JP5962996B2 - Clec14a阻害剤 - Google Patents
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Description
遺伝子CLEC14A(C型レクチンドメインファミリー14、メンバーA)は、14q21.1に位置し、以前はC14orf27、CEG1およびEGFR5として知られていた。CLEC14Aは、51kDaの予測分子量を有する490アミノ酸残基ポリペプチドをコードする。CLEC14Aポリペプチドには、ヒトCLEC14Aの遺伝子産物(その天然変異体を含む)の意味が含まれる。ヒトCLEC14Aポリペプチドは、Genbank登録番号NP_778230中に見出されるアミノ酸配列およびその天然変異体を含む。NP_778230由来のCLEC14Aポリペプチド配列は、図1中に示される(配列番号1)。
CLEC14Aの阻害剤には、CLEC14Aポリペプチドの阻害剤およびCLEC14A遺伝子/cDNAの阻害剤の双方が含まれる。
CLEC14Aまたはその特異的部分に結合する好適な抗体は、当業者により、当該技術分野で長期にわたって確立された技術を用いて作製可能である。モノクローナル抗体および抗体断片を調製する方法は、当該技術分野で周知であり、ハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein(1975年) 「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.」Nature256:495−497頁);抗体ファージディスプレイ(Winterら(1994年) 「Making antibodies by phage display technology.」Annu.Rev.Immunol.12:433−455頁);リボソームディスプレイ(Schaffitzelら(1999年) 「Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries.」 J.Immunol.Methods 231:119−135頁);および反復コロニーフィルタスクリーニング(Giovannoniら(2001年) 「Isolation of anti−angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening.」 Nucleic Acids Res.29:E27)を含む。さらに、本発明における使用に適した抗体および抗体断片は、例えば、次の出版物、すなわち、「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application」,Hurrell(CRC Press、1982年);「Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques」,H.Zola,CRC Press、1987年、ISBN:0−84936−476−0;「Antibodies:A Laboratory Manual」、第1版、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York、1988年、ISBN 0−87969−314−2;「Using Antibodies:A Laboratory Manual」、第2版、HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York、1999年、ISBN0−87969−543−9;および「Handbook of Therapeutic Antibodies」 Stefan Duebel編、第1版、−Wiley−VCH、Weinheim、2007年、ISBN:3−527−31453−9において記載されている。
小さい干渉RNAは、Hannonら、Nature,418(6894):244−51頁(2002年);Brummelkampら、Science 21、21頁(2002年);およびSuiら、Proc.Natl Acad.Sci.USA99、5515−5520頁(2002年)において記載されている。RNA干渉(RNAi)は、配列がサイレント遺伝子(silenced gene)に相同な二本鎖(dsRNA)によって開始される、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。配列特異的なmRNA分解のメディエーターは、典型的には、インビボでより長いdsRNAからのリボヌクレアーゼIIIの切断によって生成可能な、21および22ヌクレオチドの小さい干渉RNA(siRNA)である。21ヌクレオチドsiRNA二本鎖は、内因性および異種遺伝子の双方の発現を特異的に抑制することが示されている(Elbashirら(2001年) Nature411:494−498頁)。哺乳類細胞においては、siRNAは、より長い二本鎖(ds)RNAがPKR(dsRNA依存性タンパク質キナーゼ)を活性化し、かつタンパク質合成全体を阻害することから、下記の2つの相補的な21mersからなる必要があると考えられる。
