CN117886943A - 用于疾病和病症治疗和预防的抗-肾酶抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于疾病和病症治疗和预防的抗‑肾酶抗体。具体地，本发明涉及用于结合和抑制肾酶的组合物和方法。在一个实施方式中，肾酶结合分子抑制肾酶活性。因此，在其中肾酶活性降低是有益的疾病和病况的情况下，这些抑制性肾酶结合分子可以起到治疗剂的作用。

Description

用于疾病和病症治疗和预防的抗-肾酶抗体
本申请是申请日为2018年12月27日的题为“用于疾病和病症治疗和预防的抗-肾酶抗体”的中国专利申请号201880084379.5的分案申请。
相关申请的交叉引用
本发明申请主张2017年12月29日提交的美国临时专利申请No.62/611,609的优先权，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
背景技术
肾酶(RNLS)是主要在肾、心脏、骨骼肌、精巢并且在较小程度上在其它组织中产生的蛋白(Xu等人,2005J Clin Invest.115(5):1275-80和Wang等人,2008Mol Biol Rep.35(4):613-20)。已描述了两种肾酶的同工型变体，肾酶-1和肾酶-2。由于最终外显子的差异剪接，这两种肾酶形式是不同的。已将肾酶描述为新型含-黄素腺嘌呤二核苷酸的单胺氧化酶，其具有使儿茶酚胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺选择性脱氨基的活性。与健康个体相比，已描述了患有晚期肾病的患者血浆中肾酶的缺乏。儿茶酚胺通过影响心输出量和血管阻力在维持和调节血压中，包括在疾病中起重要作用。向大鼠输注重组形式的肾酶导致心肌收缩力、心率和血压降低。肾衰竭患者的特征在于循环儿茶酚胺水平升高，这与高血压和通过心血管并发症的更高的死亡率相关。因此，蛋白肾酶可以在控制和维持儿茶酚胺-引起的血压变化中起作用，并且肾病患者中所观察到的肾酶缺乏可以对结局有害。
与健康个体相比，已描述了患有晚期肾病的患者血浆中肾酶的缺乏。肾衰竭患者的特征在于循环儿茶酚胺水平升高，这与高血压和通过心血管并发症的更高的死亡率相关。因此，蛋白肾酶可以在控制和维持儿茶酚胺-引起的血压变化中起作用，并且肾病患者中所观察到的肾酶缺乏可以对结局有害。然而，对于肾酶在癌症中的作用知之甚少。
癌症的基本特征在于细胞衰老和死亡的调控异常。肾酶(RNLS)是通过经由质膜钙ATP酶PMCA4b的信号转导以激活PI3K/AKT和MAPK途径来保护缺血性和毒性细胞损伤的分泌的黄素蛋白。
皮肤癌是常见的人恶性肿瘤，并且其发病率在发达国家中不断升高(Gray-Schopfer等人,2007Nature.445:851-7；Lowe等人,2014Mayo Clinic Proceedings.89:52-9；Lesinski等人,2013Future oncology.9:925-7)。黑素瘤是最致命的皮肤癌形式，一旦其不可切除，则存活率较低(Lowe等人,2014Mayo Clinic Proceedings.89:52-9)它是分子异质性疾病，并且已鉴别了参与疾病发生和发展的信号通路中的一些关键变化。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路在黑素瘤的病理发生中起重要作用(Gray-Schopfer等人,2007Nature.445:851-7；Lesinski等人,2013Future oncology.9:925-7；Yajima等人,2012Dermatology research and practice.2012:354191)。Ras、Raf、PI3K或PTEN(PI3K抑制剂)中的突变可以导致ERK和AKT的持续激活，这反过来促进细胞存活和增殖。Dankort等人通过小鼠中BRafV600E的条件性黑素细胞-特异性表达对其进行了很好地证实，其中无小鼠发生黑素瘤，然而，当与Pten肿瘤抑制基因的沉默结合时，显示了100％的黑素瘤发生的外显率(Dankort等人,2009Nature genetics.41:544-52)。这些病原性途径的阐明有利于开发靶向超激活的激酶的特异性抑制剂。尽管已在患有转移性黑素瘤的选择性患者组的治疗中证实了这些试剂的有效性，但是它们的有益作用通常是短暂的，因此急需鉴别其它治疗性靶标。
在黑素瘤肿瘤，并且具体地在CD163+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中，RNLS表达显著增加。在患有原发性黑素瘤的患者群组中，疾病-特异性存活与肿瘤块中RNLS的表达负相关，这表明了RNLS的病原性作用。使用siRNA、抗-RNLS抗体或RNLS来源的抑制肽的RNLS信号转导的抑制显著降低了黑素瘤细胞的体外存活。在异种移植小鼠模型中，使用单克隆抗体的抗-RNLS疗法显著抑制了黑素瘤肿瘤的生长。使用m28-RNLS(先前也称为1D-28-4)的治疗在CD163+TAM中导致内源RNLS表达以及总的和磷酸化的STAT3显著降低。肿瘤细胞中细胞凋亡的升高与p38 MAPK介导的B细胞淋巴瘤2相关蛋白Bax的激活暂时相关。细胞周期抑制剂p21的表达升高，并且记录了细胞周期阻滞。这些结果表明通过CD163+TAM的RNLS产生的增加有利于通过激活STAT3的黑素瘤生长，并且RNLS信号转导的抑制在黑素瘤控制中具有潜在的治疗应用。
用于体液和组织中肾酶检测的改善方法可以帮助肾病、心血管疾病和/或癌症的诊断和预后。然而，肾酶作为相关生物标志物的验证需要用于其检测的高选择性试剂。抗体-基技术广泛用于生物标志物的检测。迄今为止，仅有少量抗肾酶的试剂抗体，并且没有或仅有最低的鉴定。
胰腺癌是最致死的赘生物之一，其导致全世界约330,000人死亡并且导致美国40,000人死亡(World Cancer Report 2014.WHO Press；2014)。胰癌难以检测，并且大部分病例是在晚期诊断的(Nolen等人,2014PLoS ONE.9(4):e94928)。尽管在这种癌症的化疗使用中具有一些进展，但是该疾病仍极耐受所有药物疗法(Hidalgo等人,2010New EnglandJournal of Medicine.362(17):1605-17)。胰腺癌个体的整体5-年存活率<5％(Hidalgo等人,2010New England Journal of Medicine.362(17):1605-17)，并且需要其它治疗靶标。
胰腺癌的发生依赖于基因突变的逐步积累(Jones等人,2008Science.321(5897):1801-6)，其中一些导致异常的MAPK、PI3K和JAK-STAT信号转导。从最低限度发育不良的上皮细胞到发育异常，再到浸润性癌的发展反映了激活致癌基因(例如，KRAS2)或者使肿瘤抑制基因9(例如，CDKN2a/INK4a、TP53和DPC4/SMaD4)失活的基因突变的逐步积累(Hidalgo等人,2012Annals of Oncology.23(suppl 10):x135-x8)。95、90和75％的胰腺肿瘤分别在KRAS2、CDKN2a和TP53中具有突变。这些突变导致了以癌症生长为特征的持续和失调的增殖。已通过24个晚期胰腺导管腺癌(PDAC)的综合基因分析定义了PDAC中的突变全景图和核心信号通路(Jones等人,2008Science.321(5897):1801-6)。这些数据表明大部分PDAC含有主要为点突变并且影响约12个细胞信号通路的大量遗传变化。
该研究还鉴别了541个在PDAC中，在90％的肿瘤中过表达至少10-倍的基因。这包括最近鉴别的蛋白肾酶(RNLS)、肿瘤或肿瘤来源的细胞系的2至4-倍的增加。RNLS是新型分泌的黄素蛋白(Xu等人,2005J Clin Invest.115(5):1275-80；Desir等人,2012J Am HeartAssoc.1(e002634；Desir等人,2012J Am Soc Hypertens.6(6):417-26；Li等人,2008Circulation.117(10):1277-82)，其具有NADH氧化酶活性(Farzaneh-Far等人,2010PLoS One.5(10):e13496；Beaupre等人,2015Biochemistry.54(3):795-806)，从而通过独立于其内源酶催化活性的受体-介导的过程(Wang等人,2014Journal of theAmerican Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)促进细胞和器官存活(Lee等人,2013J Am Soc Nephrol.24(3):445-55)。RNLS快速激活蛋白激酶B(AKT)、胞外信号-调控激酶(ERK)和有丝分裂原激活的蛋白激酶(p38)。ERK或AKT中的任一种的化学抑制终止了RNLS的保护作用(Wang等人,2014Journal of the American Society ofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。
因此，仍需要用于包括肾病、心血管疾病和癌症在内的疾病或病症的检测、诊断、预防和治疗的结合肾酶的改善的方法和组合物，如抗体。本发明解决了这种需要。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及包含特异性结合至肾酶的抗体或其结合部分的组合物。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分以至少10-6M的亲和力特异性结合至肾酶。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分特异性结合包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的肽。
在一个实施方式中，所述肾酶是人肾酶。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖基化抗体或者双重特异性抗体。
在一个实施方式中，所述免疫缀合物包含治疗剂或检测部分。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分选自人源化抗体、嵌合抗体、完全人抗体和抗体模拟物。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分包含以下中的至少一种：a)包含SEQID NO:155的氨基酸序列的重链(HC)CDR1，b)包含选自SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:168的氨基酸序列的HC CDR2，c)包含选自SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:163的氨基酸序列的HC CDR3，d)包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链(LC)CDR1，e)包含SEQ IDNO:153的氨基酸序列的LC CDR2和f)包含选自SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:160的氨基酸序列的LC CDR3。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分包含含有SEQ ID NO:155的氨基酸序列的HC CDR1、含有SEQ ID NO:156的氨基酸序列的HC CDR2、含有SEQ ID NO:157的氨基酸序列的HC CDR3、含有SEQ ID NO:152的氨基酸序列的LC CDR1、含有SEQ ID NO:153的氨基酸序列的LC CDR2和含有SEQ ID NO:154的氨基酸序列的LC CDR3。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分包含含有SEQ ID NO:219的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:221的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分包含以下中的至少一种：a)包含选自SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:203的氨基酸序列的HC CDR1，b)包含选自SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:204的氨基酸序列的HC CDR2，c)包含选自SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:205的氨基酸序列的HC CDR3，d)包含选自SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:200的氨基酸序列的LCCDR1，e)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的LC CDR2和f)包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的LC CDR3。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分包含含有SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HC CDR1、含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HC CDR2、含有SEQ ID NO:199的氨基酸序列的HC CDR3、含有SEQ ID NO:194的氨基酸序列的LC CDR1、含有SEQ ID NO:195的氨基酸序列的LC CDR2和含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的LC CDR3。
在一个实施方式中，所述抗体或其结合部分包含含有SEQ ID NO:223的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VL。
在一个实施方式中，本发明涉及包含编码特异性结合至肾酶的至少一种抗体或其结合部分的序列的分离的核酸分子。
在一个实施方式中，所述分子包含与选自SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ IDNO:222和SEQ ID NO:224的至少一种核酸序列至少80％同一的至少一种核酸序列。
在一个实施方式中，本发明涉及包含选自SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ IDNO:222和SEQ ID NO:224的至少一种核酸序列的表达载体。
在一个实施方式中，本发明涉及包含选自SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ IDNO:222和SEQ ID NO:224的至少一种核酸序列的细胞。
在一个实施方式中，本发明涉及治疗对其有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含特异性结合至肾酶的抗体或其结合部分的组合物。
在一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种其它试剂的步骤。
在一个实施方式中，所述疾病或病症是选自肾病、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、肾脏的炎症性病症和癌症的至少一种。
在一个实施方式中，所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症是胰腺癌或黑素瘤。
在一个实施方式中，所述受试者是人。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方式的以下详细说明。应理解本发明不局限于附图中所示的实施方式的确切方案和工具。
图1显示了用于使兔免疫的肽抗原(SEQ ID NO:1-7)。
图2显示了全长肾酶-1蛋白序列(SEQ ID NO:8)。
图3显示了肾酶蛋白内的抗原位置(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:50)。显示了抗原1A/1B、1C、1D、1E、1F和3A5。
图4显示了抗-1D表位单克隆1D-28-4重链编码序列(SEQ ID NO:52)和氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
图5显示了抗-1D表位单克隆1D-28-4轻链编码序列(SEQ ID NO:53)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
图6显示了抗-1D表位单克隆1D-37-10重链编码序列(SEQ ID NO:60)和氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。
图7显示了抗-1D表位单克隆1D-37-10轻链编码序列(SEQ ID NO:61)和氨基酸序列(SEQ ID NO:18)。
图8显示了抗-1F表位单克隆1F-26-1重链编码序列(SEQ ID NO:68)和氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。
图9显示了抗-1F表位单克隆1F-26-1轻链编码序列(SEQ ID NO:69)和氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。
图10显示了抗-1F表位单克隆1F-42-7重链编码序列(SEQ ID NO:76)和氨基酸序列(SEQ ID NO:33)。
图11显示了抗-1F表位单克隆1F-42-7轻链编码序列(SEQ ID NO:77)和氨基酸序列(SEQ ID NO:34)。
图12显示了抗-肾酶-2表位单克隆3A-5-2重链编码序列(SEQ ID NO:84)和氨基酸序列(SEQ ID NO:41)。
图13显示了抗-肾酶-2表位单克隆3A-5-2轻链编码序列(SEQ ID NO:85)和氨基酸序列(SEQ ID NO:42)。
图14显示在ELISA测定中，抗全长肾酶蛋白的抗-肾酶多克隆抗体特异性结合结合的肾酶蛋白。
图15显示抗1D肽的单克隆抗体1D 28-4和1D 37-10以浓度依赖性方式结合至肾酶-1。1D肽存在于肾酶-1和肾酶-2两者中。抗1F肽的单克隆抗体1F 42-7和1F 26-1仅存在于肾酶-1中。1F mAb以浓度-依赖性方式结合至肾酶-1。
图16显示为了确立所述抗体是否可以用于通过免疫印迹检测肾酶，在SDS-PAGE上分析细菌或哺乳动物来源的重组肾酶蛋白的稀释系列，并使用Ren1D 28-4抗体进行免疫印迹。通过该方法清楚地鉴别了任一种来源的重组蛋白。
图17显示通过ELISA测定，抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-42-7和1F-26-1以浓度-依赖性方式结合肾酶-1蛋白(图15)。然而，当在ELISA板测定上将相同抗体用于检测重组肾酶-2时，仅1D-28-4和1D-37-10显示出稳健的浓度-依赖性结合。在ELISA测定中观察到抗体3A5-2结合至肾酶-2同工型。因此，可以看出抗对应于一种或其它肾酶同工型的肽的抗体对于相关全长蛋白显示出特异性。
图18显示抗1D表位的单克隆抗体1D 28-4和1D 37-10以浓度依赖性方式结合至1D-BSA蛋白(实心圆表示1D 28-4，空心圆表示1D 37-10)。
图19显示生物素化的单克隆抗体1D 28-4(实心圆)、1D 37-10(空心圆)、1F 42-7(实心三角形)和1F 26-1(空心三角形)以浓度依赖性方式结合至肾酶-1。
图20，包括图20A和图20B显示可以通过竞争ELISA检测重叠表位。(图20A)通过非缀合的1D 28-4(实心圆)竞争生物素化的1D 37-10；类似地，抗1F肽的抗体还彼此竞争：通过非缀合的1F 42-7(实心三角形)竞争生物素化的1F 26-1；当与来自未免疫的兔的非缀合抗体培育时，来自生物素化的单克隆抗体的信号不会降低(空心圆和三角形)。(图20B)在其它实例中，抗全长肾酶-1的多克隆抗体E2930显示与每个生物素化的单克隆抗体1D 37-10、1F 26-1以及两种生物素化的mAb的混合物竞争(实心圆、实心方块和空心菱形)；另外，来自未免疫的兔的非缀合的抗体不与两种生物素化的抗体的混合物竞争(实心三角形)；通过抗两种生物素化的单克隆抗体的多克隆抗体E2930的竞争表明该多克隆抗体结合至肾酶多肽上的多个表位。
图21显示抗体1D-28-4、1F-42-7、1D-37-10和1F-26-1均以高亲和力结合肾酶-值在2.67nM至0.316nM KD的范围内。在抗体之间观察到了宽泛的结合和解离速率范围，这表明了不同抗体组合物的不同属性。
图22显示了抗-肾酶抗体结合亲和力的总结。
图23显示抗RNLS的两种单克隆抗体[克隆#28-4(m28-RNLS)、37-10(m37-RNLS)]降低了所测试的所有(总计5个)黑素瘤细胞系的存活力，并且显示了代表性实例。
图24显示m28-RNLS证实了与升高的处理浓度相关的升高的细胞毒性水平(p<0.05)。
图25显示了作为对照(兔IgG)和抗-肾酶(m28-RNLS)处理组之间的时间的函数的肿瘤体积。对于体内研究，将A375.S2(人黑素瘤)细胞皮下注射至无胸腺裸鼠以产生肿瘤。一旦肿瘤达到～50mm3的体积，则用对照兔IgG或RNLS中和单克隆抗体m28-RNLS处理动物。总体上，在研究期间维持了动物的健康和活动，抗体治疗未显示出毒性。每隔一天测量肿瘤尺寸，并且通过m28-RNLS的治疗在所有测试点降低了肿瘤体积(p<0.05)。
图26显示通过细胞增殖标志物Ki67对来自异种移植肿瘤切片的IHC染色显示相对于用兔IgG处理的那些，用抗-RNLS抗体处理的肿瘤内细胞增殖显著降低：对照组中为35.1±2.3个阳性细胞/高倍视野，相对于RNLS Ab治疗组中的13.4±3.0，n＝14，p＝0.0004。
图27显示与兔IgG相比，m28-RNLS施用导致肿瘤体积显著降低。
图28显示了m28-RNLS、m37-RNLS和可商购的多克隆(抗RP-220部分序列)抗体对人胰腺腺癌细胞生长的抑制作用。
图29显示了m28-RNLS、m37-RNLS和可商购的多克隆(抗RP-220部分序列)抗体对人胰腺腺癌细胞生长的抑制作用。
图30显示了m28-RNLS、m37-RNLS和可商购的多克隆(抗RP-220部分序列)抗体对人胰腺腺癌细胞生长的抑制作用。
图31显示与兔IgG相比，m28-RNLS治疗导致肿瘤体积显著降低。
图32显示5种人源化m28变体(m28-K2、m2-K5、m28-K13、m28-K14和m28-K16，表2)显示与人和小鼠RNLS两者的结合升高。
图33显示5种人源化m28变体(m28-K2、m2-K5、m28-K13、m28-K14和m28-K16，表2)显示与人和小鼠RNLS两者的结合升高。
图34显示5种人源化m28变体(m28-K2、m2-K5、m28-K13、m28-K14和m28-K16，表2)还降低了黑素瘤(SK-MEL-28)和胰腺腺癌(BxPC3)的人细胞系的存活力，(显示了代表性实例)，这表明m28变体在人癌症中的潜在治疗用途。
图35显示5种人源化m28变体(m28-K2、m2-K5、m28-K13、m28-K14和m28-K16，表2)还降低了黑素瘤(SK-MEL-28)和胰腺腺癌(BxPC3)的人细胞系的存活力，(显示了代表性实例)，这表明m28变体在人癌症中的潜在治疗用途。
图36显示了评价人源化m28变体的剂量反应和IC50的示例性实验。
具体实施方式
本发明涉及使用结合至肾酶的试剂对肾酶的至少一种生物活性的抑制。在多个实施方式中，本发明涉及通过向对其有需要的受试者施用肾酶抑制剂来治疗个体中肾酶-相关病变或肾酶-相关病况的组合物和方法。在多个实施方式中，使用本发明所述的组合物和方法可诊断、可预防和可治疗的疾病和病症包括急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、肾脏的炎症性病症和癌症。
在一个实施方式中，本发明广泛地涉及肾酶-相关病况，如癌症的治疗、预防和诊断。在一个实施方式中，本发明涉及用于癌症的诊断、治疗、抑制、预防或减轻的方法和组合物。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节肾酶水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。在癌症和相关疾病和病症的背景中，本发明提供了用于降低肾酶水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。本发明的一些方面提供了用于癌症转移的治疗、预防、诊断或预后的方法和组合物。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。
通常，本文所使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验程序是本领域中熟知且常用的那些。
