CN105431170A - 嵌合腺相关病毒/博卡病毒细小病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒(bocavirus)衣壳蛋白质和重组型腺相关病毒(AAV)基因体；经分离的rBoV，其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和重组型BoV基因体，以及其用途。

Description

嵌合腺相关病毒/博卡病毒细小病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请案要求2013年4月8日提交的美国申请案第61/809,702号的申请日的权利，其公开内容并入本文中。
政府权利的声明
本发明是在政府支持下，在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的HL108902下进行。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
基因疗法自1990年以来已广泛用于临床试验，其中报导多个使用病毒或非病毒载体传递治疗基因的成功案例。肺对于具有固有基因缺陷(如囊肿性纤维化(CF)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)不足)或其它慢性后天性呼吸道病症(如哮喘和肺癌)的患者的基因疗法治疗来说是重要器官。其中，由编码蛋白质囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)的单基因缺陷引起的肺病CF是最常见的危及生命的基因缺陷固有疾病，其仅在美国每年便花费约45000万美元用于患者护理。尽管近十年来，临床治疗具有改良的CF患者生活质量和寿命，但对于这种单基因缺陷固有疾病，基因疗法通过置换缺陷性CFTR基因以永久地矫正病症来呈现最佳治愈(米勒(Mueller)等人,2008；德瑞斯科尔(Driskell)等人,2003；格里森巴赫(Griesenbach)等人,2010)。
CF是由CFTR基因编码中的突变引起的常染色体隐性基因病症(罗门斯(Rommens)等人,1989)。其是多器官疾病，但CF肺病是最能危及生命的(罗伊(Rowe)等人,2005)。重组型腺相关病毒载体(rAAV)是当前研究用于CF肺基因疗法的一种基因疗法药剂(格里森巴赫等人,2010；弗洛狄(Flotte),2007；卡特(Carter),2005)。
用于CF肺基因疗法的rAAV载体已研究接近二十年，并且大部分血清型似乎由呼吸道上皮细胞的顶端表面内吞而与转导(即经编码的转基因的表达)的变化程度无关。尽管这些载体在参看临床试验中显示良好的安全性概况(艾特肯(Aitken)等人,2001；莫斯(Moss)等人,2007；瓦格纳(Wagner)等人,2002)，但其由于两个重要原因而未能实现体内互补。首先，感染之后的病毒粒子处理中的进入后障壁似乎以蛋白酶体依赖性方式限制细胞核易位，并且因此限制转基因表达(段(Duan)等人,2000；丁(Ding)等人,2005；颜(Yan)等人,2002；钟(Zhong)等人,2008；钟等人,2007)。rAAV2的这一特征反映在CF临床试验中，其中病毒基因组留存在测试个体的呼吸道上皮细胞中并且未检测到转基因衍生的CFTRmRNA或肺功能的临床改良(艾特肯等人,2001；莫斯等人,2007；瓦格纳等人,2002)。由于动物模型与人类之间的物种特异性差异，已证明鉴别可避免这些局限性的适合的rAAV血清型具有挑战性(弗洛狄等人,2010；刘(Liu)等人,2007a；刘等人,2007b)。已证明rAAV1是用于人类呼吸道顶端感染的最有效血清型(弗洛狄等人,2010；颜等人,2012；颜等人,2006)，而其它人在使用引导型衣壳进化以增强顶端人类上皮(HAE)转导中rAAV的向性方面取得成功(李(Li)等人,2009；埃克斯科丰(Excoffon)等人,2009)。然而，CFHAE中的有效CFTR互补仍需要使用蛋白酶体抑制剂以增强转导(李等人,2009；张等人,2004)。
来自rAAV载体的有效CFTR表达的第二个主要障碍是其有限的封装能力(约4.9kb)，其必须使用小型弱启动子和/或使用CFTR小基因(张等人,1998)。临床试验中测试的第一代rAAV-CFTR使用AAV2ITR内的隐藏启动子驱动全长CFTRcDNA的表达(艾特肯等人,2001)，并且这随后通过并入短83bp合成启动子得到改良(张等人,2004)。其它避开rAAV载体的小填充能力的努力包括通过删除非关键序列(如R结构域处的部分缺失)以扩展核心启动子元件(如缩短的CMV启动子)的空间来削减CFTRcDNA的尺寸(李等人,2009；张等人,1998；奥斯特加德(Ostedgaard)等人,2005；奥斯特加德等人,2002)。尽管这些策略具有改良的CFTR表达，但显而易见的是，推动rAAV的封装限制可引起rAAV基因体的5'端处的不一致缺失(卡普拉诺夫(Kapranov)等人,2012)，因此进一步损害基因体稳定性和表达。
发明内容
如本文中所述，重组型人类博卡病毒-1(HBoV-1)是由ORF破坏的rHBoV1基因体产生，其从顶端表面有效转导人类呼吸道上皮(HAE)。HBoV1的较大基因体和高呼吸道向性对于产生用于基因转移(例如呼吸道基因转移)的病毒载体来说是理想的，包括用于遗传性和后天性疾病的基因疗法，如遗传性和后天性肺部疾病、癌症，以及例如针对呼吸道疾病的疫苗。如本文中进一步描述，产生rAAV2/HBoV1嵌合病毒(例如约5.5kb基因体)，其中HBoV1衣壳封装尺寸过大的rAAV2基因组。临床试验支持在用于囊肿性纤维化(参看)肺病的基因疗法情形下应用rAAV2基因体的安全性。嵌合载体保持rAAV2基因体的高安全性概况，同时还提供HBoV1衣壳的呼吸道顶端向性。已证实rAAV2/HBoV1能够以比rAAV1或rAAV2(4.7kb基因组)分别大5.6倍和70倍的功效顶端转导HAE。分子研究表明HBoV1衣壳介导的基因转移需要呼吸道上皮细胞的极化。此外，含有全长CFTR编码序列和强CBA启动子的rAAV2/HBoV1-CFTR病毒可有效矫正囊肿性纤维化HAE中的CFTR依赖性氯离子传递。因此，嵌合AAV/HBoV病毒载体适用于囊肿性纤维化和其它肺部疾病的基因疗法，以及研发针对HBoV1感染和其它呼吸道病毒(如流感病毒)的疫苗。在感染期期间的蛋白酶体抑制剂的共同投药还使AAV/HBoV1嵌合载体转导显著增强一千倍。
