ES2333228T3 - Nuevas herramientas de expresion para aplicaciones multiproteicas. - Google Patents
Nuevas herramientas de expresion para aplicaciones multiproteicas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2333228T3 ES2333228T3 ES04803271T ES04803271T ES2333228T3 ES 2333228 T3 ES2333228 T3 ES 2333228T3 ES 04803271 T ES04803271 T ES 04803271T ES 04803271 T ES04803271 T ES 04803271T ES 2333228 T3 ES2333228 T3 ES 2333228T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vector
- cells
- site
- baculovirus
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 105
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 56
- 101100545229 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ZDS2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101100113084 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) mcs2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 101100167209 Ustilago maydis (strain 521 / FGSC 9021) CHS8 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 172
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 165
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 164
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 101
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 38
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 31
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 31
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 27
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 18
- 244000292604 Salvia columbariae Species 0.000 claims description 18
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 claims description 18
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 claims description 18
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 claims description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 16
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 8
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 5
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 claims description 2
- 101150008755 PCNA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 69
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 101150027376 chiA gene Proteins 0.000 description 23
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 18
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 17
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 17
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 16
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 15
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 14
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 11
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 11
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 11
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 9
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 9
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 7
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 101150038013 PIR gene Proteins 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 6
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 5
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000012750 in vivo screening Methods 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 4
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 4
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 3
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 3
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 3
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 3
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 2
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 108010045262 enhanced cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- -1 CAT Proteins 0.000 description 1
- 108010009575 CD55 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229940098006 multigen Drugs 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017822 negative regulation of protein modification process Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 108091006108 transcriptional coactivators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/70—Vectors containing special elements for cloning, e.g. topoisomerase, adaptor sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Polinucleótido para aplicaciones multigénicas, que comprende una disposición funcional según la figura I: comprendiendo dicha disposición: (a) por lo menos dos casetes de expresión: T1 - MCS1 - P1 y P2 - MCS2 - T2 en una disposición de cabeza con cabeza, cabeza con cola o cola con cola, comprendiendo cada uno un sitio de clonación múltiple MCS1 o MCS2, flanqueado por un promotor P1 y una secuencia de terminador T1 para MCS1 y flanqueado por un promotor P2 y una secuencia de terminador T2 para MCS2, (b) por lo menos un módulo de multiplicación M intermedio de los promotores P1 y P2 que comprende por lo menos dos sitios de restricción A y B, (c) por lo menos dos sitios de restricción X e Y, flanqueando cada uno uno de los casetes de expresión, en el que: (i) los sitios de restricción A y X, así como B e Y son compatibles, pero (ii) los productos de ligación de AY y de BX no son divididos enzimáticamente por los enzimas de restricción a, b, x o y, específicos para los sitios de restricción A, B, X e Y, e (iii) los sitios de restricción A y B, así como X e Y no son compatibles.
Description
Nuevas herramientas de expresión para
aplicaciones multiproteicas.
La presente invención se refiere a
polinucleótidos para aplicaciones multigénicas, que comprende una
nueva disposición funcional, así como vectores, células huésped y
animales recombinantes que comprenden dichos polinucleótidos.
Asimismo, la presente invención se refiere a
procedimientos para generar casetes de expresión multigénica,
procedimientos para producir complejos multiproteicos in
vitro e in vivo, y procedimientos para producir una
vacuna.
Además, la presente invención comprende
procedimientos para cribar interacciones entre complejos de
proteínas o modificaciones de proteínas, y procedimientos para el
cribado in vitro o in vivo de compuestos candidatos
que pueden presentar entre complejos de proteínas o de
modificaciones de proteínas, o capaces de inhibir interacciones
entre complejos de proteínas o de inhibir modificaciones de
proteínas.
Además, la presente invención se refiere a la
utilización de los polinucleótidos, vectores, células huésped o
animales recombinantes de la invención para: (i) la preparación de
un medicamento para la terapia génica, (ii) la producción
recombinante de complejos multiproteicos, (iii) la producción de una
vacuna, o (iv) el cribado de compuestos de interés.
Finalmente, e igualmente importante, la
invención se refiere a un kit de partes que comprende por lo menos
un polinucleótido, un vector y/o una célula huésped según la
invención.
La identificación de nuevos complejos
multiproteicos en las células eucarióticas se ha acelerado
considerablemente, en particular debido a la aparición del análisis
genómico de las interacciones proteína-proteína, a
la introducción de potentes procedimientos de purificación de
proteínas de afinidad múltiple y al desarrollo de técnicas
analíticas ultrasensibles. Basándose en búsquedas exhaustivas de
dos híbridos, se ha estimado que el número de parejas de
interacción para una proteína determinada de la levadura de
panadería es de entre cinco y ocho (Schwikowski et al., A
network of protein-protein interactions in yeast,
Nat. Biotechnol. 18:1257-1261, 2000; Bader et
al., Analyzing protein-protein interaction data
obtained from different sources, Nat. Biotechnol.
20:991-997, 2002; Von Mering et al.,
Comparative assessment of large-scale data sets of
protein-protein interacions, Nature
417:399-403, 2002; Grigoriev, A., On the number of
protein-protein interacions in the yeast proteome,
Nucleic Acids Res. 31:4157-4161, 2003). De esta
manera, ha surgido el concepto de la célula como una colección de
máquinas proteicas multicomponente, con una proteína para
esencialmente cada proceso importante. Lo expuesto anteriormente
plantea retos significativos para las tecnologías de producción de
proteínas centradas en estudios moleculares de tipo estructural y
funcional de los complejos multiproteicos eucarióticos, debido a que
las cantidades intracelulares típicamente son refractarias a la
extracción a gran escala a partir de la fuente.
Se han utilizado vectores policistrónicos
portadores de varios genes que codifican componentes de complejos
multiproteicos para casos seleccionados de administración en la
terapia génica (De Felipe, P., Polycistronic viral vectors, Curr.
Gene Ther. 2:355-378, 2002; Planelles, V., Hybrid
lentivirus vectors, Methods Mol. Biol. 229:273-284,
2003). Recientemente se ha utilizado un vector policistrónico para
la expresión de un complejo de factor transcripcional compuesto de
cuatro subunidades en E. coli (Selleck et al., A
histone fold TAF octamer within the yeast TFIID transcriptional
coactivator, Nat. Struct. Biol. 8:695-700, 2001).
Los constructos de ADN en estos estudios se generaron mediante
procedimientos convencionales utilizando endonucleasas y ligasa.
Sin embargo, los complejos de proteínas en los eucariotas con
frecuencia contienen diez o más subunidades con polipéptidos
individuales de tamaños variables, de hasta varios cientos de kDa,
lo que limita severamente la aplicabilidad de las estrategias
convencionales de clonación y en gran parte descarta a E.
coli como sistema huésped útil para la expresión de proteínas
heterólogas.
Los baculovirus recombinantes resultan
particularmente atractivos para la producción de nivel elevado de
conjuntos grandes de proteínas (O'Reilly et al., Baculovirus
expression vectors. A laboratory manual. Oxford Press, New York,
1994). Los genes regulados por promotores tardíos del virus de la
polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNVP) con
frecuencia se expresan abundantemente, se procesan fielmente y se
direccionan a su compartimiento celular apropiado. Incluso
partículas de arquitectura compleja, tales como las estructuras de
cápside, se han ensamblado con éxito en células de insecto
utilizando el sistema baculovirus (Roy et al., Baculovirus
multigene expression vectores and their use for understanding the
assembly process of architecturally complex virus particles, Gene
190:119-129, 1997). La expresión de varios genes en
una célula puede conseguirse mediante coinfección con virus que
transportan un gen foráneo cada uno. Sin embargo, este enfoque
inevitablemente conduce a considerables variaciones en los niveles
de producción de las proteínas individuales como resultado de la
varianza estadística entre células infectadas en la estequiometría
vírica. Una alternativa mejor es la infección con un baculovirus
que contenga todos los genes heterólogos seleccionados (Roy et
al., ver anteriormente; Bertolotti-Ciarlet
et al., Immunogenicity and protective efficacy of rotavirus
2/6-virus-like particles produced
by a dual baculovirus expression vector and administered
intramuscularly, intranasally, or orally to mice, Vaccine
21:3885-3990, 2003). Lo expuesto anteriormente
resulta posible debido a la naturaleza flexible de la cubierta de
AcNVP, que permite alojar inserciones de ADN de gran tamaño en el
genoma circular de 130 kb de ADNds. Tradicionalmente, la generación
de baculovirus recombinante se lleva a cabo en dos etapas. En
primer lugar se clonan los genes foráneos en un vector de
transferencia de tamaño reducido propagado en E. coli y
después se insertan en el genoma de baculovirus, de gran tamaño,
mediante recombinación homóloga en células de insecto en una
reacción que proporciona progenie recombinante al 30%-80% en el caso
de que se utilice ADN vírico parental linearizado (O'Reilly et
al., ver anteriormente). Este procedimiento se simplificó
sustancialmente mediante la introducción de un vector lanzadera
baculovírico (bácmido bMON14272) propagado en E. coli
(Luckow et al., Efficient generation of infectious
recombinant baculoviruses by site-specific
transposon-mediated insertion of foreign genes into
a baculovirus genome propagated in E. coli, J. Virol.
67:4566-4579, 1993). El bácmido contiene el sitio de
unión de Tn7 para la transposición de genes foráneos procedentes de
un vector de transferencia
(Bac-to-Bac^{TM}, Invitrogen)
(Luckow et al., ver anteriormente;
Bac-to-Bac^{TM} Baculovirus
Expression Systems Manual, Invitrogen, Life Technologies
Incorporated, 2000). Para la coexpresión se introdujo un vector de
transferencia bicistrónico, pFastBac^{TM} Dual, que contenía los
promotores víricos tardíos polihedrina (polh) y p10 en dos casetes
de expresión separados con conjuntos de sitios de restricción
destinados a la subclonación secuencial de dos genes
foráneos.
foráneos.
Para la producción de complejos multiproteicos
que contienen subunidades grandes y además muchas subunidades,
todavía existe una fuerte necesidad de vectores de transferencia que
permitan ensamblar genes de una manera modular no secuencial, para
aliviar las limitaciones impuestas por la escasez de sitios de
restricción útiles en una colección de secuencias codificantes,
cada una de las cuales comprende varios miles de pares de bases.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar nuevas herramientas y
procedimientos para la generación rápida y flexible de complejos
multiproteicos.
También existe una necesidad de nuevas
herramientas y procedimientos para producir complejos multiproteicos
de diez o más subunidades con polipéptidos individuales de tamaños
de hasta varios cientos de kDa.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar nuevas herramientas y procedimientos para generar
complejos multiproteicos grandes con muchas subunidades y
simultáneamente minimizar los requisitos de sitios de restricción
únicos.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar un sistema altamente flexible de producción de
complejos multiproteicos en el que las secuencias codificantes de
subunidades individuales pueden sustituirse de manera modular,
evitando la regeneración de novo del conjunto completo de
secuencias codificantes.
También existe una necesidad de herramientas y
procedimientos en los que resulte posible el intercambio modular
sencillo de promotores específicos de organismo, de tejido o de tipo
celular, para producir recombinantemente un complejo multiproteína
particular en diversos organismos, eucarióticos (de mamífero,
levadura, etc.) y procarióticos, o bajo condiciones seleccionadas
(por ejemplo etapas tempranas, tardías o muy tardías de la
infección vírica de una célula huésped, etc.).
La solubilidad y actividad de las macromoléculas
biológicas con frecuencia se encuentra comprometida en casos de
producción y purificación aislada de los componentes
interaccionantes, y en estos casos la reconstitución en condiciones
in vitro no genera datos fisiológicamente significativos. Por
lo tanto, para investigar interacciones entre complejos
macromoleculares existe una necesidad de sistemas potentes y
expandibles que permitan la coexpresión de dos o varios complejos
de proteínas idealmente en una sola célula, consistiendo cada uno
de varios componentes.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer aspecto, el objetivo anteriormente
indicado se consigue proporcionando un nuevo polinucleótido para
aplicaciones multigénicas que comprende una disposición funcional
según la fig. I;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
comprendiendo dicha
disposición:
- (a)
- por lo menos dos casetes de expresión \underbar{T1 - MCS1 - P1} y \underbar{P2 - MCS2 - T2} en disposición de cabeza con cabeza, de cabeza con cola o de cola con cola, comprendiendo cada uno un sitio de clonación múltiple MCS1 o MCS2, flanqueado MCS1 por un promotor P1 y una secuencia terminadora T1, y flanqueado MCS2 por un promotor P2 y una secuencia terminadora T2,
- (b)
- por lo menos un módulo de multiplicación M entre los promotores P1 y P2, que comprende por lo menos 2 sitios de restricción A y B,
- (c)
- por lo menos dos sitios de restricción X e Y, cada uno flanqueando uno de los casetes de expresión,
en los que:
- (i)
- los sitios de restricción A y X y B e Y son compatibles, aunque:
- (ii)
- los productos de ligación de AY y de BX no resultan divididos enzimáticamente por los enzimas de restricción a, b, x o y, específicos para los sitios de restricción A, B, X e Y, y
- (iii)
- los sitios de restricción A y B, así como X e Y, no son compatibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido según la invención puede ser
un ADN, un ARN, o un polinucleótido que comprende uno o más
análogos sintéticos de nucleótido, preferentemente un ADN, más
preferentemente un ADN de doble cadena.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "casete de expresión" debe interpretarse que se
refiere a un fragmento de ADN que contiene una secuencia de
promotor utilizada para reclutar la maquinaria de transcripción del
ADN, seguido de un oligonucleótido codificante de una secuencia de
señal para reclutar la maquinaria de traducción del ARN (por
ejemplo la secuencia de consenso Kozak en eucariotas o la secuencia
Shine-Dalgarno en procariotas), seguido de una
secuencia oligonucleótida que contiene por lo menos una secuencia de
ADN dividida por un enzima de restricción (sitio de clonación
múltiple MCS) que se utilizará para la inserción de fragmentos de
ADN codificantes de productos génicos de elección, y una secuencia
de terminador que dirige los procesos relacionados con el final de
la transcripción y la modificación del transcrito de ARN (por
ejemplo la poliadenilación en eucariotas).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "módulo de multiplicación" hace referencia a un
conjunto de fragmentos de ADN situados en el exterior de los
casetes de expresión y/o entre casetes de expresión, que permite la
combinación iterativa de varios o muchos casetes de expresión.