CLEC14Aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって選択的なアンチセンス核酸分子は、当該技術分野で既知のように、そのcDNAまたは遺伝子配列を参照することにより、容易に設計することが可能である。アンチセンス核酸、例えばオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸であり、それは相補的核酸配列に特異的に結合しうる。適切な標的配列に結合することにより、RNA−RNA、DNA−DNA、またはRNA−DNA二本鎖が形成される。これらの核酸は、遺伝子のセンスまたはコード鎖に対して相補的であることから、「アンチセンス」と称されることが多い。最近、三重らせんの形成は、オリゴヌクレオチドがDNA二本鎖に結合される場合には可能であることが判明している。オリゴヌクレオチドがDNA二重らせんの主溝内の配列を認識しうることが見出された。三重らせんは、それによって形成された。これは、二本鎖DNAに主溝の水素結合部位の認識を介して特異的に結合する配列特異的な分子を合成することが可能であることを示唆する。上記オリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合することにより、標的核酸の機能を阻害しうる。これは、例えば、転写、プロセシング、ポリ(A)付加、複製、翻訳を遮断するか、または細胞の阻害機序を促進する、例えばRNA分解を促進する結果でありうる。
リボザイムは、部位特異的な方法で核酸が切断された、RNAまたはRNA−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する。例えば、多数のリボザイムは、高い特異度でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断することが多い。この特異性は、基質が、化学反応前に、リボザイムの内部ガイド配列(internal guide sequence)(「IGS」)と特異的な塩基対合相互作用を介して結合する必要性に起因している。
CLEC14Aの阻害剤が、典型的には、医薬組成物として、すなわち医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を伴い、個体に投与することを意図して調合されることになることは理解されている。
National Cancer Institute Press Release(2005年4月14日付、2005年6月16日更新)(「Bevacizumab Combined With Chemotherapy Improves Progression−Free Survival for Patients With Advanced Breast Cancer」)によると、血管新生阻害剤の抗VEGFモノクローナル抗体ベバシズマブは、標準の化学療法と併用して投与される場合、多数の固形腫瘍における臨床転帰を改善する。用いられている併用は、ベバシズマブとイリノテカン、フルオロウラシル、およびロイコボリンとの併用;ベバシズマブとFOLFOX4(オキサリプラチン、5−フルオロウラシルおよびロイコボリンのレジメン)との併用;ベバシズマブとパクリタキセルとの併用;ならびにベバシズマブとパクリタキセルおよびカルボプラチンとの併用、を含む。
より選択的な、ひいてはより優れた抗癌剤の開発に向けた手段の一つは、生物活性分子の、腫瘍内皮マーカーに特異的な分子(例えばヒト抗体)に結合することによる、腫瘍環境への標的化送達である。それらの利用可能性およびそれらが可能にする治療オプション(例えば腔内血液凝固または免疫細胞の動員)に起因し、腫瘍血管上に選択的に発現される血管マーカーは、理想的にはリガンドに基づく腫瘍標的化方法に適合し、腫瘍血管新生のイメージングおよび腫瘍血管新生に対する細胞毒性剤の標的化が可能になる。
CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体は、検出可能な部分に結合される場合、イメージング、例えば腫瘍の血管イメージングにおいて有用でありうる。腫瘍の血管イメージングにおいて有用な方法および化合物は、出願人らが以前に公表した国際公開第02/36771号パンフレット(参照により本明細書中に援用される)において記載されている。
(i)ポリペプチドCLEC14Aに選択的に結合する抗体、および(ii)検出可能な部分、を含む化合物を個体に投与するステップと、
身体における検出可能な部分の存在および/または位置を検出するステップと、
を含む、方法を提供する。
出願人らの知る限りにおいては、CLEC14Aの阻害剤が血管新生の阻害剤であることがかつて示唆されたことはない。また、血管新生の阻害が、腫瘍以外の血管新生疾患または症状を処置する上で有用でありうることは理解されるであろう。したがって、本発明の第5の態様に従い、処置を必要とする個体における血管新生を阻害する方法であって、CLEC14Aの阻害剤を個体に投与するステップを含む、方法が提供される。
本発明の第6の態様は、血管新生を阻害する生体外方法であって、生体外でCLEC14Aの阻害剤を組織または細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。典型的には、血管新生を阻害するこの生体外方法は、血管新生アッセイとの関連でまたは腫瘍血管新生のモデルにおいて、例えば下記のように実施される。したがって、細胞は、個体から取り出されている腫瘍細胞系または腫瘍細胞で確立してもよい。組織または細胞は、好ましくは哺乳類組織または細胞、および最も好ましくはヒト組織または細胞である。好ましくは、組織または細胞は、腫瘍内皮を含むか、または腫瘍内皮のモデルである。CLEC14Aの阻害剤に対する選好は、本発明の第1の態様に関連し、上記の通りである。
本発明の第7の態様は、固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤、または固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤を同定するためのリード化合物を同定する方法であって、
