JP4359498B2 - 転写活性な座を標的化する方法 - Google Patents
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Description
本願は、２００１年６月６日に出願された米国仮出願番号６０／２９６，２６０に対する優先権を主張する。この出願を通して、種々の刊行物を参照する。これらの刊行物の全体の開示は、本明細書中で、本願への参考として援用される。
（発明の分野）
本発明の分野は、プロモーターレス選択カセットを転写活性遺伝子座に標的化する方法である。特に、本発明の分野は、他の方法を用いて以前に観察された効率よりもずっと高効率で、胚性幹細胞または他の真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座にプロモーターレス選択カセットを標的化する方法である。発明の分野はまた、ＤＮＡ標的化ベクター、標的化細胞、およびこの標的化細胞から生じた非ヒト生物（特に、マウス）を包含する。
本発明の分野は、プロモーターレス選択カセットを転写活性遺伝子座に標的化する方法である。特に、本発明の分野は、他の方法を用いて以前に観察された効率よりもずっと高効率で、胚性幹細胞または他の真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座にプロモーターレス選択カセットを標的化する方法である。発明の分野はまた、ＤＮＡ標的化ベクター、標的化細胞、およびこの標的化細胞から生じた非ヒト生物（特に、マウス）を包含する。
（発明の背景）
トランスジェニック動物およびノックアウト（ＫＯ）動物は、全生物において遺伝子機能についての見識を得るため、および推定薬物標的を評価するために、広範に使用されている。ＫＯ動物の場合、目的の遺伝子は、通常、マーカー遺伝子で置き換えられて、ヘテロ接合性のヌル対立遺伝子が作製され、これは、次いで、ホモ接合性へと飼育され得る（しかし、少数のノックアウト動物は、ハプロ不全（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（Ｌｉｎｄｓａｙら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１０、９７−１０１；ＮｕｔｔおよびＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、１９９９、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、３８０、６０１−１１；Ｎｕｔｔら、１９９９、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２１、３９０−５；Ｓｃｈｗａｂｅら、２０００、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、６７、８２２−３１；Ｗｉｌｋｉｅ、１９９４、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ、３１、８９−９８）またはインプリンティング（ＤｅＣｈｉａｒａら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４５、７８−８０）に起因して半接合性の表現型を有する）。ホモ接合性ヌル対立遺伝子は、目的の遺伝子のインビボでの機能を理解するために使用され得る表現型を誘導し得る。しかし、約６０％のホモ接合性ヌル対立遺伝子変異動物は、表現型を示さず、そしてそれらが表現型を示す場合、その表現型は、目的の遺伝子が存在しない場合どうなるのかに関する情報しか提供しないので、目的の遺伝子が、トランスジェニック動物の操作によって過剰発現および／または誤発現される補完的なアプローチがしばしば使用される。トランスジェニック動物において、導入遺伝子を保有するＤＮＡ構築物またはベクターを設計する方法に依存して、目的の遺伝子は、過剰発現され得るか（すなわち、野生型遺伝子により通常生成されるよりも高いレベルで発現される）、誤発現され得るか（すなわち、それを通常発現する組織と異なる組織において、および／またはそれが通常発現されない時に発現される）、またはその両方であり得る。重要なことは、その発現レベルおよび発現プロフィールは、導入遺伝子を駆動するプロモーターの選択に大部分依存することに注意するべきであることである。さらに、トランスジェニック動物技術は、正常な内因性遺伝子座の活性に影響を及ぼすことなく、目的の遺伝子の任意の考えられ得るバージョン（変異体およびタグ化形態を含む）を発現するために使用され得る。特定の時点または特定のセットの条件下で、導入遺伝子の発現を開始または停止する能力（例えば、調節性のＣｒｅ技術（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２４、１４０４−１１；ＮａｇｙおよびＭａｒ、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１５８、９５−１０６；ＲｏｓｓａｎｔおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９９、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、１３、１４２−５；Ｓｃｈｗｅｎｋら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２６、１４２７−３２；Ｖｏｏｉｊｓら、２００１、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ、２、２９２−２９７)、Ｔｅｔ調節系（ＢａｒｏｎおよびＢｕｊａｒｄ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２７、４０１−２１；ＢｌａｕおよびＲｏｓｓｉ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６、７９７−９；ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９、５５４７−５１；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、１７６６−９；ＳｈｏｃｋｅｔｔおよびＳｃｈａｔｚ、１９９６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３、５１７３−６）、Ｔｅｔ−ＥＲ（Ｆａｎｄｌ、Ｊａｍｅｓ、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．の名前で、２００２年５月２９日に出願された、米国仮出願番号 （その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用することによる、または当該分野で公知の他の適切な技術）を組み合わせることで、目的の遺伝子のインビボでの機能を注意深く分析すること、および薬物標的候補遺伝子および新規タンパク質に基づく治療剤を評価することが可能である。
トランスジェニック動物およびノックアウト（ＫＯ）動物は、全生物において遺伝子機能についての見識を得るため、および推定薬物標的を評価するために、広範に使用されている。ＫＯ動物の場合、目的の遺伝子は、通常、マーカー遺伝子で置き換えられて、ヘテロ接合性のヌル対立遺伝子が作製され、これは、次いで、ホモ接合性へと飼育され得る（しかし、少数のノックアウト動物は、ハプロ不全（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（Ｌｉｎｄｓａｙら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１０、９７−１０１；ＮｕｔｔおよびＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、１９９９、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、３８０、６０１−１１；Ｎｕｔｔら、１９９９、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２１、３９０−５；Ｓｃｈｗａｂｅら、２０００、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、６７、８２２−３１；Ｗｉｌｋｉｅ、１９９４、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ、３１、８９−９８）またはインプリンティング（ＤｅＣｈｉａｒａら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４５、７８−８０）に起因して半接合性の表現型を有する）。ホモ接合性ヌル対立遺伝子は、目的の遺伝子のインビボでの機能を理解するために使用され得る表現型を誘導し得る。