JP2003501082A

JP2003501082A - ハイブリッド酵母−細菌クローニング系およびその使用

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Publication number: JP2003501082A
Application number: JP2001502565A
Authority: JP
Inventors: マイケルメンデズ，; ミッシェルファイナー，
Original assignee: セルジェネシスインコーポレイテッド
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2003-01-14
Also published as: US7083971B1; WO2000075299A1; EP1100884A1; AU5597200A; CA2336590A1

Abstract

(57)【要約】大きい核酸のクローニング、操作および送達のための組換えアプローチならびに組換え系を開示する。相同組換えに依存して、大きい核酸セグメントの単離、操作および送達を媒介するベクターを開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、種々の遺伝子工学目的（遺伝子治療を含む）のための、大きい核酸
の捕捉、クローニング、操作および送達に関する。本発明はさらに、新規な組換
えクローニングベクターおよびクローニング系、ならびにその使用方法に関する
。

【０００２】（発明の背景）クローニングベクターは、種々の細胞プロセスおよびその基礎をなす生化学的
経路を、理解および操作するために重要である。このような理解は、科学的知識
を豊富にし、そして新しい発見を導く助けとなる。最終的に、このような発見は
、価値ある研究ツールならびに効果的な治療組成物および治療的処置の発展を導
き得る。

【０００３】短い配列の操作可能な多くのベクターとは全く対照的に、大きい核酸配列（例
えば、ゲノム全体）の遺伝子解析、遺伝子工学および遺伝子送達のためのツール
としてのクローニングベクターは、ほとんど開発されていない。複雑な配列のク
ローニングおよび操作は、連結反応の効率に悪影響を及ぼす挿入物の長さに起因
して、特別に困難であった。また、独特な制限部位の少なさが、大きい核酸の調
製をさらに制限する。

【０００４】今日までの、大きい核酸配列の分析および操作のために最適化されたこれらの
系は、このような配列の標的細胞への送達に効果的でない。大きい配列の送達に
ために最適化された系もまた、核酸の分析／操作に効率的ではなかった。例えば
、外来遺伝子を含有するウイルスベクターを調製するために、Ｓｔｒａｔｆｏｒ
ｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−
６３０，１９９２）は、哺乳動物パッケージング細胞株において組換えウイルス
を生成するための相同組換えの使用を教示する。

【０００５】広く使用されるウイルスベクターの中で、レンチウイルスは増殖させることが
困難であり得、そして比較的小さい（約９ｋｂ）。従って、このようなベクター
は、増殖困難性および制限された長さの挿入物の受容能力に苦難する（Ｗｉｖｅ
ｌら（１９９８）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．
１２（３）：４８３−５０１）。制限された挿入物サイズは、調節配列の付加を
おそらく妨げる、さらなる弱点を有する。

【０００６】同様に、ＡＡＶベースのベクターは、比較的小さいサイズ（約４．５ｋｂ）の
ために、最大の挿入物サイズが非常に制限される（Ｆｌｏｔｔｅら（１９９５）
ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２（６）：３５７−３６２）。

【０００７】アデノウイルスベースのベクターは、増殖の容易さ、高レベルの導入遺伝子（
ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）発現、宿主ゲノム中の組み込みの欠損（これは、変異の危
険性を低下する）、およびより長い挿入物（約３５ｋｂ）を保持する能力を含む
、いくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｈａｒｄｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７１（３）：１８４２−１８４９）。

【０００８】組換えアデノウイルスを開発するいくつかの努力は、３つの異なるアプローチ
を使用し、これらは、哺乳動物細胞、酵母細胞または細菌細胞のいずれかにおけ
る相同組換えに依存する。

【０００９】哺乳動物細胞における相同組換えは、最も広範に適用される。Ｍｉｔｔａｌら
（ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ２８：６７−９０，１９９３）は、スプリッ
ト欠損ゲノムを含む２つのプラスミドの、この欠損アデノウイルスをレスキュー
し得る相補パッケージング細胞株への同時トランスフェクションを教示する。

【００１０】しかし、上記のように、哺乳動物細胞における相同組換えは、希少な事象であ
る。従って、哺乳動物細胞の使用は、非効率的であり得る。この哺乳動物細胞ア
プローチはまた、繰り返しの複数回のプラーク精製、ならびに複雑かつ時間のか
かるウイルス生成プロトコルを必要とする。さらに、アデノウイルス配列の末端
以外のベクターの領域における特異的変異の導入は、非常に退屈なものであるの
で、この組換えベクターにおける複数の変異の操作および回収は、実質的に不可
能である。

【００１１】Ｋｅｔｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：６１８６−
６１９０，１９９４）は、酵母ベースの系を教示し、ここで、全長アデノウイル
スゲノムは感染性の酵母人工染色体としてクローン化され、そして維持される。
この系は、このベクター内の任意の配列を改変するため、および必要な場合に複
数の挿入物を導入するために、酵母における高い相同組換え効率に依存した。し
かし、この組換えベクターの低い形成効率およびこの組換えベクターの酵母細胞
からの低い収率は、ビリオンをレスキューする能力を極度に制限し、従って、ト
ランスフェクションを非常に困難なものにする。

【００１２】この酵母ベースの系の制限を克服するための試みは、Ｃｈａｒｔｉｅｒら（Ｖ
ｉｒｏｌ．７０：４８０５−４８１０，１９９６）、Ｃｒｏｕｚｅｔら（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１４１４−１４１９，１９９７）およ
びＨｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：２５０９−２５１４
，１９９８）に細菌系の開発を促した。細菌系は、より高い組換え効率の利点を
提供し、従って、より効率的である。

【００１３】しかし、これらの系は、組換えクローンを同定するために、大きな、煩雑なス
クリーニングプロセスを必要とする。他の考慮すべき制限は、複数の変異挿入物
を操作することができないことおよび各々の特定の細菌系に高度に特異的な細菌
シャトルベクターを必要とすることである。

【００１４】従って、汎用性の組換えベクターおよび既存のアプローチの欠点を克服し得る
方法の、未だ満たされていない必要性が残存する。このようなベクターおよび方
法は、分裂細胞および非分裂細胞の両方の広い標的範囲、および高レベルの導入
遺伝子発現を可能にするべきである。理想的には、このような系は、宿主ゲノム
中の組み込みの危険性を最小化しながら、高い組換え効率を有する。この必要性
に応じるために、このような系は、広範なスクリーニングプロトコルの必要性を
最小化しながら、大きい配列および複数の変異挿入物の操作を可能にするべきで
ある。このようなベクターはまた、容易に増殖され、そしてインビトロまたはイ
ンビボでのこのような組換え核酸の哺乳動物細胞への直接的な送達のために、十
分な量の回収を可能にするべきである。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、標的細胞への大きい核酸の捕捉、クローニング、操作、生成および
送達に対する、汎用的な組換えアプローチを提供する。本発明は、組換えクロー
ニング系を提供する。より詳細には、本発明は、相同組換え技術に依存する、細
胞またはウイルスへの大きい核酸セグメントの単離、操作および送達を媒介する
ためのベクターを提供する。本発明はまた、大きい核酸をクローン化、操作およ
び送達するために、このような組換えクローニングベクターを使用するための方
法を提供する。さらに、本発明は、トランスジェニック植物およびトランスジェ
ニック動物の研究の促進因子として、ならびに植物および動物の遺伝子工学アプ
ローチ（例えば、遺伝子治療およびワクチン適用のような）のために、このよう
な組換えクローニング系を使用するための方法を提供する。

【００１６】第１の局面において、本発明は、以下を含む組換えクローニング系を提供する
：（ａ）第１の選択マーカーおよび第１の環化エレメントを含む、第１のアーム
；ならびに（ｂ）第２の選択マーカーおよび第２の環化エレメントを含む、第２
のアーム。少なくとも１つのアームはまた、複製起点を含む。本発明の別の好ま
しい実施態様において、各々のアームはまた、希少な制限エンドヌクレアーゼ認
識部位を含む。本発明のさらに別の好ましい実施態様において、各アームはポリ
リンカーを含む。第１の環化エレメントは、第１のＬｏｘＰ部位を含む核酸配列
であり得、そして第２の環化エレメントは、第２のＬｏｘＰ部位を含む核酸配列
であり得る。

【００１７】１つの好ましい実施態様において、本発明は、以下を含む組換えクローニング
系を提供する：（ａ）第１の選択マーカー、第１の環化エレメントおよび標的核
酸の５’末端配列に相同な第１の核酸を含む、第１のアーム；ならびに（ｂ）第
２の選択マーカー、第２の環化エレメントおよび標的核酸の３’末端配列に相同
な第２の核酸を含む、第２のアーム。

【００１８】本発明はまた、本発明に従う組換えクローニング系および標的核酸を含む組成
物を提供する。本発明の１つの実施態様において、標的核酸は、真核生物核酸で
ある。本発明の１つの実施態様において、標的核酸は、哺乳動物核酸である。好
ましい実施態様において、標的核酸は、ヒト核酸である。別の好ましい実施態様
において、標的核酸は、ウイルス核酸である。

【００１９】１つの実施態様において、目的のエレメントの全ては、単一の分子（例えば、
環状物、プラスミドまたはエピソームを含む）に含まれる。従って、別の局面に
おいて、本発明は、酵母選択マーカー、細菌選択マーカー、テロメア、セントロ
メア、酵母複製起点、細菌複製起点および希少な制限エンドヌクレアーゼ認識部
位を含む、組換えクローニングベクターを提供する。本発明の１つの実施態様に
おいて、ベクターは、少なくとも１つの独特のクローニング部位を含む。好まし
い実施態様において、ベクターはポリリンカーを含む。本明細書中で明らかにさ
れるように、このベクターは、従来の遺伝子工学方法によって容易に操作され、
標的核酸に隣接する核酸に相同な核酸の導入を促進する。従って、１つの実施態
様において、本発明は、標的核酸の５’末端に相同な第１の核酸；および標的核
酸の３’末端に相同な第２の核酸を含む、クローニングベクターを提供する。

【００２０】別の局面において、本発明は、標的核酸を含むギャップを埋めた（ｇａｐ−ｆ
ｉｌｌｅｄ）ベクターを生成する方法を提供する。この方法において、標的核酸
、標的核酸の５’末端に相同な第１の核酸、第１の選択マーカーおよび第１の環
化エレメントを含む第１のアーム、ならびに標的核酸の３’末端に相同な第２の
核酸、第２の選択マーカーおよび第２の環化エレメントを含む第２のアームが、
相同組換えを可能にする条件下で接触される。本発明のこの局面に従う方法は、
この２つのアームと標的核酸との間での相同組換えによって、ギャップを埋めた
ベクターを生成する。本発明のこの局面に従う１つの実施態様において、少なく
とも１つのアームは、複製起点をさらに含む。本発明の別の好ましい実施態様に
おいて、各アームは、希少な制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに含む。本
発明のさらに好ましい実施態様において、第１の環化エレメントは、第１のＬｏ
ｘＰ部位を有する核酸であり、そして第２の環化エレメントは、第２のＬｏｘＰ
部位を有する核酸である。

【００２１】１つの好ましい実施態様において、相同組換えは、インビトロで行われる。こ
の局面の特に好ましい実施態様において、相同組換えは、インビボで行われる。
より好ましい実施態様において、相同組換えは、酵母細胞において生じる。１つ
の好ましい実施態様において、相同組換えは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅまたはＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｕｓｔｉｌｌａｇｏにおいて生じる。

【００２２】別の局面において、本発明は、本発明に従う組換えクローニング系または組換
えクローニングベクターを保持する、真核生物宿主細胞を提供する。１つの実施
態様において、真核生物宿主細胞は、酵母細胞である。本発明の１つの好ましい
実施態様において、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｕｓｔｉｌｌａｇｏである。

【００２３】なお別の局面において、本発明は、本発明のギャップを埋めたアームを環化す
る方法を提供する。本発明の１つの実施態様において、ギャップを埋めたベクタ
ーを、第１のＬｏｘＰ部位および第２のＬｏｘＰ部位とＣｒｅとを接触させるこ
とによって環化し、それによって、部位特異的組換えによる環化されたギャップ
を埋めたベクターを産生する。好ましい実施態様において、ギャップを埋めたベ
クターは、細菌内で環化される。別の好ましい実施態様において、ギャップを埋
めたベクターが、インビトロにおいて環化される。本発明は、本発明のその局面
の環化されたギャップを埋めたベクターを含む細菌細胞を、さらに提供する。

【００２４】さらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む組換え送達ユニットを生
成する方法を提供する：（ａ）標的核酸を含むギャップを埋めたベクターの産生
工程；および（ｂ）送達ユニット内へのギャップを埋めたベクターの導入工程。
本発明の１つの実施態様において、送達ユニットはウイルスである。従って、ギ
ャップを埋めたベクターの導入は、工程（ａ）のベクターを、相補する哺乳動物
細胞に導入することによって生じ、複製欠損ウイルスベクターを生成する。この
ベクターは、送達ユニット内への導入前に、直鎖状であっても、環状であっても
よい。