将标准技术用于核酸和肽的合成。通常根据本领域中的常规方法以及多种一般参考文献进行所述技术和程序(例如，Sambrook and Russell,2012,Molecular Cloning,ALaboratory Approach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY和Ausubel等人,2012,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)，在整个文档中提供了所述技术和程序。
本文所使用的命名和在如下所述的分析化学和有机合成中使用的实验室程序是本领域中熟知且常用的那些。将标准技术或其修改形式用于化学合成和化学分析。
冠词“一”和“一个”在本文中用于表示一个或大于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”表示一个元素或大于一个元素。
当表示可测值，如量、时距等时，如本文所使用的“约”意味着涵盖了所指定值的±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％的变化，照此这些变化对于实施所公开的方法是适合的。
当在生物、组织、细胞或其组分的背景中使用时，术语“异常的”是指至少一个可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、时间等)不同于显示出“正常”(预期的/自我平衡的)各个特征的那些生物、组织、细胞或其组分的那些生物、组织、细胞或其组分。对于一种细胞、组织类型或受试者正常或预期的特征可以对于不同的细胞或组织类型是异常的。
如本文所使用的术语“类似物”泛指通常在结构上类似于它们作为类似物的化合物的化合物或者“母体”化合物。一般地，类似物将保留母体化合物的某些特征，例如，生物或药理学活性。类似物可以缺少其它不太期望的特征，例如，抗原性、蛋白水解不稳定性、毒性等。类似物包括其中在“类似物”中，母体化合物的特定生物活性降低，同时母体化合物的一种或多种独特的生物活性不受影响的化合物。当应用于多肽时，术语“类似物”可以具有对母体化合物不同的氨基酸序列同一性范围，例如，母体化合物或母体化合物的所选部分或域的给定氨基酸序列中的至少约70％，更优选地至少约80％-85％或者约86％-89％，并且更优选地至少约90％，约92％，约94％，约96％，约98％或约99％。当应用于多肽时，术语“类似物”泛指由对结合域融合蛋白的至少一部分具有显著同一性的约至少3个氨基酸的节段所组成的多肽。类似物通常为至少5个氨基酸长，至少20个氨基酸长或更长，至少50个氨基酸长或更长，至少100个氨基酸长或更长，至少150个氨基酸长或更长，至少200个氨基酸长或更长并且更通常地至少250个氨基酸长或更长。一些类似物可能缺少明显的生物活性，但仍可以用于多种用途，如对预定表位产生抗体，作为通过亲和色谱法检测和/或纯化反应性抗体的免疫学试剂或者作为具有结合域融合蛋白功能的竞争性或非竞争性激动剂、拮抗剂或部分激动剂。
如本文所使用的术语“抗体”是指能够特异性结合至结合伴侣分子的特异性表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。本发明中所述的抗体可以以多种形式存在，其包括(例如)多克隆抗体、单克隆抗体、胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab')2，以及单链抗体(scFv)、重链抗体，如骆驼科动物抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
术语“抗体片段”是指全抗体的至少一部分并且是指全抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、sdAb(VL或VH)、骆驼科动物VHH域、scFv抗体和由抗体片段所形成的多重特异性抗体。术语“scfv”是指包含含有轻链可变区的至少一个抗体片段和含有重链可变区的至少一个抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区通过短柔性多肽接头连续连接并且能够作为单链多肽表达，并且其中scFv保留了其所衍生自的全抗体的特异性。除非具体说明，否则如本文所使用的scFv可以以任一种顺序具有VL和VH可变区，例如，相对于所述多肽的N末端和C末端，所述scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
如本文所使用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的多肽链，并且其通常决定了抗体所属的种类。
如本文所使用“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的多肽链。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链表示两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所使用的术语“合成抗体”表示使用DNA重组技术所产生的抗体，如(例如)通过如本文所述的噬菌体所表达的抗体。还应将该术语视为表示已通过编码所述抗体的DNA分子的合成产生并且所述DNA分子表达指明所述抗体的抗体蛋白质或氨基酸序列的抗体，其中已使用在本领域中可用的并且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得了所述DNA或氨基酸序列。
“嵌合抗体”是指一类工程抗体，其包含来源于供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)以及来源于受体抗体的轻链和重链恒定区。
“人源化抗体”是指一类工程抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的CDR，所述分子剩余的免疫球蛋白-来源部分来源于一种(或以上)的人免疫球蛋白。另外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力(参见，例如，1989,Queen等人,Proc.Natl.Acad Sci USA,86:10029-10032；1991,Hodgson等人,Bio/Technology,9:421)。适合的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自常规数据库，例如，KABAT数据库、LosAlamos数据库和Swiss蛋白数据库的抗体。其特征为与供体抗体的框架区的同源性(基于氨基酸)的人抗体可以适合于提供用于供体CDR插入的重链恒定区和/或重链可变框架区。可以以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变框架区的适合的受体抗体。应注意所述受体抗体重链和轻链不需要来源于相同受体抗体。现有技术描述了产生这些人源化抗体的几种方法(参见，例如，EP-A-0239400和EP-A-054951)。
术语“供体抗体”是指为第一免疫球蛋白伴侣(first immunoglobulin partner)提供其可变区、CDR或其其它功能性片段或类似物的氨基酸序列的抗体(单克隆和/或重组)，从而提供了改变的免疫球蛋白编码区和具有供体抗体的结合特异性以及中和活性特征的所得的表达的改变的抗体。
术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组)，其为第一免疫球蛋白伴侣贡献了编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或者任意部分，但是在一些实施方式中，全部)。在某些实施方式中，人抗体是受体抗体。
“CDR”的定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，它是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDR(或者CDR区)。因此，如本文所使用的“CDR”是指所有三个重链CDR，或者所有三个轻链CDR(或者如果有的话，所有重链和所有轻链CDR两者)。抗体的结构和蛋白折叠可以表示将其它残基考虑为结合区的一部分并且技术人员也将这样理解。参见，例如，Chothia等人,(1989)Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions；Nature342,p 877-883。
术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDR的剩余序列。由于可以通过不同系统确定CDR序列的确切定义，因此框架序列的含义获得了相应不同的解释。六种CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链上的框架区划分为每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。当未将具体亚区指明为FR1、FR2、FR3或FR4时，通过其它提及时，框架区表示单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR。FR代表4种亚区之一，并且FRs代表构成框架区的4种亚区中的两个或更多个。
如本文所使用的，“免疫测定”是指使用能够特异性结合至靶标分子以检测和定量所述靶标分子的抗体的任何结合测定。
对于抗体来说，如本文所使用的术语“特异性结合”表示识别特异性结合伴侣分子，但是基本不识别或结合样品中的其它分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的结合伴侣分子的抗体还可以结合至来自一个或多个物种的结合伴侣分子。但是，这种物种间的反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合至结合伴侣分子的抗体还可以结合至所述结合伴侣分子不同的等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体作为特异性的分类。
在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异的结合”可以与抗体、蛋白或肽与第二结合伴侣分子的相互作用结合用于表示所述相互作用取决于所述结合伴侣分子上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，通常，抗体识别并结合至特异性蛋白结构，而不是蛋白。如果抗体对表位“A”特异，则在含有标记的“A”和所述抗体的反应中，含有表位A的分子(或者游离的未标记的A)的存在将降低结合至所述抗体的标记的A的量。在一些情况下，术语“特异性结合”是指选择性结合，其中所述抗体识别对于结合至结合伴侣分子的提高的亲和力重要的序列或构象表位。
如本文所使用的，术语“中和”是指当结合蛋白特异性结合肾酶时，肾酶生物活性的中和。优选地，中和结合蛋白是中和抗体，其与肾酶的结合导致肾酶生物活性的抑制。优选地，中和结合蛋白结合肾酶并且将肾酶的生物学活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％或以上。在一些实施方式中，所述肾酶是人肾酶。
术语“表位”具有通过抗体或其结合部分或者其它结合分子，如(例如)scFv所识别的结合伴侣分子上的位点的其常规含义。表位可以是分子或氨基酸段，包括表示完整蛋白或多肽的一小部分的段。表位可以是构象的(即不连续的)。也就是说，它们可以由已通过蛋白折叠为并列的一级序列的非邻接部分所编码的氨基酸形成。
如本文所使用的短语“生物样品”旨在包括包含其中可以检测到核酸的表达或多肽的细胞、组织或体液的任何样品。这些生物样品的实例包括(但不限于)血液、淋巴、骨髓、活组织检查和涂片。天然状态为液体的样品在本文中称为“体液”。可以通过多种技术，包括(例如)通过刮研或擦拭区域或者通过使用针获得体液，从患者获得生物样品。用于收集多种身体样品的方法在本领域中是熟知的。
如本文所使用的术语“癌症”的定义为以异常细胞的异常生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体其它部分。多种癌症的实例包括(但不限于)乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、肉瘤等。
如本文所使用的，“缀合的”是指一个分子与第二分子的共价连接。
基因的“编码区”包括所述基因的编码链的核苷酸残基以及所述基因的非编码链的核苷酸，其分别与通过所述基因的转录所产生的mRNA分子的编码区同源或互补。
mRNA分子的“编码区”还包括所述mRNA分子的核苷酸残基，其与所述mRNA分子翻译期间的转运RNA分子的反密码子区相匹配或者其编码了终止密码子。因此，所述编码区可以包括包含在所述mRNA分子所编码的成熟蛋白中不存在的氨基酸残基(例如，蛋白输出信号序列中的氨基酸残基)的密码子的核苷酸残基。
如本文用于表示核酸的“互补的”是指两条核酸链的区域之间或者相同核酸链的两个区域之间的序列互补性的广泛概念。已知第一核酸区的腺嘌呤残基能够与反向平行于所述第一区的第二核酸区的残基(如果所述残基为胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特异性氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够用反向平行于所述第一链的第二核酸链的残基(如果所述残基是鸟嘌呤)碱基配对。如果当以反向平行的方式布置所述两个区，且所述第一区的至少一个核苷酸残基能够与所述第二区的残基碱基配对，则核酸的第一区与具有相同或不同核酸的第二区互补。优选地，所述第一区包含第一部分，所述第二区包含第二部分，其中当以反向平行方式布置所述第一和第二部分时，所述第一部分的核苷酸残基的至少约50％，并且优选地至少约75％，至少约90％或者至少约95％能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，所述第一部分的所有核苷酸残基能够与所述第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文所使用的，术语“衍生物”包括多肽、多核苷酸或其它分子的化学修饰。本发明的上下文中，“衍生多肽”，例如，通过糖基化、PEG化或任何类似的方法修饰的多肽保留了结合活性。例如，术语结合域的“衍生物”包括已通过(例如)添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其它这些分子化学修饰的结合域融合蛋白、变体或片段，其中所述分子非天然地连接至野生型结合域融合蛋白。多肽的“衍生物”还包括通过相对于参考多肽具有(例如)氨基酸替换、缺失或插入而“衍生”自参考多肽的那些多肽。因此，多肽可以“衍生”自野生型多肽或任何其它多肽。如本文所使用的，化合物，包括多肽还可以“衍生”自特定来源，例如，衍生自特定生物、组织类型或衍生自存在于特定生物或特定组织类型中的特定多肽、核酸或其它化合物。
如本文所使用的术语“DNA”的定义为脱氧核糖核酸。
“编码”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列，如基因、cDNA或mRNA用作生物过程中用于具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或者具有从中所获得的限定的氨基酸序列和生物学性质的其它聚合物和大分子的合成的模板的固有性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生了蛋白，则所述基因编码所述蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其它产物。
除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，从而在一些形式中，编码所述蛋白的核苷酸序列可以含有内含子。
“疾病”是动物的健康状态，其中所述动物不可以维持体内平衡，并且其中如果所述疾病未得到改善，则所述动物的健康持续变差。
相反，动物中的“病症”是其中所述动物能够维持体内平衡，但是其中所述动物的健康状态不如不存在所述病症的情况下的状态良好的健康状态。如果保持不治疗，则病症不必需导致所述动物的健康状态进一步降低。
如果疾病或病症的病征或症状的严重程度，患者经历这种病征或症状的频率，或两者降低，则所述疾病或病症“减轻”。
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以为施用所述化合物的受试者提供有益作用的化合物的量。
对于本文所述的结合域多肽，术语“高亲和力”是指至少约10-6M，优选地至少约10-7M，更优选地至少约10-8M或以上，更优选地至少约10-9M或以上，更优选地至少约10-10M或以上，例如，高达10-12M或以上的解离常数(Kd)。然而，对于其它结合域多肽，“高亲和力”结合可以是不同的。
如本文所使用的术语“抑制”表示相对于对照值，将活性或功能抑制或阻断(例如)约10％。优选地，与对照值相比，活性被抑制或阻断了50％，更优选地75％，并且更优选地95％。如本文所使用的，“抑制”还表示将分子、反应、相互作用、基因、mRNA和/或蛋白的表达、稳定性、功能或活性的水平降低了可测量的量或者完全防止。抑制剂是(例如)结合至、部分或完全阻断活性、降低、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调蛋白、基因和mRNA的稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如，拮抗剂。
如本文所使用的术语“调节剂”和所关心的分子的“调节”以其多种形式旨在涵盖与所关心的蛋白酶相关的活性的拮抗作用、激动作用、部分拮抗作用和/或部分激动作用。在多个实施方式中，“调节剂”可以抑制或刺激蛋白酶的表达或活性。这些调节剂包括蛋白酶分子、反义分子、核糖酶、三链体分子和RNAi多核苷酸以及其它分子的小分子激动剂和拮抗剂。
如本文所使用的，“说明材料”包括可以用于传递所述试剂盒中的本发明的化合物、组合物、载体或递送系统对于产生减轻本文所列举的多种疾病或病症的作用的有用性的出版物、记录、图表或任何其它表达媒介。任选地或者替代地，所述说明材料可以描述一种或多种减轻哺乳动物细胞或组织中的疾病或病症的方法。本发明所述的试剂盒的说明材料可以(例如)粘贴在包含本发明所鉴别的化合物、组合物、载体或递送系统的容器上，或者可以与包含所鉴别的化合物、组合物、载体或递送系统的容器一起运输。作为另外一种选择，所述说明材料可以与所述容器分开运输，其目的在于通过接受者协作使用所述说明材料和所述化合物。
“分离的”表示相对于天然状态改变或从天然状态中除去。例如，在其正常背景中天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然背景中共存的材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以处于基本纯化的形式，或者可以存在于非天然环境中，如(例如)宿主细胞。
“分离的核酸”是指已与在天然存在的状态中对其侧接的序列分离的核酸段或片段，即已从通常邻近于所述片段的序列(即在其天然存在的基因组中邻近于所述片段的序列)中除去的DNA片段。所述术语还适用于已基本从天然伴随所述核酸的其它组分(即，在细胞中天然伴随所述核酸的RNA或DNA或蛋白)中纯化的核酸。因此，所述术语包括(例如)引入到载体中，引入到自主复制质粒或病毒中，或者引入到原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者作为独立于其它序列的单独的分子(即，作为通过PCR或限制性内切酶消化所产的cDNA或者基因组或cDNA片段)存在的重组DNA。它还包括作为编码其它多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。
在本发明的背景中，使用了以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷酸，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟嘌呤核苷，“T”是指胸腺嘧啶核苷并且“U”是指尿嘧啶核苷。如本文所使用的术语“多核苷酸”的定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有以下常识：核酸是多核苷酸，其可以水解为单体“核苷酸”。所述单体核苷酸可以水解为核苷。如本文所使用的多核苷酸包括(但不限于)通过本领域中可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式无限制地包括重组方式，即使用常规克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组中对核酸序列的克隆，和通过合成方式。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是可互换使用的并且表示由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且不限制蛋白或肽序列可以包含的最大氨基酸数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何的肽或蛋白。如本文所使用的，该术语是指短链和长链两者，所述短链在本领域中通常称为(例如)肽、寡肽和寡聚物，并且长链在本领域中通常称为蛋白，其存在多种类型。“多肽”包括(例如)生物学活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、杂二聚物、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类拟物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的组合。
当描述多肽时，术语“保守替换”是指基本不改变多肽活性的多肽的氨基酸组成的改变，即氨基酸被具有类似性质的其它氨基酸替换。提供功能类似的氨基酸的保守替换表在本领域中是熟知的。以下六组分别含有通常理解为表示对另外一种的保守替换的氨基酸：(1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；(2)门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天门冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(还参见，Creighton,1984,Proteins,W.H.Freeman and Company)。除以上-定义的保守替换之外，氨基酸残基的其它修饰也可以导致产生“保守修饰变体”。例如，可以将所有带电氨基酸认为是对于彼此的替换，无论它们是带正电荷的或是带负电荷的。另外，保守修饰的变体也可以由使编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸，例如，通常小于5％的氨基酸改变、添加或缺失的单个替换、缺失或添加产生。此外，可以通过用相同氨基酸的不同密码子替换天然或野生型基因所使用的氨基酸的密码子，从重组多肽中制备保守修饰的变体。
如本文所使用的术语“RNA”的定义为核糖核酸。
如本文所使用的术语“重组DNA”的定义为通过连接来自不同来源的DNA碎片所产生的DNA。
如本文所使用的术语“重组多肽”的定义为通过使用重组DNA方法所产生的多肽。
“药物可用的”表示(例如)与制剂的其它成分相容且一般对于向其受体的施用安全的载体、稀释剂或赋形剂。如本文所使用的，“载体”包括当与缀合物混合时，保留了缀合物的活性且与受试者的免疫系统无反应性的任何材料。实例包括(但不限于)任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水乳液和多种类型的润湿剂。其它载体还可以包括无菌溶液、片剂(包括糖衣片剂)和胶囊剂。通常，这些载体含有赋形剂，如淀粉、牛奶、糖、特定类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体还可以包括调味剂和着色剂或其它成分。通过熟知的常规方法配制包含这些载体的组合物。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中是可互换使用的并且表示具有补体系统的任何动物，优选地哺乳动物，并且最优选地人，其包括需要用于病况或其后遗症的疗法或对病况或其后遗症易感的人。因此，个体可以包括(例如)狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠、猴和小鼠以及人。
在两条或更多条核酸或多肽序列的背景中，如本文所使用的“同一的”或“同一性”表示在指定区域，序列具有相同的指定百分比的残基。可以通过两条序列的最佳比对，在指定区域比较两条序列，确定在两条序列中存在的相同残基的位置数目以获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以指定区域中位置的总数并将结果乘以100以获得序列同一性百分比来计算百分比。在其中两条序列具有不同长度或者比对产生了一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基包含在计算的分母中，而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以认为是等价的。可以手动或通过使用计算机序列算法，如BLAST或BLAST 2.0获得同一性。