しかし、約６０％のホモ接合性ヌル対立遺伝子変異動物は、表現型を示さず、そしてそれらが表現型を示す場合、その表現型は、目的の遺伝子が存在しない場合どうなるのかに関する情報しか提供しないので、目的の遺伝子が、トランスジェニック動物の操作によって過剰発現および／または誤発現される補完的なアプローチがしばしば使用される。トランスジェニック動物において、導入遺伝子を保有するＤＮＡ構築物またはベクターを設計する方法に依存して、目的の遺伝子は、過剰発現され得るか（すなわち、野生型遺伝子により通常生成されるよりも高いレベルで発現される）、誤発現され得るか（すなわち、それを通常発現する組織と異なる組織において、および／またはそれが通常発現されない時に発現される）、またはその両方であり得る。重要なことは、その発現レベルおよび発現プロフィールは、導入遺伝子を駆動するプロモーターの選択に大部分依存することに注意するべきであることである。さらに、トランスジェニック動物技術は、正常な内因性遺伝子座の活性に影響を及ぼすことなく、目的の遺伝子の任意の考えられ得るバージョン（変異体およびタグ化形態を含む）を発現するために使用され得る。特定の時点または特定のセットの条件下で、導入遺伝子の発現を開始または停止する能力（例えば、調節性のＣｒｅ技術（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２４、１４０４−１１；ＮａｇｙおよびＭａｒ、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１５８、９５−１０６；ＲｏｓｓａｎｔおよびＭｃＭａｈｏｎ、１９９９、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、１３、１４２−５；Ｓｃｈｗｅｎｋら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２６、１４２７−３２；Ｖｏｏｉｊｓら、２００１、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ、２、２９２−２９７)、Ｔｅｔ調節系（ＢａｒｏｎおよびＢｕｊａｒｄ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２７、４０１−２１；ＢｌａｕおよびＲｏｓｓｉ、１９９９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６、７９７−９；ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９、５５４７−５１；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、１７６６−９；ＳｈｏｃｋｅｔｔおよびＳｃｈａｔｚ、１９９６、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３、５１７３−６）、Ｔｅｔ−ＥＲ（Ｆａｎｄｌ、Ｊａｍｅｓ、「Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．の名前で、２００２年５月２９日に出願された、米国仮出願番号 （その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用することによる、または当該分野で公知の他の適切な技術）を組み合わせることで、目的の遺伝子のインビボでの機能を注意深く分析すること、および薬物標的候補遺伝子および新規タンパク質に基づく治療剤を評価することが可能である。
トランスジェニック動物技術の利点および有用性にも関わらず、トランスジェニック動物を作製するのに現在利用可能な方法は、いくつかの技術的困難に苦しめられている。トランスジェニックマウスを作製するために最も頻繁に利用される方法は、前核注入である（ＪａｃｋｓｏｎおよびＡｂｂｏｔ、２０００、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９９）。この方法において、目的の遺伝子を保有するＤＮＡ構築物またはベクターは、プロモーターの下流に挿入され、その後にポリアデニル化シグナル配列が続く。プロモーターは、一般的に、その組織特異性に基づいて選択される。いくつかの例において、ユビキタスプロモーター（すなわち、生物における多くの（全てではないにしても）異なる組織および細胞型において発現されるプロモーター）を使用することが望ましいが、他の例においては、組織特異的プロモーター（すなわち、一つまたは数種の組織においてのみ発現されるプロモーター）を使用することが望ましい。一旦構築されると、ＤＮＡ構築物またはベクターは、卵母細胞に注入され、次いで、この細胞は、養母に移植される。一旦初代の子（ｆｏｕｎｄｅｒ ｐｕｐ）が誕生すると、それらは、導入遺伝子の発現についてスクリーニングされなければならない。この方法に関連するいくつかのより深刻な問題は、導入されたＤＮＡ構築物が、複数のコピーにおいて、無作為かつ頻繁に、ゲノムに組み込まれるという事実から生じる。次いで、この無作為の組み込みは、しばしば、いくつかのその後の問題を引き起こし得、これらは、以下のような初代の試験において明らかになる。
Ａ．位置的効果：導入遺伝子の異常な発現（すなわち、プロモーターの選択を反映しない発現）が、しばしば観察される。これは、構築物において使用されるプロモーターが、特異的な組織と異なる組織における発現を指示する調節エレメントを含む、遺伝子座内またはその付近での組み込みから生じ得る。位置的効果は、特に、目的の遺伝子の普遍的な発現が所望されるトランスジェニック動物を作製するのに問題となる。代表的に、このような動物を作製するために、遺伝子の発現は、ユビキタスプロモーターにより駆動される。しかし、上記の状況を反映して、調節エレメントを含む遺伝子座内またはその付近でのＤＮＡ構築物の組み込みが、目的の遺伝子の発現を組織のサブセットのみに制限することが、しばしば見られる。位置効果は、ＢＡＣに基づくトランスジェニック動物技術（ＪａｃｋｓｏｎおよびＡｂｂｏｔ、２０００、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９９；Ｙａｎｇら、１９９７、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５、８５９−６５；Ｙａｎｇら、１９９９、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２２、３２７−３５）を使用することによって最小に抑えられ得るが、この方法はなおも、以下に記載される問題を有し、さらに、単一のＢＡＣは複数の遺伝子を含み得るので、ＢＡＣに基づくトランスジェニック動物を作製することによって、目的の遺伝子だけでなく、同一のＢＡＣ上に存在し得る任意の隣接遺伝子も発現するトランスジェニック動物が生成され得る。
（Ｂ）導入遺伝子のサイレンシング：導入遺伝子の複数の組み込みは、サイレンシング（Ｇａｒｒｉｃｋら、１９９８、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、１８、５６−９；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９８、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２０、５３２−５；Ｌａｕら、１９９９、Ｄｅｖ Ｄｙｎ、２１５、１２６−３８）および不安定化（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｋａｓｔｎｅｒら、１９９６、Ｓｏｍａｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２２、３８３−９２）を誘導し得ることが観察された。この効果は、初代のスクリーニングを混乱させ得る（以下を参照のこと）。
（Ｃ）内因性対立遺伝子の挿入不活性化：ＤＮＡ構築物またはベクターの挿入が、内因性遺伝子の発現パターンを意図せず不活性化または変更し得ることが、文献において報告されている（Ｍｅｒｌｉｎｏら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、５、１３９５−４０６）。これは、トランスジェニック動物がヘテロ接合性として維持される（ハプロ不全に起因する表現型が存在しないことを想定する）場合、問題ではあり得ないが、それは、飼育工程を混乱させ得る。さらに、挿入不活性化が検出されない場合、それは、実際にそれは、トランスジェニックＤＮＡ構築物がそれ自体に挿入された遺伝子についてヌルの生成に起因する場合に、導入遺伝子の発現を表現型に起因すると考えさせることにより、表現型の解釈を混乱させ得る。無作為の組み込みの１０％が、組み込み部位に位置する遺伝子の挿入不活性化を生じると概算されている（ＪａｃｋｓｏｎおよびＡｂｂｏｔ、２０００、Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、２９９）。このような現象は、表現型分析前に発見するのが困難である。導入遺伝子の上流および下流の配列をクローニングすることにより、挿入部位が特徴付けられ得るが、マウスゲノムはまだこれから配列決定され、完了との注釈が付けられなければならないので、導入遺伝子が組み込まれた場所を正確に決定することは困難であり得る。さらに、組み込み現象は、調節エレメントを破壊し得る。どの調節エレメントおよび／または遺伝子が破壊されたかを同定することは、非常に複雑であり、そして実行困難である。
