CN110117578A - 人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用 - Google Patents

人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用 Download PDF

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李毅
朱记平
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Wuhan Bioengineering Institute
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Abstract

本发明公开了一种人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用，属于分子生物学及基因工程领域。将人博卡病毒的ITR区序列分为5个片段，分段连接到去除B19基因、添加多克隆位点的pB19‑4244d载体上，得到人博卡病毒1型感染性克隆。本发明的人博卡病毒1型感染性克隆，可用于制备基因治疗载体。酶切去除人博卡病毒1型感染性克隆的人博卡病毒基因1505nt‑4138nt，插入含启动子、外源基因的DNA片段，获得基因治疗载体。本发明构建的人博卡病毒1型感染性克隆可在细胞上有效复制，构建的人博卡病毒基因治疗载体可表达外源蛋白并对肿瘤细胞有杀伤效应。

Description

人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及基因工程领域，具体涉及人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用。
背景技术
人博卡病毒(Human bocavirus)是目前近年来发现的继细小病毒B19之后，第二种能对人类致病的细小病毒，该病毒通常在患有急性呼吸道感染的儿童患者的鼻咽物中检测到，世界范围内对其有广泛的流行病学报道，检出率一般介于2-19％。人博卡病毒1型(Human bocavirus 1，HBoV1)同多种常见的呼吸道病毒共感染，被认为是两岁以下儿童呼吸道病毒感染疾病中，继呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(adenovirus)和鼻病毒(rhinovirus)之后的第四种重要病毒感染源。急性呼吸道感染在发达国家的医院里是儿童感染的头号威胁。
虽然世界各地有众多关于HBoV1的研究和报道，但是绝大多数研究仅仅局限于流行病学调查，对病毒的感染机制和致病机理鲜有深入研究。究其原因，因为实际样本中病毒粒子滴度太低，很难分离得到足够量的病毒基因组DNA；HBoV1没有有效的易感细胞系，无法通过组织培养的方法扩增病毒。而细小病毒核酸末端又具有较强的二级回文结构，难于直接用PCR扩增获知其准确序列。因此，构建人博卡病毒感染性克隆，为HBoV1的各种研究提供了最重要的工具和最基本的信息，有助于详细研究该病毒感染特点，有助于对HBoV1感染机制和致病机理进行深入和广泛的探讨。
HBoV1被发现可作为靶向呼吸系统疾病的新型基因治疗载体。选用HBoV1作为基因治疗载体转导目的基因在靶细胞中的表达，具有下述优点：首先，HBoV1基因结构简单，存在复制非必须基因，为外源基因的插入提供了位点；其次，HBoV1操作容易，实验流程简单快捷，重组病毒易于构建，容易获得高滴度病毒粒子；三，HBoV1可感染原代细胞，感染效率高、稳定性高；四，HBoV1的感染具有很高的靶细胞/组织特异性；五，人博卡病毒的感染具有较低的免疫原性。
目前，关于HBoV1的致病机理及其与呼吸系统疾病的关系已成为研究热点，以HBoV1为对象，构建基因治疗病毒载体，在呼吸系统疾病的基因治疗方面有潜在的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人博卡病毒1型感染性克隆，本发明的目的还在于提供人博卡病毒1型感染性克隆的应用以及一种基因治疗载体。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种人博卡病毒1型感染性克隆，含有左右两端回文序列，可在细胞中进行核酸复制，通过分段连接人博卡病毒基因至载体，具体为通过包括下述步骤的方法构建得到：
(1)将pB19-4244d载体用Sal I酶切去除B19基因后再连接，得到Z-4244d载体。
(2)将含Sal I和Xho I粘性末端、序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段1与Sal I单酶切的Z-4244d载体片段进行连接，得到Z-4244d2载体。
(3)用Sal I和Hind III酶切序列SEQ ID NO.2所示的DNA片段2和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-2载体；用Sal I、Bcl I双酶切序列SEQ ID NO.3所示的DNA片段3，连接到经Sal I、Bgl II双酶切的Z-4244d2-2载体上得到Z-4244d2-2-3载体。
(5)用Sal I、Apa I酶切序列SEQ ID NO.4所示的DNA片段4和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-4载体；用Apa I、Xho I酶切序列SEQ ID NO.5所示的DNA片段5和Z-4244d2-4载体，连接，得到Z-4244d2-4-5载体；用Kas I酶切序列SEQ ID NO.6所示的DNA片段6和Z-4244d2-4-5载体，连接，得到Z-4244d2-4-5-6载体。