短语“百分比(％)同一性”或“百分比同一的”是指在两种或更多种氨基酸序列的比较中发现的序列相似性百分比。可以使用任何适合的软件，电子地确定百分比同一性。同样地，通过将一条多肽的氨基酸序列与第二条多肽的氨基酸序列相比较，确定了两条多肽(或者它们中的任一条或两条的一个或多个部分)之间的“相似性”。用于这些比较的任何适合的算法可以适合于本发明上下文中的应用。
“治疗性治疗”是出于减轻或消除那些病征的目的，施用于显示出病变的病征的受试者的治疗。
“治疗有效量”是当施用于患者时，改善疾病症状的本发明的化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明的化合物的量将基于化合物、疾病状态及其严重程度、要治疗的患者年龄等而改变。通常可以通过本领域的技术人员考虑其自身的知识以及考虑本发明的公开内容来确定治疗有效量。
术语“治疗(treat、treating、treatment)”表示本文所述的治疗或预防措施。“治疗”方法使用向需要这种治疗的受试者施用本发明的组合物，例如，患有疾病或病症的受试者或者最终可能患这种疾病或病症的受试者，以预防、治愈、延缓病症或复发病症、降低其严重程度或者改善其一种或多种症状，或者以延长在不存在这种治疗的情况下预期的存活以外的受试者的存活。
作为在本文中使用的术语，“变体”是分别与参考核酸序列或肽序列在序列方面不同的核酸序列或肽序列，但是它们保留了参考分子的基本生物性质。核酸变体的序列变化可以不改变通过参考核酸所编码的肽的氨基酸序列，或者可以导致氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短。肽变体的序列变化通常是有限的或保守的，从而所述参考肽和所述变体的序列在整体上是非常类似的，并且在多个区域是相同的。变体和参考肽可以在氨基酸序列方面以任意组合相差一个或多个替换、添加、缺失。核酸或肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者可以是已知不是天然存在的变体。可以通过突变技术或者通过直接合成制备核酸和肽的非天然存在的变体。
范围：在整个发明公开中，本发明的多个方面可以以范围格式存在。应理解以范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应将其视为对本发明范围的刻板限制。因此，对范围的描述应认为具有具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，对范围，如1至6的描述应认为具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这是适用的，而无需考虑范围的宽度。
描述
本发明涉及使用特异性结合肾酶的试剂对肾酶的结合和抑制。在多个实施方式中，本发明涉及通过向对其有需要的受试者施用肾酶抑制剂来治疗个体中肾酶-相关疾病或病症的组合物和方法。在一些实施方式中，所述肾酶抑制剂是肾酶结合分子。在一些实施方式中，所述肾酶结合分子是抗体。在多个实施方式中，使用本发明所述的组合物和方法可诊断、可预防和可治疗的疾病和病症包括急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、肾脏的炎症性病症和癌症。
在一个实施方式中，本发明广泛地涉及癌症的治疗、预防和诊断。在一个实施方式中，本发明涉及用于癌症的诊断、分级、治疗、抑制、预防或减轻的方法和组合物。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节肾酶水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。在癌症和相关疾病和病症的背景中，本发明提供了用于降低肾酶水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。本发明的一些方面提供了用于癌症转移的治疗、预防、诊断或预后的方法和组合物。
肾酶抑制剂组合物和使用方法
在多个实施方式中，本发明包括治疗或预防其中期望降低肾酶的水平或活性的疾病或病症的肾酶抑制剂组合物和方法。可以使用本发明所述的组合物和方法治疗或预防的其中期望降低肾酶的水平或活性的疾病或病症的一个非限制性实例包括癌症。在多个实施方式中，本发明所述的肾酶抑制剂组合物和治疗或预防方法降低了活性肾酶多肽的量、活性肾酶肽片段的量、肾酶酶活力的量、肾酶底物结合活性的量、肾酶受体结合活性的量或它们的组合。
本领域技术人员将理解基于本文所提供的公开内容，活性肾酶水平的降低涵盖了肾酶表达，包括转录、翻译或两者的降低并且还涵盖了促进肾酶的降解，包括在RNA水平(例如，RNAi、shRNA等)和在蛋白水平(例如，泛素化等)。技术人员还将理解一旦通过本发明的教导内容所指导，活性肾酶水平的降低包括肾酶活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的降低。因此，肾酶的水平或活性的降低包括(但不限于)编码肾酶的核酸的转录、翻译或两者的降低；并且它还包括肾酶多肽或其肽片段的任何活性的降低。本发明所述的肾酶抑制剂组合物和方法可以选择性抑制肾酶，或者可以抑制肾酶和另一种分子两者。
可以使用多种方法评价肾酶的抑制，包括本文所公开的那些以及本领域中已知的或未来将开发的方法。也就是说，实践人员将理解基于本文所提供的公开内容，可以使用评价存在于生物样品中的编码肾酶的核酸(例如，mRNA)的水平，肾酶多肽或其肽片段的水平，肾酶活性水平(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)或其组合的方法来容易地评价肾酶水平或活性的降低。
基于本文所提供的公开内容，本领域技术人员将理解本发明在对其有需要的受试者中的治疗或预防中是有用的，无论所述受试者是否还使用其它药物治疗或疗法进行治疗。此外，技术人员还将理解基于本文所提供的教导内容，通过本文所述的组合物和方法可治疗的疾病或病症涵盖了其中肾酶起作用并且其中肾酶水平或活性降低将促进积极治疗结局的任何疾病或病症。在多个实施方式中，使用本发明所述的化合物和方法可治疗或可预防的疾病或病症包括急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病或病症(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状左心室功能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律紊乱、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或病症、肾脏疾病或病症、胃肠疾病或病症、肝脏疾病或病症、肺疾病或病症、胰脏疾病或病症(例如，胰腺炎)、精神疾病或病症(例如，抑郁症、焦虑等)或者神经系统疾病或病症。
在另一个实施方式中，本发明所述的肾酶抑制剂可以施用于正在用外源肾酶、重组肾酶、肾酶片段和/或肾酶激活剂治疗的患者以控制、滴定、降低或稳定患者中内源和/或外源肾酶的水平或活性。
本发明所述的降低肾酶或肾酶片段的水平或活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的肾酶抑制剂组合物和方法包括，但不应视为受限于化合物、蛋白、肽、拟肽、抗体、抗体片段、抗体模拟物、核糖酶、小分子化合物、短发夹RNA、RNAi、反义核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白的核酸序列、肾酶受体、肾酶受体片段或其组合。在一些实施方式中，所述抑制剂是变构抑制剂。本领域技术人员将容易地理解基于本文所提供的发明公开，肾酶抑制剂组合物涵盖了降低肾酶或其片段的水平或活性的任何化合物。另外，肾酶抑制剂组合物涵盖了化学修饰的化合物和衍生物，如化学领域中的技术人员所熟知的。
本发明所述的降低肾酶或肾酶片段的水平或活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的肾酶抑制剂组合物和方法包括抗体及其片段。本发明所述的抗体包括多种形式的抗体，其包括(例如)多克隆抗体、单克隆抗体、胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)2、单链抗体(scFv)、重链抗体(如骆驼科动物抗体)、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体。在一个实施方式中，本发明所述的抗体是特异性结合至肾酶的抗体。在一些实施方式中，本发明所述的抗体是双重特异性抗体，其中第一特异性是对肾酶，第二特异性是对细胞或组织上的靶标分子以将所述双重特异性抗体导向至其中存在靶标分子并且其中期望肾酶结合的解剖学位置。在一些实施方式中，本发明所述的抗体是双重特异性抗体，其中第一特异性是对肾酶，第二特异性是对通过所述抗体第二特异性所携带且被布置到期望肾酶结合的解剖学位置的第二结合伴侣分子(即有效载荷(payload))。
在一些实施方式中，本发明所述的用于癌症治疗的肾酶抑制剂(例如，肾酶结合分子)向受试者的施用用于引起和/或补充通过受试者免疫系统对癌症的免疫应答。受试者对癌症的免疫应答可以是任何宿主防御或应答，其包括先天性免疫应答、体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或它们的组合。
此外，当配备了本发明的公开内容和本文中举例说明的方法时，本领域技术人员将理解肾酶抑制剂组合物包括将来将发现的，通过药学领域中的熟知标准(如本文中详细描述的和/或如本领域中已知的肾酶抑制的生理学结果)可以鉴别的这些抑制剂。因此，本发明不以任何方式受限于如本文所举例说明或公开的任何具体的肾酶抑制剂组合物；而是，本发明涵盖了如在本领域中已知的并且如将来将发现的，实践人员将理解为有用的那些抑制剂组合物。
鉴别和产生肾酶抑制剂组合物的其它方法对于本领域那些技术人员是熟知的，其包括(但不限于)从天然存在的来源(例如，链霉菌属(Streptomyces sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、Stylotella aurantium等)获得抑制剂。作为另外一种选择，可以化学合成肾酶抑制剂。此外，实践人员将理解基于本文所提供的教导内容，肾酶抑制剂组合物可以得自重组生物。用于化学合成肾酶抑制剂和用于从天然来源获得它们的组合物和方法在本领域中是熟知的并且在本领域中已有描述。
本领域技术人员将理解可以作为化合物、蛋白、肽、拟肽、抗体、抗体片段、抗体模拟物、核糖酶、小分子化合物、短发夹RNA、RNAi、反义核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白的核酸序列、肾酶受体、肾酶受体片段或其组合来施用抑制剂。对于向细胞或组织施用蛋白或编码蛋白的核酸构建体，多种载体及其它组合物和方法是熟知的。因此，本发明包括施用作为肾酶抑制剂的蛋白或编码蛋白的核酸的方法。(Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York；Ausubel等人,1997,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York)。
本领域技术人员将认识到降低本身将提高肾酶的水平或活性的分子的量或活性可以在本发明所述的组合物和方法中用于降低肾酶的水平或活性。
反义寡核苷酸是与RNA分子的一些部分互补的DNA或RNA分子。当存在于细胞中时，反义寡核苷酸杂交至已有的RNA分子并抑制向基因产物的翻译。使用反义寡核苷酸抑制基因表达在本领域中是熟知的(Marcus-Sekura,1988,Anal.Biochem.172:289)，如在细胞中表达反义寡核苷酸的方法(Inoue，美国专利No.5,190,931)。本发明所述的方法包括使用反义寡核苷酸来降低肾酶的量或者降低导致肾酶的量或活性升高的分子的量，借此降低肾酶的量或活性。
在本发明中考虑了通过本领域那些技术人员熟知的方法合成并向细胞提高的反义寡核苷酸。举例来说，可以将反义寡核苷酸合成至约10至约100个长，更优选地约15至约50个核苷酸长。核酸分子的合成在本领域中是熟知的，修饰的反义寡核苷酸的合成也是熟知的，从而与未修饰的反义寡核苷酸相比，改善了生物活性(Tullis,1991,美国专利.No.5,023,243)。
类似地，可以通过反义分子与启动子或其它基因调控元件的杂交来抑制基因的表达，借此影响基因转录。用于与所关心的基因相互作用的启动子或其它调控元件的鉴别的方法在本领域中是熟知的并且包括如酵母双杂交系统的这些方法(Bartel and Fields主编,In:The Yeast Two Hybrid System,Oxford University Press,Cary,N.C.)。
作为另外一种选择，可以通过使用核糖酶来实现表达肾酶的基因或者表达提高肾酶的水平或活性的蛋白的基因的抑制。核糖酶用于抑制基因表达的使用对于本领域技术人员是熟知的(参见，例如，Cech等人,1992,J.Biol.Chem.267:17479；Hampel等人,1989,Biochemistry 28:4929；Altman等人,美国专利No.5,168,053)。核糖酶是具有切割其它单链RNA分子的能力的催化RNA分子。核糖酶已知是序列特异性的，并因此可以修饰以识别特异性核苷酸序列(Cech,1988,J.Amer.Med.Assn.260:3030)，从而使得能够选择性切割特异性mRNA分子。考虑到所述分子的核苷酸序列，通过本文中的公开内容和所引入的参考文献，本领域的技术人员可以合成反义寡核苷酸或核糖酶而无需过度实验。
作为另外一种选择，可以通过使用短发夹RNA或反义RNA，包括siRNA、miRNA和RNAi来实现表达肾酶的基因或者表达提高肾酶的水平或活性的蛋白的基因的抑制。考虑到所述分子的核苷酸序列，通过本文中的公开内容和所引入的参考文献，本领域的技术人员可以合成这种短发夹RNA或反义RNA而无需过度实验。
本领域技术人员将理解可以快速(例如，短期内，如1天、1周或1个月)或长期(例如，长期内，如数月或一年或以上)施用肾酶或肾酶片段的抑制剂。本领域技术人员将理解可以单独或以与其它试剂的任意组合施用肾酶抑制剂。此外，可以在时间意义上单独或以任意组合施用肾酶抑制剂，其中它们可以同时，或者在彼此之前和/或之后施用。本领域的技术人员将理解基于本文所提供的发明公开，肾酶抑制剂组合物可以用于治疗或预防对其有需要的受试者中的疾病或病症，并且可以单独或与另一种抑制剂以任意组合使用抑制剂组合物以实现治疗结果。
在多个实施方式中，本文所述的本发明的任何肾酶或肾酶片段的抑制剂可以单独或与和癌症有关的其它分子的其它抑制剂组合施用。
当通过本发明公开，包括本文详述的方法所提供时，本领域技术人员将理解本发明不局限于已建立的疾病或病症，如癌症的治疗。具体地，所述疾病或病症不需要已表现出损害受试者的程度；的确，不需要在施用治疗之前在受试者中检测所述疾病或病症。也就是说，不必需在本发明可以提供益处之前发生明显的疾病或病症。因此，本发明包括用于预防受试者中的疾病或病症的方法，其中如先前在本文其它处所讨论的，可以在疾病或病症发病之前向受试者施用肾酶抑制剂组合物，借此预防所述疾病或病症的发生。本文所述的预防性方法还包括治疗处于症状缓解中的受试者以用于预防疾病或病症的复发。
当通过本文中的公开内容所提供时，本领域技术人员将理解疾病或病症的预防涵盖了作为针对所述疾病或病症，包括癌症的预防措施向受试者施用肾酶抑制剂组合物。如在本文其它处更全面地讨论的，降低肾酶的水平或活性的方法涵盖了广泛的技术，其不仅用于降低肾酶活性，而且还用于降低编码肾酶的核酸的表达，包括转录的降低、翻译的降低或两者。
另外，如本文在其它处所公开的，本领域技术人员将理解一旦通过本文所提供的教导内容所提供，本发明涵盖了预防多种疾病、病症和病变的方法，其中肾酶的表达和/或活性的降低介导、治疗或预防了所述疾病、病症和病变。用于评价疾病是否与肾酶的水平或活性有关的方法在本领域中是已知的。此外，本发明涵盖了将来将发现的这些疾病的治疗或预防。
本发明涵盖了肾酶抑制剂的施用以实践本发明所述的方法；基于本文所提供的发明公开，技术人员将理解如何配制适当的肾酶抑制剂和如何向受试者施用。然而，本发明不局限于任何具体的施用方法或治疗方案。
本发明提供了结合至肾酶的组合物。在一个实施方式中，所述肾酶结合剂抑制肾酶的水平或活性。因此，在其中肾酶活性降低将有益的疾病和病况中，这些抑制性肾酶结合剂可以潜在地起到治疗剂的作用。
在一些情况下，除其潜在的治疗作用之外，肾酶可以用作疾病或病症的诊断标志物，所述疾病或病症包括(但不限于)急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN，肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、肾脏的炎症性病症和癌症。不具有正常作用的肾脏的患者具有较低的肾酶水平。因此，本发明还包括基于使用本发明所述的肾酶结合剂的肾酶的检测和/或定量，诊断对心血管、心脏、肾脏、胃肠、肝脏、肺、胰脏以及精神和神经学相关病况、病症和疾病，包括癌症的敏感性的方法。例如，可以通过确定肾酶水平，如肾酶蛋白水平来诊断、评价和监测心血管病况、病症和疾病，如高血压、无症状左心室功能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律紊乱和动脉粥样硬化；精神病况、病症和疾病，如抑郁症和焦虑；和心脏病况、病症和疾病，如肺动脉高血压。例如，肾酶蛋白水平的降低将是与交感神经输出(sympathetic output)增加有关的病症的诊断标志物。本发明所述的组合物和方法可以用于治疗、预防、降低或改善高血压，包括收缩期高血压、单纯收缩期高血压和糖尿病高血压。此外，预期对于更罕见的高血压病症、肺动脉高血压以及胰腺炎具有相同益处。肺动脉高血压是罕见的肺部血管病症，其中肺动脉(从心脏引向肺部的血管)中的压力升高至正常水平以上并且可能变的危急生命。肺床中血压升高的发展与糖尿病高血压和单纯收缩期高血压中体循环血压的升高的相似性表明涉及类似的机制。
本发明所述的降低肾酶的水平或活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的肾酶抑制剂组合物包括，但不应视为受限于化合物、蛋白、肽、拟肽、抗体、抗体片段、抗体模拟物、核糖酶、小分子化合物、短发夹RNA、RNAi、反义核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白的核酸序列、肾酶受体、肾酶受体片段或其组合。在一些实施方式中，所述抑制剂是变构抑制剂。本领域技术人员将容易地理解基于本文所提供的发明公开，肾酶抑制剂组合物涵盖了降低肾酶水平或活性的化合物。另外，肾酶抑制剂组合物涵盖了化学修饰的化合物和衍生物，如化学领域中的技术人员所熟知的。
本发明所述的降低肾酶的水平或活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的肾酶抑制剂组合物包括抗体及其片段。本发明所述的抗体包括多种形式的抗体，其包括(例如)多克隆抗体、单克隆抗体、胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)2、单链抗体(scFv)、重链抗体(如骆驼科动物抗体)、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体。在一个实施方式中，本发明所述的抗体是特异性结合至肾酶的抗体。在一些实施方式中，本发明所述的抗体是双重特异性抗体，其中第一特异性是对肾酶，第二特异性是对将所述双重特异性抗体导向至其中期望肾酶结合的解剖学位置的靶标分子。在一些实施方式中，本发明所述的抗体是双重特异性抗体，其中第一特异性是对肾酶，第二特异性是对携带并布置在其中期望肾酶结合的解剖学位置的第二结合伴侣分子。
在某些实施方式中，本发明所述的抗体，包括其肾酶结合片段包括通过任何适合的多核苷酸所编码的本文所公开的抗体氨基酸序列，或者任何分离或配制的抗体。此外，本发明公开的抗体包含了具有本文所述的抗-肾酶抗体的结构和/或功能特征的抗体。在一个实施方式中，抗-肾酶抗体结合肾酶并借此部分或基本改变肾酶的至少一种生物活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)。在一些实施方式中，所述肾酶是人肾酶。
在一个实施方式中，本发明的抗-肾酶抗体免疫特异性结合对肾酶蛋白、肽、亚基、片段、部分或它们的任意组合特异的至少一种指明的表位，并且不特异性结合至除了来源于其它物种的肾酶以外的其它多肽。所述至少一种表位可以包含含有肾酶蛋白的至少一部分的至少一种抗体结合区。如本文所使用的术语“表位”是指能够结合至抗体的蛋白决定簇。表位通常由化学活性表面分子集团(surface groupings of molecules)，如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特异的立体结构特征以及特异的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合会丧失，而后者不会。
在一些实施方式中，本发明包括含有特异性结合至肾酶的抗体(例如，抗体结合部分)的组合物。在一个实施方式中，抗-肾酶抗体是多克隆抗体。在另一个实施方式中，抗-肾酶抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗-肾酶抗体是嵌合抗体。在其它实施方式中，抗-肾酶抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，所述肾酶是人肾酶。在一些实施方式中，本发明所述的抗体特异性结合至SEQ ID NO:1-7、8、50、92、94中的至少一种及其片段。
抗体的结合部分包含保留了特异性结合至结合伴侣分子(例如，肾酶)的能力的抗体的一个或多个片段。已显示可以通过全长抗体片段来发挥抗体的结合功能。术语抗体的“结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域所组成的一价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管通过单独的基因编码Fv片段的两个域VL和VH，但是可以使用重组方法，通过能够将它们制备为其中VL和VH区配对以形成一价分子的单一蛋白链的合成接头将它们连接(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规方法获得这些抗体片段，并且对于以与完整抗体相同的方式的用途筛选所述片段。可以通过重组DNA技术或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生结合部分。
结合至本发明的肾酶的抗体是体外、原位和/或体内抑制、阻断或干扰至少一种肾酶活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的抗体。适合的抗-肾酶抗体，所指明的部分或变体还可以任选地影响至少一种肾酶活性或功能，如(但不限于)RNA、DNA或蛋白质合成、蛋白释放、肾酶信号转导、肾酶切割、肾酶活性、肾酶受体结合、肾酶产生和/或合成。
在一个实施方式中，本发明的抗体结合肾酶。在一个实施方式中，所述抗体特异性结合至肾酶-1。在另一个实施方式中，所述抗体特异性结合至肾酶-2。在另一个实施方式中，所述抗体特异性结合至肾酶-1和肾酶-2两者。另外，已产生了表位特异性抗体。本发明优选的抗体包括单克隆抗体1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2。双重特异性抗体，例如，识别肾酶-1和肾酶-2的抗体的实例包括抗体1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10和如本文所述的多克隆抗体。肾酶-型特异性抗体的实例包括1F-26-1、1F-42-7，其对肾酶-1特异。3A-5-2对肾酶-2特异。本发明的抗体片段包括人源化重链和轻链Fv区，如SEQ IDNO:219、221、223和225所示。在本发明的多个实施方式中，抗-肾酶抗体或抗体片段包含人源化重链和轻链Fv区，如SEQ ID NO:219、221、223和225所示，或其片段或部分。图4至图13和实施例2中显示了编码抗-肾酶单克隆抗体的序列。
单克隆抗体1D-28-4的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:52)和氨基酸序列(SEQID NO:9)见于图4。单克隆抗体1D-28-4的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:53)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)见于图5。
单克隆抗体1D-37-10的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:60)和氨基酸序列(SEQID NO:17)见于图6。单克隆抗体1D-37-10的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:61)和氨基酸序列(SEQ ID NO:18)见于图7。