Los sitios de restricción compatibles son sitios
de restricción que, al ser divididos por enzimas afines, resultan
en regiones monocatenarias protuberantes o recesivas de ADN de igual
longitud de nucleótidos que son cohesivas, es decir, que pueden
hibridarse entre sí mediante apareamiento de bases complementarias
de Watson-Crick, y que de esta manera pueden ser
nuevamente unidas por ligasas, proporcionando una molécula de ADN
funcional unida covalentemente. Alternativamente, los sitios de
restricción que al dividirse resultan en fragmentos de ADN de
extremos romos, también son compatibles, es decir, pueden ser
nuevamente unidas por ligasas proporcionando moléculas de ADN
funcional covalentemente unidas.
Son ejemplos no limitativos de endonucleasas de
restricción que producen extremos protuberantes compatibles:
SpeI/AvrII; AgeI/XmaI/SgrA; BamHI/BgIII; BsrGI/BanI; EagI/NotI;
EcoRI/MfeI; NdeI/AseI; NheI/XbaI; PstI/NsiI; SalI/XhoI.
Son ejemplos no limitativos de endonucleasas de
restricción que producen extremos romos compatibles, es decir
pueden ligarse entre sí todas las combinaciones, las endonucleasas
siguientes: BstZ17I, EcoRV, FspI, HpaI, MluNI, PmeI, ScaI, SnaBI,
StuI, XmnI.
Las expresiones "cabeza con cabeza",
"cabeza con cola" y "cola con cola" definen la disposición
relativa de los promotores y terminadores de los casetes de
expresión individuales. Por ejemplo, T1-T2 es una
disposición "cola con cola", P1-P2 es una
disposición "cabeza con cabeza" y P1/P2-T2/T1
es una disposición "cabeza con cola". Debe apreciarse que la
fig. 1 muestra una disposición cabeza con cabeza y que,
evidentemente, diferentes disposiciones en las que el sitio de
multiplicación M se encuentra entre casetes de expresión y los
sitios de restricción X e Y flanquean, cada uno, los límites
exteriores de los casetes de expresión de la disposición de la fig.
1 se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención.
Preferentemente los dos o más casetes de
expresión se disponen en una disposición de "cabeza con
cabeza".
En una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a polinucleótidos, en los que los
sitios de restricción A y B en el módulo de multiplicación M se
seleccionan de entre el grupo que consiste en BstZ17I, SpeI, ClaI y
NruI o enzimas de restricción que presentan sitios de división
idénticos a los de dichos enzimas ("isoesquizómeros").
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a polinucleótidos, en los que los
sitios de restricción X e Y se seleccionan de entre el grupo que
consiste en PmeI y AvrlI o enzimas de restricción que presentan
sitios de división idénticos a los de dichos enzimas
("isoesquizómeros").
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a polinucleótidos, en los que los
promotores P1 y P2 se seleccionan de entre el grupo que consiste en
los promotores baculovíricos muy tardíos polh, p10 y p_{XIV}, el
promotor baculovírico tardío vp39, el promotor baculovírico híbrido
tardío/muy tardío vp39polh, promotores baculovíricos tempranos
P_{cap/polh}, pcna, etl, p35, egt,
da26; CMV, SV40, UbC, EF-1\alpha, RSVLTR,
MT, P_{DS47}, Ac5, P_{GAL} y P_{ADH}.
Además, una forma de realización preferida de la
presente invención se refiere a polinucleótidos, en los que las
secuencias de terminador T1 y T2 se seleccionan de entre SV40, HSVtk
o BGH (hormona del crecimiento bovina).
Además de la disposición funcional en la fig. 1,
resulta preferido que un polinucleótido de la presente invención
comprenda además por lo menos un sitio para su integración en un
vector o célula huésped. Dicho sitio de integración permitirá la
incorporación genómica o transitoria conveniente del polinucleótido
en vectores y células huésped. Los sitios de integración para la
incorporación genómica resultan más preferentes.
Resultan particularmente preferidos los
polinucleótidos, en los que el sitio de integración es compatible
para la integración del polinucleótido en un virus seleccionado de
entre el grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociado
(AAV), parvovirus autónomo, virus del herpes simplex (HSV),
retrovirus, radinovirus, virus Epstein-Barr,
lentivirus, virus del bosque de Semliki y baculovirus.
Resultan más preferidos los polinucleótidos
según la invención en los que el sitio de integración es compatible
para la integración del polinucleótido en un baculovirus.
El sistema de expresión baculovirus ha sido muy
utilizado para la expresión de proteínas recombinantes en células
de insecto. Recientemente se han utilizado con éxito vectores
baculovíricos recombinantes manipulados para que contengan
elementos promotores activos en células de mamífero para la
administración génica transitoria y estable en un amplio espectro
de líneas celulares primarias y establecidas de mamífero. También se
ha demostrado la aplicabilidad de los baculovirus modificados en la
administración génica in vivo. En contraste con otros
vectores víricos utilizados comúnmente, los baculovirus presentan la
propiedad única de replicarse en células de insecto, no pudiendo
iniciar un ciclo de replicación y produciendo virus infecciosos en
células de mamífero. Los virus pueden manipularse fácilmente,
pueden alojar inserciones grandes de ADN foráneo, inician un efecto
citopático microscópicamente observable reducido o nulo en células
de mamífero y presentan un buen perfil de seguridad biológica (Kost
et al., Recombinant baculoviruses as mammalian cell
gene-delivery vectors, Trends in Biotechnology
20(4), abril de 2002). Estos atributos implican que los
baculovirus resultan particularmente útiles para la práctica de la
presente invención.
En una forma de realización más preferida,
dicho/s sitio o sitios de integración opcionalmente comprendidos en
el polinucléotido de la presente invención se seleccionan de entre
el grupo que consiste en los elementos del transposón Tn7, los
sitios de unión específicos de la integrasa \lambda y las SSR
(recombinasas específicas de sitio), preferentemente el sitio de
recombinación específico cre-lox (LoxP) o el sitio
de recombinación específico de la recombinasa FLP (FRT).
Preferentemente, el sitio o sitios de
integración son compatibles para la integración del polinucleótido
en una célula huésped eucariótica seleccionada de entre el grupo
que consiste en células de mamífero, preferentemente humanas;
células porcinas, preferentemente CPK, FS-13,
PK-15; células bovinas, preferentemente MDB, BT;
células ovinas, preferentemente FLL-YFT; C.
elegans; células de levadura, preferentemente S.
cerevisiae, S. pombe, C. albicans, P.
pastoris, y células de insecto.
Para las células huésped humanas, el sitio de
integración preferentemente es compatible para la integración del
polinucleótido en una célula huésped seleccionada de entre el grupo
que consiste en células HeLa, Huh7, HEK293, HepG2,
KATO-III, IMR32, MT-2, células
\beta pancreáticas, queratinocitos, fibroblastos de médula ósea,
células de CHP212, células neurales primarias, células W12,
SK-N-MC, Saos-2,
WI38, hepatocitos primarios, células FLC4, 143TK-,
DLD-1, fibroblastos pulmonares embrionarios
derivados de feto humano, fibroblastos primarios de prepucio,
células de osteosarcoma Saos-2, y células MRC5 y
MG63.
Para las células huésped de insecto, el sitio de
integración preferentemente es compatible para la integración del
polinucleótido en una célula huésped seleccionada de entre el grupo
que consiste en células de S. frugiperda, más
preferentemente células Sf9, Sf21, Express Sf+, células High Five H5
y células de D. melanogaster, más preferentemente células
Schneider S2.
En una forma de realización preferida, el
polinucleótido según la invención comprende además uno o más
marcadores de resistencia para seleccionar las células huésped que
presentan las propiedades deseadas, basándose en la resistencia de
las mismas a sustancias tóxicas. Más preferentemente, dichos
marcadores de resistencia se seleccionan de entre los marcadores de
resistencia a ampicilina, cloranfenicol, gentamicina,
espectinomicina y canamicina.
En el caso de que se desee una célula huésped
procariótica para incorporar un nucleótido de la presente invención,
resulta preferido que el polinucleótido según la invención
comprenda además un origen de replicación condicional R6K\gamma
para que la propagación dependa del gen pir en un huésped
procariótico.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización muy preferida, el
polinucleótido según la invención comprende:
- (a)
- promotores P1 y P2, seleccionados de entre polh y p10,
- (b)
- secuencias de terminador, seleccionadas de entre SV40 y HSVtk,
- (c)
- sitios de restricción A y B en el módulo de multiplicación M, seleccionados de entre el grupo que consiste en BstZ171, SpeI, ClaI y NruI,
- (d)
- sitios de restricción X e Y, seleccionados de entre el grupo que consiste en PmeI y AvrlI,
- (e)
- sitios para la integración vírica, seleccionados del sistema de recombinación cre-lox y Tn7.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un vector que comprende una secuencia de polinucleótido
según la presente invención.
En una forma de realización preferida, dicho
vector se selecciona de entre el grupo que consiste en plásmidos,
vectores de expresión y vectores de transferencia.
Dichos vectores resultan útiles para la
incorporación de elementos de ADN heterólogo, preferentemente genes.
Dichos vectores pueden ser vectores de expresión o vectores de
transferencia, preferentemente útiles para la transferencia de
genes eucarióticos, y la transferencia génica mediada por vectores
transitorios o víricos.
Más preferentemente, dicho vector es un plásmido
o un virus.
En una forma de realización específicamente
preferida, dicho virus se selecciona de entre el grupo que consiste
en adenovirus, virus adenoasociado (AAV), parvovirus autónomo, virus
del herpes simplex (HSV), retrovirus, radinovirus, virus
Epstein-Barr, lentivirus, virus del bosque de
Semliki y baculovirus.
En una forma de realización todavía más
preferida, el vector de la presente invención es un vector de
expresión baculovirus.
Al manipular los vectores de expresión
baculovirus, inesperadamente se encontró que la ruptura funcional de
dos genes baculovíricos, v-cath y
chiA, conducía a un mantenimiento mejorado de los
compartimientos celulares durante la infección y la expresión de
las proteínas. La calidad de las proteínas producidas mediante
dicho nuevo sistema baculovirus mejoró significativamente mediante
la reducción de la actividad proteolítica dependiente del virus y
la reducción de la lisis celular.
Por lo tanto, en un aspecto diferente, la
presente invención también se refiere a baculovirus en general, en
los que los dos genes baculovíricos v-cath y
chiA se alteran funcionalmente.
En una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un vector baculovirus según la
invención, en el que los dos genes baculovíricos
v-cath y chiA son alterados
funcionalmente.
Preferentemente, los vectores según la presente
invención comprenden además un sitio para las SSR (recombinasas
específicas de sitio), preferentemente LoxP para la recombinación
específica de sitio cre-lox.
Más preferentemente, el sitio
cre-lox se encuentra situado en uno o en ambos genes
baculovíricos v-cath y chiA y altera
la función de los mismos.
En otra forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a vectores que comprenden un elemento
transposón, preferentemente el sitio de unión Tn7.
Preferentemente, dicho sitio de unión se
encuentra situado dentro de un gen marcador. De esta manera, puede
evaluarse el éxito de la integración mediante transposición
utilizando el gen marcador.
Más preferentemente, el gen marcador se
selecciona de entre el grupo que consiste en luciferasa,
\beta-gal, CAT, genes codificantes de proteína
fluorescente, preferentemente GFP, BFP, YFP, CFP y variantes de las
mismas y el gen lacZ\alpha. Las variantes de los genes
marcadores son las que presentan diferencias de secuencias
inferiores a 30%, preferentemente inferiores a 20%, más
preferentemente inferiores a 10%, aunque conservan sustancialmente
propiedades funcionales de marcador iguales a la del gen marcador
original.
En una forma de realización más preferida, el
vector de la presente invención presenta la secuencia según SEC ID
nº 1 (pFBDM). Ver también la fig. 2.
En otra forma de realización todavía más
preferida, el vector de la presente invención presenta la secuencia
según SEC ID nº 2 (pUCDM). Ver también la fig. 3.
A continuación, se ejemplifican los vectores
según la presente invención haciendo referencia a los vectores
baculovíricos más preferentes pFBDM y pUCDM. Sin embargo, la
descripción siguiente de dichos vectores específicos de la presente
invención no debe interpretarse como limitativa del alcance de la
invención.