(6)将Z-4244d2-2-3载体用Sal I、Xho I双酶切，连接到经Sal I单酶切的Z-4244d2-4-5-6载体上，得到Z-4244d2-2-3-4-5-6载体；PCR扩增含HBoV1基因组编码区nt518-4139的片段，将该片段与Z-4244d2-2-3-4-5-6载体用BspE I、Bgl II双酶切后，连接，得到人博卡病毒1型感染性克隆pIHBoV1。
所述的人博卡病毒1型感染性克隆在制备基因治疗载体中的应用。
一种基因治疗载体，为酶切去除人博卡病毒1型感染性克隆的人博卡病毒基因
1505nt-4138nt，插入含启动子、外源基因的DNA片段，获得人博卡病毒基因治疗载体。优选的，所述的启动子为肿瘤特异性启动子，所述的外源基因为TNF基因。
进一步地，所述的基因治疗载体通过包括下述步骤的方法构建得到：
(1)将人博卡病毒感染性克隆pIHBoV1和序列如SEQ ID NO.7所示的DNA片段7用Hind III和Bgl II进行双酶切，连接，得到重组载体；
(2)PCR扩增或合成两端含酶切位点的外源基因片段，将该外源基因片段与步骤(1)得到的重组载体通过酶切、连接，得到基因治疗载体。
本发明的优点在于：本发明构建的人博卡病毒1型感染性克隆可在细胞上有效复制，构建的人博卡病毒基因治疗载体可表达外源蛋白并对肿瘤细胞有杀伤效应。
附图说明
图1是pIHBoV1的双酶切鉴定结果图。
图2是pIHBoV1复制功能检测结果图。
图3是rpHBoV1的双酶切鉴定结果图。
图4是rpHBoV1转染HEK293T后荧光显微镜观察EGFP表达的结果图。
图5是rpHBoV1-TNF的双酶切鉴定结果图。
图6是Western blot检测TNF的表达结果图。一抗为抗GFP多克隆抗体，rpHBoV1表达EGFP，大小约27kD；rpHBoV1-TNF表达EGFP-TNF融合蛋白，大小约52kD。
图7是Western blot检测rpHBoV1-TNF转染细胞后诱导caspase 3活化结果图。
图8是rpHBoV1-TNF抑制HEK293T细胞活性结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1人博卡病毒感染性克隆的构建
(1)将质粒pB19-4244d(pB19-4244d的构建见文献Construction and sequencingof an infectious clone of the human parvovirus B19)用Sal I酶切去除B19基因后再连接，得到Z-4244d载体。
(2)合成含多克隆位点的、序列如SEQ ID NO.1所示的片段1，该片段序列为GTCGACCCGCGG GGTACC CCCGGG GGGCCC GCATGC GGTACC AAGCTT CTCGAG，其包含以下酶切位点：5’-SalI-SacII-KpnI-SmaI-ApaI-SphI-KpnI-HindIII-XhoI-3’。取片段1的两条单链DNA(sense：5’-TCGACCCGCGGGGTACCCCCGGGGGGCCCGCATGCGGTACCAAGCTTC-3’，antisense：5’-TCGAGAAGCTTGGTACCGCATGCGGGCCCCCCGGGGGTACCCCGCGGG-3’)各50pmol，混匀，置于95℃5min，自然冷却至室温，稀释至合适浓度，与Sal I单酶切的Z-4244d载体片段进行连接反应：5×连接酶反应缓冲液4μL，载体30fmol，插入DNA片段90fmol，T4DNA连接酶1μL(10U)，用无菌水补足体积至20μL。混匀，室温反应15min。取DH5α感受态细胞置于冰上解冻，取连接反应产物10μL加入感受态细胞中，混匀，静置于冰上30min，于42℃热激1min，立即置于冰上，约5min，加1mL无抗性LB液体培养基，混匀，于37℃孵育1h。细胞均匀涂布在含Amp的抗性平板上，经过筛选、鉴定获得含多克隆位点的Z-4244d2载体。
(3)对人博卡病毒的左右ITR区序列进行序列分析，将ITR区序列分为5个片段(序列如SEQ ID NO.2-6所示)进行人工合成，所合成5个片段的序列分别为：
片段2(SEQ ID NO.2)：
GTCGACAGATCTaatcgccggcagacatattggattccaagatggcgcatgtgcaaccacgtcacatataaaataataaatattcacaaggaggagtggttatatgatgtaatccataaccactctcaggaaatgacgtatgatagccaatcagaattgagtattaaacctatataagctgctgcacttcctgattcaatcagactgcatccggtctccggcgagtgaacatctctggaaaaagctccacgcttgtggtgagtctactatggctttcaatcctcctgtgattagagctttttctcaacctgcttttacttatgtcttcaaatttccatatccacaatggaaagaaaaagaatggctgcttcatgcacttttagctcatggaactgaacaatctatgatacaattaagaaactgcgctcctcatccggatgaagacataatccgtgatgacttgcttatttctttagaagatcgccattttggggctCTCGAGAAGCTT；该片段为SalⅠ-BglⅡ-人博卡病毒基因93-576nt-XhoⅠ-HindⅢ。
