JP2001321174A - アンチセンス型ジーントラップベクター - Google Patents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
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- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
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-
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- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＥＳ細胞以外のインビトロ細胞分化系におい
ても適用することができる、トラップされた遺伝子に対
応する対立遺伝子における正常な遺伝子（野生型遺伝
子）の発現機能が欠失又は抑制された細胞及びその調製
方法や、該細胞を用いるジーントラップ法や、該細胞の
調製に用いられるアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーを提供すること。 【解決手段】 ジーントラップベクターを細胞に導入す
ることにより、効率よくトラップクローンを得ることが
できるばかりでなく、トラップしたクローンのジーント
ラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の
位置に内因性遺伝子と逆方向に強力なプロモーターを挿
入することができるアンチセンスプロモーター導入ベク
ターを導入することによって、トラップされた遺伝子に
対するアンチセンスＲＮＡを強制的に転写させ、野生型
遺伝子からの転写産物を破壊する。
ても適用することができる、トラップされた遺伝子に対
応する対立遺伝子における正常な遺伝子（野生型遺伝
子）の発現機能が欠失又は抑制された細胞及びその調製
方法や、該細胞を用いるジーントラップ法や、該細胞の
調製に用いられるアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーを提供すること。 【解決手段】 ジーントラップベクターを細胞に導入す
ることにより、効率よくトラップクローンを得ることが
できるばかりでなく、トラップしたクローンのジーント
ラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の
位置に内因性遺伝子と逆方向に強力なプロモーターを挿
入することができるアンチセンスプロモーター導入ベク
ターを導入することによって、トラップされた遺伝子に
対するアンチセンスＲＮＡを強制的に転写させ、野生型
遺伝子からの転写産物を破壊する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、野生型遺伝子の発
現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法や、かかる
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製に用いることができるアンチセンスプロモーター導入
ベクターや、それを用いたジーントラップ法等に関す
る。
現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法や、かかる
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製に用いることができるアンチセンスプロモーター導入
ベクターや、それを用いたジーントラップ法等に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生物は多種多様のシグナル分子を介して
細胞の増殖、分化の制御をしている。ペプチド、ステロ
イド等のこれらシグナル分子とそのレセプターはこれま
でに多数分離同定され、ノックアウトマウスの作製によ
り個体レベルでの機能解析も行われてきている。このよ
うな生物学的刺激がどのような遺伝子群の発現を制御
し、細胞の状態を変えていくのかを知ることは生物学的
に重要であり、従来から、ショウジョウバエや線虫、ゼ
ブラフィッシュでは、変異原性化学物質（ＥＮＵなど）
を用いた大規模な変異体スクリーニングが行われ、個体
の表現型を指標に、ある特定の生物学的現象に関連する
変異体が分離され、その原因遺伝子が同定され、数多く
の生物学的現象が分子レベルで明らかにされてきてい
る。
細胞の増殖、分化の制御をしている。ペプチド、ステロ
イド等のこれらシグナル分子とそのレセプターはこれま
でに多数分離同定され、ノックアウトマウスの作製によ
り個体レベルでの機能解析も行われてきている。このよ
うな生物学的刺激がどのような遺伝子群の発現を制御
し、細胞の状態を変えていくのかを知ることは生物学的
に重要であり、従来から、ショウジョウバエや線虫、ゼ
ブラフィッシュでは、変異原性化学物質（ＥＮＵなど）
を用いた大規模な変異体スクリーニングが行われ、個体
の表現型を指標に、ある特定の生物学的現象に関連する
変異体が分離され、その原因遺伝子が同定され、数多く
の生物学的現象が分子レベルで明らかにされてきてい
る。
【０００３】一方、マウスにおいては実験動物施設など
の制約により、個体を用いた大規模な変異体スクリーニ
ングはほとんど不可能であったが、胚性幹細胞（Embryo
nicStem cells：ＥＳ細胞）への外来性ベクターの挿入
変異を基礎とする、ジーントラップ法（あるいはプロモ
ータートラップ法）が確立されて以来、このような大規
模スクリーニングが哺乳類でも可能になった（Science
244, 463-465, 1989、Genes & Dev. 5, 1513-1523, 199
1、Genes & Dev. 6, 903-918, 1992）。特にＥＳ細胞を
用いることにより、変異を受けた遺伝子が同定できるば
かりでなく、その個体での表現型を解析できる利点があ
る。
の制約により、個体を用いた大規模な変異体スクリーニ
ングはほとんど不可能であったが、胚性幹細胞（Embryo
nicStem cells：ＥＳ細胞）への外来性ベクターの挿入
変異を基礎とする、ジーントラップ法（あるいはプロモ
ータートラップ法）が確立されて以来、このような大規
模スクリーニングが哺乳類でも可能になった（Science
244, 463-465, 1989、Genes & Dev. 5, 1513-1523, 199
1、Genes & Dev. 6, 903-918, 1992）。特にＥＳ細胞を
用いることにより、変異を受けた遺伝子が同定できるば
かりでなく、その個体での表現型を解析できる利点があ
る。
【０００４】ランダムにベクター挿入を生起させるディ
ファレンシャル・ディスプレイ（differential displa
y）法やｃＤＮＡサブトラクション法等の方法は、標的
遺伝子の発現レベルに依存することなく遺伝子の同定が
できる。しかし、挿入変異は無作為に起こるため、多数
のランダム変異の中から重要と思われる変異を選別する
方法が必要であるとされ、ジーントラップ法が確立され
た当初は、トラップクローンを胚操作してキメラを作製
し、発現パターンをスクリーニングするという方法が用
いられていたが、この方法では大量の胚操作を行う必要
があり、しかも発現パターンのみからでは研究者の目的
に合致した遺伝子かどうかの予想はつかない。
ファレンシャル・ディスプレイ（differential displa
y）法やｃＤＮＡサブトラクション法等の方法は、標的
遺伝子の発現レベルに依存することなく遺伝子の同定が
できる。しかし、挿入変異は無作為に起こるため、多数
のランダム変異の中から重要と思われる変異を選別する
方法が必要であるとされ、ジーントラップ法が確立され
た当初は、トラップクローンを胚操作してキメラを作製
し、発現パターンをスクリーニングするという方法が用
いられていたが、この方法では大量の胚操作を行う必要
があり、しかも発現パターンのみからでは研究者の目的
に合致した遺伝子かどうかの予想はつかない。
【０００５】また、選択マーカーとしてβ−ガラクトシ
ダーゼ（β−ｇａｌ）とネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅ
ｏR）の融合遺伝子（β−ｇｅｏ）を有するベクター
が、ジーントラップ法によく用いられているが、このβ
−ｇｅｏ型ベクターではＥＳ細胞においてすでに発現し
ている遺伝子のトラップクローンしか得られないという
問題点があった。これら問題点を解決するため、ホスホ
グリセロキナーゼ又は同等の強力なプロモーターに接続
されたネオマイシン耐性遺伝子の下流にスプライスドナ
ー配列を配置した、ｐｏｌｙＡ ｔｒａｐ法が開発され
た（Nature 392,608-611, 1998、Dev. Dyn. 212, 326-3
33, 1998）。この方法によれば、刺激前に全く発現され
ていない遺伝子をも捕獲できる。
ダーゼ（β−ｇａｌ）とネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅ
ｏR）の融合遺伝子（β−ｇｅｏ）を有するベクター
が、ジーントラップ法によく用いられているが、このβ
−ｇｅｏ型ベクターではＥＳ細胞においてすでに発現し
ている遺伝子のトラップクローンしか得られないという
問題点があった。これら問題点を解決するため、ホスホ
グリセロキナーゼ又は同等の強力なプロモーターに接続
されたネオマイシン耐性遺伝子の下流にスプライスドナ
ー配列を配置した、ｐｏｌｙＡ ｔｒａｐ法が開発され
た（Nature 392,608-611, 1998、Dev. Dyn. 212, 326-3
33, 1998）。この方法によれば、刺激前に全く発現され
ていない遺伝子をも捕獲できる。
【０００６】上記誘導選択型ジーントラップ法に用いら
れるベクターの最も重要な特徴は、スプライスアクセプ
ター（ＳＡ）配列を有し、このすぐ下流になんらかのレ
ポーター遺伝子、ｌａｃＺやＧＦＰを接続している点で
あり、このベクターが遺伝子“Ｘ”のイントロンかエク
ソンに正方向に挿入されると、この変異遺伝子座から転
写されるｍＲＮＡは、遺伝子“Ｘ”の挿入部位上流のエ
クソンからベクターのＳＡに接続し、“Ｘ”−レポータ
ー融合ｍＲＮＡとなる。そしてこの融合遺伝子産物によ
り、内因性プロモーター活性をモニターできる。例え
ば、ある液性因子によって“Ｘ”が誘導あるいは制御さ
れるとすると、それはＸ−ｇａｌ染色あるいはＧＦＰ輝
度の増強または減弱となって現れる。そこで、このよう
な液性因子に反応するクローンを選別し、解析すれば、
その特定の液性因子の下流遺伝子を同定でき、また、胚
操作を経て得られた変異マウスによって、遺伝子“Ｘ”
の発現パターンを観察することもできるし、挿入変異を
受けた遺伝子座は破壊されているため、ノックアウトマ
ウス表現型を解析することができる。
れるベクターの最も重要な特徴は、スプライスアクセプ
ター（ＳＡ）配列を有し、このすぐ下流になんらかのレ
ポーター遺伝子、ｌａｃＺやＧＦＰを接続している点で
あり、このベクターが遺伝子“Ｘ”のイントロンかエク
ソンに正方向に挿入されると、この変異遺伝子座から転
写されるｍＲＮＡは、遺伝子“Ｘ”の挿入部位上流のエ
クソンからベクターのＳＡに接続し、“Ｘ”−レポータ
ー融合ｍＲＮＡとなる。そしてこの融合遺伝子産物によ
り、内因性プロモーター活性をモニターできる。例え
ば、ある液性因子によって“Ｘ”が誘導あるいは制御さ
れるとすると、それはＸ−ｇａｌ染色あるいはＧＦＰ輝
度の増強または減弱となって現れる。そこで、このよう
な液性因子に反応するクローンを選別し、解析すれば、
その特定の液性因子の下流遺伝子を同定でき、また、胚
操作を経て得られた変異マウスによって、遺伝子“Ｘ”
の発現パターンを観察することもできるし、挿入変異を
受けた遺伝子座は破壊されているため、ノックアウトマ
ウス表現型を解析することができる。
【０００７】他方、遺伝子操作における有効なツールと
して、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘ組換え
システム(J.Mol.Biol.(1981)150,467-486)や酵母サッカ
ロミセス・セレビッシェのＦＬＰ−ＦＲＴ組換えシステ
ム（J.Mol.Biol.(1998)284,363-384）が知られている。
例えば、リコンビナーゼ（組換え酵素）Ｃｒｅは、２つ
のｌｏｘＰ配列間において相互の部位特異的組換えを誘
導し、同一ＤＮＡ分子上に同方向の２つのｌｏｘＰ配列
が存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列が切り
出されて環状分子となり（切出し反応）、またその逆
に、異なるＤＮＡ分子上に２つのｌｏｘＰ配列が存在
し、その一方が環状ＤＮＡである場合は、ｌｏｘＰ配列
を介して環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ分子上に挿入される
（挿入反応）。この挿入反応を利用すると、ｌｏｘＰが
既に存在する動植物細胞の染色体に所望の遺伝子を挿入
することができるが、リコンビナーゼＣｒｅの切出し−
挿入反応の平衡は切出し反応側に偏っており、挿入ＤＮ
Ａの多くが再度切り出されてしまうために非常に効率が
悪かった。
して、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘ組換え
システム(J.Mol.Biol.(1981)150,467-486)や酵母サッカ
ロミセス・セレビッシェのＦＬＰ−ＦＲＴ組換えシステ
ム（J.Mol.Biol.(1998)284,363-384）が知られている。
例えば、リコンビナーゼ（組換え酵素）Ｃｒｅは、２つ
のｌｏｘＰ配列間において相互の部位特異的組換えを誘
導し、同一ＤＮＡ分子上に同方向の２つのｌｏｘＰ配列
が存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列が切り
出されて環状分子となり（切出し反応）、またその逆
に、異なるＤＮＡ分子上に２つのｌｏｘＰ配列が存在
し、その一方が環状ＤＮＡである場合は、ｌｏｘＰ配列
を介して環状ＤＮＡが他方のＤＮＡ分子上に挿入される
（挿入反応）。この挿入反応を利用すると、ｌｏｘＰが
既に存在する動植物細胞の染色体に所望の遺伝子を挿入
することができるが、リコンビナーゼＣｒｅの切出し−
挿入反応の平衡は切出し反応側に偏っており、挿入ＤＮ
Ａの多くが再度切り出されてしまうために非常に効率が
悪かった。
【０００８】上記野生型ｌｏｘＰ配列は、２つの１３塩
基の逆方向反復配列（inverted repeat）と、該逆方向
反復配列に挟まれた８塩基のスペーサー領域配列とから
なる３４塩基のＤＮＡ配列からなり、ＤＮＡ鎖の組換え
は上記スペーサー領域で行われることが知られている
が、リコンビナーゼによる上記挿入反応の効率を向上さ
せるため、配列表の配列番号１に示される本来のｌｏｘ
Ｐ配列（野生型）の塩基配列とは異なる塩基配列のｌｏ
ｘＰ配列（変異型）を用いる方法が提案されている。こ
れら方法としては、例えば、配列番号２に示される変異
型ｌｏｘＰ配列を有するｌｏｘ７１と、配列番号３に示
される変異型ｌｏｘＰ配列を有するｌｏｘ６６とを用い
る方法（Nucleic Acids Research,1997,Vol.25,No.4,86
8-872）や、スペーサー領域の塩基配列の一部を他の塩
基に置換した変異型ｌｏｘＰ配列を利用する方法（特開
平１１−１９６８８０号公報）などが知られている。
基の逆方向反復配列（inverted repeat）と、該逆方向
反復配列に挟まれた８塩基のスペーサー領域配列とから
なる３４塩基のＤＮＡ配列からなり、ＤＮＡ鎖の組換え
は上記スペーサー領域で行われることが知られている
が、リコンビナーゼによる上記挿入反応の効率を向上さ
せるため、配列表の配列番号１に示される本来のｌｏｘ
Ｐ配列（野生型）の塩基配列とは異なる塩基配列のｌｏ
ｘＰ配列（変異型）を用いる方法が提案されている。こ
れら方法としては、例えば、配列番号２に示される変異
型ｌｏｘＰ配列を有するｌｏｘ７１と、配列番号３に示
される変異型ｌｏｘＰ配列を有するｌｏｘ６６とを用い
る方法（Nucleic Acids Research,1997,Vol.25,No.4,86
8-872）や、スペーサー領域の塩基配列の一部を他の塩
基に置換した変異型ｌｏｘＰ配列を利用する方法（特開
平１１−１９６８８０号公報）などが知られている。
【０００９】また、スプライスアクセプター配列の上流
に内因性遺伝子と逆方向に連結されたＳＶ４０由来のア
ンチセンスプロモーターを有するジーンサーチベクター
ｐＬＬＧＳＹと、ｌｏｘＰ配列（野生型）の間に上記ア
ンチセンスプロモーターの転写を活性化しうるＬＡＰ３
４８配列を有するトランスアクチベーターベクターｐＬ
ＬＴＸと、該トランスアクチベーターベクターｐＬＬＴ
ＸにおけるｌｏｘＰ配列（野生型）間のＤＮＡを切り出
すためのリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現ベクターｐＲ
ＳＶ−ｃｒｅとを用いて、哺乳動物細胞におけるアレル
座のノックアウト機能をコントロールすることにより、
腫瘍感受性遺伝子を単離したとの報告もなされている
