JPH08506239A - 標的細胞に対して特異的な、修飾された結合部分を有するウイルス - Google Patents

標的細胞に対して特異的な、修飾された結合部分を有するウイルス

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JPH08506239A JP6510853A JP51085394A JPH08506239A JP H08506239 A JPH08506239 A JP H08506239A JP 6510853 A JP6510853 A JP 6510853A JP 51085394 A JP51085394 A JP 51085394A JP H08506239 A JPH08506239 A JP H08506239A
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Abstract

(57)【要約】 宿主細胞のための受容体を有するウイルス又はウイルス様粒子に由来し、ウイルス又はウイルス様粒子を標的細胞に結合させる結合部分により授与された変更された結合特性を備え、上記宿主細胞受容体は修飾又は欠損してウイルス又はウイルス様粒子が実質的に上記宿主細胞に結合できないことを特徴とするウイルス又はウイルス様粒子が開示されている。ウイルスを標的細胞に結合させる結合部分により授与された結合特性をウイルスが備えたことを特徴とする、アデノウイルス又はインフルエンザウイルス又はワクシニアウイルス又はこれらのいずれかの複製欠損誘導体が開示されている。適当な結合部分はモノクローナル後退、ScFvs、dAbsおよび最小の認識単位を含む。遺伝子治療とガン治療の分野における、標的細胞への遺伝子の輸送媒体としてのこれらのうち少なくともいくつかの用途が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 標的細胞に対して特異的な、修飾された結合部分を有するウィルス 本発明は、特に遺伝子療法及び癌治療の分野における、標的細胞への遺伝子の 輸送(delivery)媒体に関する。 標的細胞への遺伝子の輸送は、特に哺乳類の身体内においては、例えば遺伝子 療法、癌治療および未だ見いだされるべき遺伝的操作の領域において、多くの用 途を有する。輸送される遺伝子は、タンパク質もしくはRNAのような分子をコ ード(encode)することができるが、それらは標的細胞に対して細胞毒性である 。また、輸送される遺伝子は、標的細胞中で欠損した遺伝子の機能的複製をコー ドすることもできる。後者の場合には、前述の遺伝子の機能的複製による生成物 が、欠損した複製の生成物に置き換わり、標的細胞がその真性の機能を果すこと が可能となる。 遺伝子療法および癌治療のために遺伝子を輸送するウィルスもしくはウィルス 様の粒子の用途について開示する。 しかしながら、ほとんどの場合において望ましい遺伝子を含有するウィルスも しくはウィルス様の粒子が細胞を標的とすることは、宿主ウィルスの元来の特異 性、もしくは、例えば吸入による肺細胞へのウィルスの直接投与などの、標的と される細胞へのウィルスの局所投与に依存していた。 ヒトのアデノウィルス5(Ad5)ゲノムは、36キロ塩基対の二重鎖直線状 DNA分子からなる。ウィルスの複製周期には、二つの段階がある:4つの転写 ユニットE1、E2、E3およびE4が表現される前期段階、および主要な後期 プロモータ(MLP)から後期転写が表現されるとき、ウィルス性DNA合成の 開始後に起こる後期段階である。これらの後期の遺伝情報はほとんどのウィルス 性構造タンパク質をコードする。ヒトのアデノウィルス(Ads)のE1、E2 、およびE4遺伝子生成物は、他のウイルスの機能と同様に転写活性化、細胞変 態およびウイルス性DNA複製を伴い、ウィルス成長には欠かせないものである 。対照的に、E3遺伝子生成物は、培養細胞におけるウィルス複製もしくはワタ ネズミ(cotton rats)の深刻な肺の感染症には必須ではないが、インビボでの 免疫監視の回避にはなくてはならないことが判る。 我々は、”ウィルス様粒子”とは、(i)感染力がなく、(ii)その核酸に よる形質転換に従う、適切な細胞系中でのみ成長されるような、タンパク質に囲 まれた核酸のコア(core)を含む核タンパク質粒子のことを意味するものとする 。従って、哺乳類動物起源のウイルス様粒子は、Saccharomyces cerevisiae中、 もしくはバキュロウィルス発現形を経た昆虫細胞中にて成長されよう。 M13およびfdのような、新規な結合特性を生み出すための繊維状バクテリ オファージ(細菌性ウィルス)の被覆タンパク質の修飾は、Cwirlaら(1990)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-6382およびScott & Smith(1990)Scienc e 249,386-390に開示されている。 かねてより、例えば、Kingsmanら(1991)Tibtech 9,303-309に見られるよう に、レトロウィルスベクターを含むレトロエレメント粒子が特定の細胞を標的と するよう修飾されることが提唱されている。 本願の優先日以降であるが、出願日より以前に公開されたRussellら(1993)N ucl.Acids Res.21,1081-1085には、機能的抗体フラグメントを示すレトロウ ィルスベクターについて開示され、原則として、組換えレトロウィルス粒子の表 面上で抗体フラグメントを表わすことは、遺伝子輸送のためにウィルスを細胞へ の標的とするために使用できることを示唆している。しかしながら、ウィルスエ ンベロープタンパク質の全てのサブユニットが抗体に融合するようなレトロウィ ルスが組み立てられるか否かは不明であり、もしこれが可能であったとしても、 ウィルスが細胞に感染するか否かは不明である。 標的とされる遺伝子の輸送があるものと考えて、NIP-誘導(derivatised) ヒト細胞を試験したか、修飾したもの(抗-NIP抗体を表す)と修飾していな いエコトロピック(ecotropic)ウィルス粒子のいずれをも許容する結果となっ た。NIPは4-ヒドロキシ-3-ヨード-5-ニトロフエニル酢酸である。 本願の優先日以降であるが、出願日より以前に公開されたHichaelら(1993)J .Biol.Chem.268,6866-6869には、アデノウィルスおよび二つの連結した領域 、DNA結合領域とリガンド領域とからなるベクターシステムの間の分子結合 (conjugation)について記載されている。しかし、この構造においては、該構 造の交換リガンド領域と、付加的なリガンドが結合型に導入されたことによる細 胞特異的に標的とする潜在力との両方の可能性において、ウィルス性部分機能が 損われることが述べられている。 Curielら(1992)Human Gene Therapy 3,147-154には、異質エピトープがヘ クソンタンパク質に導入され、ポリリジン-抗体複合DNAがヘクソン上の異質 エピトープに結合している抗体によってアデノウィルスに結合されるようなアデ ノウィルスについて記載されている。異質DNAは、ビリオンの外側に結合して 転移する。 上記のウィルス及びウィルス様粒子は、その表面に表される結合部分を用いて 細胞を標的とすることができるが、依然としてその元来のホスト細胞をも標的と することもできる。 我々はここに、少なくともそのうちのいくらかは、高い特異性をもつ標的細胞 に結合することができ、標的細胞に遺伝物質を輸送することができる新たなウィ ルスおよびウィルス様粒子:少なくともウィルスおよびウィルス様粒子のいくら かは、ウィルスの元来の宿主細胞に実質的に結合することなく標的細胞に結合し 、遺伝物質を輸送することができることを発明した。 本発明は一つの態様として、標的細胞へのウイルスまたはウイルス様粒子の結 合を許容する結合部分によって与えられる修飾された結合特異性を包含する宿主 細胞受容体を有するウィルスもしくはウィルス様の粒子から誘導されるウィルス もしくはウィルス様の粒子を提供し、このウィルスもしくはウィルス様粒子が、 宿主細胞に対する受容体が修飾または欠落されるために、実質的にこの宿主細胞 に結合できないことを特徴とする。 “実質的にその宿主細胞に結合できない”とは、修飾されたウィルスが、宿主 細胞に対して修飾されていないウィルスのほんの1%の結合親和力しか有してい ないこととする。 一般に、元来のウィルスおよびウィルス様粒子の結合特異性は、ウィルスおよ びウィルス様粒子の表面に表現される受容体様分子と、その宿主細胞の表面に表 現される同系統の受容体様分子との間の特異な相互作用によって与えられる。本 発明は結合特異性の有益な修飾を提供し、これによってウィルスおよびウィルス 様粒子が異なる特異的な標的細胞に結合することが可能となる。 修飾された結合部分の導入は、例えば前記のように元来の結合特異性の転移( removal)を達成することであってもよい。 本発明の第二の態様は、該ウィルスを標的細胞へ結合させるようにした結合部 分によって与えられる修飾した結合特異性を有するウイルスであることを特徴と する、アデノウィルス、インフルエンザウィルスもしくは牛痘ウィルス、あるい はこれらのうちいずれかの複製−欠損誘導体を包含する。 “結合部分”とは、標的細胞上の分子と結合することのできる、ウィルスもし くはウィルス様粒子の表面に露出した分子を意味するものとする。この“結合部 分”は、その結合特異性が変化するような方法で修飾されたウィルスもしくはウ ィルス様粒子上の分子であるか、もしくは、新たな結合特異性を提供するために ウィルスもしくはウィルス様粒子に付加され、その表面に露出した分子であって もよい。 結合部分が、無垢で(naive)修飾していないウイルスの宿主細胞に対するレ セプターに外来であるならば好ましい。 結合部分が、スペーサーグループ(spacer group)によって直接または間接的 に、ウィルスもしくはウィルス様粒子に結合または融合されるならば、さらに好 ましい。 “宿主細胞”とは、その受容体様分子を用いて、修飾していない無垢のウィル スが結合することのできる細胞、および該細胞上の同系の受容体様分子を意味す るものとする。“標的細胞”とは、修飾したウィルスが、その結合部分を用いて 結合することのできる細胞を意味するものとする。結合部分が、同系の受容体様 分子ではない宿主細胞上の実体を認識するような、本発明の第二の態様に関する 状況では、宿主細胞が標的細胞となることもある。 ウィルスもしくはウィルス様粒子がバクテリオファージであり、標的細胞が細 菌であってもよく、このような場合は細菌性感染の治療における使用法を本発明 に見出すことができる。 本発明の好ましい実施態様においては、標的細胞は真核細胞である。この真核 細胞は酵母細胞であってもよく、ウィルスもしくはウィルス様粒子は、水虫もし くはカンヂダ(Candida)感染症のような酵母感染症の治療において、医療分野 で有用なものとなる。しかし、真核細胞は哺乳類のものであることが望ましく、 本発明が遺伝子療法および癌治療の領域において利用されることが予想される。 本発明の第一の態様の好ましい実施態様においては、ウィルスもしくはウィル ス様粒子はアデノウィルスもしくはインフルエンザウィルスもしくは牛痘のよう な疱瘡ウィルスである。 ウィルスもしくはウィルス様粒子が“複製−欠損(replication-defective) ”であることもまた好ましい。“複製欠損”とは、その遺伝材料が、その感染し た細胞中で分化もしくは繁殖することができないように操作されたウィルスのこ とを意味するものとする。 本発明のウィルスもしくはウィルス様粒子の結合部分は、標的細胞結合特異性 を提供する。細胞結合タンパク質もしくはペプチドもしくは炭水化物もしくは脂 質のいずれもが、細胞をウィルスもしくはウィルス様粒子の標的とするのに有用 であろう。例えば、ペプチドホルモンを構成するようなアミノ酸の短い直線範囲 は、標的細胞に結合し得る構造を個別に混入することができるポリペプチドの領 域であるので有用である。 好ましい実施態様においては、結合部分はモノクローナル性抗体、ScFv( 単鎖Fvフラグメント)、dAb(単領域抗体)もしくは抗体の最小認識単位の うちいずれか一つの特性を有する。 標的細胞上の結合部分は、標的細胞特異的抗原であってもよい。このような抗 原を表1に列挙する。他の結合部分、細胞上の標的および、修飾したウィルスも しくはウィルス様粒子によって輸送される薬剤を用いて有効に治療される疾患を 表2に与える。 この結合部分は、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗原の多くに 結合するモノクローナル抗体は既に知られているが、どんな場合でも、モノクロ ーナル抗体技術に関連する今日の技術を用い、ほとんどの抗原に対して抗体を調 整することができる。