まとめると、これらの問題により、この方法により得られたトランスジェニック動物の表現型の全体的な不確定さが生じる。上記の問題に起因して、作製された各トランスジェニック動物系統について、少なくともいくつかの初代系統が、導入遺伝子の発現レベルおよびプロフィールについてスクリーニングされなければならない。最後に、所望の発現レベルおよびプロフィールを有する初代が発見される場合でさえも、内因性遺伝子座の挿入不活性化は、なおも問題となり得る。
トランスジェニック動物を作製するための別の方法は、胚性幹（ＥＳ）細胞を使用する（Ｐｉｒｉｔｙら、１９９８、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、５７、２７９−９３；Ｒｏｓｓａｎｔら、１９９３、Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ、３３９、２０７−１５）。この方法は、前核注入には依存しないが、目的の遺伝子の無作為の組み込みに依存し、従って、これはまた、上記問題の影響を受けやすい。より最近では、目的の遺伝子を特定の染色体座に導入することによりトランスジェニック動物を作製する考案がなされている。２つの異なるタイプの挿入がなされている。第１の方法は、特定の染色体座（例えば、ｈｐｒｔ遺伝子座）への「プロモーター−目的の遺伝子−ポリアデニル化部位カセット」の導入を含む（Ｅｖａｎｓ、２０００、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２、６７−７５；Ｗａｌｌａｃｅら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２８、１４５５−６４）。このアプローチの欠点は、標的化のためのｈｐｒｔ遺伝子座の選択にある。ｈｐｒｔ遺伝子座は、Ｘ連鎖不活性化を受け、そしてこれにより飼育工程が複雑となる。なぜならば、雌マウスはそれらの子孫への転写活性導入遺伝子の信頼できる伝播のために、ホモ接合性に飼育されなければならないからである。第２の方法は、特定の染色体座への目的の遺伝子の導入を含み、従って、遺伝子発現を制御するためにその遺伝子座の調節エレメントを使用する。この状況において、目的の遺伝子の発現は、標的化された遺伝子座により発現される遺伝子の発現とほとんど同一であるべきであり、また、従って、それに限定される。この方法は、標的化された内因性遺伝子座内に位置する遺伝子についてヘテロ接合性のヌルを生じ、従って、この遺伝子座は、半接合性ヌル表現型の欠損について注意深く選択されなければならない（Ｌｉｎｄｓａｙら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１０、９７−１０１；ＮｕｔｔおよびＢｕｓｓｌｉｎｇｅｒ、１９９９、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、３８０、６０１−１１；Ｎｕｔｔら、１９９９、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、２１、３９０−５；Ｗｉｌｋｉｅ、１９９４、Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ、３１、８９−９８）。さらに、このようなトランスジェニック系統をヘテロ接合性キャリアとして維持するのに特別な注意が払われなければならない。なぜならば、ホモ接合性への飼育は、導入遺伝子が導入された遺伝子座でのホモ接合性のヌルの生成を導き、従って、導入遺伝子の存在と無関係の表現型を示し得るからである。最後に、導入遺伝子の発現は、非改変遺伝子座によりコードされる遺伝子が発現される組織に制限される。従って、このストラテジーは、組織特異的トランスジェニック体を作製するのに非常に有用であるが、これは未だ、表現型が存在しないことがハプロ不全から生じる遺伝子座に制限されており、そしておそらくホモ接合性への飼育についての可能性を制限する。
これらの方法は、位置的効果の問題を解決し、そして初代についてスクリーニングする必要性を回避するが、それらは、複雑な飼育工程またはその動物の通常の機能発揮に必要とされ得る内因性染色体座の挿入不活性化のような他の問題を有する。従って、現在利用可能な方法に存在する、混乱させる問題を含まないトランスジェニック動物およびノックアウト動物の迅速、再現可能、効果的、かつ簡単な作製を可能にする方法に対する必要性が、なおも存在する。
（発明の要旨）
本発明に従って、本出願人らは、プロモーターのない選択カセットを転写活性な座中に標的化するための新規な方法を提供する。特に、本発明は、真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、これにより、他の方法を用いて以前に得られた標的化効率よりもかなり高い標的化効率を達成し、そして正確に標的化された事象についてスクリーニングする際にかなり少ない努力しか必要としない。本発明の新規な方法はまた、現在の方法論に関係する問題（例えば、内因性染色体座の挿入不活化および導入遺伝子発現に対する位置効果）を克服する。
本発明に従って、本出願人らは、プロモーターのない選択カセットを転写活性な座中に標的化するための新規な方法を提供する。特に、本発明は、真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、これにより、他の方法を用いて以前に得られた標的化効率よりもかなり高い標的化効率を達成し、そして正確に標的化された事象についてスクリーニングする際にかなり少ない努力しか必要としない。本発明の新規な方法はまた、現在の方法論に関係する問題（例えば、内因性染色体座の挿入不活化および導入遺伝子発現に対する位置効果）を克服する。
本発明のＤＮＡ標的化ベクターは、標的化されている転写活性な座の内因性プロモーターにより駆動されるポジティブ薬物選択マーカーの発現に依存する、選択ストラテジーを利用する。転写活性な座は、細胞の現在の分化状態が、転写機構にとって利用可能であり、かつその転写から生じるメッセージが、その細胞内部で見出され得る。その薬物選択マーカーを転写するためのプロモーターを保有せず、従ってその薬物選択マーカーの転写について標的化されている座に存在するプロモーターに依存する標的化ベクターを使用して、転写活性な座を標的化することにより、標的化されたクローンのみが、有効に選択される。本発明の方法を実施する際に本出願人らにより利用された転写活性な座の非限定的例は、ＲＯＳＡ２６座である。転写活性な座の他の例は、ＢＴ−５座（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９９ Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ８５，３５〜４７）およびＯｃｔ４（Ｗａｌｌａｃｅ，２０００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８，１４５５〜６４）であり、その各々は、本発明の方法を実施するための適切であり得る。
代表的な転写活性な座としてＲＯＳＡ２６座を使用して、本出願人らは、大部分標的化されるクローンが生じ、それにより、サザンブロッティングまたは当該分野で精通されている他の診断方法により標的化されたクローンについてスクリーニングする必要性が軽減されることを見出した。このことは、トランスジェニック動物の生成について個々の細胞クローンよりも、標的化された細胞のプールを使用することを可能にし、それにより、個々のクローンを使用する場合に遭遇する問題（例えば、キメラ動物を生成するために変異したクローンを意図せずに使用すること、低い程度のキメラ現象を達成すること、そして／または生殖系列伝達の欠如）を排除する。
本発明に従って、本出願人らは、本明細書中において、ほぼ１００％の効率で遺伝子標的化を実施するための新規な方法を記載し、すなわち、その方法において、選択から生じる薬物耐性細胞の本質的にすべてが、正確に標的化され、そして標的化ベクターの相同組換え媒介組み込みを含む。この新規な方法は、最初、
（１）転写活性な座中に標的化することを、
