전자는 발현하지 않는다. 환상 DNA 분자상의 lacZ 유전자가 표적용 아데노 바이러스 AxCALwM의 CAG 프로모터의 하류, 즉 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 삽입되어 비로소 lacZ 유전자가 발현한다. 따라서, lacZ 유전자의 발현은 실제로 유전자 치환 (이 경우는 삽입) 이 일어난 것의 명확한 증거가 된다.
상기 3 종류의 바이러스 단독, 또는 그 중의 2 개의 바이러스의 조합에서는 lacZ 유전자가 발현한 세포는 전혀 존재하지 않았지만, 3 종류의 바이러스를 동시에 감염함으로써 lacZ 유전자의 발현이 명확하게 관찰되고, 더욱이 lacZ 유전자를 발현한 세포의 비율은 공여용 아데노 바이러스의 양에 의존하여 증가하고, 최대 약 90 %의 세포에서 lacZ 유전자의 발현을 관찰하였다. 이상의 결과로부터, 공여용 아데노 바이러스상의 lacZ 유전자가 환상 DNA 분자의 형태를 통해 표적용 아데노 바이러스의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 매우 효율적으로 삽입된, 즉 유전자 치환이 일어난 것이 명확해졌다.
(2) 동물세포의 염색체에 존재하는 유전자의 치환
다음으로, 아데노 바이러스 게놈상 뿐만 아니라, 동물세포의 염색체에 존재하는 유전자도 효율적으로 치환할 수 있는 것을 나타내기 위해, 이하의 실험을 행하였다. 실험계의 원리는 (1) 과 동일한데, 유전자 치환되는 세포주 (표적 세포)를 얻기 위해, CAG 프로모터/야생형 loxP 서열/하이그로마이신 B 내성 유전자/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열 구조의 DNA를 포함하는 플라스미드로 CV-1 세포를 형질전환하고, 하이그로마이신 B 내성을 가지며 또한 상기 구조의 DNA가 세포당 1 카피만 삽입된 세포주를 복수 제작하였다.
이들 세포주에 공여용 아데노 바이러스 AxALZMOL 및 Cre 발현 아데노 바이러스 AxCANCre를 동시에 감염시켰다. 그 결과, 공여용 아데노 바이러스 또는 Cre 발현 아데노 바이러스 단독에서는 lacZ 유전자를 발현한 세포는 전혀 존재하지 않았지만, 양 바이러스를 동시 감염함으로써 lacZ 유전자가 발현한 세포가 매우 고빈도로 관찰되었다. 그 비율은 사용한 세포주에 따라 다른데, 최대 약 30 %의 세포에서 lacZ 유전자가 발현하고 있었다. 이 실험계에서는 세포의 클론화는 일체 행하고 있지 않으므로, lacZ 유전자가 발현한 세포의 비율은 염색체 상에서의 유전자 치환이 일어난 비율을 직접 나타내고 있다. 따라서, 이상의 결과는 본 발명의 변이형 loxP 서열을 사용함으로써 동물세포의 염색체에서의 유전자 치환을 매우 효율적으로 행할 수 있는 것을 나타내는 것이다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 리콤비나아제 Cre의 존재하, 야생형 loxP 서열과는 재조합 반응이 일어나지 않고, 또한 동일 서열의 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서의 재조합 반응은 2 개의 야생형 loxP 서열 사이와 동일 정도의 효율로 일어나는 변이형 loxP 서열을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열, 또는 다른 서열의 변이형 loxP 서열의 조합에 의해 동물세포를 시작으로 하는 고등진핵세포에서 효율이 높은 유전자 삽입 또는 유전자 치환을 행하는 방법을 제공하고, 그 방법을 동식물 세포로의 유전자 도입, 재조합 바이러스 제작, 동식물 개체에서의 유전자 조작 등에 응용하는 것에 있다.
본 발명자들은 loxP 서열의 스페이서 영역의 8 염기 모두에 대하여 가능한 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열을 제작하고, 매우 예민한 측정방법으로 반응성을 시험함으로써 2 개의 loxP 서열 사이에서의 리콤비나아제 Cre 의존 재조합 반응의 기구를 연구하고, 반응에 필수인 염기서열을 발견하였다. 이러한 결과에 기초하여, 동일 서열의 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서는 2 개의 야생형 loxP 서열 사이와 동일 정도의 효율로 재조합 반응이 일어나는데, 야생형 loxP 서열 또는 다른 서열의 변이형 loxP 서열과는 재조합 반응이 일어나지 않는 변이형 loxP 서열을 발견하였다. 또한, 이들 loxP 서열을 조합함으로써 동물세포의 염색체에 매우 높은 효율로 유전자를 삽입하는 것에 성공하였다. 본 발명은 이러한 결과에 기초하고 더욱 연구를 진행하여 완성하기에 이른 것이다.
즉, 본 발명의 요지는 다음의 (1) ∼ (21) 과 같다 ;
(1) 이하의 성질을 갖는 변이형 loxP 서열.
(a) 대장균 P1 파지 유래의 하기 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G), 4 번째 (T) 또는 5 번째 (A) 염기 중 적어도 1 개의 염기 및 6 번째 (T) 또는 7 번째 (G) 염기 중 적어도 한쪽의 염기가 다른 염기로 치환되고, 스페이서 영역 이외의 영역은 임의의 염기로 치환되어 있어도 되는 서열로 이루어지고,
(b) 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 야생형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않고,
(c) 리콤비나아제 Cre의 존재하, 동일한 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어난다 ;
(2) 이하의 성질을 갖는 변이형 loxP 서열.
(a) 대장균 P1 파지 유래의 하기 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G) 및 4 번째 (T)의 염기에서 선택되는 1 개의 염기가 다른 염기로 치환되고, 스페이서 영역 이외의 영역은 임의의 염기로 치환되어 있어도 되는 서열로 이루어지고,
(b) 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 야생형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않고,
(c) 리콤비나아제 Cre의 존재하, 동일한 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어난다 ;
(3) 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 다른 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 변이형 loxP 서열 ;
(4) 서열번호: 26, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 35, 서열번호: 39, 서열번호: 42 또는 서열번호: 49로 나타나는 서열인 상기 (1)에 기재된 변이형 loxP 서열 ;
(5) 상기 (1) 내지 (4)중 어느 하나에 기재된 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA;
(6) 적어도 하나의 야생형 loxP 서열 및 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 변이형 loxP 서열을 적어도 하나 갖는 DNA ;
(7) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 원하는 유전자가 삽입된 상기 (6)에 기재된 DNA ;
(8) 서로 다른 서열을 갖는 적어도 2 개의 상기 (3)에 기재된 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA ;
(9) 서로 다른 서열을 갖는 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에 원하는 유전자가 삽입된 상기 (8)에 기재된 DNA ;
(10) 상기 (6) 내지 (9)중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 형질전환된 세포;
(11) 하기 DNA (a) 및 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키고, 하기 DNA (c)를 얻는 것으로 이루어지는 유전자 치환방법.
(a) 야생형 loxP 서열, 유전자 A 및 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 변이형 loxP 서열을 이 순서로 갖는 DNA.
(b) 야생형 loxP 서열, 유전자 B 및 DNA (a)와 동일한 변이형 loxP 서열을 이 순서로 갖는 환상 DNA.
(c) DNA (a)에서 유전자 A가 유전자 B로 치환된 DNA.
여기에서, 유전자 A 및 유전자 B는 서로 다른 임의의 유전자이다 ;
(12) 하기 DNA (a) 및 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키고, 하기 DNA (c)를 얻는 것으로 이루어지는 유전자 치환방법.
(a) 서로 다른 서열을 갖는 2 개의 상기 (3)에 기재된 변이형 loxP 서열 (변이형 loxP 서열 1 및 변이형 loxP 서열 2) 및 유전자 A를 변이형 loxP 서열 1/유전자 A/변이형 loxP 서열 2의 순서로 갖는 DNA.
(b) 변이형 loxP 서열 1, 유전자 B 및 변이형 loxP 서열 2를 이 순서로 갖는 환상 DNA.
(c) DNA (a)에서 유전자 A가 유전자 B로 치환된 DNA.
여기에서, 유전자 A 및 유전자 B는 서로 다른 임의의 유전자이다 ;
(13) 유전자 B가 기능적인 유전자가 아닌 것을 특징으로 하는 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 방법 ;
(14) 유전자 A가 기능적인 유전자가 아닌 것을 특징으로 하는 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 방법 ;
(15) DNA (a)가 세포의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 플라스미드 DNA 또는 이본쇄 환상 DNA 바이러스의 DNA인 것을 특징으로 하는 상기 (11) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 방법 ;
(16) DNA (a)가 세포의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 세포내에서 변환됨으로써 이본쇄 환상 DNA가 되는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 (11) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 방법 ;
(17) DNA (a)가 이본쇄 DNA 바이러스의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 플라스미드 DNA 또는 이본쇄 환상 DNA 바이러스의 DNA인 것을 특징으로 하는 상기 (11) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 방법 ;
(18) DNA (a)가 이본쇄 DNA 바이러스의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 세포내에서 변환됨으로써 이본쇄 환상 DNA가 되는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 (11) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 방법 ;
(19) DNA (a)의 이본쇄 DNA 바이러스가 아데노 바이러스인 것을 특징으로 하는 상기 (17) 또는 (18)에 기재된 방법 ;
(20) 상기 (6) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 DNA를 염색체상에 갖는 트랜스제닉 동물 ;
(21) 상기 (6) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 DNA로 이루어지는 의약.
이하, 본 발명의 일부로서 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술분야에서의 통상의 변경이 가능한 것은 말할 것도 없다. 그리고, 실시예중의 파지, 플라스미드, DNA, 각종 효소, 대장균, 배양세포 등을 취급하는 모든 조작은 특별히 언급하지 않는 한, 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual. T. Maniatis et al., 제 2 판 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory」에 기재된 방법에 준하여 행하였다.