（Cell,Vol.85,319-329,May 3,1996）。
に内因性遺伝子と逆方向に連結されたＳＶ４０由来のア
ンチセンスプロモーターを有するジーンサーチベクター
ｐＬＬＧＳＹと、ｌｏｘＰ配列（野生型）の間に上記ア
ンチセンスプロモーターの転写を活性化しうるＬＡＰ３
４８配列を有するトランスアクチベーターベクターｐＬ
ＬＴＸと、該トランスアクチベーターベクターｐＬＬＴ
ＸにおけるｌｏｘＰ配列（野生型）間のＤＮＡを切り出
すためのリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子発現ベクターｐＲ
ＳＶ−ｃｒｅとを用いて、哺乳動物細胞におけるアレル
座のノックアウト機能をコントロールすることにより、
腫瘍感受性遺伝子を単離したとの報告もなされている
（Cell,Vol.85,319-329,May 3,1996）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】ジーントラップベクタ
ーは挿入型遺伝子変異によって、対立遺伝子の片側のみ
を破壊するため、遺伝子破壊時の表現型を観察するため
には、ＥＳ細胞のトラップクローンからキメラマウスを
作製し、これらキメラマウスを交配して得られるホモ接
合体を用いなくてはならない。そして、ＥＳ細胞以外の
インビトロ細胞分化系においては、両対立遺伝子を破壊
することは極めて困難であり、アンチセンスプロモータ
ーを用いることも考えられてはきたが、特定の遺伝子座
の特定の位置に効率良くアンチセンスプロモーターを挿
入することができる方法は知られていなかった。本発明
の課題は、ＥＳ細胞以外のインビトロ細胞分化系におい
ても適用することができる、トラップされた遺伝子に対
応する対立遺伝子における正常な遺伝子（野生型遺伝
子）の発現機能が欠失又は抑制された細胞及びその調製
方法や、該細胞を用いるジーントラップ法や、該細胞の
調製に用いられるアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーを提供することにある。
ーは挿入型遺伝子変異によって、対立遺伝子の片側のみ
を破壊するため、遺伝子破壊時の表現型を観察するため
には、ＥＳ細胞のトラップクローンからキメラマウスを
作製し、これらキメラマウスを交配して得られるホモ接
合体を用いなくてはならない。そして、ＥＳ細胞以外の
インビトロ細胞分化系においては、両対立遺伝子を破壊
することは極めて困難であり、アンチセンスプロモータ
ーを用いることも考えられてはきたが、特定の遺伝子座
の特定の位置に効率良くアンチセンスプロモーターを挿
入することができる方法は知られていなかった。本発明
の課題は、ＥＳ細胞以外のインビトロ細胞分化系におい
ても適用することができる、トラップされた遺伝子に対
応する対立遺伝子における正常な遺伝子（野生型遺伝
子）の発現機能が欠失又は抑制された細胞及びその調製
方法や、該細胞を用いるジーントラップ法や、該細胞の
調製に用いられるアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来のス
プライスアクセプター配列とβ−ｇｅｏ配列とを有する
プラスミド型ベクターのスプライスアクセプター配列の
上流に上記変異型ｌｏｘＰ配列を挿入したジーントラッ
プベクターと、上記変異型ｌｏｘＰ配列部位に内因性遺
伝子と逆方向に強力なプロモーターを挿入することがで
きるアンチセンスプロモーター導入ベクターとを作製
し、前記トラップベクターを用いることにより、効率よ
くトラップクローンを得ることができるばかりでなく、
トラップしたクローンのジーントラップベクターの挿入
が起こった変異遺伝子座の所定の位置にアンチセンスプ
ロモーターを挿入することによって、トラップされた遺
伝子に対するアンチセンスＲＮＡを強制的に転写させ、
かつ野生型遺伝子からの転写産物を破壊できることを見
い出し、本発明を完成するに至った。
プライスアクセプター配列とβ−ｇｅｏ配列とを有する
プラスミド型ベクターのスプライスアクセプター配列の
上流に上記変異型ｌｏｘＰ配列を挿入したジーントラッ
プベクターと、上記変異型ｌｏｘＰ配列部位に内因性遺
伝子と逆方向に強力なプロモーターを挿入することがで
きるアンチセンスプロモーター導入ベクターとを作製
し、前記トラップベクターを用いることにより、効率よ
くトラップクローンを得ることができるばかりでなく、
トラップしたクローンのジーントラップベクターの挿入
が起こった変異遺伝子座の所定の位置にアンチセンスプ
ロモーターを挿入することによって、トラップされた遺
伝子に対するアンチセンスＲＮＡを強制的に転写させ、
かつ野生型遺伝子からの転写産物を破壊できることを見
い出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】すなわち本発明は、ジーントラップベクタ
ーを細胞に導入し、挿入型遺伝子変異を有するトラップ
クローンを選別し、かかるトラップクローンのジーント
ラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の
位置に、アンチセンスプロモーター導入ベクターを用い
て、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿入するこ
とを特徴とする野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制
された細胞の調製方法（請求項１）や、ジーントラップ
ベクターが、スプライスアクセプター配列又はスプライ
スドナー配列を有することを特徴とする請求項１記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法（請求項２）や、ジーントラップベクターが、ス
プライスアクセプター配列の下流又はスプライスドナー
配列の上流に連結された選択マーカー遺伝子又はレポー
ター遺伝子を有することを特徴とする請求項２記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法（請求項３）や、ジーントラップベクターが、ＩＲ
ＥＳを介して、スプライスアクセプター配列の下流又は
スプライスドナー配列の上流に連結された選択マーカー
遺伝子又はレポーター遺伝子を有することを特徴とする
請求項３記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制
された細胞の調製方法（請求項４）や、選択マーカー遺
伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアト
キシン耐性遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子で
あることを特徴とする請求項３又は４記載の野生型遺伝
子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請
求項５）や、ジーントラップベクターが、リコンビナー
ゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型
逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項１〜５
のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑
制された細胞の調製方法（請求項６）や、１つの変異型
逆方向反復配列を、スプライスアクセプター配列の上流
域に有することを特徴とする請求項６記載の野生型遺伝
子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請
求項７）や、２つの変異型逆方向反復配列を、共にスプ
ライスアクセプター配列の上流域に有することを特徴と
する請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は
抑制された細胞の調製方法（請求項８）や、変異型逆方
向反復配列を、スプライスアクセプター配列の上流域
と、選択マーカー遺伝子の下流域にそれぞれ有すること
を特徴とする請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項９）や、変
異型逆方向反復配列が、同一又は互いに異なる変異型逆
方向反復配列であることを特徴とする請求項８又は９記
載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞
の調製方法（請求項１０）や、１つの変異型逆方向反復
配列と１つの野生型逆方向反復配列とを、順不同で共に
スプライスアクセプター配列の上流域に有することを特
徴とする請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失
又は抑制された細胞の調製方法（請求項１１）や、１つ
の変異型逆方向反復配列と１つの野生型逆方向反復配列
とを、それらのいずれか一方の配列をスプライスアクセ
プター配列の上流域に、他方の配列を選択マーカー遺伝
子の下流域に、有することを特徴とする請求項６記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法（請求項１２）や、アンチセンスプロモーター導
入ベクターが、ジーントラップベクターの挿入が起こっ
た変異遺伝子座の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向
にプロモーターを挿入することができる、リコンビナー
ゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型
逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項１〜１
２のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は
抑制された細胞の調製方法（請求項１３）や、内因性遺
伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域と下流
域に、互いに異なる変異型逆方向反復配列をそれぞれ有
することを特徴とする請求項１３記載の野生型遺伝子の
発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項
１４）や、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモー
ターの上流域と下流域に、同一の変異型逆方向反復配列
をそれぞれ有することを特徴とする請求項１３記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法（請求項１５）や、１つの変異型逆方向反復配列と
１つの野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一
方の配列を内因性遺伝子と逆方向に挿入されたプロモー
ターの上流域に、他方の配列を該プロモーターの下流域
に、有することを特徴とする請求項１３記載の野生型遺
伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項１６）や、変異型逆方向反復配列が、大腸菌Ｐ
１ファージ由来の野生型ｌｏｘＰ配列又は酵母サッカロ
ミセス・セレビッシェ由来の野生型ＦＲＴ配列を変異さ
せた変異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求
項６〜１６のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項１７）や、
変異型逆方向反復配列が、逆方向反復領域中に変異を有
する変異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求
項６〜１７のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項１８）や、
逆方向反復領域中に変異を有する変異型逆方向反復配列
が、配列番号２に示される塩基配列をもつｌｏｘ７１配
列及び／又は配列番号３に示される塩基配列をもつｌｏ
ｘ６６配列であることを特徴とする請求項１８記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法（請求項１９）や、変異型逆方向反復配列が、逆方
向反復領域間に存するスペーサー領域に変異を有する変
異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求項６〜
１７のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞の調製方法（請求項２０）や、内因性
遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの下流に、ジ
ーントラップベクターにおける選択マーカー遺伝子と異
なる選択マーカー遺伝子を連結することを特徴とする請
求項１〜２０のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能
が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項２１）
や、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの
下流に連結する選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシ
ン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２１記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法（請求項２２）や、アンチセンスプロモーター導
入ベクターが、ジーントラップベクターにおける選択マ
ーカー遺伝子、及び内因性遺伝子と逆方向に挿入される
プロモーターの下流に連結された選択マーカー遺伝子と
異なるネガティブ選択性選択マーカー遺伝子を、変異型
逆方向反復配列又は野生型逆方向反復配列を介して、内
因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域
に、該プロモーターと同方向又は逆方向に有することを
特徴とする請求項１３〜２２のいずれか記載の野生型遺
伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項２３）や、ネガティブ選択性選択マーカー遺伝
子が、ホスホグリセロキナーゼのプロモーターに連結さ
れたチミジンキナーゼ遺伝子又はジフテリアトキシン耐
性遺伝子であることを特徴とする請求項２３記載の野生
型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方
法（請求項２４）や、内因性遺伝子と逆方向に挿入され
るプロモーターが、ホスホグリセロキナーゼのプロモー
ターであることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか
記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細
胞の調製方法（請求項２５）や、変異遺伝子座の所定の
位置が、スプライスアクセプター配列の上流域であるこ
とを特徴とする請求項２〜２５のいずれか記載の野生型
遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項２６）や、リコンビナーゼを細胞内で発現させ
ることにより、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを
挿入することを特徴とする請求項１〜２６のいずれか記
載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞
の調製方法（請求項２７）や、細胞がＥＳ細胞であるこ
とを特徴とする請求項１〜２７のいずれか記載の野生型
遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項２８）に関する。
ーを細胞に導入し、挿入型遺伝子変異を有するトラップ
クローンを選別し、かかるトラップクローンのジーント
ラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の
位置に、アンチセンスプロモーター導入ベクターを用い
て、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿入するこ
とを特徴とする野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制
された細胞の調製方法（請求項１）や、ジーントラップ
ベクターが、スプライスアクセプター配列又はスプライ
スドナー配列を有することを特徴とする請求項１記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法（請求項２）や、ジーントラップベクターが、ス
プライスアクセプター配列の下流又はスプライスドナー
配列の上流に連結された選択マーカー遺伝子又はレポー
ター遺伝子を有することを特徴とする請求項２記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法（請求項３）や、ジーントラップベクターが、ＩＲ