（２）「プロモーターのない選択カセット」を、薬物選択遺伝子の転写について標的化されている座の内因性プロモーターに依存する標的化ベクターを利用することによって、正確に標的化されている細胞のみについて効果的に選択するために使用することと、組み合わせる。正確に標的化された真核生物細胞について選択する能力は、トランスジェニック動物を生成するために標的化された個々の細胞クローンよりも標的化された細胞プールを使用することを可能にする。さらなる利点としては、（ａ）正確に標的化されたクローンについてスクリーニングする必要性を大いに減少し、それにより、時間、労力、および関連するコストの節約をもたらすこと、および（ｂ）低い程度のキメラ現象を含むトランスジェニック動物を生成する細胞クローン、生殖系列に寄与し得ないトランスジェニック動物を生成する細胞クローン、または他のように変異されかつ導入遺伝子の発現に関連しない表現型結果を生じ得るトランスジェニック動物を生成する細胞クローンを選択する可能性を減少することが、挙げられる。
（１）転写活性な座中に標的化することを、
（２）「プロモーターのない選択カセット」を、薬物選択遺伝子の転写について標的化されている座の内因性プロモーターに依存する標的化ベクターを利用することによって、正確に標的化されている細胞のみについて効果的に選択するために使用することと、組み合わせる。正確に標的化された真核生物細胞について選択する能力は、トランスジェニック動物を生成するために標的化された個々の細胞クローンよりも標的化された細胞プールを使用することを可能にする。さらなる利点としては、（ａ）正確に標的化されたクローンについてスクリーニングする必要性を大いに減少し、それにより、時間、労力、および関連するコストの節約をもたらすこと、および（ｂ）低い程度のキメラ現象を含むトランスジェニック動物を生成する細胞クローン、生殖系列に寄与し得ないトランスジェニック動物を生成する細胞クローン、または他のように変異されかつ導入遺伝子の発現に関連しない表現型結果を生じ得るトランスジェニック動物を生成する細胞クローンを選択する可能性を減少することが、挙げられる。
以下は、本発明の方法の好ましい実施形態のいくつかの非限定的要約である。
本発明の１つの好ましい実施形態は、真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
また好ましいのは、幹細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
本発明のさらなる好ましい実施形態は、胚性幹細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性胚性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性胚性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
別の実施形態は、真核生物細胞における転写活性な座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
また好ましいのは、幹細胞における転写活性な座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
本発明のさらなる好ましい実施形態は、胚性幹細胞における転写活性な座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
なお別の好ましい実施形態は、ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって真核生物細胞を遺伝子改変するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
さらなる好ましい実施形態は、ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって幹細胞を遺伝子改変するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
１つの実施形態は、ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって胚性幹細胞を遺伝子改変するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性胚性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性胚性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
別の実施形態は、転写活性な座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって真核生物細胞を遺伝子改変するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
さらなる実施形態は、転写活性な座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって幹細胞を遺伝子改変するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
本発明の好ましい実施形態は、転写活性な座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって胚性幹細胞を遺伝子改変するための方法であり、この方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性胚性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を薬物耐性について選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の薬物耐性胚性幹細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する。
さらなる好ましい実施形態は、遺伝子改変されたＲＯＳＡ２６座を含む非ヒト生物であり、この非ヒト生物は、以下：
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を胚盤胞中に導入する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する、方法により生成される。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、このＲＯＳＡ２６座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこのＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を胚盤胞中に導入する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する、方法により生成される。
また好ましいのは、遺伝子改変された転写活性な座を含む非ヒト生物であり、この非ヒト生物は、以下：
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の融合した真核生物細胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する、方法により生成される。
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、このヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、このプロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そしてこの５’相同性アームおよび３’相同性アームは、この転写活性な座に由来する、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を薬物耐性について選択する工程；
ｄ）（ｃ）の薬物耐性真核生物細胞をスクリーニングして、このプロモーターのない選択カセットが相同組換えによりこの転写活性な座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の融合した真核生物細胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する、方法により生成される。
他の実施形態は、上記転写活性な座に対する遺伝子改変が、コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化；新規なコード配列、新規な遺伝子セグメント、もしくは新規な調節エレメントの挿入；条件的対立遺伝子の生成；またはある種に由来するコード配列もしくは遺伝子セグメントを、同じ種もしくは異なる種に由来する相同性コード配列もしくはオルソログ配列で置換すること；を包含する実施形態であり、特に、上記コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化が、置換、付加、または融合を包含し、その融合が、エピトープタグまたは二機能性タンパク質を含む、実施形態である。
本発明の別の好ましい実施形態において、上記胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞、ラット胚性幹細胞、または他の齧歯類の胚性幹細胞である。