【００２５】さらなる局面において、本発明は、新規の組換えクローニング系、および所定
のウイルスまたは哺乳動物細胞型における特定の核酸の役割を調査するのに有用
な方法を提供する。本発明に適切なこのベクターおよび方法は、本発明の前述の
局面について考察されるものと、実質的に同一である。

【００２６】他の局面において、本発明は、核酸のクローニング、操作および送達のために
有用な、組換えクローニング系およびその系を使用する方法を提供する。本発明
のいくつかの実施態様において、このベクターおよび方法が、インビトロおよび
インビボの両方での遺伝子移入、ならびにインビボのワクチン接種および他の遺
伝子治療適用を含む治療または診断の目的のために使用される。他の好ましい実
施態様において、本発明のベクターおよび方法が、ウイルス、植物、細菌、線虫
、魚、ハエ、哺乳動物、ならびに動物の分子遺伝子操作のために使用される。従
って、いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、機能的ゲノム学的（ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ）アプローチを介して同定された遺伝子の標的確認のため、およ
び任意の所定のゲノム位置に挿入される哺乳動物遺伝子のライブラリーの構築の
ための、ツールおよび方法を提供する。

【００２７】（発明の詳細な説明）本発明は、大きな核酸の操作および送達に関する。本発明はさらに、組換えク
ローニングベクターおよび組換えクローニング系、ならびにこれらの使用方法に
関する。

【００２８】広範な関連性のない細胞型および細胞周期段階において機能し得る（従って、
異なる系の利点を組み合わせる、強力な操作ツールおよび方法を提供する）汎用
性のあるクローニング系が、開発され得たことを認識することは、予測しない発
見であった。本発明のハイブリッドクローニング系および方法は、所定の核酸の
捕獲および操作のための系としての汎用性の高い酵母と、そのような核酸の増幅
のための高効率の細菌の系とを組み合わせる。大きな核酸フラグメントの単離、
操作、および送達を媒介する、相同組換えに依存する組換えベクターを構築した
。本明細書において記載される本発明はまた、大きな核酸を、クローニング、操
作および送達すすためのそのような組換えクローニングベクターを使用するため
の方法を提供する。最後に、本発明は、トランスジェニックな植物および動物の
研究の増強因子として、および遺伝子治療アプローチのための、ならびに植物お
よび動物の遺伝子操作アプローチのための、そのような組換えクローニング系を
使用する方法を提供する。

【００２９】本明細書において使用される技術用語および科学用語は、そうでないと定義さ
れない限り、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有す
る。当業者に公知の種々の資料および方法論に対して、本明細書において参照が
なされる。組換えＤＮＡ技術の一般原則を示す標準的な参考の研究としては、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ、
１９８９；Ｋａｕｆｍａｎら編、「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄＭｅｄｉｃｉｎｅ」、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、１９９
５；およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、「ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ、１９９１が挙げられる。本発明の選択された局面のために有用な一般
的な方法論および酵母遺伝学の方法論を教示する標準的な参照文献としては；Ｓ
ｈｅｒｍａｎら、「ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌＭｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８６およびＧｕｔｈｒｉｅら、「Ｇｕｉｄｅｔｏ
ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９１が挙げられる。

【００３０】当業者に公知の任意の適切な材料および/または方法が、本発明を実行するに
おいて利用され得る。本発明を実行するための材料および/または方法が記載さ
れる。以下の記載および実施例において言及がなされる材料、試薬などは、他に
注記しない限り、商業的供給原から入手可能である以下の記載においては、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術において用いられる多
数の通常用いられる用語が利用される。

【００３１】本明細書において一般的に理解され、そして用いられる場合、「単離した核酸
分子」、「単離した核酸」または「単離した核酸配列」は、ヌクレオチドの重合
体をいい、そしてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む
がそれらに限定されない。

【００３２】「組換えＤＮＡ」は、異なる供給源由来のものを含むＤＮＡセグメントを、組
換えＤＮＡ技術（すなわち、分子遺伝的操作）を用いて、連結することにより形
成される任意のＤＮＡ分子である。

【００３３】本明細書において一般的に理解され、そして用いられる場合、「ＤＮＡセグメ
ント」は、ヌクレオチドの直線ストレッチを含む分子をいい、ここでこのヌクレ
オチドは、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはポリペプチドと呼ばれる
アミノ酸残基の直線配列を含む分子を、遺伝子コードを通じてコードし得る配列
に存在する。

【００３４】「遺伝子」は、単一のポリペプチド鎖またはタンパク質をコードするＤＮＡで
あり、そして本明細書において用いる場合、５’および３’非翻訳末端を含み得
る。このポリペプチドは、このタンパク質の機能的活性が保持される限り、コー
ド配列の全長配列または任意の部分によりコードされ得る。

【００３５】「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の
逆転写により合成される組換え核酸分子である。

【００３６】「構造遺伝子」は、ｍＲＮＡに転写されるＤＮＡである。次いで、ｍＲＮＡは
、特定のポリペプチドのアミノ酸特性の重合体に翻訳される。

【００３７】「制限エンドヌクレアーゼ」（または「制限酵素」）は、核酸分子中の塩基の
特定の配列（通常、４、５または６塩基対の長さ）を認識し、そしてそこかまた
は近位で核酸を切断する能力を有する酵素である。例えば、ＥｃｏＲＩは、配列
ＧＡＡＴＴＣ／ＣＴＴＡＡＧを認識する。

【００３８】「希な制限エンドヌクレアーゼ認識部位」は、核酸において頻繁には乗じない
部位である。希な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の非限定的な例としては、酵
素Ｉ−ＳｃｅＩおよびＮｏｔＩにより認識される核酸が挙げられる。ところが、
ゲノムにおいて共通である配列を認識する制限エンドヌクレアーゼは、広範囲の
ＤＮＡフラグメントが、希な切断物を生じるために、ゲノムＤＮＡが同じもので
消化され、そしてアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色により
大きさに提示される場合、「スメア」を生じる。なぜなら認識部位がゲノム中で
共通でなく、同じ条件下でＤＮＡフラグメントの別個のバンドを生じるからであ
る。

【００３９】「制限フラグメント」は、制限エンドヌクレアーゼでの消化により生成される
ＤＮＡ分子である。所定のゲノムまたは核酸分子は、特定の制限エンドヌクレア
ーゼにより、制限フラグメントのセットに消化され得る。

【００４０】サザーンハイブリダイゼーション手順は、特定のＤＮＡを可視化することを意
味する。標識したＤＮＡ分子またはプローブは、固体基質（例えば、ニトロセル
ロースフィルター）に結合する断片化した一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズされる
。標識したＤＮＡプローブに対して相補的なＤＮＡを保有するフィルター上の領
域は、再アニーリング反応の結果として、それ自体により標識される。このよう
な標識を示すフィルターの領域が可視化される。ハイブリダイゼーションプロー
ブは、一般に、特定のＤＮＡフラグメントの分子クローニングにより産生される
。

【００４１】「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」または「オリゴマー」は、２つ以上のデ
オキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子である。正確な大
きさは、多くの因子に依存し、次には、オリゴヌクレオチドの最終的な機能また
は用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、合成的にかまたはクローニングによ
り誘導され得る。

【００４２】「プライマー」は、標的の近位またはそこでアニーリングし得るオリゴヌクレ
オチドである。このプライマーは一般に、一本鎖核酸であり、そしてしばしば、
核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が開始される条件下におかれた
場合、ＤＮＡ合成の起点として働く。

【００４３】「発現」は、構造遺伝子がポリペプチドを生成するプロセスである。これは、
遺伝子のｍＲＮＡへの転写を含み、そしてこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへ
の翻訳もまた含み得る。

【００４４】「ベクター」は、核酸を運搬するビヒクルである。ベクターは、核酸分子キャ
リアであり、ここで目的の核酸がビヒクル核酸の組み込み部分としてそれに挿入
される。ベクターはしばしば、特定の機能、例えば、マルチクローニング部位、
複製起点、選択マーカーなどを供給する有益な核酸を含む。

【００４５】「クローニングベクター」は、単一分子の一部としてベクターに含まれる目的
の核酸を保有するのに適切な核酸である。クローニングベクターは、さらなる操
作および増幅のために目的の核酸分子を捕獲するように働き得る。

【００４６】「発現ベクター」は、クローニングベクターに類似のベクターまたはビヒクル
であるが、これは、宿主への形質転換後、発現ベクター中にクローニングされた
核酸を発現し得る。クローニングした核酸は通常、特定の制御の制御のもと（す
なわち、作動可能に連結される）か、または調節核酸（例えば、プロモーター配
列）のもとに置かれる。発現制御配列は、発現が生じる条件（例えば、ベクター
が原核生物宿主または真核生物宿主において作動可能に連結された遺伝子を発現
するように設計されているか否か）に依存して変化する。このベクターはさらに
、エンハンサーエレメント、終止配列および組織特異性エレメントのような転写
エレメント、ならびに翻訳開始部位および翻訳終止部位を含み得る。

【００４７】配列（タンパク質または核酸のいずれか）の「機能的誘導体」は、誘導体が作
製される親タンパク質または親核酸の生物学的活性に実質的に類似する生物学的
活性（機能的または構造的のいずれか）を有する分子である。タンパク質の機能
的誘導体は、翻訳後修飾（例えば、共有結合された炭水化物）を含み得、これは
、特定の機能を果たすためのそのような修飾の必要性に依存する。用語「機能的
誘導体」は、分子の「フラグメント」、「セグメント」、「改変体」、「アナロ
グ」または「化学的誘導体」を含むことが意図される。

【００４８】本明細書中で使用される場合、分子は、通常には別の分子の一部ではないさら
なる化学部分が含まれる場合に、その別の分子の「化学的誘導体」であるといわ
れる。例えば、そのような部分は、分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを
改善し得る。あるいは、部分は、分子の毒性を低減し得、分子の任意の所望され
ない副作用などを除去または減弱し得る。そのような効果を媒介し得る部分は、
「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
」（１９８０）に開示される。そのような部分の分子へのカップリング手順は、
当該分野において周知である。

【００４９】タンパク質または核酸の「改変体」は、その親タンパク質または親核酸のいず
れかに対して、構造および生物学的活性が実質的に類似する分子をいうことが意
図される。従って、その用語が本明細書中で使用される場合、２つの分子が共通
の活性を有し、そして互いに置換し得るならば、たとえそれらの分子のうちの一
方の組成または二次構造、三次構造もしくは四次構造が他方において見られるも
のと同一ではないとしても、あるいはアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が同
一ではないとしても、その２つは改変体であると考えられる。

【００５０】「変異」は、遺伝物質における任意の検出可能な変化であり、この変化は、娘
細胞、そしておそらく変異細胞または変異個体を生じる後の世代にさえ遺伝され
得る。変異細胞の子孫が多細胞生物において体細胞のみを生じる場合、細胞の変
異スポットまたは変異領域は、固体培養物において生じる。有性生殖生物の生殖
細胞系における変異は、配偶子によって次世代に遺伝され、おそらく体細胞およ
び生殖細胞の両方において新しい変異状態を有する個体を生じ得る。変異は、１
つ以上のデオキシリボヌクレオチドの化学的構成もしくは物理学的構成、易変性
、複製、表現型機能または組換えに影響を及ぼす、検出可能な非天然の変化のい
ずれか（またはそれらの組合せ）であり得；ヌクレオチドは、付加、欠失、置換
、逆位、または新しい位置に転位（逆位ありおよび逆位なし）され得る。変異は
、自発的に生じ得、そして変異原の適用によって実験的に誘導され得る。核酸分
子の変異改変体は変異から生じる。変異ポリペプチドは、変異核酸分子から生じ
得る。

【００５１】「ポリリンカー」は、公知のベクターまたはプラスミドに、制限認識部位（マ
ッピングおよびクローニングするために使用され得る）を導入する、構築された
ＤＮＡである。ポリリンカーはまた、「マルチクローニング部位」として同定さ
れる。

【００５２】「精製された」タンパク質または核酸は、細胞性成分から分離された、タンパ
ク質または核酸である。精製されたタンパク質または核酸は、天然において見ら
れないレベルの純度にまで単離されている。「単離された」は、天然において見
られないあるレベルの精製を示すことが意図される。

【００５３】本発明は、新規のクローニング系を提供し、この系は（ａ）順に、第１の選択
マーカーおよび第１の環化エレメントを含む第１のアーム；ならびに（ｂ）第２
の選択マーカーおよび第２の環化エレメントを含む第２のアーム、を含む。アー
ムのうちの１つはまた、複製起点を含み得る。

【００５４】本明細書中で使用する用語「アーム」は、酵母宿主および細菌宿主において複
製し得る部分を生成するために必要な、第１のアームおよび第２のアームまたは
左アームおよび右アームとしても示される２つのアームのうちの一方を示す。本
発明によるアームは、好ましくは酵母中でアセンブリする。このことは、遺伝子
操作が、高度に汎用性のある酵母系においてもたらされるのを可能にする。酵母
ベクターは、文献に広く記載されており、酵母ベクターの操作方法もまた、本明
細書中以後で議論されるように周知である（例えば、Ｋｅｔｎｅｒら（１９９４
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：６１８６〜６１９
０を参照のこと）。