ポリペプチドCLEC14Aまたはその断片に結合する候補化合物を提供するステップと、
候補化合物を血管新生アッセイにおいて試験するステップと、
を含み、ここで、アッセイにおける血管新生を阻害する候補化合物は、固形腫瘍の処置において有用な作用剤であるか、または固形腫瘍の処置において有用な作用剤を同定するためのリード化合物であってもよい、方法を提供する。
目的
発明者は、CLEC14Aの発現および機能を特徴づけるための多くの実験を行った。
HUVECの調製および培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、ドナーのインフォームドコンセントを得た後にUK National Health Serviceによって提供されたへその緒から単離した。へその緒を胎盤から切除し、静脈を無菌PBSで洗浄し、血液を除去した。M199培地(Sigma)で希釈した1mg/mlのコラゲナーゼを、静脈に注射し、次いで37℃で20分間インキュベートし、内皮細胞を分離した。HUVECを、10%FCS、10%大血管内皮細胞成長添加物(large vessel endothelial cell growth supplement)(TCS Cell Works)、および4mM L−グルタミンを含有するM199完全培地での洗浄によって採取し、ブタ皮膚(Sigma)でコートされたディッシュ由来の0.1%タイプ1ゼラチン上にプレーティングした。
ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)およびヒト気管支上皮細胞(HBE)を、TCS Cell Worksから購入した。ヒト肺線維芽細胞(MRC5)を、Cancer Research UK Central Servicesから得た。ヒト末梢血単核球(PBMC)を、University of BirminghamのInstitute of Cancer Researchから得た。肝細胞は、Professor David Adams(School of Immunity and Infection,University of Birmingham)から贈呈された。
全RNAを、TRI試薬(Sigma)使用し、培養液中の一次細胞から単離した後、提供されたランダムプライマーを有するHigh−Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems)を使用し、cDNA合成を行った。ProbeLibrary リアルタイム PCRアッセイ系(Exiqon)を、CLEC14Aの発現の一次細胞スクリーニングにおいて使用した。フロチリン2をハウスキーピング遺伝子として選択し、それに対し、CLEC14Aの発現を正規化した。CLEC14Aおよびフロチリン2に対するプライマーおよびプローブセットを、ProbeFinderソフトウェア(Roche)によって設計した。CLEC14Aに対するプライマーおよびプローブセットは、
5’−CTGGGACCGAGGTGAGTG−3’(配列番号6)、および
5’−CGCGATGCAAGTAACTGAGA−3’(配列番号7)(プローブ番号24を伴う)
であった。
5’−TGTTGTGGTTCCGACTATAAACAG−3’(配列番号8)、および
5’−GGGCTGCAACGTCATAATCT−3’(配列番号9)(プローブ番号28を伴う)
であった。
ヒトCLEC14A(NM_199786.1、zgc:66439)cDNAのゼブラフィッシュオルソログを、zClec14Aプライマー:
フォワード:5’−GGAGAAAAAGCAGACAATATCATTTTA−3’(配列番号10)、および
リバース:5’−AGTCTCTCTCACTTAGGTTTCCTCTTT−3’(配列番号11)
を使用し、受精後24時間(hpf)のcDNA調製物から増幅した。
フォワード:5’−AAACCTAAGTGAGAGAGACTGTGC−3’(配列番号12)、および
リバース:5’−ACAGAGTACGCTATTTTCATCCATC−3’(配列番号13)
を使用して増幅した。
フォワード:5’−CACCCTGGGAGTGAAACA−3’(配列番号14)、および
リバース:5’−ACTTGCAGGCGATGTGAGC−3’(配列番号15)
を使用して増幅した。
HUVECを、氷冷メタノール中に固定したガラス製マイクロウェルチャンバー(Nunc)内で成長させ、PBST中10%FCS3%BSAでブロッキングしたPBSTで洗浄した。次いで、細胞を、パラフィン包埋切片用に使用されるのと同じプロトコルに従い、CLEC14A抗体で染色するか、または、親切にもProfessor Maria Grazia Lampugnani(Firc Institute for Molecular Oncology,Milan)により贈呈された、ヒトVE−カドヘリンに対する5μg/mlのマウスモノクローナルIgG抗体で同時染色した。切片染色を、510レーザー走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)で分析した。
PCMV−sport6ベクター内の完全長CLEC14Aを、MGCから購入した。配列を、TOPOベクター(Invitrogen)に、次いでpEGFP−N1ベクター(Invitrogen)にサブクローン化した。105個のCHO細胞を、10%FCSおよび4mMグルタミンを含有するDMEM(Invitrogen)にプレーティングし、培養した。播種の48時間後、サブコンフルエントな(sub−confluent)細胞を、6:1の比で、Fugene6(ROCHE)を使用し、完全長CLEC14Aを有するpEGFP−N1で形質移入した。形質移入混合物を、細胞培養物に24時間かけて添加し、次いで無血清DMEMと交換した。細胞を、形質移入の72時間後、Axioscope 2 Plusライブ蛍光顕微鏡システム(Zeiss)を使用して分析し、画像を、Axiocomカラーカメラ(Zeiss)で取得した。