他の好ましい実施形態は、上記胚盤胞が、マウス胚盤胞、ラット胚盤胞、または他の齧歯類の胚盤胞であり、そしてその代理母が、マウス、ラットまたは他の齧歯類である、実施形態である。
好ましい実施形態において、上記非ヒト生物は、マウスである。
（定義）
「トランスジェニック」細胞またはトランスジェニック生物とは、その細胞または生物において通常は発現されない様式で遺伝子を発現するように遺伝子改変された、細胞または生物を意味する。
「トランスジェニック」細胞またはトランスジェニック生物とは、その細胞または生物において通常は発現されない様式で遺伝子を発現するように遺伝子改変された、細胞または生物を意味する。
「プロモーターのない」とは、真核生物細胞において発現を付与し得るプロモーターを欠くことを意味する。
「プロモーターのない選択カセット」とは、哺乳動物プロモーターを欠く、選択マーカー遺伝子またはｃＤＮＡを含む、ＤＮＡカセットである。そのカセットは、その選択マーカー遺伝子またはｃＤＮＡの発現を引き起こさない他の遺伝子エレメントを含み得る。
「転写活性な座」とは、その細胞の現在の分化状態で、転写機構にとって利用可能であり、かつそれらの転写から生じるメッセージが細胞内部で見出され得る、座である。
「標的化ベクター」とは、所望の遺伝子改変と隣接する内因性染色体核酸配列と「相同な」配列を含む、ＤＮＡ構築物である。その隣接する相同性配列（「相同性アーム」と呼ばれる）は、その相同性アームと、対応する内因性配列との間に存在する相同性によって、ゲノム中の特定の染色体位置に標的化ベクターを方向付け、そして「相同組換え」と呼ばれるプロセスによって所望の遺伝子改変を導入する。
「相同な」とは、互いに対してハイブリダイズ可能であるかまたは分子間交換可能であるに十分に、同一であるかまたは類似するかのいずれかである２つ以上の核酸配列を意味する。
「遺伝子標的化」とは、標的化ベクターを使用して、相同組換えを介して内因性配列中に挿入すること、内因性配列の欠失、または内因性配列の置換によって、その内因性染色体座を改変することである。
「トランスジェニック」細胞または「トランスジェニック」生物とは、遺伝子または座または座がそのゲノム中に導入されている、細胞または生物である。
「遺伝子ノックアウト」とは、染色体座中にコードされる遺伝子情報の破壊から生じる遺伝子改変である。
「遺伝子ノックイン」とは、染色体座中にコードされる遺伝子情報を、異なるＤＮＡ配列で置換することから生じる遺伝子改変である。
「ノックアウト生物」とは、その生物の細胞のうちの有意な割合が、遺伝子ノックアウトを保有する、生物である。
「ノックイン生物」とは、その生物の細胞のうちの有意な割合が、遺伝子ノックインを保有する、生物である。
「マーカー」または「選択マーカー」とは、その集団中にある処理された細胞の大多数から、そのマーカーを発現するトランスフェクトされた希な細胞を単離することを可能にする、選択用マーカーである。そのようなマーカーの遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、または蛍光発光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「ＥＳ細胞」とは、胚性幹細胞である。この細胞は、通常は、胚盤胞期の胚の内細胞塊に由来する。
「ＥＳ細胞クローン」とは、ＤＮＡの導入およびそれに続く選択後の、ＥＳ細胞集団のうちの単一の細胞に由来する細胞の部分集団である。
「隣接ＤＮＡ」とは、特定の言及点と同一線上にありかつその言及点と近接する、ＤＮＡセグメントである。
「非ヒト生物」とは、ヒトであると通常は一般社会により承認されない生物。
「オルソログ」配列とは、別の種においてその配列と機能的に等価である、ある種由来の配列を指す。
下記に示される記載および実施例は、本発明を例証するために提供される。これらの実施例が、単に例示のために提供され、本発明を限定する目的について意図されないことを、当業者は認識する。
（発明の詳細な説明）
遺伝子改変哺乳動物を作製するために有用なＥＳ細胞を作製するために現在利用可能な方法は、前核注入、または改変ＥＳ細胞の使用を包含する。プロモーター、目的の遺伝子、ポリアデニル化配列および他の調節エレメントまたは補助エレメントをコードする配列を含むＤＮＡ構築物またはベクターの前核注入を利用する方法は、広範に用いられているが、導入遺伝子がゲノム中にランダムに組み込まれる事実から主に生じるいくつかの深刻な欠点がある。これらの欠点は、上記の「背景」の節に詳細に概説される。ＥＳ細胞を利用する方法のいくつかはまた、導入遺伝子のランダム組込みに依存したが、より近年は、特定の染色体座へのトランスジェニック構築物の標的化の考えもまた利用されている。後者の方法は、導入遺伝子がランダムに組み込まれる方法で遭遇する問題のいくつかに対する解決策を提供するとはいえ、これらの方法は、標的化ＥＳ細胞クローンに対して非常に多数の非標的化（それゆえ、有用でない）ＥＳ細胞を生じる遺伝子標的化技術に依然として依存している。それゆえ、本出願人は、遺伝子標的化を実施するための新しくかつ新規な方法を本明細書中で記載し、ここで、薬物選択に耐えた実質的に全ての細胞は、正確に標的化された事象から生じ、従って、ほとんどの場合、クローンの大規模なスクリーニングの必要性を排除する。
遺伝子改変哺乳動物を作製するために有用なＥＳ細胞を作製するために現在利用可能な方法は、前核注入、または改変ＥＳ細胞の使用を包含する。プロモーター、目的の遺伝子、ポリアデニル化配列および他の調節エレメントまたは補助エレメントをコードする配列を含むＤＮＡ構築物またはベクターの前核注入を利用する方法は、広範に用いられているが、導入遺伝子がゲノム中にランダムに組み込まれる事実から主に生じるいくつかの深刻な欠点がある。これらの欠点は、上記の「背景」の節に詳細に概説される。ＥＳ細胞を利用する方法のいくつかはまた、導入遺伝子のランダム組込みに依存したが、より近年は、特定の染色体座へのトランスジェニック構築物の標的化の考えもまた利用されている。後者の方法は、導入遺伝子がランダムに組み込まれる方法で遭遇する問題のいくつかに対する解決策を提供するとはいえ、これらの方法は、標的化ＥＳ細胞クローンに対して非常に多数の非標的化（それゆえ、有用でない）ＥＳ細胞を生じる遺伝子標的化技術に依然として依存している。それゆえ、本出願人は、遺伝子標的化を実施するための新しくかつ新規な方法を本明細書中で記載し、ここで、薬物選択に耐えた実質的に全ての細胞は、正確に標的化された事象から生じ、従って、ほとんどの場合、クローンの大規模なスクリーニングの必要性を排除する。
目的のゲノムの選択された部位（染色体座）で導入遺伝子の挿入のために操作された従来の標的化ベクターは、５’相同性アーム、続いて目的の導入遺伝子（頻繁に、特定のプロモーターが先行する）、ポジティブ選択マーカー遺伝子含有カセット、および３’相同性アームからなる。これらの方法において用いられる選択マーカー遺伝子含有カセットは、ポジティブ薬物選択遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼまたは当該分野で周知の他の適切な薬物選択遺伝子）の発現を駆動する、遍在的に発現されるプロモーター（例えば、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター）、続いて転写されたメッセージの効率的なポリアデニル化を付与するポリアデニル化シグナル配列からなる（図１）。この選択カセットは、それ自体のプロモーターを保有するので、これは、（相同組換えを介して）所望の（標的化された）部位に組み込まれたか、または（ランダム／異常な組換えの結果として）別の部位に組み込まれたかとは独立して薬物耐性を付与する。標的座への相同組換えを介したこのカセットの組込みは、比較的稀な事象であるので、多くの薬物耐性クローンは、どのクローンが正確に標的化されたか（すなわち、選択カセットが、特異的相同組換えの結果として、選り抜きの染色体座に挿入されたクローン）、そしてどのクローンが標的化されていないか（すなわち、選択カセットがゲノム中にランダムに組み込まれたクローン）を正確に決定するためにスクリーニングされなければならない。いくつかの染色体座は、他の座よりも高頻度で標的化され得るとはいえ、一般に、スクリーニングプロセスは代表的に、１００より多くのクローンをサザンブロッティング、ＰＣＲ、または他の標準的方法によってスクリーニングすることを含む。これらのプロセスは、退屈で、時間がかかり、かつ費用がかかり得る。