Los nuevos vectores de transferencia baculovirus
preferidos mencionados anteriormente se construyeron específicamente
para aplicaciones multigénicas. Dichos vectores comprenden ADN
baculovírico receptor manipulado para una producción de proteínas
mejorada, y proporcionan un procedimiento simple y rápido para
integrar genes mediante dos sitios de acceso (attTn7 y LoxP) en
dicho ADN baculovírico en células de E. coli adaptadas con
dicho fin.
Los vectores según la presente invención
permitirán elucidar las redes de interacción de proteínas (el
interactoma). Debido a que muchos de los complejos multiproteicos
identificados no se encuentran presentes en cantidades suficientes
en sus células nativas para el análisis biológico molecular
detallado, el estudio de dichos complejos depende de tecnologías
recombinantes para la producción a gran escala de proteínas
heterólogas. En la actualidad los procedimientos de expresión
recombinante requieren una inversión desproporcionada tanto en horas
de trabajo como en materiales antes de la expresión de las
multiproteínas, y tras la expresión no proporcionan flexibilidad
para alterar rápidamente los componentes multiproteína para estudios
revisados de la expresión.
Los vectores de la presente invención, en
particular los sistemas de expresión baculovirus según la invención,
facilitan y aceleran inmensamente la expresión de
multiproteínas.
Los vectores de transferencia de la invención,
en particular pFBDM y pUCDM, que contienen un módulo de
multiplicación, facilitan mucho la combinación modular de genes
heterólogos con requisitos mínimos de sitios de restricción únicos.
Los promotores víricos (por ejemplo los promotores muy tardíos p10 y
polh) en estos vectores pueden intercambiarse por otras secuencias
de promotor (temprano, tardío) en caso necesario. De manera similar,
pueden sustituirse las secuencias de terminador (en la actualidad
SV40, HSVtk).
La utilización de vectores baculovíricos con
genes v-cath y chiA funcionalmente
alterados permite un mantenimiento mejorado de los compartimientos
celulares durante la infección y producción de proteínas. La
calidad de las proteínas producidas mediante dicho sistema vector
mejoró significativamente mediante la reducción de la actividad
proteolítica dependiente del virus y la reducción de la lisis
celular.
Además, los vectores según de la presente
invención proporcionan un protocolo completamente nuevo para la
generación combinatorial rápida de ADN recombinante, preferentemente
ADN baculovírico, mediante el acceso al genoma del vector a través
de dos sitios específicos.
Además de un sitio de transposón Tn7, se
introdujo una secuencia LoxP en un sitio separado en el
genoma baculovírico que podía aceptar casetes de expresión
multigénica desde el plásmido pUCDM mediante recombinación
específica de sitio. Se desarrolló un protocolo para llevar a cabo
la transposición de Tn7 (procedente de derivados de pFBDM que
portaban casetes multigénicos) y la recombinación específica de
sitio de LoxP (procedente de derivados de pUCDM que portaban
casetes multigénicos) de manera eficiente en una única etapa en
E. coli. Estos protocolos pueden utilizarse no sólo para
integrar casetes multigénicos con secuencias codificantes de
subunidades de complejo multiproteína en vectores (por ejemplo
vectores baculovirus), sino también para integrar enzimas
específicos (quinasas, acetilasas, etc.) que modifiquen las
proteínas que se investigan (ver la fig. 1 para una ilustración
adicional).
El vector de transferencia pFBDM contiene dos
casetes de expresión en disposición de cabeza con cabeza, que
presentan múltiples sitios de clonación MCS1 y MCS2 flanqueados por
promotores polh o p10 y secuencias de señal poliA SV40 o HSVtk,
respectivamente. El módulo de multiplicación M se encuentra situado
entre las secuencias de promotor. Las secuencias utilizadas para la
transposición de Tn7 (Tn7L y Tn7R) comprenden los casetes de
expresión y un marcador de resistencia a la gentamicina (ver la fig.
2 para más detalles).
El vector de transferencia pUCDM presenta un
casete de expresión idéntico que incluye un módulo de
multiplicación, al igual que pFBDM. Este casete de expresión se
encuentra flanqueado por una repetición invertida de LoxP. El
vector pUCDM contiene un marcador de resistencia al cloranfenicol y
un origen de replicación condicional R6K\gamma que provoca que su
propagación dependa de la expresión del gen pir en el huésped
procariótico (ver la fig. 3 para más detalles).
Los vectores pFBDM y pUCDM resultan
particularmente adecuados para generar casetes de expresión
multigénica gracias al módulo de multiplicación insertado entre los
dos promotores. La lógica de la multiplicación se ilustra en la
fig. 4. El único requisito previo para ensamblar casetes de
expresión multigénica es que los enzimas de restricción utilizados
para la multiplicación (por ejemplo PmeI, AvrlI, SpeI y BstZ17I o
NruI) sean únicos, lo que puede conseguirse fácilmente, por ejemplo
mediante mutagénesis sitio-dirigida antes del
ensamblaje de los casetes multigénicos. Los genes se clonan en MCS1
y MCS2 de pFBDM. A continuación, se extrae el casete de expresión
completo mediante digestión con PmeI y AvrlI. El fragmento
resultante se introduce en el módulo de multiplicación de un
derivado de pFBDM que contiene grupos adicionales de genes, mediante
sitios SpeI/BstZ17l o SpeI/NruI (SpeI produce un extremo cohesivo
compatible con AvrlI, mientras que BstZ17l, NruI y PmeI generan
extremos romos en el corte). Los sitios de restricción implicados se
eliminan durante el procedimiento y la multiplicación puede
repetirse iterativamente utilizando el módulo presente en el casete
insertado. La misma lógica resulta aplicable también a la generación
de derivados de pUCDM con casetes de expresión multigénica. Además,
las secuencias de promotor y de terminador pueden modificarse
fácilmente si se desea utilizando sitios de restricción apropiados
en dichos vectores. Ver la fig. 4 para más detalles.
Además, se modificó el genoma de baculovirus
para obtener propiedades de producción de proteína mejoradas. Se
alteraron dos genes baculovíricos, v-cath y
chiA, conduciendo a un mantenimiento mejorado de los
comportamientos celulares durante la infección y la producción de
proteínas. El gen v-cath codifica una
proteasa vírica, V-CATH, que se activa al morir la
célula mediante un proceso que depende de un gen contiguo en el ADN
vírico, chiA, que codifica una quitinasa. Se alteraron ambos
genes para eliminar la actividad de V-CATH y ganar
la opción de utilizar cromatografía de afinidad por la quitina para
la purificación sin interferencia del producto del gen chiA.
La calidad de las proteínas producidas por el baculovirus MultiBac
resultó significativamente mejorada mediante la reducción de la
actividad proteolítica dependiente de virus y la lisis celular
reducida. En sustitución de la secuencia de ADN vírico alterada, se
introdujo una secuencia LoxP para la recombinación específica de
sitio de cre-lox. Ver la fig. 5 para más
detalles.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "MultiBac" es sinónimo de la forma de realización
ejemplificativa y preferida de dicho vector vírico baculovirus, es
decir, un genoma modificado de baculovirus que no presenta los
genes v-cath y chiA. Además,
"MultiBac" en el contexto de "sistema MultiBac"
comprendida dicho vector vírico baculovirus modificado, así como
los tipos celulares de E. coli derivados de la cepa
DH10\alpha que contienen dicho vector baculovírico
(DH10MultiBac^{ET}, DH10MultiBac^{Cre}, etc.), conjuntamente con
los factores necesarios para llevar a cabo las reacciones de
recombinación indicadas en la presente memoria (transposición de
Tn7, recombinación específica de sitio) y además los vectores
ejemplificativos y preferidos, pFBDM y pUCDM, según la presente
invención.
Todos los vectores según la presente invención,
en particular los vectores de transferencia preferidos pFBDM y
pUCDM, resultan útiles para introducir complejos multiproteicos en
células huésped.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una célula huésped que comprende un polinucleótido y/o un
vector según la invención.
Las células huésped preferidas para la practica
de la invención son las seleccionadas de entre el grupo que
consiste en células de mamífero, preferentemente células humanas,
células de roedor, células porcinas, células bovinas, células
ovinas, células de C. elegans, células de levadura, células
de insecto y células de E. coli.
Las células de levadura preferentes para la
práctica de la invención son: S. cerevisiae, S. pombe,
C. albicans y P. pastoris.
Las células de E. coli preferidas para la
práctica de la invención son las células Top10, DH5\alpha,
DH10\alpha, HB101, TG1, BW23473, BW23474.
Las células de insecto preferentes para la
práctica de la invención son las células de S. frugiperda,
preferentemente Sf9, Sf21, Express Sf+ o High Five H5, y las células
de D. melanogaster, preferentemente las células Schneider
S2.
Las células humanas preferentes para la práctica
de la invención se seleccionan de entre el grupo que consiste en
células HeLa, Huh7, HEK293, HepG2, KATO-III, IMR32,
MT-2, células \beta pancreáticas, queratinocitos,
fibroblastos de médula ósea, CHP212, células neurales primarias,
W12, SK-N-MC,
Saos-2, WI38, hepatocitos primarios, FLC4, 143TK-,
DLD-1, fibroblastos pulmonares embrionarios
derivados de feto humano, fibroblastos primarios de prepucio,
células de osteosarcoma Saos-2, MRC5 y MG63.
Evidentemente las células que comprenden un
polinucleótido y/o un vector según la presente invención en modo
alguno se encuentran limitadas a células o tejidos celulares
aislados.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere asimismo a un animal recombinante no humano que comprende
una secuencia polinucleótido y/o un vector según la invención.
Dichos animales recombinantes no humanos
resultan útiles para elucidar el papel de los complejos
multienzimáticos o para cribar compuestos para actividades
biológicas in vivo.
Preferentemente, los animales no humanos según
la invención se seleccionan de entre los mamíferos, preferentemente
roedores, porcinos y bovinos, C. elegans, e insectos,
preferentemente S. frugiperda y D. melanogaster.
Las herramientas de la presente invención, es
decir, los polinucleótidos, vectores, células huésped y animales
recombinantes, permiten la combinación modular conveniente, rápida y
simple de genes heterólogos con requisitos mínimos de sitios de
restricción únicos.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un procedimiento para generar casetes de expresión
multigénica, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- clonación de uno o más genes en MCS1 y/o MCS2 de un primer vector según la invención,
- (b)
- clonación de uno o más genes en MCS1 y/o MCS2 de un segundo vector según la invención,
- (c)
- extracción de la disposición funcional completa en los sitios de restricción X e Y en el primer vector de transferencia,
- (d)
- corte del segundo vector de transferencia en el módulo de multiplicación M,
- (e)
- ligación de la disposición funcional extraída de la etapa (c) en el sitio de multiplicación del segundo vector de la etapa (d), produciendo de esta manera un tercer vector de transferencia que presenta el módulo de multiplicación del primer vector de transferencia y casetes de expresión de tanto el primer como el segundo vector, y
- (f)
- opcionalmente repetición de las etapas (a) a (e) para ensamblar un vector de transferencia con múltiples casetes de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, los sitios de restricción X e Y
en la etapa (c) son PmeI y AvrlI o isoesquizómeros de estos
enzimas, y los sitios de restricción en el módulo de multiplicación
del segundo vector en la etapa (d) se seleccionan de entre BstZ17I,
SpeI, ClaI y NruI o isoesquizómeros de estos enzimas.
Más preferentemente, puede utilizarse el vector
de transferencia baculovirus pFBDM para la etapa (a) y/o (b).
Además, más preferentemente, el vector de
transferencia baculovirus pUCDM puede utilizarse para la etapa (a)
y/o (b).
Para una mejor comprensión del procedimiento de
la invención en general, se ilustra en la fig. 4 un procedimiento
ejemplificativo utilizando el vector preferente pFBDM.
El procedimiento de la invención permite la
introducción convencional de genes en uno o más casetes de expresión
de la invención y posteriormente facilita el ensamblaje modular de
estos casetes de expresión en un único vector, minimizando
simultáneamente el número de sitios de restricción requeridos para
ello.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para producir complejos multiproteicos in
vitro, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- generación de casetes de expresión multigénica según la invención tal como se ha descrito anteriormente,
- (b)
- transferencia de los casetes de expresión multigénica a una célula huésped capaz de expresar dichos genes simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, la transferencia en la etapa
(b) se lleva a cabo por medio de un vector, preferentemente un
virus.
Preferentemente, la célula huésped se selecciona
de entre células de mamífero, de levadura, de E. coli y de
insecto.
En el caso de que la célula huésped sea una
célula de insecto, son preferentemente las células S.
frugiperda, más preferentemente Sf9, Sf21, células H5 high
five o Express SF+, o células melanogaster, más
preferentemente las células Schneider S2.
Cuando la célula huésped es una célula de
mamífero, preferentemente es una célula humana seleccionada de entre
el grupo que consiste en células HeLa, Huh7, HEK293, HepG2,
KATO-III, IMR32, MT-2, células
\beta pancreáticas, queratinocitos, fibroblastos de médula ósea,
CHP212, células neurales primarias, W12,
SK-N-MC, Saos-2,
WI38, hepatocitos primarios, FLC4, 143TK-, DLD-1,
fibroblastos pulmonares embrionarios derivados de feto humano,
fibroblastos primarios de prepucio, osteosarcoma
Saos-2, y células MRC5 y MG63.