ＥＳを介して、スプライスアクセプター配列の下流又は
スプライスドナー配列の上流に連結された選択マーカー
遺伝子又はレポーター遺伝子を有することを特徴とする
請求項３記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制
された細胞の調製方法（請求項４）や、選択マーカー遺
伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアト
キシン耐性遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子で
あることを特徴とする請求項３又は４記載の野生型遺伝
子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請
求項５）や、ジーントラップベクターが、リコンビナー
ゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型
逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項１〜５
のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑
制された細胞の調製方法（請求項６）や、１つの変異型
逆方向反復配列を、スプライスアクセプター配列の上流
域に有することを特徴とする請求項６記載の野生型遺伝
子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請
求項７）や、２つの変異型逆方向反復配列を、共にスプ
ライスアクセプター配列の上流域に有することを特徴と
する請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は
抑制された細胞の調製方法（請求項８）や、変異型逆方
向反復配列を、スプライスアクセプター配列の上流域
と、選択マーカー遺伝子の下流域にそれぞれ有すること
を特徴とする請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項９）や、変
異型逆方向反復配列が、同一又は互いに異なる変異型逆
方向反復配列であることを特徴とする請求項８又は９記
載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞
の調製方法（請求項１０）や、１つの変異型逆方向反復
配列と１つの野生型逆方向反復配列とを、順不同で共に
スプライスアクセプター配列の上流域に有することを特
徴とする請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失
又は抑制された細胞の調製方法（請求項１１）や、１つ
の変異型逆方向反復配列と１つの野生型逆方向反復配列
とを、それらのいずれか一方の配列をスプライスアクセ
プター配列の上流域に、他方の配列を選択マーカー遺伝
子の下流域に、有することを特徴とする請求項６記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法（請求項１２）や、アンチセンスプロモーター導
入ベクターが、ジーントラップベクターの挿入が起こっ
た変異遺伝子座の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向
にプロモーターを挿入することができる、リコンビナー
ゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型
逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項１〜１
２のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は
抑制された細胞の調製方法（請求項１３）や、内因性遺
伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域と下流
域に、互いに異なる変異型逆方向反復配列をそれぞれ有
することを特徴とする請求項１３記載の野生型遺伝子の
発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項
１４）や、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモー
ターの上流域と下流域に、同一の変異型逆方向反復配列
をそれぞれ有することを特徴とする請求項１３記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法（請求項１５）や、１つの変異型逆方向反復配列と
１つの野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一
方の配列を内因性遺伝子と逆方向に挿入されたプロモー
ターの上流域に、他方の配列を該プロモーターの下流域
に、有することを特徴とする請求項１３記載の野生型遺
伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項１６）や、変異型逆方向反復配列が、大腸菌Ｐ
１ファージ由来の野生型ｌｏｘＰ配列又は酵母サッカロ
ミセス・セレビッシェ由来の野生型ＦＲＴ配列を変異さ
せた変異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求
項６〜１６のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項１７）や、
変異型逆方向反復配列が、逆方向反復領域中に変異を有
する変異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求
項６〜１７のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項１８）や、
逆方向反復領域中に変異を有する変異型逆方向反復配列
が、配列番号２に示される塩基配列をもつｌｏｘ７１配
列及び／又は配列番号３に示される塩基配列をもつｌｏ
ｘ６６配列であることを特徴とする請求項１８記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法（請求項１９）や、変異型逆方向反復配列が、逆方
向反復領域間に存するスペーサー領域に変異を有する変
異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求項６〜
１７のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞の調製方法（請求項２０）や、内因性
遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの下流に、ジ
ーントラップベクターにおける選択マーカー遺伝子と異
なる選択マーカー遺伝子を連結することを特徴とする請
求項１〜２０のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能
が欠失又は抑制された細胞の調製方法（請求項２１）
や、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの
下流に連結する選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシ
ン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項２１記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法（請求項２２）や、アンチセンスプロモーター導
入ベクターが、ジーントラップベクターにおける選択マ
ーカー遺伝子、及び内因性遺伝子と逆方向に挿入される
プロモーターの下流に連結された選択マーカー遺伝子と
異なるネガティブ選択性選択マーカー遺伝子を、変異型
逆方向反復配列又は野生型逆方向反復配列を介して、内
因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域
に、該プロモーターと同方向又は逆方向に有することを
特徴とする請求項１３〜２２のいずれか記載の野生型遺
伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項２３）や、ネガティブ選択性選択マーカー遺伝
子が、ホスホグリセロキナーゼのプロモーターに連結さ
れたチミジンキナーゼ遺伝子又はジフテリアトキシン耐
性遺伝子であることを特徴とする請求項２３記載の野生
型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方
法（請求項２４）や、内因性遺伝子と逆方向に挿入され
るプロモーターが、ホスホグリセロキナーゼのプロモー
ターであることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか
記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細
胞の調製方法（請求項２５）や、変異遺伝子座の所定の
位置が、スプライスアクセプター配列の上流域であるこ
とを特徴とする請求項２〜２５のいずれか記載の野生型
遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項２６）や、リコンビナーゼを細胞内で発現させ
ることにより、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを
挿入することを特徴とする請求項１〜２６のいずれか記
載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞
の調製方法（請求項２７）や、細胞がＥＳ細胞であるこ
とを特徴とする請求項１〜２７のいずれか記載の野生型
遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法
（請求項２８）に関する。
【００１３】また本発明は、請求項１〜２８のいずれか
記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細
胞の調製方法により得られる、トラップされた遺伝子に
対するアンチセンスＲＮＡを転写することができる細胞
（請求項２９）に関する。
記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細
胞の調製方法により得られる、トラップされた遺伝子に
対するアンチセンスＲＮＡを転写することができる細胞
（請求項２９）に関する。
【００１４】また本発明は、ジーントラップベクターが
導入された、挿入型遺伝子変異を有するトラップクロー
ンの前記ジーントラップベクターの挿入が起こった変異
遺伝子座の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向に挿入
することができるプロモーターを有することを特徴とす
るアンチセンスプロモーター導入ベクター（請求項３
０）や、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配
列を変異させた変異型逆方向反復配列を有することを特
徴とする請求項３０記載のアンチセンスプロモーター導
入ベクター（請求項３１）や、内因性遺伝子と逆方向に
挿入されるプロモーターの上流域と下流域に、互いに異
なる変異型逆方向反復配列をそれぞれ有することを特徴
とする請求項３１記載のアンチセンスプロモーター導入
ベクター（請求項３２）や、内因性遺伝子と逆方向に挿
入されるプロモーターの上流域と下流域に、同一の変異
型逆方向反復配列をそれぞれ有することを特徴とする請
求項３１記載のアンチセンスプロモーター導入ベクター
（請求項３３）や、１つの変異型逆方向反復配列と１つ
の野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一方の
配列を内因性遺伝子と逆方向に挿入されたプロモーター
の上流域に、他方の配列を該プロモーターの下流域に、
有することを特徴とする請求項３１記載のアンチセンス
プロモーター導入ベクター（請求項３４）や、変異型逆
方向反復配列が、大腸菌Ｐ１ファージ由来の野生型ｌｏ
ｘＰ配列又は酵母サッカロミセス・セレビッシェ由来の
野生型ＦＲＴ配列を変異させた変異型逆方向反復配列で
あることを特徴とする請求項３１〜３４のいずれか記載
のアンチセンスプロモーター導入ベクター（請求項３
５）や、変異型逆方向反復配列が、逆方向反復領域中に
変異を有する変異型逆方向反復配列であることを特徴と
する請求項３１〜３５のいずれか記載のアンチセンスプ
ロモーター導入ベクター（請求項３６）や、逆方向反復
領域中に変異を有する変異型逆方向反復配列が、配列番
号２に示される塩基配列をもつｌｏｘ７１配列及び／又
は配列番号３に示される塩基配列をもつｌｏｘ６６配列
であることを特徴とする請求項３６記載のアンチセンス
プロモーター導入ベクター（請求項３７）や、変異型逆
方向反復配列が、逆方向反復領域間に存するスペーサー
領域に変異を有する変異型逆方向反復配列であることを
特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のアンチセ
ンスプロモーター導入ベクター（請求項３８）や、内因
性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの下流に、
ジーントラップベクターにおける選択マーカー遺伝子と
異なる選択マーカー遺伝子が連結されていることを特徴
とする請求項３０〜３８のいずれか記載のアンチセンス
プロモーター導入ベクター（請求項３９）や、内因性遺
伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの下流に連結さ
れている選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン耐性
遺伝子であることを特徴とする請求項３９記載のアンチ
センスプロモーター導入ベクター（請求項４０）や、変
異型逆方向反復配列又は野生型逆方向反復配列を介し
て、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの
上流域に、該プロモーターと同方向又は逆方向に該プロ
モーターとネガティブ選択性選択マーカー遺伝子を有す
ることを特徴とする請求項３０〜４０のいずれか記載の
アンチセンスプロモーター導入ベクター（請求項４１）
や、ネガティブ選択性選択マーカー遺伝子が、ホスホグ
リセロキナーゼのプロモーターに連結されたチミジンキ
ナーゼ遺伝子又はジフテリアトキシン耐性遺伝子である
ことを特徴とする請求項４１記載のアンチセンスプロモ
ーター導入ベクター（請求項４２）や、内因性遺伝子と
逆方向に挿入されるプロモーターが、ホスホグリセロキ
ナーゼのプロモーターであることを特徴とする請求項３
０〜４２のいずれか記載のアンチセンスプロモーター導
入ベクター（請求項４３）に関する。
導入された、挿入型遺伝子変異を有するトラップクロー
ンの前記ジーントラップベクターの挿入が起こった変異
遺伝子座の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向に挿入
することができるプロモーターを有することを特徴とす
るアンチセンスプロモーター導入ベクター（請求項３
０）や、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向反復配
列を変異させた変異型逆方向反復配列を有することを特
徴とする請求項３０記載のアンチセンスプロモーター導
入ベクター（請求項３１）や、内因性遺伝子と逆方向に
挿入されるプロモーターの上流域と下流域に、互いに異
なる変異型逆方向反復配列をそれぞれ有することを特徴
とする請求項３１記載のアンチセンスプロモーター導入
ベクター（請求項３２）や、内因性遺伝子と逆方向に挿
入されるプロモーターの上流域と下流域に、同一の変異
型逆方向反復配列をそれぞれ有することを特徴とする請
求項３１記載のアンチセンスプロモーター導入ベクター
（請求項３３）や、１つの変異型逆方向反復配列と１つ
の野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一方の
配列を内因性遺伝子と逆方向に挿入されたプロモーター
の上流域に、他方の配列を該プロモーターの下流域に、
有することを特徴とする請求項３１記載のアンチセンス
プロモーター導入ベクター（請求項３４）や、変異型逆
方向反復配列が、大腸菌Ｐ１ファージ由来の野生型ｌｏ
ｘＰ配列又は酵母サッカロミセス・セレビッシェ由来の
野生型ＦＲＴ配列を変異させた変異型逆方向反復配列で
あることを特徴とする請求項３１〜３４のいずれか記載
のアンチセンスプロモーター導入ベクター（請求項３
５）や、変異型逆方向反復配列が、逆方向反復領域中に
変異を有する変異型逆方向反復配列であることを特徴と
する請求項３１〜３５のいずれか記載のアンチセンスプ
ロモーター導入ベクター（請求項３６）や、逆方向反復
領域中に変異を有する変異型逆方向反復配列が、配列番
号２に示される塩基配列をもつｌｏｘ７１配列及び／又
は配列番号３に示される塩基配列をもつｌｏｘ６６配列