실시예 1
2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서의 리콤비나아제 Cre 의존 재조합 반응
(1) 리콤비나아제 Cre를 포함하는 세포 추출액의 조제
리콤비나아제 Cre 의존 재조합 반응에 사용하는 Cre를 포함하는 세포 추출액을 얻을 목적에서 이하의 조작을 행하였다. Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 벡터 AxCANCre (카네가에 등, Nucleic acid Res., Vol.23, 3816-3821(1995)) 약 1 ×109 PFU를 225 ㎠ 플라스크 1 개의 293 세포 (인간 태아 신장 유래 세포주)에 감염 (37 ℃, 1 시간) 시키고, 배지 (5 % FCS 함유 DMEM 배지)를 첨가후 추가로 24 시간 배양하였다. 배양 종료후, 저속 원심기로 1000 회전 5 분 원심하고, 배양 상청을 버리고 세포를 모았다. 세포에 보존용 완충액 (50 % 글리세롤/20 mM 트리스 염산 (pH 7.5)/300 mM 염화 나트륨/1 mM EDTA (pH 7.5)) 5 ml를 첨가하여 세포를 현탁하고, 밀폐형 소니케이터를 사용하여 200 W, 2 분 (30 초 ×4 회) 세포를 파쇄하고, 세포내에 존재하는 Cre 단백을 방출시켰다. 얻어진 세포 파쇄액을 마이크로 원심기로 15000 회전 10 분 원심하고, 그 상청을 냉동보존 (-80℃) 하였다.
(2) 변이형 loxP 서열을 포함하는 합성 DNA의 제작
야생형 loxP 서열중의 8 염기의 스페이서 부분을 1 염기 또는 2 염기 동시에, 다른 염기로 치환한 52 염기의 합성 DNA를 제작하였다. 합성한 DNA의 종류는 1 염기의 변이가 24 종류, 2 염기 동시의 변이가 29 종류이고, 각각 센스사슬 및 안티센스사슬을 합성하였다. 야생형 loxP 서열의 합성 DNA의 구조를 도 1 (센스사슬은 서열번호: 55, 안티센스사슬의 서열번호: 56)에 나타낸다. 또, 변이형 loxP 서열 (센스사슬 및 안티센스사슬)을 도 2 ∼ 도 5에 나타낸다. 야생형 센스사슬과 안티센스사슬은 완전한 상보 서열이 아니고, 각각의 사슬을 어닐링하여 2 본쇄 DNA로 했을 때, 5' 말단이 각각 4 염기 돌출하고, 양말단이 제한효소 XbaI 및 XhoI의 절단단편이 되도록 설계하였다. 그 때문에, 이들 2 본쇄 DNA 는, XbaI 단편측은 제한효소 XbaI 및 NheI 절단단편과, XhoI 단편측은 제한효소 XhoI 및 SalI 절단단편과 각각 결합할 수 있다.
모든 1 본쇄 합성 DNA는 5' 말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 인산화하고, 각각의 변이에 대응하는 센스사슬 및 안티센스사슬을 어닐링하였다. 이후, 이 2 본쇄 합성 DNA를 변이형 loxP 합성 DNA 라고 부른다.
(3) 2 개의 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
직쇄상 DNA의 양단에 동일 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 기질 DNA를 얻을 목적에서 이하의 조작을 행하였다.
플라스미드 pBR322를 제한효소 NheI 및 SalI으로 동시에 절단하고, 변이형 loxP 합성 DNA (1 염기만의 치환) 24 종류를 각각 T4 DNA 리가제로 결찰 반응 (플라스미드 : 합성 DNA의 몰비 1 : 6)을 행한 후, 제한효소 XbaI 및 XhoI으로 동시에 절단하였다. 이 제한효소처리에 의해 pBR322 DNA의 양단에 복수개 결합한 변이형 loxP 합성 DNA가 제거되고, pBR322 DNA의 양단에 동일 서열의 변이형 loxP 합성 DNA가 1 개소씩 결합한 약 4.1 kb의 직쇄상 DNA가 생긴다. 이어서, 미반응 및 제한효소 절단된 변이형 loxP 합성 DNA를 GEANCLEAN II (프나코시사 제조)에 의해 제거하고, 양단에 변이형 loxP 서열이 결합한 직쇄상 DNA (약 4.1 kb)를 다음에 나타내는 반응의 기질 DNA 로서 사용하였다.
(4) 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응
이하에 나타내는 어세이 방법으로 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에서 Cre 의존 재조합 반응이 일어나는지를 검토하였다.
최종농도, 50 mM 트리스 염산 (pH 7.5)/10 mM MgCl2/1 ㎎/ml 소 혈청 알부민/1 mM 페닐메틸술포닐플로라이드 (PMSF)/5 ㎍/ml 아프로티닌을 포함하는 완충액에, (3)에서 조제한 기질 DNA (1 ㎍)와 (1)에서 조제한 Cre를 포함하는 세포 추출액 10 ㎕를 첨가하고 (반응액량 50 ㎕), 37 ℃에서 30 분 반응하였다. 반응 종료후, 반응액에 45 ㎕의 TE 버퍼 (pH 8.0) 및 5 ㎕의 EDTA 용액 (pH 8.0)을 첨가하고, 페놀/클로로포름 추출 및 클로로포름 추출을 행하고, 추가로 에탄올 침전하고, 얻어진 DNA를 RNaseA (20 ㎍/ml)를 포함하는 TE 버퍼 (pH 8.0) 30 ㎕에 용해하였다. 이어서, 그 반의 양을 제한효소 BsaHI으로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동후, 브롬화 에티듐 (EtBr) 염색에 의해 검출된 DNA의 밴드를 해석하였다.
Cre에 의한 재조합 반응을 행하기 전의 직쇄상 기질 DNA (약 4.1 kb)를 제한효소 BsaHI 절단하면, 2.7 kb, 610 bp, 380 bp, 360 bp의 4 개의 밴드가 생긴다. 한편, 기질 DNA가 Cre에 의해 재조합 반응을 일으키면, 변이형 loxP를 1 개 갖는 약 4.0 kb의 환상 DNA와 변이형 loxP 만으로 이루어지는 약 50 bp의 직쇄상 DNA가 생기므로, 이들을 제한효소 BsaHI 절단하면, 2.7 kb, 920 bp, 380 bp, 50 bp의 4 개의 밴드가 생긴다 (도 6 참조). 따라서, 920 bp의 밴드는 Cre에 의한 재조합 반응이 일어난 것을 나타내고, 610 bp 및 360 bp의 밴드는 Cre에 의한 재조합 반응이 일어나고 있지 않은 것을 나타내므로, 이들 밴드의 양비에 의해 재조합 반응의 효율을 알 수 있다. 결과를 표 1에 나타낸다.
| 서열번호 | 합성DNA번호 | 변이형 loxP 서열-변이형 loxP 서열 | 야생형 loxP 서열-변이형 loxP 서열 | ||
| 중간체(970 bp) | 최종 반응체(920 bp) | 중간체(970 bp) | 최종 반응체(920 bp) | ||
| 1 | 야생형 | 1 | 9 | 1 | 9 |
| 2 | #11 | 4 | 2 | 3 | 5 |
| 3 | #12 | 6 | 3 | 4 | 7 |
| 4 | #13 | 4 | 3 | 3 | 7 |
| 5 | #21 | 4 | 5 | 5 | 0 |
| 6 | #22 | 4 | 5 | 7 | 0 |
| 7 | #23 | 6 | 5 | 9 | 0 |
| 8 | #31 | 5 | 7 | 9 | 0 |
| 9 | #32 | 6 | 3 | 9 | 0 |
| 10 | #33 | 6 | 6 | 9 | 0 |
| 11 | #41 | 1 | 7 | 9 | 0 |
| 12 | #42 | 5 | 6 | 9 | 0 |
| 13 | #43 | 5 | 6 | 9 | 0 |
| 14 | #51 | 1 | 9 | 7 | 1 |
| 15 | #52 | 1 | 9 | 7 | 2 |
| 16 | #53 | 1 | 8 | 7 | 1 |
| 17 | #61 | 1 | 8 | 1 | 3 |
| 18 | #62 | 1 | 8 | 1 | 6 |
| 19 | #63 | 1 | 9 | 1 | 2 |
| 20 | #71 | 1 | 7 | 1 | 1 |
| 21 | #72 | 3 | 7 | 1 | 1 |
| 22 | #73 | 3 | 1 | 1 | 1 |
| 23 | #81 | 3 | 3 | 4 | 7 |
| 24 | #82 | 8 | 5 | 5 | 9 |
| 25 | #83 | 2 | 9 | 2 | 8 |
(표 중, 반응의 중간체 및 최종 반응체의 양을 0 ∼ 9 까지의 10 단계로 표시하였다. 숫자가 클수록 생성량이 많다. 2 개의 야생형 loxP 서열 사이에서 반응을 행한 경우의 최종 반응체의 양 (DNA 밴드의 농도)을 최대의 「9 」로 하고, DNA의 밴드를 거의 검출할 수 없는 경우 (「9」의 5 % 미만)를 「0」 으로 하였다. 반응 중간체의 상세에 대해서는 실시예 2-(2)에서 설명함)
#11, #73의 변이형 loxP 서열은 반응효율이 나쁘지만, 그 외의 변이형 loxP 서열은 서열에 따라 다소 반응효율에 차이는 있으나 동일 서열의 변이형 loxP 서열끼리에서는 Cre 의존 재조합 반응이 생기는 것이 확인되었다.
실시예 2
야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응 (No. 1)
(1) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
[1] 야생형 loxP 서열을 하나 갖는 플라스미드 (pBRwt)의 구축
플라스미드 pBR322에 하나의 야생형 loxP 서열을 삽입한 플라스미드 (pBRwt)를 구축하기 위해 이하의 (a) 및 (b)의 조작을 행하였다.
(a) pBR322를 제한효소 EcoNI으로 절단하고, 추가로 Klenow 효소에 의해 양단을 평활화하고, 페놀/클로로포름 추출을 행하여 EcoNI 및 Klenow 효소를 실활시킨 후, 겔 여과에 의해 반응액을 TE 버퍼로 치환하였다. 이어서, XhoI 링커 (5'-pCCTCGAGG-3')를 결찰하고, 제한효소 XhoI 및 PstI으로 동시 절단한 후, 아가로스 전기영동을 행하여 약 2.9 kb의 밴드를 절단하였다. 이 밴드를 GEANCLEAN II (프나코시사 제조)를 사용하여 정제하고, 한쪽의 단이 XhoI 절단단편, 다른 쪽이 PstI 절단단편인 약 2.9 kb의 DNA 단편을 얻었다.