En el caso de que la célula huésped sea una
célula de levadura, preferentemente es de S. cerevisiae,
S. pombe, C. albicans o P. pastoris.
La presente exposición no se encuentra limitada
a procedimientos in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto diferente de la presente exposición
se refiere a un procedimiento para producir complejos multiproteicos
in vivo, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- generación de casetes de expresión multigénica según las reivindicaciones 39 a 42,
- (b)
- transferencia de los casetes de expresión multigénica a un animal en el que dichos genes se expresan simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, la transferencia de la etapa
(b) se lleva a cabo por medio de un vector, preferentemente un
vector virus, más preferentemente un vector baculovirus.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
baculovirus resultan particularmente útiles como vehículos de
administración génica de células de mamífero.
Para producir complejos multiproteicos in
vivo, dicho animal preferentemente se selecciona de entre
mamíferos, C. elegans o insectos.
Los insectos preferidos para la puesta en
práctica de dicho procedimiento son S. frugiperda y D.
melanogaster.
Los mamíferos preferidos para la puesta en
práctica de la invención son el ser humano, roedores, porcinos o
bovinos.
El descubrimiento reciente de un número
continuamente creciente de complejos multiproteicos en células
eucarióticas (el "interactoma") exige técnicas de expresión
heteróloga mejoradas, en particular para complejos de proteínas con
cantidades intracelulares refractarias a la extracción a partir de
la fuente (por ejemplo próximas a las de todos los complejos
multiproteicos humanos). Las proteínas eucarióticas con
frecuencia son entidades multidominio grandes (>100 kDa) y
existen en la célula en forma de complejos de 5 a 8 proteínas de
promedio. En general, los complejos de proteínas que contienen
proteínas grandes no pueden producirse en un estado funcionalmente
activo con tecnologías de expresión genéricas (por ejemplo
procarióticas). Además, los componentes de los complejos
multiproteicos con frecuencia muestran problemas de plegamiento y
compromiso de la actividad biológica al producirse en aislamiento.
Las tecnologías actuales de expresión eucariótica (sistema
baculovirus, sistemas de expresión de levadura y de mamífero, etc.)
no han sido diseñadas para la expresión rápida y flexible de varios
genes grandes codificantes de complejos multiproteicos.
Sin embargo, los vectores de la presente
invención se han adaptado para satisfacer dichos requisitos. Dichos
vectores son capaces de transportar casetes de expresión de
múltiples genes para la inserción, por ejemplo, en un baculovirus
modificado con propiedades mejoradas de producción de proteínas en
virtud de sitios de entrada independientes
(Cre-loxP y Tn7 y/o otros). En
combinación con las tasas de producción elevadas obtenidas, por
ejemplo, en células de insecto, de esta manera pueden utilizarse
vectores según la presente invención de manera flexible para
generar complejos multiproteicos destinados a estudios estructurales
y funcionales, proporcionando información significativa para la
utilización en investigación y en el desarrollo de fármacos, por
ejemplo como dianas fisiológicamente significativas para el
descubrimiento de ligandos que influyan sobre su actividad
(inhibidores, anticuerpos, etc.).
La exposición también resulta particularmente
útil para preparar una vacuna dirigida contra complejos de proteínas
de múltiples subunidades en mamíferos. Las unidades complejas
multiproteína con frecuencia muestran epítopos diferentes a los de
las proteínas individuales y, por lo tanto, son más estrechamente
similares a los epítopos relevantes de muchos complejos de
proteínas naturales, proporcionando así mejores antígenos diana para
la producción de anticuerpos. Además, pueden introducirse múltiples
proteínas para vacunas multivalentes y opcionalmente incluso
proteínas adyuvantes en un vector únicamente y expresarse
simultáneamente para garantizar la máxima eficacia.
Recientemente, se han construido partículas
similares a viriones (VLP) que consisten de cuatro proteínas
procedentes del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo
(SARS) utilizando un vector de expresión baculovirus recombinante
(Mortola et al., Efficient assembly and release of SARS
coronavirus-like particles by a heterologous
expression system, FEBS Letters 576:174-178, 2004),
ofreciendo un candidato potencial a vacuna para esta enfermedad. La
utilización de vectores según la presente invención, debido a la
capacidad modular de los mismos de transportar múltiples unidades
de expresión génica, facilitará en gran medida la generación de
dichas vacunas, consistentes de componentes incluso más numerosos
que las VLP de SARS.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, la presente exposición también se
refiere a un procedimiento para producir una vacuna, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- administrar por lo menos un polinucleótido y/o vectores según la invención en un mamífero, de manera que por lo menos una proteína codificada por lo menos por un casete de expresión de dicho polinucleótido se exprese dentro del animal,
- (b)
- opcionalmente administrar un adyuvante en dicho animal,
- (c)
- opcionalmente aislar anticuerpos y/o células de bazo productoras de anticuerpos, específicos para dicha proteína o proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un protocolo
conveniente y simple para producir recombinantemente complejos
multiproteicos que se encuentran en la Naturaleza. Estos complejos
multiproteicos pueden someterse a ensayo para interacciones de
complejos de proteínas o modificaciones de proteínas. También pueden
someterse a ensayo para la interacción con compuestos que se
sospecha presentan actividad biológica o incluso valor médico.
En otro aspecto, la presente exposición se
refiere a un procedimiento para someter a ensayo interacciones de
complejos de proteínas o modificaciones de proteínas.
\newpage
En una forma de realización preferida, la
presente exposición se refiere a un procedimiento para el cribado
in vitro para interacciones de complejos de proteínas o
modificaciones de proteínas, que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- proporcionar una célula huésped que comprende por lo menos un polinucleótido y/o un vector según la invención, que comprende por lo menos un casete de expresión con genes para por lo menos dos proteínas de interés y capaz de expresar dichas proteínas simultáneamente,
- (b)
- detección de las interacciones o modificaciones en una o más de las proteínas expresadas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización preferida, la
presente exposición comprende un procedimiento para el cribado
in vitro de compuestos candidatos capaces de:
- (i)
- interacciones de complejos de proteínas, o (ii) una o más modificaciones de una o más proteínas (de un complejo multiproteína), o (iii) inhibir interacciones entre complejos de proteínas, o (iv) inhibir una o más modificaciones de una o más proteínas, comprendiendo las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar una célula huésped que comprende por lo menos un polinucleótido según la invención y/o un vector según la invención, que comprende por lo menos un casete de expresión con genes para por lo menos dos proteínas de interés y capaz de expresar dichas proteínas simultáneamente,
- (b)
- administrar el compuesto candidato en la célula huésped de la etapa (a),
- (c)
- detectar interacciones entre complejos de proteínas o modificaciones de una o más de las proteínas expresadas o detectar la inhibición de las interacciones entre complejos de proteínas o la inhibición de modificaciones de las proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente exposición también comprende ensayos
de cribado in vivo.
Los polinucleótidos y/o vectores de la presente
invención también pueden utilizarse para el cribado in vivo
de interacciones proteína-proteína o complejo
multiproteína-complejo multiproteína (ver la fig.
13I para una ilustración general de este tipo de procedimiento de
cribado), también de bibliotecas aleatorizadas o grupos de ADNc,
así como modificaciones fisiológicas (fosforilación, glucosilación,
etc.) de complejos de proteínas particulares o de ensamblajes
multiproteína (ver la fig. 13II para una ilustración general de este
tipo de procedimiento de cribado).
\vskip1.000000\baselineskip
En otra forma de realización preferida, la
presente exposición enseña un procedimiento para el cribado in
vivo de compuestos candidatos capaces de: (i) interacciones
entre complejos de proteínas o una o más modificaciones de una o
más proteínas (de un complejo multiproteína), o (iii) capaces de
inhibir las interacciones entre complejos de proteínas o de inhibir
una o más modificaciones de una o más proteínas, que comprende las
etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar un animal que comprende por lo menos un polinucleótido según la invención y/o un vector según la invención, que comprende por lo menos un casete de expresión con genes para por lo menos dos proteína de interés y capaz de expresar dichas proteínas simultáneamente,
- (b)
- administrar el compuesto candidato al animal de la etapa (a),
- (c)
- detectar interacciones entre complejos de proteína o modificaciones en una o más de las proteínas expresadas o detectar la inhibición de las interacciones entre complejos de proteínas o la inhibición de las modificaciones de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden administrarse en mamíferos complejos
multiproteicos bioactivos, aunque también combinaciones médicamente
ventajosas de proteínas, tales como, por ejemplo, mezclas de
anticuerpos, opcionalmente con interleuquinas y/o adyuvantes,
simultáneamente por medio de los polinucleótidos de la presente
invención y/o vectores de administración génica de la presente
invención.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, la
presente exposición también se refiere asimismo a la utilización de
un polinucleótido y/o vector según la invención para la preparación
de un medicamento que comprende un vehículo de transferencia
multigénica para la terapia génica.
Se están realizando grandes esfuerzos para
desarrollar sistemas de administración génica para aplicaciones
terapéuticas. En el pasado, la terapia génica ha despertado tanto un
gran entusiasmo como críticas. Hasta hoy, se han realizado grandes
progresos en la evaluación de la terapia génica en ensayos clínicos
sobre el modo de conseguir estrategias clínicas seguras aplicables
in vivo y ex vivo para enfermedades humanas (Worgall
S., A realistic chance for gene therapy in the future, Pediatr.
Nephrol., 2004). Globalmente, la terapia génica en la actualidad
representa un camino muy prometedor para la corrección de trastornos
tanto genéticos como adquiridos, que implican la expresión
permanente o transitoria de un producto génico terapéutico (Worgall
S., ver anteriormente). Los vectores basados en virus recombinantes,
en particular los que no son de replicación competente en huéspedes
mamíferos (por ejemplo los vectores baculovíricos), recientemente se
han convertido en potentes herramientas para la administración
génica en células de mamífero y se han aplicado con éxito en un
amplio abanico de líneas celulares de mamífero, incluyendo seres
humanos, primates, roedores, bovinos, porcinos y ovinos (revisión
en Kost y Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell
gene-delivery vectores. Trends Biotechnol.
20:173-180, 2002). Para obtener efectos complejos de
transferencia/terapia génica tanto ex vivo como in
vivo, ha surgido una creciente demanda de vectores víricos
policistrónicos para conseguir resultados más potentes mediante
terapia génica combinada que los obtenidos mediante terapia de
genes individuales (de Felipe, P., Polycistronic viral vectors,
Curr. Gene Ther. 2:355-378, 2002; Planelles, V.,
Hybrid lentivirus vectors, Methods Mol. Biol.
229:273-284, 2003). La necesidad de incorporación de
genes accesorios en un virus portador que debe administrarse in
vivo, por ejemplo para bloquear la inactivación por el sistema
del complemento, también ha sido demostrada mediante la utilización
de un baculovirus pseudotipado con proteína de cubierta
baculovírica gp64 que porta una fusión de dominio proteico del
factor humano de aceleración del decaimiento (Hueser et al.,
Incorporation of decay-accelerating factor into the
baculovirus envelope generates complement-resistant
gene transfer vectors, Nat. Biotechnol. 19:451-455,
2001), ejemplificando la necesidad de proporcionar modificaciones
recombinantes del nivel de producción de virus, además de los
múltiples genes que deben transferirse con fines terapéuticos.
Preferentemente el vector utilizado para
preparar un medicamento es un baculovirus recombinante.
\vskip1.000000\baselineskip
Más preferentemente, el vector utilizado para
preparar un medicamento dado a conocer en la presente memoria es un
baculovirus que comprende por lo menos un casete de expresión
multigénica codificante de:
- (i)
- uno o más productos génicos, preferentemente proteínas, para la terapia, y
- (ii)
- una o más proteínas baculovíricas,
y en el que el baculovirus es capaz de expresar
los genes de los productos génicos terapéuticos, preferentemente
proteínas, bajo el control de uno o más promotores de mamífero
activos en el animal bajo tratamiento, y los genes para las
proteínas baculovíricas bajo el control de promotores
baculovíricos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida, la
proteína o proteínas de la etapa (ii) son proteínas baculovíricas
humanizadas expresadas a partir de un baculovirus pseudotipado,
preferentemente una proteína de cubierta baculovírica gp64
humanizada, por ejemplo gp64 fusionada con una proteína humana, tal
como, por ejemplo, factor acelerador del decaimiento.
En un aspecto más general, la presente invención
se refiere a la utilización de un polinucleótido y/o un vector y/o
una célula huésped y/o un animal según la invención para la
producción recombinante de complejos multiproteicos.
Mediante la utilización de genes codificantes de
las proteínas fluorescentes EYFP y ECFP inesperadamente se observó
un incremento prácticamente lineal de la producción de proteína
fluorescente ligado al número de genes codificantes de esta
proteína integrados en los vectores según la presente invención. Más
exactamente, el rendimiento productivo (por 1 l de cultivo de
células de insecto) de proteína fluorescente era de 6 a 8 mg/l en
caso de encontrarse una copia del gen, de aproximadamente 11 mg si
se encontraban presentes dos copias, y de aproximadamente 18 mg en
caso de encontrarse tres copias del gen en un vector según la
presente invención utilizado para la expresión. Lo expuesto
anteriormente sugiere una manera simple no conocida anteriormente
de incrementar drásticamente la cantidad de una proteína
recombinante expresada utilizando un sistema de expresión según la
invención, es decir simplemente proporcionando dos, tres o más
copias del mismo gen y no una sola copia. Lo expuesto anteriormente
resulta de especial interés para la producción de proteínas a escala
industrial, por ejemplo con fines farmacéuticos, en particular para
proteínas membranales que resultan de interés primordial para el
desarrollo de fármacos (por ejemplo GPCR), la producción de los
cuales en la actualidad se ve dificultada en gran parte por los
bajos rendimientos productivos.