片段3(SEQ ID NO.3)：
GTCGACgtggttgcacatgcgccatcttggaatccaatatgtctgccggctcagtcatgcctgcgctgcgcgcagcgcgctgcgcgcgcgcaTGATCA；该片段为SalⅠ-人博卡病毒基因1-86nt-BclⅠ。
片段4(SEQ ID NO.4)：
GTCGACctttttcaatatggatatattcctattgaaaatgaactcgcagatcttgatggaaatgcagctggaggcaatgctacagaaaaagcacttctgtatcagatgcctttttttctacttgaagacagtgaccaccaagtacttagaactggtgagagcactgaatttacttttaactttgactgtgaatgggttaacaatgaaagagcatacattcctcctggactaatgtttaatccaaaagtcccaacaagaagagttcagtacataagacaaaacggaagcacagcagccagcacaggcagaattcagccatactcaaaaccaacaagctggatgacaggacctggcctgctcagtgcacaaagagtaggaccacagtcatcagacactgctccattcatggtttgcactaacccagaaggaacacacataaacacaggtgctgcaggatttggatctggctttgatcctccaagcggatgtctggcaccaactaacctagaatacaaacttcagtggtaccagacaccagaaggaacaggaaataatggaaacataattgcaaacccatcactctcaatgcttagagaccaactcctatacaaaggaaaccagaccacatacaatctagtgggggacttatggatgtttccaaatcaagtctgggacagatttcctatcaccagagaaaatccaatctggtgcaaaaaaccaagggctgacaaacacacaatcatggatccatttgatggatcaattgcaatggatcatcctccaggcactatttttataaaaatggcaaaaattccagttccaactgcctcaaatgcagactcatacctaaacatgtactgtactggacaagtcagctgtgaaattgtatgggaggtagaaagatacgcaacaaagaactggcgtccagaaagaagacatactgcactcgggatgtcactgggaggagagagcaactacacgcctacataccacgtggatccaacaggagcatacatccagcccacgtcatatgatcagtgtatgccagtaaaaacaaacatcaatgaagtgttgtaatcttataagcctcttttttgcttctgcttacaagttcctcctcaatggacaagcggaaagtgaagggtgactgtagtcctgagctcatgggttcaagaccacagcccgatggtagtggtgttaccgtctcgaacctagccgacagcccttgtacattgtggggggagctgttttgtttgcttatgcaatcgcgaaactctatatcttttaatgtgttgttgttgtacatgcgccatcttagttttatatcagctggcgccGGGCCC；该片段为SalⅠ-人博卡病毒基因4097-5427nt-ApaⅠ。
片段5(SEQ ID NO.5)：
GGGCCCggcgccagctgatataaaactaagatggcgcatgtacaacaacaacacattaaaagatatagagtttcgcgattgcataagcaaCTCGAG；该片段为ApaⅠ-人博卡病毒基因5460-5543nt-XhoⅠ。
片段6(SEQ ID NO.6)：
GGCGCCttagttatataacatgcatgttatataactaaGGCGCC；该片段为KasⅠ-人博卡病毒基因5428-5459nt-KasⅠ。
(4)用SalI和HindIII酶切片段2和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-2载体；用SalI、BclI双酶切片段3，连接到经SalI、BglII双酶切的Z-4244d2-2载体上得到含有HBoV1完整左侧发夹结构的Z-4244d2-2-3载体。该载体转化至大肠杆菌sure感受态，并保存菌种。
(5)将片段4经Sal I、Apa I双酶切连接到经Sal I、Apa I双酶切的Z-4244d2载体上得到Z-4244d2-4载体。将片段5经Apa I、Xho I双酶切连接到经ApaI、XhoI双酶切的Z-4244d2-4载体上得到Z-4244d2-4-5载体。将片段6连接到经KasI酶切后的Z-4244d2-4-5载体上，得到包含HBoV1右侧发夹结构全部序列的Z-4244d2-4-5-6载体。该载体转化至大肠杆菌sure感受态，并保存菌种。
(7)将Z-4244d2-2-3载体经SalI、XhoI双酶切，连接到经Sal I单酶切的Z-4244d2-4-5-6载体上，得到Z-4244d2-2-3-4-5-6载体。HBoV1基因组编码区的长片段nt518(BspEI)-4139(Bgl II)从pWHL中PCR扩增得到，经BspEI、BglII双酶切之后连接到经BspEI/Bgl II双酶切的Z-4244d2-2-3-4-5-6载体上，获得包含HBoV1全基因组序列的载体，该载体命名为pIHBoV1，即为人博卡病毒感染性克隆。该载体转化至大肠杆菌sure感受态，并保存菌种。