であることを特徴とする請求項３６記載のアンチセンス
プロモーター導入ベクター（請求項３７）や、変異型逆
方向反復配列が、逆方向反復領域間に存するスペーサー
領域に変異を有する変異型逆方向反復配列であることを
特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のアンチセ
ンスプロモーター導入ベクター（請求項３８）や、内因
性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの下流に、
ジーントラップベクターにおける選択マーカー遺伝子と
異なる選択マーカー遺伝子が連結されていることを特徴
とする請求項３０〜３８のいずれか記載のアンチセンス
プロモーター導入ベクター（請求項３９）や、内因性遺
伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの下流に連結さ
れている選択マーカー遺伝子が、ピューロマイシン耐性
遺伝子であることを特徴とする請求項３９記載のアンチ
センスプロモーター導入ベクター（請求項４０）や、変
異型逆方向反復配列又は野生型逆方向反復配列を介し
て、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの
上流域に、該プロモーターと同方向又は逆方向に該プロ
モーターとネガティブ選択性選択マーカー遺伝子を有す
ることを特徴とする請求項３０〜４０のいずれか記載の
アンチセンスプロモーター導入ベクター（請求項４１）
や、ネガティブ選択性選択マーカー遺伝子が、ホスホグ
リセロキナーゼのプロモーターに連結されたチミジンキ
ナーゼ遺伝子又はジフテリアトキシン耐性遺伝子である
ことを特徴とする請求項４１記載のアンチセンスプロモ
ーター導入ベクター（請求項４２）や、内因性遺伝子と
逆方向に挿入されるプロモーターが、ホスホグリセロキ
ナーゼのプロモーターであることを特徴とする請求項３
０〜４２のいずれか記載のアンチセンスプロモーター導
入ベクター（請求項４３）に関する。
【００１５】また本発明は、請求項３０〜４３のいずれ
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクターを用い
ることを特徴とするジーントラップ方法（請求項４４）
に関する。
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクターを用い
ることを特徴とするジーントラップ方法（請求項４４）
に関する。
【００１６】また本発明は、請求項３０〜４３のいずれ
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクターを用い
ることを特徴とする細胞内の特定遺伝子の発現を欠失又
は抑制する細胞の処理方法（請求項４５）に関する。
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクターを用い
ることを特徴とする細胞内の特定遺伝子の発現を欠失又
は抑制する細胞の処理方法（請求項４５）に関する。
【００１７】また本発明は、請求項３０〜４３のいずれ
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクターをＥＳ
細胞に導入し、該ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイク
ロインジェクションすることにより得られることを特徴
とする遺伝子の発現が欠失又は抑制されたノックアウト
様マウス（請求項４６）に関する。
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクターをＥＳ
細胞に導入し、該ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイク
ロインジェクションすることにより得られることを特徴
とする遺伝子の発現が欠失又は抑制されたノックアウト
様マウス（請求項４６）に関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明の野生型遺伝子の発現機能
が欠失又は抑制された細胞の調製方法としては、ジーン
トラップベクターを細胞に導入し、挿入型遺伝子変異を
有するトラップクローンを選別し、かかるトラップクロ
ーンのジーントラップベクターの挿入が起こった変異遺
伝子座の所定の位置に、アンチセンスプロモーター導入
ベクターを用いて、内因性遺伝子と逆方向にプロモータ
ーを挿入することができる方法であれば特に制限される
ものではなく、ここで野生型遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞とは、トラップされた遺伝子に対応す
る対立遺伝子における正常な遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞をいい、かかる発現機能の欠失又は抑
制は、アンチセンスプロモーターの転写産物（アンチセ
ンスＲＮＡ）と野生型遺伝子からの転写産物（センスＲ
ＮＡ）のハイブリダイズによりもたらされる。また、用
いる細胞としては特に制限されるものではなく、動植物
細胞等を例示することができる。動物細胞としてはＥＳ
細胞を好適に例示することができるが、本発明はＥＳ細
胞以外のインビトロ細胞分化系においても適用すること
ができるという特徴を有する。
が欠失又は抑制された細胞の調製方法としては、ジーン
トラップベクターを細胞に導入し、挿入型遺伝子変異を
有するトラップクローンを選別し、かかるトラップクロ
ーンのジーントラップベクターの挿入が起こった変異遺
伝子座の所定の位置に、アンチセンスプロモーター導入
ベクターを用いて、内因性遺伝子と逆方向にプロモータ
ーを挿入することができる方法であれば特に制限される
ものではなく、ここで野生型遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞とは、トラップされた遺伝子に対応す
る対立遺伝子における正常な遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞をいい、かかる発現機能の欠失又は抑
制は、アンチセンスプロモーターの転写産物（アンチセ
ンスＲＮＡ）と野生型遺伝子からの転写産物（センスＲ
ＮＡ）のハイブリダイズによりもたらされる。また、用
いる細胞としては特に制限されるものではなく、動植物
細胞等を例示することができる。動物細胞としてはＥＳ
細胞を好適に例示することができるが、本発明はＥＳ細
胞以外のインビトロ細胞分化系においても適用すること
ができるという特徴を有する。
【００１９】上記ジーントラップベクターとしては、細
胞に導入した場合に挿入型遺伝子変異を生起することが
できるものであれば特に制限されるものではないが、ス
プライスアクセプター配列を有するジーントラップベク
ターが好ましく、かかるスプライスアクセプター配列の
下流に選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子が連結
された、特にＩＲＥＳ（internal ribosomal entry zit
e）を介して選択マーカー遺伝子が連結されたジーント
ラップベクターがより好ましい。また、強力なプロモー
ターに連結された選択マーカー遺伝子の下流にスプライ
スドナー配列を持つベクターも好ましい。上記スプライ
スアクセプター配列としては、その５′末端側でスプラ
イス受容部位を形成することができるものであればどの
ようなＤＮＡ配列でもよく、例えばエングレイルド−２
(Engrailed-2)のスプライスアクセプター配列を具体的
に挙げることができ、スプライスアクセプター配列を有
することにより、ベクター挿入部位の３′末端側エクソ
ンから選択マーカー遺伝子へのスプライシングがおこ
り、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子が内因性
遺伝子断片との融合遺伝子として転写されうる。また、
上記スプライスドナー配列としてはその３′末端側でス
プライス供与をすることができるものであればどのよう
なＤＮＡ配列でもよく、例えばマウスｈｐｒｔ（hypoxa
nthine phosphoribosyl transferase）遺伝子のスプラ
イスドナー配列を具体的に挙げることができ、スプライ
スドナー配列を有することにより、ベクター挿入部位の
３′末端側の内因性エクソンへのスプライシングがおこ
り、選択マーカー遺伝子が内因性遺伝子断片との融合遺
伝子として転写されうる。また上記選択マーカー遺伝子
としては、ジーントラップクローンをスクリーニングす
ることができるものであればどのようなものでもよく、
例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアト
キシン耐性遺伝子、β−ｇａｌとｎｅｏRの融合遺伝子
（β−ｇｅｏ）を具体的に挙げることができる。そし
て、ＩＲＥＳを介してかかる選択マーカー遺伝子を連結
しておくと、ＩＲＥＳの下流のＡＵＧが開始コドンとな
って翻訳される。
胞に導入した場合に挿入型遺伝子変異を生起することが
できるものであれば特に制限されるものではないが、ス
プライスアクセプター配列を有するジーントラップベク
ターが好ましく、かかるスプライスアクセプター配列の
下流に選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子が連結
された、特にＩＲＥＳ（internal ribosomal entry zit
e）を介して選択マーカー遺伝子が連結されたジーント
ラップベクターがより好ましい。また、強力なプロモー
ターに連結された選択マーカー遺伝子の下流にスプライ
スドナー配列を持つベクターも好ましい。上記スプライ
スアクセプター配列としては、その５′末端側でスプラ
イス受容部位を形成することができるものであればどの
ようなＤＮＡ配列でもよく、例えばエングレイルド−２
(Engrailed-2)のスプライスアクセプター配列を具体的
に挙げることができ、スプライスアクセプター配列を有
することにより、ベクター挿入部位の３′末端側エクソ
ンから選択マーカー遺伝子へのスプライシングがおこ
り、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子が内因性
遺伝子断片との融合遺伝子として転写されうる。また、
上記スプライスドナー配列としてはその３′末端側でス
プライス供与をすることができるものであればどのよう
なＤＮＡ配列でもよく、例えばマウスｈｐｒｔ（hypoxa
nthine phosphoribosyl transferase）遺伝子のスプラ
イスドナー配列を具体的に挙げることができ、スプライ
スドナー配列を有することにより、ベクター挿入部位の
３′末端側の内因性エクソンへのスプライシングがおこ
り、選択マーカー遺伝子が内因性遺伝子断片との融合遺
伝子として転写されうる。また上記選択マーカー遺伝子
としては、ジーントラップクローンをスクリーニングす
ることができるものであればどのようなものでもよく、
例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐
性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアト
キシン耐性遺伝子、β−ｇａｌとｎｅｏRの融合遺伝子
（β−ｇｅｏ）を具体的に挙げることができる。そし
て、ＩＲＥＳを介してかかる選択マーカー遺伝子を連結
しておくと、ＩＲＥＳの下流のＡＵＧが開始コドンとな
って翻訳される。
【００２０】また、本発明におけるジーントラップベク
ターとしては、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向
反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有するも
のが、アンチセンスプロモーター導入ベクターと協働し
て、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを効率よく挿
入することができるので望ましい。かかる変異型逆方向
反復配列を有するジーントラップベクターとしては、１
つの変異型逆方向反復配列を、スプライスアクセプター
配列の上流域に有するベクターや、同一又は互いに異な
る２つの変異型逆方向反復配列を、共にスプライスアク
セプター配列の上流域に有するベクターや、同一又は互
いに異なる変異型逆方向反復配列を、スプライスアクセ
プター配列の上流域と、選択マーカー遺伝子の下流域に
それぞれ有するベクターや、１つの変異型逆方向反復配
列と１つの野生型逆方向反復配列とを、順不同で共にス
プライスアクセプター配列の上流域に有するベクター
や、１つの変異型逆方向反復配列と１つの野生型逆方向
反復配列とを、それらのいずれか一方の配列をスプライ
スアクセプター配列の上流域に、他方の配列を選択マー
カー遺伝子の下流域に有するベクターを例示することが
できる。
ターとしては、リコンビナーゼが認識する野生型逆方向
反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有するも
のが、アンチセンスプロモーター導入ベクターと協働し
て、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを効率よく挿
入することができるので望ましい。かかる変異型逆方向
反復配列を有するジーントラップベクターとしては、１
つの変異型逆方向反復配列を、スプライスアクセプター
配列の上流域に有するベクターや、同一又は互いに異な
る２つの変異型逆方向反復配列を、共にスプライスアク
セプター配列の上流域に有するベクターや、同一又は互
いに異なる変異型逆方向反復配列を、スプライスアクセ
プター配列の上流域と、選択マーカー遺伝子の下流域に
それぞれ有するベクターや、１つの変異型逆方向反復配
列と１つの野生型逆方向反復配列とを、順不同で共にス
プライスアクセプター配列の上流域に有するベクター
や、１つの変異型逆方向反復配列と１つの野生型逆方向
反復配列とを、それらのいずれか一方の配列をスプライ
スアクセプター配列の上流域に、他方の配列を選択マー
カー遺伝子の下流域に有するベクターを例示することが
できる。
【００２１】上記リコンビナーゼが認識する野生型逆方
向反復配列としては、バクテリオファージＰ１のリコン
ビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列や、酵母サッカ
ロミセス・セレビッシェのＦＬＰリコンビナーゼが認識
するＦＲＴ配列を例示することができ、またかかる野生
型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列と
は、野生型逆方向反復配列における塩基が１又は２以上
置換、欠失、付加等の変異を受け、その変異によりリコ
ンビナーゼによる特異的ＤＮＡ組換え反応における基質
特異性が変化する配列をいい、かかる変異型逆方向反復
配列としては、配列番号１に示される野生型ｌｏｘＰ配
列の逆方向反復配列領域の塩基配列の一部を他の塩基に
置換した配列番号２に示される変異型ｌｏｘＰ配列を有
するｌｏｘ７１、配列番号３に示される変異型ｌｏｘＰ
配列を有するｌｏｘ６６（Nucleic Acids Research,199
7,Vol.25,No.4,868-872）や、上記野生型ｌｏｘＰ配列
のスペーサー領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換し
た変異型ｌｏｘＰ配列（特開平１１−１９６８８０号公
報）や、配列番号４に示される野生型ＦＲＴ配列の逆方
向反復配列領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換した
配列番号５に示される変異型ＦＲＴ配列（J.Mol.Biol.
(1998)284,363-384）等を具体的に例示することができ
る。
向反復配列としては、バクテリオファージＰ１のリコン
ビナーゼＣｒｅが認識するｌｏｘＰ配列や、酵母サッカ
ロミセス・セレビッシェのＦＬＰリコンビナーゼが認識
するＦＲＴ配列を例示することができ、またかかる野生
型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列と
は、野生型逆方向反復配列における塩基が１又は２以上
置換、欠失、付加等の変異を受け、その変異によりリコ
ンビナーゼによる特異的ＤＮＡ組換え反応における基質
特異性が変化する配列をいい、かかる変異型逆方向反復
配列としては、配列番号１に示される野生型ｌｏｘＰ配
列の逆方向反復配列領域の塩基配列の一部を他の塩基に
置換した配列番号２に示される変異型ｌｏｘＰ配列を有
するｌｏｘ７１、配列番号３に示される変異型ｌｏｘＰ
配列を有するｌｏｘ６６（Nucleic Acids Research,199
7,Vol.25,No.4,868-872）や、上記野生型ｌｏｘＰ配列
のスペーサー領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換し
た変異型ｌｏｘＰ配列（特開平１１−１９６８８０号公
報）や、配列番号４に示される野生型ＦＲＴ配列の逆方
向反復配列領域の塩基配列の一部を他の塩基に置換した
配列番号５に示される変異型ＦＲＴ配列（J.Mol.Biol.