結合部分は、抗原の一部であってもよく(例えばFabフ ラグメント)、合成抗体フラグメントであってもよい(例えばScFv)。選択 された抗原に対する好適なモノクローナル抗体は、例えば、”モノクローナル抗 体:技術便覧(Mnoclonal Antibodies:Amanual of techniques)”H Zola(CRC Press,1988)及び”モノクローナルハイブリドーマ抗体:技術と応用(Monoclo nal Hybridoma Antibodies;Techniques and Applications)”J G R Hurrell( CRC Press,1982)に開示されたような周知の技術で調整することができる。 好適に調整された非−ヒト抗体は、例えば、マウス抗体のCDR領域をヒト抗 体の骨格構造(framework)に挿入するといった周知の方法で、”ヒト化(human ized)”することができる。 抗体の可変重量(variable heavy)(VH)及び可変軽量(variable light) (VL)領域は抗原認識に含まれ、事実は、初期のプロテアーゼ消化実験によっ て最初に認識される。さらなる確認は、”ヒト化”またはげっ歯類抗体によって 見いだされる。げっ歯類起源の可変領域は、ヒト起源の不変領域と融合され、そ の結果得られる抗体は、げっ歯類パレンタル(parental)抗体の抗原特異性を保 持している(Morrison等、(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851-6855 )。 その抗原特異性は、可変領域によって付与され、不変領域には依存しないこと は、すべてがひとつまたはそれ以上の可変領域を含む抗体フラグメントの細菌表 現(bacterial expression)を含む実験から知られる。これらの分子は、Fab −様分子(Better等(1988)Science 240,1041);Fv分子(Skerra等(1988 )Science 240,1038);VH及びVLパートナー領域が可撓性オリゴペプチドを 介して結合したScFv分子(BIrd等(1988)Science 242,423:Huston等(19 88)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879)及び単離したV領域からなるdA bs(Ward等(1989)Nature 341,544)を含む。特異的結合部位を保持した抗 体フラグメントの合成に含まれる技術の一般的な総説が、Winter及びMilstain( 1991)Nature,349 293-299に見られる。 ”ScFv分子”という用語によって、我々は、VHおよびVLパートナー(pa rtner)領域が可撓性オリゴペプチドを介して結合された分子を意味する。 全抗体ではなく抗体フラグメントを使用するのが有利である。補体結合のよう な全抗体のエフェクター機能は取り除かれる。ScFv及びdAb抗体フラグメ ントは、他のポリペプチドとの融合として発現されうる。 最小認識単位は、Fvフラグメントのひとつまたはそれ以上の相補的決定領域 (CDR)の配列から導かれる。全抗体、及びF(ab’)2フラグメントは” 二価(bivalent)”である。”二価”という用語によって、我々は、前記抗体及 びF(ab’)2フラグメントが、2つの抗原結合部位を有することを意味する 。逆に、Fab、Fv、ScFv、dAvフラグメント及び最小認識単位は、一 価であり、ひとつの抗原結合部位した持たない。 さらなる実施態様において、結合部分は標的細胞特異的な細胞表面受容体のリ ガンドの少なくとも一部である。 標的細胞特異的な細胞表面受容体は、ホルモン(GnRH)を放出するヒトの ゴナドトロピンに対する受容体であるのが好ましい。この好ましい実施態様にあ っては、結合部分がGnRHであり、その結合特異性は、表面にGnRH受容体 を表現するヒトの癌細胞に対するものである。そのようなヒト癌細胞の例は、前 立腺、胸部、及び子宮癌細胞である。 また、標的細胞特異的な細胞表面受容体は、黒色腫細胞で多く表現される黒色 素刺激ホルモン(MSH)に対する受容体である。この好ましい実施態様にあっ ては、結合部分はMSHであり、その結合特異性は黒色腫細胞に対してである。 また、標的細胞特異的な細胞表面受容体は、ソマトスタチンに対する受容体で ある。 もちろん、GnRH、MSH及びソマトスタチンに対する受容体は、それ自身 が標的細胞特異的な抗原であり、モノクローナル抗体、ScFv、dAbまたは 最小認識領域のうちのいずれかひとつの特性を有する結合部分によって認識され る。よって、標的細胞の結合部位が細胞表面受容体であっても、それは、結合部 分によって認識される標的細胞特異的な細胞表面受容体としても振る舞う。 ポリペプチドである結合部分が、組換えDNA技術を用いて便利に作られるこ とは、当業者には理解されるだろう。結合部分は下記に述べるウイルス表面のタ ンパク質またはウイルス様タンパク質と融合するか、あるいはそれらは、適当な 宿主の適当なベクターからの発現によって、ウイルスまたはウイルス様粒子とは 無関係に合成され、次いで後述のようにウイルスまたはウイルス様粒子に結合す る。 例えば、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン等の、多くの標的部位を コードする核酸配列は知られており、EMBL及びGenBankのような公衆 がアクセスできるヌクレオチド配列データベースを参照すれば容易に見いだせる 。ヌクレオチド配列がわかれば、例えば、化学的DNA合成技術を用いて、ある いは、ゲノムDNAからまたは組織特異的cDNAから要求されるDNAを増幅 するポリメラーゼ連鎖反応を用いて、選択された結合部分をコードするDNAの 製法は当業者にとって明らかである。 ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン等は、すべて結合部分として有用 であるが、それらをコードする多くのcDNAは、一般に、例えば英国バイオケ ミストリー会社(British Biotechnology Ltd)、オックスフォード、英国、か ら入手できる。 本発明のウイルスまたはウイルス様粒子が、その標的細胞に結合したとき、前 記標的細胞にその核酸を導く、即ち、標的細胞がウイルスまたはウイルス様粒子 に感染されるのが好ましい。この方法でウイルスまたはウイルス様粒子に感染し た標的細胞、特に癌細胞は、その表面にウイルス分子を表現し、免疫系によって 認識され破壊される。もちろん、他の細胞毒機能も細胞を殺す。 ひとつの実施態様では、ウイルスまたはウイルス様粒子がアデノウイルスであ るとき、EIB遺伝子は実質的に削除されるか、あるいはその遺伝子生成物がE 1Aタンパク質と決して相互作用しないように修飾される。E1Aタンパク質は アポプトシスを刺激するが、通常はその作用はE1Bによって阻害される。便利 なことに、E1B遺伝子は挿入によって不活性化され、好ましくは下記に定義す る細胞毒遺伝子が、E1B遺伝子またはその近傍に挿入される。 E1、E3及びE4の上流部位は、組換えアデノウイルスの生成における外来 DNAの挿入部位として使用できる。例えば、すべてここに参考文献として挙げ るBerknerとSharp(1984)Nucl.Acids Res.12 1925-1941;Chanda等(1990)V irology 175,535-547;Haj-AhmedとGraham(1986)J.Virol.57,267-274;Sa ito等(1985)J.Virol.54,711-719を参照。アデノウイルス粒子にパッケージ (package)できるDNA分子の大きさの上限は、野生種遺伝子の105%であ り、約2kbの外来(extra)DNAだけがウイルスDNAの欠失の補償なしに 挿入できる。E1は、細胞培地でのウイルス複製に必須であるが、そのウイルス が293細胞で成長するときは、E1配列は外来DNAに置換することができ、 それはAd5DNAで形質転換され、本質的にE1を表現する(Graham等(1977 )J.Gen.Virol.36 59-72、ここに参考文献として組み入れる)。Ad5のE 3から欠失された1.9kbを有するベクターは、細胞培地におけるウイルス複 製を阻害することなく構築される(GrahamとPrevec(1992)の総説”ワクチン: 免疫学的問題への新しいアプローチ(Vaccines:New Approaches to Immunologi cal Problems)”、R.W.Ellis(編)、Butterworth-Heinemann,Boston,MA, 364-390頁、ここに参考文献として組み入れる)。そのようなベクターは、4k bまでの外来DNAの挿入を可能にする。E3の挿入を含む組換えデノウイルス は、すべてのAd−透過性細胞列で複製し、E3挿入を含むアデノウイルスベク ターの多数がインビボ及びインビトロの両方で効率的に外来遺伝子を表現するこ とが観察された(Berkner(1988)Biotechniques 6,616-629;Chanda等(1990 )Virology175,535-547;Dewar等(1989)J.Virol.63,129-136;Graham(19 90)Trends Biotechnol.8,85-87;GrahamとPrevec(1992)”ワクチン:免疫 学的問題への新しいアプローチ”、R.W.Ellis(編)、Butterworth-Heinemann, Boston,MA,364-390頁;Johnson等(1988)Virology 164,1-14;Lubeck等(19 89)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6763-6767;McDermott等(1989)Virolog y 169,244-247;Morin等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,4626-4630 ;Prevec等(1989)J.Gen.Virol.70,429-434;Prevec等(1990)J.Inf.Di s.161,27-30;Schneider等(1989)J.Gen.Virol.70,417-427;Vernon等( 1991)J.Gen.Virol.72,1243-1251;Yuasa等J.Gen.Virol.72,1927-1934 、すべてここに参考文献として組み入れる)。 実質的に、複製−検出性アデノウイルスは、EIAタンパク質の欠損の生成に よって作られる。好ましくは、これは、E1A遺伝子の欠失あるいはE1Aタン パク質の表現を阻害するE1A遺伝子の突然変異によって達成される。 さらに好ましくは、ウイルスまたはウイルス様粒子は、遺伝子治療に好適な遺 伝子を含むようにさらに修飾される。 ひとつの実施態様において、遺伝子は、直接的または間接的な細胞毒機能を持 つ分子をコードする。”直接的または間接的”細胞毒という用語によって、我々 は遺伝子によってコードされた分子が、それ自身が毒性(例えば、リチン;腫瘍 壊死因子;インターロイキン−2;インターフェロンーガンマ;リボヌクレアー ゼ;デオキシリボヌクレアーゼ;プセウドモナス外毒素A)であるか、あるいは 代謝されて毒性生成物を生ずる、さもなくば他の何かにおいて毒性生成物を生ず る作用をすることを意味する。リチンcDNAの配列は、ここで参考文献として 取り入れられているLamb等(1985)Eur.J.Biochem.148,265-270に開示され ている。 例えば、本発明のウイルスまたはウイルス様粒子を用いて、酵素をコードする DNA配列を標的にするのが好ましく、その酵素は、比較的非毒性のプロドラッ グ(prodrug)を毒性のドラッグ(drug)に変換するものである。酵素シトシン デアミナーゼは、5−フルオロシトシン(5FC)を5−フルオロウラシル(5 FU)に変換する(Mullen等(1922)PNAS 89,33);単純性ほう疹酵素チミジ ンキナーゼは、細胞を、抗ウイルス薬ガンシクロビル(GCV)またはアシクロ ビル(aciclovir)での処理に対して敏感にする(Moolten(1986)Cancer Res. 46,5276;Ezzedine等(1991)New Biol.3,608)。例えば、E.coliまた はサッカロミセス属セレビシアエ(cerevisiae)といったすべての生物のシトシ ンデアミナーゼが使用できる。 よって、本発明の好ましい実施態様では、遺伝子はシトシンデアミナーゼをコ ードし、患者は付随的に5FCを与えられる。”付随的に”という用語によって 、我々は、腫瘍細胞の形質転換に関連して、前記遺伝子から表現されたシトシン デアミナーゼにより標的細胞において5FCが5FUに変換されるときに5FC が投与されることを意味している。