いくつかのアプローチを利用して、非標的化相同組換え事象よりも標的化相同組換え事象の頻度を増大させているか、またはバックグラウンドを低下させ、それによって正確に標的化された細胞のより容易な検出を可能にしている。バックグラウンドを低下させる１つのアプローチは、ポジティブ／ネガティブ選択を含み、そしてこれは、それについて選択され得る薬物耐性マーカー（ポジティブ選択薬物耐性遺伝子）に加えて、それを除くように選択され得るネガティブ選択マーカーを用いる。このようなマーカー遺伝子の１例は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼであり、これは、ガンシクロビルを用いて、これを除去するように選択され得る。選択カセットがポジティブ／ネガティブ選択を用いる標的化ベクターでは、このネガティブ選択カセットは、このベクターの相同性アームの外側に配置される。同じ相同性アームを用いて達成される標的化の効率を評価する、多くの充分な数の並んだ比較は存在しないが、ポジティブ選択対ポジティブ／ネガティブ選択のみを用いて比較することによって、ポジティブ／ネガティブ選択が、正確に標的化されたクローンの提示を、ポジティブ選択のみを利用して対応する標的化ベクターによって達成される提示の約５〜１０倍増大させることが報告されている。ポジティブ／ネガティブ選択の欠点のうちの１つ、そしてまた、それがなぜ効率１００％でないかの理由の１つは、ネガティブ選択カセットが、変異によって、またはより通常には、メチル化によって不活化され得、それゆえ、作動せず、その結果、組込みがランダムな部位で生じるのを可能にすることである。さらに、これは、スクリーニングされなければならないクローンの数を低減するが、正確に標的化された事象についてのスクリーニングについての必要性を完全には解決しない（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３）。
用いられている別のアプローチは、「エキソン捕捉技術」と呼ばれ、この技術は、プロモーターを欠く選択カセットを操作することに依存する。エキソン捕捉のために代表的に用いられるこの選択カセットは、スプライスアクセプター（ＳＡ）、続いて薬物選択マーカーおよびポリアデニル化シグナルからなる。エキソンを捕捉するために用いられる場合、この選択カセットは細胞中に導入され、そしてゲノム中にランダムに挿入されることが可能にされる。この薬物選択マーカーはそれ自体のプロモーターを欠いているので、これは、転写活性な遺伝子中のエキソンの下流に組み込まれた場合にのみ発現される。これらの条件（転写活性な座内での挿入およびその座におけるエキソンの後ろでの挿入）は両方とも、薬物選択プロセスに耐性であるように挿入物を保有する細胞クローンについて満たされなければならない。この型の選択ストラテジーを用いて、ＥＳ細胞中で発現される遺伝子が同定されている（ＦｒｉｅｄｒｉｃｈおよびＳｏｒｉａｎｏ，１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，５，１５１３−２３；Ｗｉｌｅｓら，２０００，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２４，１３−４）。しかし、この選択ストラテジーは、標的化ベクターを操作する場合、以下を含むいくつかの理由から、慣用的には用いられていない：（１）これは、ＥＳ細胞において発現される遺伝子についてのみ用いられ得る；および（２）その適用においてでさえ、分化したＥＳ細胞について選択する危険性に起因して、これは「最後の手段の方法」と考えられる。これは、その遺伝子が、分化していないＥＳ細胞において通常は発現されない場合に生じる。ＥＳ細胞において通常は発現されない座のプロモーターによって駆動される薬物耐性遺伝子発現について選択することによって、標的化座を発現する分化した細胞について不注意にも選択する。
本発明に従って、出願人は、以下を初めて組み合わせた：（１）転写活性な座への標的化と、（２）薬物選択遺伝子の転写について標的化される座の内因性プロモーターに依存する標的化ベクターを利用することによって、正確に標的化された細胞のみを効果的に選択するための「プロモーターのない選択カセット」の使用。プロモーターのない薬物選択マーカーのランダム挿入は、転写活性なプロモーターの下流での挿入の結果としてこのマーカーの発現を極めて稀にしかもたらさないので、このようなカセットが、相同性アームの使用を介して、特定の転写活性な座へと指向される場合、得られる薬物耐性細胞は本質的に全て、標的化ベクターと標的化される座との間での相同組換えから生じる。従って、ほぼ１００％の標的化頻度が得られる。操作された座を特定の染色体座へと標的化されることの利点を全て有することに加えて、本明細書中に記載される新規技術は、トランスジェニック動物を作製する分野において、以下を含むいくつかの重要な進歩をもたらす：
（ａ）これは、正確に標的化された細胞のみを選択して、ほぼ１００％の標的化頻度となり、それゆえ、正確に標的化された細胞についてスクリーニングする必要性を解決する。
（ａ）これは、正確に標的化された細胞のみを選択して、ほぼ１００％の標的化頻度となり、それゆえ、正確に標的化された細胞についてスクリーニングする必要性を解決する。
（ｂ）正確に標的化された細胞のみを選択することは、時間、労働およびコストを節約するだけでなく、トランスジェニック動物を誘導するために、個々の細胞クローンの代わりに薬物耐性標的化細胞のプールを使用することをも可能にする。
（ｃ）個々のクローンの代わりに標的化された細胞のプールを使用することは、変異クローンを用いてトランスジェニック動物が誘導される可能性またはクローンから誘導されたキメラ動物が生殖細胞系に遺伝しない可能性を低減させる。
以下に提示する説明および実施例は、本発明を例示するために提供される。当業者は、これらの実施例が、例としてのみ提供され、本発明を限定する目的で含まれたのではないことを容易に認識する。
本明細書中に記載されるＤＮＡベクターを構築するために用いられる技術の多くは、当業者に周知の標準的な分子生物学の技術である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１、２および３巻，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。全てのＤＮＡ配列決定を、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いた標準的技術によって行う。
（実施例１）
以下は、本明細書中に記載される新規な技術の非限定的な例である。ＲＯＳＡ２６座のエキソン１の下流の配列を含む約２ｋｂの５’相同性アームからなるＤＮＡ標的化ベクターを構築した。ＲＯＳＡ２６座は、タンパク質に翻訳されないＲＮＡをコードする。（エキソン１が翻訳される転写活性な座では、プロモーターのない選択マーカーが、エキソン１にもしくはエキソン１の前に標的化されるべきであるか、または標的化される座によって通常コードされるタンパク質に対する融合体として標的化されるべきであることに留意すべきである）。５’相同性アームは、ＮｏｔＩ部位からＮｈｅＩ部位にまたがる（ＦｒｉｅｄｒｉｃｈおよびＳｏｒｉａｎｏ，１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，５，１５１３−２３．；Ｓｏｒｉａｎｏ，１９９９，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２１，７０−１）。選択カセットを、その部位に挿入した。この特定の例における選択カセットは、ＳＡ−ｌｏｘＰ−ＥＭ７−ｎｅｏ−４×ポリＡ−ｌｏｘＰであり、ここで、ＳＡは、スプライスアクセプター配列であり、この２つのｌｏｘＰ部位は、バクテリオファージＰ１由来の組換え部位（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ，１９８４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９，１５０９−１４）の座であり、ＥＭ７は、原核生物の構成的に活性なプロモーターであり、ｎｅｏは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｃｋら，１９８２，Ｇｅｎｅ，１９，３２７−３６）であり、そして４×ポリＡは、マウスｐｇｋ遺伝子のポリアデニル化シグナル（Ａｄｒａら，１９８７，Ｇｅｎｅ，６０，６５−７４）、ならびにシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期ポリアデニル化シグナルおよび後期ポリアデニル化シグナル（Ｒｅｄｄｙら，１９７８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００，４９４−５０２；Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら，１９７８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５３，１６１３−８）の両方を含む２５４ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントの３コピーをタンデムに連結することによって操作されたポリアデニル化シグナルである。当業者は、この選択カセット中の個々の成分の多くが、匹敵する成分で置換され得ることを認識する。