因此，本发明提供基因转移载体，例如用于人类肺疾病基因疗法和疫苗。载体对人类呼吸道具有高向性，具有HBoV衣壳之大封装能力并且使rAAV基因体有效衣壳化。作为高效呼吸道转导载体，载体可用于CF基因疗法策略，以及用于其它肺部疾病的基因疗法，如AAT不足、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肺癌以及针对野生型HBoV感染和其它呼吸道感染(如流感病毒和呼吸道合胞体病毒(RSV)感染)的疫苗接种，例如在婴儿、幼童、青少年或成年人中。
本发明还提供用于研发具有rAAV基因组的基于博卡病毒(BoV)的基因转移疫苗的平台，其用于人类、宠物和家畜，包括(但不限于)肺部疾病。基因转移载体的博卡病毒衣壳(例如重组型博卡病毒载体(rBoV)和嵌合腺相关/博卡病毒细小病毒载体(rAAV/BoV))可来自人类博卡病毒和非人类博卡病毒的不同染色。人类博卡病毒1(HBoV1)是具有感染呼吸道的向性的呼吸性病毒，并且人类博卡病毒2到博卡病毒4(HBoV2、HBoV3和HBoV4)是具有感染胃肠道的向性的肠病毒。已从非人类哺乳动物分离非人类博卡病毒，如猪博卡病毒、犬博卡病毒和猫博卡病毒。
在一个实施例中，本发明提供经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质(例如人类博卡病毒衣壳蛋白质)和重组型异源细小病毒基因体(例如重组型腺相关病毒(AAV)基因体)。举例来说，rAAV基因体可包括编码异源基因产物的表达盒，例如其是治疗性蛋白质，如囊性纤维化跨膜传导调控因子、α-抗胰蛋白酶、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白或红血球生成素；抗原，如病毒、细菌、肿瘤或真菌抗原；或靶向抗原的抗原决定基的中和性抗体或其片段，如来自人类呼吸道病毒(例如流感病毒或RSV)的抗原。在一个实施例中，基因产物是治疗性基因产物。在一个实施例中，基因产物是预防性基因产物。在一个实施例中，基因产物是催化性RNA。在一个实施例中，基因产物是多肽或肽。在一个实施例中，衣壳蛋白质是HBoV1、HBoV2、HBoV3或HBoV4衣壳蛋白质。在一个实施例中，博卡病毒衣壳蛋白质是来自从非人类物种分离的博卡病毒(例如猪博卡病毒)，其提供肺或其它器官的感染的独特向性。在一个实施例中，用于疫苗接种的rAAV/HBoV或rAAV/BoV载体用于动物中以保护家畜或宠物。在一个实施例中，AAV基因体是AAV-1、AAV-2或AAV-5基因体。在一个实施例中，AAV基因体是AAV-1、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8或AAV-9基因体。
本发明范围内的BoV序列包括(但不限于)与具有例如SEQIDNo9、17-18、39或42-43中的一个的连续序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％核酸序列一致性的核酸序列，或其补体。本发明范围内的BoV衣壳序列包括(但不限于)与具有例如SEQIDNo21-24、39-41或44-45中的一个的序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致性的氨基酸序列。
本发明提供制备包含博卡病毒(BoV)衣壳蛋白质和重组型异源细小病毒基因体(如重组型AAV(rAAV)基因体)的嵌合病毒的方法。所述方法包括提供以下载体：第一载体，其包含重组型AAV基因体的核酸序列；第二载体，其包含用于AAV复制的一个或多个腺病毒基因(例如E4orf6基因、E2A蛋白质基因和VARNA基因中的一个或多个)的核酸序列；第三载体，其包含编码一种或多种Rep蛋白质(例如Rep40、Rep52、Rep68或Rep78)的核酸序列；以及第四载体，其包含末端序列，所述末端序列是缺失型博卡病毒基因体，其编码BoV1衣壳和基因产物用于衣壳化。用可有效产生嵌合病毒的量的载体转染细胞，例如哺乳动物或昆虫细胞。在一个实施例中，用于引入昆虫细胞的载体包括AAV2Rep辅助杆状病毒(Bac-AAV2Rep)，其表达AAV2Rep78/Rep52；HBoV1Cap辅助病毒(Bac-HBoVCap)，其表达HBoV1衣壳蛋白质VP1、VPx和VP2；以及转移载体(Bac-rAAV)，其含有携载相关基因(GOI)的rAAV2基因体。用可有效产生嵌合病毒的量的这些杆状病毒载体感染昆虫细胞。
在一个实施例中，嵌合病毒可不包括转基因，但具有ITRs和非编码序列(“填充”序列)。这类病毒具有诱导体液反应的衣壳(例如HBoV衣壳)并且因此适用作疫苗。在一个实施例中，嵌合病毒传递到肺。在一个实施例中，嵌合病毒传递到鼻、气管支气管和/或肺。在一个实施例中，嵌合病毒是由感染其它器官(如胃肠道)的BoV病毒株产生。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染人类。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染动物，如家畜或宠物。
在一个实施例中，嵌合病毒包括转基因，其基因产物促进对BoV的体液或细胞反应并且具有ITR。作为对BoV衣壳的体液反应和由转基因的表达增强的免疫反应(体液和/或细胞)的结果，这类病毒适用作疫苗。在一个实施例中，嵌合病毒传递到肺。在一个实施例中，嵌合病毒传递到鼻、气管支气管和/或肺。在一个实施例中，嵌合病毒由感染其它器官的BoV病毒株产生。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染人类。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染动物，如家畜或宠物。