将pIHBoV1载体用Hind III和Bgl II双酶切后通过琼脂糖电泳进行鉴定，可观察到约5.9kb和2.6kb的条带(图1)，表明pIHBoV1构建成功。
将HEK293T细胞接种至6孔板，用完全培养基DMEM(含10％FBS)培养细胞汇合度至70-80％，每孔加入2μg pIHBoV1载体和2μL lip2000进行转染，转染后48h收取细胞样本。提取细胞样本中的Hirt DNA，将提取的Hirt DNA用限制性内切酶DpnⅠ进行酶切消化。消化后的产物用Southern Blot进行复制功能检测，结果见图2。结果表明，pIHBoV1可在HEK293T细胞中有效复制，并且在复制过程中产生了dRF DNA、mRF DNA和ssDNA三种DNA。
实施例2重组人博卡病毒基因治疗载体的构建
将pIHBoV1用Hind III和Bgl II进行双酶切，去除1505-4138nt基因，一方面为容纳外源基因提供空间，另一方面缺失非结构蛋白(HBoV1核酸复制必需蛋白)表达，提高基因治疗载体安全性。
人工合成序列如SEQ ID NO.7所示的DNA片段，该片段含肿瘤特异性启动子、荧光标签蛋白、多克隆位点，命名为hTERTp-E。
将hTERTp-E用Hind III和Bgl II双酶切后连接至用同样酶双酶切的载体pIHBoV1上，通过转化(感受态细胞为大肠杆菌Sure)、筛选、鉴定得到重组载体rpHBoV1，即得到重组人博卡病毒基因治疗载体rpHBoV1。其中鉴定为将载体用Hind III和Bgl II双酶切后通过琼脂糖电泳进行鉴定，可观察到约5.9kb和1.0kb的条带(图3)，表明rpHBoV1构建成功，获得了含外源片段的重组人博卡病毒基因治疗载体rpHBoV1。
实施例3重组人博卡病毒基因治疗载体rpHBoV1的应用
(1)将rpHBoV1转染人胚肾细胞系HEK293T细胞，培养48小时后，观察细胞中荧光标签蛋白的表达，确定rpHBoV1对外源基因的递送效率。结果表明(图4)，70％的细胞表达标签蛋白，重组载体递送效率高。
(2)以人源cDNA为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得TNF基因(Genbank：NM_000594.4)：
TNF-pI F2：GC TCTAGA GGAGGTTCAGGAGGT AGCACTGAAAGCATGATCCGG(含Xba I酶切位点)；
TNF-pI R2：CG ACGCGT TCACAGGGCAATGATCCCAA(含Mlu I酶切位点)。
将上述PCR扩增产物和rpHBoV1用Xba I、Mlu I双酶切后进行连接，通过转化(感受态细胞为大肠杆菌Sure)、筛选、鉴定得到TNF基因的重组人博卡病毒基因治疗载体rpHBoV1-TNF。其中鉴定为载体用Xba I、Mlu I双酶切后通过琼脂糖电泳进行鉴定，可观察到约6.9kb和0.7kb的条带(图5)，表明rpHBoV1-TNF构建成功，获得了含TNF基因的重组人博卡病毒基因治疗载体rpHBoV1-TNF。将HEK293T细胞接种至6孔板，用完全培养基DMEM(含10％FBS)培养细胞汇合度至70-80％，每孔加入2μg rpHBoV1-TNF载体和2μL lip2000进行转染，培养48小时后，收集细胞样品。Western blot检测TNF的表达(图6)和细胞凋亡相关蛋白caspase 3活化(图7)，CCK-8检测细胞活性受到抑制(图8)，结果表明，rpHBoV1-TNF可有效杀伤肿瘤细胞。
上述CCK-8检测细胞活性的方法如下：向96孔板每个孔加入100μL细胞悬液。将孔板于培养箱内培养24h后，向孔板中转染0.1μg质粒。将孔板于培养箱内培养48h后，避光向每孔加入10μL CCK-8溶液，将孔板避光放在培养箱内孵育2h，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值。
细胞存活率利用以下公式进行计算：
细胞存活率％＝(待测组OD450nm值－空白对照组OD450nm值)/(正常细胞对照组OD450nm值－空白对照组OD450nm值)×100％；
待测组：具有细胞、CCK-8溶液和转染质粒的孔；空白对照组：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔；正常细胞对照组：具有细胞、CCK-8溶液而没有转染质粒的孔。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉生物工程学院
<120> 人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgacccgc ggggtacccc cggggggccc gcatgcggta ccaagcttct cgag 54
<210> 2
<211> 508
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgacagat ctaatcgccg gcagacatat tggattccaa gatggcgcat gtgcaaccac 60
gtcacatata aaataataaa tattcacaag gaggagtggt tatatgatgt aatccataac 120
cactctcagg aaatgacgta tgatagccaa tcagaattga gtattaaacc tatataagct 180