Además, los complejos multiproteicos
recombinantes producidos según la presente invención resultan
particularmente útiles para el análisis biofísico, estructural,
cristalográfico, de microscopía electrónica y basado en RMN de
complejos multiproteicos para la investigación y también para el
desarrollo de fármacos.
Preferentemente, la exposición se refiere a la
utilización de un polinucleótido y/o un vector y/o una célula
huésped y/o un animal según la invención para producir una
vacuna.
También resulta preferida la utilización de un
polinucleótido y/o un vector y/o una célula huésped y/o un animal
dado a conocer en la presente memoria para el cribado de por lo
menos una proteína in vitro o in vivo, opcionalmente
conjuntamente con un compuesto candidato, para la asociación de
proteínas, la modificación de proteínas, o un efecto biológico en
una célula huésped o animal o para la inhibición de la asociación de
proteínas, de la modificación de proteínas o de un efecto biológico
en una célula huésped o animal.
En otro aspecto, la presente exposición se
refiere a un kit de partes que comprende por lo menos un
polinucleótido y/o un vector y/o una célula huésped según la
invención, opcionalmente comprendiendo asimismo un manual de
instrucciones, antibióticos, tampones y/o compuestos marcadores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensamblan genes de interés en casetes de
expresión multigénica utilizando el módulo de multiplicación
presente en los vectores de transferencia pFBDM y pUCDM. Los
vectores resultantes se introducen en ADN baculovírico MultiBac en
células de E. coli DH10MultiBac^{Cre}, que contienen los
factores para la transposición de Tn7 (para los derivados de pFBDM)
y para la recombinación específica de sitio
cre-lox (para los derivados de pUCDM). Las
colonias que contienen bácmido que transporta casetes multigénicos
integrados se identifican mediante cribado azul/blanco (la
transposición de Tn7 interrumpe el gen lacZ\alpha) y la
resistencia al cloranfenicol (proporcionada por la integración
catalizada por Cre del derivado de pUCDM). La transposición y la
recombinación específica de sitio se llevan a cabo secuencialmente
o, alternativamente, simultáneamente, en una reacción de una etapa.
El ADN del bácmido se prepara a partir de clones seleccionados y se
utiliza para transfectar células de insecto para la producción de
proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
El mapa circular de pFBDM representa los
promotores (polh, p10), terminadores (SV40, HSVtk), sitios de
clonación múltiple (MCS1, MCS2), elementos transposones (Tn7L,
Tn7R) y marcadores de resistencia (ampicilina y gentamicina). Los
genes de interés se clonan en MCS1 o MCS2 utilizando sitios de
restricción únicos. El módulo de multiplicación (M) se encuentra
situado entre los promotores p10 y polh.
\vskip1.000000\baselineskip
El mapa circular de pUCDM muestra promotores
(polh, p10), terminadores (SV40, HSVtk), sitios de clonación
múltiple (MCS1, MCS2), la repetición invertida para la recombinación
específica de sitio cre-lox (LoxP) y un
marcador de resistencia (al cloranfenicol). Los genes de interés se
clonan en MCS1 o en MCS2 utilizando sitios de restricción únicos.
El módulo de multiplicación (M) se encuentra situado entre los
promotores p10 y polh.
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestra la lógica de la multiplicación para
pFBDM. El casete de expresión que contiene dos genes de elección
(denominados a y b) se extrae mediante digestión con AvrlI y PmeI
(en cajas) y se introducen en un módulo de multiplicación de un
constructo que contiene genes adicionales (c, d) en sitios
BstZ17I/SpeI (o, alternativamente NruI/SpeI) presentes en el módulo
de multiplicación (M). SpeI produce un extremo cohesivo compatible
con AvrlI, mientras que BstZ17I, NruI y PmeI generan extremos
romos. Los derivados multigénicos de pUCDM pueden generarse
siguiendo la misma lógica.
\vskip1.000000\baselineskip
El genoma vírico modificado se muestra en una
representación esquemática. El sitio de unión de Tn7 se encuentra
situado dentro de un gen LacZ\alpha; la inserción de elementos Tn7
de derivados de pFBDM produce, por lo tanto, un fenotipo blanco al
sembrarse en agar que contiene BluoGal e IPTG. En lugar de los genes
víricos interrumpidos v-cath y chiA,
se insertó una secuencia LoxP para aceptar derivados de pUCDM
mediante catálisis con Cre, produciendo un fenotipo resistente al
cloranfenicol.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen codificante de la proteína fluorescente
amarilla EYFP se clonó en pUCDM y se integró en MultiBac mediante
catálisis con Cre. El virus se separó clonalmente mediante ensayo en
placa. Se sometieron a ensayo 32 placas para la expresión de EYFP
mediante espectroscopía de fluorescencia. La excitación se llevó a
cabo a 488 nm. Se muestran los espectros registrados del lisado
celular de los virus 1 a 12 (parte superior). En el presente
experimento, 91% (29 de 32) de los especímenes mostró una emisión
fuerte de fluorescencia, indicando que se había expresado la
proteína EYFP (Tabla en la parte inferior).
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación entre el lisado de células
infectadas por virus MultiBac y por un baculovirus disponible
comercialmente ("tipo salvaje"). La producción de proteínas
dependiente de virus en ambas muestras era virtualmente idéntica 48
horas después de las infecciones (fig. A). La incubación de lisado
celular durante 96 horas a temperatura ambiente tras la recolección
mostró un contenido de proteínas en la muestra prácticamente no
alterado respecto a las células infectadas por MultiBac. En
contraste, la proteolisis resultaba evidente en la muestra de
células infectadas por el virus de tipo salvaje (fig. B). El efecto
de la deleción de proteasa sobre la morfología celular 72 horas
después de la infección se muestra en micrografías de células
infectadas por MultiBac sin v-cath ni
chiA (MultiBac) o por virus comercial que contenía los genes
de proteasa y de quitinasa (tipo salvaje). Las células en la
micrografía superior eran uniformemente redondas y presentaban una
apariencia intacta. En contraste, la lisis celular era prevalente
en la micrografía inferior (fig. C).
\vskip1.000000\baselineskip
Se expresó el complejo Isw2 a partir del sitio
attTn7 o, alternativamente, a partir de los sitios AttTn7 y LoxP de
MultiBac. El lisado celular, así como el complejo de proteínas
purificado a partir de ambos bácmidos compuestos mostraba niveles
de producción de proteínas prácticamente iguales. La muestra de
células Sf21 no infectadas se incluyó como control.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sitios de integración se ilustran
esquemáticamente en la parte superior de secciones de gel teñidas
con Coomassie, que muestran los componentes de los complejos
multiproteicos respectivos. Se indican los rendimientos. La
expresión de EYFP se muestra en la parte inferior mediante secciones
de filtros western de los lisados celulares respectivos, con
rendimientos calculados a partir de los espectros de
absorbancia.
\vskip1.000000\baselineskip
Un virus híbrido (parte izquierda) resulta en la
expresión de EYFP y ECFP en células de insecto (parte superior
derecha) y en la expresión de REDds en células COS infectadas por
virus que ha sido amplificado en células Sf21 (parte inferior
derecha).
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 11 representa la secuencia
polinucleótida completa de una forma de realización preferida de la
presente invención, el vector baculovírico circular de
transferencia pFBDM.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 12 representa la secuencia
polinucleótida completa de una forma de realización preferida de la
presente invención, el vector baculovírico circular de
transferencia pUCDM.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 13 ilustra las estrategias de cribado
con vectores según la presente invención para la evaluación de la
asociación física entre proteínas/complejos de proteínas (I.) y/o de
las modificaciones de los mismos (II.) in vivo.
A continuación se describen las formas de
realización específicas de la invención a título de ejemplo no
limitativo del alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen en detalle nuevos
vectores baculovíricos de transferencia según la presente invención
construidos específicamente para aplicaciones multigénicas. Estos
vectores de transferencia presentan un ADN baculovírico receptor
modificado que se ha manipulado para una producción de proteínas
mejorada, y un procedimiento simple y rápido para integrar genes a
través de dos sitios de acceso (attTn7 y LoxP) en dicho ADN
baculovírico en células de E. coli adaptadas a este fin.
Dichos vectores (pFBDM y pUCDM) contienen un módulo de
multiplicación y facilitan en gran medida la combinación modular de
genes heterólogos con una necesidad mínima de sitios de restricción
únicos. Los promotores víricos (en la actualidad los promotores muy
tardíos p10 y polh) pueden intercambiarse en estos vectores por
otras secuencias de promotor (tempranas, tardías) en caso necesario.
De manera similar, pueden sustituirse las secuencias de terminador
(en la actualidad SV40, HSVtk).
Dichos vectores comprenden un genoma
baculovírico manipulado (MultiBac) con propiedades mejoradas de
producción de proteínas. Se interrumpieron dos genes baculovíricos,
conduciendo a un mantenimiento mejorado de los compartimientos
celulares durante la infección y la producción de proteínas. La
calidad de las proteínas producidas por dicho sistema mejoró
significativamente mediante la reducción de la actividad
proteolítica dependiente del virus y la reducción de los niveles de
lisis celular.
Los vectores según la invención proporcionan un
nuevo procedimiento para la rápida generación combinatorial de ADN
baculovírico recombinante mediante el acceso al genoma vírico a
través de dos sitios específicos (ver la fig. 1 para una visión
general). Además del sitio de transposón Tn7 comercializado, se
introdujo una secuencia LoxP en un sitio separado del genoma de
baculovirus que podía aceptar casetes de expresión multigénica del
plásmido pUCDM mediante recombinación específica de sitio. Se
desarrolló un protocolo para llevar a cabo la transposición de Tn7
(procedente de derivados de pFBDM que transportaban casetes
multigénicos) y la recombinación específica de sitio LoxP
(procedente de derivados de pUCDM que transportaban casetes
multigénicos) eficientemente en una única etapa en E. coli.
Estos protocolos resultan útiles no sólo para integrar casetes
multigénicos con secuencias codificantes de subunidades de complejo
multiproteína en MultiBac, sino también para integrar enzimas
específicos (quinasas, acetilasas, etc.) para la modificación de las
proteínas investigadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de transferencia pFBDM (SEC ID nº 1,
fig. 11) contiene dos casetes de expresión en orientación cabeza
con cabeza con múltiples sitios de clonación MCS1 y MCS2 flanqueados
por los promotores polh o p10 y secuencias de señal poliA de SV40 o
de HSVtk, respectivamente. El módulo de multiplicación M se
encuentra situado entre las secuencias promotoras. Las secuencias
utilizadas para la transposición de Tn7 (Tn7L y Tn7R) comprenden
los casetes de expresión y un marcador de resistencia a la
gentamicina. Para más detalles ver la fig. 2.
El vector de transferencia pUCDM (SEC ID nº:2,
figura 12) presenta un casete de expresión que comprende un módulo
de multiplicación como pFBDM. Este casete de expresión es flanqueado
por una repetición inversa de LoxP. El vector pUCDM contiene un
marcador de resistencia de cloranfenicol y un origen de R6K\gamma
condicional de replicación que hace su propagación dependiente de
la expresión del gen pir en el huésped procariótico. Para
más detalles, ver la figura 3.
\newpage
En resumen, ambos vectores fueron preparados
como se expone a continuación. El vector de transferencia pFBDM se
obtuvo a partir de pFastBac^{TM}DUAL (Invitrogen). La secuencia
5'-TACTAGTATCGATTCGCG-ACC se insertó
en el sitio BstZ17l entre los promotores p10 y polh generando el
módulo de multiplicación que contiene, en orden, los sitios de
división BstZ17l, SpeI, ClaI y NruI. Se añadió un sitio para el
cortador raro PmeI sustituyendo la secuencia de reconocimiento
SnaBI con el oligonucleótido
5'-AGCTTTGTTTAAACAAAGCT. El vector pUCDM se generó
combinando el fragmento EcoRV/AlwNI de 998 bp del univector pUNI10
que contiene el origen de R6K\gamma con el fragmento AlwNI de
1258 bp a partir de pLysS (Novagen) tras el tratamiento con nucleasa
mung bean (New England Biolabs). Este fragmento pLysS contiene el
marcador de resistencia de cloranfenicol. El constructo resultante
fue digerido con SmaI y XbaI, y se ligó al fragmento PmeI/AvrII de
1016 bp de pFBDM. Los sitios de restricción única para las
endonucleasas de restricción de AvrII y PmeI se reintrodujeron
mediante mutagénesis sitio-dirigida utilizando
utilizando el protocolo QuickChange (Stratagene). Los vectores pUCDM
y pFBDM contienen los casetes de expresión idénticos que comprenden
el módulo de multiplicación.