在一个实施例中，嵌合AAV/BoV病毒包括转基因并且具有ITR。转基因可编码任何抗原(例如肿瘤抗原)、BoV蛋白质(但不是允许BoV复制的蛋白质)、流感病毒蛋白质(例如H1或N1蛋白质)或SARS病毒基因(如衣壳基因)，或免疫反应调节剂，例如细胞激素，包括(但不限于)IFN-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子、IL-1、IL-17或IL-6，或其它可增强细胞或体液免疫反应的基因产物。在一个实施例中，嵌合病毒传递到肺。在一个实施例中，嵌合病毒传递到鼻、气管支气管和/或肺。在一个实施例中，嵌合病毒由感染其它器官的BoV病毒株产生。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染人类。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染动物，如家畜或宠物。
在一个实施例中，转基因可编码被动免疫接种的抗体，例如针对呼吸道病毒感染，例如靶向不同流感病毒株中的保存性抗原决定基的大体上中和型抗体，或针对其它呼吸道病毒，如呼吸道合胞体病毒(RSV)和SARS病毒。在一个实施例中，嵌合病毒是由感染除呼吸道以外的器官的BoV病毒株产生。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染人类。在一个实施例中，嵌合病毒用于感染动物，如家畜或宠物。
还提供用于增强哺乳动物细胞的嵌合病毒转导的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞(例如人类细胞)与经分离的包含博卡病毒衣壳蛋白质的嵌合病毒和编码异源基因产物的rAAV基因体以及可有效额外或协同增强rAAV转导的量的至少一种药剂接触。在一个实施例中，哺乳动物细胞是哺乳动物肺细胞。在一个实施例中，药剂是化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂。在一个实施例中，哺乳动物细胞是除肺以外的哺乳动物细胞，其中博卡病毒的替代性病毒株(从人类或其它动物分离)可实现有效感染。在一个实施例中，药剂是蛋白酶体调节剂，例如蛋白酶体抑制剂。
本发明包括用于增强哺乳动物细胞(例如哺乳动物肺细胞)的病毒转导的方法。举例来说，哺乳动物肺细胞与包含博卡病毒衣壳蛋白质的嵌合病毒和rAAV基因体以及与未与所述药剂接触哺乳动物细胞相比可有效增强病毒转导的量的药剂接触，其中药剂是蛋白酶体抑制剂。
在一个实施例中，本发明提供用于增强哺乳动物细胞(如哺乳动物肺细胞)中转基因的表达的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞与一定量的药剂(其是蛋白酶体抑制剂)和包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和包含转基因的rAAV基因体接触，其中所述量促进rAAV的转导，从而与未与药剂接触的哺乳动物细胞相比增强转基因的表达。
在一个实施例中，本发明提供使哺乳动物免疫的方法。所述方法包括使哺乳动物与包含博卡病毒衣壳蛋白质的嵌合病毒和重组型异源细小病毒基因体(例如rAAV基因体)接触，所述基因体包含适用于诱发针对抗原(例如微生物抗原，如病毒、细菌、寄生虫或真菌，或肿瘤抗原)的保护性免疫反应的转基因，或适用于预防病原体(包括(但不限于)病毒、细菌、真菌或寄生虫)感染的中和型抗体或其片段。在一个实施例中，哺乳动物还与蛋白酶体抑制剂接触。在一个实施例中，转基因编码中和型抗体或其抗原结合片段。因此，嵌合病毒可用作疫苗，例如被动疫苗。
还提供用于抑制或治疗与内源性基因产物的异常表达相关的病状的方法。所述方法包括使具有罹患病状的风险或罹患病状的哺乳动物与有效量至少一种可促进转导的蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂以及有效量的经分离的包含博卡病毒衣壳蛋白质的嵌合病毒和rAAV基因体接触，其中基因体包含编码功能性基因产物的至少一部分的转基因，所述功能性基因产物于哺乳动物中的表达可抑制或治疗病状的至少一种症状。在一个实施例中，转基因编码囊性纤维化跨膜传导调控因子、α-1抗胰蛋白酶、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白或红血球生成素。
在一个实施例中，哺乳动物经历用经分离的包含博卡病毒衣壳蛋白质的嵌合病毒进行的病毒基因疗法并且被投予可有效增强(与未与药剂接触的哺乳动物中的细胞相比)哺乳动物细胞中rAAV中的转基因的表达的量的rAAV基因体，其是作为蛋白酶体抑制剂的药剂。
还提供rHBoV病毒。在一个实施例中，rHBoV病毒可不包括转基因，但具有末端倒序序列(TPS)，所述序列不相同并且是非编码序列(“填充”序列)，即其不是复制胜任型。这类病毒具有诱导体液反应的衣壳(BoV)并且因此适用作疫苗。在一个实施例中，嵌合病毒传递到肺。在一个实施例中，嵌合病毒传递到其它非肺细胞类型，其中BoV衣壳序列对感染具有向性。
为了产生rBoV，在一个实施例中，使用两个或更多个载体。一个载体具有用于复制和封装的顺式元件，其包括TPS和任选的异源序列(转基因)。另一个载体具有用于反式作用因子的序列，但不具有顺式元件(其是缺失的)。两个载体可位于一个质体或两个不同质体上。此外，反式作用因子可位于不同质体上。举例来说，非结构蛋白质(例如NS和NP1)的序列可位于一个质体上并且另一个质体可具有衣壳蛋白质的序列。封装rBoV所需的结构蛋白质还可以分成多个载体以避免产生野生型BoV。
在一个实施例中，AAV/BoV病毒是在培养的昆虫细胞中产生。这种方法包括以下物质的效用：重组型杆状病毒载体(BEV)，其是AAVRep辅助杆状病毒(Bac-AAVRep)，其表达AAVRep78/Rep52；BoV1Cap辅助病毒(Bac-BoVCap)，其表达BoV1衣壳蛋白质VP1、VPx和VP2；以及转移载体(Bac-rAAV)，其含有携载相关基因(GOI)的rAAV基因体。用可有效产生嵌合病毒的量的这些杆状病毒载体感染昆虫细胞。