投与量は、体重1kg当たり、1日に0.0 01から100.0mgの5FC、好ましくは0.1〜10.0mg/kg/日 である。 酵素の作用によって、比較的非毒性な形態から細胞毒性形態に変換される5F Cのような成分は、”プロドラッグ”と称される。 プロドラッグ/酵素の他の組み合わせは、Bagshawe等によって開示されている もの(WO88/07378)、即ち種々のアルキル化剤とポセウドモナスspp.CPG 2酵素、及びEpenetosとRowlinson-Buszaに開示されているもの(WO91/11201) 、即ちシアン発生のプロドラッグ(例えばアミグダリン)及び植物由来のβ−グ ルコシダーゼを含む。 この本発明の実施態様で有用な酵素は、以下のものを含むが、これらに限られ ることはない。リン酸含有プロドラッグをフリードラッグ(free drug)に変換 するアルカリ性ホスフアターゼ;硫酸含有プロドラッグをフリードラッグに変換 するのに有用なアリルスルフアターゼ;非毒性の5−フルオロシトシンを抗癌剤 である5−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ;セラ チア属プロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及 びカテプシン(カテプシンB及びL等)などの、ペプチド含有プロドラッグをフ リードラッグに変換するのに有用なプロテアーゼ;D−アミノ酸置換基を含有す るプロドラッグの変換に有用なD−アラニルカルボキシペプチダーゼ;グリコシ ル化プロドラッグのフリードラッグへの変換に有用なβ−ガラクトシダーゼ及び ノイラミニダーゼなどの炭化水素開裂酵素:β−ラクタムから誘導されたドラッ グのフリードラッグへの変換に有用なβ−ラクタマーゼ;ペニシリンVアミダー ゼまたはペニシリンGアミダーゼのような、アミノ基窒素においてフェノキシア セチル基またはフェニルアセチル基が誘導されたドラッグを各々フリードラッグ に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ。さもなくば、当業者にはabzy meとして知られている酵素活性を有する抗体も、本発明のプロドラッグをフリ ー活性ドラッグに変換するのに用いられる[例えば、R J Massey,Nature,328 457-458頁(1987)参照]。 同様に、本発明のプロドラッグは、前記したプロドラッグ、即ちリン酸含有プ ロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含 有プロドラッグ、D−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、 β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有 プロドラッグまたは任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、 5−フルオロシトシン及び他のフルオロウリジンプロドラッグであり、共役の酵 素によってさらに活性で細胞毒性のフリードラッグに変換されるものを含むが、 それらに限られるものではない。本発明で用いるプロドラッグ形態に誘導され得 る細胞毒性ドラッグの例は、エトポシド、テニポシド(teniposide)、アドリア マイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン(carminomysin)、アミノプテリ ン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、シスプラチン(cis-platinum)及びシ スプラチン類似物、ブレオマイシン、エスペラマイシン(esperamicins)[米国 特許番号4,675,187参照]、5−フルオロウラシル、メルフアラン及び 他の関連した窒素マスタード(mustards)を含むが、これらに限られるものでは ない。 さらなる実施態様においては、標的細胞に誘導される遺伝子は、標的とされた RNAまたはDNAを開裂させることのできるリボザイム(ribozyme)をコード する。開裂させるべく標的とされたRNAまたはDNAは、細胞に必須のRNA またはDNAでり、その開裂が細胞死をもたらすものであってもよく、開裂され るRNAまたはDNAは、例えば腫瘍遺伝子などの好ましくないタンパク質をコ ードするRNAまたはDNAであり、このRNAまたはDNAの開列が細胞の癌 化を阻害するものであってもよい。 ここに開示するウイルスまたはウイルス様粒子の遺伝子でコードされるリボザ イムは、CechとHerschang”Site-specific cleavage of single standard DNA” US 5,180,818;Altman等”Cleavage of targeted RNA by RNAse P”US 5,168,05 3;Cantin等”Ribozyme cleavage of HIV-1 RNA”US 5,149,796;Cech等”RNA r ibozyme polymerases,dephosphorylases,restriction endoribonucleases and methods US 5,093,246;及びBeen等”RNA ribozyme polymerazes,dephosphory lases,restiction endoribonucleases and method;cleaves single-standard RNA at specific site by transesterification”,US4,987,071に記載されてお り、これらはすべてここで参考文献として取り入れられる。 さらなる実施態様において、標的細胞に誘導される遺伝子はアンチセンスRN Aをコードする。 ”アンチセンスRNA”という用語によって、我々は、タンパク質をコードす るmRNA分子からの表現と交雑し阻害する、あるいは細胞中のプレ−mRNA またはtRNAまたはrRNAと交雑する、もしくは遺伝子からの表現と交雑し 阻害するRNA分子を意味する。 好都合には、アンチセンスRNAを表現する遺伝子は、mRNAに相補的なR NAのような適当な配列(orientation)におけるプロモーターに隣接したタン パク質をコードするコーディング配列を挿入することにより構築される。好まし くは、このアンチセンスRNAは、例えばras、bcl、src、またはp5 3及びRbのようなサプレッサー遺伝子といった腫瘍遺伝子のような望まれない ポリペプチドの表現をブロックする。 望まれないポリペプチドの表現を撤廃するのではなく、その表現を十分に減退 させることが理解されるであろう。 さらに、アンチセンスRNAとしての表現に好適なDNA配列は、GenBa nkやEMBLのような公衆がアクセスできるデータベースから容易に導かれる 。 本発明の他の実施態様では、遺伝子は、標的細胞の欠損遺伝子の機能を置き換 える。 ヒトを含む哺乳類には数千もの遺伝的遺伝子疾患が存在するが、それらは欠損 遺伝子に起因する。そのような遺伝子疾患は、CFTR遺伝子の突然変異である ことが知られている嚢性線維症、ジストロフィン(dystrophin)遺伝子の突然変 異であることが知られているデュシェーヌ筋ジストロフィー、HbA遺伝子の突 然変異であることが知られている鎌型赤血球疾患を含む。多くの種類の癌が欠損 遺伝子、特に光腫瘍遺伝子(photooncogenes)、及び突然変異を受けた腫瘍−サ プレッサー遺伝子によって発生する。 よって、嚢性線維症の治療に有効な本発明のウイルスまたはウイルス様粒子は 、欠損CFTR遺伝子の機能に置き換わる機能的なCFTR遺伝子を含むのが好 ましい。同様に、癌の治療に有効な本発明のウイルスまたはウイルス様粒子は、 欠損光腫瘍遺伝子または腫瘍−サプレッサー遺伝子の機能に置き換わる機能的な 光腫瘍遺伝子または腫瘍−サプレッサー遺伝子を含むのが好ましい。 光腫瘍遺伝子の例は、ras、src、bcl等であり、腫瘍−サプレッサー 遺伝子の例は、p53及びRbである。 ”遺伝子”という用語によって、我々は、イントロン、またはそのフラグメン ト、またはcDNA、またはそのフラグメントを含む核酸コード配列を意味する 。 遺伝子は、ウイルスまたはウイルス様粒子のゲノム中の適宜の位置に導入され 、その表現を押し進めるプロモーター及び/またはエンハンサー(enhancer)を 含むことが理解される。 プロモーター及び/またはエンハンサーが標的とすべき細胞に対して選択的で あるのが好ましい。組織または腫瘍特異的なプロモーターの数例を以下に挙げる が、あらゆるときに発見される新種もこの本発明の実施態様に有用である。 ともにメラニン色素の合成に鍵となる役割を演ずるチロシナーゼ及びTRP− 1遺伝子は、メラノサイト細胞の生成物に特異的なタンパク質をコードする。チ ロシナーゼ及びチロシナーゼ−関連タンパク質(TRP−1)遺伝子の5’末端 は、これらのプロモーター要素の下流をクローンした遺伝子上の表現の組織特異 性を与える。 これらの遺伝子の5’末端は、M.Bradl等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 88,164-168及びI.J.Jackson等(1991)Nucleic Acid Res.19,3799-3804 に記載されている。 前立腺特異的抗原(PSA)は、ヒトの前立腺分泌の主要なタンパク質成分で ある。それは、前立腺癌の検知及びモニターのための有効なマーカーとなる。P SA及びPSAの前立腺特異的表現を司るプロモーター領域をコードする遺伝子 は、(Lungwall(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.161,1151-1159;Riegm an等(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.159,95-102;Brawer(1991)Acta Oncol.30,161-168)に記載されている。 発癌抗原(CEA)は、腫瘍マーカーとして、特に大腸癌患者の監視において 広く用いられている。CEAは、正常な組織にも存在するが、腫瘍組織において は対応する正常な組織に比較して高いレベルで明確に表現される。CEAをコー ドする完全な遺伝子は、クローンされ、そのプロモーター領域が分析された。そ の翻訳出発点より上流側の約400のヌクレオチドを含むCEA遺伝子プロモー ター構造は、腺癌細胞列SW303において、HeLa細胞列に比較して9倍高 い活性を示した。これは、細胞型特異的表現を伝達するシス−アクティング(ci s-acting)配列が、この領域に含まれていることを示している(Schrewe等(199 0) Mol.Cell.Biol.10,2738-2748)。 c−erbB−2遺伝子及びプロモーターは、既に特徴づけされ、遺伝子生成 物は腫瘍細胞列において過−表現されることが示された(Kraus等(1987)EMBOJ .6,605-610)。 ムチン遺伝子、MUCI、は、胸部及び膵臓細胞列において選択的に表現を指 図できる5’フランキング(flanking)配列を含むが、WO91/09867に 教示されているように、非−上皮細胞列においてはできない。 ウイルスまたはウイルス様粒子を標的細胞に結合させる結合部分は、ポリペプ チドまたはオリゴ糖または脂質またはその標的細胞に特異的に結合できる他のあ らゆる分子であってよい。 結合部分はポリペプチドであるのが好ましい。 結合部分が結合されるウイルスまたはウイルス様粒子表面上の分子は、ウイル スまたはウイルス様粒子の被覆中のポリペプチド、オリゴ糖、または脂質または 他の分子であってよい。その分子はポリペプチドであるのが好ましい。 結合部分及びウイルスまたはウイルス様粒子表面上の分子がともにポリペプチ ドであるとき、それらは、O'Sullivan等Anal.Biochem.(1979)100,100-108 に一般的に記載されているようなポリペプチドを架橋する従来の方法のいずれか によって互いに結合される。例えば、結合部分がチオール基に富んだものであり 、ウイルスまたはウイルス様粒子表面の分子がそれらのチオール基と反応可能な 、例えばヨウ化酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHIA)また はN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(CPD P)といった2官能性試薬と反応していてもよい。例えば、m−マレイミドベン ゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって得られるようなアミド 及びチオエーテル結合は一般的に、インビボにおいてジスルフィド結合より安定 である。 