El vector baculovírico, denominado MultiBac, que
representa un bácmido debido a que contiene un origen de
replicación (replicón F) que permite su propagación en cepas de
E. coli (por ejemplo DH10\alpha y derivados), se construyó
de la manera siguiente. Se utilizó plásmido pKIIoxP, que contiene el
fragmento lineal utilizado para sustituir los genes
v-cath y chiA en bMON14272 mediante
recombinación de ET, se generó a partir de pFastBaC^{TM}DUAL
mediante recircularización del fragmento StuI/FspI de 3.385 pb,
eliminando de esta manera dichos sitios e interrumpiendo el gen de
resistencia a la ampicilina. Este vector, pKI, presenta un marcador
gentamicina y pFastBac^{TM}DUAL p10 MCS, que contiene los sitios
de restricción XhoI, NcoI y KpnI. Se modificó pKI para proporcionar
pKIIoxP de la manera siguiente. Se introdujo en el sitio NcoI el
fragmento BspHI de 1.008 pb de pFastBac^{TM}DUAL que contenía el
marcador de resistencia a la ampicilina. A continuación, se
amplificó la región de homología HomA del gen baculovírico
chiA a partir de bMON14272 con los cebadores
5'-GCGCGCCTCGAGGCCTCCCACGTGCCC
GACCCCGGCCCG y 5'-GCGCGCCTCGAGGGAGGAGCTGCGCGCAATGC y se digirió con XhoI. El fragmento de 408 pb resultante se insertó en el sitio XhoI de pKI. La región de homología HomB del gen v-cath se amplificó con los cebadores 5'-GCGCGCGGTACCGCGTTCGAAGCCATCATTA y 5'-GCGCGCGGTACCAGGCCTGAAAAATCCGTCCTCTCC, se digirió con KpnI y el fragmento de 372 pb resultante se insertó en el sitio KpnI de pKI. Finalmente, se introdujo una secuencia Cre-loxP en el sitio NheI con el oligonucleótido 5'-CTAGAATAACT TCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAGTTTA AACT. Se generó el gen codificante de la recombinasa Cre y una etiqueta de seis histidinas directamente contigua al codón de inicio a partir de oligonucleótidos sintéticos (Microsynth, CH) y se ligó en vector pBAD22 digerido con NcoI/KpnI. El marcador de resistencia a la ampicilina se inactivó mediante digestión con FspI/ScaI. Se extrajo de pPICZA (Invitrogen) mediante digestión con PvuII/EcoRV un gen de resistencia a la zeocina bajo el control de un promotor procariótico sintético (EM7), y se ligó con el fragmento FspI/ScaI de 5.388 pb, proporcionando pBADZ-His_{6}Cre.
GACCCCGGCCCG y 5'-GCGCGCCTCGAGGGAGGAGCTGCGCGCAATGC y se digirió con XhoI. El fragmento de 408 pb resultante se insertó en el sitio XhoI de pKI. La región de homología HomB del gen v-cath se amplificó con los cebadores 5'-GCGCGCGGTACCGCGTTCGAAGCCATCATTA y 5'-GCGCGCGGTACCAGGCCTGAAAAATCCGTCCTCTCC, se digirió con KpnI y el fragmento de 372 pb resultante se insertó en el sitio KpnI de pKI. Finalmente, se introdujo una secuencia Cre-loxP en el sitio NheI con el oligonucleótido 5'-CTAGAATAACT TCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAGTTTA AACT. Se generó el gen codificante de la recombinasa Cre y una etiqueta de seis histidinas directamente contigua al codón de inicio a partir de oligonucleótidos sintéticos (Microsynth, CH) y se ligó en vector pBAD22 digerido con NcoI/KpnI. El marcador de resistencia a la ampicilina se inactivó mediante digestión con FspI/ScaI. Se extrajo de pPICZA (Invitrogen) mediante digestión con PvuII/EcoRV un gen de resistencia a la zeocina bajo el control de un promotor procariótico sintético (EM7), y se ligó con el fragmento FspI/ScaI de 5.388 pb, proporcionando pBADZ-His_{6}Cre.
El vector de transferencia pFBDM, pKILoxP y
pBADZ-His_{6}Cre se propagaron en cepas genéricas
de E. coli, tal como células TOP10 (Invitrogen), pUCDM se
propagó en los huéspedes bacterianos BW23473 o BW23474 que
expresaban el gen pir.
A continuación, para la generación del bácmido
baculovírico MultiBac, se modificó el vector
pBAD-ET\gamma que portaba recE truncado bajo el
promotor PBAD inducible con arabinosa y recT bajo el promotor EM7,
introduciendo el gen de resistencia a la zeocina procedente de
pPICZA en los sitios FspI y ScaI, tal como se ha descrito para
pBADZ-His_{6}Cre, proporcionando
pBADZ-ET\gamma. Este vector se transformó en
células DH10BAC^{TM} (Invitrogen) que portaban el bácmido
bMON14272 y el plásmido ayudante pMON7124, proporcionando colonias
resistentes a canamicina, tetraciclina y zeocina. Se utilizó una
colonia individual para inocular 500 ml de medio 2xTY
(bactotriptona al 1,6%, extracto de levadura al 1%, NaCl al 0,5%) en
presencia de dichos tres antibióticos, a 20ºC. A DO_{600}=0,25,
se añadió L-arabinosa (Fluka BioChemicals) hasta el
0,1% y el cultivo se incubó hasta alcanzar DO_{600}=0,5. A
continuación, se generaron células DH10BacET electrocompetentes
siguiendo los procedimientos estándares y se almacenaron a -80ºC.
Se transformó el vector pKIloxP en células JM110 (Stratagene) que
no presentaban actividad de dam ni de dcm. Se digirió
ADN de plásmido no metilado con StuI, proporcionando un fragmento
de 1.827 pb que contenía el marcador de resistencia a la ampicilina
y una secuencia Cre-LoxP flanqueada por regiones de
homología de chiA y
v-cath. A continuación, se electroporó un
mínimo de 0,3 \mug de ADN lineal en las células DH10BacET. Las
células transformadas se cultivaron durante 4 horas a 37ºC y se
sembraron en placas de agar que contenían canamicina, tetraciclina y
ampicilina. Se analizó mediante amplificación por PCR el ADN de
bácmido procedente de dos colonias individuales triplemente
resistentes, utilizando los cebadores
5'-AGGTACTAAATATGGCG y
5'-CTGAGCGACATCACT, que se hibridan en el exterior
de las regiones de homología, y mediante secuenciación del
fragmento de PCR para confirmar la integración correcta. Se
prepararon tal como anteriormente células DH10MultiBac
electrocompetentes congeladas que contenían el bácmido modificado
en el que los genes v-cath y chiA se
habían sustituido por un marcador ampicilina y LoxP, en
medio de cultivo en el que la ampicilina sustituía a la zeocina.
Para generar bácmidos MultiBac compuestos, se
transformó pBADZ-His_{6}Cre en DH10MultiBac
mediante electroporación para la expresión de clones productores de
recombinasa Cre resistentes a canamicina, tetraciclina y zeocina.
Se utilizó una colonia individual para inocular 500 ml de medio 2xTY
en presencia de dichos antibióticos, a 20ºC. Se añadió
L-arabinosa hasta el 0,1% a DO_{600}=0,25. A
DO_{600}=0,5 se prepararon células DH10MultiBac^{Cre}
electrocompetentes congeladas que contenían recombinasa Cre
sobreexpresada. Se electroporaron plásmidos pUCDM o derivados en
células DH10MultiBac^{Cre} y se sembraron en placas de agar que
contenían canamicina, tetraciclina y cloranfenicol. Los clones
triplemente resistentes se sometieron a ensayo en placas que
contenían IPTG y Bluogal para la integridad del gen
lacZ\alpha con Tn7, proporcionando colonias azules
en todos los casos ensayados. Los clones se analizaron para
identificar el suceso correcto de recombinación específica de sitio
Cre-loxP mediante amplificación por PCR y
secuenciación, tal como se ha indicado anteriormente. La pérdida de
pBADZ-His_{6}Cre se confirmó mediante nueva
siembra en placa en presencia de zeocina. Se prepararon células
electrocompetentes a partir de los clones individuales en presencia
de canamicina, tetraciclina y cloranfenicol. La transposición de
elementos Tn7 de derivados de pFBDM a Tn7, la identificación
de recombinantes mediante cribado azul/blanco, y la transfección de
bácmido compuesto purificado se llevaron a cabo según los
protocolos establecidos (por ejemplo O'Reilly, D.R., Miller, L.K. y
Luckow, V.A., "Baculovirus expression vectors. A laboratory
manual", Oxford University Press, New
York-Oxford, 1994;
"Bac-to-Bac^{TM} Baculovirus
Expression Systems Manual", Invitrogen, Life Technologies
Incorporated, 2000). Para la transformación simultánea de
DH10MultiBac^{Cre} con derivados de pUCDM y de pFBDM, se utilizó
por lo menos 1 \mug de
cada uno.
cada uno.
Una función del replicón F en el bácmido es
limitar el número de copia a uno o dos, reduciendo el potencial de
recombinación no deseada. La introducción de derivados de pFBDM en
MultiBac interrumpe el gen lacZ\alpha, permitiendo la
identificación inequívoca de células que contienen únicamente el
bácmido compuesto. Sin embargo, en el caso de la fusión catalizada
por Cre de derivados de pUCDM, no puede descartarse la coexistencia
de una copia de bácmidos tanto compuesto como parental, basándose
en la resistencia al cloranfenicol. Por lo tanto, se separaron
clonalmente mediante purificación en placa los virus de las
transfecciones iniciales con MultiBac que contenían el gen EYFP
insertado mediante catálisis con Cre. Debido a que 29 de 32 (91%) de
los especímenes purificados en placa expresaba EYFP, se produjo
recombinación específica de sitio Cre-loxP a
eficacia prácticamente saturante. A pesar de la presencia de varias
copias de promotores (p10, polh) y terminadores (SV40, HSVtk)
víricos, los derivados MultiBac pudieron subcultivarse en serie por
lo menos cinco veces en células Sf21 a una multiplicidad de
infección (MOI) \leq 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores pFBDM y pUCDM resultan
particularmente adecuados para generar casetes de expresión
multigénica debido al módulo de multiplicación insertado entre los
dos promotores. La lógica de la multiplicación se ilustra en la
fig. 4. El único requisito previo para ensamblar casetes de
expresión multigénica es que los enzimas de restricción utilizados
para la multiplicación (por ejemplo PmeI, AvrlI, SpeI y BstZ17I o
NruI) son únicos, lo que puede conseguirse fácilmente por ejemplo
mediante mutagénesis sitio-dirigida previamente al
ensamblaje del casete multigénico o a la provisión de compuestos
(por ejemplo ácidos nucleicos péptidos) capaces de enmascarar
sitios adicionales que no deben dividirse en las secuencias de ADN
codificantes insertadas. Se clonaron genes en MCS1 y MCS2 de pFBDM.
A continuación, se extrajo el casete de expresión completo mediante
digestión con PmeI y AvrlI. El fragmento resultante se introdujo en
el módulo de multiplicación de un derivado de pFBDM que contenía
conjuntos adicionales de genes mediante sitios SpeI/BstZ17I o
SpeI/NruI. SpeI produce un extremo cohesivo compatible con AvrlI,
mientras que BstZ17I, NruI y PmeI generan extremos romos. Los sitios
de restricción implicados se eliminan durante el proceso y la
multiplicación puede repetirse iterativamente utilizando el módulo
presente en el casete insertado. También se aplica el mismo
razonamiento a la generación de derivados de pUCDM con casetes de
expresión multigénica. Además, las secuencias de promotor y de
terminador pueden modificarse fácilmente, si se desea, utilizando
sitios de restricción apropiados en los vectores de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se modificó el genoma baculovírico para obtener
propiedades mejoradas de producción de proteínas. Se interrumpieron
dos genes baculovíricos, v-cath y
chiA, conduciendo a un mantenimiento mejorado de los
compartimientos celulares durante la infección y la producción de
proteínas. El gen v-cath codifica una
proteasa vírica, V-CATH, que se activa con la
muerte celular mediante un proceso dependiente de un gen contiguo en
el ADN vírico, chiA, que codifica una quitinasa. Ambos genes
se interrumpieron para eliminar la actividad de
V-CATH y para ganar la opción de poder utilizar
cromatografía de afinidad para la quitina para la purificación sin
interferencia del producto del gen chiA. La calidad de las
proteínas producidas mediante el denominado baculovirus MultiBac
mejoró significativamente al reducirse la actividad proteolítica
dependiente de virus y los niveles de lisis celular. En lugar de la
secuencia de ADN vírico interrumpida, se introdujo una secuencia
LoxP para la recombinación específica de sitio
cre-lox. Para más detalles ver la fig. 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron los genes seleccionados en los
sitios de clonación múltiple MCS1 o MCS2 (ver las figs. 2 y 3) de
pFBDM y pUCDM utilizando procedimientos de clonación estándares. Se
transformaron reacciones de ligación de los derivados de pFBDM en
células de E. coli estándares para la clonación (tales como
TOP10, DH5\alpha, HB101) y se sembraron en placas de agar que
contenían ampicilina (100 \mug/ml). Las reacciones de ligación
para los derivados de pUCDM se transformaron en células de E.
coli que expresaban el gen pir (tales como BW23473,
BW23474) y se sembraron en placas de agar que contenían
cloranfenicol (25 \mug/ml). Se seleccionaron los clones correctos
basándose en la digestión de restricción específica y la
secuenciación del ADN de los insertos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron sobre hielo (15 minutos)
aproximadamente 5 a 10 ng del derivado de pUCDM con 50 a 100 \mul
de células DH10MultiBac^{Cre} electrocompetentes. Tras la
electroporación (pulso de 200 ohms, 25 \muF, 1,8 kV), las células
se incubaron a 37ºC durante 8 horas y se sembraron en placa de agar
que contenía canamicina (50 \mug/ml), cloranfenicol (25
\mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Aparecieron colonias tras
la incubación a 37ºC (12 a 15 horas). A continuación, se prepararon
bácmidos para la transfección de células de insecto (ver III.6) o
clones para la integración de un derivado de pFBDM mediante
transposición de Tn7 (ver posteriormente).