在一个实施例中，rBoV病毒包括转基因，其基因产物可促进对BoV的体液或细胞反应并且具有TPS，例如其本身不是复制胜任型或可产生感染性BoV。作为对BoV衣壳的体液反应和由转基因的表达增强的免疫反应(体液和/或细胞)的结果，这类病毒适用作疫苗。在一个实施例中，rHBoV传递到肺。封装rBoV所需的结构蛋白质还可以分成多个载体以避免产生野生型BoV。在一个实施例中，嵌合病毒传递到其它非肺细胞类型，其中BoV衣壳序列对感染具有向性。
在一个实施例中，AAV/BoV病毒是在培养的昆虫细胞中产生。这种方法包括以下物质的效用：重组型杆状病毒载体(BEV)，其是AAVRep辅助杆状病毒(Bac-AAVRep)，其表达AAVRep78/Rep52；BoV1Cap辅助病毒(Bac-BoVCap)，其表达BoV1衣壳蛋白质VP1、VPx和VP2；以及转移载体(Bac-rAAV)，其含有携载相关基因(GOI)的rAAV基因体。用可有效产生嵌合病毒的量的这些杆状病毒载体感染昆虫细胞。
在一个实施例中，rHBoV病毒包括转基因并且具有HBoVTPS。转基因可编码任何抗原(例如肿瘤抗原)、HBoV蛋白质(但不是允许HBoV复制的蛋白质)、流感病毒蛋白质(例如H1或N1蛋白质)或SARS病毒基因(如衣壳基因)，或免疫反应调节剂，例如细胞激素，包括(但不限于)IFN-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子、IL-1、IL-17或IL-6，或其它可增强细胞或体液免疫反应的基因产物。在一个实施例中，rBoV传递到鼻、气管支气管和/或肺。在一个实施例中，用于病毒制备的载体包括TPS和NS序列，并且用转基因代替衣壳序列，所述转基因允许细胞中的复制，但不具有其它以反式提供的序列，不产生后代。在一个实施例中，用于病毒制备的载体包括TPS和NS序列，并且用肿瘤细胞或细胞激素的前药(例如IFN-α、IFN-γ、IL-1、TNF或IL-17)的转基因代替衣壳序列以增强对BoV的免疫反应。
还提供用于增强哺乳动物细胞的rBoV转导的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞(例如人类细胞)与经分离的包含博卡病毒衣壳蛋白质的rHBoV和编码异源基因产物的rBoV基因体接触，并且在一个实施例中包括可有效额外或协同增强转导的量的至少一种药剂。在一个实施例中，哺乳动物细胞是哺乳动物肺细胞。在一个实施例中，药剂是蛋白酶体调节剂，例如蛋白酶体抑制剂。在一个实施例中，药剂是化学治疗剂、降脂剂、抗生素、粘液溶解剂或食品添加剂。
本发明包括用于增强哺乳动物细胞(例如哺乳动物肺细胞)的病毒转导的方法。举例来说，哺乳动物肺细胞与包含博卡病毒衣壳蛋白质的rBoV和rAAV基因体以及与未与所述药剂接触哺乳动物细胞相比可有效增强病毒转导的量的药剂接触，其中药剂是蛋白酶体抑制剂。
在一个实施例中，本发明提供用于增强哺乳动物细胞(如哺乳动物肺细胞)中转基因的表达的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞与一定量的药剂(其是蛋白酶体抑制剂)和包含人类博卡病毒衣壳蛋白质的rBoV和包含转基因的rBoV基因体接触，其中所述量促进rBoV的转导，从而与未与药剂接触的哺乳动物细胞相比增强转基因的表达。
在一个实施例中，本发明提供使哺乳动物免疫的方法。所述方法包括使哺乳动物与包含博卡病毒衣壳蛋白质(例如人类博卡病毒衣壳蛋白质)的rBoV和包含适用于诱发对抗原(例如微生物抗原，如病毒、细菌、寄生虫或真菌，或肿瘤抗原)或中和型抗体或其抗原结合片段的保护性免疫反应的转基因的rBoV基因体接触。在一个实施例中，哺乳动物还与蛋白酶体抑制剂接触。因此，rBoV可用作疫苗，例如被动疫苗。
还提供用于抑制或治疗与内源性基因产物的异常表达相关的病状的方法。所述方法包括使具有罹患病状的风险或罹患病状的哺乳动物与有效量至少一种可促进转导的蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、抗生素、粘液溶解剂或食品添加剂以及有效量的经分离的包含人类博卡病毒衣壳蛋白质的rBoV和rBoV基因体接触，其中基因体包含编码功能性基因产物的至少一部分的转基因，所述功能性基因产物于哺乳动物中的表达可抑制或治疗病状的至少一种症状。在一个实施例中，转基因编码囊性纤维化跨膜传导调控因子、α1-抗胰蛋白酶、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白或红血球生成素。
在一个实施例中，哺乳动物经历用经分离的包含人类博卡病毒衣壳蛋白质的rHBoV进行的病毒基因疗法并且被投予可有效增强(与未与药剂接触的哺乳动物中的细胞相比)哺乳动物细胞中rHBoV中的转基因的表达的量的rHBoV基因体，其是作为蛋白酶体抑制剂的药剂。
附图说明
图1.初始极化HAE的rHBoV1载体制备和感染。(A)本研究中使用的HBoV1基因体和原病毒质体的示意性结构。pHBoV1KUm630是HBoV1病毒蛋白质的反式互补的辅助质体，pIHBoV1是HBoV1全基因组的感染性纯系，并且prHBoV1-CBAluc是rHBoV1顺式转移原病毒质体。还指示用于克隆的关键限制酶剪切位点并且标记(Δ)NS和VP基因内的小型缺失。(B)HEK293细胞中rHBoV1原病毒质体的复制互补分析。将pIHBoV1(泳道1)、prHBoV1-CBAluc(泳道2)或prHBoV1-CBAluc+prHBoV1KUm630(泳道3)质体转染到HEK293细胞中。在转染后48小时提取HirtDNA并且在琼脂糖凝胶上解析之前由DpnI消化。用32P标记的HBoV1探针通过南方印迹法(Southernblotting)观测HBoV1复制中间物(由箭头指示)。使用来自经HBoV1感染性纯系(pIHBoV1，泳道1)转染的细胞的HirtDNA作为阳性对照。分别在图的左侧和右侧展示矮和长暴露。(C)通过CsCl平衡超离心法部分分离来自经rHBoV1-CBAluc和prHBoV1KUm630共转染的HEK293的DNaseI-消化细胞裂解物。曲线展示rHBoV1的分布。针对所观察的梯度密度(空心点)的CBAluc(实心点)基因组。通过TaqManPCR确定每一份(约750μL)中的基因体拷贝。(D)在ALI培养物和初始HAEALI培养物中，HEK293细胞、IB3细胞、未分化(UD)CuFi8细胞单层、极化CuFi8细胞的rHBoV1.CBAluc感染之后的转导分析。资料表示在感染后第2天，每个孔的平均(+/-SEM)相关荧光素酶活性(n＝4)。(E)感染后不同时间点时的来自经rHBoV1.CBAluc感染的HAEALI培养物的转基因表达。资料表示每个孔的平均(+/-SEM)相关荧光素酶活性(n＝3)。