【００５５】遺伝子操作の後、このクローニング系は、より大量の核酸を調製するために適
切な細菌環境への移行を可能にする。細菌型ベクターの代表的な例としては、Ｐ
１人工染色体、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）および単一コピープラスミドＦ因子
が挙げられる（Ｓｈｉｚｕｙａら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．８９：８７９４〜８７９７）。同様に、細菌ベクターは当該分野におい
て周知である（例えば、Ｉｏａｎｎｏｕら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ６：８４
〜８９）。

【００５６】本発明はまた、酵母選択マーカー；細菌選択マーカー；テロメア；セントロメ
ア；酵母複製起点；細菌複製起点；および稀な制限エンドヌクレアーゼ認識部位
を一分子中に含む組換えベクター（例えば、プラスミドまたはエピソーム）を提
供する。

【００５７】目的の組換えベクターは、目的の標的核酸を目的のベクター中へ捕捉および組
み込むための、酵母における相同組換えを可能にする。目的の標的核酸は、大き
な核酸であり得、そして例えば、その中に目的の外来遺伝子を含んでいるベクタ
ー（例えば、ウイルスベクター）を含み得る。ウイルスベクターにおける目的の
外来遺伝子は、その転写された産物、およびおそらくその転写産物の翻訳産物が
、しばしば目的の宿主（例えば、ヒト）において利益を有する外来遺伝子である
。従って、目的の発明は、目的の治療遺伝子を含むウイルスベクターのクローニ
ングおよび調製を可能にする。

【００５８】本発明によるベクターは、酵母においてテロメアとして機能する適切に配向さ
れたＤＮＡおよびセントロメアを含む。任意の適切なテロメアが使用され得る。
適切なテロメアは、酵母においてテロメア機能を提供し得る多くの生物由来のテ
ロメア反復を含むがこれらに限定されない。ヒトにおける末端反復配列（ＴＴＡ
ＧＧＧ）_Nは、トリパノソーマにおける末端反復配列と同一であり、そして酵母
における末端反復配列（（ＴＧ）₁〜₃）_Nおよびテトラヒメナにおける末端反復
配列（ＴＴＧＧＧ）_Nと類似する（ＳｚｏｓｔａｋおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ（
１９８２）Ｃｅｌｌ２９：２４５−２５５；Ｂｒｏｗｎ（１９８８）ＥＭＢＯ
Ｊ．７：２３７７−２３８５；ならびにＭｏｙｚｉｓら（１９８８）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：６６２２−６６２６）。

【００５９】用語「セントロメア」は、本明細書中で、本発明のベクターの減数分裂および
有糸分裂での安定な複製および正確な分配を媒介し、それによって、娘細胞への
適切な分離を確実にする核酸を同定するために用いられる。適切なセントロメア
は、大きな直鎖状プラスミドに有糸分裂安定性および減数分裂安定性を付与する
酵母のセントロメアＣＥＷ４を含むがこれに限定されない（Ｍｕｒｒａｙおよび
Ｓｚｏｓｔａｋ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ３０５：１８９−１９３；Ｃａｒｂ
ｏｎ（１９８４）Ｃｅｌｌ３７：３５１−３５３；ならびにＣｌａｒｋら（１
９９０）Ｎａｔｕｒｅ２８７：５０４−５０９）。

【００６０】本発明による２つのアームの少なくとも１つまたは環状ベクターは、選り抜き
の宿主細胞／粒子において機能する、少なくとも１つの複製系を含む。本明細書
中以後明らかになるように、当業者は、選り抜きの標的核酸の操作、増幅および
／または送達が、１より多くの宿主細胞／粒子の使用を必要とし得ることを理解
する。従って、選り抜きの各々の宿主細胞／粒子において機能的な１より多くの
複製系が含まれ得る。

【００６１】宿主細胞のうちの１つが哺乳動物宿主細胞である場合、複製系は、哺乳動物細
胞において複製することが公知のウイルス（例えば、ＳＶ４０、エプスタイン−
バー、レトロウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス
、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、ｈｃＭＶなど）由来の複製
系を含む。宿主細胞が原核生物（特にＥ．ｃｏｌｉ）である場合、複製系は、原
核生物（例えば、Ｐ１プラスミドレプリコン、ｏｒｉ、Ｐ１溶解性レプリコン、
ＣｏｌＥ１、ＢＡＣ、単一コピー性プラスミドＦ因子など）において機能的であ
る複製系を含む。

【００６２】本発明の好ましい実施態様では、１または両方のいずれかのアームおよび環状
ベクターはさらに、大きな核酸の複製を支持し得る、酵母複製起点を含む。本発
明による複製領域の好ましい非限定的な例は、自律複製配列、すなわち「ＡＲＳ
エレメント」を含む。ＡＲＳエレメントは、高頻度形質転換を付与する酵母配列
として同定された。テトラヒメナＤＮＡ末端は、酵母におけるＡＲＳエレメント
としてＡＲＳ１およびＡＲＳＨ４とともに用いられた（Ｋｉｓｓら（１９８１）
Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１：５３５−５４３；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（
１９７９）Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９；ならびにＢａｒｔｏｎおよびＳｍｉｔ
ｈ（１９８６）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６：２３５４）。本発明の好まし
い実施態様では、アームの各対（左アームおよび右アーム）について、２以上の
複製起点が存在し得る。後者は、非常に長いＤＮＡ配列が導入されたベクターに
ついての好ましい実施態様であることが見出された。

【００６３】本発明の局面による第１および／または第２のアームは、環状化されたベクタ
ー形態（例えば、プラスミド形態）において連結され得る。環状化は、インビボ
またはインビトロで目的のアームを用いて生じ得る。あるいは、目的の環状ベク
ターが用いられ得る。本明細書中で用いられ、そして本明細書中上記で、手短に
部分的に説明されるように、用語「ベクター」は、プラスミドもしくはファージ
のＤＮＡ、またはＤＮＡもしくは他の核酸がクローニングされ得る他の核酸を示
す。このベクターは、宿主細胞において自律複製し得、そしてこのような核酸が
決定可能な様式で切断され得、そして核酸フラグメントが挿入され得る、１また
は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によってさらに特徴付けられ得る。こ
のベクターはさらに、このベクターで形質転換された細胞の同定に適切な選択マ
ーカーを含み得る。

【００６４】用語「選択マーカー」は、本明細書中で、ネガティブおよび／またはポジティ
ブ方法論によって、ベクターを含む組換え宿主細胞の検出および／または選択を
可能にする配列を同定するために用いられる。このようなネガティブまたはポジ
ティブな選択マーカーは、挿入された遺伝子または核酸であり得る。当業者は、
適切な選択マーカーの選択は、用いられる宿主細胞、ウイルスまたは他の実体の
遺伝子型に依存することを認識する。従って、（以下により詳細に記載される）
細菌におけるアームおよびベクターの選択は、細菌性選択マーカーを使用して達
成され得る。細菌選択マーカーの好ましい非限定的な例としては、例えば、その
細胞に有効な影響を有し得る（例えば、その細胞に対して細胞傷害性である）因
子に対して細胞を感受性または耐性にする遺伝子が挙げられる。従って、公知の
選択遺伝子としては、種々の抗生物質に対して耐性を付与する選択遺伝子（例え
ば、ＡＭＰ（アンピシリン）、ＴＥＴ（テトラサイクリン）およびＫＡＮ（カナ
マイシン）マーカー）が挙げられる。

【００６５】同様に、酵母におけるベクターの選択は、酵母選択マーカーの使用により達成
され得る。例としては、公知のＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２および
ＡＤＥマーカーが挙げられる。本発明のいくつかの実施態様では、ベクターまた
はアームは、２以上の選択マーカーを含み得る。従って、１つの実施態様では、
アームは、標的核酸との相同組換えで失われるＡＤＥマーカー、およびＨＩＳ３
マーカーを含み得る。他のアームは、ＴＲＰＩマーカーを含み得る。選択は、形
質転換された細胞を、適切なドロップアウト選択培地（例えば、Ｗａｔｓｏｎら
（１９９２）ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ、第２版，Ｆｒｅｅｍａｎａｎ
ｄＣｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照のこと）で増殖させる
ことによって達成される。例えば、ＨＩＳ３は、第１のアームを含む細胞の選択
を可能にする。ＴＲＰ１は、第２のアームを含む細胞の選択を可能にする。ＡＤ
Ｅは、相同組換えが起きたクローンのスクリーニングおよび選択を可能にする。
ＡＤＥは、色選択（赤）を可能にする。

【００６６】用語「環化エレメント」は、組換えベクターへの目的のアームの環化を促進し
得る核酸を示すために用いられる。当業者は、適切な環化エレメントとしては、
組換え事象を促進する種々の公知の反復配列が挙げられることを認識する。それ
ゆえ、環化エレメントの代表例としては、縦列反復（例えば、Ａｌｕ配列（Ｇａ
ｒｚａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：６４１−６４６）など）が挙げ
られる。別の環化エレメントは、Ｃｒｅレコンビナーゼと接触して所定の部位で
部位特異的組換え事象を生じる、ＬｏｘＰ部位間での相互作用を含む。環化エレ
メントとして適切なＬｏｘ部位の非限定的な代表例は、米国特許第５，６５８，
７７２号に記載される。別の実施態様では、環化エレメントは、ＦＬＰ媒介組換
えに従う。本発明による環化エレメントとして適切なＦＬＰ配列およびＦＬＰレ
コンビナーゼの非限定的な代表例は、米国特許第５，６７７，１７７号に記載さ
れる。

【００６７】クローニングを促進するために、各アームはまた、稀な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を含むべきである。「稀な制限エンドヌクレアーゼ認識部位」は、核
酸において頻繁には現れない、制限エンドヌクレアーゼ酵素の基質である。稀な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位の非限定的な例としては、Ｉ−ＳｃｅＩおよび
ＮｏｔＩによって認識される制限エンドヌクレアーゼ認識部位が挙げられる。

【００６８】本発明のなお別の好ましい実施態様では、各アームは、ポリリンカーを含む。

【００６９】さらに、本発明は、アームまたは環状ベクターの両方がまた、目的の標的核酸
の５’末端配列および３’末端配列に相同な核酸を含む、クローニング系を提供
する。

【００７０】用語「相同」は、本明細書中で使用される場合、一本鎖にされたかまたは一本
鎖である標的核酸（例えば、遺伝子、転写制御エレメントまたは遺伝子内ＤＮＡ
）の一部にハイブリダイズする能力を有するに十分な直鎖状同一性または類似性
であることを意味する。このようなハイブリダイゼーションは通常、好ましくは
ワトソン−クリック塩基対を形成する、相補鎖間の塩基特異的水素結合の結果で
ある。実際問題として、このような相同性は、相同組換え事象の観察から推論さ
れ得る。好ましくは、このような相同性は、約８塩基〜約１０００塩基、そして
最も好ましくは約１２塩基〜約５００塩基の直鎖状核酸である。当業者は、相同
性が、より長い核酸ストレッチに及び得ることを認識する。

【００７１】「標的配列」、「目的の外来遺伝子」、「導入遺伝子」および「挿入物」は、
本発明によるクローニングおよび発現系またはベクターにおいて挿入されること
が求められる任意の配列または核酸を言及するために用いられる。

【００７２】本発明の標的核酸は、複雑にかなり変動し得る。標的核酸は、ウイルス性、原
核生物性または真核生物性のＤＮＡ、より具体的には哺乳動物ＤＮＡ（例えば、
ｃＤＮＡ）、より具体的にはエキソン（コード）配列ならびにイントロン（非コ
ード）配列の両方を含み得る。それゆえ、本発明の標的核酸は、１以上の遺伝子
を含み得る。好ましい実施態様では、標的核酸は、染色体である。標的核酸また
は、任意の起源および／または性質の核酸であり得る。従って、標的核酸は、原
核生物または真核生物の核酸であり得る。標的核酸はまた、ＤＮＡウイルス（例
えば、アデノウイルス、ヒトヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ポッ
クスウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイ
ン−バーウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または単純ヘルペスウイルス
）またはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、
ヒト免疫不全ウイルス、マウス白血病ウイルスまたはアルファウイルス））を含
むウイルスであり得る。

【００７３】本発明のベクターは、構築物の調製、増幅、宿主細胞の形質転換またはトラン
スフェクション、および（該当する場合）宿主細胞への組み込みにおいて用途を
見出し得る、標的配列以外の機能的実体を含むようにさらに改変され得る。

【００７４】本発明の１つの実施態様では、標的核酸は、調節核酸を含む。「調節配列」ま
たは「調節核酸」は、本明細書中で、それによって制御される核酸の複製、転写
および／または発現を（直接的または間接的のいずれかで、そして上方または下
方のいずれかに）調節する、任意の配列または核酸を示すために広範な意味で用
いられる。このような調節核酸による制御は、核酸を構成的または誘導的に転写
および／または翻訳されるようにし得る。調節核酸の例としては、転写プロモー
ターおよびエンハンサーが挙げられるがこれらに限定されない。従って、本発明
のアームおよびベクターは、転写調節領域（例えば、転写開始領域など）を含み
得る。当業者は、多数の転写開始配列（チミジンキナーゼプロモーター、β−ア
クチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターを含
む）が単離されており、そして利用可能であることを認識する。