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron sobre hielo (15 minutos)
aproximadamente 5 a 10 ng del derivado de pFBDM con 50 a 100 \mul
de células DH10MultiBac^{Cre} electrocompetentes. Tras la
electroporación (pulso de 200 ohms, 25 \muF, 1,8 kV), las células
se incubaron a 37ºC durante 8 horas y se sembraron en placas de agar
que contenían canamicina (50 \mug/ml), gentamicina (7 \mug/ml),
ampicilina (100 \mug/ml), tetraciclina (10 \mug/ml), BluoGal
(100 \mug/ml) e IPTG (40 \mug/ml). Se seleccionaron las colonias
blancas tras la incubación a 37ºC (18 a 24 horas). A continuación,
se prepararon bácmidos para la infección de células de insecto (ver
posteriormente).
\vskip1.000000\baselineskip
La recombinación específica de sitio
Cre-lox y la transposición de Tn7 pueden
llevarse a cabo simultáneamente en células DH10MultiBac^{Cre}, si
se desea. Debido a que la eficacia de una doble transformación es
reducida en comparación con la transformación con un plásmido
únicamente, deben utilizarse cantidades significativamente mayores
de ADN en esta reacción. Se incubaron aproximadamente 2 a 4 \mug
del derivado de pFBDM y 2 a 4 \mug del derivado de pUCDM
seleccionado, sobre hielo (15 minutos) con 50 a 100 \mul de
células DH10MultiBac^{Cre} electrocompetentes. Tras la
electroporación (pulso de 200 ohms, 25 \muF, 1,8 kV), las células
se incubaron a 37ºC durante 8 horas y se sembraron en placas de
agar que contenían cloranfenicol (25 \mug/ml), canamicina (50
\mug/ml), gentamicina (7 \mug/ml), tetraciclina (10 \mug/ml),
BluoGal (100 \mug/ml) e IPTG (40 \mug/ml). Se seleccionaron las
colonias blancas tras la incubación a 37ºC (18 a 24 horas). A
continuación, se prepararon bácmidos para la infección de células
de insecto (ver posteriormente).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinadas aplicaciones, puede resultar
ventajoso añadir genes de proteínas para la expresión de un ADN
baculovírico MultiBac que ya porte un conjunto de genes foráneos
integrados mediante catálisis con Cre. A continuación, las células
DH10MultiBac^{Cre} que portaban MultiBac recombinante con un
derivado de pUCDM integrado (ver III.2) se sembraron nuevamente en
agar que contenía cloranfenicol (25 \mug/ml),
canamicina (50 \mug/ml), ampicilina (100 \mug/ml), tetraciclina
(10 \mug/ml), BluoGal (100 \mug/ml) e IPTG (40 \mug/ml). A
continuación, una colonia azul con un derivado de MultiBac
competente para la transposición se incubó en 500 ml de medio 2xTY
que contenía cloranfenicol (25 \mug/ml), canamicina (50
\mug/ml), ampicilina (50 \mug/ml) y tetraciclina (10 \mug/ml)
a 37ºC hasta que la DO_{600} alcanzó 0,5. A continuación, se
enfrió el cultivo sobre hielo (15 minutos) y se centrifugó (4.000
rpm, 8 minutos). El pellet celular se resuspendió en 250 ml de
solución helada de glicerol al 10% (estéril) y se centrifugó (4.000
rpm, 8 minutos). El pellet celular se resuspendió a continuación en
200 ml de solución helada de glicerol al 10% (estéril) y se
centrifugó nuevamente (4.000 rpm, 8 minutos). A continuación, el
pellet celular se resuspendió en 50 ml de solución helada de
glicerol al 10% (estéril) y finalmente, tras la centrifugación, en 1
ml de solución de glicerol al 10% (estéril). Las células se
congelaron en alícuotas de 50 a 100 \mul en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -80ºC. La transposición de los derivados de pFBDM
puede llevarse a cabo tal como se indica a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de ADN de bácmido, la infección
de células de insecto y la expresión de proteínas se llevaron a
cabo según los protocolos establecidos (por ejemplo O'Reilly, D.R.,
Miller, L.K. y Luckow, V.A., "Baculovirus expression vectors. A
laboratory manual", Oxford University Press, New
York-Oxford, 1994;
"Bac-to-Bac^{TM} Baculovirus
Expression Systems Manual", Invitrogen, Life Technologies
Incorporated, 2000).
\vskip1.000000\baselineskip
La propagación de MultiBac en las células
DH10MultiBac^{Cre} depende de la presencia del replicón F en el
bácmido. Una función del replicón F es el control estrecho del
número de copia (una o dos), reduciendo el potencial de
recombinación no deseada. La introducción de derivados de pFBDM en
MultiBac interrumpe el gen lacZ\alpha, permitiendo de esta
manera la identificación inequívoca de las células que contienen
únicamente bácmido compuesto. En el caso de la integración
catalizada por Cre de los derivados de pUCDM, sin embargo, no puede
descartarse la coexistencia de un bácmido compuesto y una molécula
parental de MultiBac basándose en la resistencia al cloranfenicol.
Por lo tanto, el virus de las transfecciones iniciales con MultiBac
que contenía un gen de la proteína fluorescente amarilla EYFP
insertada mediante catálisis con Cre se separó clonalmente mediante
purificación de placas. 29 de 32 (91%) de los especímenes
purificados de placas expresaban EYFP, apoyando que se había
producido una reacción de recombinación específica de sitio
cre-lox con eficacia prácticamente saturante (para
más detalles ver la fig. 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la producción de proteínas heterólogas
con un sistema de expresión baculovírico comercializado, se observó
una rotura proteolítica dependiente de virus que concordaba con la
acción de una cisteína proteasa. El gen baculovírico
v-cath codifica una cisteína proteasa que se
encuentra directamente implicada en la licuefacción de la célula
huésped de insecto. V-CATH se activa tras la muerta
celular mediante un proceso dependiente de un gen contiguo en el
ADN vírico, chiA, que codifica una quitinasa. La interrupción
de ambos genes eliminó la actividad de V-CATH y
además proporcionó la opción de utilizar cromatografía de afinidad
para la quitina para la purificación sin interferencias del producto
del gen chiA. El efecto de la interrupción se sometió a
ensayo comparando muestras de células infectadas por virus MultiBac
con células infectadas por un baculovirus comercializado que
portaba v-cath y chiA. Se observó una
actividad proteolítica fuertemente reducida, concomitantemente con
un mantenimiento muy mejorado de la integridad celular, en el lisado
de células infectadas con MultiBac (para más detalles ver la fig.
7).
\vskip1.000000\baselineskip
En un experimento, se expresó el complejo Isw2
de la levadura de remodelado de la cromatina, que consiste en las
proteínas Isw2p de 130 kDa y ltc1p de 145 kDa. Se creó una versión
de MultiBac con ambas proteínas integradas en el sitio attTn7, y
una segunda versión con Isw2p integrado en el sitio attTn7 y ltc1p
insertado en el sitio LoxP. El desacoplamiento espacial de los dos
genes en el virus no afectó adversamente a los niveles relativos de
producción de las subunidades ni al ensamblaje funcional del
complejo Isw2 en las células de insecto, ejemplificando la utilidad
de los sitios tanto Cre-lox como Tn7 para la
integración y expresión simultáneas de las proteínas. Para más
detalles ver la fig. 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Además del complejo de remodelado Isw2 de la
levadura también se expresó el complejo Isw1b de la levadura de
tres componentes (360 kD) y un complejo de factor transcripcional
humano (700 kDa) utilizando MultiBac. Además, en todos los casos,
también se coexpresó la proteína fluorescente EYFP. El rendimiento
constante de EYFP y los complejos respectivos en los experimentos
de coexpresión ilustran que la expresión no es saturante en este
sistema y sugieren que pueden expresarse complejos incluso mucho
mayores que contengan muchas mas subunidades utilizando MultiBac.
Para más detalles ver la fig. 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó un virus derivado de MultiBac que
contenía las proteínas fluorescentes EYFP y ECFP bajo el control de
promotores baculovíricos y REDds bajo el control del promotor tardío
de CMV. Las células de insecto infectadas por dicho virus híbrido
mostraron expresión de EYFP y ECFP. Las células COS de mamífero
infectadas por virus amplificado en células de insecto mostraron
fluorescencia fuerte de proteína REDds, demostrando el uso potencial
de MultiBac para la transferencia multigénica en células de
mamífero ("BacMam"). Para más detalles ver la fig. 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente memoria se da a conocer un kit de
sistema MultiBac que puede comprender uno o más de los elementos
siguientes:
células DH10MultiBac^{Cre}, células BW23474,
BW23474^{\ding{61}}, vector pFBDM, vector pUCDM, plásmido de
control para la transposición de Tn7*, plásmido de control para la
recombinación específica de sitio cre-lox*,
un reactivo transfectante genérico^{#}
\ding{61}cepas de E. coli que expresan
el gen pir para la propagación de derivados de pUCDM (puede
utilizarse cualquier otra cepa con fondo pir+)
*en los experimentos, se utilizaron como
controles vectores con genes para las proteínas fluorescentes ECFP
y EYFP. Estos genes se comercializan bajo licencia de Molecular
Probes. Resultan particularmente útiles como controles debido a que
la observación de la fluorescencia, mediante microscopía
fluorescente o mediante la utilización de un espectrofotómetro, es
muy sencilla. Sin embargo, puede utilizarse cualquier tipo de
plásmido de control portador de un gen codificante de una proteína
que pueda identificarse con facilidad (glucurodinasa, catecol
desoxigenasa, XylE, luciferasa, etc.).
^{#}Por ejemplo, CellFECTIN (Invitrogen), el
reactivo de transfección LipoTAXI® (Stratagene, etc.).
<110> Eidgenoessische Technische
Hochschule zurich
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas herramientas de expresión
para aplicaciones multiproteicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> RP20504
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-11-25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/552.072
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> baculovirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: vector
de baculovirus pFBDM
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3005
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> baculovirus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia: vector
de baculovirus pUCDM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Polinucleótido para aplicaciones
multigénicas, que comprende una disposición funcional según la
figura I:
comprendiendo dicha
disposición:
- (a)
- por lo menos dos casetes de expresión: \underbar{T1 - MCS1 - P1} y \underbar{P2 - MCS2 - T2} en una disposición de cabeza con cabeza, cabeza con cola o cola con cola, comprendiendo cada uno un sitio de clonación múltiple MCS1 o MCS2, flanqueado por un promotor P1 y una secuencia de terminador T1 para MCS1 y flanqueado por un promotor P2 y una secuencia de terminador T2 para MCS2,
- (b)
- por lo menos un módulo de multiplicación M intermedio de los promotores P1 y P2 que comprende por lo menos dos sitios de restricción A y B,
- (c)
- por lo menos dos sitios de restricción X e Y, flanqueando cada uno uno de los casetes de expresión,
en el que:
- (i)
- los sitios de restricción A y X, así como B e Y son compatibles, pero
- (ii)
- los productos de ligación de AY y de BX no son divididos enzimáticamente por los enzimas de restricción a, b, x o y, específicos para los sitios de restricción A, B, X e Y, e
- (iii)
- los sitios de restricción A y B, así como X e Y no son compatibles.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en
el que los sitios de restricción A y B en el módulo de
multiplicación M se seleccionan de entre el grupo que consiste en
BstZ17I, Spe, ClaI y NruI o enzimas de restricción que presentan
sitios de división idénticos a los de dichos enzimas
("isoesquizómeros").
3. Polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2,
en el que los sitios de restricción X e Y se seleccionan de entre
el grupo que consiste en PmeI y AvrlI o enzimas de restricción que
presentan sitios de división idénticos a los de dichos enzimas
("isoesquizómeros").
4. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los promotores P1 y P2 se
seleccionan de entre el grupo que consiste en promotores
baculovíricos muy tardíos polh, p10 y p_{XIV}, promotor
baculovírico tardío vp39, promotor baculovírico híbrido tardío/muy
tardío vp39polh, promotores baculovíricos tempranos P_{cap/polh},
pcna, etl, p35, egt, da26; CMV, SV40,
UbC, EF-1\alpha, RSVLTR, MT, P_{DS47}, Ac5,
P_{GAL} y P_{ADH}.
5. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que las secuencias de terminador T1 y
T2 se seleccionan de entre SV40, HSVtk o BGH (hormona de crecimiento
bovina).
6. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende además por lo menos un sitio
para su integración en un vector o célula huésped.
7. Polinucleótido según la reivindicación 6, en
el que el sitio de integración se selecciona de entre el grupo que
consiste en los elementos transposones de Tn7, sitios de unión
específica de integrasa \lambda y SSR (recombinasas específicas
de sitio), preferentemente el sitio de recombinación específica
cre-lox (LoxP) o el sitio de recombinación
específica de recombinasa FLP (FRT).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polinucleótido
comprende:
- (a)
- los promotores P1 y P2 seleccionados de entre polh y p10,
- (b)
- las secuencias de terminador seleccionadas de entre SV40 y HSVtk,
- (c)
- los sitios de restricción A y B en el módulo de multiplicación M seleccionados de entre el grupo que consiste en BstZ17I, SpeI, ClaI y NruI,
- (d)
- los sitios de restricción X e Y seleccionados de entre el grupo que consiste en PmeI y AvrII,
- (e)
- los sitios para la integración vírica seleccionados de entre el sistema de recombinación Tn7 y cre-lox.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Vector que comprende una secuencia de
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector según la reivindicación 9, en el que
dicho vector es un virus seleccionado de entre el grupo que
consiste en adenovirus, virus adenoasociado (AAV), parvovirus
autónomo, virus del herpes simplex (HSV), retrovirus, radinovirus,
virus de Epstein-Barr, lentivirus, virus del bosque
de Semliki y baculovirus.