(b) pBR322를 제한효소 NheI으로 절단하고, 야생형 loxP 서열을 포함하는 합성 DNA (52 bp)를 결찰한 후, 제한효소 XhoI 및 PstI으로 동시 절단하고, 반응액을 아가로스 전기영동하였다. 야생형 loxP 서열을 하나 포함하는 약 1.4 kb의 밴드를 절단하고, GEANCLEAN II (프나코시사 제조)를 사용하여 정제하였다. 이 약 1.4 kb의 DNA 단편도 한쪽의 끝이 XhoI 절단단편, 다른쪽이 PstI 절단단편이다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰한 후 대장균을 형질전환하고, pBR322의 NheI 사이트와 EcoNI 사이트 사이에 하나의 야생형 loxP 서열이 삽입된 플라스미드 pBRwt (4.4 kb, 도 7)를 얻었다.
[2] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
직쇄상 DNA의 한쪽의 단에 야생형 loxP 서열을, 다른쪽에 변이형 loxP 서열을 갖는 기질 DNA를 조제하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
플라스미드 pBRwt의 야생형 loxP 서열로부터 약 30 bp 떨어진 위치에 SalI 사이트가 존재하므로, 이 플라스미드를 제한효소 SalI으로 절단하여 직쇄상으로 한 후, 실시예 1-(3) 과 동일한 변이형 loxP 합성 DNA (52 bp, 24 종류)를 결찰하였다 (플라스미드 : 합성 DNA의 몰비 1 : 6). 이 조작에 의해 pBRwt의 SalI 절단부위에 변이형 loxP 합성 DNA의 XhoI 절단단편측이 결합한다. 이어서, 반응액을 제한효소 XbaI 및 XhoI으로 동시에 절단하고, pBRwt의 양단에 복수개 결합한 변이형 loxP 합성 DNA를 제거한 후, 미반응 및 제한효소 절단된 변이형 loxP 합성 DNA를 GEANCLEAN II (프나코시사 제조)에 의해 반응액으로부터 제거하고, 한쪽의 단에 야생형 loxP 서열이, 다른쪽의 단에 변이형 loxP 서열이 각 1 개 결합한 직쇄상 DNA (약 4.4 kb, 도 8)를 얻었다. 이 DNA를 기질 DNA로 하여 다음에 나타내는 반응에 사용하였다.
(2) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응
반응 및 해석방법은 실시예 1-(4)와 동일한데, 기질 DNA는 실시예 1-(3)에서 나타낸 DNA 대신에 실시예 2-(1)에서 나타낸 DNA를 사용하였다.
하기에 나타낸 야생형 loxP 서열의 염기서열에서, 2 개의 loxP 서열 사이에서의 재조합은 8 염기의 스페이서 영역의 하측 DNA 사슬의 7 번째와 8 번째 염기 사이의 절단ㆍ재결합이 먼저 일어나고, 이어서 상측 DNA 사슬의 1 번째와 2 번째 염기 사이의 절단ㆍ재결합이 일어남으로써 반응이 완료한다는 것이 알려져 있다 (Guo et al., Nature, Vol. 389, 40-46(1997)).
따라서, 하측 DNA 사슬의 재조합은 일어나는데 상측 DNA 사슬의 재조합이 일어나지 않는 경우에는 반응의 중간체로서 검출된다. 본 발명자들이 사용한 어세이계에서는 이 중간체는 약 970 bp 부근의 밴드로서 검출되었다.
실시예 1-(4)에서 나타냈는데, 920 bp의 밴드는 상측 및 하측 DNA의 양측이 재조합되어 반응이 완료한 것에 유래하는 밴드이고, 970 bp의 밴드는 중간체에서 반응이 멈춰 있는 것에 유래하는 밴드이다. 이 2 개의 밴드의 유무에 특히 착안하여 해석한 결과를 표 1에 나타낸다. 또, 표 1의 결과의 개요를 이하에 나타낸다 (#의 다음의 숫자는 변이 loxP 서열번호).
#11, 12, 13 (서열번호: 2, 3, 4) : 반응은 최종단계까지 진행한다 ;
#21, 22, 23 (서열번호: 5, 6, 7) : 반응은 중간체에서 멈추고, 최종단계까지 진행하지 않는다 ;
#31, 32, 33 (서열번호: 8, 9, 10) : 반응은 중간체에서 멈추고, 최종단계까지 진행하지 않는다 ;
#41, 42, 43 (서열번호: 11, 12, 13) : 반응은 중간체에서 멈추고, 최종단계까지 진행하지 않는다 ;
#51, 52, 53 (서열번호: 14, 15, 16) : 반응은 대부분 중간체에서 멈추는데, 극히 일부 최종단계까지 진행한다 (약 5 %) ;
#61, 63 (서열번호: 17, 19) : 중간체는 거의 생기지 않는데, 반응은 극히 일부 최종단계까지 진행한다 (5 ∼ 10 %) ;
#62 (서열번호: 18) : 중간체는 거의 생기지 않는데, 반응은 일부 최종단계까지 진행한다 (최종 반응체는 #61, 63 보다 많다) ;
#71, 72, 73 (서열번호: 20, 21, 22) : 중간체는 거의 생기지 않는데, 반응은 극히 일부 최종단계까지 진행한다 (약 5%, 최종 반응체는 #61, 63 보다 적다) ;
#81, 82, 83 (서열번호: 23, 24, 25) : 반응은 최종단계까지 진행한다 ;
이상의 결과, 1 번째에서 8 번째 염기의 치환효과를 치환개소마다 정리하면, (1) 1 번째 또는 8 번째 염기를 치환해도 야생형 loxP 서열과 반응하는, (2) 2 번째, 3 번째 또는 4 번째 염기를 치환하면 야생형 loxP 서열과는 거의 반응하지 않는, (3) 5 번째, 6 번째 또는 7 번째 염기를 치환하면 야생형 loxP 서열과 반응하기 어려워지는데 일부 반응하는 것이 명확해졌다. 또, 이들 결과로부터, 2 번째에서 5 번째 염기의 치환과, 6 번째 및 7 번째 염기의 치환은 질적으로 다르고, 전자는 반응이 중간체에서 멈추고, 후자는 반응의 최초의 스텝이 현저하게 저해되어 있기 때문인 것이 명확해졌다.
또한 본 발명자들의 측정법에서는 야생형 loxP 서열과의 사이에서는 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않는다고 보고 (Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)) 되어 있는 변이형 loxP 서열 (#71에 상당)은 야생형 loxP 서열과의 반응성이 완전하게는 상실되어 있지는 않고, 약 5 %의 빈도로 재조합 반응이 일어나는 것이 명확해졌다.
실시예 3
야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응 (No. 2)
(1) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열의 Cre 의존 재조합 반응을 실시예 1 및 2에서 사용한 어세이계보다 감도가 높은 어세이계에서 검출하기 위한 기질 DNA를 얻기 위해 이하의 조작을 행하였다.
[1] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 갖는 플라스미드 (pBLA 변이체)의 구축
pBR322의 양단에 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열이 각 1 개 결합한 약 4.4 kb의 직쇄상 DNA에 아데노 바이러스 5 형 유래의 DNA 단편을 결합한 플라스미드를 구축하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
아데노 바이러스 5 형의 E1 및 E3 유전자 이외의 거의 전체길이가 삽입된 코스미드 벡터 pAxcw (일본 공개특허공보 평8-308585 호 15 면)를 제한효소 XbaI 및 XhoI으로 동시에 절단하고, 반응액을 아가로스 전기영동후 약 3.8 kb의 밴드를 절단하고, GEANCLEAN II (프나코시사 제조)를 사용하여 정제하였다. 이 3.8 kb의 DNA 단편과, 실시예 2-(1)-[2]에서 조제한, 한쪽의 단에 야생형 loxP 서열이 다른쪽의 단에 변이형 loxP 서열이 각 1 개 결합한 직쇄상 DNA (약 4.4 kb)를 결찰한 후, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pBLA 변이체 (8.2 kb, 도 9)를 얻었다. 그리고 이 플라스미드 pBLA 변이체는 이 조작을 행한 플라스미드의 총칭으로, 실제로는 표 1의 #11, #21, #22, #23, #31, #41, #51, #61, #71, #72, #73, #81에 대응하는 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열을 각 1 개를 갖는 개개의 플라스미드를 제작하였다.
[2] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
플라스미드 pBLA 변이체로부터, Cre 의존 재조합 반응에 기질에 사용하는 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 갖는 직쇄상 DNA를 조제하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
플라스미드 pBLA 변이체에는 삽입한 아데노 바이러스 게놈 부분에 제한효소 NcoI 사이트가 1 개소 존재하기 때문에, 이 플라스미드를 제한효소 NcoI으로 절단하여 직쇄상 DNA로 하고, 반응액을 아가로스 전기영동후 약 8.2 kb의 밴드를 절단하고, GEANCLEAN II (프나코시사 제조)를 사용하여 정제하였다. 이 8.2 kb의 직쇄상 DNA를 다음에 나타내는 반응의 기질로서 사용하였다.
(2) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응
상술한 기질 DNA를 실시예 1-(4)에서 나타낸 반응액에 첨가하고, 37 ℃에서 30 분 Cre 의존 재조합 반응을 행하였다. 반응 종료후, 반응액에 45 ㎕의 TE 버퍼 (pH 8.0) 및 5 ㎕의 EDTA 용액 (pH 8.0)을 첨가하고, 페놀/클로로포름 추출 및 클로로포름 추출을 행하고, 추가로 에탄올 침전하고, 얻어진 DNA를 RNaseA (20 ㎍/ml)를 포함하는 TE 버퍼 (pH 8.0) 30 ㎕에 용해하였다. 이어서, 그 반의 양을 제한효소 DraI 절단하고, 아가로스 겔 전기영동후, 브롬화 에티듐 (EtBr) 염색에 의해 검출된 DNA의 밴드를 해석하였다.
기질로서 사용한 직쇄상 DNA 에는 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 DraI 사이트가 2 개소 존재하기 때문에, Cre에 의한 재조합이 일어나지 않는 경우에는 DraI 절단에 의해 5.9 kb, 1.3 kb, 0.7 kb의 3 개의 밴드가 생긴다 (도 10). 한편, 기질 DNA가 Cre에 의해 재조합 반응을 일으키면, 2 개소의 DraI 사이트 및 loxP 서열 하나를 포함하는 약 4 kb의 환상 DNA 와, 하나의 loxP 서열을 포함하며 DraI 사이트가 존재하지 않는 약 3.8 kp의 직쇄상 DNA가 생기기 때문에, DraI 절단에 의해 3.8 kb, 3.3 kb, 0.7 kb의 3 개의 밴드가 생긴다. 따라서, 3.8 kb 및 3.3 kb의 밴드의 존재는 Cre에 의한 재조합 반응이 일어난 것을 나타내고, 5.9 kb 및 1.3 kb의 밴드 존재는 Cre에 의한 재조합 반응이 일어나고 있지 않은 것을 나타내므로, 이들 밴드의 양비에 의해 재조합 반응의 효율을 알 수 있다. 또한, 실시예 2-(2)에서 설명한 반응의 중간체는 이 어세이에서는 10 kb의 위치에서 검출되었다. 결과를 이하에 정리하였다.