【００７５】本発明はまた、ギャップを埋めたベクターを生成する方法を提供する。ベクタ
ーは、標的核酸の５’領域および３’領域に相同な配列の間の領域（ギャップ）
を埋めることにより、本発明による標的核酸の相同組換えおよび挿入の際に「ギ
ャップを埋めた」と規定される。それゆえ、本発明のクローニング系を、相同組
換えを可能にする条件下で標的核酸と接触させる。好ましい実施態様では、この
方法は、以下を相同組換えを可能にする条件下で合わせる：（ｉ）標的核酸の５
’末端に相同な第１の核酸、第１の選択マーカーおよび第１の環化エレメントを
含む第１のアーム；（ｉｉ）標的核酸；ならびに（ｉｉｉ）標的核酸の３’末端
に相同な第２の核酸、第２の選択マーカーおよび第２の環化エレメントを含む第
２のアーム。本発明のこの局面による方法は、２つのアームと標的核酸との間で
の相同組換えによってギャップを埋めたベクターを生じる。このアームおよび標
的核酸において見出される相同領域間での交換は、相同な核酸間での任意の点で
の相同組換えによってもたらされる。

【００７６】目的の環状ベクターに関して、「ギャップを埋めること」は、本質的に、その
ベクターへの標的配列の挿入、すなわち、サブクローニングである。

【００７７】好ましい実施態様では、相同組換えは、当該分野で周知の方法論によってイン
ビトロでもたらされ得る。例えば、本発明の方法は、酵母溶解産物調製物を用い
て実施され得る。別の好ましい実施態様では、相同組換えはインビボで起きる。
それゆえ、本発明の方法は、相同組換え事象を支持し得る任意の宿主細胞（例え
ば、細菌、酵母および哺乳動物の細胞など）を用いて実施され得る。当業者は、
適切な宿主の選択は、この方法のクローニング系において用いられる選択マーカ
ーの特定の組み合わせに依存することを認識する。

【００７８】目的の宿主細胞へとベクターを導入するために用いられ得る技術としては、リ
ン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、細菌−プロトプラスト
融合、核へのＤＮＡのマイクロインジェクションなどが挙げられる。ＤＮＡは、
一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、弛緩またはスーパーコイルであり得る。
当業者は、多数のプロトコルが、例えばＫｅｏｗｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１８５：５２７−５３７，１９９０）において記載されるような哺乳動物細
胞をトランスフェクトするために実質的に交換可能に用いられ得ることを認識す
る。好ましくは、真核生物細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅまたはＳ．ｕｓｔｉｌｌａ
ｇｏ））が用いられる。酵母細胞中に核酸を導入するための方法は当該分野で周
知である。それゆえ、このような工程は、従来の形質転換方法論によって達成さ
れ得る。適切な方法論の非限定的な例としては、エレクトロポレーション、アル
カリカチオンプロトコルおよびスフェロプラスト細胞の形質転換が挙げられる。

【００７９】組換え酵母細胞は、当該分野で周知の方法に従って、本明細書中に記載される
選択マーカーを用いて選択され得る。それゆえ、当業者は、本発明のギャップを
埋めたベクターを保有する組換え酵母細胞が、その中に含まれる選択マーカーに
基づいて選択され得ることを認識する。それゆえ、ＨＩＳ３およびＴＲＰＩを保
有する組換えベクターは、形質転換酵母細胞を、ｈｉｓおよびｔｒｐを欠くドロ
ップアウト選択培地の存在下で増殖させることにより選択され得る。単離された
ポジティブクローンは、さらに精製され、そして例えば、制限分析、電気泳動、
サザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応などによって分析されて、本発明の
組換えベクターの存在および構造が確認され得る。

【００８０】本発明はさらに、本発明の方法に従って操作された、ギャップを埋めたベクタ
ーを提供する。このようなベクターは、本発明のアームまたはベクターと、選り
抜きの標的核酸との間の相同組換えの産物である。

【００８１】本発明はまた、本発明によるクローニング系またはベクターを保有する、原核
生物細胞および真核生物宿主細胞を提供する。１つの実施態様では、真核生物宿
主細胞は酵母細胞である。本発明の好ましい実施態様では、酵母細胞は、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅまたはＳ．ｕｓ
ｔｉｌｌａｇｏである。適切な細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓである。

【００８２】別の局面では、本発明は、本発明のギャップを埋めたアームを環化する方法を
提供する。ギャップを埋めたベクターは、その中に含まれる第１および第２のＬ
ｏｘ部位とＣｒｅとを接触させ、それにより、部位特異的組換えによって環化し
たギャップを埋めたベクターを生成することにより環化され得る。ギャップを埋
めたベクターは、細菌において環化され得る。本発明はさらに、本発明の環化し
たギャップを埋めたベクターを含む細菌細胞を提供する。

【００８３】本発明はさらに、大きな標的核酸を細胞または粒子（例えば、ウイルスなど）
中にクローニング、操作および送達するための方法を提供する。本発明によれば
、ウイルスクローニング系は、標的配列を含むように操作され、そして本明細書
中以後で提供される例から明らかになるように、高い効率でクローニングされた
標的核酸内の任意の核酸を遺伝的に改変するために、酵母の高い相同組換え率を
使用することが可能である非感染性誘導体化クローンとして維持される。

【００８４】ギャップを埋めた直鎖状ベクターは、インビトロまたはインビボで、例えば、
細菌中で環状ベクターへと変換され得る。目的の環状ベクターは、増幅、精製、
切断および使用されて、細胞に直接的にまたは標的細胞へのその後の送達のため
に適切な送達系に導入されるに十分な量のＤＮＡが回収され得る。この方法論は
、任意の大きなウイルス性または非ウイルス性ゲノムをクローニングおよび改変
するに大きな多用途性を提供し、そして組換えベクターとしてのその使用を容易
に促進する。

【００８５】細胞への、ギャップを埋めたベクターの直接送達は、当該分野で周知の方法（
例えば、リン酸カルシウム形質転換方法論またはエレクトロポレーションなど）
によってもたらされ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。

【００８６】従って、本発明は、以下の工程を包含する組換え送達ユニットを生成するため
の方法を提供する：（ａ）標的配列を含むギャップを埋めたベクターを生成する
工程；（ｂ）必要に応じて、本発明のギャップを埋めたベクターアームを環化す
る工程；（ｃ）このベクターを増殖させる工程；および（ｄ）このギャップを埋
めたベクターを送達ユニットに導入する工程。本発明の１つの実施態様では、こ
の送達ユニットは、ウイルスである。それゆえ、ギャップを埋めたベクターの導
入は、このベクターを補完哺乳動物細胞に導入して、複製欠損ウイルスベクター
を生成することによりもたらされる。ギャップを埋めたベクターが、増幅されそ
して送達ユニットに配置される前に環化または線状化され得ることが認識される
。

【００８７】従って、本発明はまた、以下の工程を包含する組換え送達ユニットを生成する
方法を提供する：（ａ）標的配列を含むギャップを埋めたベクターを生成する工
程；（ｂ）ギャップを埋めたベクターアームを必要に応じて環化する工程；（ｃ
）このベクターを増殖させる工程；（ｄ）このギャップを埋めたベクターを線状
化する工程；および（ｅ）このギャップを埋めたベクターを送達ユニットに導入
する工程。本発明の１つの実施態様では、送達ユニットはウイルスである。それ
ゆえ、線状化されたギャップを埋めたベクターの導入は、このベクターを補完哺
乳動物細胞に導入して、複製欠損ウイルスベクターを生成することによりもたら
される。当業者は、このベクターが線状化されるか否かは、操作される配列と相
関することを認識する。

【００８８】用語「送達ユニット」とは、本発明のギャップを埋めたベクター（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）に会合し得、そして特定の器官、組織または個体の細胞型へのインビ
ボまたはエキソビボでのこのようなベクターＤＮＡまたはベクターＲＮＡの輸送
を媒介し得る任意の実体を意味する。送達ユニットは当該分野で公知であり、そ
してＤＮＡに複合体化し得る、リポソーム、タンパク質複合体、多糖、合成有機
ポリマーまたは両親媒性物質（脂質を含む）を含む。本発明のベクターを送達ユ
ニットに導入するための方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、前出を参照のこと。このような方法は、用いられる送達ユニットの性質
および標的核酸の性質に依存してかなり変動することが当業者に明らかである。

【００８９】本明細書中上記で議論するように、標的核酸は、種々の型のＤＮＡ（例えば、
動物起源、植物起源またはウイルス起源）であり得る。従って、ギャップを埋め
たベクター核酸の、送達ユニット細胞における挿入は、任意の所定の適用におけ
る標的核酸の性質および選り抜きの送達ユニットまたは粒子に依存する。本明細
書中のどこかに考察されるように、ギャップを埋めたベクターにおける標的核酸
は、ウイルス核酸を単独でまたは宿主細胞または選り抜きの粒子において発現さ
れるべき核酸と組み合わせて含み得る。ウイルス核酸を含む標的核酸は、形質転
換方法論によってウイルス粒子に導入され得る。当業者は、いくつかの方法が当
該分野で利用可能であり、そして当該分野で周知であることを認識する。１つの
このような方法論は、ウイルス粒子のパッケージングのための補完パッケージン
グ因子を提供するパッケージング細胞株における、ウイルスタンパク質をコード
する核酸のトランスフェクションを含む。これらの例では、標的核酸は、ウイル
スキャプシドに、例えば、適切な補完細胞株を用いてパッケージングすることに
よって導入される。

【００９０】標的核酸を含むギャップを埋めたベクターは、大きな核酸（例えば、組換えア
デノウイルスベクター）をコードすることおよび操作することを可能にする。例
えば、ギャップを埋めたアームは、（例えば、上記のようなＬｏｘ／Ｃｒｅ媒介
組換えによって）環化され、増幅され、そしてこの目的のために操作された稀な
切断制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化される。次いで、この線状化された
ベクターは、失われたウイルス機能の生成を可能にし、それによって完全にアセ
ンブルしたアデノウイルスを生成する、補完パッケージング細胞株をトランスフ
ェクトするために用いられる。アデノウイルス配列のパッケージングのために有
用なパッケージング細胞株の例としては、２９３細胞、２９３Ｅ４細胞（Ｗａ
ｎｇら（１９９５）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２：７７５−７８５）および９
１１細胞（Ｆａｌｌａｕｘら（１９９６）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐ
ｙ７：２１５−２２２）が挙げられる。このようなビリオンは、下記のような
遺伝子治療適用のためにさらに用いられ得る。当業者は、本明細書中に記載され
るベクターおよび方法が、当該分野で公知の標準的方法に従って、送達するため
にパッケージングされるべき種々のウイルスベクターを操作するように容易に改
変され得ることを認識する。

【００９１】本発明の別の実施態様では、本発明のギャップを埋めたベクターは、閉じた環
状形態で、または線状化された形態で、非ウイルス性送達ユニットに導入される
。非ウイルス性送達ユニットの例としては、ＤＮＡへ複合体化し得る、リポソー
ム、タンパク質複合体、多糖、合成有機ポリマーおよび両親媒性物質（脂質を含
む）が挙げられる。このような送達ユニットへＤＮＡを導入するための方法は、
当該分野で周知である。例えば、「ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ」、Ｒｏｂｂｉｎｓ編、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙ（１９９７）および「ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ」、Ｌｅｍｏｉ
ｎｅおよびＣｏｏｐｅｒ編、ＢｉｏｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．（１９９７）を参照のこと。それゆえ、例えば
、本発明のベクターは、リン酸カルシウム方法論、エレクトロポレーションまた
はマイクロインジェクションを用いて導入され得る。

【００９２】本発明のクローニング系および方法は、種々の目的のために有用である。例え
ば、ベクターは、インビトロおよびインビボでの遺伝子移入、インビボでのワク
チン接種および遺伝子治療を含む、治療的または診断的目的のために用いられ得
る。本発明のアセンブルした送達ユニットは、その中に含まれる核酸荷物（ｃａ
ｒｇｏ）を標的細胞へと送達するために用いられ得る。

【００９３】それゆえ、本発明は、失われた遺伝子機能を提供し、それゆえ疾患症状を改善
するために用いられ得る。例えば、βサラセミアおよび鎌状赤血球貧血という疾
患は、成体βグロビン遺伝子の異常発現によって引き起こされる。これらの疾患
を被る大部分の個体は、βグロビンについての正常コピーの胎児遺伝子を有する
。しかし、胎児遺伝子は、高メチル化されており、そしてサイレントである。胎
児グロビン遺伝子の置換は、必要とされるグロビン機能を提供し、それによって
疾患症状を改善し得る。