他の化学的方法が、オリゴ糖及び脂質と、他のオリゴ糖、脂質またはポリペプ チドと結合するのに有効である。 結合部分及びウイルスまたはウイルス様粒子表面上の分子がともにポリペプチ ドであり、そのポピペプチドが遺伝子工学の技術の作用によって生成されるのが 好ましい。遺伝子工学の使用は、そのようなポリペプチドの融合よりも正確な制 御を可能にする。 よって、本発明のさらなる実施態様は、結合部分とウイルスまたはウイルス様 粒子表面のタンパク質との融合をコードするヌクレオチド配列である。 この結合部分とウイルスまたはウイルス様粒子表面のタンパク質との融合をコ ードするヌクレオチド配列は、ウイルス遺伝子の変性によって生成されるのが好 ましい。 ヌクレオチド配列は、固相ホスホルアミダイト(phosphoramidite)化学を用 いてデノポ合成されるが、このヌクレオチド配列を2つの部分から構築する方が 普通であり、その第1の部分が結合部分をコードし、第2の部分がウイルスまた はウイルス様粒子表面上のタンパク質をコードする。この2つの部分は、各々の 遺伝子から制限エンドヌクレアーゼ消化作用により、またはポリメラーゼ連鎖反 応のような当業者に知られた方法によって導かれる。 相補的結合末端を介した2つのヌクレオチド配列を有効に結合させるための多 くの方法が開発されている。例えば、ひとつまたはそれ以上の制限部位を含む合 成リンカー(linkers)は、2つのDNAセグメントを互いに結合する方法を提 供する。エンドヌクレアーゼ制限消化作用によって生成された各DNAセグメン トは、E.coliDNAポリメラーゼIのバクテリオファージT4DNAポリ メラーゼで処理されるが、これは、3’−5’−エキソヌクレオリチック(exon ucleolytic)活性を持つ突き出た3’一本鎖末端を取り除き、引っ込んだ3’末 端をこれらの高分子化活性で満たす酵素である。 従って、これらの活性の組み合わせは、鈍い(blunt)末端のDNAセグメン トを生ずる。この鈍い末端のセグメントは、次いで、バクテリオフアージT4D NAリガーゼのような鈍い末端のDNAの配位を触媒できる触媒の存在下で、過 剰なモル数のリンカー分子とともにインキュベートされる。よって、この反応の 生 成物は、高分子リンカー配列を末端に有するDNAセグメントである。これらの DNAセグメントは、次いで適当な制限酵素で開裂され、DNAセグメントの末 端に見合う末端を生ずる酵素で既に開裂された表現ベクターにリフトされる。 多くの制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、International Bi othchnologies Inc,Nwe Haven,CN,USAを含む多くの供給元から商業的に入手 可能である。 本発明の融合ポリペプチドをコードするDNAを生成する好ましい方法は、Sa iki等(1988)Science 239,487-491に記載されたように、ポリメラーゼ連鎖反 応を用いるものである。 この方法では、融合される2つのポリペプチドをコードする各DNA分子が、 2つの特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(primer)を用いて酵素的に増幅 され、それ自身が増幅されたDNAに取り込まれる。前記特異的なプライマーは 、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、それは次いで前述したT4DNAリ ガーゼを用いた前記2つのDNA分子の結合に使用される。 本発明のひとつの態様の特別な特徴は、本発明のウイルスまたはウイルス様粒 子をその宿主細胞には決して結合しないように、なおかつ標的細胞にはその結合 部分によって結合するように修飾することである。 アデノウイルスの宿主細胞受容体は、ペントン線維であってもよく、インフル エンザウイルスのそれは赤血球凝集素受容体であってもよい。 これらの受容体は、アミノ酸残基の挿入または削除または置換によって、それ らの宿主細胞結合機能を分裂させるように修飾されていてもよい。好ましくは、 標的細胞に対する結合部分は、結合部分が標的細胞と結合できるような方法で宿 主細胞受容体に結合され、宿主細胞受容体は宿主細胞に結合できず、従ってウイ ルスまたはウイルス様粒子の結合特異性が修飾される。さらに好ましくは、ウイ ルスまたはウイルス様粒子表面に露出した宿主細胞受容体の部分が結合部分に置 換され、標的細胞によるウイルスDNAの取り込みを促進する宿主細胞受容体の 部分が残存している。好ましくは、結合部分は宿主細胞受容体にスペーサー基に よって直接的または間接的に結合している。 スペーサー基の例は、4から1000アミノ酸残基のポリペプチド配列である 。 よって、本発明のひとつの実施態様では、アデノウイルスにおけるペントン線 維をコードする遺伝子は、表面露出した部分をコードするDNAがScFvをコ ードするDNAフラグメントに置換され、そのScFvが、標的細胞表面抗原に 結合する抗体から導かれたものであるような方法で修飾される。 ペントン線維の融合可能な部位は同定されている。 アデノウイルス線維は、3つのプロモーターからなるトリマーである。この軸 は血清型によって種々の長さを持ち、15アミノ酸の繰り返し単位からなる(例 えば、血清型は6、15、及び21繰り返し単位で同定される)。これらの繰り 返し単位は2重ではない:アミノ酸構造の正確な保存ではなく、相対的な疎水性 の一般的保存がある。例えば40及び41のようないくつかの血清型は、異なる 長さの線維タンパク質の軸を持つ。これは、構造の束縛においてある程度の可撓 性があることを示唆している。 カルボキシ末端(或る200アミノ酸)は、ノブ(knob)の形成を助長し、そ れはカプシドから(分子のレベルで)遠く離れて直立に保持される。細胞受容体 及びドッキングの機構は明確に同定され説明されていないが、我々は、細胞結合 の最も近い候補となる構造はノブであることを提案する。よって、ひとつの実施 態様において、ペントン線維のすべてのノブは、単鎖抗体(ScFv)領域で置 き換えられる。3重構造は、各線維が3つのScFvで終わることを意味してい る。さらに、ScFv領域はCDR、あるいは知られた特異性の非抗体由来ペプ チドまたは標的細胞と特異的に相互作用をすることができる他の分子で置き換え られる。 従って、好ましい融合部位は、軸及びノブ領域の元の結合、あるいは(DNA 配列がよりアメナブル(amenable)であることが証明される必要があるが、)軸 の反復単位間のすべての結合にある。好ましくは、軸の最小長さは、天然に同定 された最小寸法を越えて短くなることはない。よって、融合が考えられる少なく とも15の潜在的部位がある。 結合部分が線維の末端を形成し、それによってノブを置換するのが好ましいが 、結合部分は、まだその結合表面を顕現し標的細胞に結合するのを除くペントン 線維配列内で融合してもよい。 好ましくは、結合部分はノブと融合し、ノブ構造の外に伸びる。 さらなる実施態様では、インフルエンザウイルス赤血球凝集素は、結合部分に 取り込まれるように修飾される。インフルエンザウイルスは、(血清型に応じて )7または8の遺伝子セグメントを有し、すべてネガティブストランド(negati ve strand)RNAである。好ましくは、赤血球凝集素をコードするすべてのセ グメントからのcDNAは、このセグメントを横切って後方(backward)に刺激 し、ネガティブストランドRNAがつくられるようなプロモーターを添加するこ とによって構築され修飾される。上述したような、好適な結合分子との遺伝子の 融合は、標準的な組換えDNA法を用いてなされ、好適な細胞ラインがこの遺伝 子構造物でトランスフェクシヨンされる。このトランスフェクションされた細胞 ラインのインフルエンザウイルスでの感染、及び、新しい赤血球凝集素によって のみ認識されるマーカーを表現する通常のレジスタント細胞列の感染による新し い赤血球凝集素を含む再分類(reassort)されたゲノムの選択は、修飾された細 胞結合特異性を持つ目的とするウイルスを生み出す。 本発明のさらなる態様は、細胞培地においてウイルスまたはウイルス様粒子を 生成し、次いで上述した結合部分を、ウイルスまたはウイルス様粒子に結合する 方法を提供する。 本発明のさらなる態様は、細胞培地において、その表面に結合部分を表現する ように遺伝子的に修飾されたウイルスまたはウイルス様粒子の製造方法を提供す る。ウイルスまたはウイルス様粒子は、修飾に先立ってその宿主中で成長するが 、ひとたび結合特異性を変える修飾がなされると、そのウイルスまたはウイルス 様粒子は標的細胞中で成長する。よって、例えば結合部分が胸部腫瘍細胞抗原を 認識する場合、そのウイルスまたはウイルス様粒子は胸部腫瘍細胞培地中で成長 する。 本発明のウイルスまたはウイルス様粒子は、如何なる方法で投与されてもよい が、通常は注射であり、例えば、静脈内、腹腔内、または嚢内で、標準無菌液、 例えば(静脈内投与のときの)生理食塩水といった希釈剤及びキャリアの非発熱 性製剤中でなされる。 本発明のさらなる態様は、間接的細胞毒機能を有する分子をコードする遺伝子 を含むウイルスまたはウイルス用粒子の輸送方法を提供する。 好ましくは、この間接的細胞毒機能は、プロドラッグを細胞毒ドラッグに変換 する酵素である。そのようなウイルスまたはウイルス様粒子を用いて、まずその ウイルスまたはウイルス様粒子が標的細胞に結合し、その核酸を細胞に導き、そ して間接的細胞毒機能を表現するが、それは通常1日程度を要し、次いでプロド ラッグを投与する。ウイルスまたはウイルス様粒子の投与と、プロドラッグの投 与との間のタイミングは、非発明的方法で最適化できる。 プロドラッグの投与量は、医師によって通常の基準に従って選択される。ウイ ルスまたはウイルス様粒子の投与量は、同様に通常の基準に従って、腫瘍治療の 場合は、特にその腫瘍の型、段階、場所及び患者の体重を参照して選択される。 治療期間は、部分的にはウイルスまたはウイルス様粒子に対する免疫反応の迅速 性及び程度による。 ウイルスまたはウイルス様粒子のいくつかは、それ自身または適当なプロドラ ッグとともに、任意の腫瘍の細胞または認識可能な(表面)実体を選択的に現す 細胞の定義された分類の破壊に対して極めて安定である。ウイルスまたはウイル ス様粒子を用いて治療される癌の型は、胸部、前立腺、大腸、直腸、卵巣、精巣 、及び脳の癌である。化合物は、主にヒト用をめざすが、イヌ、ネコ、ウシ、ウ マ、ブタ、及びシカを含む他の哺乳類の治療にも使用できる。 ここに、本発明を以下の図面及び実施例を参照して詳細に説明する。 図1は、(a)宿主細胞に結合し感染できるが標的細胞のような非宿主細胞に はできない非修飾(即ち”無垢”)のウイルスまたはウイルス様粒子;及び(b )宿主細胞には結合せず感染しないが、標的細胞には結合し感染するように修飾 された結合特異性を持つウイルスまたはウイルス様粒子、及び(c)(b)と同 様で、さらに遺伝子治療または癌治療用の遺伝子を含むように修飾されたウイル スまたはウイルス様粒子を示す。 図2は、(a)非修飾(無垢)のアデノウイルス、(b)宿主細胞を認識する ペントン線維が、標的細胞を認識する抗体フラグメントに部分的に置換されるよ うに修飾されたアデノウイルス、及び(c)(b)と同様で、癌の遺伝子治療用 のウイルスDNAに加えてさらに遺伝物質を持つアデノウイルスを示す。 図3は、(a)インフルエンザウイルス及び(b)少なくとも血液凝集素部位 の部分が、抗−癌細胞結合活性を持つ抗体で置換された遺伝子修飾されたインフ ルエンザウイルスを示す。 図4は、レトロウイルス;及び(b)表面に抗癌細胞−結合性抗体フラグメン トまたは抗癌細胞−結合性ペプチドを表現するようさらに修飾されたものを除い て(a)と同様なレトロウイルスを示す。 図5は、線維内の融合可能な部位を示すペントン線維を表す図である。 図6は、Ad5線維及びScFvをコードするDNA間の融合を示す。 図7は、ScFvの増幅に用いられるオリゴヌクレオチドの配列を示す。すべ てのオリゴヌクレオチドは5’から3’に存在し、FORプライマーの逆の(re verse)補体が表され誘導されたアミノ酸配列が関連して示される。 図8は、プラスミドpRAS117の構造を示す。 図9は、pRAS117のHindIIIとEcoRIとの間のヌクレオチド 及び誘導されたアミノ酸配列を示す。 図10は、プラスミドpRAS117のマップ(map)を示す。 図11は、プラスミドpRAS118の構造を表す図である。 図12は、Ad5線維DNAフラグメントを増幅するためのオリゴヌクレオチ ドの配列を示す。すべてのオリゴヌクレオチドは5’→3’に存在する。FOR プライマーの逆の補体が表される。誘導されたアミノ酸配列が関連して示される 。 