图2.HBoV1衣壳中的伪封装rAAV2基因组。(A)通过CsCl平衡超离心法部分分离来自所指示的HEK293细胞质体转染的DNaseI-消化细胞裂解物。通过TaqManPCR确定每一份中病毒基因组的数目。(B)用所指示的质体(M：分子量标记物；泳道1：pAV2-F5tg83luc+pAV-Rep2；泳道2：pAV2-F5tg83luc+pAVRC2.3；泳道3：pAV2-CF5tg83luc+pAV-Rep2；泳道4：pAV2-CF5tg83+pAV-Rep2+pHBoV1KUm630)的组合与Ad辅助pAd4.1一起转染HEK293细胞。在48小时之后从经转染的细胞提取低分子量(Hirt)DNA并且用DpnI消化，接着使用32P标记的荧光素酶探针进行南方印迹法。rAV2.F5tg83Luc和rAV2.CF5tg83Luc基因组的4.8kb和5.4kb复制形式(RF)DNA由箭头指示。(C)嵌合载体rAV2/HBc.F5tg83luc的阴性染色透射电子显微照片(条柱＝15000x图像中100nm和50000x图像中50nm)。具有不完全封装病毒DNA的病毒类粒子(<1％总病毒粒子)由插图中的白色箭头标记。(D)使用红外线图像系统(InfraredImageSystem)对所指示的病毒制备进行双色西方印记法(红色：AAV；绿色：HBoV1)。经转化的单通道图像还分别用左图和右图中指向AAV2和HBoV1VP蛋白质(VP1和VP2)的深色箭头展示。来自HBoV1VPx蛋白质的灰色箭头和白色箭头标记蛋白质。
图3.rHBoV1和rAAV2/HBoV1载体的封装极性和能力。(A)通过狭线印迹法将病毒AV2/2.F5tg83luc、AV2/HBc.F5tg83luc和rHBoV1.CBAluc装载到尼龙膜上，并且用针对荧光素酶基因的负和正股的32P标记的32单元寡核苷酸探针观测(左图)。基于用NIHImageJ软体定量的信号密度计算每个病毒制剂中的负和正股的百分比(右图)。(B)rAAV载体AV2/2.F5tg83luc、嵌合病毒AV2/HBc.F5tg83luc和AV2/HBc.CF5tg83luc的2×108DRP在碱性凝胶负载缓冲液中在95℃下加热10分钟并且接着在0.9％碱性琼脂糖凝胶中解析。在转移到尼龙膜之后，用32P标记的荧光素酶探针进行南方印迹法。黑色和白色箭头分别标记较短的rAV2.F5tg83luc(4.8kb)和较长的rAV2.CF5tg83luc(5.4kb)基因组。(C)左图描绘用32P标记的片段探测的AV2/HBc.F5tg83luc和rHBoV1.CBAluc病毒制剂的狭线印迹(基于荧光素酶转基因的TaqManPCR，约109DRP)，所述片段识别荧光素酶基因(1.7kb)或对辅助质体来说独特的HBoV1基因体区域(覆盖NP1编码区的2.64kbHindIII/BglII片段)。右图相对于质体标准，基于信号强度描绘荧光素酶或NP1基因片段的相关拷贝。使用NIHImageJ软体将所展示的rAAV2/HBoV1和rHBoV1病毒制剂的平均(+/-范围)信号密度定量。
图4.rAAV2/HBoV1与rAAV载体之间的转导比较。(A)HEK293细胞用AV2/2.F5tg83luc(MOI＝2,500DRP/细胞)或AV2/HBc.F5tg83luc(MOI＝50,000DRP/细胞)感染之后第2天的荧光素酶表达。结果展示24孔板中每个孔的平均(+/-SEM，N＝4)相关荧光素酶活性。(B)用来自顶端或底外侧表面的AV2/2.F5tg83luc、AV2/1.F5tg83luc或AV2/HBc.F5tg83luc感染初始HAEALI培养物。每个Millicell插入物的接种物中的载体量是1010DRP，约5,000到10,000DRP/细胞。资料表示来源于三个供体的HAEALI培养物的N＝6独立感染在感染后第7天测量的平均(+/-SEM)相关荧光素酶活性(RLU/孔)。(C，D)在用1010DRP/Millicell插入物的rAAV2/1、rAAV2/2和rAAV2/HBoV1载体顶端感染初始HAEALI培养物之后18小时进行病毒粒子内化和亚细胞分布分析。通过TaqManPCR对细胞质和细胞核部分中的病毒基因组进行定量。每个培养物中检测的全部病毒基因组呈现于(C)中，其中黑色条柱表示细胞核部分并且白色条柱表示细胞质部分。每个部分中病毒基因组的百分比呈现于(D)中。资料表示N＝3独立感染的平均(+/-SEM)病毒基因体拷贝(每个孔)。
图5.人类呼吸道上皮细胞的极化和非极化培养物中，蛋白酶体抑制剂对rAAV2/HBoV1转导的作用。(A，B)用具有(A)AV2/2.F5tg83luc或(B)AV2/HBc.F5tg83luc的1010DRP/Millicell插入物顶端感染初始HAEALI培养物16小时时段。当指示时，仅在感染周期期间施用蛋白酶体抑制剂(PI)LLnL(40nM)和多柔比星(doxorubicin)(5μM)。历时11天使用Xenogen200IVIS通过活细胞的生物光子成像来监测荧光素酶表达。资料表示在感染后第3、7和11天的三个时间点时的每个孔的平均(+/-SEM，n＝6)相关荧光素酶活性。(C)在塑料(CuFi-UD)和HEK293细胞上的ALI(CuFi-ALI；a：顶端感染，b：底外侧感染)或非极化未分化单层处作为极化上皮培养的CuFi8细胞与1.5×109DRP的AV2/HBc.F5tg83luc一起在37℃下培育4小时。在感染时，所有培养物含有约5×105个细胞。在感染之后，洗去未结合病毒并且用胰蛋白酶从培养物负载物剥离细胞且溶解以用于病毒基因组的TaqManPCR定量，或返回培育箱用于感染后24小时使用细胞裂解物进行的荧光素酶表达分析。当指示(+PI)时，在4小时感染周期期间，CuFi8细胞用蛋白酶体抑制剂多柔比星(1μM)和LLnL(8nM)处理。资料表示感染后4小时的平均(+/-SEM)总载体基因组(n＝4)和感染后24小时的相关荧光素酶活性(n＝3)。