单克隆抗体1F-26-1的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:68)和氨基酸序列(SEQID NO:25)见于图8。单克隆抗体1F-26-1的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:69)和氨基酸序列(SEQ ID NO:26)见于图9。
单克隆抗体1F-42-7的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:76)和氨基酸序列(SEQID NO:33)见于图10。单克隆抗体1F-42-7的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:77)和氨基酸序列(SEQ ID NO:34)见于图11。
单克隆抗体3A-5-2的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:84)和氨基酸序列(SEQ IDNO:41)见于图12。单克隆抗体3A-5-2的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:85)和氨基酸序列(SEQ ID NO:42)见于图13。
考虑到某些单克隆抗体可以结合至肾酶蛋白，则可以将VH和VL序列“混合和匹配”以产生本发明公开的其它抗-肾酶结合分子。可以使用以上和实施例中所述的结合测定(例如，免疫印迹法、Bia-Core等)测试这些“混合和匹配”抗体的肾酶结合。优选地，当将VH和VL链混合和匹配时，用结构类似的VH序列替换来自特定VH/VL配对的VH序列。同样地，优选地，用结构类似的VL序列替代来自特定VH/VL配对的VL序列。
因此，在一些实施方式中，本发明是抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含编码新型重链可变序列的至少一种多肽序列。在其它实施方式中，本发明是抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含编码新型轻链可变序列的至少一种多肽序列。
在一个实施方式中，第一VH互补决定区(HC CDR1)包含如SEQ ID NO:155的氨基酸序列；第二VH互补决定区(HC CDR2)包含选自：SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:162和SEQ IDNO:168的氨基酸序列；第三VH互补决定区(HC CDR3)包含选自：SEQ ID NO:157和SEQ IDNO:163的氨基酸序列；第一VL互补决定区(LC CDR1)包含如SEQ ID NO:152的氨基酸序列；第二VL互补决定区(LC CDR2)包含如SEQ ID NO:153的氨基酸序列；第三VL互补决定区(LCCDR3)包含选自：SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:160的氨基酸序列。在一个实施方式中，HCCDR1包含SEQ ID NO:155；HC CDR2包含SEQ ID NO:156；HC CDR3包含SEQ ID NO:157；LCCDR1包含SEQ ID NO:152；LC CDR2包含SEQ ID NO:153；LC CDR3包含SEQ ID NO:154。在一个实施方式中，VH包含SEQ ID NO:219；VL包含SEQ ID NO:221。在一个实施方式中，通过接头连接两个多肽以形成单链可变区片段(scFv)，其中所述多肽相对于所述接头的布置选自：VH-接头-VL和VL-接头-VH。
在一个实施方式中，第一VH互补决定区(HC CDR1)包含选自以下组：SEQ ID NO:197和SEQ ID NO:203的氨基酸序列；第二VH互补决定区(HC CDR2)包含选自：SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:204的氨基酸序列；第三VH互补决定区(HC CDR2)包含选自：SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:205的氨基酸序列；第一VL互补决定区(LC CDR1)包含选自：SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:200的氨基酸序列；第二VL互补决定区(LC CDR2)包含如SEQ ID NO:195的氨基酸序列；第三VL互补决定区(LC CDR3)包含如SEQ ID NO:196的氨基酸序列。在一个实施方式中，HC CDR1包含SEQ ID NO:197；其中HC CDR2包含SEQ ID NO:198；其中HC CDR3包含SEQ ID NO:199；其中LC CDR1包含SEQ ID NO:194；其中LC CDR2包含SEQ ID NO:195；其中LC CDR3包含SEQ ID NO:196。在一个实施方式中，VH包含SEQ ID NO:223；VL包含SEQ IDNO:225。在一个实施方式中，通过接头连接两个多肽以形成单链可变区片段(scFv)，其中所述多肽相对于所述接头的布置选自：VH-接头-VL和VL-接头-VH。
在多个实施方式中，新型重链可变序列还包含至少一种其它多肽序列。在多个实施方式中，新型轻链可变序列还包含至少一种其它多肽序列。在一个实施方式中，VH多肽还包含重链CH1域；VL多肽还包含轻链CL域。在一个实施方式中，VH多肽还包含重链CH1域、重链CH2域和重链CH3域以形成抗体重链；VL多肽还包含轻链CL域以形成抗体轻链。在一个实施方式中，将抗体重链和抗体轻链连接以形成半抗体。在一个实施方式中，将半抗体连接至另一个半抗体以形成抗体。在多个实施方式中，使用二硫键实现了形成半抗体的重链与轻链的连接和两个半抗体的连接。在其它实施方式中，使用非二硫键的键或连接实现了形成半抗体的重链与轻链的连接和两个半抗体的连接。
在另一个方面，本发明公开提供了分离的单克隆抗体或其结合部分，其包含(a)重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:9、17、25、33和41的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:10、18、26、34和42的氨基酸序列，其中所述抗体特异性结合肾酶蛋白。
优选的重链和轻链组合包括：(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区；或者(b)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；或者(c)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区；或者(d)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变区；或者(e)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明公开提供了包含1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7或3A-5-2的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的VH CDR1的氨基酸序列分别引入了SEQ ID NO:11、19、27、35和43所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的VH CDR2的氨基酸序列分别引入了SEQID NO:12、20、28、36和44所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的VHCDR3的氨基酸序列分别引入了SEQ ID NO:13、21、29、37和45所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的VK CDR1的氨基酸序列分别引入了SEQ ID NO:14、22、30、38和46所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的VK CDR2的氨基酸序列分别引入了SEQ ID NO:15、23、31、39和47所示的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的VK CDR3的氨基酸序列分别引入了SEQ ID NO:16、24、32、40和48所示的序列。使用Kabat系统显示CDR区(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)。
考虑到这些抗体中的每一个可以结合至肾酶家组成员并且主要通过CDRl、CDR2和CDR3区提供结合特异性，因此VH CDRl、CDR2和CDR3序列和VL CDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合和匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合和匹配，尽管每个抗体必须含有VH CDRl、CDR2和CDR3和VL CDRl、CDR2和CDR3)以产生本发明公开的其它抗-肾酶结合分子。可以使用以上和实施例中所述的结合测定(例如，免疫印迹法、分析等)测试这些“混合和匹配”抗体的肾酶结合。优选地，当将VH CDR序列混合和匹配时，用结构类似的CDR序列替换来自特定VH序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序列。同样地，当将VL CDR序列混合和匹配时，优选地用结构类似的CDR序列替换来自特定VL序列的CDRl、CDR2和/或CDR3序列。对于技术人员将容易地显而易见的，对于单克隆抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7或者3A-5-2，可以通过用来自本文所公开的CDR序列的结构类似的序列替换一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新型VH和VL序列。
因此，在另一个方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其结合部分，其包含选自下列中的至少一种：(a)包含选自SEQ ID NO:11、19、27、35和43的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:12、20、28、36和44的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:13、21、29、37和45的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含选自SEQ IDNO:14、22、30、38和46的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:15、23、31、39和47的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含选自SEQ ID NO:16、24、32、40和48的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中所述抗体特异性结合肾酶。
在另一个实施方式中，所述抗体包含选自下列的CDR中的至少一种：(a)包含SEQID NO:11的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:12的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ IDNO:13的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，所述抗体包含选自下列的CDR中的至少一种：(a)包含SEQID NO:19的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ IDNO:21的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:22的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:23的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，所述抗体包含选自下列的CDR中的至少一种：(a)包含SEQID NO:27的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:28的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ IDNO:29的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:31的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:32的轻链可变区CDR3。
在另一个其它实施方式中，所述抗体包含选自下列的CDR中的至少一种：(a)包含SEQ ID NO:35的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:36的重链可变区CDR2；(c)包含SEQID NO:37的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:38的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ IDNO:39的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，所述抗体包含选自下列的CDR中的至少一种：(a)包含SEQID NO:43的重链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:44的重链可变区CDR2；(c)包含SEQ IDNO:45的重链可变区CDR3；(d)包含SEQ ID NO:46的轻链可变区CDR1；(e)包含SEQ ID NO:47的轻链可变区CDR2；和(f)包含SEQ ID NO:48的轻链可变区CDR3。
以上分离的抗-肾酶抗体CDR序列建立了根据本发明分离的并且包括包含所列CDR序列的多肽的新型肾酶结合蛋白家族。为了产生和选择具有肾酶结合和/或肾酶检测和/或肾酶中和活性的本发明的CDR，可以使用用于产生本发明的结合蛋白和评价那些结合蛋白的肾酶和/或肾酶结合和/或检测和/或中和特征的本领域中已知的标准方法，其包括(但不限于)本文具体所述的那些。
优选地，本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)显示出在盐、化合物及其它多肽的复杂混合物中检测和结合肾酶的强大能力，例如，如通过本领域中已知的几种体外和体内测定中的任一种所评价的。技术人员将理解如在疾病的诊断和治疗和预防方法中有用的，本文所述的肾酶结合分子(例如，抗体等)还在本发明的程序和方法中有用，其包括(但不限于)免疫色谱测定、免疫斑点测定、Luminex测定、ELISA测定、ELISPOT测定、蛋白微阵列测定、免疫印迹测定、质谱测定、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散测定、液相色谱-串联质谱测定、ouchterlony免疫扩散测定、反相蛋白微阵列、火箭免疫电泳测定、免疫组织化学染色测定、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS、蛋白芯片测定、分离和纯化方法以及亲和色谱(还参见，2007,Van Emon,Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques,CRCPress；2005,Wild,Immunoassay Handbook,Gulf Professional Publishing；1996,Diamandis and Christopoulos,Immunoassay,Academic Press；2005,Joos,Microarraysin Clinical Diagnosis,Humana Press；2005,Hamdan and Righetti,Proteomics Today,John Wiley and Sons；2007)。
更优选地，本发明所述的肾酶结合分子(例如，抗体等)显示出降低或中和肾酶活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的强大能力，如通过本领域中已知的几种体外和体内测定中的任一种所评价的。例如，这些肾酶结合分子(例如，抗体等)中和肾酶-相关或肾酶-介导的疾病或病症。优选地，本发明所述的肾酶结合分子(例如，抗体等)还显示出降低或中和肾酶活性的强大能力。在一些实施方式中，所述肾酶是人肾酶。
如本文所使用的，“特异性结合至肾酶蛋白”的肾酶结合分子(例如，抗体等)旨在表示结合至任何动物的肾酶蛋白的肾酶结合分子(例如，抗体等)。在一些实施方式中，该抗体结合至人肾酶。优选地，所述肾酶结合分子(例如，抗体等)以1×10-6M或以下，更优选地1×10-7M或以下，更优选地1×10-8M或以下，更优选地5×10-9M或以下，更优选地1×10-9M或以下或者甚至更优选地3×10-10M或以下的KD结合至肾酶蛋白。如本文所使用的术语“基本不结合”至蛋白或细胞表示不结合或不以高亲和力结合至蛋白或细胞，即以大于1×106M或以上，更优选地1×105M或以上，更优选地1×104M或以上，更优选地1×103M或以上，更优选地1×102M或以上的KD结合至蛋白或细胞。如本文所使用的术语“KD”旨在表示解离常数，其得自Kd与Ka的比(即Kd/Ka)并且可以表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域中良好建立的方法确定肾酶结合分子(例如，抗体等)的KD值。用于确定结合分子(例如，抗体等)的KD的优选方法为通过使用表面等离子共振，优选地使用生物传感器系统，如系统。
如本文所使用的，术语对于IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶标结合伴侣分子具有1×l0-7M或以下，更优选地5×l0-8M或以下，更优选地1×l0-8M或以下，更优选地5×l0-9M或以下并且甚至更优选地1×l0-9M或以下的KD。然而，对于其它抗体同种型，“高亲和力”结合可以是不同的。例如，对于IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有10-6M或以下，更优选地10-7M或以下，更优选地10-8M或以下的抗体。
在某些实施方式中，抗体包括重链恒定区，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，所述重链恒定区是IgG1重链恒定区或者IgG4重链恒定区。此外，所述抗体可以包括轻链恒定区，即κ轻链恒定区或者λ轻链恒定区中的任一种。优选地，所述抗体包括κ轻链恒定区。作为另外一种选择，所述抗体部分可以是(例如)Fab片段或单链Fv片段。
抗-肾酶抗体的产生
本发明提供了结合至肾酶的组合物。本文所公开的肾酶分子是包括与本文所公开的其它多肽具有高和/或显著序列同一性的那些的一类分子。更具体地，推定的肾酶将与具有SEQ ID NO:49或51所示的序列的核酸共有至少约40％的序列同一性。更优选地，编码肾酶的核酸与本文所公开的SEQ ID NO:49或51具有至少约45％的同一性，或者至少约50％的同一性，或者至少约55％的同一性，或者至少约60％的同一性，或者至少约65％的同一性，或者至少约70％的同一性，或者至少约75％的同一性，或者至少约80％的同一性，或者至少约85％的同一性，或者至少约90％的同一性，或者至少约95％的同一性，或者至少约98％，或者至少约99％的序列同一性。更优选地，所述核酸是SEQ ID NO:49或51或93或95。术语“肾酶”还包括肾酶同工型。肾酶基因含有覆盖人基因组的染色体10中的310188bp的9个外显子。本文所公开的肾酶克隆(SEQ ID NO:49，GenBank登录号：BC005364)是含有外显子1、2、3、4、5、6、8的基因。存在至少两种其它肾酶蛋白的可变剪接形式，如人基因组数据库中所示。一种可变剪接形式含有外显子1、2、3、4、5、6、9，其在人基因组数据库中通过作为GenBank登录号AK002080和NMJ18363的克隆鉴别，其序列明确地作为参考并入本文。另一种可变剪接形式含有外显子5、6、7、8，其在人基因组数据库中通过作为GenBank登录号BX648154的克隆鉴别，其序列明确地作为参考并入本文。除非另外说明，否则“肾酶”涵盖了所有已知的肾酶(例如，大鼠肾酶和人肾酶)以及具有本文所公开的肾酶的特征和/或物理性质的待发现的肾酶，其包括(但不限于)人肾酶和黑猩猩肾酶。
另外，推定的肾酶与具有序列SEQ ID NO:8或50的多肽共有至少约60％的序列同一性。更优选地，肾酶与本文所公开的SEQ ID NO:8或50具有至少约45％的同一性，或者至少约50％的同一性，或者至少约55％的同一性，或者至少约60％的同一性，或者至少约65％的同一性，或者至少约70％的同一性，或者至少约75％的同一性，或者至少约80％的同一性，或者至少约85％的同一性，或者至少约90％的同一性，或者至少约95％的同一性，或者至少约98％，或者至少约99％的序列同一性。更优选地，所述肾酶多肽具有SEQ ID NO:8或50或92或94的氨基酸序列。
在一个实施方式中，可以通过使用来源于肾酶序列的肽产生本发明的抗体以使动物免疫，借此动物产生了抗所述免疫原的抗体。示例性的免疫原包括来源于肾酶的肽。也就是说，可以在本发明中使用具有肾酶序列片段的肽。可以通过多种方式产生肽，其包括作为重组肽表达，作为较大的多肽表达并酶促或化学切割。作为另外一种选择，如本领域中已知的，可以合成产生它们。图1中显示了用于产生本发明的亲和力试剂的优选的肽(SEQ IDNO:1-7)。
可以任选地通过多种技术产生本发明所述的抗-肾酶抗体，其包括Kohler andMilstein(1975)Nature 256:495的标准体细胞杂交技术(杂交瘤方法)。在杂交瘤方法中，如本文所述，使小鼠或其它适当的宿主动物，如仓鼠或恒河猴免疫以引起产生或能够产生将特异性结合至用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。作为另外一种选择，可以使淋巴细胞体外免疫。然后，使用适合的融合剂，如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(Academic Press,1986))。
使用杂交瘤技术用于产生和筛选特异性抗体的方法是本领域中常规且熟知的。在一个实施方式中，本发明提供了通过以下方法产生单克隆抗体的方法以及所产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过将分离自通过本发明的多肽或肽免疫的小鼠或兔或其它物种的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后对通过融合所产生的杂交瘤筛选分泌能够结合本发明的多肽的抗体的杂交瘤克隆来产生杂交瘤。简要地，可以用肾酶多肽或其肽使小鼠免疫。在优选的实施方式中，将肾酶多肽或其肽与佐剂一起施用以刺激免疫应答。这些佐剂包括弗氏完全或不完全佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这些佐剂可以通过将其多价螯合在局部沉积物中来保护多肽不会快速分散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对于巨噬细胞以及免疫系统的其它组分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果正在施用多肽，则免疫接种日程将包括维持数周的多肽的两次或更多次施用。
作为另外一种选择，可以用肾酶多肽或其肽使兔免疫。在该实施方式中，全长肾酶蛋白或来源于肾酶的肽中的任一种可以用作免疫原。
在本发明中使用的肾酶可以采取多种形式。例如，它们可以包括纯化的肾酶蛋白或其片段，重组产生的肾酶或其片段。在一些实施方式中，所述肾酶是人肾酶。当使用重组肾酶时，它可以在真核或原核细胞中产生，如本领域中已知的。其它免疫原包括来源于肾酶的肽。也就是说，可以在本发明中使用具有肾酶序列片段的肽。可以通过多种方式产生肽，其包括作为重组肽表达，作为较大的多肽表达并酶促或化学切割。作为另外一种选择，如本领域中已知的，可以合成产生它们。图1中显示了用于产生本发明的亲和力试剂的优选的肽(SEQ ID NO:1-7)。SEQ ID NO:8中显示了人肾酶的全长氨基酸序列，其中如所指示的，已知的多态性是可能的(与SEQ ID NO.92相比)。SEQ ID NO:50显示了肾酶-2的氨基酸序列，再次，其中如所指示的，已知的多态性是可能的(与SEQ ID NO.94相比)。将理解存在其它多态性。这些也包含在肾酶的定义中。在一些实施方式中，本发明所述的肾酶结合分子特异性结合至SEQ ID NOS：1-7、8、50、92、94中的至少一种及其片段。