図13は、pRAS111のHindIII部位とEcoRI部位との間のヌ クレオチド配列と演繹されたアミノ酸配列を示す。 図14は、細胞毒遺伝子を有するアデノウイルスの構築を表す図である。 図15は、マウス及びヒト化したHMFG1可変領域のヌクレオチド及びアミ ノ酸配列を与える。 [実施例1: 単鎖Fv(ScFv)を含有する結合部位が融合するアデノウイ ルスAd5ファイバー内の融合部位] ここで用いられるAd5 DNA配列の並び(co-ordinates)は、以下から得 られる: ADRCOMPGE 1: 残基1から32760 および ADRCOMPGE 2: 残基32761−35935 これらは、Intelligeneticsデータベース上のプログラムSEQを用いてアク セスできる。 Ad5ファイバーの配列は、Chroboczek,J.およびJacrot,B.(1987)”Th e Sequence of adenovirus fiber:Similarities and differences between ser otypes 2 and 5”Virology,161,549-554中にも見出される。またアクセス名A DEFIBでドイツ、ハイデルベルクのEHBL Databaseより入手可能である。 シャフトとScFvとの間の融合配列を図6に示す。融合部位は、シャフトの 繰り返し単位の接合点にある。シャフト配列は通常のタイプ文字で示す;ScF v配列はイタリック体で示す。pstIおよびXhoI部位は、用いたScFvに特有 のものである。 融合Aはシャフトの第1番目の繰り返し単位の末端(31218−9の並び) にあり、融合Bは第2番目の末端(31266−7)に、融合Cは第3番目(3 1323−4)に、融合Dは第4番目(31368−9)に、融合Eは第5番目 (31413−4)に、融合Fは第6番目(31458−9)に、融合Gは第7 番目(31503−4)に、融合Hは第8番目(31551−2)に、融合Iは 第9番目(31596−7)に、融合Jは第10番目(31641−2)に、融 合Kは第11番目(31692−3)に、融合Lは第12番目(31737−8 )に、融合Mは第13番目(31787−8)に、融合Nは第14番目(318 36−7)に、融合Oは第15番目(31884−5)に、融合Pは第16番目 (31929−30)に、融合Qは第17番目(31995−6)に、融合Rは 第18番目(32040−1)に、融合Sは第19番目(32103−4)に、 融合Tは第20番目(32151−2)に、融合Uは第21番目(32199− 200)に、そして融合Vはシャフトの第22番目の繰り返し単位の末端(32 244−5)、すなわちシャフトとノブとの間の接合点にある。 [実施例2: 表面上でScFvを発現するアデノウイルスの調製] 以下により、遺伝学的に修飾されたファイバーをAd5ゲノム中に導入する: (a)標準的な組換え体DNA技術によって、プラスミドpE4のファイバー遺 伝子を修飾されたファイバーと置換し、そして(b)組換えによってウイルスを 再構成する。 pE4は、Ad5ゲノムの右手側半分を含有し、かつ、私たちが用いたAd5 ファイバー遺伝子源としての役割をもった、プラスミドである。これは、この構 造の詳細を示した、コベントリーCV4 7AL、ウォーリック大学(University of W arwick)Biological SciencesのKeith Leppard博士によって与えられた。これが Ad5ゲノムの残りを含有する哺乳類の細胞中に導入されると、修飾を有する組 換え体を得ることができる。ヒトのセルラインのほとんどが組換えのために使用 できるが、HeLa細胞が好ましい。 プラスミドpE4は、次の方法で容易に作製される。BstN1を用いて消化し、 pBR322配列中の位置1442−2502に対応するBstN1フラグメントが 除去されるようなXhoIリンカーを用いて再結合することにより、pBR322 の誘導体が作製される。JonesおよびShenk(1979)Cell 17,683-689に記載され ているアデノウイルスAd5株309からのDNAを単離し、除タンパクする。 つぎに、このDNAをClaIリンカーに連結し、EcoRIとClaIとで切断する。76 %のAd5ゲノムから右手側末端までの領域に対応するEcoRI-ClaIフラグメン トはを単離し、上述のpBR322誘導体のEcoRI-ClaI部位にクローン化して 、pE4を形成する。 アデノウイルスタイプ5およびHeLa細胞は、アクセス番号ATCC VR -5およびATCC CCL-2で、米国メリーランド州20852-1776、ロックビル 、Packlawn Drive 12301のAmerican Type Culture Collectionから入手可能であ る。 プラスミドpRAS117の構成 プラスミドpRAS111のHindIII部位から、シャイン-ダルガルノの配列 とpelBリーダー配列とを越えて、ScFv中のPstI部位までにわたるDNAセグ メントをPCRで仲介して増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーLE ADHBACKおよびLEADbFOR(図7)を用いた。LEADbFORは 、pelBリーダー配列の直後のBglII部位の併合を律する。各プライマー25pmol と、各dNTP250mMと、67mMのトリス-HCl(pH8.8)と、17mM の(NH42SO4と、1.5mMのMgCl2と、200mg.ml-1のゼラチンと、T hermus aquaticus(Taq)ポリメラーゼ(Cetus)の5単位とを有する50μlの 反応容積中で、25μlのパラフィン油で覆って、プラスミドpRAS111か らのDNA(100ng)を24回の増幅に供した(94℃)1分;65℃、1. 5分および72℃、2分)。反応の後で、500μlのクロロホルムを用いた抽 出によって、油を除去した。サンプルを2%のアガロースゲル上に載せ、増幅さ れたフラグメントを1枚のNA45紙(Schleicher and Schuell)上に電気泳動 させた。つづいて、TE(10mM トリス-HCl、pH7.5、1mM EDTA )中に調製された400μlの1mM NaCl中に70℃で30分間浸漬すること により、結合したDNAを溶出した。これに800μlのエタノールを加え、そ してインキュベーション(2時間、−20℃)の後でDNAを遠心分離によって 回収した。50μlのT/E中でペレットを得た。 精製した増幅されたフラグメントの5分の1(10μl)を、制限酵素HindII IおよびPstIを用いて、各酵素を10単位ずつ含有し、50mMのトリス-HCl、 pH7.5、と、10MgCl2と、100mMのNaClと、1mMのジチオエリ トレイトール(dithioerythreitol)との総容積20μl中で切断した。インキュ ベーション(1時間、37℃)の後、70℃で15分間インキュベーションを行 うことによって反応を止めた。 平滑断端にされた増幅されたフラグメントを、pUC8のHindIIIおよびpstI 部位の間でクローン化した。 プラスミドpUC8(1μg)を、制限酵素HindIIIおよびPstIを用いて、各酵 素を10単位ずつ含有し、50mMのトリス-HCl、pH7.5、と、10Mg Cl2と、100mMのNaClと、1mMのジチオエリトレイトールとの総容積2 0μl中で切断した。インキュベーション(1時間、37℃)の後、70℃で 15分間インキュベーションを行うことによって反応を止めた。 連結反応には、70mMのトリス-HClpH7.5と、7mMのMgCl2と、0 .7mMのrATPと、4mMのジチオトレイトールと、0.5mg.ml-1のBSAと 、T4 DNAリガーゼの10単位とを含有する15μlの総容積中に、pUC 8/HindIII,PstIを1.5μlと増幅されたリーダー/HindIII,PstIを3μl入 れた。インキュベーション(2時間、室温)の後、1μlの500mMのEDTA 、pH8.0、および14μlのH2Oを添加することによって反応を止めた。 この連結混合物を用いて、E.coliを形質転換した。 この連結混合物のアリコート(5μl)を用いて、商業的に入手可能なコンピ テントE.coli K12 DH58,1αF(Life Sciences Inc)の200μlの アリコートを形質転換した。インキュベーション(30分、0℃)と、熱ショッ ク(2分、42℃)と、800μlのL-ブロスの添加と、回復(37℃、1時間 )の後で、50mMのIPTG(イソプロビル-β-D-ガラクトピラノシド)と1 00μg.ml-1のX-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラク トピラノシド)とを含有する100μg.ml-1のアンピシリンを含んだL-寒天プ レート上に細胞(100μl)を散布した。細胞を37℃で一晩増殖させ、個々 のコロニーを新しいL-寒天/アンピシリンプレートに移した。6時間の増殖の 後、コロニーを用いて100μg.ml-1のアンピシリンを含有するL-ブロス5ml のアリコートを接種した。これらの細胞を37℃で振りながら一晩増殖させ、プ ラスミドDNA源として用いた。 これらの細胞をプラスミドDNA源として用いた。 収穫された細胞を、2mg.ml-1の鶏卵リゾチームを含有するSET(50mMの ショ糖、100mMのトリス-HCl、pH7.5)360μl中で懸濁し、1.5 mlのマイクロフュージ管(microfuge tube)に移し、300μの10%のTriton X-100を添加して希釈した。沸騰水上に2分間浮かべ、氷/水中でさらに1分間 冷却した後に、マイクロセントリフュージ(microcentrifuge)中で遠心分離( 14000xg,20分)することによって変性された細胞破片を除去した。3 00μlの7.5Mの酢酸アンモニウムを添加し、遠心分離(14000xg ,10分)することにより、可溶性の残存するタンパク質の大部分を除去した。 720μlの低温(−20℃)のイソプロパノールを添加し、遠心分離(140 00xg,10分)することにより、核酸を沈殿させた。エタノールを用いてペ レットを濯いで乾燥した後に、170μg.ml-1のRNアーゼAを含有する60μ lのTE中でDNAを可溶化した。 酵素HindIIIおよびBglIIを用いて5μlのアリコートを制限酵素消化すること により、これらのプラスミドのうちのどれがpRAS117であるかを同定した 。この構成の図式を図8に示す。pRAS117のHindIIIおよびEcoRI部位の 間の、ヌクレオチドおよび誘導されるアミノ酸の配列を図9に示す。プラスミド pRAS117の地図を図10に示す。 HindIII部位とEcoRI部位との間の、pRSA111の関連部分のヌクレオチ ド配列を図13に示す。 プラスミドpRAS118の構成(図11) pRAS117のHindIII-pstIフラグメントを130bp用いて、pRAS1 11の対応するフラグメントを置換し、プラスミド118を生成した。前記で用 いられた条件でHindIIIおよびPstIを用いてpRAS111 DNAのアリコー ト(2μg)を切断し、大きいフラグメントを前記のように電気泳動でNA45 紙上に単離し、DNAをTE10μl中で懸濁した。前記で用いられた条件でHin dIIIおよびpstIを用いてpRAS117 DNAのアリコート(10μl)を切 断し、小さいフラグメントを前記のように電気泳動でNA45紙上に単離し、D NAをTE 10μl中で懸濁した。 単離されたpRSA111/HindIIIPstIの大きいフラグメント(1.5μl) とpRSA117/HindIIIPstIの小さいフラグメント(3μl)とを混合し、前 記の条件で連結した。 形質転換、コロニーの取扱い、およびDNAの調製は、前記したとおりである 。 酵素HindIII、PstI、およびBgIIIを用いて5μlのアリコートを制限酵素消化 することにより、これらのプラスミドのうちのどれがpRAS118であるか を同定した。これにより、BglIIクローニング部位がPe1Bリーダーのすぐ下流に あって、Ad5ファイバーからのDNAのフラグメントを挿入するのに適した( また、他の望ましい融合作用の融合にも適した)、NIP反応性のScFvがコ ードされる。 Ad5ファイバーDNAフラグメントの増幅 オリゴヌクレオチドTAILbBACKと、オリゴヌクレオチドFIBREP FOR、FIBRE3FOR、FIBRE6FOR、FIBRE9FOR、FI BRE12FOR、FIBRE15FOR、FIBRE18FOR、FIBRE 21FOR、FIBRE22FORのいずれかとを用いたPCRによって、Ad 5ファイバーからのDNAフラグメントを増幅した。オリゴヌクレオチド配列は 図12に記載されている。 TAILdBACKは、ファイバーの基部でのBglII部位の併合を律する。