图6.在用AV2/HBc.CBAhCFTR感染之后，通过初始CFHAEALI培养物传递的CFTR依赖性氯离子的部分矫正。在蛋白酶体抑制剂LLnL(40nM)和多柔比星(5μM)存在下，用AV2/HBc.CF5tg83luc或AV2/HBc.CBAhCFTR以1010DRP/Millicell插入物(MOI是5000到10000DRP/细胞)感染来源于两个CF患者供体的CFHAEALI培养物(基因型：ΔF508/ΔF508同型接合)。还培养未经感染的非CFHAE用于电生理学比较并且在感染后第10天评估实验培养物。(A)在如所指示依序添加多种抑制剂和促效剂之后，CFHAE的上皮短路电流(Isc)的代表性迹线。在CFTR电流的cAMP促效剂(弗斯可林(forskolin)和IBMX)诱导和GlyH101抑制之前，使用氨氯吡脒(Amiloride)和DIDS阻断ENaC介导的钠电流和非CFTR氯离子通道。ΔIsc(cAMP)反映cAMP促效剂诱导之后CFTR介导的氯离子电流的活化，并且ΔIsc(glyH)反射添加GlyH101之后CFTR介导氯离子电流的抑制。CF感染的培养物和非CF对照物的ΔIsc(cAMP)和ΔIsc(glyH)(平均值+/-SEM，n＝6个独立转移孔(transwell))的概述资料。(C)在用AV2/HBc.CBAhCFTR(左图)或AV2/HBc.CF5tg83luc(右图)感染之后，CFHAE中CFTR表达(绿色)的免疫荧光检测。
图7.人类呼吸道上皮细胞的极化如何影响HBoV1病毒粒子感染和转导的一个可能模型。(A)极化HAE可含有HBoV1的多个结合和/或共受体。在这一所说明的情形中，单个结合受体存在于顶端膜上并且在底外侧膜上显著减少或不存在。存在两个不同共受体，包括顶端膜上的有效共受体-1和底外侧膜上的更丰富的低效共受体-2。通过共受体-1进行的内饮作用产生功能有效(来自转导观点)病毒粒子处理，其受蛋白酶体活性高度影响，而通过共受体-2进行的内化在处理病毒粒子方面是无效的并且不受蛋白酶体功能影响。与顶端膜相比，这一模型符合来自底外侧表面的显著较少病毒捕捉和转导。其它未图示模型可包括底外侧表面上的第二种结合受体，其通过共受体-1或共受体-2低效内吞。(B)在非极化人类呼吸道细胞中，初始结合受体共受体-1和共受体-2存在于相同细胞膜中。两种共受体皆可与相同结合受体相互作用，然而，共受体-2的丰度大于共受体-1。因此，通过共受体-2进行的HBoV1病毒粒子的内饮作用占主要地位，并且因为这一路径在产生性转导方面处理HBoV1病毒粒子的效率较低，转基因表达也较低。这些结果符合非极化人类呼吸道细胞中的高水平HBoV1病毒粒子内饮作用，但不良转导和弱蛋白酶体抑制剂反应。
图8.包括全长核苷酸序列的示例性HoBV序列(JQ923422，具有nts1-140处的左侧5'发夹和nts5344-5543处的右侧3'发夹，其是HBoV1复制和封装的顺式元件)，在两个末端不具有末端发夹的核苷酸序列(例如GQ925675)和由此编码的蛋白质。适用于本发明的病毒的蛋白质包括与图8，SEQIDNO:9-36中的HBoV蛋白质的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％氨基酸序列一致性的蛋白质。
图9.293细胞中rAAV2/HBoV1载体产生的最佳化。(A)HBoV1Cap辅助质体。(1)pHBoV1NSCap是原型HBoV1辅助子；(2)pCMVHBoV1NSCap来源于原型辅助子，其是P5启动子前方的CMV启动子；和(3)pCMVHBoV1NS1(-)Cap来源于pCMVHBoV1NSCap，具有早期封端的NS1ORF。(B)CF感染的培养物和非CF对照物的经4-质体转染的293细胞生产系统(用pAV2.CMVGFP(5.4kb)、pAd4.1、pAV2-Rep和Cap辅助子无关转移孔中的一个转染)中HBoV1VP1、VPx和VP2的西方印迹分析。(C)由改良的rAAV2/HBoV1生产系统(经pAV2.CMVGFP(5.4kb)、pAd4.1、pAV2-Rep和pCMVHBoV1NS1(-)Cap辅助子转染)的rAAV2/HBoV1的产率与293细胞中rAAV2/2生产系统(经pAV2.CMVGFP(5.4kb)、pAd4.1、pAV2-RepCap辅助子转染)的产率类似。以20个145mm培养盘的规模，由并行产生标绘的对比。
图10.Sf9细胞中的rAAV2/HBoV1产生。(A)用于rAAV2/HBoV1产生的BEV的构造。所展示的三个BEV是使用Bac-to-Bac方法(英杰公司(Invitrogen))产生。根据科汀方法(Kotinmethod)设计Bac-Cap，但在VP1编码序列的nt273(G到A)处引入静默点突变以确保适合的VP1:VPx:VP2比率。还根据科汀方法构筑Bac-Rep；Ph：多角体蛋白启动子。(B)病毒蛋白质表达和rAAV2DNA复制的分析。在注射后72小时，通过蛋白质印迹法分析用3BEV感染的Sf9细胞的HBoV1上限和AAV2Rep的表达，并且通过南方印迹法分析rAAV2基因体的复制。以与经pHBoV1NSCap转染的293细胞类似的比率有效产生HBoV1Cap蛋白质(VP1、VPx和VP2)，并且其表达不干扰AAV2Rep78/52的表达或共感染Sf9细胞中rAAV2基因体复制的救援。指示rAAV2DNA的复制形式(RF)和双重RF。(C)载体纯化。使用来自200ml培养物的受感染Sf9细胞在CsCl梯度上纯化载体。收集洗脱份并且关于DRP进行定量。使用阴性染色在电子显微镜下观测纯化。照片显示直径为约25nm的完全封装病毒粒子。(D)Sf9细胞(来自200mLSf9细胞培养物)中rAAV2/HBoV1和rAAV2/2载体产生的并行对比。用于产生rAAV2的BEV是Bac-(ITR)GFP和Bac-Rep/(AAV2)Cap(由科汀实验室(Kotinlaboratory)友情提供)。使用CsCl梯度纯化载体，并且使用GFP探针以DRP/制剂形式定量。(E)Sf9细胞中产生的rAAV2/HBoV1载体的官能团的活性与由293细胞产生的相同。资料表示受Sf9或293细胞中产生的载体顶端感染的CuFi-ALI培养物中的RLU。施用10KMOI并且在注射后48小时使细胞溶解以用于荧光素酶分析。