2.5×105個のHUVECを、形質移入の前日、6つのウェルプレートに播種した。CLEC14Aに対する2つの異なるsiRNA二本鎖、GAACAAGACAATTCAGTAA(二本鎖1、配列番号4)およびCAATCAGGGTCGACGAGAA(二本鎖2、配列番号5)(Eurogentech)を使用し、また陰性対照二本鎖と並行して使用した。形質移入を、0.3%リポフェクタミンRNAiMax(Invitrogen)およびoptiMEM(Invitrogen)中の10nM二本鎖を使用して行った。正常なM199完全培地と交換する前、形質移入混合物を、細胞とともに4時間インキュベートした。細胞を形質移入の48時間後に使用し、タンパク質発現のノックダウンをウエスタンブロッティングによって評価した。タンパク質を、NP40溶解緩衝液を使用して単離し、BioRad Dcタンパク質アッセイを用い、製造業者の使用説明書(BioRad)に従って定量した。各レーンにおいて等量のタンパク質を負荷し、SDS PAGEを介して分離した。タンパク質を、ニトロセルロース膜上に移し、0.2ng/mlのヒツジCLEC14A IgG抗ヒトポリクローナル抗体(R&D System)および0.2μg/mlのHRP複合化ウサギポリクローナル抗ヒツジ二次抗体(Abcam)を使用してプローブした。同じブロットを、1ng/mlのマウスモノクローナル抗チューブリン一次抗体および1μg/mlのヤギポリクローナル抗マウスHRP複合二次抗体でプローブした。
2.5×105個のHUVECを、形質移入の前日、6つのウェルプレートに播種した。形質移入の48時間後、20μlのピペットチップでスクラッチした。HUVECの化学運動性移動(chemokinetic migration)を、Leica DM1000光学顕微鏡およびUSB2.0 2M Xliカメラで、0、4、8、12および24時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、セル(cell)IQアナライザソフトウェアを用いて強調し、計算した。
コンフルエントなHUVECに対し、20μlのピペットチップでスクラッチした。5、10および20μg/mlのCLEC14A抗血清を含有する新しい培地を交換した。HUVECの化学運動性移動を、Leica DM1000光学顕微鏡およびUSB2.0 2M Xliカメラで、0、4、8、12および24時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、セルIQアナライザソフトウェアを用いて強調し、計算した。
コンフルエントなHUVECまたはマウス内皮細胞系SENDの細胞に対し、10μlのピペットチップでスクラッチした。マウスにおいてCLEC14Aの細胞外ドメインに対して産生された1μg/mlまたは10μg/mlのモノクローナルCLEC14A抗体を含有する新しい培地を適用した。HUVECまたはSEND細胞の化学運動性移動を、Leica DM1000光学顕微鏡およびUSB2.0 2M Xliカメラで、0、4、6、12時間での傷口閉鎖の画像を取得することによって評価した。開口傷領域を、Image Jソフトウェアを用いて定量した。
HUVECの一次培養物を、トリプシン/EDTA(Sigma)で解離し、予めコラーゲン/ゼラチンでコートした長方形のガラス毛細管(マイクロスライド;内部幅3mm、深さ0.3mm)に播種した。播種は、24時間以内にコンフルエントな単層を生成する密度であった。播種後、マイクロスライドを、特別に設けられたガラス皿に置いて、予め壁に融合されたガラス管に取り付けた。シリコンゴム管(Tygon R1000;Fisher,Loughborough,UK)を、各外部アームに接続した。ディッシュは培地を有し、それを加湿CO2インキュベーター(Nuaire DH;Triple Red,Thame,Oxfordshire,UK)内に置いた。チューブは、インキュベーター壁内のポートを通した。2つの隣接するアーム(マイクロスライドに取り付けたものと空のもの)からのチューブを、接続し、マルチチャンネルの8ローラーポンプ(モデル502S;Watson Marlow Ltd.)に入れ、連続流ループを形成した。ポンプチューブの内径およびポンプ速度を選択し、流速(7.76ml/分)を送り、マイクロスライドにおいて2.0Pa(=20dyn/cm2)の壁せん断応力が得られた。ポンプおよび外部チューブをパースペクスボックス内に入れ、サーモスタットで37℃に制御した。各ディッシュ内の別々のマイクロスライドからのチューブを、別々のポンプに接続した。これにより、マイクロスライドを通して少量の培地を1時間に1回、30秒間ポンピングし、「静的」条件下での持続的な成長を可能にした。HUVECを、静的条件下で24時間培養し、次いで2.0Paのせん断応力に24時間さらした。各ディッシュ内の静的条件下およびフロー条件下のマイクロスライドのペアを、同一の再循環培地に同時間さらした。