11. Vector según la reivindicación 10, en el que
el vector es un vector de expresión baculovírico.
12. Vector según la reivindicación 11, en el que
los dos genes baculovíricos v-cath y
chiA se encuentran funcionalmente alterados.
13. Vector según las reivindicaciones 9 a 12,
que comprende además un sitio para las SSR (recombinasas específicas
de sitio), preferentemente LoxP para la recombinación específica de
sitio cre-lox.
14. Vector según las reivindicaciones 12 y 13,
en el que el sitio cre-lox se encuentra situado en
uno o en ambos de los genes baculovíricos
v-cath y chiA.
15. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, que comprende un elemento transposón,
preferentemente el sitio de unión de Tn7.
16. Vector según la reivindicación 9, en el que
dicho vector presenta la secuencia según la SEC ID nº 1 (pFBDM).
17. Vector según la reivindicación 9, en el que
dicho vector presenta la secuencia según la SEC ID nº 2 (pUCDM).
18. Célula huésped que comprende un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y/o un
vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17.
19. Célula huésped según la reivindicación 18,
seleccionada de entre el grupo que consiste en células de mamífero,
preferentemente células humanas, células de roedor, células
porcinas, células bovinas, células ovinas, y células de C.
elegans; células de levadura, preferentemente S.
cerevisiae, S. pombe, C. albicans y P.
pastoris; células de insecto; y células de E. coli.
20. Animal no humano recombinante que comprende
un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
y/o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17.
21. Animal no humano según la reivindicación 20,
en el que el animal se selecciona de entre los mamíferos,
preferentemente roedor, porcino y bovino y C. elegans.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Procedimiento para generar casetes de
expresión multigénica, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- clonar uno o más genes en MCS1 y/o MCS2 de un primer vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17,
- (b)
- clonar uno o más genes en MCS1 y/o MCS2 de un segundo vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17,
- (c)
- extraer la disposición funcional completa en los sitios de restricción X e Y en el primer vector de transferencia,
- (d)
- cortar el segundo vector de transferencia en el módulo de multiplicación M,
- (e)
- ligar la disposición funcional extraída de la etapa (c) en el sitio de multiplicación cortado del segundo vector de la etapa (d), produciendo así un tercer vector de transferencia que presenta el módulo de multiplicación del primer vector de transferencia y los casetes de expresión del primer y del segundo vector, y
- (f)
- repetir opcionalmente las etapas (a) a (e) para ensamblar un vector de transferencia con múltiples casetes de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento para producir complejos
multiproteicos in vitro, que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- generar casetes de expresión multigénica según la reivindicación 22,
- (b)
- transferir los casetes de expresión multigénica a una célula huésped que puede expresar dichos genes simultáneamente.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55207204P | 2004-03-09 | 2004-03-09 | |
| US552072P | 2004-03-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2333228T3 true ES2333228T3 (es) | 2010-02-18 |
Family
ID=34919595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES04803271T Active ES2333228T3 (es) | 2004-03-09 | 2004-11-25 | Nuevas herramientas de expresion para aplicaciones multiproteicas. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20080004228A1 (es) |
| EP (2) | EP2133428A1 (es) |
| JP (1) | JP4597188B2 (es) |
| AT (1) | ATE442450T1 (es) |
| AU (1) | AU2004316874B2 (es) |
| CA (1) | CA2558313C (es) |
| DE (1) | DE602004023128D1 (es) |
| ES (1) | ES2333228T3 (es) |
| WO (1) | WO2005085456A1 (es) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1910550A4 (en) | 2005-07-21 | 2009-11-04 | Abbott Lab | MULTIGENIC EXPRESSION COMPRISING SORF CONSTRUCTS AND METHODS USING POLYPROTEINS, PRO-PROTEINS, AND PROTEOLYSIS |
| EP1783228A1 (en) * | 2005-11-08 | 2007-05-09 | ETH Zürich | Recombinant expression of multiprotein complexes using polygenes |
| JP5152962B2 (ja) * | 2007-06-08 | 2013-02-27 | 国立大学法人静岡大学 | 目的タンパク質の製造方法 |
| GB0820631D0 (en) * | 2008-11-11 | 2008-12-17 | London School Hygiene & Tropical Medicine | Vectors |
| JP2012519476A (ja) | 2009-03-06 | 2012-08-30 | ヨーロピアン モレキュラー バイオロジー ラボラトリー | 多タンパク質複合体のクローニング及び発現のための核酸 |
| WO2010112533A1 (en) | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Enhanced production of papillomavirus-like particles with a modified baculovirus expression system |
| KR20120018783A (ko) | 2009-05-01 | 2012-03-05 | 레드바이오텍 아게 | 다중 유전자 벡터에 의해 암호화된 재조합 바이러스-유사 입자 |
| CN101947317B (zh) * | 2010-09-27 | 2012-05-30 | 武汉大学 | 一种h5n1禽流感病毒样颗粒疫苗的规模化制备方法 |
| FR2978456B1 (fr) | 2011-07-27 | 2015-02-20 | Genethon | Systeme baculoviral pour l'expression d'un vecteur de therapie genique |
| US8945876B2 (en) | 2011-11-23 | 2015-02-03 | University Of Hawaii | Auto-processing domains for polypeptide expression |
| WO2013100713A2 (ko) * | 2011-12-30 | 2013-07-04 | 이화여자대학교 산학협력단 | 효모 염색체 통합 또는 산업 스트레인 형질전환용 효모 발현 벡터, 그리고 이들의 용도 |
| KR101328481B1 (ko) * | 2011-12-30 | 2013-11-13 | 이화여자대학교 산학협력단 | 염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도 |
| ES2612854T3 (es) * | 2012-06-12 | 2017-05-19 | Alternative Gene Expression, S.L. | Elementos de ADN recombinante para la expresión de proteínas recombinantes en una célula huésped |
| US9701983B2 (en) | 2012-06-12 | 2017-07-11 | Alternative Gene Expression S.L. | Baculoviral DNA elements for the expression of recombinant proteins in a host insect |
| CN104735977B (zh) | 2012-06-12 | 2016-09-21 | 替代基因表达公司 | 用于在宿主细胞中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件 |
| WO2014141170A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Method for the generation of polycystronic vectors |
| EP3246406B1 (en) | 2015-01-16 | 2022-03-09 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Gene expression system using stealthy rna, and gene introduction/expression vector including said rna |
| CN104630271A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-05-20 | 浙江大学 | 可视化红色荧光杆状病毒的构建方法 |
| US10611800B2 (en) | 2016-03-11 | 2020-04-07 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus gB polypeptide |
| US10262981B2 (en) * | 2016-04-29 | 2019-04-16 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. | Integrated circuit, system for and method of forming an integrated circuit |
| CN107988259B (zh) * | 2018-01-12 | 2020-01-21 | 中国科学院生物物理研究所 | SmartBac杆状病毒表达系统及其应用 |
| MX2021001163A (es) | 2018-07-31 | 2021-07-15 | Imophoron Ltd | Péptidos multimerizantes derivados del dominio de pliegue kelly roll del capsómero pentagonal de adenovirus. |
| US11629172B2 (en) | 2018-12-21 | 2023-04-18 | Pfizer Inc. | Human cytomegalovirus gB polypeptide |
| WO2020264139A1 (en) * | 2019-06-26 | 2020-12-30 | Virovek, Inc. | Baculovirus expression system |
| WO2021110993A1 (en) * | 2019-12-04 | 2021-06-10 | Synbionik Gmbh | An efficient shuttle vector system for the expression of heterologous and homologous proteins for the genus zymomonas |
| CA3166852A1 (en) | 2020-02-05 | 2021-08-12 | Frederic Garzoni | Engineered polypeptides derived from variable domain of adenovirus penton base |
| CN111593072B (zh) * | 2020-05-12 | 2021-04-27 | 深圳海关动植物检验检疫技术中心 | 一种在昆虫细胞中共表达非洲猪瘟病毒四种结构蛋白的方法及其应用 |
| CA3183207A1 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Daniel Joseph Fitzgerald | Fatty acid complexes of coronavirus spike protein and their use |
| TWI810589B (zh) | 2020-06-21 | 2023-08-01 | 美商輝瑞股份有限公司 | 人巨細胞病毒糖蛋白Ｂ（ｇＢ）多肽 |
| AU2022334711A1 (en) * | 2021-08-23 | 2024-04-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Baculovirus expression system |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5169784A (en) * | 1990-09-17 | 1992-12-08 | The Texas A & M University System | Baculovirus dual promoter expression vector |
| US5871986A (en) * | 1994-09-23 | 1999-02-16 | The General Hospital Corporation | Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell |
| US6355240B1 (en) * | 1995-07-26 | 2002-03-12 | Basf Aktiengellschaft | Enhanced insecticidal insect virus through the expression of heterologous proteins with early promoters |
| EP2316919B1 (en) * | 2001-02-14 | 2015-10-07 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom |
| WO2004009768A2 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Invitrogen Corporation | Viral vectors containing recombination sites |
-
2004
- 2004-11-25 EP EP09011354A patent/EP2133428A1/en not_active Withdrawn
- 2004-11-25 AT AT04803271T patent/ATE442450T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-11-25 CA CA2558313A patent/CA2558313C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-25 DE DE602004023128T patent/DE602004023128D1/de active Active
- 2004-11-25 EP EP04803271A patent/EP1723246B1/en not_active Not-in-force
- 2004-11-25 AU AU2004316874A patent/AU2004316874B2/en not_active Ceased
- 2004-11-25 ES ES04803271T patent/ES2333228T3/es active Active
- 2004-11-25 WO PCT/EP2004/013381 patent/WO2005085456A1/en not_active Application Discontinuation
- 2004-11-25 JP JP2007502200A patent/JP4597188B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-25 US US10/592,066 patent/US20080004228A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-12-11 US US14/966,258 patent/US20160177336A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE442450T1 (de) | 2009-09-15 |
| CA2558313C (en) | 2011-05-17 |
| WO2005085456A1 (en) | 2005-09-15 |
| JP4597188B2 (ja) | 2010-12-15 |
| CA2558313A1 (en) | 2005-09-15 |
| EP1723246A1 (en) | 2006-11-22 |
| AU2004316874B2 (en) | 2011-01-06 |
| EP1723246B1 (en) | 2009-09-09 |
| JP2007527722A (ja) | 2007-10-04 |
| DE602004023128D1 (de) | 2009-10-22 |
| EP2133428A1 (en) | 2009-12-16 |
| US20080004228A1 (en) | 2008-01-03 |
| US20160177336A1 (en) | 2016-06-23 |
| AU2004316874A1 (en) | 2005-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2333228T3 (es) | Nuevas herramientas de expresion para aplicaciones multiproteicas. | |
| JP5075833B2 (ja) | ポリジーンを使用する多タンパク質複合体の組換え発現 | |
| Van Oers et al. | Thirty years of baculovirus–insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology | |
| Kouprina et al. | A new generation of human artificial chromosomes for functional genomics and gene therapy | |
| Mansouri et al. | Baculovirus for gene delivery to mammalian cells: Past, present and future | |
| US6291214B1 (en) | System for generating recombinant viruses | |
| Zitzmann et al. | Process optimization for recombinant protein expression in insect cells | |
| CN1418224A (zh) | Tcf效应元件 | |
| US20050201983A1 (en) | Engineered baculoviruses and their use | |
| Kaleri et al. | Generation of transgenic chicks using an oviduct-specific expression system | |
| US20220154149A1 (en) | Syncytial oncolytic herpes simplex mutants as potent cancer therapeutics | |
| Liskovykh et al. | Highly Efficient Microcell‐Mediated Transfer of HACs Containing a Genomic Region of Interest into Mammalian Cells | |
| KR100717091B1 (ko) | 레콤비나제 발현 세포 | |
| ES2554561B1 (es) | Nuevos promotores derivados de baculovirus con elevada actividad en sistemas de expresión basados en baculovirus | |
| JP4288259B2 (ja) | 動物細胞感染用の組換えｄｎａウイルスベクター | |
| Kumari et al. | Transgenic animals in biotechnology | |
| Yu et al. | YBac: A novel and simple baculovirus system for heterologous protein production in Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) cells | |
| US20160130588A1 (en) | Method for the generation of polycystronic vectors | |
| CN110117578A (zh) | 人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用 | |
| CN114292879A (zh) | 一种用于在对虾中递送和表达外源基因的对虾病毒表达系统 | |
| US20160002643A1 (en) | Compositions And Methods To Enhance Protein Expression | |
| Fernandes | Establishment and evaluation of flexible insect cell lines for rapid production of recombinant proteins | |
| WO2005067506A2 (en) | Method for monitoring and generating high capacity gutless adenoviral vector | |
| JPH104973A (ja) | 組換えバキュロウイルス及びその利用 |