F IBREnFOR系プライマーは、シャフト繰り返し単位3−4(FIBRE3 FOR)、6−7(FIBRE6FOR)、9−10(FIBRE9FOR)、 12−13(FIBRE12FOR)、15−16(FIBRE15FOR)、 18−19(FIBRE18FOR)、21−22(FIBRE21FOR)の 接合点か、単位22とノブとの間(FIBRE22FOR)か、もしくはノブ配 列の末端(FIBREPFOR)で、PstI部位の併合を律する。 ファイバーおよびScFvの融合 ファイバーの増幅されたセグメントをBgIIIとPstIとを用いて平滑断端にし、 プラスミドpRAS118のBgIIIおよびPstI部位の間で連結する。これにより 、T7プロモーターの転写調節下での融合の領域が与えられる。融合を発現しな い、DH5などの適当なE.coli株の形質転換の後で、コロニーを回収する。 スクリーニング 融合用の候補を含有するコロニーを、これらのプラスミドDNAの制限酵素消 化によって同定する。これらの候補のDNAを用いて、lac制御下でT7ポリメ ラーゼの染色体挿入を有する、BL21(DE3)などの適当なE.coli株を形 質転換する。これらの細胞中では、無償性誘導物質を用いるT7ポリメラーゼの 発現の誘発により、融合タンパク質の発現が起こる。可溶性NIP-反応性材料 を、正しく組み立てられた融合を有するコロニーにおいて同定する。これらの有 するDNAを同定し、pRAS111から誘導されるNIP-反応性ScFvを 細胞結合性ScFvと置換する。 プラスミドpE4中のファイバー:ScFvの置換 ファイバー遺伝子の約半分に沿ってHindIII部位がある。また、長いファイバ ーを有する融合には、このHindIII部位が含まれている。この融合は、この部位 に導入される。 インビボにおけるプラスミドpE4-ScFvのアデノウイルスゲノムとの組換 え ペントンファイバー上でScFvを発現するウイルス粒子を得るために、参 照によってここに援用されるMittalほか(1993)Virus Res.28,67-90に記載さ れているように、293細胞などのの適当な細胞をプラスミドpE4−ScFv およびプラスミドpFG173でコトランスフェクトする。pFG173とpE 4-ScFvのいずれも個々ではウイルス子孫を生成することができないので、 293細胞のトランスフェクシヨンの際に、生存できるウイルス子孫はこれら2 つのプラスミドの間のインビボでの組換えによってのみ生成され、その結果Ad 5ゲノム中へのペントンファイバー-ScFv融合が確保される。 293細胞は、アクセス番号ATCC CRL 1573でATCCから入手 可能な、ヒトの形質転換された一次胚細胞である。 こうして作られたアデノウイルス粒子は、これらの表面上にNIP結合性Sc Fvを発現する。この様な粒子は、表1および2に同定されたような、標的細胞 特異性結合部分がNIP分子に接続し、かつ細胞を標的とするような、2段階標 的化の方策において有用である。いったんこれらが患者体内の標的細胞に局在化 すれば、NIP結合性ScFvを示すアデノウイルスが患者に投与され、NIP に結合する。 [実施例3: アデノウイルスAd5のE3領域中への細胞毒性遺伝子の挿入] Ad5のE3領域中への細胞毒性遺伝子を確保する(rescue)ための調製にお いて、SV40初期プロモーターとポリA付加配列とを有するカセット中に細胞 毒性コード化配列をまず挿入して、図14に示されたプラスミドpTOXが得ら れた。 E3領域に細胞毒性遺伝子とSV40調節配列とを有するウイルスを得るため に、プラスミドpTOXおよびpFG173(図14)を用いて293細胞をコ トランスフェクトする。プラスミドpFG173は、Grahm(1984)EHBO J.3, 2917-2922およびMitallほか(1993)Virus Res.28,67-90に記載されている、 75.9m.u.としてEcoRIでkanr遺伝子を挿入することによって円形のAd 5 d1309ゲノムを含有する感染性プラスミドである、pFG140から構 成される。 pFG173とpTOXのいずれも個々では感染性ウイルス子孫を生成するこ とができないので、293細胞のトランスフェクシヨンの際に、生存できるウイ ルス子孫はこれら2つのプラスミドの間のインビボでの組換えによってのみ生成 され、その結果Ad5ゲノム中へのE3挿入が確保される。 コトランスフェクシヨンの後で得られたウイルス性プラークを単離して293 細胞中で拡大し、ウイルス性DNAをHindIIIで消化した後でアガロースゲル上 で分析した。望ましいAd5細胞毒性遺伝子組換え体の構造は、特徴を示すフラ グメントの存在によって確定される。1つの組換え体はプラーク精製され、さら に研究するために用いられる。 図14の説明 プラスミドpFG173には、m.u.75.9−84.9の間で自発的に欠失し た3.2kb配列を除いて、Ad5ゲノム全体が含まれている。293細胞のコト ランスフェクシヨンのためにプラスミドpTOXおよびpFG173を用いて、 Ad5のE3領域中のSV40調節配列に隣接する細胞毒性遺伝子を、インビボ での組換えによって確保した。生じたAd5細胞毒性遺伝子組換え体を、Ad5 -TOXと命名した。Ad5-TOXゲノムのHindIIIおよびXbaI制限部位の相対 的位置を示す。SV40プロモーター、細胞毒性遺伝子、およびSV40ポリア デニル化シグナルの、位置と方向を以下に示す。塗りつぶした帯:ルシフェラー ゼ遺伝子;白ぬきの帯:SV40プロモーターおよびSV40ポリアデニル化シ グナル;ハッチ入りの帯:amprおよびkanr遺伝子。 細胞毒性遺伝子はチミジンキナーゼに関するcDNAである。 その他の細胞毒性遺伝子は、同様の方法でAd5のE3領域中に挿入される。 [実施例4: マウスモノクローナル抗体HMFG1およびヒト化されたモノク ローナル抗体HuHMFG1からの単鎖Fv] マウスおよび再形成されたHMFG1の様々な領域の、ヌクレオチドおよびア ミノ酸配列。(a)マウスおよび再形成されたHMFG1に関する、重鎖の様々 な領域の配列(Mo VH-HMFG1およびHu VH-HMFG1);(b)マ ウスおよび再形成された軽鎖のそれそれの様々な領域(Mo Vκ−HMFG1 およびHu Vκ-HMFG1)。CDRおよび骨格領域の、アミノ酸の番号付 けおよび定義は、Kabatほか(1987)Sequences of Proteins of immunological Interest,4版、アメリカ合衆国メリーランド州20892、ベセスダ、NIH、 US Dept of Health and Human Services Public Health Serviceからのものである 。 HMFG1に関するScFvおよびHu HMFG1に関するScFvをエン コードする遺伝子を生成するために、図15に記載されたヌクレオチドの配列に 、Birdほか(1988)Science 242,423またはHustonほかProc.Natl.Acad.Dci .USA85,5879に記載されている方法を適用する。実施例1および2に記載され ているように、アデノウイルスペントンファイバー遺伝子中に、これらの遺伝子 を個々に融合する。 H17E2のVHおよびVL鎖のアミノ酸配列は、”Monoclonal antibodies-ap plication clinical oncology”,第37-43頁,1911,A.A.Epenetos 編、Chapma n&Hall,イギリス、に記載されている。 VHおよびVL鎖をコードするヌクレオチド配列は、遺伝コードを用いてアミノ 酸配列から容易に導かれる。ScFvは、上述のBirdほかおよびHustonほかの方 法を用いて、配列から作製できる。配列表に用いる検索表 配列表 (1)一般情報 (i)出願人: (A)名: インペリアル キャンサー リサーチ テクノロジー リミテ ッド (B) ストリート:サルディナ ハウス、サルディナ ストリート (C)市: ロンドン (E)国: イギリス (F)郵便コード(ZIP): WC2A 3NL (ii)発明の名称: 標的細胞への化合物 (iii)配列の数: 80 (iv)コンピューター読みとりフォーム: (A)媒体型: フロッピーディスク (B)コンピューター: IBM PC コンパティブル (C)オペレーティングシステム: PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア: パテント イン リリース #1.0 バージョン#1.25(EPO) (2)配列番号1の情報 (i)配列の特徴: (A)長さ: 30塩基対 (B)型: 核酸 (C)鎖の数: 二本鎖 (D)トポロジー: 直鎖状 (ii)分子型: DNA(genomic) (iii)ハイポセティカル: NO (iii)アンチセンス: NO (vi)起源: (A)生物名: アデノウィルス (B)株名: Ad5 (ix)特徴: (A)名前/記号(NAME/KEY): CDS (B)位置: 1..30 (xi)配列記述: 配列番号 1 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【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1994年11月21日 【補正内容】 (1)国際出願日明細書の第4頁(翻訳文の第3頁第18行から第4頁第10行 ) 本発明は一つの態様として、標的細胞へのウイルスまたはウイルス様粒子の結 合を許容する結合部分によって与えられる修飾された結合特異性を包含する宿主 細胞受容体を有するウィルスもしくはウィルス様の粒子から誘導されるウィルス もしくはウィルス様の粒子を提供し、このウィルスもしくはウィルス様粒子が、 宿主細胞に対する受容体が修飾または欠落されるために、実質的にこの宿主細胞 に結合できないことを特徴とする。 “実質的にその宿主細胞に結合できないウイルスまたはウイルス様粒子”とは 、修飾されたウィルスが、宿主細胞に対して修飾されていないウィルスのほんの 1%の結合親和力しか有していない修飾されたウイルスを含む。 一般に、元来のウィルスおよびウィルス様粒子の結合特異性は、ウィルスおよ びウィルス様粒子の表面に表現される受容体様分子と、その宿主細胞の表面に表 現される同系統の受容体様分子との間の特異な相互作用によって与えられる。本 発明は結合特異性の有益な修飾を提供し、これによってウィルスおよびウィルス 様粒子が異なる特異的な標的細胞に結合することが可能となる。 修飾された結合部分の導入は、例えば前記のように元来の結合特異性の転移( removal)を達成することであってもよい。 本発明の第二の態様は、該ウィルスを標的細胞へ結合させるようにした結合部 分によって与えられる修飾した結合特異性を有するウイルスであることを特徴と する、アデノウィルス、インフルエンザウィルスもしくは牛痘ウィルス、あるい はこれらのうちいずれかの複製−欠損誘導体を包含する。 “結合部分”とは、標的細胞上の分子と結合することのできる、ウィルスもし くはウィルス様粒子の表面に露出した分子を意味するものとする。 (2) 請求の範囲 1. 標的細胞にウイルス又はウイルス様粒子を結合させる結合部分によって授 与された変更された結合特性を備える宿主細胞のための受容体を有するウイルス 又はウイルス様粒子から誘導されたウイルス、又はウイルス様粒子において、 上記ウイルス又はウイルス様粒子が上記宿主細胞に実質的に結合できないよう に、上記宿主細胞受容体が修飾又は欠失されたことを特徴とするウイルス又はウ イルス様粒子。 2. 標的細胞が真核細胞であることを特徴とする請求の範囲第1項のウイルス 又はウイルス様粒子。 3. ウイルス又はウイルス様粒子がアデノウイルス、インフルエンザウイルス 、ワクシニアウイルス、他のいずれかの動物ウイルス又はそれらのいずれかの複 製欠損誘導体であることを特徴とする請求の範囲第2項のウイルス又はウイルス 様粒子。 4. 標的細胞にウイルス又はウイルス様粒子を結合させる結合部分によって授 与された、変更された結合特性を有することを特徴とするアデノウイルス又はイ ンフルエンザウイルス又はワクシニアウイルス、又はこれらのいずれかの複製欠 損誘導体。 5. 結合部分がモノタローナル抗体、ScFv、dAb、又は抗体の最小認識 単位であることを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子。 6. 結合部分が標的細胞に特異的な細胞表面受容体のリガンドの少なくとも一 部であることを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれかのウイルス又 はウイルス様粒子。 7. 結合部分が標的細胞に特異的な表面抗原を認識することを特徴とする請求 の範囲第5項又は第6項のウイルス又はウイルス様粒子。 