【００９４】本発明はまた、遺伝子を上方調節または下方調節して、ヒトの疾患を担う異常
な遺伝子発現パターンを代償するために用いられ得る。さらに、クローニング系
およびこの使用方法は、遺伝子発現の抑制を含む、良性および悪性の腫瘍および
他のヒト疾患に対する治療アプローチにおいて有用である。他の好ましい実施態
様では、本発明のベクターおよび方法は、ウイルス、植物ならびに動物の分子遺
伝操作のために使用される。

【００９５】従って、目的の発明は、大量の特に大きな核酸（例えば、目的の治療遺伝子の
ような目的の遺伝子を保有する組換えベクター）を生成する手段を本質的に提供
し、ここで本発明の産物は、組換え遺伝子および遺伝子産物について公知のよう
に、任意の種々の使用（例えば、治療的使用または診断的使用）のために用いら
れ得る。

【００９６】以下の実施例は、本発明のさらなる特定の好ましい実施態様を例示することが
意図され、そして全く限定されない。当業者は、単なる慣用実験を用いて、本明
細書中に記載される特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識するかま
たは確認し得る。このような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、そし
て以下の特許請求の範囲によって含まれる。

【００９７】（実施例）以下は、本明細書に記載される実施例において使用される材料および方法の列
挙である。

【００９８】（プラスミド：）ギャップを埋める（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）ベクターであ
るｐ−ｌｅｆｔ、ｐＴｒｐ３４．１、ｐＨｉｓＡｄｖ−２２、ｐＴｒｐ１０１４
−２９およびｐＴｒｐ３６６−２２を図に記載する。ベクターは、ギャップを埋
めるために必要とされるシス作用エレメントの全てを含み、酵母および細菌の両
方において本発明に従うベクターを維持および環化する。ベクターｐ２Ｐｕｃを
図に記載する。それは、アデノウイルスベクターの種々の領域へトランスジーン
をシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）するために使用され得るベクターの例である。

【００９９】ｐＡｄ１０ｓａｃＢＩＩ（ｐＥＤ−Ｒ２Ｐ２の構築のために使用される）は、
Ｐｉｅｒｃｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：２
０５６−２０６０、１９９２）に記載され；そしてｐＥＤ−Ｒ２Ｐ２の構築のた
めに使用されるｐＹＡＣ−Ｓ／Ｎ−３は、ＥｃｏＲＩ部位でのリンカーの挿入な
らびにＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ部位の導入による、ｐＹＡＣ４由来である。ｐＹ
ＡＣ４は、Ｂｕｒｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：８０６−８１２（１９８７
）に記載される。ｐＴｒｐ１０１４−２９の構築のために使用されるＡｄ５−１
０１４を、Ｗａｎｇら、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：３９３−４００（１９
９７）に記載されるようにＡ１０１４アデノウイルスのＰＣＲ増幅によって単離
した。ｐＬＯＸ−Ａｄｅ／ＵｒａおよびｐＬＯＸ−ＣＭＶ−Ｗ９を構築するため
に使用されるｐＡｄＬＯＸは、Ｈａｒｄｙら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１
：１８４２−１８４９に記載される。

【０１００】（酵母および細菌株：）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
株ＹＰＨ８５７（ＭＡＴα、ｈｉｓ３−Δ２００、ｔｒｐ１Δ１、ｕｒａ３−５
２、ｌｅｕ２−Δ１、Ｌｙｓ２−８０１、ａｄｅ２−１０１）を、酵母の形質転
換において使用し、そしてＴｒｐ⁺ベクターおよびＨＩＳ⁺ベクターについての選
択を可能にした。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎ５３５２９（これは、構成的に発現されたＰ
１Ｃｒｅ組換え遺伝子を含む（例えば、Ｓａｕｅｒら（１９９８）Ｇｅｎｅ
７０：３３１−３４１；およびＳａｕｅｒら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１７：１４７−１６１に記載される通り））を使用して、例えば、Ｓ
ａｕｅｒら（１９８８）前出；Ｓａｕｅｒら（１９８９）前出；Ａｂｒｅｍｓｋ
ｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ３２：１３０１−１３１１；およびＳｔｅｉｎｂｅ
ｒｇら（１９８３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１２３−１５４に記載
されるように、Ｌｏｘ／Ｃｒｅ組換えを使用することによって、本発明のギャッ
プを埋めたアームを環化した。

【０１０１】ＤＨ１０Ｂ株（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、０．７のＯＤ₅₅₀
への増殖によってエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｐｍｐｅｔｅｎｔ
）にし、そして氷冷１０％グリセロールでそれを収集および洗浄し、ドライアイ
スエタノール槽中でフラッシュ凍結し、そして−８０℃で保存した。総酵母ＤＮ
Ａを、Ｓｈｅｒｍａｎら（以下）に記載されるように調製し、そしてＢｉｏ−Ｒ
ａｄＧｅｎｅＰｕｌｓａｒＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒにおいて０．１
ｃｍのキュベットを１，８００Ｖ、２００オーム、および２５ｍＦで使用するこ
とによって、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ中にエレクトロポレートした。細胞を、
回復を可能にし、そしてクローンを、カナマイシン（５ｍｇ／ｌ）プレート上で
選択した。当該分野で公知である多くの他の形質転換方法が、本明細書に詳細に
記載されるかまたは参照される方法の代わりに置換され得ることは、当業者に明
らかである。

【０１０２】１０１４欠失は、Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．６：１
３４３−１３５３（１９９５）に記載される。３６６欠失は、Ａｒｍｅｎｔａｎ
ｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６（１９９７）に記載される。

【０１０３】（アガロースゲル電気泳動）制限フラグメントの長さを決定するために、サイ
ズに基づいて二本鎖ＤＮＡ分子を分画するための分析方法が、必要である。この
ような分画を達成するために最も一般的に使用される技術（唯一の技術ではない
が）は、アガロースゲル電気泳動である。この方法の原理は、ＤＮＡ分子が、最
大分子の移動を最も大きな程度に、および最小分子の移動を最も小さな程度に遅
延させる篩ゲル中を移動することである。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦ
ＧＥ）は、より大きなＤＮＡフラグメントの分画を可能にする。

【０１０４】（サザン転写手順）サザン転写手順（サザンブロッティングともいわれる）の
目的は、分画手順から得られたＤＮＡフラグメントの相対的位置を保持しながら
、アガロースゲル電気泳動によって分画されたＤＮＡをニトロセルロースフィル
ター紙または別の適切な表面もしくは支持体へ転写することである。アガロース
ゲルからニトロセルロースへの転写を達成するために使用されるこの方法論は、
毛管作用または電気泳動的転移によって、ゲルからニトロセルロース紙へＤＮＡ
を引き出すことを包含する。サザンハイブリダイゼーション転移手順によるよう
にニトロセルロースフィルター上へ固定化された、ブロットされた核酸のプロー
ブ化を、標識プローブを使用することによって達成し得る。

【０１０５】（核酸ハイブリダイゼーション）核酸ハイブリダイゼーションは、相補的塩基
配列を有する２つの一本鎖核酸分子が、適切な条件下で熱力学的に有利な二本鎖
構造を再形成するという原理に依存する。二本鎖構造は、一方がサザンハイブリ
ダイゼーション転移手順によるようにニトロセルロースフィルター上に固定化さ
れる場合でさえ、２つの相補的一本鎖核酸の間で形成する。試験されるべきＤＮ
Ａを、制限エンドヌクレアーゼで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分画
し、一本鎖形態へ変換し、そしてニトロセルロース紙へ転写する。結合した核酸
を、ハイブリダイゼーションプローブへ再アニーリングするために利用した。ハ
イブリダイゼーション条件の例は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、ＪｏｈｎＷ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）において
見出され得る。例えば、ニトロセルロースフィルターを、５０％ホルムアミド、
高濃度塩（５×ＳＳＣ[２０×：３ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリ
ウム]または５×ＳＳＰＥ[２０×：３．６ＭＮａＣｌ／０．２ＭＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄／０．０２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．７]）、５×デンハルト溶液、１％ＳＤ
Ｓおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で標識プローブとと
もに６８℃で一晩インキュベートする。続いて、以下の所望のストリンジェンシ
ーに基づいて選択される温度で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で数回洗浄
した：室温（低ストリンジェンシー）、４２℃（中程度のストリンジェンシー）
または６８℃（高ストリンジェンシー）。選択された温度を、ＤＮＡハイブリッ
ドの融点（Ｔ_m）に基づいて決定する。他のハイブリダイゼーション条件および
洗浄条件を、当該分野で公知の核酸の物理的特徴、核酸ハイブリダイゼーション
速度論および所望の結果によって当業者の自由裁量で利用し得、そして調節し得
る。

【０１０６】（ハイブリダイゼーションプローブ）サザンハイブリダイゼーション手順にお
いて特定のＤＮＡを可視化するために、標識化ＤＮＡ分子またはハイブリダイゼ
ーションプローブを、ニトロセルロースフィルターに結合した、分画したＤＮＡ
に反応させる。標識ＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡ配列を保有するフィルター
上の領域は、それら自体が標識されて再アニーリング反応の結果となる。このよ
うな標識化を示すフィルターの領域を、可視化する。ハイブリダイゼーションプ
ローブを、一般に、特定のＤＮＡの分子クローニングによって生成する。この標
識（例えば、放射性核種、発光部分、酵素、抗原など）は当該分野で公知である
。

【０１０７】（ＰＣＲ増幅）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)は、大量の標的配列を生成す
るための周知の方法である。一般に、増幅プライマーを、標的基質核酸配列にア
ニールさせる。適切な酵素を使用して、そして適切な条件下で、プライマーに隣
接して見出されるかまたはプライマー間に見出される配列を、合成によって増幅
する。サンプルＰＣＲ反応条件は、以下である：標準的なＰＣＲ反応緩衝液中に
ｄＮＴＰ（最終濃度２００ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸）、５’プラ
イマーおよび３’プライマー（各６００ｍＭ）、鋳型ＤＮＡ（１ｇ）、ＭｇＳＯ ₄ （２０ｍＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）（与えられた全ての濃度は、
この反応についての最終濃度である）。この反応を、まず９４℃で３分間実施し
、次いで、９４℃で１分間、５５℃で１分間および６８℃で３分間を５サイクル
、続いて、９４℃で１分間、６３℃で１分間および６８℃で３分間を１５サイク
ル、続いて、４℃で反応を保持する。個々の反応条件は、例えば、所望の結果お
よび核酸の物理的特性に基づいて、当業者によって設定可能である。

【０１０８】（実施例１）（酵母および細菌の形質転換）酵母株ＹＰＨ８５７を、ＳｈｅｉｓｔｌおよびＧｅｉｔｚ（Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１６：３３９−３４６，１９８９）ならびにＳｈｅｒｍａｎら、「Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＹｅａ
ｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ」（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒ、１９８６
）に記載されるような酢酸リチウム法によって、ベクターアーム（ＰＨｉｓＡ
ｄｖ−２２（５μｇ）；ｐＴｒｐ１０１４−２９（１０μｇ））およびＡｄ５フ
ィラー（充填）（ｆｉｌｌｅｒ）ＤＮＡ（１０μｇ）を用いて形質転換した。酵
母形質転換体を、ヒスチジンを欠く選択培地上で選択し、そしてトリプトファン
を欠く選択培地プレート上でスクリーニングした。酵母増殖および表現型試験の
ための標準的な方法を、Ｓｈｅｒｍａｎら（前出）によって記載されるように利
用した。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎ５３５２９またはＤＨ１０Ｂを０．７のＯＤ₅₅₀へ細
胞を増殖させてエレクトロコンピテントにし、次いで、氷冷１０％グリセロール
でそれを収集および２回洗浄し、ドライアイスエタノール槽中でフラッシュ凍結
し、そして−８０℃で保存した。総酵母ＤＮＡを、Ｓｈｅｒｍａｎら（前出）に
記載されるように調製し、そして、例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌ
ｓａｒＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒにおいて０．１ｃｍのキュベットを１，
８００Ｖ、２００オーム、および２５ｍＦで使用することによって、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ株中にエレクトロポレートした。細胞を、回復を可能にし、そしてクローンを
、カナマイシン（５ｍｇ／ｌ）プレート上で選択した。当該分野で公知である多
くの他の形質転換方法が、本明細書に詳細に記載されるかまたは参照される方法
の代わりに置換され得ることは、当業者に明らかである。

【０１０９】（実施例２）（ＤＮＡの精製および分析）ベクターからのＤＮＡを、当該分野で公知の方法に従って単離および分析した
。記載される特定の方法に対する例示の目的のためであり、そして限定すること
なく、アデノウイルス配列（本実施例に記載されるような）でギャップを埋めた
、得られた代表的なベクターのＤＮＡを、低融解プラグにおいて調製し、そして
パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によって分析するか、あるいは適切
な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳｍａＩ）で消化し、そして従来のアガロ
ースゲル電気泳動によって分析した。代替において、ベクターを、クローン化さ
れた特定の配列に基づいて、２つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化した（例
えば、ＳｍａＩ、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＳｍａＩ／Ｉ−ＳｃｅＩ消化および標準的
な電気泳動での分析）。これらの目的のために有用な標準的なプロトコルは、Ｇ
ｅｍｍｉｌｌら（「ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ」
第１巻、「ＵｎｆｏｌｄｉｎｇＴｈｅＧｅｎｏｍｅ」２１７−２５１頁、Ｒ
ａｍＳ．Ｖｅｒｍａ編）において十分に記載されている。当該分野で公知の多
くの他の方法が、詳細に記載されるかまたは参照される方法の代わりに置換され
得ることは、当業者に明らかである。