(1998)284,363-384）等を具体的に例示することができ
る。
【００２２】本発明のアンチセンスプロモーター導入ベ
クターとしては、ジーントラップベクターが導入され
た、挿入型遺伝子変異を有するトラップクローンの前記
ジーントラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座
の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向に挿入すること
ができるプロモーターを有するベクターであれば特に制
限されるものではないが、リコンビナーゼが認識する野
生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列
を有するベクターが好ましい。かかる変異型逆方向反復
配列を有するアンチセンスプロモーター導入ベクターと
しては、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモータ
ーの上流域と下流域に、互いに異なるあるいは同一の変
異型逆方向反復配列をそれぞれ有するベクターや、１つ
の変異型逆方向反復配列と１つの野生型逆方向反復配列
とを、それらのいずれか一方の配列を内因性遺伝子と逆
方向に挿入されたプロモーターの上流域に、他方の配列
を該プロモーターの下流域に有するベクターを例示する
ことができる。
クターとしては、ジーントラップベクターが導入され
た、挿入型遺伝子変異を有するトラップクローンの前記
ジーントラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座
の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向に挿入すること
ができるプロモーターを有するベクターであれば特に制
限されるものではないが、リコンビナーゼが認識する野
生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列
を有するベクターが好ましい。かかる変異型逆方向反復
配列を有するアンチセンスプロモーター導入ベクターと
しては、内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモータ
ーの上流域と下流域に、互いに異なるあるいは同一の変
異型逆方向反復配列をそれぞれ有するベクターや、１つ
の変異型逆方向反復配列と１つの野生型逆方向反復配列
とを、それらのいずれか一方の配列を内因性遺伝子と逆
方向に挿入されたプロモーターの上流域に、他方の配列
を該プロモーターの下流域に有するベクターを例示する
ことができる。
【００２３】また、本発明のアンチセンスプロモーター
導入ベクターとして、内因性遺伝子と逆方向に挿入され
るプロモーターの下流に、ジーントラップベクターにお
ける選択マーカー遺伝子と異なる選択マーカー遺伝子が
連結されているものが、トラップクローンのジーントラ
ップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位
置へのアンチセンスプロモーターの導入を確認すること
ができることから好ましく、かかる選択マーカー遺伝子
としては特に制限されるものではないが、例えばピュー
ロマイシン耐性遺伝子を例示することができる。さら
に、アンチセンスプロモーター導入ベクターに、ジーン
トラップベクターにおける選択マーカー遺伝子や上記プ
ロモーターの下流に連結された選択マーカー遺伝子と異
なるネガティブ選択性選択マーカー遺伝子を、変異型逆
方向反復配列又は野生型逆方向反復配列を介して、内因
性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域
に、該プロモーターと同方向又は逆方向に配置しておく
ことが、トラップクローンのジーントラップベクターの
挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置へのアンチセ
ンスプロモーターの導入をより一層正確に確認すること
ができることから好ましく、かかるネガティブ選択性選
択マーカー遺伝子としては特に制限されるものではない
が、例えばホスホグリセロキナーゼのプロモーターに連
結されたチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン
耐性遺伝子等を用いることにより、リコンビナーゼの作
用を受けることなく挿入されたクローンをガンシクロビ
アで排除することができる。
導入ベクターとして、内因性遺伝子と逆方向に挿入され
るプロモーターの下流に、ジーントラップベクターにお
ける選択マーカー遺伝子と異なる選択マーカー遺伝子が
連結されているものが、トラップクローンのジーントラ
ップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位
置へのアンチセンスプロモーターの導入を確認すること
ができることから好ましく、かかる選択マーカー遺伝子
としては特に制限されるものではないが、例えばピュー
ロマイシン耐性遺伝子を例示することができる。さら
に、アンチセンスプロモーター導入ベクターに、ジーン
トラップベクターにおける選択マーカー遺伝子や上記プ
ロモーターの下流に連結された選択マーカー遺伝子と異
なるネガティブ選択性選択マーカー遺伝子を、変異型逆
方向反復配列又は野生型逆方向反復配列を介して、内因
性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域
に、該プロモーターと同方向又は逆方向に配置しておく
ことが、トラップクローンのジーントラップベクターの
挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置へのアンチセ
ンスプロモーターの導入をより一層正確に確認すること
ができることから好ましく、かかるネガティブ選択性選
択マーカー遺伝子としては特に制限されるものではない
が、例えばホスホグリセロキナーゼのプロモーターに連
結されたチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン
耐性遺伝子等を用いることにより、リコンビナーゼの作
用を受けることなく挿入されたクローンをガンシクロビ
アで排除することができる。
【００２４】また、本発明のアンチセンスプロモーター
導入ベクターにおける、内因性遺伝子と逆方向に挿入さ
れるプロモーターとしては、トラップクローンのジーン
トラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定
の位置から５′側に位置する、トラップジーンのアンチ
センスＲＮＡを転写しうるものであれば特に制限される
ものではないが、プロモーター作用の強力なものが好ま
しい。かかる強力なプロモーターとしては、マウスのホ
スホグリセロキナーゼのプロモーター、ＲＮＡポリメレ
ースIIプロモーター、ＳＶ４０の前期プロモーター、Ｓ
Ｖ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの主要後期
プロモーター、メタロチオネインプロモーター、レトロ
ウイルスのＬＴＲ、ヘルペスシンプレックスウイルスの
チミジンキナーゼのプロモーター等を例示することがで
きる。また、上記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓ
Ａ５８のラージＴ抗原遺伝子のプロモーターなどスイッ
チング機能を有するプロモーターを用いることにより、
トラップジーンの発現を制御することができる。さら
に、プロモーターの上流にエンハンサーを設けておくこ
ともできる。
導入ベクターにおける、内因性遺伝子と逆方向に挿入さ
れるプロモーターとしては、トラップクローンのジーン
トラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定
の位置から５′側に位置する、トラップジーンのアンチ
センスＲＮＡを転写しうるものであれば特に制限される
ものではないが、プロモーター作用の強力なものが好ま
しい。かかる強力なプロモーターとしては、マウスのホ
スホグリセロキナーゼのプロモーター、ＲＮＡポリメレ
ースIIプロモーター、ＳＶ４０の前期プロモーター、Ｓ
Ｖ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの主要後期
プロモーター、メタロチオネインプロモーター、レトロ
ウイルスのＬＴＲ、ヘルペスシンプレックスウイルスの
チミジンキナーゼのプロモーター等を例示することがで
きる。また、上記ＳＶ４０の温度感受性突然変異株ｔｓ
Ａ５８のラージＴ抗原遺伝子のプロモーターなどスイッ
チング機能を有するプロモーターを用いることにより、
トラップジーンの発現を制御することができる。さら
に、プロモーターの上流にエンハンサーを設けておくこ
ともできる。
【００２５】本発明における、トラップクローンのジー
ントラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所
定の位置としては、アンチセンスプロモーター導入ベク
ターを用いて内因性遺伝子と逆方向に挿入したプロモー
ターが、トラップジーンのアンチセンスＲＮＡを転写し
うる位置であれば特に制限されるものではないが、スプ
ライスアクセプター配列の上流域であることが好まし
い。また、かかるジーントラップベクターの挿入が起こ
った変異遺伝子座の所定の位置に前記プロモーターを挿
入方法としては、公知のＤＮＡ挿入技術であれば特に制
限なく使用できるが、ジーントラップベクターに変異型
逆方向反復配列が存する場合の該プロモーターの挿入に
際してはリコンビナーゼを用いることが好ましく、かか
るリコンビナーゼはリコンビナーゼ遺伝子発現ベクター
等を用いて発現させることにより、細胞内に存在せしめ
ることができる。
ントラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座の所
定の位置としては、アンチセンスプロモーター導入ベク
ターを用いて内因性遺伝子と逆方向に挿入したプロモー
ターが、トラップジーンのアンチセンスＲＮＡを転写し
うる位置であれば特に制限されるものではないが、スプ
ライスアクセプター配列の上流域であることが好まし
い。また、かかるジーントラップベクターの挿入が起こ
った変異遺伝子座の所定の位置に前記プロモーターを挿
入方法としては、公知のＤＮＡ挿入技術であれば特に制
限なく使用できるが、ジーントラップベクターに変異型
逆方向反復配列が存する場合の該プロモーターの挿入に
際してはリコンビナーゼを用いることが好ましく、かか
るリコンビナーゼはリコンビナーゼ遺伝子発現ベクター
等を用いて発現させることにより、細胞内に存在せしめ
ることができる。
【００２６】次に、本発明の野生型遺伝子の発現機能が
欠失又は抑制された細胞の調製方法は、以下のように行
われる。まず前記ジーントラップベクターを細胞に導入
し、該ベクターが細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた挿
入型遺伝子変異を有するトラップクローンを選択マーカ
ー遺伝子の発現により選別する。かかるトラップクロー
ンにアンチセンスプロモーター導入ベクターとリコンビ
ナーゼＣｒｅ発現ベクターを導入し、ジーントラップベ
クターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置に、
内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿入する。動物
細胞に環状ＤＮＡ分子を導入する方法は、一般的に用い
られている方法を使用することができる。上記ベクター
類の細胞への導入方法としては特に制限されるものでは
なく、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カル
シウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェ
クション法、遺伝子銃などの公知の方法を用いることが
できる。上記アンチセンスプロモーターの導入につい
て、図１〜８を参照しながら具体的に説明するが、図１
〜８においては、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）
の下流にＩＲＥＳを介して選択マーカー遺伝子β−ｇｅ
ｏが連結されたジーントラップベクターの挿入がエクソ
ン３（Ｅ３）の下流に起こった変異遺伝子座と、その下
流にピューロマイシン耐性遺伝子が結合されたホスホグ
リセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ−ＰｕｒｏＲ）及
びホスホグリセロキナーゼプロモーターの下流に連結さ
れたチミジンキナーゼ遺伝子及びポリＡ（ＰＧＫ−ｔｋ
−ｐＡ）を有するアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーを用いたアンチセンスプロモーターの導入が模式的に
示されている。
欠失又は抑制された細胞の調製方法は、以下のように行
われる。まず前記ジーントラップベクターを細胞に導入
し、該ベクターが細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた挿
入型遺伝子変異を有するトラップクローンを選択マーカ
ー遺伝子の発現により選別する。かかるトラップクロー
ンにアンチセンスプロモーター導入ベクターとリコンビ
ナーゼＣｒｅ発現ベクターを導入し、ジーントラップベ
クターの挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置に、
内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿入する。動物
細胞に環状ＤＮＡ分子を導入する方法は、一般的に用い
られている方法を使用することができる。上記ベクター
類の細胞への導入方法としては特に制限されるものでは
なく、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カル
シウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェ
クション法、遺伝子銃などの公知の方法を用いることが
できる。上記アンチセンスプロモーターの導入につい
て、図１〜８を参照しながら具体的に説明するが、図１
〜８においては、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）
の下流にＩＲＥＳを介して選択マーカー遺伝子β−ｇｅ
ｏが連結されたジーントラップベクターの挿入がエクソ
ン３（Ｅ３）の下流に起こった変異遺伝子座と、その下
流にピューロマイシン耐性遺伝子が結合されたホスホグ
リセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ−ＰｕｒｏＲ）及
びホスホグリセロキナーゼプロモーターの下流に連結さ
れたチミジンキナーゼ遺伝子及びポリＡ（ＰＧＫ−ｔｋ
−ｐＡ）を有するアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーを用いたアンチセンスプロモーターの導入が模式的に
示されている。
【００２７】図１には、１つの変異型逆方向反復配列
（ｌｏｘ７１）をスプライスアクセプター配列の上流域
に有するジーントラップベクターと、アンチセンスプロ
モーターの上流域と下流域に同一の変異型逆方向反復配
列（ｌｏｘ６６）をそれぞれ有するアンチセンスプロモ
ーター導入ベクターとを用いた場合が示されており、図
２には１つの変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ６６）をス
プライスアクセプター配列の上流域に有するジーントラ
ップベクターと、アンチセンスプロモーターの上流域と
下流域に同一の変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ７１）を
それぞれ有するアンチセンスプロモーター導入ベクター
とを用いた場合が示されている。
（ｌｏｘ７１）をスプライスアクセプター配列の上流域
に有するジーントラップベクターと、アンチセンスプロ
モーターの上流域と下流域に同一の変異型逆方向反復配
列（ｌｏｘ６６）をそれぞれ有するアンチセンスプロモ
ーター導入ベクターとを用いた場合が示されており、図
２には１つの変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ６６）をス
プライスアクセプター配列の上流域に有するジーントラ
ップベクターと、アンチセンスプロモーターの上流域と
下流域に同一の変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ７１）を
それぞれ有するアンチセンスプロモーター導入ベクター
とを用いた場合が示されている。
【００２８】また、図３には、互いに異なる変異型逆方
向反復配列（ｌｏｘ６６とｌｏｘ７１）をスプライスア
クセプター配列の上流域に有するジーントラップベクタ
ーと、アンチセンスプロモーターの上流域と下流域に互
いに異なる変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ７１とｌｏｘ
６６）をそれぞれ有するアンチセンスプロモーター導入
ベクターとを用いた場合が示されており、図４には、２
つの変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ７１）をスプライス
アクセプター配列の上流域に有するジーントラップベク
ターと、アンチセンスプロモーターの上流域と下流域に
同一の変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ６６）をそれぞれ
有するアンチセンスプロモーター導入ベクターとを用い
た場合が示されており、図５には、変異型逆方向反復配
列（ｌｏｘ７１）をスプライスアクセプター配列の上流
域と選択マーカー遺伝子の下流域にそれぞれ有するジー
ントラップベクターと、アンチセンスプロモーターの上
流域と下流域に同一の変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ６
６）をそれぞれ有するアンチセンスプロモーター導入ベ
クターとを用いた場合が示されている。
向反復配列（ｌｏｘ６６とｌｏｘ７１）をスプライスア
クセプター配列の上流域に有するジーントラップベクタ
ーと、アンチセンスプロモーターの上流域と下流域に互
いに異なる変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ７１とｌｏｘ
６６）をそれぞれ有するアンチセンスプロモーター導入
ベクターとを用いた場合が示されており、図４には、２