如本文所述和/或如本领域中已知的，还可以任选地通过能够产生人抗体组库的转基因动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物等)的免疫产生抗-肾酶抗体。可以使用适合的方法，如本文所述的方法从这些动物分离产生人抗-肾酶抗体的细胞并且这些细胞是无限增殖化的。作为另外一种选择，可以通过本文所教导的方法以及本领域中已知的那些方法，将抗体编码序列克隆，引入适合的载体并用于转染宿主细胞以用于所述抗体的表达和分离。
在其胚系构型中具有人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠的使用提供了抗多种靶标，包括正常人免疫系统耐受的人自体抗原的高亲和力完全人单克隆抗体的分离(Lonberg,N.等人,美国专利No.5,569,825、美国专利No.6,300,129和1994,Nature 368:856-9；Green,L.等人,1994,Nature Genet.7:13-21；Green,L.&Jakobovits,1998,Exp.Med.188:483-95；Lonberg,N.and Huszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93；Kucherlapati等人美国专利No.6,713,610；Bruggemann,M.等人,1991,Eur.J.Immunol.21:1323-1326；Fishwild,D.等人,1996,Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez,M.等人,1997,Nat.Genet.15:146-156；Green,L.,1999,J.Immunol.Methods231:11-23；Yang,X.等人,1999,Cancer Res.59:1236-1243；Bruggemann,M.and Taussig,M J.,Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458,1997；Tomizuka等人WO02043478)。可以将这些小鼠中的内源免疫球蛋白基因座破坏并使其缺失以消除动物产生通过内源基因所编码的抗体的能力。另外，可以使用如在本文其它地方所述的技术，向公司，如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(San Jose,Calif.)预定以提供抗所选的靶标结合伴侣分子(例如，抗原等)的人抗体。
在另一个实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体包含人免疫球蛋白基因并且所述文库作为(例如)单链抗体(scFv)，作为Fab或者显示出配对或未配对的抗体可变区的一些其它构建体表达人抗体结合域(Vaughan et lo al.Nature Biotechnology14:309-314(1996):Sheets等人PITAS(USA)95:6157-6162(1998))；Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人J.Mol.Biol.,222:581(1991))。还可以使用噬菌体展示法制备本发明的人单克隆抗体以用于筛选人免疫球蛋白基因文库。在本领域中建立了用于分离人抗体的这些噬菌体展示方法。参见，例如：授权给Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484和5,571,698；授权给Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；授权给McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；和授权给Griffiths等人的美国专利5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
可以使用任何适合的技术，如重组蛋白的产生来实施免疫原性抗原的制备和单克隆抗体的产生。可以以纯化蛋白或者包含完整细胞或细胞或组织提取液的蛋白混合物的形式将免疫原性抗原施用于动物，或者可以在动物身体中从编码所述抗原或其部分的核酸从头形成抗原。
如本领域中熟知的，可以使用(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术或其组合制备本发明分离的核酸。使用本领域中已知的方法(例如，通过使用能够特异性结合至编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，容易地分离了编码所述单克隆抗体的DNA并测序。当产生杂交瘤时，这些细胞可以用作该DNA的来源。作为另外一种选择，使用其中编码序列和翻译产物连接的展示技术，如噬菌体或核糖体展示文库，简化了粘合剂和核酸的选择。在噬菌体选择之后，可以将来自噬菌体的抗体编码区分离并用于产生完整抗体，包括人抗体，或者任何其它所期望的结合片段，并且在任何所期望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。
人源化抗体
本发明还提供了结合人肾酶的人源化免疫球蛋白(或抗体)。免疫球蛋白的人源化形式具有基本来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变框架区和特异性结合肾酶的基本来自非人mAb的CDR。如果存在，则恒定区也基本来自人免疫球蛋白。人源化抗体对肾酶显示出至少约10-6M(1μM)、约10-7M(100nM)或以下的KD。人源化抗体的结合亲和力可以大于或小于它们所来源的小鼠抗体的结合亲和力。为了实现人源化抗体对于肾酶的亲和力的变化，改善亲和力，可以在CDR残基或人残基中进行替换。
用于产生结合至肾酶的人源化抗体的来源优选地为1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7或3A-5-2兔单克隆抗体，在本文所提供的实施例中描述了它们的产生、分离和鉴定，尽管也可以使用与1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7或3A-5-2抗体竞争对肾酶的结合的其它抗体。序列表中所示的所鉴别的CDR可以是人源化过程的起点。例如，以下氨基酸序列(及其相应的核酸序列)中的任何一个或多个可以是人源化过程的起点：(a)包含选自SEQ ID NO:11、19、27、35和43的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(b)包含选自SEQ ID NO:12、20、28、36和44的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(c)包含选自SEQ ID NO:13、21、29、37和45的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(d)包含选自SEQ ID NO:14、22、30、38和46的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(e)包含选自SEQ ID NO:15、23、31、39和47的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(f)包含选自SEQ ID NO:16、24、32、40和48的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
如果人可变域框架采用与CDR来源的亲代可变框架相同或类似的构象，则兔或小鼠CDR向人可变域框架的替换很可能导致保留它们正确的空间取向。这通过从其框架序列对CDR所来源的亲代可变框架域显示出高度序列同一性的人抗体获得人可变域得到实现。重链和轻链可变框架区可以来源于相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然存在的人抗体序列，可以来源于人种系免疫球蛋白序列或者可以是几种人抗体和/或种系序列的共有序列。
通过兔或小鼠可变区的氨基酸序列与已知的人抗体序列的计算机比较，鉴别了适合的人抗体序列。分别对重链和轻链进行比较，但是对于它们，原理是类似的。
在一个实例中，将抗-肾酶mAb的氨基酸序列用于查询从公共抗体序列数据库汇编的人抗体数据库。重链可变区可以用于发现具有最高序列同一性的人可变区。类似地，轻链可变区可以用于发现具有最高序列同一性的人可变区。对于每个亲代可变区，制备了其中将编码来自亲代mAb供体的重链可变区之一的CDR的区域转移至所选的人重链可变序列，从而替换人可变区的CDR的DNA构建体。
亲代CDR区与人可变框架区的非天然的并列可以导致产生非天然的构象限制，除非通过某些氨基酸残基的替换进行修正，否则这将导致结合亲和力的丧失。如以上所提及的，本发明所述的人源化抗体包含基本来自人免疫球蛋白的可变框架区和基本来自亲代(例如，兔或小鼠)免疫球蛋白的CDR。在鉴别了亲代抗体的CDR和适当的人受体免疫球蛋白序列后，下一步将确定应替换那些来自这些组分的残基(如果有)以优化所产生的人源化抗体的性质。通常，应使亲代对人氨基酸残基的替换最小化，因为亲代残基的引入提高了抗体在人中引起免疫应答的风险。基于它们对CDR构象和/或与靶标结合伴侣分子结合的可能影响，选择用于替换的氨基酸。可以通过建模，特定位置的氨基酸特征的检查或者特定氨基酸的替换或突变的影响的经验观察来进行对这些可能影响的研究。就经验方法来说，已发现产生可以对所期望的活性、结合亲和力或特异性进行筛选的变体序列文库是特别方便的。产生这种变体文库的一种形式是噬菌体展示载体。作为另外一种选择，可以使用用于改变编码可变域内的靶向残基的核酸序列的其它方法来产生变体。
可以使用计算机建模完成确定是否需要其它替换和选择用于替换的氨基酸残基的另一种方法。用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的计算机硬件和软件是广泛可用的。通常，从免疫球蛋白链或其域的解析结构开始产生分子模型。将要建模的链与解析三维结构的链或域比较氨基酸序列相似性，并且选择显示出最大序列相似性的链或域作为分子模型构建的起点。修饰解析起始结构以允许要建模的免疫球蛋白链或域中的实际氨基酸与起始结构中的那些之间的差异。然后，将修饰的结构组装成复合免疫球蛋白。最终，通过能量最小化并且通过验证所有原子彼此之间处于适当的距离内并且键长和键角处于化学可接受限值内来精修模型。
通常，人源化抗体中的CDR区是基本相同的，并且更通常，与它们所来源的亲代抗体中的相应CDR区相同。尽管通常不期望，但是有时可能对CDR残基做出一个或多个保守氨基酸取代，同时不明显影响所得人源化免疫球蛋白的结合亲和力。偶尔地，CDR区的替换可以提高结合亲和力。
除了以上所讨论的具体的氨基酸替换外，人源化免疫球蛋白框架区通常是基本相同的，并且更通常地，与它们所来源的人抗体的框架区相同。当然，框架区中的多个氨基酸对抗体的特异性或亲和力几乎没有直接贡献。因此，框架残基的多个单个保守替换可以是耐受的，同时所得的人源化免疫球蛋白的特异性或亲和力无明显改变。
由于编码的简并度，多种核酸序列将编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。可以通过固-相DNA合成或者通过先前制备的所期望的多核苷酸的变体的PCR突变来产生所期望的核酸序列。编码本发明申请中所述的抗体的所有核酸明确地包括在本发明中。
如上所述的所产生的人源化抗体的可变区段通常与至少一部分人免疫球蛋白恒定区连接。抗体将含有轻链和重链恒定区两者。重链恒定区通常包含CH1、铰链、CH2、CH3并且有时包含CH4域。
人源化抗体可以包含来自任何抗体种类的任何类型的恒定域，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及来自任何亚类(同种型)的任何类型的恒定域，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。当期望人源化抗体显示出细胞毒活性时，所述恒定域通常是补体结合恒定域并且种类通常为IgG1。当不期望这种细胞毒活性时，所述恒定域可以是IgG2类的。人源化抗体可以包含来自不止一个种类或同种型的序列。
将任选地与恒定区连接的编码人源化轻链和重链可变区的核酸插入表达载体。可以在相同或不同的表达载体中克隆轻链和重链。将编码免疫球蛋白链的DNA节段可操作性地连接至确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体中的控制序列。这些控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029(1989)；WO 90/07861；Co等人,J.Immunol.148,1149(1992)，以上文献出于所有目的以其全部内容作为参考并入本文)。
使用肾酶结合分子的方法
考虑到本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)的性质，肾酶结合分子作为用于诊断、治疗或预防人和动物中的肾酶-相关病况的诊断、治疗和预防剂是适合的。
通常，使用包括将治疗或预防有效量的本发明的一种或多种单克隆抗体或结合片段施用给敏感受试者或者显示出其中已知肾酶活性具有病理结局，如肿瘤生长和转移的病况的受试者。可以施用肾酶结合分子的任何活性形式，包括抗体Fab和F(ab')2片段。
优选地，所使用的肾酶结合分子与受体物种相容，从而对于肾酶结合分子的免疫应答不会导致产生不可接受地短循环半衰期或者在受试者中引起对所述肾酶结合分子的免疫应答。优选地，所施用的肾酶结合分子显示出一些次级功能，如与受试者的Fc受体结合和ADCC机制的激活。
个体的治疗可以包括治疗有效量的本发明所述的肾酶结合分子的施用。如下所述，可以在试剂盒中提供肾酶结合分子。可以作为混合物，例如，以相同的量使用或施用所述肾酶结合分子，或者在序列中单独提供所述肾酶结合分子，或者一次全部施用所述肾酶结合分子。在向患者提供肾酶结合分子时，基于以下因素，如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况、先前病史等，所施用的试剂的剂量将是不同的。
通常，如果施用全身剂量的肾酶结合分子，则期望向受体提供处于下列范围内的肾酶结合分子的剂量：约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(受体体重)，尽管可以施用更低或更高的剂量。可以预期低至1.0mg/kg的剂量将显示出一定效力。优选地，约5mg/kg是可接受的剂量，尽管高至约50mg/kg的剂量水平也是优选的，特别是对于治疗性使用。作为另外一种选择，可以提供具体的量的肾酶结合分子的施用，其不基于患者的体重，如以下范围内的量：1μg-100μg、1mg-100mg或者1g-100g。例如，位点特异性施用可以施用至身体隔室或空腔，如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸骨正中内、子宫内、膀胱内、病灶、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、眼科或透皮方式。
所述肾酶结合分子组合物可以制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其它施用，具体地以液体溶液或混悬液的形式；用于在阴道或直肠施用中使用，具体地以半固体形式，如(但不限于)乳膏剂和栓剂；用于口腔或舌下施用，如(但不限于)以片剂或胶囊剂的形式；或者鼻内，如(但不限于)以粉末剂、滴鼻剂或气溶胶或特定试剂的形式；或者眼科，如(但不限于)滴眼剂；或者用于牙科疾病的治疗；或者经皮，如(但不限于)凝胶剂、软膏剂、洗剂、混悬剂或具有下列物质的贴片递送系统：具有化学增强因子，如二甲基亚砜以改变皮肤结构或提高透皮贴片中的药物浓度，或者具有氧化剂，其使得含有蛋白和肽的制剂能够应用于皮肤(WO 98/53847)，或者使得能够应用电场以产生瞬时输送途径，如电穿孔或提高带电药物通过皮肤的移动性，如离子电渗，或者使得能够应用超声，如超声促渗(美国专利No.4,309,989和4,767,402)。
以类似的方式，本发明所述的肾酶结合分子的另一种治疗性使用是使用抗本发明的单克隆抗体之一的抗-个体基因型抗体的患者的自动免疫。通过模拟表位结构的抗-个体基因型抗体的免疫可以引起主动抗-肾酶应答(Linthicum,D.S,and Farid,N.R.,Anti-Idiotypes,Receptors,and Molecular Mimicry(1988),1-5页和285-300页)。
可以根据已知的方法配制本发明所述的肾酶结合分子以制备药物有用的组合物，其中这些材料或它们的功能衍生物与药物可用的载体媒介物混合合并。适合的媒介物和它们的制剂，包括其它人蛋白，例如，人血清白蛋白描述于(例如)Remington'sPharmaceutical Sciences(第16版,Osol,A.主编,Mack Easton Pa.(1980))。为了形成适合于有效施用的药物可用的组合物，这些组合物将含有有效量的上述化合物以及适合的量的载体媒介物。可以使用其它药物方法来控制作用的持续时间。可以通过使用聚合物来复合或吸收所述化合物以实现控制释放制剂。通过控制释放制剂来控制作用的持续时间的另一种可能的方法将本发明所述的化合物引入到聚合物材料，如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚物颗粒中。作为另外一种选择，作为将这些试剂引入聚合物颗粒中的替代，有可能将这些材料分别包封在通过(例如)界面聚合所制备的微胶囊中，例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)-微胶囊中，或者包封在胶体药物递送系统中，例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊中或者包封在粗乳液(macroemulsion)中。
可以通过单一剂量日程表，或者优选地通过其中第一疗程可以是施用1-10个单独的剂量，随后在后续时间间隔提供维持或加强应答所需的其它剂量，例如，在1-4个月进行第二剂量，并且如果需要，在几个月后进行后续剂量的多次剂量日程表提供治疗。适合的治疗日程表的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或者足以引起预期将减少疾病症状或者降低疾病严重程度的所期望的应答的其它日程表。
本发明还提供了对于实施本发明有用的试剂盒。本发明的试剂盒包括含有上述抗体或者结合上述抗体包装的第一容器。所述试剂盒还可以包含含有对于实施本发明所必需的或方便的溶液或者结合所述溶液包装的另一种容器。所述容器可以由玻璃、塑料或箔片制备，并且可以是小瓶、瓶、小袋、管、袋等。所述试剂盒还可以含有书面资料，如用于实施本发明的程序或分析信息，如第一容器方式中所含的试剂的量。所述容器可以与书面资料一起处于另一种容器装置中，例如，盒子或袋中。
本发明的另一个方面是用于检测生物样品中的肾酶的试剂盒。所述试剂盒包含容纳了结合肾酶表位的一种或多种肾酶结合分子的容器和出于结合至肾酶以形成复合物和检测所述复合物的形成，从而所述复合物的存在或不存在与样品中肾酶的存在或不存在相关的目的，使用肾酶结合分子的说明。容器的实例包括使得能够同时检测多个样品中的肾酶的多孔板。
组合疗法
本发明所述的肾酶结合分子组合物可以与另一种治疗性治疗或试剂组合使用以治疗疾病或病症。例如，本发明所述的肾酶结合分子可以单独或与一个或多个治疗有效的试剂或治疗组合施用。其它治疗有效的试剂可以缀合至本发明所述的肾酶结合分子，引入与本发明所述的肾酶结合分子相同的组合物，或者可以作为单独的组合物施用。可以在本发明所述的抗体或相关化合物的施用之前、期间和/或之后施用其它治疗剂或治疗。
在某些实施方式中，本发明所述的肾酶结合分子与一种或多种其它治疗剂或治疗共施用。在其它实施方式中，本发明所述的肾酶结合分子独立于一种或多种其它治疗剂或治疗的施用来施用。例如，首先施用本发明所述的肾酶结合分子，然后施用一种或多种其它治疗剂或治疗。作为另外一种选择，首先施用一种或多种其它治疗剂，然后施用本发明所述的肾酶结合分子。作为另一种实例，首先进行治疗(例如，手术、放射线等)，然后施用本发明所述的肾酶结合分子。
其它治疗有效的试剂/治疗包括手术、抗-肿瘤剂(包括化疗剂和放射线)、抗-血管生成剂、其它靶标的抗体、小分子、光动力学疗法、免疫疗法、免疫增强疗法、细胞毒性剂、细胞因子、趋化因子、生长抑制剂、抗-激素剂、激酶抑制剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂和促进血液细胞增殖的试剂。
在一个实施方式中，如本文所使用的“另一种治疗剂”是第二不同的治疗剂或抗癌剂，即本发明所述的肾酶结合分子“以外的”治疗剂或抗癌剂。任何第二治疗剂可以在本发明所述的组合疗法中使用。另外，根据以下指导，考虑到实现相加作用、大于相加作用和潜在的协同作用，可以选择第二治疗剂或“第二抗-癌剂”。
为了实践组合的抗-肿瘤治疗，将以在动物或患者内对于导致产生它们的组合抗-肿瘤作用有效的方式，与另一种，即第二不同的抗癌剂组合，向动物或患者施用本发明的肾酶结合分子。因此，将以对于在肿瘤或肿瘤脉管系统内导致它们的组合或同时存在以及在肿瘤环境中导致产生它们的组合作用有效的量和有效的时间段来提供所述试剂。为了实现该目标，可以将本发明的肾酶结合分子与第二不同的抗癌剂以单一组合物或者作为使用不同施用途经的两种不同的组合物基本同时施用于动物。
作为另外一种选择，本发明的肾酶结合分子可以以(例如)数分钟至数周的范围内的间隔处于所述第二不同的抗癌剂之前或之后。在某些实施方式中，当本发明所述的肾酶结合分子和所述第二不同的抗癌剂分别应用于动物时，将确保每次递送之间的时间不达到显著的时间段，从而每种试剂仍将能够对肿瘤发挥有利的组合作用。在这些情况下，考虑将肿瘤与两种试剂在彼此之间约5分钟至约1周内接触，并且更优选地，在彼此之间约12-72小时内接触，其中仅约12-48小时的延迟时间是最优选的。
可以基于某些标准，包括在本文其它处所讨论的那些来选择用于单独定时的组合疗法的第二治疗剂。然而，如果需要，优选地选择一种或多种第二不同的抗癌剂用于之前或之后的施用不会妨碍它们在基本同时施用中的使用。第二不同的抗癌剂选择用于在本发明的第一治疗剂“之前”施用并且设计以实现提高和潜在协同的作用。
选择用于在本发明的第一治疗剂“之后”施用且设计以实现提高和潜在协同的作用的第二不同的抗癌剂包括受益于所述第一治疗剂的作用的试剂。因此，用于后续施用的有效的第二不同的抗癌剂包括抑制转移的抗血管生成剂；靶向坏死肿瘤细胞的试剂，如对于变得可接近的来自体内恶性细胞的胞内结合伴侣分子特异的抗体(美国专利No.5,019,368、4,861,581和5,882,626，每篇专利具体地作为参考并入本文)；化疗剂；和攻击任何肿瘤细胞的抗-肿瘤细胞免疫缀合物。
本发明所述的肾酶结合分子还可以与癌症免疫疗法组合施用。所述癌症免疫疗法可以是设计以对于受试者的癌细胞引起体液免疫应答，或者对于受试者的癌细胞引起细胞介导的免疫应答，或者对受试者的癌细胞的体液免疫应答和细胞介导的应答的组合的免疫疗法。与本发明所述的肾酶结合分子组合使用的癌症免疫疗法的非限制性实例包括癌症疫苗、DNA癌症疫苗、继承性细胞疗法、继承性免疫疗法、CAR T-细胞疗法、抗体、免疫增强化合物、细胞因子、白介素(例如，IL-2等)、干扰素(IFN-α等)和检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂、CTLA-4抑制剂等)。
在一些情况下，可以期望显著延长治疗时间段，其中在各个施用之间经过了几天(2、3、4、5、6或7天)、几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)或甚至几个月(1、2、3、4、5、6、7或8个月)。在一种治疗旨在基本破坏肿瘤，如本发明所述的第一治疗剂，并且另一种治疗旨在预防微转移或肿瘤再生长，如抗血管生成剂的施用的情况下，这将是有利的。然而，应在手术之后谨慎的时间施用抗-血管生成剂以使得能够有效伤口愈合。然后，可以患者终生施用抗血管生成剂。
还设想将使用本发明所述的肾酶结合分子或者所述第二不同的抗癌剂中任一种的不止一次施用。可以隔日或隔周交替施用本发明所述的肾酶结合分子和所述第二不同的抗癌剂；或者可以施用一系列的一种试剂治疗，然后施用一系列的另一种治疗。在任何情况下，为了使用组合疗法实现肿瘤消退，所有所需要的是以对于发挥抗-肿瘤作用有效的组合的量递送两种试剂，而不管施用时间。
可以与本发明的肾酶抑制剂组合使用化学治疗药物。化学治疗药物可以杀死增殖肿瘤细胞，从而提高由于整体治疗所产生的坏死区。