8. 結合部分が、その宿主細胞のための受容体以外のウイルス又はウイルス様 粒子上の分子に接合されることを特徴とする請求の範囲第1項から第7項のいず れかのウイルス又はウイルス様粒子。 9. 結合部分が、その宿主のための上記ウイルス又はウイルス様粒子上の受容 体の一部に接合され又は形成することを特徴とする請求の範囲第1項から第7項 のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 10. ウイルス又はウイルス様粒子の表面上の上記分子が蛋白質であることを 特徴とする請求の範囲第8項のウイルス又はウイルス様粒子。 11. 標的細胞に特異的な細胞表面受容体か、GnRH受容体、MSH受容体 又はソマトスタチン受容体のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第6項 のウイルス又はウイルス様粒子。 12. 遺伝子治療のために好適な遺伝子を含む請求の範囲第1項から第11項 のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 13. 遺伝子が、直接的又は間接的な細胞毒性機能を有する分子をコードする ことを特徴とする請求の範囲第12項のウイルス又はウイルス様粒子。 14. 遺伝子が、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子、インターフェロン-ガ ンマ、リボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼのうちのいずれかをコ ードすることを特徴とする請求の範囲第13項のウイルス又はウイルス様粒子。 15. 遺伝子が、相対的に非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬剤に変換するこ とのできる酵素をコードすることを特徴とする請求の範囲第13項のウイルス又 はウイルス様粒子。 16. 遺伝子がシトシンデアミナーゼ又はチミジンキナーゼのいずれかである ことを特徴とする請求の範囲第15項のウイルス又はウイルス様粒子。 17. 遺伝子が標的細胞中の遺伝子中の欠損を克服するものであることを特徴 とする請求の範囲第12項のウイルス又はウイルス様粒子。 18. 遺伝子がCFTR、ジストロフィン及びヘモグロビンAのいずれかであ ることを特徴とする請求の範囲第17項のウイルス又はウイルス様粒子。 19. 上記ウイルス又はウイルス様粒子が標的細胞に該核酸を輸送するように 適合され、さらに核酸を含むことを特徴とする請求の範囲第1項から第15項の ウイルス又はウイルス様粒子。 20. 上記受容体が蛋白質を備えたことを特徴とする請求の範囲第1項のウイ ルス又はウイルス様粒子。 21. ウイルスがインフルエンザウイルスであり、上記受容体が血球凝集素受 容体蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第20項のウイルス。 22. ウイルスがアデノウイルスであり、上記受容体がペントンファイバー蛋 白質であることを特徴とする請求の範囲第20項のウイルス。 23. 結合部分が、シャフトの反復ユニットの接合点のいずれか1つ又はそれ 以上で、ペントンファイバー蛋白質と融合されたことを特徴とする請求の範囲第 20項のウイルス。 24. 結合部分がScFvであることを特徴とする請求の範囲第23項のウイ ルス。 25. ScFvが腫瘍細胞抗原に結合したことを特徴とする請求の範囲第24 項のウイルス。 26. 結合部分かポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第1項から 第25項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 27. 結合部分が、上記ウイルス又はウイルス様粒子の表面上の蛋白質に融合 されたことを特徴とする請求の範囲第10項又は第20項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子。 28. 医薬において用いるための請求の範囲第1項から第27項のいずれかの ウイルス又はウイルス様粒子。 29. 請求の範囲第23項から第25項および第27項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子の表面上の蛋白質と結合部分との融合物をコードするヌクレ オチド配列。 30. 請求の範囲第8項で定義されたように修飾された受容体をコードするヌ クレオチド配列であって、受容体かポリペプチド中心骨格を含むヌクレオチド配 列。 31. 付加的にウイルス又はウイルス様粒子のケノムの残部を含む請求の範囲 第29項又は第30項のいずれかで定義されたヌクレオチド配列。 32. 請求の範囲第1項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒 子をコードするヌクレオチド配列。 33. 請求の範囲第15項又は第16項のウイルス又はウイルス様粒子とプロ ドラッグを備えた治療システム。 34. (1)細胞を上記ウイルス又はウイルス様粒子で感染させること、(2 )感染させた細胞をウイルス又はウイルス様粒子が十分高い力価に達するまで培 養すること、(3)ウイルス又はウイルス様粒子を収集し実質的に精製すること 、および(4)結合部分を実質的に精製されたウイルス又はウイルス様粒子に接 合させること、を備えた細胞培養内の請求の範囲第1項から第27項のいずれか のウイルス又はウイルス様粒子の製造方法。 35. (1)結合部分を製造するためにウイルス又はウイルス様粒子を遺伝的 に修飾すること、(2)遺伝的に修飾されたウイルス又はウイルス様粒子で細胞 を感染させること、(3)細胞をウイルス又はウイルス様粒子が十分高い力価に 達するまで培養すること、および(4)遺伝的に修飾されたウイルス又はウイル ス様粒子を収集し実質的に精製すること、を備えた細胞培養内の請求の範囲第1 項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子の製造方法。 36. 請求の範囲第1項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒 子と薬剤担体を含む薬剤組成物。 37. 請求の範囲第13項のウイルス又はウイルス様粒子の投与を備えた、破 壊される標的細胞を有する哺乳類の治療方法。 38. (1)請求の範囲第15項又は第16項のウイルス又はウイルス様粒子 を投与すること、(2)ウイルス又はウイルス様粒子を、その核酸に結合させて 標的細胞へ輸送させること、および(3)上記プロドラッグを投与することを備 えた、破壊される標的細胞を有する哺乳類の治療方法。 39. 請求の範囲第17項又は第18項のウイルス又はウイルス様粒子の投与 を備えた欠損遺伝子を有する哺乳類の治療方法。 【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1995年1月18日 【補正内容】 請求の範囲 1. 標的細胞にウイルス又はウイルス様粒子を結合させる結合部分によって授 与された変更された結合特性を備える宿主細胞のための受容体を有するウイルス 又はウイルス様粒子から誘導されたウイルス、又はウイルス様粒子において、 上記ウイルス又はウイルス様粒子が上記宿主細胞に実質的に結合できないよう に、上記宿主細胞受容体が共有結合で修飾又は欠失されたものであり、上記ウイ ルス又はウイルス様粒子はレトロウィルス又はレトロウイルス様粒子でないこと を特徴とするウイルス又はウイルス様粒子。 2. 標的細胞が真核細胞であることを特徴とする請求の範囲第1項のウイルス 又はウイルス様粒子。 3. ウイルス又はウイルス様粒子がアデノウイルス、インフルエンザウイルス 、ワクシニアウイルス、他のいずれかの動物ウイルス又はそれらのいずれかの複 製欠損誘導体であることを特徴とする請求の範囲第2項のウイルス又はウイルス 様粒子。 4. 標的細胞にウイルス又はウイルス様粒子を結合させる結合部分によって授 与された変更された結合特性を有し、上記結合部分がペプチドであってウイルス の露出ペプチドに融合したことを特徴とする、アデノウイルス又はインフルエン ザウイルス又はワクシニアウイルス、又はこれらのいずれかの複製欠損誘導体。 5. 結合部分がモノクローナル抗体、ScFv、dAb、又は抗体の最小認識 単位であることを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子。 6. 結合部分が標的細胞に特異的な細胞表面受容体のリガンドの少なくとも一 部であることを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれかのウイルス又 はウイルス様粒子。 7. 結合部分が標的細胞に特異的な表面抗原を認識することを特徴とする請求 の範囲第5項又は第6項のウイルス又はウイルス様粒子。 8. 結合部分が、その宿主細胞のための受容体以外のウイルス又はウイルス様 粒子上の分子に接合されることを特徴とする請求の範囲第1項から第7項のいず れかのウイルス又はウイルス様粒子。 9. 結合部分が、その宿主のための上記ウイルス又はウイルス様粒子上の受容 体の一部に接合され又は形成することを特徴とする請求の範囲第1項から第7項 のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 10. ウイルス又はウイルス様粒子の表面上の上記分子が蛋白質であることを 特徴とする請求の範囲第8項のウイルス又はウイルス様粒子。 11. 標的細胞に特異的な細胞表面受容体が、GnRH受容体、MSH受容体 又はソマトスタチン受容体のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第6項 のウイルス又はウイルス様粒子。 12. 遺伝子治療のために好適な遺伝子を含む請求の範囲第1項から第11項 のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 13. 遺伝子が、直接的又は間接的な細胞毒性機能を有する分子をコードする ことを特徴とする請求の範囲第12項のウイルス又はウイルス様粒子。 14. 遺伝子が、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子、インターフエロン-ガ ンマ、リボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼのうちのいずれかをコ ードすることを特徴とする請求の範囲第13項のウイルス又はウイルス様粒子。 15. 遺伝子が、相対的に非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬剤に変換するこ とのできる酵素をコードすることを特徴とする請求の範囲第13項のウイルス又 はウイルス様粒子。 16. 遺伝子がシトシンデアミナーゼ又はチミジンキナーゼのいずれかである ことを特徴とする請求の範囲第15項のウイルス又はウイルス様粒子。 17. 遺伝子が標的細胞中の遺伝子中の欠損を克服するものであることを特徴 とする請求の範囲第12項のウイルス又はウイルス様粒子。 18. 遺伝子がCFTR、ジストロフィン及びヘモグロビンAのいずれかであ ることを特徴とする請求の範囲第17項のウイルス又はウイルス様粒子。 19. 上記ウイルス又はウイルス様粒子が標的細胞に該核酸を輸送するように 適合され、さらに核酸を含むことを特徴とする請求の範囲第1項から第15項の ウイルス又はウイルス様粒子。 20. 上記受容体が蛋白質を備えたことを特徴とする請求の範囲第1項のウイ ルス又はウイルス様粒子。 21. ウイルスがインフルエンザウイルスであり、上記受容体が血球凝集素受 容体蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第20項のウイルス。 22. ウイルスがアデノウイルスであり、上記受容体がペントンファイバー蛋 白質であることを特徴とする請求の範囲第20項のウイルス。 23. 結合部分が、シャフトの反復ユニットの接合点のいずれか1つ又はそれ 以上で、ペントンファイバー蛋白質と融合されたことを特徴とする請求の範囲第 20項のウイルス。 24. 結合部分がScFvであることを特徴とする請求の範囲第23項のウイ ルス。 25. ScFvが腫瘍細胞抗原に結合したことを特徴とする請求の範囲第24 項のウイルス。 26. 結合部分がポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第1項から 第25項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 27. 