#11, 81 : 반응은 최종단계까지 진행한다 ;
#21, 22, 23, 31, 41 : 반응은 중간체에서 멈추고, 최종단계까지 진행하지 않는다 ;
#51: 반응은 대부분 중간체에서 멈추고, 극히 일부 최종단계까지 진행한다 ;
#61 : 중간체는 거의 생기지 않는데, 일부 최종단계까지 진행한다 ;
#71 : 중간체는 거의 생기지 않는데, 일부 최종단계까지 진행한다 (최종산물은 #72, 73 보다 많다) ;
#72, 73 : 중간체는 거의 생기지 않고, 극히 일부 최종단계까지 진행한다 ;
이상의 결과로부터, 실시예 2 보다도 감도가 높은 방법으로 어세이를 행해도 경향은 동일하고, 야생형 loxP 서열과의 사이에서는 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않는다고 보고 (Hoess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)) 되어 있는 변이형 loxP 서열 (#71에 상당) 에서도 야생형 loxP 서열과의 반응성은 일부 남아 있고, 그 정도 (최종 반응물의 양)는 동일 개소의 치환인 #72 나 #73 보다도 높고, #71의 치환은 야생형 loxP 서열과의 반응성을 결실시키기 위해서는 불충분한 것이 다시 확인되었다.
실시예 4
2 개의 염기를 치환한 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응
(1) 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응
[1] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
직쇄상 DNA의 한쪽 단에 야생형 loxP 서열을, 다른쪽에 변이형 loxP 서열을 갖는 기질 DNA를 실시예 2-(1)-[2]에 나타낸 방법에 따라 조제하였다. 즉, 플라스미드 pBR322에 야생형 loxP 서열이 1 개 삽입된 플라스미드 pBRwt (실시예 2-(1)-[1]에 기재)의 제한효소 SalI 사이트에 각각의 2 염기 치환한 변이형 loxP 합성 DNA (도 4 및 도 5 참조)를 결찰한 직쇄상 DNA를 기질 DNA 로서 조제하였다.
[2] Cre 의존 재조합 반응 (No. 1)
[1]에서 조제한 기질 DNA를 사용하고, 실시예 1-(4)에 나타낸 방법으로 Cre 의존 재조합 반응을 행하여 해석하였다. 그 결과를 표 2 (우란)에 나타낸다.
| 서열번호 | 합성DNA번호 | 변이형 loxP 서열-변이형 loxP 서열 | 야생형 loxP 서열-변이형 loxP 서열 | ||
| 중간체(970 bp) | 최종 반응체(920 bp) | 중간체(970 bp) | 최종 반응체(920 bp) | ||
| 1 | 야생형 | 1 | 9 | 1 | 9 |
| 20 | #71 | 1 | 6 | 0 | 1 |
| 26 | #2171 | 3 | 3 | 0 | 0 |
| 27 | #2172 | 4 | 2 | ||
| 28 | #2173 | 6 | 0 | ||
| 29 | #2271 | 2 | 6 | ||
| 30 | #2272 | 1 | 6 | 0 | 0 |
| 31 | #2273 | 3 | 4 | ||
| 32 | #2371 | 3 | 2 | ||
| 33 | #2372 | 2 | 0 | ||
| 34 | #2373 | 6 | 1 | 0 | 0 |
| 35 | #3171 | 4 | 7 | 0 | 0 |
| 36 | #3172 | 0 | 0 | ||
| 37 | #3271 | 3 | 4 | ||
| 38 | #3272 | 6 | 2 | 0 | 0 |
| 39 | #3371 | 5 | 5 | ||
| 40 | #3372 | 6 | 1 | ||
| 41 | #3373 | 6 | 2 | 0 | 0 |
| 42 | #4171 | 0 | 4 | 0 | 0 |
| 43 | #4172 | 2 | 4 | ||
| 44 | #4271 | 4 | 2 | ||
| 45 | #4272 | 4 | 1 | 0 | 0 |
| 46 | #4371 | 4 | 2 | ||
| 47 | #4372 | 3 | 2 | ||
| 48 | #4373 | 7 | 0 | 1 | 0 |
| 49 | #5171 | 0 | 6 | 0 | 0 |
| 50 | #5272 | 1 | 4 | 0 | 0 |
| 51 | #5373 | 1 | 2 | 0 | 0 |
| 52 | #6171 | 0 | 6 | 1 | 1 |
| 53 | #6272 | 1 | 2 | 0 | 0 |
| 54 | #6373 | 1 | 2 | 0 | 0 |
(표 중, 반응의 중간체 및 최종 반응체의 양을 0 ∼ 9 까지의 10 단계로 표시하였다. 숫자가 클수록 생성량이 많다. 2 개의 야생형 loxP 서열 사이에서 반응을 행한 경우의 최종 반응체의 양 (DNA 밴드의 농도)을 최대의 「9」로 하고, DNA의 밴드를 거의 검출할 수 없는 경우 (「9」의 5 % 미만)를 「0」 으로 하였다. 반응 중간체의 상세에 대해서는 실시예 2-(2) 에서의 설명을 참조)
#6171의 변이형 loxP 서열을 사용한 경우에는 최종 반응체 (920 bp)가 일부 관찰되고, 야생형 loxP 서열과의 사이에서 재조합 반응이 생겼다. 그러나, 그 이외의 해석된 변이형 loxP 서열은 야생형 loxP 서열과는 전혀 반응하지 않고, 그 정도는 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 경우보다도 더욱 적었다.
[3] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 갖는 플라스미드의 구축
#2171, #2272, #2373의 변이형 loxP 합성 DNA를 사용하고, 실시예 2-(1)-[2] 및 3-(1)-[1]에 나타낸 방법으로 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 갖는 플라스미드 pBLA 변이체 (8.2 kb, 도 9 참조)를 3 종류 구축하였다.
[4] Cre 의존 재조합 반응 (No. 2)
[3]에서 구축한 플라스미드를 제한효소 NheI으로 절단하고, 실시예 3-(1)-[2]에 나타낸 방법으로 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 갖는 직쇄상의 기질 DNA (8.2 kb)를 조제하였다. 이 기질 DNA를 사용하고, 실시예 3-(2)에서 나타낸 방법으로 Cre 의존 재조합 반응을 행하여 해석하였다. 그 결과, 3 종류의 변이형 loxP 서열 어느 경우에도 반응의 중간체 및 최종 반응체는 거의 생기지 않았다. 즉, 2 염기를 치환한 변이형 loxP 서열은 야생형 loxP 서열과의 재조합 반응을 거의 일으키지 않고, 반응의 특이성은 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 경우보다도 더욱 높아진 것이 나타났다.
(2) 2 개의 동일 서열의 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응
[1] 2 개의 변이형 loxP 서열을 포함하는 기질 DNA의 조제
29 종류의 변이형 loxP 서열 (도 4 및 도 5 참조)에 대하여 실시예 1-(3)에 나타낸 방법으로 직쇄상 DNA의 양단에 동일 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 기질 DNA를 조제하였다. 즉, 상기 변이형 loxP 합성 DNA를 제한효소 NheI 및 SalI으로 동시에 절단한 플라스미드 pBR322에 각각 결찰하고, pBR322 DNA의 양단에 동일 서열의 변이형 loxP 합성 DNA가 결합한 약 4.1 kb의 직쇄상 DNA를 조제하였다.
[2] Cre 의존 재조합 반응 (No. 1)
[1]에서 조제한 기질 DNA를 사용하고, 실시예 1-(4)에 나타낸 방법으로 Cre 의존 재조합 반응을 행하여 해석하였다. 그 결과를 표 2 (좌란)에 나타낸다. #2173 이나 #2372와 같이 전혀 재조합 반응이 일어나지 않는 변이형 loxP 서열도 있었는데, #2271, #2272, #3171, #3371, #4171, #5171, #6171은 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열과 거의 동일 정도, #2171, #2273, #3271, #4172는 1 염기 치환의 변이형 loxP 서열의 반 정도의 효율로 재조합 반응이 일어나고 있는 것을 확인하였다.
[3] 변이형 loxP 서열을 하나 갖는 플라스미드의 구축
#2171, #2272, #2373의 변이형 loxP 합성 DNA를 사용하고, 실시예 2-(1)-[1]에 나타낸 방법으로 플라스미드 pBR322의 NheI 사이트와 EcoNI 사이트 사이에 각각의 변이형 loxP 서열을 하나 삽입한 3 종류의 플라스미드 (pBR2171, pBR2272, pBR2373, 각 4.4 kb, 도 7 참조)를 구축하였다.
[4] 2 개의 동일 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 플라스미드의 구축
[3]에서 구축한 3 종류의 플라스미드 (pBR2171, pBR2272, pBR2373)를 각각 제한효소 SalI으로 절단하고, 플라스미드에 삽입되어 있는 것과 동일 서열의 변이형 loxP 합성 DNA (#2171, #2272, #2373)를 각각 결찰한 후, 실시예 2-(1)-[2] 및 실시예 3-(1)-[1]에 나타낸 방법으로 2 개의 동일 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 3 종류의 플라스미드 (pBLA2171x2, pBLA2272x2, pBLA2373x2, 각 8.2 kb, 도 9 참조)를 구축하였다.
[5] Cre 의존 재조합 반응 (No. 2)
[4]에서 구축한 3 종류의 플라스미드를 제한효소 NheI으로 각각 절단하고, 실시예 3-(1)-[2]에 나타낸 방법으로 2 개의 동일 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 직쇄상의 기질 DNA (8.2 kb)를 조제하였다. 이 기질 DNA를 사용하고, 실시예 3-(2)에서 나타낸 방법으로 Cre 의존 재조합 반응을 행하여 해석하였다. 그 결과, 변이형 loxP 서열 #2272 사이에서의 재조합 반응은 야생형 loxP 서열 사이에서의 재조합 반응과 거의 동일 정도의 매우 높은 효율이었다. 변이형 loxP 서열 #2171은 일부 중간체에서 반응이 멈추지만 최종단계까지 반응은 진행하였다. 한편, 변이형 loxP 서열 #2373은 반응은 거의 중간체에서 멈추고, 최종단계까지 진행하지 않았다.