本发明的一个方面提供了使用本发明的肾酶抑制剂治疗或预防癌症的方法。技术人员将理解通过非限制性实例，治疗或预防患者中的癌症包括杀死和破坏癌细胞以及减少癌细胞的增殖或细胞分裂速率。技术人员还将理解通过非限制性实例，癌细胞可以是原发癌细胞、癌干细胞、转移性癌细胞。以下是可以通过所公开的方法和组合物治疗的癌症的非限制性实例：急性成淋巴细胞性白血病；急性髓细胞性白血病；肾上腺皮质癌；儿童肾上腺皮质癌；阑尾癌；基底细胞癌；肝外胆管癌；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；儿童脑干神经胶质瘤；成人脑肿瘤；脑肿瘤，儿童脑干神经胶质瘤；脑肿瘤，儿童中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性瘤；小脑星形细胞瘤；脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；颅咽管瘤；成室管膜细胞瘤；室管膜瘤；成神经管细胞瘤；髓上皮瘤；中分化松果体实质细胞瘤；幕上原始神经外胚层瘤和成松果体细胞瘤；视觉传导路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓肿瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；胃肠类癌瘤；中枢神经系统非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤，儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；宫颈癌；儿童脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性粒性白血病；慢性脊髓增生病；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T-细胞淋巴瘤；食道癌；尤文氏家族肿瘤；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，成视网膜细胞瘤；胆囊癌；胃(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；儿童脑干神经胶质瘤；神经胶质瘤，儿童脑星形细胞瘤；儿童视觉传导路和下丘脑神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；郎格罕细胞组织细胞增生症；霍奇金淋巴瘤；舌癌；下丘脑和视觉传导路神经胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾脏细胞)癌；郎格罕细胞组织细胞增生症；喉癌；急性成淋巴细胞性白血病；急性髓性白血病；慢性淋巴细胞白血病；慢性髓细胞性白血病；毛细胞白血病；唇和口腔癌；肝癌；非小细胞肺癌；小细胞肺癌；AIDS-相关淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；成神经管细胞瘤；黑素瘤；眼内(眼)黑素瘤；Merkel细胞癌；间皮瘤；原发灶隐匿的转移性颈鳞癌；口腔癌；多发性内分泌瘤综合征(儿童)；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；霉菌病；蕈样；脊髓发育不良综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病；慢性粒细胞性白血病；成人急性骨髓性白血病；儿童急性骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；慢性脊髓增生病；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非小细胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞瘤；卵巢低度恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中分化松果体实质细胞瘤；成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤；垂体瘤；血浆体凯尔特人肿瘤(Plasma Celt Neoplasm)/多发性骨髓瘤；胸膜肺胚细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾脏细胞(肾)癌；肾盂和输尿管，移行细胞癌症；呼吸道癌，涉及染色体15上的NUT基因；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌；肉瘤，尤文氏家族肿瘤；卡波西肉瘤；软组织肉瘤；子宫肉瘤；塞扎里综合征；皮肤癌(非黑素瘤)；皮肤癌(黑素瘤)；皮肤癌，Merkel细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，原发灶隐匿的颈鳞癌，转移性；胃(胃)癌；幕上原始神经外胚层瘤；T细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺瘤和胸腺癌瘤；甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；妊娠滋养细胞肿瘤；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯物伦巨球蛋白血症；和胚胎性癌肉瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括在施用本发明的肾酶结合分子之前，同时或之后，用癌症的补充疗法，如手术、化疗、化疗剂、放射疗法或激素疗法或其组合治疗受试者。
化疗剂包括细胞毒性剂(例如，5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、阿霉素(oxorubicin)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿糖胞苷USP、环磷酰胺、雌莫司汀磷酸钠(estramucine phosphate sodium)、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、丙卡巴肼、丝裂霉素、白消安、环磷酰胺、米托蒽醌、卡铂、顺铂、重组干扰素alfa-2a、紫杉醇、替尼泊苷和链脲霉素(streptozoci))、细胞毒性烷化剂(例如，白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑或乙基磺酸)、烷化剂(例如，亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、AZQ、BCNU、白消安、双硫丹(bisulphan)、羧基邻苯二甲酸铂、CBDCA、CCNU、CHIP、苯丁酸氮芥、吡葡亚硝脲、顺铂、氯乙矾(clomesone)、氰基吗啉代阿霉素、甲基二磺酸乙二醇脂(cyclodisone)、环磷酰胺、1-2-5-6-双脱水卫矛醇、氟多潘、hepsulfam、海恩酮、异环磷酰胺、美法仑、甲基CCNU、丝裂霉素C、米托唑胺(mitozolamide)、氮芥、PCNU、哌嗪、哌嗪二酮、哌泊溴烷、泊非霉素、螺旋乙内酰螺旋乙内酰脲芥(spirohydantoin mustard)、链脲佐菌素、替罗昔隆、四铂、塞替派、曲他胺、尿嘧啶氮芥和Yoshi-864)、抗有丝分裂剂(例如，别秋水仙碱(allocolchicine)、软海绵素M、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、尾海兔素10、美登素、根霉素、紫杉醇衍生物、紫杉醇、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春碱和硫酸醛基长春碱)、植物碱(例如，放线菌素D、博来霉素、L-天冬酰胺酶、伊达比星、硫酸长春碱、硫酸醛基长春碱、光辉霉素(mitramycin)、丝裂霉素、柔红霉素、VP-16-213、VM-26、长春瑞滨和泰索帝)、生物制剂(例如，alpha干扰素、BCG、G-CSF、GM-CSF和白介素-2)、拓扑异构酶I抑制剂(例如，喜树碱、喜树碱衍生物和吗啉代阿霉素)、拓扑异构酶II抑制剂(例如，米托蒽醌、氨萘非特、m-AMSA、蒽吡唑衍生物、吡唑啉吖啶、比生群HCL、柔红霉素、脱氧多柔比星、美诺立尔、N,N-二苄基道诺霉素、oxanthrazole、苯甲酰腙柔红霉素、VM-26和VP-16)和合成物(例如，羟基脲、丙卡巴肼、o,p'-DDD、达卡巴嗪、CCNU、BCNU、顺-二氨二氯铂、米托蒽醌、CBDCA、左旋咪唑、六甲三聚氰胺、全反式视黄酸、格立得(gliadel)和卟吩姆钠)。
抗增殖剂是减少细胞增殖的化合物。抗增殖剂包括烷化剂、抗代谢物、酶、生物反应调节剂、杂剂、激素和拮抗剂、雄激素抑制剂(例如，氟他胺和醋酸亮脯利特)、抗雌激素剂(例如，枸橼酸他莫昔芬及其类似物、托瑞米芬、屈洛昔芬和雷洛昔芬(roloxifene))。具体的抗增殖剂的其它实例包括(但不限于)左旋咪唑、硝酸镓、格拉司琼、沙格司亭锶-89氯化物、非格司亭、匹鲁卡品、右雷佐生和昂丹司琼。
本发明所述的肾酶结合分子可以单独施用或与其它抗肿瘤剂组合施用，所述抗肿瘤剂包括细胞毒性剂/抗肿瘤剂和抗血管生成剂。细胞毒性剂/抗肿瘤剂的定义为攻击并杀死癌细胞的试剂。一些细胞毒性剂/抗肿瘤剂是使肿瘤细胞中的基因材料烷基化的烷化剂，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基噻替派、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、belustine、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪(dacabazine)。其它细胞毒性剂/抗-肿瘤剂是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤、咪唑硫嘌呤和丙卡巴肼。其它细胞毒性剂/抗-肿瘤剂是抗生素，例如，多柔比星、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、普卡霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和道诺霉素。对于这些化合物，存在多种可商购的脂质体制剂。其它细胞毒性剂/抗肿瘤剂是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱和依托泊苷。其它细胞毒性/抗-肿瘤剂包括红豆杉醇及其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗-肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
抗血管生成剂是本领域技术人员熟知的。用于在本发明公开所述的方法和组合物中使用的适合的抗血管生成剂包括抗-VEGF抗体，包括人源化和嵌合抗体、抗-VEGF适体和反义寡核苷酸。其它已知的血管生成抑制剂包括血管阻断素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。还可以使用小分子，包括拓扑异构酶，如雷佐生、具有抗血管生成活性的拓扑异构酶II抑制剂。
可以与所公开的化合物组合使用的其它抗癌剂包括(但不限于)阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑盐酸盐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌乙酸盐；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；比生群盐酸盐；双奈法德二甲磺酸盐；比折来新；博来霉素硫酸酯；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；卡柔比星盐酸盐；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；克立那托甲磺酸盐；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；柔红霉素盐酸盐；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；地扎胍宁甲磺酸盐；地吖醌；多西他赛；多柔比星；多柔比星盐酸盐；屈洛昔芬；屈洛昔芬柠檬酸盐；屈他雄酮丙酸酯；达佐霉素；依达曲沙；依氟鸟氨酸盐酸盐；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；表柔比星盐酸盐；厄布洛唑；依索比星盐酸盐；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷磷酸盐；氯苯乙嘧胺；法倔唑盐酸盐；法扎拉滨；芬维A胺；氮尿苷；氟达拉滨磷酸盐；氟尿嘧啶；氟西他滨(fluorocitabine)；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；吉西他滨盐酸盐；羟基脲；伊达比星盐酸盐；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II或rIL2)、干扰素alfa-2a；干扰素alfa-2b；干扰素alfa-n1；干扰素alfa-n3；干扰素beta-I a；干扰素gamma-I b；异丙铂；伊立替康盐酸盐；兰瑞肽乙酸盐；来曲唑；亮脯利特乙酸盐；利阿唑盐酸盐；洛美曲索钠；洛莫司汀；洛索蒽醌盐酸盐；马索罗酚；美登素；氮芥盐酸盐；甲地孕酮；十六次甲基甲地孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；草绿霉素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；米托蒽醌盐酸盐；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；白蛋白-结合的紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；培洛霉素硫酸盐；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡罗蒽醌盐酸盐；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸甲基下肼；嘌罗霉素；嘌罗霉素盐酸盐；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；沙芬戈盐酸盐；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；锗螺胺盐酸盐；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；替洛蒽醌盐酸盐；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫唑嘌呤胺；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；托瑞米芬柠檬酸盐；曲托龙乙酸盐；曲西立滨磷酸盐；三甲曲沙；三甲曲沙葡糖醛酸；曲普瑞林；妥布氯唑盐酸盐；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸醛基长春碱；长春地辛；长春地辛硫酸盐；长春匹定硫酸盐；长春甘酯硫酸盐；长春罗新硫酸盐；长春瑞滨；长春瑞滨酒石酸盐；长春罗定硫酸盐；长春利定硫酸盐；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；佐柔比星盐酸盐。其它抗-癌药物包括(但不限于)：20-表-1,25-二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；3,4-二羟基苄胺肟(amidox)；氨磷汀；氨基-γ-酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗背侧形态发生蛋白-1；抗雄激素、前列腺癌；抗雌激素药；抗瘤酮；反义寡核苷酸；阿非迪霉素甘氨酸盐；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；无嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin3；阿扎司琼；阿扎毒素；氮杂酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星孢菌素；β内酰胺衍生物；β-alethine；亚阿克拉霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫堇；卡泊三醇；卡弗他丁C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；羧酰胺-氨基-三唑；羧酰氨三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他丁A4；考布他丁类似物；conagenin；甘蓝海绵素816(crambescidin816)；克立那托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊烯蒽醌；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸盐；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素(dehydrodidemnin)B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；3,4-二羟荃苯并氧肟酸(didox)；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮杂胞苷；9-二氢紫杉醇；二噁霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌毒素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄酮吡醇(flavopiridol)；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin盐酸盐；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德克萨卟啉钆；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；7-庚二醇-二-氨基磺酸盐(hepsulfam)；调节蛋白(heregulin)；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4-甘薯苦醇；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N三乙酸盐；兰瑞肽；雷纳霉素；来格司亭；蘑菇多糖硫酸酯；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；直链聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；德克萨卟啉镥；利索茶碱；裂解肽；美坦新；制甘糖酶素A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-肥皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体；单磷酰酯A+分支杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；多肿瘤抑制剂1-基疗法；芥抗癌剂；印度洋海绵(mycaperoxide)B；分支杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+镇痛新；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链内切酶；尼鲁米特；尼沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥可斯酮(okicenone)；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；奥拉素(oracin)；口腔细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；厄诺霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；副球菌素；帕折普汀；培门冬酶；培得星；木聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；帕斯婷A；帕斯婷B；纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼松；丙基双-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；蛋白A-基免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙酯血红蛋白聚环氧乙烷缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基瑞替普汀；RE 186羟乙二磷酸铼；根霉素；核糖酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；鲁泊塞(ruboxyl)；沙芬戈；散特平(saintopin)；SarCNU；肌肉叶绿醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；sizofuran；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；solverol；促生长因子结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D；螺莫司汀；脾脏五肽；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；基质降解酶抑制剂；索非罗新(sulfinosine)；超活性血管活性肠肽拮抗剂；苏拉斯塔(suradista)；苏拉明；苦马豆碱；合成糖胺聚糖；他莫司汀；甲碘化他莫昔芬；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯癸烷氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；菌体胚素；噻可拉林；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯环戊二烯钛；托森亭(topsentin)；托瑞米芬；全能性干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰基尿甙；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸蛋白激酶抑制剂(tyrphostins)；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦-衍生生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；伐若啉B(variolinB)；红细胞基因疗法载体系统；维拉雷琐；藜芦明；维尔丁(verdin)；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；整合素拮抗剂(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；伊米利木单抗(imilimumab)；米氮平；BrUOG 278；BrUOG 292；RAD0001；CT-011；亚叶酸钙(folfirinox)；替吡法尼；R115777；LDE225；骨化三醇；AZD6244；AMG 655；AMG 479；BKM120；mFOLFOX6；NC-6004；西妥昔单抗；IM-C225；LGX818；MEK162；BBI608；MEDI4736；威罗非尼；普利木单抗；ivolumab；纳武单抗；帕比司他；来氟米特；CEP-32496；阿仑珠单抗；贝伐单抗；奥法木单抗；帕尼单抗；派姆单抗；利妥昔单抗；曲妥珠单抗；STAT3抑制剂(例如，STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、S31-201、SF-1066、SF-1087、STX-0119、隐丹参醌、姜黄、二阿魏酰甲烷、FLLL11、FLLL12、FLLL32、FLLL62、C3、C30、C188、C188-9、LY5、OPB-31121、乙胺嘧啶、OPB-51602、AZD9150等)；缺氧诱导因子1(HIF-1)抑制剂(例如，LW6、地高辛、laurenditerpenol、PX-478、RX-0047、牡荆素(vitexin)、KC7F2、YC-1等)和净司他丁斯酯。在一个实施方式中，所述抗-癌药物是5-氟尿嘧啶、红豆杉醇或亚叶酸。
诊断方法
在一些实施方式中，在本发明所述的方法中使用与对比因子相比，受试者细胞、组织或体液中的肾酶或肾酶片段的水平的变化(例如，升高)作为用于疾病或病症诊断，评价疾病或病症的严重程度和用于监测疾病或病症治疗的效果或有效性的标志物。在多个实施方式中，所述疾病或病症是急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病或病症(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状左心室功能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律紊乱、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或病症、肾脏疾病或病症、胃肠疾病或病症、肝脏疾病或病症、肺疾病或病症、胰脏疾病或病症(例如，胰腺炎)、精神疾病或病症(例如，抑郁症、焦虑等)或者神经系统疾病或病症。