つの変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ７１）をスプライス
アクセプター配列の上流域に有するジーントラップベク
ターと、アンチセンスプロモーターの上流域と下流域に
同一の変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ６６）をそれぞれ
有するアンチセンスプロモーター導入ベクターとを用い
た場合が示されており、図５には、変異型逆方向反復配
列（ｌｏｘ７１）をスプライスアクセプター配列の上流
域と選択マーカー遺伝子の下流域にそれぞれ有するジー
ントラップベクターと、アンチセンスプロモーターの上
流域と下流域に同一の変異型逆方向反復配列（ｌｏｘ６
６）をそれぞれ有するアンチセンスプロモーター導入ベ
クターとを用いた場合が示されている。
【００２９】図６には、互いに異なる変異型逆方向反復
配列（スペーサー領域が変異したｌｏｘＰ）をスプライ
スアクセプター配列の上流域と選択マーカー遺伝子の下
流域にそれぞれ有するジーントラップベクターと、アン
チセンスプロモーターの上流域と下流域に互いに異なる
変異型逆方向反復配列（スペーサー領域が変異したｌｏ
ｘＰ）をそれぞれ有するアンチセンスプロモーター導入
ベクターとを用いた場合が示されており、図７には、野
生型逆方向反復配列（ｌｏｘＰ）と変異型逆方向反復配
列（スペーサー領域が変異したｌｏｘＰ）をスプライス
アクセプター配列の上流域に共に有するジーントラップ
ベクターと、アンチセンスプロモーターの上流域に野生
型逆方向反復配列（ｌｏｘＰ）と下流域に変異型逆方向
反復配列（スペーサー領域が変異したｌｏｘＰ）をそれ
ぞれ有するアンチセンスプロモーター導入ベクターとを
用いた場合が示されており、図８には、野生型逆方向反
復配列（ｌｏｘＰ）と変異型逆方向反復配列（スペーサ
ー領域が変異したｌｏｘＰ）をスプライスアクセプター
配列の上流域と選択マーカー遺伝子の下流域にそれぞれ
有するジーントラップベクターと、アンチセンスプロモ
ーターの上流域に野生型逆方向反復配列（ｌｏｘＰ）と
下流域に変異型逆方向反復配列（スペーサー領域が変異
したｌｏｘＰ）をそれぞれ有するアンチセンスプロモー
ター導入ベクターとを用いた場合が示されている。
配列（スペーサー領域が変異したｌｏｘＰ）をスプライ
スアクセプター配列の上流域と選択マーカー遺伝子の下
流域にそれぞれ有するジーントラップベクターと、アン
チセンスプロモーターの上流域と下流域に互いに異なる
変異型逆方向反復配列（スペーサー領域が変異したｌｏ
ｘＰ）をそれぞれ有するアンチセンスプロモーター導入
ベクターとを用いた場合が示されており、図７には、野
生型逆方向反復配列（ｌｏｘＰ）と変異型逆方向反復配
列（スペーサー領域が変異したｌｏｘＰ）をスプライス
アクセプター配列の上流域に共に有するジーントラップ
ベクターと、アンチセンスプロモーターの上流域に野生
型逆方向反復配列（ｌｏｘＰ）と下流域に変異型逆方向
反復配列（スペーサー領域が変異したｌｏｘＰ）をそれ
ぞれ有するアンチセンスプロモーター導入ベクターとを
用いた場合が示されており、図８には、野生型逆方向反
復配列（ｌｏｘＰ）と変異型逆方向反復配列（スペーサ
ー領域が変異したｌｏｘＰ）をスプライスアクセプター
配列の上流域と選択マーカー遺伝子の下流域にそれぞれ
有するジーントラップベクターと、アンチセンスプロモ
ーターの上流域に野生型逆方向反復配列（ｌｏｘＰ）と
下流域に変異型逆方向反復配列（スペーサー領域が変異
したｌｏｘＰ）をそれぞれ有するアンチセンスプロモー
ター導入ベクターとを用いた場合が示されている。
【００３０】また、本発明のアンチセンスプロモーター
導入ベクターを用いることにより、特に前記ジーントラ
ップベクターと本発明のアンチセンスプロモーター導入
ベクターとからなるアンチセンス型ジーントラップベク
ターを用いることにより、細胞内の特定遺伝子の発現を
欠失又は抑制することが可能となる結果、機能的なスク
リーニングを行うことができ、分化等に必須の遺伝子を
従前のノックアウトマウス等のホモ接合体を用いること
なく同定することが可能となる。さらに、上記アンチセ
ンス型ジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、該
ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクショ
ンすることにより、トラップジーンの発現が欠失又は抑
制されたノックアウト様マウスを創製することができ
る。以上のことからわかるように、本発明により調製さ
れるＥＳ細胞をはじめとする細胞株やマウス個体はヒト
疾患モデルの生物材料として利用することができ、また
本発明の細胞の調製方法をヒト細胞に適用すると、特定
の遺伝子の発現を抑制し、また同時に他の遺伝子を発現
させることができることから、体細胞の遺伝子治療への
応用が期待できる。
導入ベクターを用いることにより、特に前記ジーントラ
ップベクターと本発明のアンチセンスプロモーター導入
ベクターとからなるアンチセンス型ジーントラップベク
ターを用いることにより、細胞内の特定遺伝子の発現を
欠失又は抑制することが可能となる結果、機能的なスク
リーニングを行うことができ、分化等に必須の遺伝子を
従前のノックアウトマウス等のホモ接合体を用いること
なく同定することが可能となる。さらに、上記アンチセ
ンス型ジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、該
ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクショ
ンすることにより、トラップジーンの発現が欠失又は抑
制されたノックアウト様マウスを創製することができ
る。以上のことからわかるように、本発明により調製さ
れるＥＳ細胞をはじめとする細胞株やマウス個体はヒト
疾患モデルの生物材料として利用することができ、また
本発明の細胞の調製方法をヒト細胞に適用すると、特定
の遺伝子の発現を抑制し、また同時に他の遺伝子を発現
させることができることから、体細胞の遺伝子治療への
応用が期待できる。
【００３１】
【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明をさらに具
体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施
例により限定されるものではない。 実施例１（ジーントラップベクターの作製） 熊本大学の山村教授から分与を受けた、合成ｌｏｘ７１
配列を含むプラスミドpBluescript(pBS)-SK-（Nucleic
Acids Research,1997,Vol.25,No.4,868-872）のSma I−
Not I部位間に、マウスのエングレイルド２遺伝子（Ｅ
ｎ２）の約０．４ｋｂBamH I−Not I断片（１stイント
ロンの一部と２ndエクソンの一部とを含む）を挿入し
た。このスプライスアクセプター（ＳＡ）を含むプラス
ミドplox71SAのNot I部位に、プラスミドpIRES beta-ge
oの約５．５ｋｂNot I− Xho I断片にXho I− Not Iア
ダプター（tcg agc ggc cgc）を付加した断片を挿入し
た。このプラスミドplox71 SA IRES beta-geoの約６ｋ
ｂSal I断片をpBluescript II（Stratagene社製）のSal
I−Xho I部位間に挿入した。このプラスミドp Sal I/l
ox71 SA IRES beta-geoのSal I部位に、プラスミドpT1
(Sal I)の約１．２ｋｂSal I− BamH IにBamH I−Xho I
アダプター（gat ccc gct cga gcg & ccg ctc gag cg
g）を付加した断片を挿入し、ジーントラップベクターp
En/lox71/SA IRESbeta-geo/pAを得た。このジーントラ
ップベクター（図９ａ）の配列の一部を配列番号６に示
す。
体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施
例により限定されるものではない。 実施例１（ジーントラップベクターの作製） 熊本大学の山村教授から分与を受けた、合成ｌｏｘ７１
配列を含むプラスミドpBluescript(pBS)-SK-（Nucleic
Acids Research,1997,Vol.25,No.4,868-872）のSma I−
Not I部位間に、マウスのエングレイルド２遺伝子（Ｅ
ｎ２）の約０．４ｋｂBamH I−Not I断片（１stイント
ロンの一部と２ndエクソンの一部とを含む）を挿入し
た。このスプライスアクセプター（ＳＡ）を含むプラス
ミドplox71SAのNot I部位に、プラスミドpIRES beta-ge
oの約５．５ｋｂNot I− Xho I断片にXho I− Not Iア
ダプター（tcg agc ggc cgc）を付加した断片を挿入し
た。このプラスミドplox71 SA IRES beta-geoの約６ｋ
ｂSal I断片をpBluescript II（Stratagene社製）のSal
I−Xho I部位間に挿入した。このプラスミドp Sal I/l
ox71 SA IRES beta-geoのSal I部位に、プラスミドpT1
(Sal I)の約１．２ｋｂSal I− BamH IにBamH I−Xho I
アダプター（gat ccc gct cga gcg & ccg ctc gag cg
g）を付加した断片を挿入し、ジーントラップベクターp
En/lox71/SA IRESbeta-geo/pAを得た。このジーントラ
ップベクター（図９ａ）の配列の一部を配列番号６に示
す。
【００３２】実施例２（アンチセンスプロモーター導入
ベクターの作製） プラスミドpCre−Pacの１．７ｋｂSal I断片をpBluescr
ipt II（ストラタジーン社製）のSal I部位に挿入し
た。このプラスミドpBSpuroの１．２ｋｂSal I−Sma I
断片を熊本大学の山村教授から分与を受けた、合成ｌｏ
ｘ６６配列を含むプラスミドplox66のXba I−Sma I部位
間に挿入し、プラスミドplox66 PGK-puroを得た。一
方、プラスミドpGK-tkの２．８ｋｂEcoR I−Sal I断片
をplox66 Sma I−Xba I部位間に挿入した。このプラス
ミドplox66 PGK-tkのHind III−Xho I部位間にプラスミ
ドplox66 PGK-puroの３．０ｋｂNot I−Sal I断片を挿
入し、アンチセンスプロモーター導入ベクター、plox66
PGK-puro-tkを作製した（図９Ｂ）。
ベクターの作製） プラスミドpCre−Pacの１．７ｋｂSal I断片をpBluescr
ipt II（ストラタジーン社製）のSal I部位に挿入し
た。このプラスミドpBSpuroの１．２ｋｂSal I−Sma I
断片を熊本大学の山村教授から分与を受けた、合成ｌｏ
ｘ６６配列を含むプラスミドplox66のXba I−Sma I部位
間に挿入し、プラスミドplox66 PGK-puroを得た。一
方、プラスミドpGK-tkの２．８ｋｂEcoR I−Sal I断片
をplox66 Sma I−Xba I部位間に挿入した。このプラス
ミドplox66 PGK-tkのHind III−Xho I部位間にプラスミ
ドplox66 PGK-puroの３．０ｋｂNot I−Sal I断片を挿
入し、アンチセンスプロモーター導入ベクター、plox66
PGK-puro-tkを作製した（図９Ｂ）。
【００３３】実施例３（ジーントラップベクターの導
入） 実施例１により作製したジーントラップベクターと従来
のトラップベクター（図９ｃ）とを比較するために、実
験結果の蓄積があるＥＳ細胞を用いて以下のように比較
した。１５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭ
ＥＭ中で培養したマウス由来のＥＳ細胞を１５〜２０分
間トリプシン処理し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離
して上清を捨て、１０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食
塩水）を加えてＥＳ細胞を懸濁した。このＥＳ細胞懸濁
液（１×１０8個）を再び１２００ｒｐｍで３分間遠心
分離して上清を捨て、あらかじめリニアライズしておい
た実施例１により作製したジーントラップベクター又は
従来のトラップベクターをそれぞれ１００μｇ加え、最
終的に０．８ｍｌになるように冷ＰＢＳを加えて再懸濁
し、０．８ｋＶ，３μＦの条件下でエレクトロポレーシ
ョンを行った。１０分の１の細胞を１０ｃｍのプレート
にまき、Ｇ４１８によりトラップクローンを選択したと
ころ、実施例１により作製したジーントラップベクター
を用いた場合は２５２個のコロニーが得られたが、従来
のトラップベクターを導入したトラップクローンでは、
半分以下の８０〜１００個のコロニーが得られたにすぎ
なかった。
入） 実施例１により作製したジーントラップベクターと従来
のトラップベクター（図９ｃ）とを比較するために、実
験結果の蓄積があるＥＳ細胞を用いて以下のように比較
した。１５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭ
ＥＭ中で培養したマウス由来のＥＳ細胞を１５〜２０分
間トリプシン処理し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離
して上清を捨て、１０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食
塩水）を加えてＥＳ細胞を懸濁した。このＥＳ細胞懸濁
液（１×１０8個）を再び１２００ｒｐｍで３分間遠心
分離して上清を捨て、あらかじめリニアライズしておい
た実施例１により作製したジーントラップベクター又は
従来のトラップベクターをそれぞれ１００μｇ加え、最
終的に０．８ｍｌになるように冷ＰＢＳを加えて再懸濁
し、０．８ｋＶ，３μＦの条件下でエレクトロポレーシ
ョンを行った。１０分の１の細胞を１０ｃｍのプレート
にまき、Ｇ４１８によりトラップクローンを選択したと
ころ、実施例１により作製したジーントラップベクター
を用いた場合は２５２個のコロニーが得られたが、従来
のトラップベクターを導入したトラップクローンでは、
半分以下の８０〜１００個のコロニーが得られたにすぎ
なかった。
【００３４】上記２５２個のコロニーが得られたプレー
トから９６個を分離した残り１５６個のコロニーに、Ｘ
−ｇａｌ染色液（最終濃度で１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａ
ｌ、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリ
シアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＥＧ
ＴＡ、０．０２％のＮＰ４０、０．１％のリン酸バッフ
ァー；ｐＨ７．３）を加え、３７℃で遮光して２日間染
色した。この結果、１５６個のコロニー中、染色された
ものは１２７個で、視覚的に観察できなかったものが残
りの２９個（１８％）であった。また、従来のトラップ
ベクターにおいては約３０％が染色されなかった。これ
らの染色されなかったクローンは、レポーター遺伝子産
物と被トラップ遺伝子産物との融合タンパク質ができた
ためにレポーター遺伝子が発現しなかったためと考えら
れる。以上のことから、本発明のジーントラップベクタ
ーは従来のものより効率がよくトラップクローンを得る
ことができ、さらに、感度よくレポーター遺伝子発現で
きることがわかった。
トから９６個を分離した残り１５６個のコロニーに、Ｘ
−ｇａｌ染色液（最終濃度で１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａ
ｌ、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、５ｍＭのフェリ
シアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＥＧ
ＴＡ、０．０２％のＮＰ４０、０．１％のリン酸バッフ
ァー；ｐＨ７．３）を加え、３７℃で遮光して２日間染
色した。この結果、１５６個のコロニー中、染色された
ものは１２７個で、視覚的に観察できなかったものが残
りの２９個（１８％）であった。また、従来のトラップ
ベクターにおいては約３０％が染色されなかった。これ
らの染色されなかったクローンは、レポーター遺伝子産
物と被トラップ遺伝子産物との融合タンパク質ができた
ためにレポーター遺伝子が発現しなかったためと考えら
れる。以上のことから、本発明のジーントラップベクタ
ーは従来のものより効率がよくトラップクローンを得る
ことができ、さらに、感度よくレポーター遺伝子発現で
きることがわかった。
【００３５】実施例４（アンチセンスプロモーターの導
入） 実施例３で分離された９６個のクローンのうち、トラッ
プされた遺伝子座が５′ＲＡＣＥによりクローニングさ
れている３クローンを含む１０クローンの細胞（７×１
０6）をそれぞれＰＢＳ中に懸濁し、これらの懸濁液に
２０μｇのＣｒｅリコンビナーゼ一時的発現ベクター
（pCre-Pac）と２０μｇのアンチセンスプロモーター導
入ベクター（plox66 PGK-puro-tk）とを加えて０．８ｍ
ｌにし、０．２４ｋＶ、５００μＦでエレクトロポレー
ションをおこなった。これらを１０ｃｍシャーレ２枚に
プレートし、２時間後に１μｇ／ｍｌのピューロマイシ
ンと２μＭのガンシクロビアを含む選択培地に交換し、
２日間培養した。その後、２μＭのガンシクロビアのみ
を含む選択培地に交換し、５日間培養した。この結果、
１０クローンそれぞれにおいて平均７０個のコロニーを
得ることができた。これらの得られたコロニーにおいて
アンチセンスプロモーター導入ベクターが組み込まれて
いるかをサザーン法により確認した。またトラップされ
た遺伝子座が５′ＲＡＣＥによりクローニングされてい
る３クローンにおいては、ノーザン法により、野生型対
立遺伝子からの転写が抑制されているかどうかを調べた
結果、３０〜９０％の発現抑制がみられた。
入） 実施例３で分離された９６個のクローンのうち、トラッ
プされた遺伝子座が５′ＲＡＣＥによりクローニングさ
れている３クローンを含む１０クローンの細胞（７×１
０6）をそれぞれＰＢＳ中に懸濁し、これらの懸濁液に
２０μｇのＣｒｅリコンビナーゼ一時的発現ベクター
（pCre-Pac）と２０μｇのアンチセンスプロモーター導
入ベクター（plox66 PGK-puro-tk）とを加えて０．８ｍ
ｌにし、０．２４ｋＶ、５００μＦでエレクトロポレー
ションをおこなった。これらを１０ｃｍシャーレ２枚に
プレートし、２時間後に１μｇ／ｍｌのピューロマイシ
ンと２μＭのガンシクロビアを含む選択培地に交換し、
２日間培養した。その後、２μＭのガンシクロビアのみ