結合部分が、上記ウイルス又はウイルス様粒子の表面上の蛋白質に融合 されたことを特徴とする請求の範囲第10項又は第20項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子。 28. 医薬において用いるための請求の範囲第1項から第27項のいずれかの ウイルス又はウイルス様粒子。 29. 請求の範囲第23項から第25項および第27項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子の表面上の蛋白質と結合部分との融合物をコードするヌクレ オチド配列。 30. 請求の範囲第6項で定義されたように修飾された受容体をコードするヌ クレオチド配列であって、リガンドがポリペプチド中心骨格を含むヌクレオチド 配列。 31. 付加的にウイルス又はウイルス様粒子のゲノムの残部を含む請求の範囲 第29項又は第30項のいずれかで定義されたヌクレオチド配列。 32. 請求の範囲第1項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒 子をコードするヌクレオチド配列。 33. 請求の範囲第15項又は第16項のウイルス又はウイルス様粒子とプロ ドラッグを備えた治療システム。 34. (1)細胞を上記ウイルス又はウイルス様粒子で感染させること、(2 )感染させた細胞をウイルス又はウイルス様粒子が十分高い力価に達するまで培 養すること、(3)ウイルス又はウイルス様粒子を収集し実質的に精製すること 、および(4)結合部分を実質的に精製されたウイルス又はウイルス様粒子に接 合させること、を備えた細胞培養内の請求の範囲第1項から第27項のいずれか のウイルス又はウイルス様粒子の製造方法。 35. (1)結合部分を製造するためにウイルス又はウイルス様粒子を遺伝的 に修飾すること、(2)遺伝的に修飾されたウイルス又はウイルス様粒子で細胞 を感染させること、(3)細胞をウイルス又はウイルス様粒子が十分高い力価に 達するまで培養すること、および(4)遺伝的に修飾されたウイルス又はウイル ス様粒子を収集し実質的に精製すること、を備えた細胞培養内の請求の範囲第1 項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子の製造方法。 36. 請求の範囲第1項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒 子と薬剤担体を含む薬剤組成物。 37. 請求の範囲第13項のウイルス又はウイルス様粒子の投与を備えた、破 壊される標的細胞を有する哺乳類の治療方法。 38. (1)請求の範囲第15項又は第16項のウイルス又はウイルス様粒子 を投与すること、(2)ウイルス又はウイルス様粒子を、その核酸に結合させて 標的細胞へ輸送させること、および(3)上記プロドラッグを投与することを備 えた、破壊される標的細胞を有する哺乳類の治療方法。 39. 請求の範囲第17項又は第18項のウイルス又はウイルス様粒子の投与 を備えた欠損遺伝子を有する哺乳類の治療方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI A61K 48/00 8314−4C C12N 7/00 8931−4B // A61K 38/00 38/16 38/21 38/45 38/46 9455−4C A61K 37/66 Z 9455−4C 37/54 9455−4C 37/52 9455−4C 37/14 (72)発明者 スプーナー,ロバート アントニー イギリス国 WC12 0HS ロンドン デュ ケイン ロード ハマースミス ホ スピタル ローヤル ポストグラデュエイ ト メディカル スクール デパートメン ト オブ クリニカル オンコロジィ ア イシーアールエフ オンコロジィ グルー プ(番地なし) (72)発明者 エペネトス,アガメムノン アントニオ イギリス国 W12 0HS ロンドン デ ュ ケイン ロード ハマースミス ホス ピタル ローヤル ポストグラデュエイト メディカル スクール デパートメント オブ クリニカル オンコロジィ アイ シーアールエフ オンコロジィ グループ (番地なし) 【要約の続き】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 標的細胞にウイルス又はウイルス様粒子を結合させる結合部分によって授 与された変更された結合特性を備える宿主細胞のための受容体を有するウイルス 又はウイルス様粒子から誘導されたウイルス、又はウイルス様粒子において、 上記ウイルス又はウイルス様粒子が上記宿主細胞に実質的に結合できないよう に、上記宿主細胞受容体が修飾又は欠失されたことを特徴とするウイルス又はウ イルス様粒子。 2. 標的細胞が真核細胞であることを特徴とする請求の範囲第1項のウイルス 又はウイルス様粒子。 3. ウイルス又はウイルス様粒子がアデノウイルス、インフルエンザウイルス 、ワクシニアウイルス、他のいずれかの動物ウイルス又はそれらのいずれかの複 製欠損誘導体であることを特徴とする請求の範囲第2項のウイルス又はウイルス 様粒子。 4. 標的細胞にウイルス又はウイルス様粒子を結合させる結合部分によって授 与された、変更された結合特性を有することを特徴とするアデノウイルス又はイ ンフルエンザウイルス又はワクシニアウイルス、又はこれらのいずれかの複製欠 損誘導体。 5. 結合部分がモノクローナル抗体、ScFv、dAb、又は抗体の最小認識 単位であることを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子。 6. 結合部分が標的細胞に特異的な細胞表面受容体のリガンドの少なくとも一 部であることを特徴とする請求の範囲第1項から第4項のいずれかのウイルス又 はウイルス様粒子。 7. 結合部分が標的細胞に特異的な表面抗原を認識することを特徴とする請求 の範囲第5項又は第6項のウイルス又はウイルス様粒子。 8. 結合部分が、その宿主細胞のための受容体以外のウイルス又はウイルス様 粒子上の分子に接合されることを特徴とする請求の範囲第1項から第7項のいず れかのウイルス又はウイルス様粒子。 9. 結合部分が、その宿主のための上記ウイルス又はウイルス様粒子上の受容 体の一部に接合され又は形成することを特徴とする請求の範囲第1項から第7項 のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 10. ウイルス又はウイルス様粒子の表面上の上記分子が蛋白質であることを 特徴とする請求の範囲第8項のウイルス又はウイルス様粒子。 11. 標的細胞に特異的な細胞表面受容体が、GnRH受容体、MSH受容体 又はソマトスタチン受容体のいずれかであることを特徴とする請求の範囲第6項 のウイルス又はウイルス様粒子。 12. 遺伝子治療のために好適な遺伝子を含むようにさらに変更された請求の 範囲第1項から第11項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 13. 遺伝子が、直接的又は間接的な細胞毒性機能を有する分子をコードする ことを特徴とする請求の範囲第12項のウイルス又はウイルス様粒子。 14. 遺伝子が、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子、インターフェロン-ガ ンマ、リボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼのうちのいずれかをコ ードすることを特徴とする請求の範囲第13項のウイルス又はウイルス様粒子。 15. 遺伝子が、相対的に非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬剤に変換するこ とのできる酵素をコードすることを特徴とする請求の範囲第13項のウイルス又 はウイルス様粒子。 16. 遺伝子がシトシンデアミナーゼ又はチミジンキナーゼのいずれかである ことを特徴とする請求の範囲第15項のウイルス又はウイルス様粒子。 17. 遺伝子が標的細胞中の遺伝子中の欠損を克服するものであることを特徴 とする請求の範囲第12項のウイルス又はウイルス様粒子。 18. 遺伝子がCFTR、ジストロフィン及びヘモグロビンAのいずれかであ ることを特徴とする請求の範囲第17項のウイルス又はウイルス様粒子。 19. 上記ウイルス又はウイルス様粒子が標的細胞に該核酸を輸送するように 適合されたことを特徴とする核酸を含む請求の範囲第1項から第15項のウイル ス又はウイルス様粒子。 20. 上記受容体が蛋白質を備えたことを特徴とする請求の範囲第1項のウイ ルス又はウイルス様粒子。 21. ウイルスがインフルエンザウイルスであり、上記受容体が血球凝集素受 容体蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第20項のウイルス。 22. ウイルスがアデノウイルスであり、上記受容体がペントンファイバー蛋 白質であることを特徴とする請求の範囲第20項のウイルス。 23. 結合部分が、シャフトの反復ユニットの接合点のいずれか1つ又はそれ 以上で、ペントンファイバー蛋白質と融合されたことを特徴とする請求の範囲第 20項のウイルス。 24. 結合部分がScFvであることを特徴とする請求の範囲第23項のウイ ルス。 25. ScFvが腫瘍細胞抗原に結合したことを特徴とする請求の範囲第24 項のウイルス。 26. 結合部分がポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第1項から 第25項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子。 27. 結合部分が、上記ウイルス又はウイルス様粒子の表面上の蛋白質に融合 されたことを特徴とする請求の範囲第10項又は第20項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子。 28. 医薬において用いるための請求の範囲第1項から第27項のいずれかの ウイルス又はウイルス様粒子。 29. 請求の範囲第23項から第25項および第27項のいずれかのウイルス 又はウイルス様粒子の表面上の蛋白質と結合部分との融合物をコードするヌクレ オチド配列。 30. 請求の範囲第8項で定義されたように修飾された受容体をコードするヌ クレオチド配列であって、受容体がポリペプチド中心骨格を含むヌクレオチド配 列。 31. 付加的にウイルス又はウイルス様粒子のゲノムの残部を含む請求の範囲 第29項又は第30項のいすれかで定義されたヌクレオチド配列。 32. 請求の範囲第1項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒 子をコードするヌクレオチド配列。 33. 請求の範囲第15項又は第16項のウイルス又はウイルス様粒子とプロ ドラッグを備えた治療システム。 34. (1)細胞を上記ウイルス又はウイルス様粒子で感染させること、(2 )感染させた細胞をウイルス又はウイルス様粒子が十分高い力価に達するまで培 養すること、(3)ウイルス又はウイルス様粒子を収集し実質的に精製すること 、および(4)結合部分を実質的に精製されたウイルス又はウイルス様粒子に接 合させることを備えた細胞培養内の請求の範囲第1項から第27項のいずれかの ウイルス又はウイルス様粒子の製造方法。 35. (1)結合部分を製造するためにウイルス又はウイルス様粒子を遺伝的 に修飾すること、(2)遺伝的に修飾されたウイルス又はウイルス様粒子で細胞 を感染させること、(3)細胞をウイルス又はウイルス様粒子が十分高い力価に 達するまで培養すること、および(4)遺伝的に修飾されたウイルス又はウイル ス様粒子を収集し実質的に精製すること、を備えた細胞培養内の請求の範囲第1 項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒子の製造方法。 36. 請求の範囲第1項から第27項のいずれかのウイルス又はウイルス様粒 子と薬剤担体を含む薬剤組成物。 37. 請求の範囲第13項のウイルス又はウイルス様粒子の投与を備えた、破 壊される標的細胞を有する哺乳類の治療方法。 38. (1)請求の範囲第15項又は第16項のウイルス又はウイルス様粒子 を投与すること、(2)ウイルス又はウイルス様粒子を、その核酸に結合させて 標的細胞へ輸送させること、および(3)上記プロドラッグを投与することを備 えた、破壊される標的細胞を有する哺乳類の治療方法。 39. 請求の範囲第17項又は第18項のウイルス又はウイルス様粒子の投与 を備えた欠損遺伝子を有する哺乳類の治療方法。
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