【０１１０】（実施例３）（ＨＩＳ左アームの構築）リンカーを、ｐｌｅｆｔ（Ｍｅｎｄｅｚら、「ＧｅｎｏｍｅＭａｐｐｉｎｇ
ａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＭｅｅｔｉｎｇ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、１９９３）（これは、７つの独特なクローニング部位（Ｌｏｘ
ｐ部位およびＩ−Ｓｃｅ１部位（１８マーの稀切断酵素（ｒａｒｅｃｕｔｔｅ
ｒ）））を含んだ）へクローン化した。構築物であるｐｌｅｆｔＧ−５は、ＨＩ
Ｓ３、テロメア、ＬＯＸｐ部位およびこの稀切断酵素部位を含む。

【０１１１】（実施例４）（ＴＲＰ右アームの構築）リンカーを、ｐＡｄ１０ＳａｃＢＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅら（１９９２）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：２０５６−２０６０）（こ
こで、４つの独特な部位およびＩ−ＳｅｃＩ部位（１８マーの稀切断酵素）が含
まれた）へクローン化した。次の２つのフラグメントは、ｐＹＡＣ−ｓ／ｎ−３
由来であった。第１のフラグメント（これは、ＣＥＮ、ＴＲＰ１およびＡＲＳマ
ーカーを含む）を、ＡａｔＩＩで切断し、平滑末端化／ＤＮＡポリメラーゼＫｌ
ｅｎｏｗ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）
で充填し、次いで、ＳｆｉＩで切断して、このフラグメントを放出した。第２の
フラグメント（これは、ＴＥＬを含む）を、ＸｈｏＩで切断し；平滑末端化／Ｄ
ＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗで充填し、そしてＢａｍＨＩで切断して、このフ
ラグメントを放出した。３方向の連結を、ｐＡｄ１０ｓａｃＢＩＩ（ＳｆｉＩ／
ＢａｍＨＩ）および以前に記載したフラグメントを用いて設定した。ＰＴｒｐ３
４−１は、必要とされる全てのエレメント（ＴＲＰ１、テロメア、セントロメア
、ＡＲＳおよびＩ−ＳｃｅＩ部位）、Ｐ１プラスミドレプリコン、ＫＡＮ、Ｐ１
溶解レプリコン（Ｐｉｅｒｃｅら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．８９：２０５６−２０６０）、４つの独特なクローニング部位ならびに
ＬｏｘＰ部位を、ギャップを埋めるアームのために有する。Ｔｒｐ１０１４−２
９およびＰＴｒｐ３６６−２２を、両方、ＡＤ５−１０１４（Ａｒｍｅｎｔａｎ
ｏら（１９９５）Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：１３４３−１３５３）およ
び／またはＡＤ５−３６６（Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７１：２４０８−２４１６）のいずれかの、１．５ｋｂの３’末端のＰＣＲベ
ースのクローニング、さらにＢａｍＨＩおよびＩＳｃｅ−Ｉ末端の付加、ならび
にＰＴｒｐ３４−１（Ｉ−ＳｃｅＩ／ＢａｍＨＩ）へのクローニングによって、
作製した。このクローンを使用して、アデノウイルスベクターを含むインサート
のギャップを埋め得、そして１０１４Ｅ４欠失または３６６欠失のいずれかを、
それぞれ導入し得る。このベクターを、標的化のためにＢａｍＨＩによって線状
化した。

【０１１２】（実施例５）（ベクターのギャップを埋める）本発明に従うクローニング系の使用を例示するために、代表的なアームｐｌｅ
ｆｔ（左アーム）およびｐＴｒｐ（右アーム）を改変して、アデノウイルスゲノ
ムの一部と５’および３’相同性を共有する配列（すなわち、代表的な標的配列
）を含んだ。ｐｌｅｆｔ６は、ＨＩＳ３酵母選択マーカー、酵母テロメア配列、
ＬｏｘＰ部位、Ｉ−ＳｃｅＩ部位、および５’または３’相同性がクローン化さ
れ得るポリリンカーを有する。ｐＴｒｐ３４．１は、ＴＲＰＩ酵母選択マーカー
、酵母テロメア配列、ＬｏｘＰ部位、Ｉ−ＳｃｅＩ部位、Ｐ１プラスミドレプリ
コン複製起点、Ｐ１溶解レプリコン、ＫＡＮ遺伝子、ＡＲＳ、ＣＥＮ、および５
’または３’相同性がクローン化され得るポリリンカーを有する。３つのエレメ
ントを、従来の方法によってＹＰＨ−８５７酵母細胞株に導入した。

【０１１３】（実施例６）（ΔＥ１／Ｅ４（１０１４）Ａｄ５構築）酵母における相同性組換えを使用することによって、重複相同片を使用する、
前述の左アーム、右アームおよび標的配列を、酵母中の単一モジュールへ再構築
する。構築物は、両方のアーム（ＨＩＳ⁺（ＴＥＬ）およびＴＲＰ⁺（ＣＥＮ、Ａ
ＲＳ、ＴＥＬ））が存在し機能的である場合にのみ、維持され、そして安定であ
る。相同性の５’末端および３’末端がクローン化され得る限り、フィラーＤＮ
Ａのサイズまたは含量は制限されない。

【０１１４】ｐＴｒｐ１０１４−２９（これは、Ａｄ５１０１４由来の十分な３’相同性お
よびＥ４欠失を共有する配列を含む）を、ｐＨＩＳＡＤＶ−２２（これは、ＡＤ
Ｖ−１由来の５’末端相同性およびＥ１欠失を含む）と共に使用した。２つのア
ームを、Ａｄ５ＤＮＡを用いて酵母（ＹＰＨ８５７）へ同時トランスフェクト
した。総アデノウイルスＤＮＡでプローブした、Ｈｉｓについての選択、および
上記のトリプトファンの非存在下での増殖によるＴｒｐについてのスクリーニン
グにより獲得された、得られた陽性クローンのサザンブロット分析は、全マーカ
ー（ＴＲＰ⁺、ＨＩＳ⁺）を有するようにさらなる分析で見出されたクローン（Ｙ
ＡＣ１８またはＹ１８）を同定した。Ｙ１８は、約６５ｋｂのサイズである。こ
の分析は、ＹＡＣ１８を生成する相同組換えが、アデノウイルス、Ｈｉｓおよび
Ｔｒｐマーカーを保有する他のクローンと比較して、Ｅ１Δの３’末端で生じる
が、Ｅ１の５’で生じる相同組換えに起因してＥ１を含むことによって、より大
きいことを表した。

【０１１５】（実施例７）（アデノベクター構築）代表的なベクターであるｐＥＤ−Ｒ２Ｐ２は、１０１４Ｅ４欠失をＡｄ５ウイ
ルスへ導入するために有用である。０〜１．３ｍμ（マップユニット、１マップ
ユニットは、約３６０ｂｐ；Ａｄ５の５’末端に対応する）を含む６５０ｂｐの
ＢｃｌＩフラグメントを、ＬＴＲ領域にハイブリダイズするように設計されたプ
ライマー（５’−ＡＴＣＧＴＧＡＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ
−３’）（配列番号１）およびＡｄ５配列の５’末端からの６５０ｂｐをハイブ
リダイズするように設計された別のプライマー（５’−ＣＡＡＧＴＡＴＣＧＧＧ
ＴＡＴＡＴＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴＡＣＧＴ−３’）（配列番号２）を使用して、
ＰＣＲ増幅（以下に記載されるのと同じサイクリングパラメーターを使用する）
によってｐＡｄＬＯＸから単離した。これらのプライマーは、隣接するＢｃｌＩ
部位（これは、ＢａｍＨＩ適合性である）もまた含む６５０ｂｐのフラグメント
を生成するように設計した。得られたフラグメントを、Ａｄ５１０１４由来の十
分な３’末端相同性およびＥ４欠失を共有する配列を含むｐＴｒｐ１０１４−２
９中のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。得られた２３ｋｂのベクターであるｐ
ＥＤ−Ｒ２Ｐ２を、Ａｄ５ＤＮＡと共に酵母（ＹＰＨ８５７）へ同時トランス
フェクトし、Ｔｒｐプレート上で選択し、そしてサザンブロットによってＥ３配
列の存在についてスクリーニングした。次いで、このギャップを埋めたベクター
を、ＤＨ１０Ｂへ導入し、カナマイシン選択し、そして増幅した。得られた陽性
クローン（Ｔｒｐについての選択によって得られた）を、総アデノウイルスＤＮ
Ａを用いてプローブして、アデノＹＡＰ−Ｒ２Ｐ２（１０１４）と命名されたそ
のクローンを同定し、全てのマーカー（すなわち、ＧＦＰ、およびＥ３）を有す
ることをさらなる分析において見出した。

【０１１６】（実施例８）（変異体アデノベクターの構築）変異を、ｐＥＤ−Ｒ２Ｄ２ベクターを使用して、Ａｄ５中に導入した。ｐＥＤ
−Ｒ２Ｄ２構築物由来の５’末端相同性と共に、３’末端相同性およびＥ４欠失
Ａｄ５１０１４を含むベクターｐＥＤ−Ｒ２Ｄ２を、Ａｄ５−ＧＦＰ（Ｅ４⁺）
ＤＮＡまたはＡｄ５−ＧＦＰ（３６６）ＤＮＡのいずれかを用いて、酵母（ＹＰ
Ｈ８５７）へ同時トランスフェクトし、そしてＴｒｐプレート上で選択した。次
いで、ギャップを埋めたベクターを、ＤＨ１０Ｂへ導入し、カナマイシン選択し
、そして増幅した。クローンの分析（例えば、制限マッピングによる）は、予測
される変異を示した。

【０１１７】（実施例９）（ギャップを埋めたアデノベクターのＥ１領域の改変）ｐＬＯＸ−Ａｄｅ／Ｕｒａを使用して、酵母マーカーおよびＳＶ４０ポリＡ
配列を、アデノベクターのＥ１領域へ移動させた。ｐＬＯＸ−Ａｄｅ／Ｕｒａは
、ｐＡｄＬＯＸに由来し、ＡＤＥ２酵母選択マーカー、およびＵＲＡ３酵母選択
マーカー、ＴＥＬ、ＬｏｘＰ部位、Ｉ−ＳｃｅＩ部位、１〜１．３ｍμのＡｄ５
領域（Ａｄ５の５’領域に対応する）およびＳＶ４０ポリＡを有するポリリン
カーを含んだ。ｐＬＯＸ−Ａｄｅ／Ｕｒａを、Ｂｓｕ３６Ｉで切断し、Ａｄ５−
ＧＦＰ（Ｅ４⁺）ＤＮＡを用いて酵母株ＹＰＨ８５７に同時トランスフェクトし
、そしてＳＣ−ＵＲＡ、ＳＣ−Ｔｒｐプレート上で選択した。Ｕｒａ／Ｔｒｐ陽
性クローンを、Ａｄｅ陽性およびＧＦＰ陰性であることによって選択した。次い
で、クローンを、エレクトロポレーションによって酵母から細菌へ移動させた。
一旦陽性クローンがカナマイシン選択を使用して選択されると、クローンを増幅
し、そして標準的な方法論によって精製した。次いで、増幅したＤＮＡを必須の
稀切断酵素で消化して、ウイルスゲノムを放出し、そして相補的細胞をトランス
フェクトするため、および感染性アデノウイルスをレスキューするために使用し
た。

【０１１８】ｐＡｄＬＯＸを使用して、トランスジーン（ＣＭＶ−Ｗ９）を本発明のＡｄ５
ベクターのＥ１領域へ移動させた。ベクターは、相同組換えを使用することによ
って、トランスジーンのＡｄ５ベクターへの導入ならびにＡｄ５ＰＡＣ１６−
Ａ／Ｕ（Ｅ４⁺、Ｅ３⁺）上に見出されるＵＲＡ３マーカーの５ＦＯＡの陰性選択
およびＡＤＥ１マーカーの色の選択（白から赤）を可能にする。ｐＬＯＸ−ＣＭ
Ｖ−Ｗ９を、ＳｆｉＩで切断し、Ａｄ５ＰＡＣ１６−Ａ／Ｕ（Ｅ４⁺、Ｅ３⁺）
を用いて酵母株ＹＰＨ８５７へ同時トランスフェクトし、そしてＳＣ−Ｔｒｐ、
５ＦＯＡプレート上で選択した。Ａｄｅ^-およびＣＭＶ−Ｗ９⁺クローンを、エレ
クトロポレーションによって、酵母のバックグラウンドから細菌へ移動させた。
一旦ＣＭＶ−Ｗ９Ａｄ５クローンがカナマイシン選択を使用して選択されると
、このクローンを、標準的な方法論によって増幅および精製した。次いで、増幅
したＤＮＡを、必須の稀切断酵素で消化して、ウイルスゲノムを放出し、そして
相補的細胞をトランスフェクトするため、および感染性アデノウイルスをレスキ
ューするために使用した。