例えば、ｌｏｘＰ組換え部位は、ＦＲＴまたはレコンビナーゼによって認識される他の部位によって置換され得、ＥＭ７プロモーターは、哺乳動物細胞においてサイレントである任意の細菌プロモーターによって置換され得、そしてｎｅｏ遺伝子は、細菌および哺乳動物細胞の両方において選択され得る任意の適切な選択マーカー遺伝子によって置換され得る（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３）。第２のｌｏｘＰ部位の後には、ＬａｃＺをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が操作されており、続いて、ウサギβ−グロビン遺伝子 （登録Ｋ０３２５６ Ｍ１２６０３）のβ−グロビンポリアデニル化シグナル（β−グロビンポリＡ）が操作され得る。さらに、当業者は、所望の結果に依存して、ＬａｃＺの代わりに任意のＯＲＦが配置され得ること、および他のポリアデニル化シグナルが、β−グロビンポリＡの代わりに用いられ得ることを認識する。β−グロビンポリＡには、ネイティブなＲＯＳＡ２６座中の５’相同性アームと連続した３’相同性アーム含有配列が続いている。３’相同性アームは、選択カセットの挿入部位を超えて約９．４ｋｂにわたって広がり、そして独特のＥｃｏＲＩ部位までのＲＯＳＡ２６配列を含む。座配列のどのセグメントを、そして座配列をどれだけ多く相同性アーム中に含むかの選択は一般に、経験的に決定される必要がある。しかし、標的化される座のプロモーターを、相同性アームの一部として含まないことに注意すべきである。なぜなら、そうすると、選択ストラテジーを妨げるからである。選択カセット中に哺乳動物プロモーターが存在しないことおよび真核生物プロモーターＥＭ７を使用することに留意すること。ＥＭ７プロモーターは、哺乳動物細胞においてサイレントであるが、細菌においてｎｅｏ発現を駆動するために用いられ得、従って、宿主Ｅ．ｃｏｌｉにカナマイシン耐性を付与し得る。さらに、この標的化ベクターは、複製起点および宿主細菌におけるアンピシリン耐性を付与するために用いられるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。この標的化ベクターに含まれる選択マーカーは、哺乳動物プロモーターを欠くので、この標的化ベクターが哺乳動物細胞に対して薬物耐性を付与し得る唯一の方法は、選択マーカーが、標的細胞中で発現される遺伝子において適切な様式で組み込まれるか否かである。これがランダムに生じる確率は、かなり低い。なぜなら、各細胞型は、ゲノム中の全ての遺伝子のうちのサブセットのみを転写するからである。従って、ＲＯＳＡ２６座由来の５’相同性アームおよび３’相同性アームを含むことによって、出願人は、標的座への標的化ベクターの適切な挿入に向けて有効かつ効率的にバイアスをかける。構築に続いて、ＤＮＡ標的化ベクターを、当該分野で周知の標準的な方法によってＥＳ細胞中に導入し、そして標的化事象の百分率を決定した。手短には、標的化ベクターを、制限酵素消化によって３’相同性アームの３’末端の後ろで直鎖化し、そして標準的方法論（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３）を用いてＥＳ細胞中にトランスフェクトし、そしてさらに当該分野で周知の標準的方法によってＧ４１８耐性クローンを選択した。個々のクローンを拾い、そして標準的サザンブロッティングによって分析して、どのクローンが標的化されたかを決定した。調べた全てのクローンは、正確に標的化されたことがわかった。
以下は、本明細書中に記載される新規な技術の非限定的な例である。ＲＯＳＡ２６座のエキソン１の下流の配列を含む約２ｋｂの５’相同性アームからなるＤＮＡ標的化ベクターを構築した。ＲＯＳＡ２６座は、タンパク質に翻訳されないＲＮＡをコードする。（エキソン１が翻訳される転写活性な座では、プロモーターのない選択マーカーが、エキソン１にもしくはエキソン１の前に標的化されるべきであるか、または標的化される座によって通常コードされるタンパク質に対する融合体として標的化されるべきであることに留意すべきである）。５’相同性アームは、ＮｏｔＩ部位からＮｈｅＩ部位にまたがる（ＦｒｉｅｄｒｉｃｈおよびＳｏｒｉａｎｏ，１９９１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，５，１５１３−２３．；Ｓｏｒｉａｎｏ，１９９９，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２１，７０−１）。選択カセットを、その部位に挿入した。この特定の例における選択カセットは、ＳＡ−ｌｏｘＰ−ＥＭ７−ｎｅｏ−４×ポリＡ−ｌｏｘＰであり、ここで、ＳＡは、スプライスアクセプター配列であり、この２つのｌｏｘＰ部位は、バクテリオファージＰ１由来の組換え部位（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ，１９８４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５９，１５０９−１４）の座であり、ＥＭ７は、原核生物の構成的に活性なプロモーターであり、ｎｅｏは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｃｋら，１９８２，Ｇｅｎｅ，１９，３２７−３６）であり、そして４×ポリＡは、マウスｐｇｋ遺伝子のポリアデニル化シグナル（Ａｄｒａら，１９８７，Ｇｅｎｅ，６０，６５−７４）、ならびにシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期ポリアデニル化シグナルおよび後期ポリアデニル化シグナル（Ｒｅｄｄｙら，１９７８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００，４９４−５０２；Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら，１９７８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５３，１６１３−８）の両方を含む２５４ｂｐのＢａｍＨＩフラグメントの３コピーをタンデムに連結することによって操作されたポリアデニル化シグナルである。当業者は、この選択カセット中の個々の成分の多くが、匹敵する成分で置換され得ることを認識する。例えば、ｌｏｘＰ組換え部位は、ＦＲＴまたはレコンビナーゼによって認識される他の部位によって置換され得、ＥＭ７プロモーターは、哺乳動物細胞においてサイレントである任意の細菌プロモーターによって置換され得、そしてｎｅｏ遺伝子は、細菌および哺乳動物細胞の両方において選択され得る任意の適切な選択マーカー遺伝子によって置換され得る（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３）。第２のｌｏｘＰ部位の後には、ＬａｃＺをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が操作されており、続いて、ウサギβ−グロビン遺伝子 （登録Ｋ０３２５６ Ｍ１２６０３）のβ−グロビンポリアデニル化シグナル（β−グロビンポリＡ）が操作され得る。さらに、当業者は、所望の結果に依存して、ＬａｃＺの代わりに任意のＯＲＦが配置され得ること、および他のポリアデニル化シグナルが、β−グロビンポリＡの代わりに用いられ得ることを認識する。β−グロビンポリＡには、ネイティブなＲＯＳＡ２６座中の５’相同性アームと連続した３’相同性アーム含有配列が続いている。３’相同性アームは、選択カセットの挿入部位を超えて約９．４ｋｂにわたって広がり、そして独特のＥｃｏＲＩ部位までのＲＯＳＡ２６配列を含む。座配列のどのセグメントを、そして座配列をどれだけ多く相同性アーム中に含むかの選択は一般に、経験的に決定される必要がある。しかし、標的化される座のプロモーターを、相同性アームの一部として含まないことに注意すべきである。なぜなら、そうすると、選択ストラテジーを妨げるからである。選択カセット中に哺乳動物プロモーターが存在しないことおよび真核生物プロモーターＥＭ７を使用することに留意すること。ＥＭ７プロモーターは、哺乳動物細胞においてサイレントであるが、細菌においてｎｅｏ発現を駆動するために用いられ得、従って、宿主Ｅ．ｃｏｌｉにカナマイシン耐性を付与し得る。さらに、この標的化ベクターは、複製起点および宿主細菌におけるアンピシリン耐性を付与するために用いられるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。この標的化ベクターに含まれる選択マーカーは、哺乳動物プロモーターを欠くので、この標的化ベクターが哺乳動物細胞に対して薬物耐性を付与し得る唯一の方法は、選択マーカーが、標的細胞中で発現される遺伝子において適切な様式で組み込まれるか否かである。これがランダムに生じる確率は、かなり低い。なぜなら、各細胞型は、ゲノム中の全ての遺伝子のうちのサブセットのみを転写するからである。従って、ＲＯＳＡ２６座由来の５’相同性アームおよび３’相同性アームを含むことによって、出願人は、標的座への標的化ベクターの適切な挿入に向けて有効かつ効率的にバイアスをかける。構築に続いて、ＤＮＡ標的化ベクターを、当該分野で周知の標準的な方法によってＥＳ細胞中に導入し、そして標的化事象の百分率を決定した。手短には、標的化ベクターを、制限酵素消化によって３’相同性アームの３’末端の後ろで直鎖化し、そして標準的方法論（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９９，Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，２９３）を用いてＥＳ細胞中にトランスフェクトし、そしてさらに当該分野で周知の標準的方法によってＧ４１８耐性クローンを選択した。個々のクローンを拾い、そして標準的サザンブロッティングによって分析して、どのクローンが標的化されたかを決定した。調べた全てのクローンは、正確に標的化されたことがわかった。