免疫蛍光を、Cancer Research UKの組織学サービス(histology service)から得たパラフィン包埋された正常および癌ヒト組織コレクション、ならびに癌および正常組織アレイ(Superbiochips)に対して行った。胃癌、食道癌、肺癌、結腸/直腸癌、甲状腺癌および腎臓癌の各々からの、10のコアを含むヒトの一般的な癌1(MA2)、ならびに、乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌および前立腺癌の各々からの、10のコアを含む一般的な癌2(MB3)を使用した。隣接する正常な組織に一致する2つの追加的な対照アレイについても分析した。パラフィンの除去後、抗原回復のため、組織を、再水和し、クエン酸塩緩衝液(pH6)中、中間出力で3分間マイクロ波処理した。切片を、10%FCSおよび3%BSAを含有するPBSTでブロッキングした。切片を、ヒトCLEC14Aの細胞外ドメインに対する10μg/mlのヒツジIgG一次ポリクローナル抗体(R&D SYSTEM)および15μg/mlのFITC複合ウサギIgG二次抗ヒツジポリクローナル抗体(Zymax)でプローブした。管内皮細胞を、ローダミンと複合した20μg/mlのUlex europeaus凝集素I(UEAI)(Vector labs)で染色した。スライドに、DAPIを有するプロロングゴールド(prolong gold)退色防止剤(Invitrogen)を常に載せ、細胞核を対比染色した。染色切片を、510レーザー走査共焦点顕微鏡(Carl Zeiss)を使用して分析した。
モノクローナル抗体の調製に使用される抗原は、場合によってアジュバントタンパク質(AP)と複合されたマウスCLEC14A−Fc(CM)およびヒトCLEC14A−Fc(CH)であった。次のプロトコルを用い、これらの4つの抗原(CM、CH、CM−AP、CH−AP)を、マウス免疫に対して使用した。
日 処理
0 予備免疫試料を完全フロイントアジュバント中の100μgの抗原での免疫(足蹠)から採取
14 不完全フロイントアジュバント中の100μgの抗原での免疫(足蹠)
17 出血を試験
18 融合のため、膝窩リンパ節を採取
(1)膝窩リンパ節を免疫マウスから採取し、均質化した。
(2)細胞を温かいDMEMで洗浄した。
(3)細胞をsp2/0骨髄腫細胞と混合した。
(4)混合物を遠心分離した(1000g)。
(5)ペレットを50%PEG1500に懸濁し、1分間インキュベートした。
(6)懸濁液を温かいDMEMで徐々に希釈した。
(7)懸濁液を遠心分離した(1000g)。
(8)細胞を、腹膜マクロファージを有するプレートに播種した。
(9)細胞を37℃および5%CO2で培養した。
図2は、HUVECおよび他の一次細胞におけるCLEC14Aの相対的発現を示すグラフである。CLEC14Aは、内皮細胞内で特異的に発現された。これから、CLEC14Aが内皮特異的であるという出願人らの先行的な実験結果(Herbertら、2008年)が確認される。
まとめると、この試験の結果は、膜貫通タンパク質CLEC14Aが過去に認識されなかった腫瘍内皮マーカーであることを示す。
固形腫瘍のマウスモデル(例えば、Black 57マウスにおけるLewis肺癌皮下同種移植片移植またはヌードマウスにおけるHT29皮下異種移植片移植のいずれか)は、CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体を含む医薬組成物の生理食塩溶液の静脈内注入によって処置する。注入物は、2〜4か月の期間、週1回投与する。腫瘍は、動物モデルにおいて、対照に比べて退行する。
Claims (44)
- CLEC14Aの阻害剤を含む、個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤であって、CLEC14Aの阻害剤は、CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体、CLEC14Aポリヌクレオチドに特異的なsiRNA分子、アンチセンス分子、もしくはリボザイム、または、前記siRNA分子、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、薬剤。
- 個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製におけるCLEC14Aの阻害剤の使用であって、CLEC14Aの阻害剤は、CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体、CLEC14Aポリヌクレオチドに特異的なsiRNA分子、アンチセンス分子もしくはリボザイム、または、前記siRNA分子、アンチセンス分子もしくはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、使用。
- 前記阻害剤は、前記CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項1に記載の薬剤。
- 前記抗体は、成熟CLEC14Aポリペプチドの細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項3に記載の薬剤。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体である、請求項3または4に記載の薬剤。
- 前記阻害剤は、前記CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項2に記載の使用。
- 前記抗体は、成熟CLEC14Aポリペプチドの細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項6に記載の使用。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体である、請求項6または7に記載の使用。