gctgcacttc ctgattcaat cagactgcat ccggtctccg gcgagtgaac atctctggaa 240
aaagctccac gcttgtggtg agtctactat ggctttcaat cctcctgtga ttagagcttt 300
ttctcaacct gcttttactt atgtcttcaa atttccatat ccacaatgga aagaaaaaga 360
atggctgctt catgcacttt tagctcatgg aactgaacaa tctatgatac aattaagaaa 420
ctgcgctcct catccggatg aagacataat ccgtgatgac ttgcttattt ctttagaaga 480
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 1343
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgaccttt ttcaatatgg atatattcct attgaaaatg aactcgcaga tcttgatgga 60
aatgcagctg gaggcaatgc tacagaaaaa gcacttctgt atcagatgcc tttttttcta 120
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tttgactgtg aatgggttaa caatgaaaga gcatacattc ctcctggact aatgtttaat 240
ccaaaagtcc caacaagaag agttcagtac ataagacaaa acggaagcac agcagccagc 300
acaggcagaa ttcagccata ctcaaaacca acaagctgga tgacaggacc tggcctgctc 360
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ccagaaggaa cacacataaa cacaggtgct gcaggatttg gatctggctt tgatcctcca 480
agcggatgtc tggcaccaac taacctagaa tacaaacttc agtggtacca gacaccagaa 540
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aatcaagtct gggacagatt tcctatcacc agagaaaatc caatctggtg caaaaaacca 720
agggctgaca aacacacaat catggatcca tttgatggat caattgcaat ggatcatcct 780
ccaggcacta tttttataaa aatggcaaaa attccagttc caactgcctc aaatgcagac 840
tcatacctaa acatgtactg tactggacaa gtcagctgtg aaattgtatg ggaggtagaa 900
agatacgcaa caaagaactg gcgtccagaa agaagacata ctgcactcgg gatgtcactg 960
ggaggagaga gcaactacac gcctacatac cacgtggatc caacaggagc atacatccag 1020
cccacgtcat atgatcagtg tatgccagta aaaacaaaca tcaatgaagt gttgtaatct 1080
tataagcctc ttttttgctt ctgcttacaa gttcctcctc aatggacaag cggaaagtga 1140
agggtgactg tagtcctgag ctcatgggtt caagaccaca gcccgatggt agtggtgtta 1200
ccgtctcgaa cctagccgac agcccttgta cattgtgggg ggagctgttt tgtttgctta 1260
tgcaatcgcg aaactctata tcttttaatg tgttgttgtt gtacatgcgc catcttagtt 1320
ttatatcagc tggcgccggg ccc 1343
<210> 5
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcccggcg ccagctgata taaaactaag atggcgcatg tacaacaaca acacattaaa 60
agatatagag tttcgcgatt gcataagcaa ctcgag 96
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcgccttag ttatataaca tgcatgttat ataactaagg cgcc 44
<210> 7
<211> 1065
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaagcttt acggctagca gggcttccca cgtgcgcagc aggacgcagc gctgcctgaa 60
actcgcgccg cgaggagagg gcggggccgc ggaaaggaag gggaggggct gggagggccc 120