(3) 다른 서열의 변이형 loxP 서열 사이에서의 Cre 의존 재조합 반응의 검토
[1] 다른 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 플라스미드의 구축
(2)-[3]에서 구축한 플라스미드 pBR2171 및 pBR2272를 각각 제한효소 SalI으로 절단하고, 플라스미드에 삽입되어 있는 변이형 loxP 서열과는 다른 서열의 변이형 loxP 합성 DNA (pBR2171은 #2272 또는 #2373 과, pBR2272는 #2373 과)와 결찰한 후, 실시예 2-(1)-[2] 및 실시예 3-(1)-[1]에 나타낸 방법으로 2 개의 다른 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 3 종류의 플라스미드 (pBLA2171-2272, pBLA2171-2373, pBLA2272-2373, 각 8.2 kb, 도 4 참조)를 구축하였다.
[2] Cre 의존 재조합 반응
[1]에서 구축한 플라스미드를 제한효소 NheI으로 절단하고, 실시예 3-(1)-[2]에 나타낸 방법으로 2 개의 다른 서열의 변이형 loxP 서열을 갖는 직쇄상의 기질 DNA (8.2 kb)를 조제하였다. 이 기질 DNA를 사용하고, 실시예 3-(2)에서 나타낸 방법으로 Cre 의존 재조합 반응을 행하여 해석하였다. 그 결과, 3 종의 다른 서열 (#2171, #2272, #2373)의 변이형 loxP 서열 사이에서는 어느 조합도 Cre 의존 재조합 반응은 전혀 일어나지 않았다. 즉, 각각의 변이형 loxP 서열은 다른 loxP 서열과 교차 반응하지 않는 것이 나타났다.
이상, (1) 내지 (3)의 결과로부터, 2 개의 염기를 동시에 치환한 변이형 loxP 서열은 1 염기만 치환한 변이형 loxP 서열보다 인식특이성이 높아졌다. 즉, 2 개의 염기를 동시에 치환한 변이형 loxP 서열은 야생형 loxP 서열 및 다른 변이형 loxP 서열과는 반응하지 않고, 또한 동일 서열의 변이형 loxP 서열끼리에서는 야생형 loxP 서열끼리와 동일 정도 반응하는 것이 명확하게 나타났다. 또한, 변이부위로서는 loxP 서열의 스페이서 영역의 2 번째, 3 번째, 4 번째, 5 번째 중의 하나의 염기와, 7 번째 염기의 조합이 바람직하고, 또한 동일 염기부위라도 치환하는 염기의 종류에 따라 반응성 및 반응특이성이 다른 것이 나타났다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 목적으로 하는 변이형 loxP 서열로서, 구체적으로는 #2171 (서열번호: 26), #2271 (서열번호: 29), #2272 (서열번호: 30), #3171 (서열번호: 35), #3371 (서열번호: 39), #4171 (서열번호: 42), #5171 (서열번호: 49) 등을 들 수 있다.
실시예 5
야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 삽입된 유전자의 치환에 필요한 플라스미드 및 코스미드 벡터의 구축
(1) 유전자 치환의 표적측의 플라스미드 및 코스미드 벡터의 구축
[1] 2 개의 야생형 loxP 서열 사이에 클론화 부위 (SwaI 사이트)를 갖는 플라스미드 (puLwL)의 구축
플라스미드 pUC119의 제한효소 Ecl136II 사이트에 야생형 loxP 서열이 동방향으로 2 개 삽입된 플라스미드 puLL (카네가에 등, Nucleic acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995))의 2 개의 loxP 서열 사이에 존재하는 클론화 부위를 제한효소 NruI 사이트로부터 SwaI 사이트로 바꾸기 위해 이하의 조작을 행하였다.
puLL을 제한효소 NruI으로 절단하고, SwaI 링커 (5'-pGATTTAAATC-3', 서열번호: 61)를 결찰한 후, 다시 NruI으로 절단하였다. NruI에 의한 재차의 절단은 SwaI 링커가 결합하지 않고 NruI 사이트가 재생한 플라스미드를 제거하기 위해 행하였다. 반응액으로 대장균을 형질전환하고, 2 개의 야생형 loxP 서열 사이에 클론화 부위로서 SwaI 사이트를 갖는 플라스미드 puLwL (3.3 kb, 도 11 중의 A)을 얻었다.
[2] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 클론화 부위 (SwaI 사이트)를 갖는 플라스미드 (puLwM 및 puMwL)의 구축
플라스미드 puLwL의 2 개의 야생형 loxP 서열 중의 하나를 변이형 loxP 서열로 치환한 2 종류의 플라스미드를 구축하기 위해 이하의 (A), (B)의 각 조작을 행하였다. 플라스미드 puLwM (도 11 중의 B)은 동 도면에 나타낸 puLwL의 좌측의 야생형 loxP 서열을, 플라스미드 puMwL (도 11 중의 C)은 우측의 야생형 loxP 서열을 각각 변이형 loxP 서열로 치환한 것이다. 그리고, 여기에서 변이형 loxP 서열로서 야생형 loxP 서열의 스페이서 부분의 2 번째와 7 번째 염기를 동시에 변이시킨 #2171 (서열번호: 26)의 서열을 사용하였다. 이하의 실시예에서의 변이형 loxP 서열이란, 모두 이 서열의 것이다.
(A) puLwM의 구축
puLwL을 제한효소 XhoI으로 절단하고, 변이형 loxP 서열을 포함하는 60 bp의 합성 DNA (도 12, 상측 사슬의 서열번호: 57, 하측 사슬의 서열번호: 58)를 결찰한 후 대장균을 형질전환하고, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 SwaI 사이트를 갖는 플라스미드 puLwM (3.3 kb)을 얻었다. 또한, 이 플라스미드 puLwM의 합성 DNA 부분의 염기서열을 해독하고, 야생형 loxP 서열 및 변이형 loxP 서열이 목적대로 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 그리고, 사용한 합성 DNA는 한쪽의 단은 XhoI 절단단편인데 다른쪽은 SalI 절단단편이 되도록 설계했기 때문에, 플라스미드 puLwM의 야생형 loxP 서열내의 XhoI 사이트는 소멸하고 있다.
(B) puMwL의 구축
puLwL을 제한효소 MluI으로 절단하고, 변이형 loxP 서열을 포함하는 60 bp의 합성 DNA (도 13, 상측 사슬의 서열번호: 59, 하측 사슬의 서열번호: 60)를 결찰한 후 대장균을 형질전환하고, 변이형 loxP 서열과 야생형 loxP 서열 사이에 SwaI 사이트를 갖는 플라스미드 puMwL (3.3 kb)을 얻었다. 또한, 플라스미드 puLwM의 경우와 동일하게, puMwL의 합성 DNA 부분의 염기서열을 해독하여 확인하였다. 그리고, 사용한 합성 DNA는 한쪽의 단은 MluI 절단단편인데 다른쪽은 BssHII 절단단편이 되도록 설계했기 때문에, 플라스미드 puMwL의 야생형 loxP 서열내의 MluI 사이트는 소멸하고 있다.
[3] CAG 프로모터의 클론화 부위에 2 개의 야생형 loxP 서열을 삽입한 플라스미드 (pCALL)의 구축
CAG 프로모터의 프로모터부와 폴리 A 서열 사이에 2 개의 야생형 loxP 서열을 삽입한 플라스미드를 얻기 위해 이하의 두 DNA를 조제하였다. 그리고, 여기에 말하는 CAG 프로모터란, 고발현 벡터로서 일본 공개특허공보 평3-168087 호에 개시되어 있는 것이다.
(a) CAG 프로모터를 포함하는 플라스미드 pCAGGS (Niwa et. al., Gene, Vol.108, 193-200(1991))의 클론화 부위인 EcoRI 사이트를 SwaI 사이트로 바꾼 플라스미드 pCAGw (일본 공개특허공보 평8-84589 호 10 면)를 제한효소 SwaI으로 절단한 DNA.
(b) 플라스미드 puLL ([1]에 기재)을 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 동시에 절단하고, 추가로 Klenow 효소에 의해 양단을 평활화한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수한 2 개의 야생형 loxP 서열을 포함하는 약 100 bp의 DNA 단편.
(a) (b) 두 DNA를 단편을 결찰하고, 제한효소 SwaI 절단한 후 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 pCALL (4.9 kb)을 얻었다.
[4] 플라스미드 pCALL의 클론화 부위를 SwaI 사이트로 바꾼 플라스미드 (pCALwL)의 구축
플라스미드 pCALL의 2 개의 loxP 서열 사이에 존재하는 클론화 부위를 제한효소 NruI 사이트로부터 SwaI 사이트로 바꾸기 위해 이하의 조작을 행하였다.
pCALL을 제한효소 NruI으로 절단하고, SwaI 링커 (5'-pGATTTAAATC-3', 서열번호: 61)를 결찰한 후, 다시 제한효소 NruI으로 절단하였다. NruI에 의한 재차의 절단의 이유는 [1] 과 동일하다. 반응액으로 대장균을 형질전환하고, CAG 프로모터내에 2 개의 야생형 loxP 서열이 존재하고, 또한 그 사이에 클론화 부위로서 SwaI 사이트를 갖는 플라스미드 pCALwL (4.9 kb, 도 14 중의 D)을 얻었다.
[5] CAG 프로모터내에 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열을 삽입한 플라스미드 (pCALwM)의 구축
플라스미드 pCALwL의 야생형 loxP 서열의 하나를 변이형 loxP 서열로 치환한 플라스미드를 얻기 위해 이하의 양 조작을 행하였다.
(a) 플라스미드 pCALwL을 제한효소 MluI 및 XhoI으로 동시에 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 야생형 loxP 서열을 포함하지 않는 약 4.8 kb의 단편을 회수하였다.
(b) 플라스미드 puLwM을 제한효소 MluI 및 XhoI으로 동시 절단한 후 아가로스 겔 전기영동하고, 야생형 및 변이형 loxP 서열을 포함하는 100 bp의 DNA 단편을 회수하였다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰한 후 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 pCALwM (4.9 kb, 도 14 중의 E)을 얻었다. pCALwM은 프로모터/야생형 loxP 서열/SwaI 사이트 (클론화 부위)/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열의 구조를 갖는 플라스미드이다.