图11.HBoV1可使大于5.5Kb的重组型细小病毒基因体衣壳化，将5.9kbAAV2基因体封装入HBoV1衣壳。rAAV2/HBoV1是由三个转移质体产生，各自具有不同尺寸的基因体，如所指示。载体产率表示在CsCl梯度超离心之后，八个150mm培养盘中来自经转染的293细胞的制剂。提取病毒DNA，在0.9％碱性凝胶上解析，并且使用32P标记的CFTR探针观测。
图12.rAAV2/HBoV1载体有效转导HAE-ALI培养物中的纤毛和K18阳性上皮细胞。以10kMOI顶端施用所指示的载体；mCherry报导蛋白质(红色)的表达鉴别经转导的呼吸道细胞。在注射后第10天，HAE被(A)固定并且用抗β-微管蛋白IV(绿色)(纤毛细胞的标记物)染色，和(B)胰蛋白酶化，离心涂布到滑块上，固定并且用抗K18(绿色)染色(关于纤毛和非纤毛柱状细胞)。以×100获得共聚焦图像。DAPI：细胞核。
图13.用于CFTR基因传递的rAAV2基因体构筑体。(A)筛选tg83合成启动子的短合成强化子。HAE-ALI用携载tg83驱动荧光素酶卡匣和多种强化子的rAAV2/2载体感染。在注射后第3天，分析受感染的HAE的荧光素梅活性(RLU)。(B)CFHAE-ALI中通过rAAV2/HBoV1载体的Cl-传递的矫正(30％)比用rAAV2/2获得的更有效。CFHAE-ALI培养物在顶端侧并且以所指示的MOI经模拟感染或用所描绘的载体感染(每种情况n＝6)。在注射后第10天，使用上皮电压线箍和自身所含的Ussing腔室系统，基于上皮短路电流(isc)的变化评估受感染的CFHAE的CF表现型的矫正。在10kMOI下，rAAV2/HBoV1(AV2/HBc)恢复约30％CFTR介导的上皮Cl传递，与正常HAE(n＝13)相同。rAAV2/2-CFTR载体矫正CF表现型的效率较低，即使在50kMOI情况下。(C)rAAV2/HBoV1载体的rAAV2基因体构筑体。展示rAAV2至CFTR基因体构筑体，其包括纤毛细胞特异性启动子(FOXJ1)或合成启动子/强化子(F5tg83)，或合并有转录后元件(miR)，并且将封装到HBoV1衣壳中。
图14.使用SMaRT载体矫正缺陷性CFTRmRNA的示意性方法。(A)rAAV2基因体AV2.CMV-PTM24CF，其在HBoV1衣壳中假型化，并且通过CFHAE的顶端感染测试SMaRT的效用。(B)AV2.CMV-PTM24CF的反式剪接结构域的序列，其由以下组成：133-ntPTM24结合序列(蓝色，与内含子9处的133-ntBDRNA序列互补)，随后是内源性分歧点(BP，红色)、多嘧啶区域(PPT。绿色)和3'SS(CAG)(SEQIDNO:46)。(C)CFTRmRNA前体的结构和靶向机制的示意图。如所指示，引起CFTR蛋白质的缺陷或缺失的一些关键突变位于外显子10中和其下游。(D)所提议的新型rAAV2基因体AV2.CBA-PTM24CF-3UTR。
图15.新生雪貂(NewBornFerret)中的rAAV2/HBoV1转导。年龄为3天的雪貂幼崽通过气管内注射用4×1010DRP的AAV2/HBoV1.F5tg83luc感染。接种物的体积是300μL，其中多柔比星的最终浓度是250μM。在感染后1周处死动物，收集呼吸道卡匣并且解剖。使用200μL报导子溶解缓冲液(对于每片组织)从气管和肺瓣(尺寸和重量不同的六个瓣)提取蛋白质。由蛋白质提取测量荧光素酶活性(RLU)并且针对每毫克组织(湿重)正规化。使用每个组织样品的100ng基因体DNA通过TaqManPCR探测载体基因体拷贝(VGC)的量。来自雪貂幼崽的未感染的肺展示为阴性对照。
图16.示例性猪、猫和犬博卡病毒基因体和VP序列(SEQIDNO:37-45)。
具体实施方式
定义
如本文所使用的“载体”是指大分子或大分子缔合物，其包含多核苷酸或与多核苷酸缔合并且可用于调节体外或体内多核苷酸到细胞的传递。说明性载体包括例如质体、病毒载体、脂质体和其它基因传递媒剂。待传递的多核苷酸，有时称为“目标多核苷酸”或“转基因”可包含基因疗法中的相关编码序列(如编码相关治疗性蛋白质的基因)、疫苗研发中的相关编码序列(如表达适用于引起哺乳动物中的免疫反应的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)和/或可选或可检测标记物。
“AAV”是腺相关病毒，并且可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除外以其它方式需要以外，所述术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在和重组形式。如本文中所使用，术语“血清型”是指基于与既定抗血清的衣壳蛋白质反应性而鉴别并且与其它AAV区分的AAV，例如存在灵长类动物AAV的八种血清型，AAV-1到AAV-8。举例来说，血清型AAV2用于指含有由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白质和含有来自相同AAV2血清型的5'和3'ITR序列的基因体的AAV。对于本文中说明的每个实例，载体设计和制备的说明描述衣壳的血清型和5'-3'ITR序列。缩写“rAAV”是指重组型腺相关病毒，也称为重组型AAV载体(或“rAAV载体”)。