【０１１９】（実施例１０）（アーム置換）ギャップを埋めたアデノベクターのＨＩＳ３アームを、配列（トランスジーン
ｐ３８）の挿入によって変異誘発した。プラスミドｐ２Ｐｕｃを使用して、ギャ
ップを埋めたアデノベクターのＨＩＳ３アームを改変した。より詳細には、ｐ２
ＰＵＣを（ａ）Ｅ１欠失をＡｄ５ベクターへ導入するために、そして（ｂ）ポリ
リンカーへクローニングすることによって、使用し、ｐ３８のｃＤＮＡのような
トランスジーンを標的化するために使用した。プラスミドｐ２ＰＵＣおよびｐ２
ＰＵＣ３８を、ＮｏｔＩによって線状化し、そして酢酸リチウム法を使用してア
デノＹＡＣ１８を含む酵母株中に別々に形質転換した。酵母形質転換体を、リジ
ンを欠く選択培地上で選択し、そしてヒスチジンを欠く選択培地プレート上でス
クリーニングした。Ｌｙｓ⁺を試験したがＨＩｓ^-であった酵母クローンを、プラ
グにして、そしてＰＦＧＥによって試験した。全てのクローンを、総アデノウイ
ルスＤＮＡと共にハイブリダイズした。ＹＡＣ１８は、６５ｋｂで陽性クローン
を示した。酵母株Ｙ１８Ｌ／Ｈ／Ｔは、Ｌｙｓ⁺、ＨＩＳ⁺およびＴＲＰ⁺であり
、そして６５ｋｂおよび７０ｋｂで二重泳動（ｄｏｕｐｌｅｔｒｕｎｎｉｎｇ
）を示す。Ｙ１８⁺ｐ２ＰＵＣは、７０ｋｂで陽性フラグメントを示し、そして
Ｙ１８⁺ｐ２ＰＵＣ⁺ｐ３８は、７３ｋｂで陽性クローンを示した。Ｙ１８は、Ｌ
ｙｓプローブについて陰性であり、ＨＩＳプローブについて陽性であり、そして
ｐ３８プローブについて陰性であり、これは、ＨＩＳ領域がインタクトであり、
そしてｐ２ＰＵＣまたはｐ２ＰＵＣ３８によって標的化されないことを示す。Ｙ
１８⁺ＰＵＣは、Ｌｙｓについて陽性であり、ＨＩＳについて陰性であり、そし
てｐ３８について陰性であった。このデータは、Ｙ１８⁺ＰＵＣのＨＩＳ３（５
’）アームがｐ２ＰＵＣのＬｙｓアームによって標的化および置換されており、
そして増加するサイズがｐＨＩＳＡｄｅ−２２（８ｋｂ）とｐ２ＰＵＣ（１３ｋ
ｂ）との間の差異に起因することを示す。Ｙ１８⁺ｐ３８は、Ｌｙｓについて陽
性であり、ＨＩＳについて陰性であり、ｐ３８について陽性であり、そしてＹ１
８⁺２ＰＵＣよりもわずかに高く（７３ｋｂ）泳動する。そのことは、Ｙ１８⁺ｐ
３８のＨＩＳ３（５’）アームがベクターｐ２ＰＵＣ⁺ｐ３８のＬｙｓアームに
よって標的化および置換されており、そしてまたｐ３８トランスジーンを標的化
していることを示す。Ｙ１８ＰＵＣとＹ１８ｐ３８との間のサイズの差異は、ｐ
３８のｐ２ＰＵＣへの３ｋｂのインサートに起因し、３ｋｂ大きい総組換えベク
ターを作製する。Ｙ１８Ｌ／Ｈ／Ｔは、ＬｙｓおよびＨＩＳについて陽性である
が、ｐ３８について陰性である。二重線は、ｐ２ＰＵＣ（Ｌｙｓ⁺）で標的化さ
れたもの、および標的化されていないもの（ＨＩＳ⁺、Ｌｙｓ⁺）が存在する２つ
のベクターが存在することを示す。

【０１２０】（実施例１１）（１工程）変異を、アーム上の酵母マーカーに対する選択の使用なしに（すなわち、ギャ
ップを埋めたベクター配列の中間に変異を導入するために）、ギャップを埋めた
ベクターへ導入し得る。ΔＥ１／Ｅ４１０１４株（Ｈｉｓ⁺、Ｔｒｐ⁺、Ｕｒａ ⁺ およびＡｄｅ⁺）を、稀な部位（Ｉ−ＰｐｏＩ）を含むＵＲＡ／ＡＤＥオメガベ
クターで形質転換して、標的後のオメガベクターのベクターへの挿入をマッピン
グした。ＵＲＡ／ＡＤＥオメガベクターを改変して、ＡＤＶ−５のアデノウイル
ス配列と相同性を共有する５’領域中の配列および３’領域中の配列を含んだ。
相同組換えに続いて、得られたクローン（例えば、アデノ８０２）を単離し、そ
してＤＮＡを上記のように精製した。アデノ８０２を使用して株ΔＥ１／Ｅ４
１０１４（Ｈｉｓ⁺、Ｔｒｐ⁺、Ｕｒａ⁺およびＡｄｅ⁺）を形質転換した。ΔＥ１
／Ｅ４１０１４（Ｈｉｓ⁺、Ｔｒｐ⁺、Ｕｒａ^-およびＡｄｅ^-）クローンを、Ｈ
ｉｓプレート上で選択し、そしてｔｒｐの存在下でＡｄｅ（赤色選択）、および
Ｕｒａの損失についてスクリーニングした。

【０１２１】（実施例１２）（２工程インおよびアウト）変異を、アームに対する選択の使用なしにベクターへ導入し、そしてここで、
この変異をエキソビボで酵母から作製した。新規の欠失（ｄｅｌＢ）を、タンデ
ム複製（Ｃ）の標的化およびＵＲＡ３酵母マーカー上での５ＦＯＡの陰性選択に
よるＵＲＡ３およびＡＤＥ１の除去によって作製した（Ｂｏｅｋｅら（１９８４
）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７：３４５−３４６；ＢｒｏｗｎおよびＳ
ｚｏｓｔａｋ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２７８−２９０
）。

【０１２２】（実施例１３）（酵母から細菌系への転移およびベクターの環化）ギャップを埋めたベクターを、酵母バックグラウンドから細菌へ移動させ、そ
して本発明に従う代表的な環化エレメントを使用して環化する。クローンＷΔＥ
１／Ｅ４１０１４Ｌｙｓ⁺Ｔｒｐ⁺由来の総ＤＮＡを、標準的なプロトコルに
従って精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎ５３５２９を、０．７のＯＤ₅₅₀への増殖に
よってエレクトロコンピテントにし、次いで、氷冷１０％グリセロールでそれを
収集および２回洗浄し、ドライアイスエタノール槽中でフラッシュ凍結し、そし
て−８０℃で保存した。次いで、総酵母ＤＮＡを、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅ
ＰｕｌｓａｒＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒにおいて０．１ｃｍのキュベット
を１，８００Ｖ、２００オーム、および２５ｍＦで使用することによって、Ｎ５
３５２９（Ｃｒｅ⁺）中にエレクトロポレートした。細胞を、回復を可能にし、
そしてクローンを、カナマイシン（５ｍｇ／ｌ）プレート上で選択した。陽性ク
ローンを標準的なプラスミド法によって同定、増幅および選択した。アデノウイ
ルス陽性クローンを、Ｉ−ＳｃｅＩ消化によって線状化した。アームおよび細菌
配列の消化ならびに欠失に続いて、精製したウイルスゲノムを使用して、２９３
Ｅ４／２９３０Ｆ６細胞をトランスフェクトした（Ｗａｎｇら（１９９５）Ｇｅ
ｎｅＴｈｅｒａｐｙ２：７７５−７８３）。

【０１２３】（実施例１４）（組換え送達の操作およびアセンブリ）（ユニット：アデノウイルスアセンブリ）２９３−Ｅ４細胞を、トランスフェクトの前に４８時間、プレートあたり２．
５×１０⁶個の細胞で、１０ｃｍプレートにプレート化した。トランスフェクト
の１時間前、細胞に１０ｍｌの新鮮培地（２９３／ＴＳＡ培地）：ＤＭＥ、５０
ｍｌドナー仔ウシ血清（１０％）、５ｍｌグルタミンおよび５ｍｌペン／ストレ
ップ（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を供給した。５μｇのＤＮＡを、Ｉ−ＳｃｅＩ消化
によって線状化し、そしてリン酸カルシウム沈殿によって２９３−Ｅ４細胞と組
み合わせた（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）Ｃｅｌｌ５７：７７７−７８５）。
トランスフェクション後、細胞を、３９℃で５日間インキュベートし、収集し、
次いでドライアイス／エタノール槽中で３回凍結および溶融させた。次いで、細
胞を３０００×ｇで１０分間遠心分離し、そして細胞溶解物を、新鮮な２９３−
Ｅ４細胞に添加した。次いで、ウイルスＤＮＡを抽出する（Ｈｉｒｔ（１９６７
）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６：３６５−３６９を参照のこと）。アデノウイルス
ＤＮＡを、ＳｍａＩおよびＳｍａＩ／Ｉ−ＳｃｅＩで消化する。消化したＤＮＡ
を０．７％アガロースゲル上で分画し、そして構造的完全性を確認する。

【０１２４】（等価物）当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、たかだか慣用的な実
験以外を使用して、本明細書に記載される特定の物質および手順に対する多くの
等価物を認識し、または確認し得る。このような等価物は、本発明の範囲内にあ
ると考えられ、そして上述の特許請求の範囲によって包含される。

【０１２５】全ての参考文献は本明細書に引用され、そしてその全体において本明細書に参
考として援用される。

【図面の簡単な説明】

本発明の上記および他の目的の局面、その種々の特徴、ならびに本発明自体が
、添付の図面を含む本明細書の記載において提供される。図面において、以下の略号を使用する：ＨＩＳ３：酵母ＨＩＳ３遺伝子；ＴＲ
Ｐ１：酵母ＴＲＰ１遺伝子；ＵＲＡ３：酵母ＵＲＡ３遺伝子；ＡＤＥ１：酵母Ａ
ＤＥ１遺伝子；ＬＹＳ２：酵母ＬＹＳ２遺伝子；ＴＥＬ：酵母テロメア；ＣＥＮ
：酵母セントロメア；ＡＲＳ：自律複製配列、酵母の複製起点；５ＦＯＡ：５−
フルオロオロチン酸；ｍμまたはｍｕ：マップ単位；ＡＭＰ：アンピシリン耐性
決定因子；ＫＡＮ：カナマイシン耐性決定因子；Ｏｒｉ；ＣｏｌＥ１複製起点；
ＬＯＸ：ＬｏｘＰ部位；Ａｄｅｎｏ：アデノウイルス；ＰＣＲ：ポリメラーゼ連
鎖反応；ＰＦＧ：パルスフィールドゲル；ＣＭＶ：サイトメガロウイルス；Ｅ１
、Ｅ２およびＥ４：アデノウイルスゲノムの部分；Δ：欠失；ＧＦＰ：グリーン
蛍光タンパク質；Ｐ１：細菌人工染色体；ＣＲＥ：Ｃｒｅリコンビナーゼ；ＲＥ
Ｐ：複製起点；Ψ：ウイルスパッケージングシグナル；ＰＯＬＹＡＡ：ポリア
デニル化部位；ＩＴＲ：逆方向末端反復配列およびＰＦ：パルスフィールド。多
数の制限エンドヌクレアーゼ部位が、公知の命名を使用して示される（例えば、
ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＰｐｏＩなど）。

【図１】図１は、本発明に従う代表的なＤＮＡクローニング系を示す。工程１は、ギャ
ップを埋めたベクターとしての大きなＤＮＡの捕獲、クローニングおよび操作を
するための、酵母細胞中の相同組換えを示す。工程２は、細菌中でのＣｒｅ−Ｌ
ｏｘ組換えを促進し、直鎖状構築物を、細菌中で増幅されそして精製され得る環
化された機能的核酸へ変換する、代表的な環化エレメントであるＬｏｘＰの使用
を示す。次に、ベクターがウイルスゲノム（すなわち、アデノウイルス）に由来
する場合か、またはウイルスが適切なウイルスエレメントを含むように操作され
る場合、工程３は、細菌細胞がウイルスゲノムを放出し、そして感染性のウイル
ス粒子の回収を可能にするように処理され得ることを、示す。