[6] 재조합 아데노 바이러스 제작용 코스미드 벡터 (pAxCALwM)의 제작
[5]에서 제작한 플라스미드 pCALwM의 프로모터로부터 폴리 A 서열까지의 부분을 삽입한 코스미드 벡터를 제작하기 위해 이하의 양 조작을 행하였다. 그리고, 코스미드 벡터의 제작은 기존의 방법 (Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996), 및 일본 공개특허공보 평7-298877 호)에 따랐다.
(a) 아데노 바이러스 5 형 E1 및 E3 유전자 이외의 거의 전체길이가 삽입된 카세트 코스미드 pAxcw (일본 공개특허공보 평8-308585 호 15 면)를 제한효소 SwaI으로 절단하였다.
(b) 플라스미드 pCALwM을 제한효소 ApaLI 및 HindIII 및 HincII으로 동시 절단하고, 추가로 Klenow 효소에 의해 양단을 평활화후, 반응액을 아가로스 겔 전기영동하여 약 2.4 kb의 단편을 회수하였다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰한 후, 반응액의 일부를 람다ㆍ인ㆍ비트로ㆍ패키징 키트 (기가팩 XL, Stratagene 사 제조)를 사용하여 패키징 반응을 행하고, 반응액을 대장균에 감염시켜 카세트 코스미드 pAxCALwM (44.9 kb)을 얻었다.
(2) 유전자 치환의 표적측의 플라스미드의 구축
[1] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 lacZ 유전자를 삽입한 플라스미드 (puLZM)의 구축
플라스미드 puLwM ((1)-[2]에 기재)의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 대장균 lacZ 유전자를 삽입한 플라스미드를 얻기 위해 이하의 양 조작을 행하였다.
(a) 플라스미드 puLwM을 제한효소 SwaI으로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 직쇄상의 DNA 단편을 회수하였다.
(b) 플라스미드 pSRlacZ (Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996))를 제한효소 SalI 및 PstI으로 동시에 절단하고, 추가로 Klenow 효소에 의해 양단을 평활화한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 lacZ 유전자를 포함하는 약 3.1 kb의 DNA 단편을 회수하였다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰하고, 제한효소 SwaI 절단한 후 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 puLZM (6.4 kb, 도 15 중의 F)을 얻었다.
[2] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 SV40의 복제 오리진 (ori) 및 폴리 A 서열을 삽입한 플라스미드 (puMOL)의 구축
플라스미드 puMwL의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 SV40의 ori 및 폴리 A 서열 삽입한 플라스미드를 얻기 위해 이하의 양 조작을 행하였다.
(a) 플라스미드 puMwL ((1)-[2]에 기재)을 제한효소 SwaI으로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 직쇄상의 DNA 단편을 회수하였다.
(b) 플라스미드 pCAGGS ((1)-[3]에 기재)를 제한효소 BamHI으로 절단하고, 추가로 Klenow 효소에 의해 양단을 평활화한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 SV40의 ori 및 폴리 A 서열을 포함하는 약 340 bp의 DNA 단편을 회수하였다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰하고, 제한효소 SwaI으로 절단한 후 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 puMOL (3.6 kb, 도 15 중의 G)을 얻었다.
[3] 야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열을 삽입한 플라스미드 (puLZMOL)의 구축
플라스미드 puLZM 으로부터 변이형 loxP 서열을 제거하고, 플라스미드 puMOL의 변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열을 포함하는 단편을 삽입하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
(a) 플라스미드 puLZM을 제한효소 NheI 및 XhoI으로 동시에 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 야생형 loxP 서열과 lacZ 유전자를 포함하는 약 6.4 kb의 DNA 단편을 회수하였다.
(b) 플라스미드 puMOL을 제한효소 NheI 및 XhoI으로 동시에 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열을 포함하는 약 440 bp의 DNA 단편을 회수하였다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰하고, 제한효소 SwaI 절단한 후 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 puLZMOL (6.8 kb, 도 16 중의 H)을 얻었다.
[4] 플라스미드 puLZMOL의 lacZ 유전자의 5' 상류에 티미딘키나아제 유전자의 폴리 A 서열을 삽입한 플라스미드 (puALZMOL)의 구축
단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1)의 티미딘키나아제 (TK) 유전자의 폴리 A 서열을 플라스미드 puLZMOL에 삽입한 플라스미드를 구축하기 위해 다음의 양 조작을 행하였다.
(a) 플라스미드 puLZMOL을 lacZ 유전자의 5' 상류측의 야생형 loxP 서열의 5' 상류에서 1 개소 절단한 DNA 단편을 얻기 위해 이하의 조작을 행하였다. puLZMOL을 제한효소 SmaI으로 절단하고 이어서 제한효소 KpnI으로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 6.8 kb의 직쇄상 DNA 단편을 회수하였다.
(b) 플라스미드 pTK는 HSV-1의 TK 유전자를 포함하는 약 3.6 kb의 BamHI 절단단편이 pBR322의 BamHI 사이트에 삽입된 플라스미드이다 (M.Wigler et. al. Cell, Vol.14, 725-731(1978)). pTK를 제한효소 SmaI 및 NcoI 절단하면, 약 320 bp의 TK 유전자의 폴리 A 서열을 절단할 수 있다. 또한 절단한 DNA 단편의 양단을 SmaI 및 KpnI 사이트로 하기 위해 이하의 조작을 행하였다. 플라스미드 pTK를 제한효소 NcoI으로 절단하고, Klenow 효소에 의해 양단을 평활화하였다. 이어서, KpnI 링커 (5'-pGGGTACCC-3')를 결찰한 후, 제한효소 KpnI으로 절단하였다. 또한, 제한효소 SmaI 절단한 후 아가로스 겔 전기영동을 행하고, TK 유전자의 폴리 A 서열을 포함하는 약 320 bp의 DNA 단편을 회수하였다.
(a) (b)에서 조제한 두 DNA를 결찰한 후, 대장균을 형질전환하여 플라스미드 puALZMOL (7.1 kb, 도 16 중의 I)을 얻었다. puALZMOL은 TK 유전자의 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열의 구조를 갖는 플라스미드이다. 그리고, 이 과정에서 TK 유전자의 폴리 A 서열을 삽입한 것은 이들 일련의 유전자를 갖는 재조합 아데노 바이러스를 제작한 경우, 삽입부위의 상류에 있는 미동정의 아데노 바이러스 유래의 프로모터로부터 lacZ 유전자의 전사가 일어나지 않도록 하기 위해서이다.
[5] 재조합 아데노 바이러스 제작용 코스미드 벡터 (pAxALZMOL)의 제작
플라스미드 puALZMOL의 삽입 유전자 (TK 유전자의 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열)를 삽입한 코스미드 벡터를 제작하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
플라스미드 puALZMOL을 제한효소 XbaI 및 XhoI 및 DraI으로 동시 절단하고, 추가로 Klenow 효소에 의해 양단을 평활화후, 반응액을 아가로스 겔 전기영동하여 약 4.5 kb의 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편과 제한효소 SwaI으로 절단한 카세트 코스미드 pAxcw ((1)-[6]에서 조제)를 결찰하고, 제한효소 SwaI으로 절단한 후, 반응액의 일부를 람다ㆍ인ㆍ비트로ㆍ패키징 키트 (기가팩 XL, Stratagene 사 제조)를 사용하여 패키징 반응을 행하고, 반응액을 대장균에 감염시켜 카세트 코스미드 pAxALZMOL (46.7 kb)을 얻었다.
실시예 6
유전자 치환에 필요한 재조합 아데노 바이러스의 제작
(1) 유전자 치환의 표적용 재조합 아데노 바이러스 (AxCALwM)의 제작
비증식형 아데노 바이러스 벡터 (E1 및 E3 유전자를 결실)의 E1 유전자 결실부위에 프로모터/야생형 loxP 서열/SwaI 사이트 (클론화 부위)/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열을 삽입한 재조합 아데노 바이러스를 제작하기 위해 이하의 조작을 행하였다. 그리고, 재조합 아데노 바이러스의 제작은 기존의 방법 (Miyake et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996), 및 일본 공개특허공보 평7-298877 호)에 따랐다.
E3 유전자를 결실한 인간 아데노 바이러스 5 형 유래주인 Ad5-dlX (I.Saito et al., J.Virol., Vol.54, 711-719(1985))의 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체를 제한효소 EcoT22I으로 절단하였다. 이 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체와, 실시예 5-(1)-[6]에서 제작한 코스미드 벡터 pAxCALwM을 사용하여 인산칼슘 공침법으로 293 세포를 형질전환하였다. 생긴 재조합 아데노 바이러스의 클로닝 및 바이러스의 선별을 행하고, 목적하는 재조합 바이러스 AxCALwM (도 17)을 얻었다. 이 재조합 바이러스를 계대(繼代)하고, 고역가의 4 차 바이러스액 또는 5 차 바이러스액을 CsCl 초원심법으로 정제 (Y.Kanegae et al., Jpn.J.Med.Sci.Biol., Vol.47, 157-166(1994)) 한 바이러스액을 이후의 실험에 사용하였다.
(2) 유전자 치환의 공여용 재조합 아데노 바이러스 (AxALZMOL)의 제작
비증식형 아데노 바이러스 벡터 (E1 및 E3 유전자를 결실)의 E1 유전자 결실부위에 TK 유전자의 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열을 삽입한 재조합 아데노 바이러스를 제작하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
제한효소 EcoT22I 절단한 Ad5-dlX의 바이러스 DNA-말단 단백질 복합체와, 실시예 5-(2)-[5]에서 제작한 코스미드 벡터 pAxALZMOL을 인산칼슘 공침법으로 293 세포를 형질전환하고, (1) 과 동일한 방법으로 목적하는 재조합 바이러스 AxALZMOL (도 17)을 얻었다. 이 재조합 바이러스도 4 차 바이러스액 또는 5 차 바이러스액을 CsCl 초원심법으로 정제한 바이러스액을 이후의 실험에 사용하였다.