本発明の方法の再現性および一般的適用可能性を実証するために、等価なＤＮＡ標的ベクターを、他の遺伝子（これらの遺伝子は、上記のベクター中のｌａｃＺを本質的に置換した）をコードするＯＲＦ ｃＤＮＡを用いて構築した。表１は、これらのＤＮＡ標的化ベクターを用いて得られた標的化頻度を列挙する。これらの標的化ベクターにおいては、目的の遺伝子のみが置換されたことに留意すること。これらの例では、選択マーカーおよびＤＮＡ標的化ベクターの他の特徴は同じままである。
Claims (21)
- 非ヒト真核生物細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを非ヒト真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の非ヒト真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。 - 幹細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。 - 胚性幹細胞におけるＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換胚性幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。 - ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって非ヒト真核生物細胞を遺伝子改変するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを非ヒト真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の非ヒト真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換非ヒト真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。 - ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって幹細胞を遺伝子改変するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。 - ＲＯＳＡ２６座中にプロモーターのない選択カセットを標的化することによって胚性幹細胞を遺伝子改変するための方法であって、該方法は、
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを胚性幹細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の胚性幹細胞を該選択マーカーについて選択する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の形質転換胚性幹細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
を包含する、方法。 - 請求項４、５、または６に記載の方法であって、前記ＲＯＳＡ２６座に対する遺伝子改変が、コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化；新規なコード配列、新規な遺伝子セグメント、もしくは新規な調節エレメントの挿入；条件的対立遺伝子の生成；またはある種に由来するコード配列もしくは遺伝子セグメントを、同じ種もしくは異なる種に由来する相同性コード配列もしくは機能的に等価なコード配列で置換すること；を包含する、方法。
- 請求項７に記載の方法であって、前記コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化が、置換、付加、または融合を包含する、方法。
- 請求項８に記載の方法であって、前記融合が、エピトープタグまたは二機能性タンパク質を含む、方法。
- 請求項３または６に記載の方法であって、前記胚性幹細胞が、マウス胚性幹細胞、ラット胚性幹細胞、または他の齧歯類の胚性幹細胞である、方法。
- 遺伝子改変されたＲＯＳＡ２６座を含む非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下：
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を胚盤胞中に導入する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する方法により生成される、非ヒト生物。 - 遺伝子改変されたＲＯＳＡ２６座を含む非ヒト生物であって、該非ヒト生物は、以下：
ａ）ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ標的化ベクターを構築する工程であって、該ヌクレオチド配列は、
５’相同性アーム、
プロモーターのない選択カセット、および
３’相同性アーム、
を含み、該プロモーターのない選択カセットは、プロモーターのない選択マーカー遺伝子、プロモーターのない目的の遺伝子、およびポリアデニル化シグナル配列から構成され、そして該５’相同性アームおよび３’相同性アームは、ＲＯＳＡ２６遺伝子に由来し、ここで該５’相同性アームがＲＯＳＡ２６遺伝子のエクソン１の下流の配列を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＤＮＡ標的化ベクターを真核生物細胞中に導入する工程；
ｃ）（ｂ）の真核生物細胞を該選択マーカーについて選択する工程；
ｄ）（ｃ）の形質転換真核生物細胞をスクリーニングして、該プロモーターのない選択カセットが相同組換えにより該ＲＯＳＡ２６座中に組込まれた細胞を同定する工程；
ｅ）（ｄ）の真核生物細胞を別の真核生物細胞と融合する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の融合した真核生物細胞を妊娠用代理母中に導入する工程；
を包含する方法により生成される、非ヒト生物。 - 請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記ＲＯＳＡ２６座に対する遺伝子改変が、コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化；新規なコード配列、新規な遺伝子セグメント、もしくは新規な調節エレメントの挿入；条件的対立遺伝子の生成；またはある種に由来するコード配列もしくは遺伝子セグメントを、同じ種もしくは異なる種に由来する相同性コード配列もしくは機能的に等価なコード配列で置換すること；を包含する、非ヒト生物。
- 請求項１３に記載の非ヒト生物であって、前記コード配列、遺伝子セグメント、もしくは調節エレメントの変化が、置換、付加、または融合を包含する、非ヒト生物。
- 請求項１４に記載の非ヒト生物であって、前記融合が、エピトープタグまたは二機能性タンパク質を含む、非ヒト生物。
- 請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記真核生物細胞が、幹細胞である、非ヒト生物。
- 請求項１６に記載の非ヒト生物であって、前記幹細胞が、胚性幹細胞である、非ヒト生物。
- 請求項１７に記載の非ヒト生物であって、前記胚性幹細胞が、マウス胚性幹細胞、ラット胚性幹細胞、または他の齧歯類の胚性幹細胞である、非ヒト生物。
- 請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記胚盤胞が、マウス胚盤胞、ラット胚盤胞、または他の齧歯類の胚盤胞である、非ヒト生物。
- 請求項１１または１２に記載の非ヒト生物であって、前記代理母が、マウス、ラット、または他の齧歯類である、非ヒト生物。
- マウスである、請求項１１または１２に記載の非ヒト生物。
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