在一个实施方式中，本发明是通过评价受试者的生物样品中肾酶或肾酶片段的水平来诊断受试者的疾病或病症的方法。在一个实施方式中，受试者的生物样品是细胞、组织或体液。其中可以评价肾酶或肾酶片段的水平的体液的非限制性实例包括(但不限于)血液、血清、血浆和尿液。在多个实施方式中，将受试者生物样品中的肾酶或肾酶片段的水平与对比因子中肾酶或肾酶片段的水平相比较。对比因子的非限制性实例包括(但不限于)阴性对照、阳性对照、受试者的预期正常背景值、受试者的历史正常背景值、受试者作为成员的群体的预期正常背景值或者受试者作为成员的群体的历史正常背景值。在多个实施方式中，所述疾病或病症是急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病或病症(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状左心室功能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律紊乱、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或病症、肾脏疾病或病症、胃肠疾病或病症、肝脏疾病或病症、肺疾病或病症、胰脏疾病或病症(例如，胰腺炎)、精神疾病或病症(例如，抑郁症、焦虑等)或者神经系统疾病或病症。在一些实施方式中，诊断方法包括治疗患者所诊断的疾病或病症的进一步步骤。
在另一个实施方式中，本发明是通过评价受试者的生物样品中肾酶或肾酶片段的水平来评价受试者的疾病或病症的严重程度的方法。在一个实施方式中，受试者的生物样品是细胞、组织或体液。其中可以评价肾酶或肾酶片段的水平的体液的非限制性实例包括(但不限于)血液、血清、血浆和尿液。在多个实施方式中，将受试者生物样品中的肾酶或肾酶片段的水平与对比因子中肾酶或肾酶片段的水平相比较。对比因子的非限制性实例包括(但不限于)阴性对照、阳性对照、受试者的预期正常背景值、受试者的历史正常背景值、受试者作为成员的群体的预期正常背景值或者受试者作为成员的群体的历史正常背景值。在多个实施方式中，所述疾病或病症是急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病或病症(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状左心室功能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律紊乱、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或病症、肾脏疾病或病症、胃肠疾病或病症、肝脏疾病或病症、肺疾病或病症、胰脏疾病或病症(例如，胰腺炎)、精神疾病或病症(例如，抑郁症、焦虑等)或者神经系统疾病或病症。在一些实施方式中，评价严重程度的方法包括治疗患者的疾病或病症的进一步步骤。
在另一个实施方式中，本发明是通过评价受试者的生物样品中肾酶或肾酶片段的水平来监测受试者的疾病或病症的治疗效果的方法。在一个实施方式中，受试者的生物样品是细胞、组织或体液。其中可以评价肾酶或肾酶片段的水平的体液的非限制性实例包括(但不限于)血液、血清、血浆和尿液。在多个实施方式中，将受试者生物样品中的肾酶或肾酶片段的水平与对比因子中肾酶或肾酶片段的水平相比较。对比因子的非限制性实例包括(但不限于)阴性对照、阳性对照、受试者的预期正常背景值、受试者的历史正常背景值、受试者作为成员的群体的预期正常背景值或者受试者作为成员的群体的历史正常背景值。在多个实施方式中，所述疾病或病症是急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病或病症(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状左心室功能障碍、慢性充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律紊乱、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或病症、肾脏疾病或病症、胃肠疾病或病症、肝脏疾病或病症、肺疾病或病症、胰脏疾病或病症(例如，胰腺炎)、精神疾病或病症(例如，抑郁症、焦虑等)或者神经系统疾病或病症。在一些实施方式中，监测治疗效果的方法包括治疗患者的疾病或病症的进一步步骤。
在多个实施方式中，所述受试者是人受试者，并且可以是任何种族、性别和年龄。代表性的受试者包括怀疑已经历疾病或病症的那些，已诊断为已经历疾病或病症的那些，已诊断为患有疾病或病症的那些和具有出现疾病或病症的风险的那些。
得自本文所述的本发明的方法的信息可以单独使用或者与来自受试者或来自得自受试者的生物样品的其它信息(例如，疾病状态、疾病史、生命体征、血液化学性质等)组合使用。
在本发明所述的诊断方法中，对得自受试者的生物样品评价其中所含的肾酶或肾酶片段的水平。在一个实施方式中，所述生物样品是含有在本文所述的方法中有用的至少肾酶多肽的片段的样品。
在本发明所述方法的其它多个实施方式中，当与对比因子对照相比较时，当肾酶或肾酶片段的水平升高至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％或至少1000％时，则确定肾酶水平升高。在多个实施方式中，肾酶或肾酶片段水平的升高指示了疾病或病症。在多个实施方式中，所述疾病或病症是急性肾衰竭(即急性肾小管坏死或ATN、肾脏中的缺血性病况)、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、肾脏的炎症性病症和癌症。
在本发明所述的方法中，对来自受试者的生物样品评价得自患者的生物样品中的肾酶或肾酶片段的水平。可以通过评价生物样品中肾酶多肽或片段的量，生物样品中肾酶mRNA或片段的量，生物样品中肾酶活性(例如，酶活力、底物结合活性、受体结合活性等)的量或它们的组合来确定生物样品中肾酶或肾酶片段的水平。在一些实施方式中，在使用本文其它处所述的本发明的肾酶结合分子中的至少一种的测定中确定生物样品中肾酶的水平。
在本发明所述方法的多个实施方式中，测量得自患者的生物样品中肾酶水平的方法包括(但不限于)免疫色谱测定、免疫斑点测定、Luminex测定、ELISA测定、ELISPOT测定、蛋白微阵列测定、免疫印迹测定、质谱测定、放射免疫测定(RIA)、放射免疫扩散测定、液相色谱-串联质谱测定、ouchterlony免疫扩散测定、反相蛋白微阵列、火箭免疫电泳测定、免疫组织化学染色测定、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS、酶-底物结合测定、酶促测定、使用可检测分子(如发色团、荧光团或放射性底物)的酶促测定、使用这些底物的底物结合测定、使用这些底物的底物置换测定和蛋白芯片测定(还参见，2007,Van Emon,Immunoassayand Other Bioanalytical Techniques,CRC Press；2005,Wild,Immunoassay Handbook,Gulf Professional Publishing；1996,Diamandis and Christopoulos,Immunoassay,Academic Press；2005,Joos,Microarrays in Clinical Diagnosis,Humana Press；2005,Hamdan and Righetti,Proteomics Today,John Wiley and Sons；2007)。在一些实施方式中，通过使用本文其它处所述的本发明的肾酶结合分子中的至少一种的测定测量生物样品中肾酶的水平。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，其包含本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)或其组合，和说明材料，所述说明材料描述了(例如)作为如本文其它处所述的治疗性治疗或非治疗性使用，向个体施用所述肾酶结合分子或其组合。在一个实施方式中，该试剂盒还包括适合于在向个体施用本发明所述的肾酶结合分子之前，溶解或混悬包含肾酶结合分子或其组合的治疗性组合物的(优选地，无菌的)药物可用的载体。任选地，所述试剂盒包含用于施用所述肾酶结合分子的施用器。
实验实施例
现将参考以下实施例描述本发明。仅出于说明的目的提供了这些实施例，并且本发明决不应视为受限于这些实施例，而是应视为涵盖了由于本文所提供的教导内容而变得显而易见的任何和所有改变。
在不进行进一步描述的情况下，据信本领域的技术人员可以使用以上描述和以下说明性实施例制备和使用本发明所述的化合物和实践所主张的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，并且不应视为以任何方式限制本发明公开的其余部分。
实施例1：用于治疗癌症的新型组合物和方法
本文所述的结果提供了支持新型组合物和方法用于治疗癌症的用途的数据。
现将描述在这些实验中使用的材料和方法。
抗-肾酶单克隆抗体在兔中的合成
蛋白抗原制备：将肾酶-1cDNA亚克隆到pET27表达载体(Novagen)中，然后将其用于转化细菌的BL21 DE3株(Novagen)。通过标准程序从细菌包涵体分离肾酶蛋白。简要地，分离细菌包涵体并将其结合离液序列高的盐和还原剂溶解。通过增溶缓冲液的稀释，使蛋白重新折叠。在将溶解和重新折叠的蛋白最终向磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析后，将所述蛋白用作抗原以使兔免疫。
肽抗原制备：将用于免疫的肽设计以覆盖肾酶-1或2多肽的几个区域，并且包括在后续缀合中使用的N或C末端半胱氨酸残基。使用标准肽合成程序产生肽，并通过半胱氨酸残基缀合至牛血清白蛋白(BSA)以用于筛选目的或者缀合至佐剂钥孔血蓝素(KLH)以用于动物免疫。
免疫和抗体选择：使用标准程序，使用多剂量注射规程，将KLH-缀合的肽抗原和完整蛋白抗原中的每一种用于使6只兔免疫。使用标准ELISA规程，使用BSA-肽缀合物或者重新折叠的完整蛋白中的任一种作为涂层抗原，对来自每只兔的免疫前和免疫后的测试放血测试抗-肾酶滴度(参见以下规程)。将在免疫印迹分析中具有对抗-肾酶具有最高滴度的抗血清且具有所期望的内源肾酶的检测特征的兔选择用于进一步分析。将所选动物在末端采血(terminal bleeds)中使用以用于产生抗-肾酶多克隆抗体或者收获所选兔的脾脏以用于获得淋巴细胞。在标准细胞融合后，使用条件细胞培养基，在如上所述的相同肽和完整蛋白ELISA形式中筛选来自每只动物的杂交瘤混合池。选择具有最高抗-肾酶滴度和优选的内源肾酶结合特征的杂交瘤并进行亚克隆。随后，将克隆的杂交瘤扩增，并从条件细胞上清液纯化单克隆抗体。
杂交瘤的培养和扩增：将杂交瘤细胞在补充有55μM 2-巯基乙醇的杂交瘤-SFM无血清培养基(Gibco/Invitrogen)中培养。对于抗体纯化，将在15mL培养基中混悬的107个杂交瘤细胞应用于CELLine 1000生物反应器烧瓶(Wilson Wolf)的池室(cellcompartment)，并将上室充满1L培养基。在连续培养7天后，除去池室内容物(含有细胞和分泌抗体)并通过以1000g离心5分钟使细胞沉淀成粒。在抗体纯化前，回收上清液，以10,000g离心15分钟并过滤(0.2μM)以除去细胞碎片。
抗体纯化：对于抗-肾酶单克隆抗体，将预澄清的条件杂交瘤上清液在恒压下泵送通过预平衡的蛋白A亲和层析柱(GE life sciences)。用20柱体积的PBS pH 7.4清洗该柱。在0.1M甘氨酸pH 2.5中，从柱上洗脱抗体并立即使用Tris缓冲液中和。将纯抗体对过量PBSpH 7.4透析，过滤除菌并以等份储存在-80℃或者4℃。对于对肽-缀合物或完整肾酶蛋白免疫原所产生的抗-肾酶多克隆抗体，将兔末端采血血清初始通过蛋白A亲和层析柱。将来自该蛋白A柱的总的纯化的IgG混合池对PBS pH 7.4透析。通过将所述混合池通过缀合了相关肽抗原或完整肾酶蛋白中任一种的Actigel ALD柱(Sterogene)(根据生产商的说明，Actigel-抗原缀合是完整的规程)进一步纯化抗-肾酶抗体。用PBS清洗柱，并用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的IgG。使用Tris缓冲液中和纯化的IgG并对PBS透析。
常规ELISA筛选测定：通过在4℃培育过夜，将100ng/孔重组肾酶蛋白或者肾酶肽-BSA缀合物结合至96孔微量滴定板。在33℃，用5％牛奶在含有0.05％ Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中的溶液封闭所述板1小时。将肾酶抗体采血在PBS中稀释并将50μL加入至每个孔中。在33℃培育1小时后，用PBST漂洗板三次。将50μL抗-兔-辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体(Dako，在PBST中稀释至0.25μg/ml)加入至每个孔中并将板在33℃培育45分钟。用PBST清洗板三次，并用PBS清洗1次。将100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物加入至每个孔中并将板在室温下培育约5分钟。为了终止反应，将100μL 2N H2SO4加入至每个孔中。将板在分光光度计中，在450nm读数。
常规夹心ELISA测定：通常，通过在4℃培育过夜，将400ng/孔的捕获抗体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中结合至96孔微量滴定板。在33℃，用8％脱脂奶粉(NFDM)在PBS中的溶液封闭板1小时。将含有肾酶的样品在含有Tween-20的PBS中稀释至0.05％(PBST)，并将50μL加入至每个孔中。在33℃培育1小时后，用PBST漂洗板三次。将生物素化的抗体探针在PBST中稀释至4μg/mL，并将50μL加入至每个孔中。在33℃培育1小时后，用PBST清洗板3次。对于检测，将50μL稀释至0.4μg/mL的辣根过氧化物酶-缀合的(HRP)中性抗生物素蛋白(NA-HRP)加入至每个孔中并将板在室温下培育45分钟。培育后，用PBST清洗板三次，并用PBS清洗1次。将HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)加入至100μL/孔，并将板在室温下培育约5分钟。为了终止反应，将100μL 2N H2SO4加入至每个孔中。将板在分光光度计中，在450nm读数。
免疫印迹程序：将蛋白样品在4-20％ Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)上分离。使用XCell II印迹模块(Invitrogen)，将蛋白从凝胶转移至聚二氟乙烯(PVDF)膜。在室温下，用5％脱脂奶粉在含有0.1％ Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)中的溶液封闭PVDF膜1小时。然后，除去封闭缓冲液，并将膜与检测抗体培育，在20mL 5％奶粉/PBST中稀释。在室温下培育1小时后，分别用PBST将膜清洗三次，每次10分钟。将20mL抗-兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Dako，在5％奶粉/PBST中稀释至0.25μg/mL)应用于所述膜，并在室温下培育另外1小时。分别用PBST将膜清洗3次，每次10分钟。从膜中吸收过量的PBST，并应用足够增强的化学发光(ECL)+试剂(sufficient enhanced chemiluminescence(ECL)plusreagent，GE Lifesciences)以覆盖膜表面，并培育1分钟。然后，吸收过量的ECL+试剂，并将膜包裹在塑料薄膜中。通过将膜暴露于Hyperfilm-ECL(GE Lifesciences)，然后使用自动冲片机(Konica)对其进行处理以使蛋白条带显象。
肽-抗原特异性ELISA：将牛血清白蛋白(BSA)-缀合的肾酶肽抗原在PBS中稀释至100ng/孔并通过在4℃培育过夜结合至96孔微量滴定板。在33℃，用8％ NFDM在PBS中的溶液封闭板1小时。用对其所产生的抗体的稀释系列或者用对不同抗原所产生的抗体检测肽抗原。抗体的起始浓度通常为5μg/mL，然后在含有0.05％的Tween-20的PBS(PBST)中进行两倍稀释步骤。在33℃培育1小时后，用PBST漂洗板三次。通过以50ng/mL，50μL/孔添加HRP-缀合的抗-兔IgG来测定抗体结合。将板在室温下培育40分钟。培育后，用PBST清洗板三次，并用PBS清洗1次。将HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)加入至100μL/孔，并将板在室温下培育约5分钟。为了终止反应，将100μL 2N H2SO4加入至每个孔中。将板在分光光度计中，在450nm读数。
表位结合的特异性：将细菌表达的肾酶同工型在PBS中稀释至100ng/孔并通过在4℃培育过夜结合至96孔微量滴定板。在33℃，用8％ NFDM在PBS中的溶液封闭板1小时。通常从1μg/mL开始，用与不同生物素化的抗体混合的未缀合的抗体的稀释系列检测肾酶蛋白。生物素化的抗体的浓度保持恒定为125ng/孔。将两种抗体在PBST中混合在一起并作为50μL/孔的一次添加应用。在33℃培育1小时后，用PBST漂洗板三次。通过以0.4ng/mL，50μL/孔添加HRP-缀合的中性抗生物素蛋白(HRP-NA)测定生物素化的抗体与肾酶的结合。将板在室温下培育40分钟。培育后，用PBST清洗板三次，并用PBS清洗1次。将HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)加入至100μL/孔，并将板在室温下培育约5分钟。为了终止反应，将100μL 2NH2SO4加入至每个孔中。将板在分光光度计中，在450nm读数。
抗体亲和力的Biacore测量：基本如文献所述，使用Biacore T100进行结合研究(Guo X等人,2016,Scientific Reports,6:22996)。使用25mM Tris pH 8、150mM NaCl、1mMEDTA、10％甘油、0.005％ Tween-20和0.1mg/mL BSA作为运行缓冲液，在25℃完成测定。在各个抗生蛋白链菌素传感器芯片流通池上捕获生物素化的抗体并纯化，在所述芯片表面上注入重组肾酶-1。
人源化抗-肾酶单克隆抗体的合成和表征
人源化策略和规程：使用标准方法(Nelson B,2012,Methods in molecularbiology,899:27-41)，将来自M28和M42的互补决定区(CDR)移植到噬粒内Fab抗体片段形式中的4D5(Herceptin)框架上。表1中列出了用于这种CDR移植的寡核苷酸，包括所产生的氨基酸组成。另外，对于M28和M42，将HC-A71(根据Chothia(Chothia C等人,1987,Journal ofmolecular biology,196(4):901-17)编号)分别转变为K71或R71以具有亲代M28和M42CDR-H2。将寡核苷酸-定向的突变用于构建亲和力成熟文库M28和M42变体。作为独立文库，靶向单个M28 CDR-L3、-H1、-H2和-H3以及M42 CDR-L1、-H1、-H2和-H3以用于多样化。首先，使用表1所列的寡核苷酸，用终止密码子(STOP codons)替换可应用的CDR以产生亲和力成熟文库的终止模板(STOP templates)。然后，使用表1所列的通过“软随机化(softrandomization)”策略多样化的寡核苷酸，将这些终止模板用于产生亲和力成熟文库(M28，4个；M42，4个)，其中使用标准规程(Nelson B,2012,Methods in molecular biology,899:27-41)，将简并位置处的核苷酸比例调节至70％的亲代核苷酸和10％的其它核苷酸中的每一种。
如文献所述，实施对人和小鼠肾酶可交叉反应的高亲和力变体的选择和直接噬菌体ELISA(Nelson B,2012,Methods in molecular biology,899:27-41；Reshetnyak AV等人,2013,Proc of Nat Acad of Sci of the USA,110(44):17832-7)。简要地，使用在96-孔Maxisorp板(Nunc)上涂覆的人肾酶(hRNLS)或小鼠肾酶(mRNLS)的交替轮次，通过3-5轮结合选择循环文库噬菌体混合池。在3-5轮选择后，如文献所述，通过噬菌体ELISA评价各个克隆的特异性结合(Reshetnyak AV等人,2013,Proc of Nat Acad of Sci of the USA,110(44):17832-7)。对与抗生蛋白链菌素(New England Biolabs)相比，对于结合hRNLS和mRNLS显示出至少10-倍更大的信号的克隆进行DNA测序以对噬菌体-展示的Fab序列解码。
分离了3个交叉反应性M28变体，其中2个具有向多个CDR的转变，表明了文库构建和抗体选择期间的重组。使用标准方法，将变体CDR系统组合以获得具有从单个变体CDR至4个变体CDR的范围内的变化的23个独特变体。使用溶液竞争性ELISA，对全部23个变体排序(Reshetnyak AV等人,2013,Proc of Nat Acad of Sci of the USA,110(44):17832-7)。选择6个变体，M28-K2、M28-K5、M28-K9、M28-13、M28-14和M28-19以用于改变为小鼠IgG1(具有人Fv的嵌合体)以用于多点ELISA和细胞-基测试、表面等离子共振和体内测试。
分离8个交叉反应性M42变体，每个均具有向单个CDR的变化。将多点ELISA用于2个CDR-H2和2个CDR-H3变体之间的排序。对于每个CDR-H2和CDR-H3选择一个变体，并对于总计11个变体合并CDR。对这11个变体进行溶液竞争性ELISA以排序。选择3个变体M42-K31、M42-K34和M42-35以用于改变为小鼠IgG1(具有人Fv的嵌合体)。
IgG1转化、表达和纯化：将来自变体的轻链Fv片段PCR扩增以包括用于克隆至pFUSE2ss-CLIg-mk载体(InvivoGen)的5'EcoRI和3'BstAPI位点以用于向小鼠IgGκ轻链表达的转化(人-小鼠嵌合体)。将来自变体的轻链Fv片段PCR扩增以包括用于克隆至pFUSE2ss-CLIg-hk载体(InvivoGen)的5'EcoRI和3'BsiWI位点以用于向人IgGκ轻链表达的转化。将重链Fv片段PCR扩增以包括用于克隆至pFUSEss-CHIg-mG1(InvivoGen)以用于向小鼠IgG1重链表达的转化(人-小鼠嵌合体)或者克隆至pFUSEss-CHIg-hG4(InvivoGen)以用于向人IgG4重链表达的转化的5'EcoRI和3'NheI位点。根据生产商的说明，将重链和轻链载体共转染至Expi293F细胞(ThermoFisher)。在使用蛋白A琼脂糖珠(GE Healthcare)从上清液纯化之前，将细胞培养物培育5天。
现将描述本实验的结果。
肾酶抗原选择、免疫和抗体产生
肾酶是涉及血压的控制和维持的含FAD蛋白(Xu,J.等人,2005,J Clin Invest,115(5):1275-80)。高-亲和力、高-特异性抗-肾酶抗体的缺乏已阻碍了肾酶生物学和潜在的肾酶-相关治疗剂的研究和开发。迄今为止，已发展了几种多克隆研究-试剂抗体，但是这些是低亲和力的并且不能稳健地检测组织或体液样品中的内源肾酶。因此，对于不同的肾酶同工型并且进一步，对于完整蛋白内的不同肽序列具有特异性的肾酶抗体组的开发将使得能够确定地检测和鉴定肾酶基因产物。此外，仅选择高亲和力抗体将使得能够检测潜在低水平的肾酶并因此可以导致开发用于肾酶水平的蛋白-基诊断剂。
为了产生一系列对肾酶具有高亲和力和特异性的抗体，使用了两种方法。在第一种方法中，使用全长肾酶-1蛋白作为免疫原产生了多克隆抗体。将肾酶-1cDNA亚克隆到pET27表达载体(Novagen)中，然后将其用于转化细菌的BL21 DE3株(Novagen)。通过标准程序从细菌包涵体分离肾酶蛋白。简要地，分离细菌包涵体并将其结合离液序列高的盐和还原剂溶解。通过增溶缓冲液的稀释，然后最终透析至磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，使蛋白重新折叠。
用作免疫原的全长肾酶蛋白的序列可见于图2。将该蛋白用作抗原以使6只兔免疫。通过ELISA测定，对来自这些动物的抗血清筛选肾酶结合特异性，其中所述抗原是相同的重新折叠的肾酶蛋白。还基于通过免疫印迹检测人组织裂解液中内源肾酶的能力的标准，选择抗血清。将对内源肾酶具有最高抗-肾酶滴度和最大特异性的末端采血抗血清选择对于抗体纯化。使用蛋白G亲和色谱法从所述抗血清纯化总IgG，并将特异性的抗-肾酶抗体在缀合了重组肾酶蛋白的柱上进一步纯化。如以下实施例中可见，以这种方式产生的抗体结合至肾酶并进一步显示结合至肾酶上的多个表位。