【図２】図２は、本発明に従う代表的な環状ベクターを示す。工程１は、ギャップを埋
めたベクターとしての大量のＤＮＡの捕獲、クローニングおよび操作をするため
の、酵母細胞中の相同組換えを示す。工程２は、細菌中で増幅されそして精製さ
れ得るギャップを埋めたベクターの能力を示す。次に、ベクターがウイルスゲノ
ム（例えば、示されるようなアデノウイルス）に由来する場合か、またはウイル
スが適切なウイルスエレメントを含むように操作される場合、工程２は、ベクタ
ーがウイルスゲノムを放出し、そして感染性のウイルス粒子（例えば、示される
ようなアデノウイルス）の回収を可能にするように切断され得ることを示す。

【図３】図３は、本発明に従う代表的なクローニング系を示す。このクローニング系は
、左アーム（ｐｌｅｆｔＧと命名する）および右アーム（ｐＴｒｐ３４−１と命
名する）を含む。

【図４】図４は、５’および３’末端における配列ＡおよびＢと相同な配列を含む標的
配列の操作のための代表的なベクターの調製を示す。この代表的なベクター（す
なわち、Ｔｒｐ３４−１）は、模式的に示すように、ＴＲＰ１、ＬｏｘＰ部位、
Ｉ−ＳＣＥＩ部位、Ｐ１プラスミドレプリコンｏｒｉ、Ｐ１溶菌レプリコン、Ｋ
ＡＮ、細菌選択マーカー、ＡＲＳ、ＣＥＮ、ＴＥＬ、ならびに５’−Ａ相同配列
および３’−Ｂ相同配列がクローニングされ得るポリリンカーを含む。５’−Ａ
相同配列および３’−Ｂ相同配列は、酵母中でギャップを埋めるためにベクター
を直鎖状にするために使用されるＮｏｔＩ認識部位によって隔てられる。

【図５】図５は、本発明に従う代表的な左アームを示す。リンカーが、７つの独特のク
ローニング部位、ＬｏｘＰ部位およびＩ−ＳｃｅＩ認識部位を含むＰｌｅｆｔ中
にクローニングされた。生じる構築物ＰｌｅｆｔＧ−５は、ＨＩＳ３、テロメア
（白三角）、ＬｏｘＰ部位および稀な切断酵素認識部位を含む。ＰＨｉｓＡＤ
Ｖ−２２もまた、アデノウイルス粒子のような送達ユニットと組み合わせて、本
発明に従って、使用され得る。

【図６】図６は、本発明に従う代表的な右アームを示す。代表的な右アームであるｐＴ
ｒｐ３４−１は、ギャップを埋めるアームのための、ＴＲＰ１、テロメア、セン
トロメア、ＡＲＳ、Ｉ−ＳｃｅＩ部位、Ｐ１プラスミドレプリコン、ＫＡＮ、Ｐ
１溶菌レプリコン、４つの独特のクローニング部位およびＬｏｘＰ部位を含む。
ｐＴｒｐ１０１４−２９およびｐＴｒｐ３６６−２２の両方が、ＡＤ５−１０１
４またはＡＤ５−３６６のいずれかの３’末端の１．５ｋｂのＰＣＲ増幅によっ
て得られ、そしてｐＴｒｐ３４−１中にクローニングされた。

【図７】図７は、Ａｄ５ウイルス中への１０１４Ｅ４欠失の導入のために有用な、代
表的なベクターｐＥＤ−Ｒ２Ｐ２を示す。

【図８】図８は、相同性の３’末端およびＥ４欠失を含む代表的なベクターであるｐＥ
Ｄ−Ｒ２Ｄ２、Ａｄ５１０Ｔ４を、ｐＲ２Ｐ２構築物由来の相同性の５’末端と
ともに使用するＡｄ５構築物の構築を示す。

【図９】図９は、本発明に従う代表的なギャップを埋めたベクターの生成を示す。酵母
における相同組換えを使用して、示されるような３つの重複する相同部分を、酵
母中の酵母人工染色体中に再構築する。両方のアームＨＩＳ⁺（ＴＥＬ）および
Ｔｒｐ⁺（ＣＥＮ、ＡＲＳ、ＴＥＬ）が、存在して機能的である場合、ギャップ
を埋めたベクターは、維持され、そして安定である。

【図１０】図１０は、アーム置換プラスミドｐ２Ｐｕｃの構築の図示である。図に示すよ
うに、以下の工程を達成した：（ｉ）４５ｂｐのリンカーをｐＹＡＣ−４中にク
ローニングした、（ｉｉ）Ｈｉｓ３遺伝子を除去した、（ｉｉｉ）Ｕｒａ３遺伝
子を除去した、（ｉｖ）酵母マーカーＬＹＳ２を挿入した、そして（ｖ）Ａｄ５
の５’末端を挿入した。生じる構築物ｐ２Ｐｕｃは、ＬＹＳ２、テロメア、Ｌｏ
ｘＰ部位、稀な切断酵素認識部位およびＡｄ５の５’末端を含む。ｐ２Ｐｕｃを
使用して、ギャップを埋めたアデノベクターの５’末端を改変し得る。

【図１１】図１１は、ウイルスアーム置換のプロセスの図示である。プラスミドｐ２Ｐｕ
ｃを使用して、ギャップを埋めたアデノベクターのＨＩＳ３アームを改変する。
本発明のその局面に従って、ｐ２Ｐｕｃを使用して、トランスジーンをアデノベ
クターのＥ１領域中に移動させる。このベクターを使用して、Ａｄゲノム中に、
トランスジーンを移動させ得るか、またはＥ１欠失を導入し得る。

【図１２】図１２は、本発明に従う方法の図示である。この方法によって、アーム上の酵
母マーカーに対する選択を使用することなく、変異をベクター中に導入し得る。
例示するように、本発明に従う方法は、ベクターの操作のための、汎用性のある
アプローチである。実施例において、エキソビボで変異誘発した酵母株を使用し
て、ベクターの中央に変異を作製した。

【図１３】図１３は、ギャップを埋めた環状ベクターのＥ１領域を改変するための、本発
明の方法およびベクターの使用を示す図示である。

【図１４】図１４は、本発明に従う方法の図示である。この方法によって、アームに対す
る選択を使用することなく、ベクター中に変異を導入し得る。そしてこの方法に
おいて、変異は、（クローン化された）酵母のエキソビボにおいて作製されてい
ない。この図において、新規の欠失（ｄｅｌＢ）を、縦列重複（Ｃ）を標的化す
ることによって、およびＵＲＡ３酵母マーカーにおける５ＦＯＡのネガティブ選
択によるＵＲＡ３およびＡＤＥ１酵母マーカーの除去によって、作製した。

【図１５】図１５は、本発明の方法の図示である。この方法によって、ギャップを埋めた
ベクターは、（ａ）Ｃｒｅタンパク質を発現する細菌株Ｃｒｅ−Ｌｏｘ組換えに
よって環化され；（ｂ）従来のプロトコールに従って、細菌中で増幅されそして
精製され；そして（ｃ）直鎖化の後に、相補細胞株中に移入され、本発明の実施
態様に従う組換えアデノウイルス粒子を産生する。

【図１６】図１６は、トランスジーン（ＣＭＶ−Ｗ９）のＡｄ５ベクターのＥ１領域内へ
の移動を示す図示である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０９／４８４，８３０ (32)優先日平成12年１月18日(2000．1．18) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA02 DA02 DA06 DA12 EA02 FA15 4B065 AA80X AA90X AB01 BA01 CA24 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】クローニング系であって、以下：（ａ）第１の選択マーカーおよび第１の環化エレメントを有する、第１のアー
ム；および（ｂ）第２の選択マーカーおよび第２の環化エレメントを有する、第２のアー
ムを含み、ここで、少なくとも１つのアームが複製起点をさらに含む、クローニング系。
【請求項２】各アームが希少な制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさらに
含む、請求項１に記載のクローニング系。
【請求項３】各アームがポリリンカーをさらに含む、請求項１に記載のク
ローニング系。
【請求項４】前記第１の環化エレメントが、第１のＬＯＸ部位を含む核酸
であり、かつ前記第２の環化エレメントが、第２のＬＯＸ部位を含む核酸である
、請求項１に記載のクローニング系。
【請求項５】請求項１に記載のクローニング系であって、ここで：（ａ）前記第１のアームが、標的核酸の５’末端に相同な第１の核酸をさらに
含み；そして（ｂ）前記第２のアームが、該標的核酸の３’末端に相同な第２の核酸をさら
に含む、クローニング系。
【請求項６】請求項１に記載のクローニング系および標的配列を含む、組
成物。
【請求項７】前記標的配列がウイルスの核酸である、請求項６に記載の組
成物。
【請求項８】前記ウイルスがＤＮＡウイルスである、請求項７に記載の組
成物。
【請求項９】前記ＤＮＡウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイル
ス、ポックスウイルス、パポバウイルスおよびヘルペスウイルスからなる群より
選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項７に記載の
組成物。
【請求項１１】前記ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項１０
に記載の組成物。
【請求項１２】前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１１
に記載の組成物。
【請求項１３】前記レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルスである、請求
項１２に記載の組成物。
【請求項１４】以下を含む、ベクター：（ａ）酵母選択マーカー；（ｂ）細菌選択マーカー；（ｃ）テロメア；（ｄ）セントロメア；（ｅ）細菌複製エレメント；（ｆ）酵母複製エレメント；および（ｇ）少なくとも１つの希少な制限エンドヌクレアーゼ認識部位。
【請求項１５】少なくとも１つの独特の制限エンドヌクレアーゼ認識部位
を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】ポリリンカーを含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】標的核酸の５’末端に相同な第１の核酸、および該標的核
酸の３’末端に相同な第２の核酸を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１８】標的核酸をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１９】前記標的核酸がウイルスの核酸配列である、請求項１８に
記載のベクター。
【請求項２０】請求項１に記載のクローニング系を含む、真核生物宿主細
胞。
【請求項２１】前記真核生物宿主細胞が酵母細胞である、請求項２０に記
載の真核生物宿主細胞。
【請求項２２】前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅである、請求項２１に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項２３】請求項１４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２４】真核生物細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】前記真核生物細胞が酵母細胞である、請求項２４に記載の
細胞。
【請求項２６】前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅである、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】請求項６に記載の組成物を含む、細胞。
【請求項２８】真核生物細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】前記真核生物細胞が酵母細胞である、請求項２８に記載の
細胞。
【請求項３０】前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅである、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】細菌である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３２】請求項７に記載の組成物を含む、細菌細胞。
【請求項３３】請求項１または請求項１８に記載のベクターを含む、細胞
。
【請求項３４】細菌である、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３５】標的核酸を含むベクターを生成する方法であって、相同組
換えを可能にする条件下で、以下：（ａ）標的核酸；（ｂ）該標的核酸の５’末端に相同な核酸、第１の選択マーカーおよび第１の
環化エレメントを含む、第１のアーム；ならびに（ｃ）該標的核酸の３’末端に相同な第２の核酸、第２の選択マーカー、およ
び第２の環化エレメントを含む、第２のアームを接触させる工程を包含し、ここで、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の相同組換え
は、該標的核酸を含む該ベクターを生成する、方法。
【請求項３６】少なくとも１つのアームが複製起点をさらに含む、請求項
３５に記載の方法。
【請求項３７】各アームが希少な制限エンドヌクレアーゼ認識部位をさら
に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】前記第１の環化エレメントが、第１のＬｏｘＰ部位を含む
核酸であり、かつ前記第２の環化エレメントが、第２のＬｏｘＰ部位を含む核酸
である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】相同組換えが酵母細胞中で生じる、請求項３５に記載の方
法。
【請求項４０】前記標的核酸を含む前記ベクターを環化する工程をさらに
包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記ベクター
は、前記第１のＬｏｘＰ部位および前記第２のＬｏｘＰ部位をＣｒｅに接触させ
て環化され、これによって、部位特異的組換えによる環化された組換えベクター
を生成する、方法。
【請求項４２】前記ベクターが細菌中で環化される、請求項３８に記載の
方法。
【請求項４３】前記標的核酸を含む前記ベクターを、該ベクターを増殖さ
せるために細菌中に導入する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】組換え核酸を生成する方法であって、以下：（ａ）以下：（ｉ）標的核酸；ならびに（ｉｉ）作動可能に連結した以下を含む、ベクター：（１）酵母選択マーカー；（２）細菌選択マーカー；（３）テロメア；（４）セントロメア；（５）酵母複製エレメント；（６）細菌複製エレメント；（７）該標的核酸の５’末端に相同な核酸；（８）該標的核酸の３’末端に相同な核酸；および（９）少なくとも１つの希少な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を酵母細胞中で接触させる工程であって、ここで、（ｉ）および（ｉｉ）の相同組換えが該組換え核酸を生成する、工程；（ｂ）該酵母細胞から該組換え核酸を単離する工程；ならびに（ｃ）該組換え核酸を細菌に導入する工程であって、ここで、該組換え核酸が該細菌中で増幅される、工程を包含する、方法。
【請求項４５】前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】前記細菌がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである、請
求項４４に記載の方法。
【請求項４７】前記標的核酸がウイルス核酸を含む、請求項４４に記載の
方法。