실시예 7
세포의 염색체상에 존재하는 유전자의 치환에 사용하는 세포주의 제작
(1) 하이그로마이신 B 내성 유전자를 발현하는 유전자 치환용 세포주의 제작
[1] 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 클론화 부위를 갖는 리포터 유전자 삽입용 플라스미드 (pCALwMds)의 구축
실시예 5-(1)-[5]에서 제작한 플라스미드 pCALwM (도 14 중의 E)은 플라스미드 pCAGGS (실시예 5-(1)-[3]에 기재)의 CAG 프로모터내의 클론화 부위인 EcoRI 사이트에 야생형 loxP 서열/클론화 부위 (SwaI 사이트)/변이형 loxP 서열을 삽입한 플라스미드이다. 이 pCALwM 으로부터, SV40의 ori 및 폴리 A 서열을 제거할 목적에서 이하의 조작을 행하였다.
pCALwM을 BamHI으로 절단하여 SV40의 ori 및 폴리 A 서열을 제거하고, 이어서 자기결찰 후 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pCALwMds (4.6 kb, 도 18 중의 A)를 얻었다.
[2] 하이그로마이신 B 내성 유전자를 삽입한 플라스미드 (pCALhmBMds)의 구축
플라스미드 pCALwMds의 SwaI 사이트에 하이그로마이신 B 내성 유전자를 삽입한 플라스미드를 구축하기 위해 이하의 두 DNA를 조제하였다.
(a) 플라스미드 pCALwMds를 제한효소 SwaI으로 절단한 DNA 단편.
(b) 플라스미드 pCHD2L (Ikeda et al., Gene, Vol.71, 19-27(1988))을 제한효소 SmaI 및 DraI으로 동시에 절단한 후, 아가로스 전기영동에 의해 회수한 하이그로마이신 B 내성 유전자를 포함하는 약 1.1 kb의 DNA 단편.
(a) (b) 두 DNA를 결찰한 후 대장균을 형질전환하고, 플라스미드 pCALhmBMds (5.7 kb, 도 18 중의 B)를 얻었다. pCALhmBMds는 하이그로마이신 B 내성 유전자가 CAG 프로모터내의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 삽입된 플라스미드이다.
[3] 하이그로마이신 B 내성 유전자를 발현하는 형질전환 세포주의 제작
세포의 염색체상에 프로모터/야생형 loxP 서열/하이그로마이신 B 내성 유전자/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열의 외래 DNA를 1 카피 갖는 형질전환 세포주를 얻기 위해 이하의 조작을 행하였다. 그리고, 세포의 형질전환은 Chen-Okayama 법에 의한 인산칼슘-DNA 공침전법으로 행하였다.
(ⅰ) [2]에서 조제한 플라스미드 pCALhmBMds 20 ㎍을 최종농도 250 mM의 염화칼슘 용액에 용해 (액량 100 ㎕) 하고, 100 ㎕의 2 ×BBS 용액 (50 mM N,N-비스[2-히드록시에틸]-2-아미노에탄 술폰산/280 mM NaCl2/1.5 mM Na2HPO4 (pH 6.95))을 첨가한 후, 5 % FCS 첨가 DMEM 배지에서 배양한 6 ㎝ 샬레의 CV-1 세포에 첨가하고, 3 % CO2 존재하 35 ℃에서 약 24 시간 배양하였다.
(ⅱ) 배양액을 제거하고, PBS(-)로 세포를 세정후, 10 % FCS 첨가 DMEM 배지를 첨가하고, 5 % CO2 존재하 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다.
(ⅲ) 6 ㎝ 샬레로부터 세포를 떼어 96 웰 플레이트로 옮겨, 추가로 하룻밤 배양후, 배양액에 최종농도 0.4 ㎎/ml의 하이그로마이신 B를 포함하는 배지를 첨가하고, 추가로 배양을 계속하여 3 내지 4 일 간격으로 하이그로마이신 B를 포함하는 배지를 교환하였다.
(ⅳ) 약 3 주후에 생존하고 있는 세포 (하이그로마이신 B 내성 세포주)를 클론화하고, 확대배양후 세포의 게놈 DNA를 추출하였다. 형질전환에 사용한 플라스미드 pCALhmBMds 에는 인식부위가 존재하지 않는 제한효소 PvuII 로, 이 게놈 DNA를 절단한 후 전기영동하고, 플라스미드 pCALhmBMd의 전체길이를 프로브로 사용하여 서던블롯을 행하고, 세포의 염색체상에 목적하는 유전자가 1 카피만 삽입된 형질전환세포를 18 주 얻었다. 그리고, 목적하는 유전자가 1 카피만 삽입되어 있는 것은 플라스미드 pCALhmBMd에 인식부위가 1 개소만 존재하는 제한효소 EcoRI으로, 세포의 게놈 DNA를 절단한 후 행한 서던블롯에서도 확인하였다.
(2) 블레오마이신 내성 유전자를 발현하는 유전자 치환용 세포주의 제작
[1] 블레오마이신 내성 유전자를 삽입한 플라스미드 (pCALGFBMds)의 구축
플라스미드 pCALwMds의 SwaI 사이트에 블레오마이신 내성 유전자를 삽입한 플라스미드를 구축하기 위해 이하의 조작을 행하였다.
플라스미드 pTracer-CMV (Invitogen 사 제조)를 제한효소 PmaCI으로 절단한 후 아가로스 전기영동을 행하고, 녹색 형광단백질 (green fluorescent protein: GFP) 과 블레오마이신 내성 유전자의 융합 단백질의 유전자를 포함하는 약 1.1 kb의 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편과 제한효소 SwaI으로 절단한 플라스미드 pCALwMds ((1)-[2]에서 조제)를 결찰하고, 제한효소 SwaI으로 절단한 후 대장균을 형질전환하여 플라스미드 pCALGFBMds (5.7 kb, 도 18 중의 C)를 얻었다. pCALGFBMds는 GFP와 블레오마이신 내성 유전자와의 융합 단백질의 유전자가 CAG 프로모터내의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 삽입된 플라스미드이다.
[2] 블레오마이신 내성 유전자를 발현하는 형질전환 세포주의 제작.
세포의 염색체상에 프로모터/야생형 loxP 서열/GFP와 블레오마이신 내성 유전자의 융합 단백질의 유전자/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열의 외래 DNA를 1 카피 갖는 형질전환 세포주를 얻기 위해 이하의 조작을 행하였다.
기본적으로는, (1)-[3]에서 나타낸 하이그로마이신 B 내성 세포주의 제작방법과 동일하므로, 이하에 상이점만 나타낸다. CV-1 세포의 형질전환은 [2]에서 제작한 플라스미드 pCALGFBMds를 사용하였다. 형질전환 세포주의 선택약제는 블레오마이신 (최종농도 0.4 ㎎/ml)을 사용하였다. 목적하는 유전자가 1 카피만 삽입된 형질전환세포를 선택하기 위한 서던블롯은 pCALGFBMds의 전체길이를 프로브로 사용하여 행하였다.
얻어진 블레오마이신 내성 세포주 (모두 목적하는 유전자가 1 카피만 삽입)를 삽입 유전자의 발현의 강약에 따라 분류하기 위해 GFP의 발현량을 측정하였다. GFP의 발현량은 478 ㎚의 여기광(勵起光)에 의해 발광한 507 ㎚의 형광을 관측함으로써 행하고, GFP의 발현이 강한 세포주 (C18, C35), 중정도의 세포주 (C29, C38), 약한 세포주 (C19, C30)로 분류되었다 (숫자는 세포주의 번호).
실시예 8
아데노 바이러스 게놈상에 존재하는 유전자의 치환
야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열의 조합에 의해 플라스미드 DNA (환상 DNA) 상에 존재하는 lacZ 유전자를 아데노 바이러스 게놈상에 치환할 수 있는 것을 실증하기 위해 이하의 실험을 행하였다. 본 실험의 원리는 다음과 같다 (도 17). 실시예 6에서 제작한 공여용 재조합 아데노 바이러스 AxALZMOL은 TK 유전자의 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열이 삽입되어 있다. 이 바이러스와 실시예 1에서 나타낸 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 AxCANCre를 배양세포에 동시 감염하면, 2 개의 야생형 loxP 서열 사이에서 특이적 재조합 반응이 일어나고, TK 유전자의 폴리 A 서열/야생형 loxP 서열을 갖는 아데노 바이러스 (a) 와, 야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/SV40의 ori 및 폴리 A 서열의 구조를 갖는 환상 DNA (b)가 생긴다. 2 개의 야생형 loxP 서열을 삽입한 재조합 아데노 바이러스와 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스를 사용한 이 반응의 효율은 매우 높고 (카네가에 등, Nucleic acids Res., Vol.23, 3816-3821(1995)), 거의 100 %의 배양세포에서 아데노 바이러스 (a)와 환상 DNA (b)가 생성되는 것이 예측된다. 환상 DNA (b)는 SV40 ori의 프로모터를 갖는데, 그 전사는 직후의 SV40 폴리 A 서열에 의해 차단되므로, lacZ 유전자는 발현하지 않는다. 이 환상 DNA (b)가 생성된 세포에 추가로 실시예 6에서 제작한 표적용 재조합 아데노 바이러스 AxCALwM을 감염시키면, 환상 DNA (b)와 AxCALwM 사이에서 재조합 반응이 일어나고, 야생형 loxP 서열 및 변이형 loxP 서열을 각 2 개 갖는 중간체를 거쳐 프로모터/야생형 loxP 서열/lacZ 유전자/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열의 구조를 갖는 아데노 바이러스 (c)가 생성된다. 아데노 바이러스 (c)에서는 lacZ 유전자가 발현하고, lacZ 유전자에 코드되는 β-갈락토시다아제가 생산되며, 이하에 나타내는 염색조작에 의해 세포는 파랗게 염색된다.
실제의 실험에서는 공여용 재조합 아데노 바이러스 AxALZMOL, Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 AxCANCre, 표적용 재조합 아데노 바이러스 AxCALwM의 3 종류의 바이러스를 동시에 배양세포 (CV-1 세포 또는 COS-1 세포)에 감염시켰다. 각각의 바이러스의 moi (중복감염도)는 다음과 같다. 표적용 재조합 아데노 바이러스 : moi=9, Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 : moi=5 또는 15, 공여용 재조합 아데노 바이러스 : moi=10, 30, 60, 100, 200. 1 시간의 바이러스 감염후, 배지를 첨가하여 배양하였다. 3 일후, 배양액을 제거하고 PBS(-)로 세포면을 세정후, 0.25 % 글루타르알데히드액을 첨가하여 4 ℃에서 10 분간 세포를 고정한 후, 다시 PBS(-) 세정하고, X-Gal 염색액 (5 mM 페리시안화 칼륨/5 mM 페로시안화 칼륨/2 mM 염화마그네슘/1 ㎎/ml X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-D-갈락토시드)/PBS(-))을 첨가하여 하룻밤 염색하였다. 그 결과를 도 19에 나타낸다.