を含む選択培地に交換し、５日間培養した。この結果、
１０クローンそれぞれにおいて平均７０個のコロニーを
得ることができた。これらの得られたコロニーにおいて
アンチセンスプロモーター導入ベクターが組み込まれて
いるかをサザーン法により確認した。またトラップされ
た遺伝子座が５′ＲＡＣＥによりクローニングされてい
る３クローンにおいては、ノーザン法により、野生型対
立遺伝子からの転写が抑制されているかどうかを調べた
結果、３０〜９０％の発現抑制がみられた。
【００３６】
【発明の効果】本発明によると、ＥＳ細胞以外のインビ
トロ細胞分化系においても適用することができる、トラ
ップされた遺伝子に対応する対立遺伝子における正常な
遺伝子（野生型遺伝子）の発現機能が欠失又は抑制され
た細胞を調製することができる。また、かかる本発明に
より調製されるＥＳ細胞をはじめとする細胞株やマウス
個体はヒト疾患モデルの生物材料として利用することが
でき、また本発明の細胞の調製方法をヒト細胞に適用す
ると、特定の遺伝子の発現を抑制し、また同時に他の遺
伝子を発現させることができることから、体細胞の遺伝
子治療への応用が期待できる。
トロ細胞分化系においても適用することができる、トラ
ップされた遺伝子に対応する対立遺伝子における正常な
遺伝子（野生型遺伝子）の発現機能が欠失又は抑制され
た細胞を調製することができる。また、かかる本発明に
より調製されるＥＳ細胞をはじめとする細胞株やマウス
個体はヒト疾患モデルの生物材料として利用することが
でき、また本発明の細胞の調製方法をヒト細胞に適用す
ると、特定の遺伝子の発現を抑制し、また同時に他の遺
伝子を発現させることができることから、体細胞の遺伝
子治療への応用が期待できる。
【００３７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Antisense Gene Trap Vector <130> A031P50 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteriophage P1 <300> <301> Araki, K Araki, M Yamamura, K <302> Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells <303> Nucleic Acids Res. <304> 25 <305> 4 <306> 868-872 <307> 1997 <400> 1 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:lox71 sequence <300> <301> Araki, K Araki, M Yamamura, K <302> Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells <303> Nucleic Acids Res. <304> 25 <305> 4 <306> 868-872 <307> 1997 <400> 2 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:lox66 sequence <300> <301> Araki, K Araki, M Yamamura, K <302> Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells <303> Nucleic Acids Res. <304> 25 <305> 4 <306> 868-872 <307> 1997 <400> 3 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <300> <301> Ringrose, L Lounnas, V Ehrlich, L Buchholz, F Wade, R Stewart, A. F. <302> Comparative Kinetic Analysis of FLP and Cre Recombinases: Mathematical Models for DNA Binding and Recombination <303> J. Mol. Biol. <304> 284 <306> 363-384 <307> 1998 <400> 4 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:FRTM sequence <300> <301> Ringrose, L Lounnas, V Ehrlich, L Buchholz, F Wade, R Stewart, A. F. <302> Comparative Kinetic Analysis of FLP and Cre Recombinases: Mathematical Models for DNA Binding and Recombination <303> J. Mol. Biol. <304> 284 <306> 363-384 <307> 1998 <400> 5 gaagttccta tactttctag agaataaacc tctc 34 <210> 6 <211> 5054 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Gene Trap Vector <400> 6 ggtaccctat tggagtcctt caaggaaaca aacttggcct caccaggcct cagccttggc 60 tcctcctggg aactctactg cccttgggat cccgctcgac ggtatcgata agcttgatgg 120 ggatccggaa cccttaatat aacttcgtat aatgtatgct atacgaacgg tataggtccc 180 tcgacctgca gcccgatccc ctagtttgtg ataggccttt tagctacatc tgccaatcca 240 tctcattttc acacacacac acaccacttt ccttctggtc agtgggcaca tgtccagccn 300 nncccaacac ttgtatggcc ttggcggggt catccccccc ccacccccag tatctgcaac 360 ctcaagctag cttgggtgcg ttggttgtgg ataagtagct agactccagc aaccagtaac 420 ctctgccctt tctcctccat gacaaccagg tcccaggtcc cgaaaaccaa agaagaagaa 480 ccctaacaaa gaggacaagc ggcctcgcac agccttcact gctgagcagc tccagaggct 540 caaggctgag tttcagacca acaggtacgg ccgctctaga ggaattccgc ccctctccct 600 cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct 660 atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc 720 ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc 780 tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg 840 tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa 900 agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt 960 ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg 1020 atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta 1080 catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt 1140 cctttgaaaa acacgatgat aagcttgcca caaccatgga tcccgtcgtt ttacaacgtc 1200 gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 1260 ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 1320 tgaatggcga atggcgcttt gcctggtttc cggcaccaga agcggtgccg gaaagctggc 1380 tggagtgcga tcttcctgag gccgatactg tcgtcgtccc ctcaaactgg cagatgcacg 1440 gttacgatgc gcccatctac accaacgtaa cctatcccat tacggtcaat ccgccgtttg 1500 ttcccacgga gaatccgacg ggttgttact cgctcacatt taatgttgat gaaagctggc 1560 tacaggaagg ccagacgcga attatttttg atggcgttaa ctcggcgttt catctgtggt 1620 gcaacgggcg ctgggtcggt tacggccagg acagtcgttt gccgtctgaa tttgacctga 1680 gcgcattttt acgcgccgga gaaaaccgcc tcgcggtgat ggtgctgcgt tggagtgacg 1740 gcagttatct ggaagatcag gatatgtggc ggatgagcgg cattttccgt gacgtctcgt 1800 tgctgcataa accgactaca caaatcagcg atttccatgt tgccactcgc tttaatgatg 1860 atttcagccg cgctgtactg gaggctgaag ttcagatgtg cggcgagttg cgtgactacc 1920 tacgggtaac agtttcttta tggcagggtg aaacgcaggt cgccagcggc accgcgcctt 1980 tcggcggtga aattatcgat gagcgtggtg gttatgccga tcgcgtcaca ctacgtctga 2040 acgtcgaaaa cccgaaactg tggagcgccg aaatcccgaa tctctatcgt gcggtggttg 2100 aactgcacac cgccgacggc acgctgattg aagcagaagc ctgcgatgtc ggtttccgcg 2160 aggtgcggat tgaaaatggt ctgctgctgc tgaacggcaa gccgttgctg attcgaggcg 2220 ttaaccgtca cgagcatcat cctctgcatg gtcaggtcat ggatgagcag acgatggtgc 2280 aggatatcct gctgatgaag cagaacaact ttaacgccgt gcgctgttcg cattatccga 2340 accatccgct gtggtacacg ctgtgcgacc gctacggcct gtatgtggtg gatgaagcca 2400 atattgaaac ccacggcatg gtgccaatga atcgtctgac cgatgatccg cgctggctac 2460 cggcgatgag cgaacgcgta acgcgaatgg tgcagcgcga tcgtaatcac ccgagtgtga 2520 tcatctggtc gctggggaat gaatcaggcc acggcgctaa tcacgacgcg ctgtatcgct 2580 ggatcaaatc tgtcgatcct tcccgcccgg tgcagtatga aggcggcgga gccgacacca 2640 cggccaccga tattatttgc ccgatgtacg cgcgcgtgga tgaagaccag cccttcccgg 2700 ctgtgccgaa atggtccatc aaaaaatggc tttcgctacc tggagagacg cgcccgctga 2760 tcctttgcga atacgcccac gcgatgggta acagtcttgg cggtttcgct aaatactggc 2820 aggcgtttcg tcagtatccc cgtttacagg gcggcttcgt ctgggactgg gtggatcagt 2880 cgctgattaa atatgatgaa aacggcaacc cgtggtcggc ttacggcggt gattttggcg 2940 atacgccgaa cgatcgccag ttctgtatga acggtctggt ctttgccgac cgcacgccgc 3000 atccagcgct gacggaagca aaacaccagc agcagttttt ccagttccgt ttatccgggc 3060 aaaccatcga agtgaccagc gaatacctgt tccgtcatag cgataacgac ctcctgcact 3120 ggatggtggc gctggatggt aagccgctgg caagcggtga agtgcctctg gatgtcgctc 3180 cacaaggtaa acagttgatt gaactgcctg aactaccgca gccggagagc gccgggcaac 3240 tctggctcac agtacgcgta gtgcaaccga acgcgaccgc atggtcagaa gccgggcaca 3300 tcagcgcctg gcagcagtgg cgtctggcgg aaaacctcag tgtgacgctc cccgccgcgt 3360 cccacgccat cccgcatctg accaccagcg aaatggattt ttgcatcgag ctgggtaaga 3420 agcgttggca atttaaccgc cagtcaggct ttctcccaca gatgtggatt ggcgataaaa 3480 aacaactgct gacgccgctg cgcgatcagt tcacccgtgc accgctggat aacgacattg 3540 gcgtaagtga agcgacccgc attgacccta acgcctgggt cgaacgctgg aaggcggcgg 3600 gccattacca ggccgaagca gcgttgttgc agtgcacggc agatacactt gctgatgcgg 3660 tgctgattac gaccgctcac gcgtggcagc atcaggggaa aaccttattt atcatccgga 3720 aaacctaccg gattgatggt agtggtcaaa tggcgattac cgttgatgtt gaagtggcga 3780 gcgatacacc gcatccggcg cggattggcc tgaactgcca gctggcgcag gtagcagagc 3840 gggtaaactg gctcggatta gggccgcaag aaaactatcc cgaccgcctt actgccgcct 3900 gttttgaccg ctgggatctg ccattgtcag acatgtatac cccgtacgtc ttcccgagcg 3960 aaaacggtct gcgctgcggg acgcgcgaat tgaattatgg cccacaccag tggcgcggcg 4020 acttccagtt caacatcagc cgctacagtc aacagcaact gatggaaacc agccatcgcc 4080 atctgctgca cgcggaagaa ggcacatggc tgaatatcga cggtttccat atggggattg 4140 gtggcgacga ctcctggagc ccgtcagtat cggcggaatt ccagctgagc gccggtcgct 4200 accattacca gttggtctgg tgtcagggga tcccccgggc tgcagccaat atgggatcgg 4260 ccattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg 4320 gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 4380 cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc 4440 aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 4500 tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 4560 atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 4620 ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 4680 tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 4740 agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg 4800 gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 4860 gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 4920 tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 4980 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 5040 acgagttctt ctga 5054
【図１】トラップクローンのジーントラップベクターの
挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置に、本発明の
アンチセンスプロモーター導入ベクターを用いて、内因
性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置に、本発明の
アンチセンスプロモーター導入ベクターを用いて、内因
性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