ggagggggct gggccgggga cccgggaggg gtcgggacgg ggcggggtcc gcgcggagga 180
ggcggagctg gaaggtgaag gggcaggacg ggtgcccggg tccccagtcc ctccgccacg 240
tgggaagcgc ggtcctgggc gtctgtgccc gcgaatccac tattaatcgt agccaccctc 300
gagatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 360
gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 420
tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 480
accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 540
aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 600
ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 660
ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 720
cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 780
aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 840
gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 900
cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 960
gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 1020
tctagagtcg acacgcgtgc ggccgctaat taattaaaga tctag 1065

Claims (7)

1.一种人博卡病毒1型感染性克隆的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)将pB19-4244d载体用Sal I酶切去除B19基因后再连接，得到Z-4244d载体；
(2)将含Sal I和Xho I粘性末端、序列如SEQ ID NO.1所示的DNA片段1与Sal I单酶切的Z-4244d载体片段进行连接，得到Z-4244d2载体；
(3)用Sal I和Hind III酶切序列SEQ ID NO.2所示的DNA片段2和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-2载体；用Sal I、Bcl I双酶切序列SEQ ID NO.3所示的DNA片段3，连接到经Sal I、Bgl II双酶切的Z-4244d2-2载体上得到Z-4244d2-2-3载体；
(5)用Sal I、Apa I酶切序列SEQ ID NO.4所示的DNA片段4和Z-4244d2载体，连接，得到Z-4244d2-4载体；用Apa I、Xho I酶切序列SEQ ID NO.5所示的DNA片段5和Z-4244d2-4载体，连接，得到Z-4244d2-4-5载体；用Kas I酶切序列SEQ ID NO.6所示的DNA片段6和Z-4244d2-4-5载体，连接，得到Z-4244d2-4-5-6载体；
(6)将Z-4244d2-2-3载体用Sal I、Xho I双酶切，连接到经Sal I单酶切的Z-4244d2-4-5-6载体上，得到Z-4244d2-2-3-4-5-6载体；PCR扩增含HBoV1基因组编码区nt518-4139的片段，将该片段与Z-4244d2-2-3-4-5-6载体用BspE I、Bgl II双酶切后，连接，得到人博卡病毒感染性克隆pIHBoV1。
2.一种人博卡病毒1型感染性克隆，其特征在于：通过权利要求1所述的构建方法得到。
3.权利要求2所述的人博卡病毒1型感染性克隆在制备基因治疗载体中的应用。
4.一种基因治疗载体的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：酶切去除权利要求2所述的人博卡病毒1型感染性克隆的人博卡病毒基因1505nt-4138nt，插入含启动子、外源基因的DNA片段，获得基因治疗载体。
5.根据权利要求4所述的基因治疗载体的构建方法，其特征在于：所述的启动子为肿瘤特异性启动子，所述的外源基因为TNF基因。
6.根据权利要求4所述的基因治疗载体的构建方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)将人博卡病毒感染性克隆pIHBoV1和序列如SEQ ID NO.7所示的DNA片段7用HindIII和Bgl II进行双酶切，连接，得到重组载体；
(2)PCR扩增或合成两端含酶切位点的外源基因片段，将外源基因片段与步骤(1)得到的重组载体通过酶切、连接，得到基因治疗载体。
7.一种基因治疗载体，其特征在于：通过权利要求4-6任一项所述的构建方法得到。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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