- (i)CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体、および(ii)細胞毒性部分、を含む化合物を含む、細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に対して標的化するための薬剤。
- 細胞毒性剤を個体の身体における腫瘍血管新生に対して標的化するための薬剤の調製における、(i)CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体、および(ii)細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
- (i)CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体、および(ii)細胞毒性部分、を含む化合物を含む、個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤。
- 個体における腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の調製における、(i)CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体、および(ii)細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
- 前記細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸(cytotoxic nucleic acid)、直接的または間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいは放射性原子から選択される、請求項9または11に記載の薬剤。
- 前記放射性原子は、リン−32、ヨウ素−125、ヨウ素−131、インジウム−111、レニウム−186、レニウム−188、またはイットリウム−90である、請求項13に記載の薬剤。
- 前記細胞毒性部分は、直接的な細胞毒性化学療法剤、直接的な細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬に変換可能な部分、放射線増感剤、直接的な細胞毒性核酸(cytotoxic nucleic acid)、直接的または間接的な細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、あるいは放射性原子から選択される、請求項10または12に記載の使用。
- 前記放射性原子は、リン−32、ヨウ素−125、ヨウ素−131、インジウム−111、レニウム−186、レニウム−188、またはイットリウム−90である、請求項15に記載の使用。
- 少なくとも1つのさらなる抗癌剤を含む、請求項1、3〜5、9、11、13または14のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤はまた、少なくとも1つのさらなる抗癌剤を含む、請求項2、6〜8、10、12、15、または16のいずれか一項に記載の使用。
- 前記個体は、少なくとも1つのさらなる抗癌剤が投与される個体である、請求項2、6〜8、10、12、15、または16のいずれか一項に記載の使用。
- 前記少なくとも1つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン;カルボプラチン;5−フルオロウラシル;パクリタキセル;マイトマイシンC;ドキソルビシン;ゲムシタビン;トミュデックス(tomudex);ペメトレキセド;メトトレキサート;イリノテカン、フルオロウラシルおよびロイコボリン;オキサリプラチン、5−フルオロウラシルおよびロイコボリン;ならびにパクリタキセルおよびカルボプラチン、から選択される、請求項17に記載の薬剤。
- 前記少なくとも1つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン;カルボプラチン;5−フルオロウラシル;パクリタキセル;マイトマイシンC;ドキソルビシン;ゲムシタビン;トミュデックス(tomudex);ペメトレキセド;メトトレキサート;イリノテカン、フルオロウラシルおよびロイコボリン;オキサリプラチン、5−フルオロウラシルおよびロイコボリン;ならびにパクリタキセルおよびカルボプラチン、から選択される、請求項18または19に記載の使用。
- (i)CLEC14Aポリペプチドに選択的に結合する抗体、および(ii)検出可能な部分、を含む化合物を含む、個体の身体における腫瘍血管新生をイメージングするための薬剤。
- 前記個体における前記化合物の位置を検出する手段をさらに含む、請求項22に記載の薬剤。
- 前記検出可能な部分は、ヨウ素−123、ヨウ素−131、インジウム−111、フッ素−19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、テクネチウム−99m、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含む、請求項22または23に記載の薬剤。
- 前記個体は、ヒトである、請求項1、3〜5、9、11、13、14、17、20、22〜24のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記個体は、固形腫瘍を有する、請求項1、3〜5、9、11、13、14、17、20、22〜25のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺または甲状腺の腫瘍である、請求項26に記載の薬剤。