도 19는 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스를 moi=15에서 CV-1 세포에 감염시킨 경우의 결과이다. 공여용 재조합 아데노 바이러스의 moi=60 에서는 약 60 %, moi=100 에서는 약 90 %의 세포가 파랗게 염색되었다. 또 도 19 에는 나타내고 있지 않지만, 공여용 재조합 아데노 바이러스만, 및 공여용 재조합 아데노 바이러스와 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스를 동시에 감염시켜도 파랗게 염색되는 세포는 전혀 존재하지 않았다. 또한, Cre 발현 재조합 아데노 바이러스를 moi=5에서 감염시킨 경우, 및 COS-1 세포를 사용하여 동일 실험을 행한 경우도 도 19와 거의 동일한 결과였다.
이상의 결과는 공여용 재조합 아데노 바이러스의 게놈상에 존재하는 lacZ 유전자가 표적용 재조합 아데노 바이러스의 게놈상에 삽입되고, lacZ 유전자가 프로모터와 직결하여 β-갈락토시다아제가 발현한 결과, 세포가 파랗게 염색된 것을 나타낸다. 즉, 공여용 재조합 아데노 바이러스의 게놈상의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 존재하는 lacZ 유전자가 환상 DNA의 형태를 통해 표적용 재조합 아데노 바이러스의 게놈상의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 매우 높은 효율로 치환된 것을 명확하게 증거짓는 것이다.
실시예 9
세포의 염색체상에 존재하는 유전자의 치환
실시예 8에서는 환상 DNA 상에 존재하는 유전자를 아데노 바이러스의 게놈으로 치환할 수 있는 것을 나타냈는데, 세포의 염색체상의 유전자도 치환할 수 있는 것을 실증하기 위해 이하의 실험을 행하였다. 그 원리는 실시예 8 과 동일한데, 표적용 재조합 아데노 바이러스 대신에, 실시예 7에서 제작한 프로모터/야생형 loxP 서열/하이그로마이신 B 내성 유전자/변이형 loxP 서열/폴리 A 서열의 DNA가 염색체상에 1 카피 삽입된 형질전환 세포주(표적 세포)를 사용하였다 (도 20).
실시예 7에서 제작한 하이그로마이신 B 내성의 임의의 6 주의 표적 세포 (C3, C7, C8, C11, C19, C28)에 각각 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스 AxCANCre를 moi=5 에서, 공여용 재조합 아데노 바이러스 AxALZMOL을 moi=10, 30, 100, 300에서 동시에 1 시간 감염시키고, 배지를 첨가하여 배양하였다. 3 일후에, 실시예 8 과 완전히 동일한 조작을 행하여 β-갈락토시다아제가 발현한 세포를 염색하였다. 결과를 도 21에 나타낸다. 세포주에 따라 빈도는 다른데, 공여용 재조합 아데노 바이러스를 moi=100에서 감염한 경우, 10 % (C19) 내지 30 % (C8)의 세포가 파랗게 염색되었다. 공여용 재조합 아데노 바이러스를 moi=300에서 감염하면, 파랗게 염색된 세포의 비율은 더욱 늘었는데, 대량의 아데노 바이러스 입자에 의한 세포독성이 관찰되었다. 또 도면에는 나타내고 있지 않지만, 공여용 재조합 아데노 바이러스만을 moi=100에서 감염하여 Cre 발현 재조합 아데노 바이러스가 존재하지 않는 경우에는 파랗게 염색된 세포는 전혀 존재하지 않았다.
이상의 결과는 공여용 재조합 아데노 바이러스의 게놈상의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 존재하는 lacZ 유전자가 환상 DNA의 형태를 통해 표적 세포의 염색체상의 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 높은 효율로 치환된 것을 명확하게 증거짓는 것이다.
본 발명에 의해 리콤비나아제 Cre의 존재하, 야생형 loxP 서열과는 재조합 반응이 일어나지 않고, 또한 동일 서열의 2 개의 변이형 loxP 서열에서의 재조합 반응은 2 개의 야생형 loxP 서열 사이와 동일 정도의 효율로 일어나는 변이형 loxP 서열이 제공된다. 또한 본 발명에 의해 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열, 또는 다른 서열의 변이형 loxP 서열의 조합에 의해 동물세포를 시작으로 하는 고등진핵세포에서 효율이 높은 유전자 삽입 또는 유전자 치환을 행하는 방법이 제공된다.
서열표 프리 텍스트
서열번호:1의 염기서열은 야생형 loxP 서열이다.
서열번호:2 ∼ 54의 염기서열은 변이형 loxP 서열이다.
서열번호:55의 염기서열은 야생형 loxP 서열과 제한효소 인식부위를 포함하도록 디자인된 서열의 센스사슬이다.
서열번호:56의 염기서열은 야생형 loxP 서열과 제한효소 인식부위를 포함하도록 디자인된 서열의 안티센스사슬이다.
서열번호:57의 염기서열은 변이형 loxP 서열과 제한효소 인식부위를 포함하도록 디자인된 서열의 센스사슬이다.
서열번호:58의 염기서열은 변이형 loxP 서열과 제한효소 인식부위를 포함하도록 디자인된 서열의 안티센스사슬이다.
서열번호:59의 염기서열은 변이형 loxP 서열과 제한효소 인식부위를 포함하도록 디자인된 서열의 센스사슬이다.
서열번호:60의 염기서열은 변이형 loxP 서열과 제한효소 인식부위를 포함하도록 디자인된 서열의 안티센스사슬이다.
서열번호:61의 염기서열은 SwaI 링커이다.
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- 이하의 성질을 갖는 변이형 loxP 서열 :(a) 대장균 P1 파지 유래의 하기 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G), 4 번째 (T) 또는 5 번째 (A) 염기 중 1 개 이상의 염기 및 6 번째 (T) 또는 7 번째 (G) 염기 중 적어도 한쪽의 염기가 다른 염기로 치환되고, 스페이서 영역 이외의 영역은 임의의 염기로 치환되어 있어도 되는 서열로 이루어지고,(b) 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 야생형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않고,(c) 리콤비나아제 Cre의 존재하, 동일한 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어남.
- 이하의 성질을 갖는 변이형 loxP 서열 :(a) 대장균 P1 파지 유래의 하기 야생형 loxP 서열에서, 중앙부의 8 염기 (스페이서 영역)의 2 번째 (T), 3 번째 (G) 및 4 번째 (T) 염기에서 선택되는 1 개의 염기가 다른 염기로 치환되고, 스페이서 영역 이외의 영역은 임의의 염기로 치환되어 있어도 되는 서열로 이루어지고,(b) 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 야생형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않고,(c) 리콤비나아제 Cre의 존재하, 동일한 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어남.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 리콤비나아제 Cre의 존재하에서도 다른 서열을 갖는 또 하나의 변이형 loxP 서열과의 사이에서 특이적 DNA 재조합 반응이 일어나지 않는 변이형 loxP 서열.
- 제 1 항에 있어서, 서열번호: 26, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 35, 서열번호: 39, 서열번호: 42 및 서열번호: 49 로 나타나는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 변이형 loxP 서열.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 변이형 loxP 서열을 갖는 DNA.
- 야생형 loxP 서열, 및 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 변이형 loxP 서열을 포함하는 DNA.
- 제 6 항에 있어서, 야생형 loxP 서열과 변이형 loxP 서열 사이에 원하는 유전자가 삽입된 DNA.
- 서로 다른 서열을 갖는 2 개의 제 3 항에 기재된 변이형 loxP 서열을 포함하는 DNA.
- 제 8 항에 있어서, 서로 다른 서열을 갖는 2 개의 변이형 loxP 서열 사이에 원하는 유전자가 삽입된 DNA.
- 제 6 항에 기재된 DNA에 의해 형질전환된 세포.
- 하기 DNA (a) 및 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키고, 하기 DNA (c)를 얻는 것으로 이루어지는 유전자 치환방법;(a) 야생형 loxP 서열, 유전자 A 및 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 변이형 loxP 서열을 이 순서로 갖는 DNA,(b) 야생형 loxP 서열, 유전자 B 및 DNA (a)와 동일한 변이형 loxP 서열을 이 순서로 갖는 환상 DNA,(c) DNA (a)에서 유전자 A가 유전자 B로 치환된 DNA,여기에서, 유전자 A 및 유전자 B는 서로 다른 임의의 유전자임.
- 하기 DNA (a) 및 DNA (b)를 리콤비나아제 Cre의 존재하에 반응시키고, 하기 DAN (c)를 얻는 것으로 이루어지는 유전자 치환방법;(a) 서로 다른 서열을 갖는 2 개의 제 3 항에 기재된 변이형 loxP 서열 (변이형 loxP 서열 1 및 변이형 loxP 서열 2) 및 유전자 A를 변이형 loxP 서열 1/유전자 A/변이형 loxP 서열 2의 순서로 갖는 DNA,(b) 변이형 loxP 서열 1, 유전자 B 및 변이형 loxP 서열 2를 이 순서로 갖는 환상 DNA,(c) DNA (a)에서 유전자 A가 유전자 B로 치환된 DNA,여기에서, 유전자 A 및 유전자 B는 서로 다른 임의의 유전자임.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 유전자 B가 비기능적인 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 유전자 A가 비기능적인 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, DNA (a)가 세포의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 플라스미드 DNA 또는 이본쇄 환상 DNA 바이러스의 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, DNA (a)가 세포의 염색체 DNA이고, DNA (b)가 세포내에서 변환됨으로써 이본쇄 환상 DNA가 되는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, DNA (a)가 이본쇄 DNA 바이러스의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 플라스미드 DNA 또는 이본쇄 환상 DNA 바이러스의 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, DNA (a)가 이본쇄 DNA 바이러스의 염색체 DNA 이고, DNA (b)가 세포내에서 변환됨으로써 이본쇄 환상 DNA가 되는 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, DNA (a)의 이본쇄 DNA 바이러스가 아데노 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 기재된 DNA를 염색체상에 갖는 트랜스제닉 동물.
- 삭제
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