【図２】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図３】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図４】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図５】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図６】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図７】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図８】他の態様のプロモーターを挿入する場合の模式
図である。
図である。
【図９】本発明のアンチセンス型ジーントラップベクタ
ーのセットと従来のジーントラップベクターを示す図で
ある。
ーのセットと従来のジーントラップベクターを示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 BA80 CA04 DA02 EA04 FA02 FA10 FA20 GA14 HA01 4B065 AA91X AA91Y AA99Y AB01 AC10 AC20 BA02 BA03 CA24 CA29
Claims (46)
- 【請求項１】 ジーントラップベクターを細胞に導入
し、挿入型遺伝子変異を有するトラップクローンを選別
し、かかるトラップクローンのジーントラップベクター
の挿入が起こった変異遺伝子座の所定の位置に、アンチ
センスプロモーター導入ベクターを用いて、内因性遺伝
子と逆方向にプロモーターを挿入することを特徴とする
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法。 - 【請求項２】 ジーントラップベクターが、スプライス
アクセプター配列又はスプライスドナー配列を有するこ
とを特徴とする請求項１記載の野生型遺伝子の発現機能
が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項３】 ジーントラップベクターが、スプライス
アクセプター配列の下流又はスプライスドナー配列の上
流に連結された選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝
子を有することを特徴とする請求項２記載の野生型遺伝
子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項４】 ジーントラップベクターが、ＩＲＥＳを
介して、スプライスアクセプター配列の下流又はスプラ
イスドナー配列の上流に連結された選択マーカー遺伝子
又はレポーター遺伝子を有することを特徴とする請求項
３記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された
細胞の調製方法。 - 【請求項５】 選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐
性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイ
シン耐性遺伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子から選
ばれる１又は２以上の遺伝子であることを特徴とする請
求項３又は４記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は
抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項６】 ジーントラップベクターが、リコンビナ
ーゼが認識する野生型逆方向反復配列を変異させた変異
型逆方向反復配列を有することを特徴とする請求項１〜
５のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は
抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項７】 １つの変異型逆方向反復配列を、スプラ
イスアクセプター配列の上流域に有することを特徴とす
る請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑
制された細胞の調製方法。 - 【請求項８】 ２つの変異型逆方向反復配列を、共にス
プライスアクセプター配列の上流域に有することを特徴
とする請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項９】 変異型逆方向反復配列を、スプライスア
クセプター配列の上流域と、選択マーカー遺伝子の下流
域にそれぞれ有することを特徴とする請求項６記載の野
生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製
方法。 - 【請求項１０】 変異型逆方向反復配列が、同一又は互
いに異なる変異型逆方向反復配列であることを特徴とす
る請求項８又は９記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失
又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項１１】 １つの変異型逆方向反復配列と１つの
野生型逆方向反復配列とを、順不同で共にスプライスア
クセプター配列の上流域に有することを特徴とする請求
項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制され
た細胞の調製方法。 - 【請求項１２】 １つの変異型逆方向反復配列と１つの
野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一方の配
列をスプライスアクセプター配列の上流域に、他方の配
列を選択マーカー遺伝子の下流域に、有することを特徴
とする請求項６記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又
は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項１３】 アンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーが、ジーントラップベクターの挿入が起こった変異遺
伝子座の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向にプロモ
ーターを挿入することができる、リコンビナーゼが認識
する野生型逆方向反復配列を変異させた変異型逆方向反
復配列を有することを特徴とする請求項１〜１２のいず
れか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制され
た細胞の調製方法。 - 【請求項１４】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの上流域と下流域に、互いに異なる変異型逆
方向反復配列をそれぞれ有することを特徴とする請求項
１３記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制され
た細胞の調製方法。 - 【請求項１５】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの上流域と下流域に、同一の変異型逆方向反
復配列をそれぞれ有することを特徴とする請求項１３記
載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞
の調製方法。 - 【請求項１６】 １つの変異型逆方向反復配列と１つの
野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一方の配
列を内因性遺伝子と逆方向に挿入されたプロモーターの
上流域に、他方の配列を該プロモーターの下流域に、有
することを特徴とする請求項１３記載の野生型遺伝子の
発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項１７】 変異型逆方向反復配列が、大腸菌Ｐ１
ファージ由来の野生型ｌｏｘＰ配列又は酵母サッカロミ
セス・セレビッシェ由来の野生型ＦＲＴ配列を変異させ
た変異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求項
６〜１６のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠
失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項１８】 変異型逆方向反復配列が、逆方向反復
領域中に変異を有する変異型逆方向反復配列であること
を特徴とする請求項６〜１７のいずれか記載の野生型遺
伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項１９】 逆方向反復領域中に変異を有する変異
型逆方向反復配列が、配列番号２に示される塩基配列を
もつｌｏｘ７１配列及び／又は配列番号３に示される塩
基配列をもつｌｏｘ６６配列であることを特徴とする請
求項１８記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制
された細胞の調製方法。 - 【請求項２０】 変異型逆方向反復配列が、逆方向反復
領域間に存するスペーサー領域に変異を有する変異型逆
方向反復配列であることを特徴とする請求項６〜１７の
いずれか記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制
された細胞の調製方法。 - 【請求項２１】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの下流に、ジーントラップベクターにおける
選択マーカー遺伝子と異なる選択マーカー遺伝子を連結
することを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の
野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調
製方法。 - 【請求項２２】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの下流に連結する選択マーカー遺伝子が、ピ
ューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求
項２１記載の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制さ
れた細胞の調製方法。 - 【請求項２３】 アンチセンスプロモーター導入ベクタ
ーが、ジーントラップベクターにおける選択マーカー遺
伝子、及び内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプロモー
ターの下流に連結された選択マーカー遺伝子と異なるネ
ガティブ選択性選択マーカー遺伝子を、変異型逆方向反
復配列又は野生型逆方向反復配列を介して、内因性遺伝
子と逆方向に挿入されるプロモーターの上流域に、該プ
ロモーターと同方向又は逆方向に有することを特徴とす
る請求項１３〜２２のいずれか記載の野生型遺伝子の発
現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項２４】 ネガティブ選択性選択マーカー遺伝子
が、ホスホグリセロキナーゼのプロモーターに連結され
たチミジンキナーゼ遺伝子又はジフテリアトキシン耐性
遺伝子であることを特徴とする請求項２３記載の野生型
遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方
法。 - 【請求項２５】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターが、ホスホグリセロキナーゼのプロモーター
であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれか記載
の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の
調製方法。 - 【請求項２６】 変異遺伝子座の所定の位置が、スプラ
イスアクセプター配列の上流域であることを特徴とする
請求項２〜２５のいずれか記載の野生型遺伝子の発現機
能が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項２７】 リコンビナーゼを細胞内で発現させる
ことにより、内因性遺伝子と逆方向にプロモーターを挿
入することを特徴とする請求項１〜２６のいずれか記載
の野生型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の
調製方法。 - 【請求項２８】 細胞がＥＳ細胞であることを特徴とす
る請求項１〜２７のいずれか記載の野生型遺伝子の発現
機能が欠失又は抑制された細胞の調製方法。 - 【請求項２９】 請求項１〜２８のいずれか記載の野生
型遺伝子の発現機能が欠失又は抑制された細胞の調製方
法により得られる、トラップされた遺伝子に対するアン
チセンスＲＮＡを転写することができる細胞。 - 【請求項３０】 ジーントラップベクターが導入され
た、挿入型遺伝子変異を有するトラップクローンの前記
ジーントラップベクターの挿入が起こった変異遺伝子座
の所定の位置に、内因性遺伝子と逆方向に挿入すること
ができるプロモーターを有することを特徴とするアンチ
センスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項３１】 リコンビナーゼが認識する野生型逆方
向反復配列を変異させた変異型逆方向反復配列を有する
ことを特徴とする請求項３０記載のアンチセンスプロモ
ーター導入ベクター。 - 【請求項３２】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの上流域と下流域に、互いに異なる変異型逆
方向反復配列をそれぞれ有することを特徴とする請求項
３１記載のアンチセンスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項３３】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの上流域と下流域に、同一の変異型逆方向反
復配列をそれぞれ有することを特徴とする請求項３１記
載のアンチセンスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項３４】 １つの変異型逆方向反復配列と１つの
野生型逆方向反復配列とを、それらのいずれか一方の配
列を内因性遺伝子と逆方向に挿入されたプロモーターの
上流域に、他方の配列を該プロモーターの下流域に、有
することを特徴とする請求項３１記載のアンチセンスプ
ロモーター導入ベクター。 - 【請求項３５】 変異型逆方向反復配列が、大腸菌Ｐ１
ファージ由来の野生型ｌｏｘＰ配列又は酵母サッカロミ
セス・セレビッシェ由来の野生型ＦＲＴ配列を変異させ
た変異型逆方向反復配列であることを特徴とする請求項
３１〜３４のいずれか記載のアンチセンスプロモーター
導入ベクター。 - 【請求項３６】 変異型逆方向反復配列が、逆方向反復
領域中に変異を有する変異型逆方向反復配列であること
を特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のアンチ
センスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項３７】 逆方向反復領域中に変異を有する変異
型逆方向反復配列が、配列番号２に示される塩基配列を
もつｌｏｘ７１配列及び／又は配列番号３に示される塩
基配列をもつｌｏｘ６６配列であることを特徴とする請
求項３６記載のアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ー。 - 【請求項３８】 変異型逆方向反復配列が、逆方向反復
領域間に存するスペーサー領域に変異を有する変異型逆
方向反復配列であることを特徴とする請求項３１〜３５
のいずれか記載のアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ー。 - 【請求項３９】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの下流に、ジーントラップベクターにおける
選択マーカー遺伝子と異なる選択マーカー遺伝子が連結
されていることを特徴とする請求項３０〜３８のいずれ
か記載のアンチセンスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項４０】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターの下流に連結されている選択マーカー遺伝子
が、ピューロマイシン耐性遺伝子であることを特徴とす
る請求項３９記載のアンチセンスプロモーター導入ベク
ター。 - 【請求項４１】 変異型逆方向反復配列又は野生型逆方
向反復配列を介して、内因性遺伝子と逆方向に挿入され
るプロモーターの上流域に、該プロモーターと同方向又
は逆方向に該プロモーターとネガティブ選択性選択マー
カー遺伝子を有することを特徴とする請求項３０〜４０
のいずれか記載のアンチセンスプロモーター導入ベクタ
ー。 - 【請求項４２】 ネガティブ選択性選択マーカー遺伝子
が、ホスホグリセロキナーゼのプロモーターに連結され
たチミジンキナーゼ遺伝子又はジフテリアトキシン耐性
遺伝子であることを特徴とする請求項４１記載のアンチ
センスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項４３】 内因性遺伝子と逆方向に挿入されるプ
ロモーターが、ホスホグリセロキナーゼのプロモーター
であることを特徴とする請求項３０〜４２のいずれか記
載のアンチセンスプロモーター導入ベクター。 - 【請求項４４】 請求項３０〜４３のいずれか記載のア
ンチセンスプロモーター導入ベクターを用いることを特
徴とするジーントラップ方法。 - 【請求項４５】 請求項３０〜４３のいずれか記載のア
ンチセンスプロモーター導入ベクターを用いることを特
徴とする細胞内の特定遺伝子の発現を欠失又は抑制する
細胞の処理方法。 - 【請求項４６】 請求項３０〜４３のいずれか記載のア
ンチセンスプロモーター導入ベクターをＥＳ細胞に導入
し、該ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェ
クションすることにより得られることを特徴とする遺伝
子の発現が欠失又は抑制されたノックアウト様マウス。
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