- 前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項26に記載の薬剤。
- 前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項26または28に記載の薬剤。
- 前記個体は、ヒトである、請求項2、6〜8、10、12、15、16、18、19、21のいずれか一項に記載の使用。
- 前記個体は、固形腫瘍を有する、請求項2、6〜8、10、12、15、16、18、19、21、30のいずれか一項に記載の使用。
- 前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺または甲状腺の腫瘍である、請求項31に記載の使用。
- 前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項31に記載の使用。
- 前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項31または33に記載の使用。
- CLEC14Aの阻害剤を含む、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性およびリウマチ様の双方)、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症(例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症)、良性血管増殖、線維症(fibroses)、肥満、ならびに炎症、から選択される疾患または症状を処置するための薬剤であって、CLEC14Aの阻害剤は、CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体、CLEC14Aポリヌクレオチドに特異的なsiRNA分子、アンチセンス分子、もしくはリボザイム、または、前記siRNA分子、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、薬剤。
- 乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎(炎症性およびリウマチ様の双方)、黄斑変性、ページェット病、網膜症およびその血管合併症(例えば、増殖性および未熟児、および糖尿病性網膜症)、良性血管増殖、線維症(fibroses)、肥満、ならびに炎症、から選択される疾患または症状を処置するための薬剤の調製におけるCLEC14Aの阻害剤の使用であって、CLEC14Aの阻害剤は、CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体、CLEC14Aポリヌクレオチドに特異的なsiRNA分子、アンチセンス分子、もしくはリボザイム、または、前記siRNA分子、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、使用。
- 生体外での血管新生を阻害する方法であって、CLEC14Aの阻害剤を内皮細胞または血管新生モデルに生体外で投与するステップを含み、CLEC14Aの阻害剤は、CLEC14Aポリペプチドに特異的に結合する抗体、CLEC14Aポリヌクレオチドに特異的なsiRNA分子、アンチセンス分子、もしくはリボザイム、または、前記siRNA分子、アンチセンス分子、またはリボザイムをコードするポリヌクレオチドまたはベクターである、方法。
- 固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤または固形腫瘍の処置において有用でありうる作用剤を同定するためのリード化合物を同定する方法であって、
CLEC14Aポリペプチドまたはその断片に結合する候補化合物を提供するステップと、
血管新生アッセイにおいて前記候補化合物を試験するステップと、
を含み、ここで、前記アッセイにおいて血管新生を阻害する候補化合物は、固形腫瘍の処置において有用な作用剤でありうるか、または固形腫瘍の処置において有用な作用剤を同定するためのリード化合物でありうる、方法。 - 前記候補化合物が前記CLEC14Aポリペプチドまたはその断片に選択的に結合するか否かを判定する先行するステップをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記候補化合物は、抗体、ペプチド、アプタマーまたは小さい有機分子である、請求項38または39に記載の方法。
- 前記血管新生アッセイは、大動脈輪アッセイ、スポンジ血管新生アッセイ、内皮細胞増殖のアッセイ、内皮細胞移動のアッセイ、および/または内皮細胞浸潤のアッセイ、である、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定された化合物は、修飾され、かつ、前記修飾された化合物は、血管新生に対する阻害能について試験される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定された化合物または前記修飾された化合物は、固形腫瘍の動物モデルにおける有効性について試験される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定された化合物または前記修飾された化合物を合成、精製、および/または調合するステップをさらに含む、請求項38〜43のいずれか一項に記載の方法。
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