在用于产生抗-肾酶抗体的第二方法中，将肽用作免疫原。产生了在9至21个氨基酸范围内且对应于肾酶-1和肾酶-2蛋白区域的肽。所有的肽均具有N或C末端半胱氨酸残基。肽序列可见于图1，并且图3的序列对比显示其中这些肽对应于肾酶-1或2的序列。由此可见，肾酶-1特异性肽是标记的1A-F，肾酶-2特异性肽是标记的3A5。将每种肽通过半胱氨酸缀合至佐剂KLH并用于使6只兔免疫。使用相关肽(BSA-缀合物)或全长肾酶-1或2两者，通过ELISA测定对每只动物的抗血清筛选抗-肾酶抗体滴度。还对抗血清测试了它们通过免疫印迹检测组织裂解液中内源肾酶的能力。使用这些筛选标准，选择产生具有优选特征的抗体的动物。在一些实例中并且对于一些肽，几只动物产生具有所要求的特异性的抗体。在这些情况下，一只动物具有用于多克隆抗体产生的最终抗血清，并且一只或在一些实例中两只其它动物用于收获脾脏淋巴细胞。在其它实例中，单一动物具有末端采血和脾切除术。通过蛋白G色谱对来自末端采血的总IgG的纯化以及随后在肽亲和色谱上的进一步纯化，产生了对所有肽所产生的多克隆抗体。此外并且使用标准程序，将来自所选动物脾脏的淋巴细胞融合至骨髓瘤细胞以用于杂交瘤产生。对杂交瘤上清液筛选与对于其产生它们的两种肽的结合，并且随后对完整肾酶蛋白进行筛选。将所选的杂交瘤亚克隆并扩增以用于抗体纯化。通过蛋白A亲和色谱从条件杂交瘤培养上清液纯化单克隆抗体。对其产生单克隆抗体的肽可见于图1。
抗-肾酶抗体的核苷酸和氨基酸序列
对于它们的肾酶结合特异性和高亲和力选择单克隆抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2(参见以下部分)。使用标准聚合酶链反应程序和简并引物组，对于这些抗体从亚克隆杂交瘤扩增抗体重链和轻链可变区的cDNA。图4至图13显示了可变区核苷酸和氨基酸序列。以这种方式，举例说明了具有优选特征的抗体的组成。
在ELISA和免疫印迹两者中抗体对肾酶显示出特异性
如图14可见，在ELISA测定中，抗全长肾酶蛋白的抗-肾酶多克隆抗体特异性结合结合的肾酶蛋白。将细菌表达的肾酶-1在PBS中稀释至100ng/孔并通过在4℃培育过夜结合至96孔微量滴定板。在用NFDM封闭后，从1μg/mL的浓度开始，通过多克隆抗体E2930的稀释系列检测肾酶蛋白。通过添加HRP-缀合的抗-兔IgG测定抗体结合。在HRP与底物TMB反应后，在分光光度计中，在450nm对板读数。
在第二实例中，所有多克隆抗体和所选单克隆抗体克隆结合至对其产生它们的肽抗原。例如并且如图15可见，对1D肽所产生的单克隆抗体1D 28-4和1D 37-10以浓度依赖性方式结合至肾酶-1。1D肽存在于肾酶-1和肾酶-2两者中。抗1F肽的单克隆抗体1F 42-7和1F26-1仅存在于肾酶-1中。1F mAb以浓度-依赖性方式结合至肾酶-1。
在另一个实例中，为了确立所述抗体是否可以用于通过免疫印迹检测肾酶，在SDS-PAGE上分析细菌或哺乳动物来源的重组肾酶蛋白的稀释系列，并使用Ren1D 28-4抗体进行免疫印迹。如图16可见，通过该方法清楚地鉴别了任一种来源的重组蛋白。以这种方式，产生了对全长肾酶蛋白(SEQ ID NO.8或50或92或94)或者SEQ ID NO.1-7中所述的肽抗原特异的抗-肾酶抗体。
抗体对肾酶-1或肾酶-2特异
在本实施例中，对肾酶-1或肾酶-2特异性肽所产生的单克隆抗体对相关全长肾酶同工型显示出绝对特异性。对1D肽产生了抗体1D-28-4和1D-37-10，并因此它们应结合至肾酶-1和肾酶-2两者。对1F肽产生了抗体1F-42-7和1F-26-1(对于比对，参见图3)，并因此应仅对肾酶-1特异。对肽3A产生了抗体3A5-2，并因此应对肾酶-2特异。
将细菌表达的肾酶-1和2同工型在PBS中稀释至100ng/孔并结合至96孔微量滴定板。在33℃，用8％ NFDM在PBS中的溶液封闭板1小时。用抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-42-7、1F-26-1和3A5-2的稀释系列检测肾酶蛋白。抗体的起始浓度通常为1μg/mL，然后在含有0.05％的Tween-20的PBS(PBST)中进行两倍稀释步骤。在33℃培育1小时后，用PBST漂洗板三次。通过以50ng/mL，50μL/孔添加HRP-缀合的抗-兔IgG来测定抗体结合。将板在室温下培育40分钟。培育后，用PBST清洗板三次，并用PBS清洗1次。将HRP底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)加入至100μL/孔，并将板在室温下培育约5分钟。为了终止反应，将100μL 2N H2SO4加入至每个孔中。将板在分光光度计中，在450nm读数。
通过ELISA测定，抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-42-7和1F-26-1以浓度依赖性方式结合肾酶-1蛋白(图15)。然而，当在ELISA板测定上将相同抗体用于检测重组肾酶-2时，仅1D-28-4和1D-37-10显示出稳健的浓度-依赖性结合(图17)。在ELISA测定中观察到抗体3A5-2结合至肾酶-2同工型(图17)。因此，可以看出抗对应于一种或其它肾酶同工型的肽的抗体对于相关全长蛋白显示出特异性。
表位-特异性抗-肾酶抗体
合成用于免疫的肾酶肽，然后缀合至牛血清白蛋白(BSA)。将缀合的肽在PBS中稀释至100ng/孔并通过和4℃培育过夜结合至96孔微量滴定板。在用NFDM封闭后，用抗体的稀释系列检测BSA-缀合的肽。通过添加HRP-缀合的抗-兔IgG测定抗体结合。在HRP与底物TMB反应后，在分光光度计中，在450nm对板读数。对1D表位所产生的单克隆抗体1D28-4和1D37-10以浓度依赖性方式结合至1D-BSA蛋白(对于1D 28-4，图18实心圆；对于1D 37-10，空心圆)。然而，这些单克隆显示出对1F抗原非常差的结合(对于1D 28-4和1D 37-10，半填充菱形，插图)。对1F表位所产生的单克隆抗体1F 42-7和1F 26-1以浓度依赖性方式结合至1F-BSA蛋白(对于1F 26-1结合，实心正方形；对于1F 42-7结合，空心正方形)。然而，1F mAb显示出对1D肽非常差的结合(对于1F 26-1和1F 42-7，半填充圆形，插图)。在另一个实例中，对肽3A上的抗体3A5-2和肽1C上的抗体1C-22-1观察到了相同的表位-特异性。在另一个实例中，对肽1A、1B、1C、1D、1E、1F和3A所产生的全部纯化的多克隆抗体均特异性结合至相关BSA-肽融合体。
因此，对肾酶蛋白内的肽表位所产生的抗体的多个实例显示出绝对的表位特异性。在本文中显示并描述了两个表位的氨基酸组成和结合它们的单克隆抗体。
抗-肾酶抗体缀合
肾酶-特异性抗体可以缀合至将帮助抗体作为肾酶检测试剂或肾酶-定向治疗剂使用的多个实体。这些缀合可以在不干扰抗体的相对表位特异性或亲和力的情况下完成。缀合物的实例包括(但不限于)放射性离子、彩色、金属或荧光标记物、标签或毒素。在本发明的实例中，将抗-肾酶抗体缀合至维生素生物素。生物素是以极高亲和力结合至蛋白抗生物素蛋白、链霉亲和素及其变体的小型天然存在的维生素。通过生物素与抗体上的伯胺基之间的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯键完成缀合。可以通过透析除去过量未缀合的生物素。
在另一个实例中，在ELISA测定中观察到以这种方式缀合的抗-肾酶抗体维持了它们结合至肾酶蛋白的能力。将细菌表达的肾酶-1在PBS中稀释至100ng/孔并通过在4℃培育过夜结合至96孔微量滴定板。在用NFDM封闭后，从1μg/mL的浓度开始，通过生物素化的抗体的稀释系列检测肾酶蛋白。通过添加HRP-缀合的中性抗生物素蛋白测定结合的生物素化的抗体的存在。在HRP与底物TMB反应后，在分光光度计中，在450nm对板读数。生物素化的单克隆抗体1D 28-4(图19，实心圆)、1D 37-10(空心圆)、1F 42-7(实心三角形)和1F 26-1(空心三角形)以浓度依赖性方式结合至肾酶-1。
多个抗体可以竞争与肾酶上相同表位的结合
在本实施例中，单克隆和多克隆抗-肾酶抗体两者的多种组合显示彼此竞争对肾酶的结合。这显示了多个抗体的重叠表位。在另一个实例中，观察到多克隆抗体竞争两个不同的单克隆抗体，从而显示了该多克隆的多重表位特异性。将细菌表达的肾酶-1在PBS中稀释至100ng/孔并通过在4℃培育过夜结合至96孔微量滴定板。封闭后，通常从1μg/mL开始，用与不同生物素化的抗体混合的未缀合的抗体的稀释系列检测蛋白。生物素化的抗体的浓度保持恒定为125ng/孔。将两种抗体在PBST中混合在一起并作为50μL/孔的一次添加应用与预封闭的肾酶板。在33℃培育1小时后，通过以0.4ng/mL，50μL/孔添加HRP-缀合的中性抗生物素蛋白(HRP-NA)测定生物素化的抗体与肾酶的结合。添加HRP底物TMB以显示结合的生物素化的抗体。然后，将板在分光光度计中，在450nm读数。
当将生物素化的抗体与共有相同表位的未缀合的抗体培育时，通过信号降低显示抗-肾酶抗体的特异性。通过抗1D肽的单克隆抗体，在图20A中显示了一个实例。未缀合的1D28-4竞争生物素化的1D 37-10(实心圆，图20A)。类似地，抗1F肽的抗体还彼此之间竞争：未缀合的1F 42-7竞争生物素化的1F 26-1(实心三角形，图20A)。当与来自未免疫的兔的非缀合抗体一起培育时，来自生物素化的单克隆抗体的信号未降低(空心圆和三角形，图20A)。
在另一个实例中并且如图20B可见，显示抗全长肾酶-1的多克隆抗体E2930与生物素化的单克隆抗体1D 37-10、1F 26-1中的每一个以及两种生物素化的mAb的混合物竞争(实心圆，实心正方形和空心菱形，图20B)。另外，来自未免疫的兔的未缀合的抗体不竞争两种生物素化的抗体的混合物(实心三角形，图20B)。通过抗两种生物素化的单克隆抗体的多克隆抗体E2930所观察到的竞争表明这种多克隆抗体结合至肾酶多肽上的多个表位。
抗体以高亲和力和不同的结合动力学结合至肾酶
如果抗体要用于内原性蛋白的检测，则它必须对靶标显示出高亲和力。迄今为止，尚未对抗-肾酶抗体描述结合动力学。在本发明的实例中，在溶液结合测定中，多个抗-肾酶抗体显示出对全长肾酶具有低或亚纳摩尔的亲和力。将纯化的抗-肾酶抗体生物素化并结合至Biacore T100仪的抗生蛋白链菌素CM5传感器芯片上。在芯片表面上注入纯化的重组肾酶-1。使用25mM Tris pH 8、150mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油、0.005％Tween-20和0.1mg/mL BSA作为运行缓冲液，在25℃进行结合研究。可以以这种方式测量肾酶与固定化抗体的结合动力学。如图21可见并且如图22所总结的，抗体1D-28-4、1F-42-7、1D-37-10和1F-26-1均以高亲和力结合肾酶——值在2.67nM至0.316nM KD的范围内。在抗体之间观察到了宽泛的结合和解离速率范围，这表明了不同抗体组合物的不同属性。
在异种移植小鼠模型中，使用单克隆抗体m28-RNLS的抗-RNLS疗法显著抑制黑素 瘤肿瘤的生长(HollanderL等人,2016,Cancer Research,76(13):3884-94)
图23显示对RNLS所产生的两种单克隆抗体[克隆#28-4(m28-RNLS)、37-10(m37-RNLS)]降低了所测试的所有(总计5个)黑素瘤细胞系的存活力以及代表性的实施例。m28-RNLS证实细胞毒性水平的升高与处理浓度的升高相关(p<0.05，图24)。
对于体内研究，将A375.S2(人黑素瘤)细胞皮下注射至无胸腺裸鼠以产生肿瘤。一旦肿瘤达到～50mm3的体积，则用对照兔IgG或RNLS中和单克隆抗体m28-RNLS处理动物。总体上，在研究期间维持了动物的健康和活动，抗体治疗未显示出毒性。每隔一天测量肿瘤尺寸，并且通过m28-RNLS的治疗在所有测试点降低了肿瘤体积(p<0.05，图25)。在第11天，由于一些动物中的整体肿瘤尺寸和溃疡，将动物处死。通过细胞增殖标志物Ki67对来自异种移植肿瘤切片的IHC染色显示相对于用兔IgG处理的那些，用抗-RNLS抗体处理的肿瘤内细胞增殖显著降低：对照组中为35.1±2.3个阳性细胞/高倍视野，相对于RNLS Ab治疗组中的13.4±3.0，n＝14，p＝0.0004(图26)。为了测试抗-RNLS疗法在具有免疫能力的小鼠中的效力，将B16f10细胞(小鼠黑素瘤细胞系)皮下注入到C57BL/6小鼠中。一旦肿瘤达到～500mm3的体积，用对照兔IgG或RNLS中和单克隆抗体m28-RNLS处理动物，并且由于对照组非常大的肿瘤负荷，在第7天处死动物。如图27所示，与兔IgG相比，m28-RNLS施用导致肿瘤体积显著减小。
在异种移植小鼠模型中，使用单克隆抗体m28-RNLS的抗-RNLS疗法显著抑制胰腺 腺癌肿瘤的生长(Guo X等人,2016,Scientific Reports,6:22996)
基于它们的高结合亲和力(KD分别为0.316和2.67nM)，从兔中抗RP-220的单克隆抗体组中选择两个克隆m28-RNLS和m37-RNLS。通过图28、图29和图30中所示的代表性实施例显示了m28-RNLS、m37-RNLS和可商购的多克隆(抗RP-220部分序列)抗体对人胰腺腺癌细胞生长的抑制作用。
为了评价抑制抗体的治疗潜力，将BxPC3细胞皮下注入用对照兔IgG或者m28-RNLS处理的无胸腺裸鼠，并且测量肿瘤体积长达3周。如图31所示，与兔IgG相比，m28-RNLS治疗导致肿瘤体积显著减小。
使用m28-RNLS人源化变体的抗-RNLS疗法抑制肿瘤生长
将黑素瘤(人：SK-MEL-28，小鼠：YUMM1.7)和胰腺腺癌(人：BxPC3)细胞以5×104个细胞/孔的密度接种到6-孔培养平板中。使用台盼蓝测定确定细胞增殖和存活力等级。用PBS清洗细胞两次，胰蛋白酶化并用0.5％的台盼蓝染料染色。使用Bio-Rad TC10自动细胞计数器(Hercules,CA,USA)，评价每个样品中的细胞总数、活细胞总数和活细胞百分比。将所记录的数值用于确定增殖和存活力等级。
5种人源化m28变体(m28-K2、m2-K5、m28-K13、m28-K14和m28-K16，表2)显示与人和小鼠RNLS两者的结合升高(图32和图33)。这些m28变体还降低了人黑素瘤细胞系(SK-MEL-28)和胰腺腺癌(BxPC3)的存活力(图34和图35所显示的代表性实施例)，从而表明了m28变体在人癌症中的潜在治疗用途。
实施例2：序列
表1：用于M28和M42的人源化和亲和力成熟的寡核苷酸
表2：M28/M42和变体CDR
SEQ ID NO:218
M28-人源化Fv序列重链核苷酸
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAATCTGAGCAGCTTCGCCGTTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAATCATCAGCAGCGTTGGCATCACCCGCTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCAAAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCTATGGCTATAGCGGCGACGTGAACCGCCTGGACCTGTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
SEQ ID NO:219
M28-人源化Fv序列重链氨基酸(对M28 CDR和HC71移植加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLSSFAVHWVRQAPGKGLEWVAIISSVGITRYADSVKGRFTISKDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGYSGDVNRLDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:220
M28-人源化Fv序列轻链核苷酸
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGAGCGTGTATGACAACAACAACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGGCGCCAGCACCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCTGGGCGAATTCAGCTGCAGCAGCGCTGACTGCTTCGCCTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA
SEQ ID NO:221
M28-人源化Fv序列轻链氨基酸(对M28 CDR和HC71移植加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVYDNNNVAWYQQKPGKAPKLLIYGASTLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLGEFSCSSADCFAFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO:222
M42人源化Fv序列重链核苷酸
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACCTGACCACCTACGGCGTTCACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCACTGATCGGCGATCGCGGCACCACCTATTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCCGCGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTGCTCGCGGCAGCGGCTATGGCGCTCGCATCTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
SEQ ID NO:223
M42人源化Fv序列重链氨基酸(对M42 CDR和HC71移植加下划线)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNLTTYGVHWVRQAPGKGLEWVALIGDRGTTYYADSVKGRFTISRDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGYGARIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:224
M42人源化Fv序列轻链核苷酸
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGACCGTGTATAACAACAACTACGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGAAACCAGCAAACTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCCGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGGGCGGCTACAGCGGCGTGGACTTCATGGCTTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGA
SEQ ID NO:225
M42人源化Fv序列轻链氨基酸(对M42 CDR和HC71移植加下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVYNNNYVAWYQQKPGKAPKLLIYETSKLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGGYSGVDFMAFGQGTKVEIKR
本文所引用的每篇专利、专利申请和专利公开的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。尽管已参考具体实施方式公开了本发明，但是显然在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域其它技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化。所附权利要求旨在视为包括所有这些实施方式和等价变化。

Claims (16)

1.一种组合物，包含特异性结合至肾酶的抗体或其结合部分，其中所述抗体或其结合部分包含选自以下项的互补决定区(CDR)：
a)包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的LC CDR3；或
b)包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的LC CDR3；或
c)包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的LC CDR3；或
d)包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的LC CDR3；或
e)包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的LC CDR3；或
f)包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的LC CDR3；或
g)包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的LC CDR3；或
h)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:211的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:207的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的LC CDR3；或
i)包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列的HC CDR1，包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的HC CDR2，包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列的HC CDR3，包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的LC CDR1，包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的LC CDR2，和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的LC CDR3。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其结合部分以至少10-6M的亲和力特异性结合至肾酶。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其结合部分特异性结合包含选自由SEQ ID NO:1-8组成的组的氨基酸序列的肽。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述肾酶是人肾酶。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其结合部分选自由单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫缀合物、去岩藻糖基化抗体和双重特异性抗体组成的组。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述免疫缀合物包含治疗剂或检测部分。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其结合部分选自由人源化抗体、嵌合抗体、完全人抗体和抗体模拟物组成的组。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗体或其结合部分包含选自以下项的可变重(VH)链和可变轻(VL)链：
a.包含SEQ ID NO:223的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的VL；或
b.包含SEQ ID NO:219的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:221的氨基酸序列的VL。
9.一种分离的核酸分子，包含编码权利要求1-8中任一项所述的组合物中的抗体或其结合部分的氨基酸序列的序列，所述抗体或其结合部分特异性结合至肾酶。
10.一种包含权利要求9所述的核酸分子的表达载体。
11.一种包含权利要求9所述的核酸分子的细胞。
12.权利要求1至8中任一项所述的组合物在制备用于治疗对其有需要的受试者的疾病或病症的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，还包括应用至少一种其它试剂。
14.根据权利要求12或13所述的应用，其中所述疾病或病症是选自由肾病、心血管疾病、胰腺炎、肝炎、肾脏的炎症性病症和癌症组成的组中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述疾病或病症是癌症，并且所述癌症是胰腺癌或黑素瘤。
16.根据权利要求12所述的应用，其中所述受试者是人。
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