BoV是博卡病毒，并且可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除外以其它方式需要以外，所述术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在和重组形式。如本文中所使用，术语“血清型”是指BoV，其是基于与既定抗血清的衣壳蛋白质反应性而鉴别和与其它BoV区分，例如存在人类博卡病毒(HBoV)的四种已知血清型，HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4。然而，BoV中包括来源于其它非人类哺乳动物的血清型，如猪BoV。与AAV相同，HBoV和BoV的不同血清型可具有感染不同细胞类型和器官的不同向性。
rAAV/HBoV是嵌合载体，其由HBoV衣壳和rAAV基因体组成。在这类嵌合病毒中，不存在来自基因体内HBoV的基因信息。rAAV基因体可来自AAV的任何血清型。
rAAV/BoV是嵌合载体，其由非人类BoV衣壳和rAAV基因体组成。在这类嵌合病毒中，不存在来自基因体内BoV的基因信息。rAAV基因体可来自AAV的任何血清型。
如本文中所使用的向性是关于特定病毒血清型生产性感染不同表现型细胞或器官以将其基因体信息传递到细胞核的能力的术语。
如本文中所使用的“转导(Transduction/transducing)”是关于将外源性多核苷酸(例如rAAV载体中的转基因)引入宿主细胞以引起多核苷酸的表达(例如细胞中的转基因)的过程的术语。所述方法包括以下步骤中的一个或多个：1)嵌合病毒的内饮作用，2)从内体或细胞的细胞溶质中的其它细胞内区室逃逸，3)将病毒粒子或病毒基因体运输到细胞核，4)病毒粒子的脱壳，和产生可表达的双股AAV基因体形式，包括圆形中间物。rAAV可表达双股形式可保持细胞核游离基因体或任选地可整合到宿主基因体中。通过本发明的试剂(例如蛋白酶体抑制剂)发生的嵌合病毒在其结合于细胞表面受体之后的内饮作用、从内体或其它细胞内区室逃逸到细胞的细胞溶质、将病毒粒子或病毒基因体运输到细胞核或病毒粒子的脱壳以及产生可表达双股AAV基因体形式(包括圆形中间物)中的任一个或其组合的变化可引起表达水平或表达持续时间的变化，或细胞核运输的变化，或宿主细胞或表达引入的多核苷酸的细胞群体的类型或相关数目的变化。通过嵌合病毒引入的多核苷酸的表达或持续时间的变化可通过本领域中众所周知的方法确定，包括(但不限于)蛋白质表达(例如通过ELISA、流动式细胞测量术和西方印迹法)、通过杂交分析(例如北方印迹法(Northernblots)、南方印迹法和凝胶偏移迁移率分析)测量DNA和RNA产生。本发明的试剂可改变、增强或增加病毒内饮作用、从内体或其它细胞内胞质区室逃逸和运输入或到细胞核、细胞核中病毒粒子的脱壳和/或增加细胞核中rAAV基因体的双股可表达形式的串联或产生，以便改变所引入的多核苷酸(例如rAAV载体中的转基因)的体外或体内表达。用于引入外源性多核苷酸的方法包括众所周知的技术，如转染、脂质体转染、病毒感染、转型作用和电致孔，以及非病毒基因传递技术。所引入的多核苷酸可在宿主细胞中稳定或短暂保持。
“提高的转导或转导频率”、“改变的转导或转导频率”或“增强的转导或转导频率”是指与未经处理的细胞相比，经处理的细胞中上述活性中的一种或多种的增加。本发明的增加转导功效的试剂可通过测量对一种或多种转导活性的作用来确定，其可包括测量转基因的表达、测量转基因的功能或确定与未用所述试剂处理的宿主细胞相比产生相同转基因作用所需的粒子的数目。
“蛋白酶体调节剂”是指改变或增强rAAV的药剂或药剂类别，包括通过与蛋白酶体相互作用、结合到蛋白酶体或更改蛋白酶体的功能和/或蛋白酶体的运输或位置来改变或增强嵌合病毒转导或转导频率。蛋白酶体调节剂可具有如本领域中所描述的其它细胞功能，例如阿霉素(doxyrubicin)，其是一种抗生素。蛋白酶体调节剂包括蛋白酶体抑制剂，例如三肽基醛(MG132，即Z-LLL或MG101，即LLnL)、硼替佐米(bortezomib)(万珂(Velcade))、抑制蛋白酶体的钙激活中性蛋白酶、组织蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶类蛋白酶活性的药剂(瓦格纳等人,2002；杨(Young)等人,2000；西森博格(Seisenberger)等人,2001)。
“基因传递”是指将外源性多核苷酸引入用于基因转移的细胞，并且可涵盖靶向、结合、吸收、传递、定位、复制整合和表达。
“基因转移”是指将外源性多核苷酸引入细胞，其可涵盖靶向、结合、吸收、传递、定位和复制整合，但不同于且不包含基因的后续表达。
“基因表达”或“表达”是指基因转录、转译和翻译后修饰的过程。
“可检测标记基因”是允许细胞携载待具体检测的基因(例如与不携载所述标记基因的细胞区分)的基因。本领域中已知许多这类标记基因。
“可选标记基因”是在对应选择性试剂存在下允许细胞携载待具体选择或针对的基因的基因。作为说明，抗生素抗性基因可以阳性可选标记基因形式使用，其允许在对应的抗生素存在下阳性选择宿主细胞。本领域中已知多种阳性和阴性可选标记，其中一些描述于下文中。
如本文所使用的“rAAV载体”是指包含非AAV来源的多核苷酸序列(即与AAV异源的多核苷酸)的AAV载体，典型地是细胞的基因转型相关序列。在本发明的优选载体构筑体中，异源多核苷酸由一个或两个AAV反向末端重复序列(ITR)侧接。术语rAAV载体涵盖rAAV载体粒子和rAAV载体质体。
“嵌合病毒”或“嵌合病毒粒子”是指由至少一个衣壳蛋白质和衣壳化多核苷酸组成的病毒粒子，其来自不同病毒。
AAV的“辅助病毒”是指使得AAV(例如野生型AAV)由哺乳动物细胞复制和封装的病毒。本领域中已知AAV的多种这类辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒，如牛痘。腺病毒涵盖许多不同子组，但最常使用子组C中的第5类型腺病毒。已知大量人类、非人类哺乳动物和禽类来源的腺病毒，并且可从储存中心(如ATCC)获得。
“感染性”病毒或病毒粒子是包含多核苷酸组分的病毒或病毒粒子，其能够传递到对病毒物种具有营养性的细胞中。所述术语未必暗示病毒的任何复制能力。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化或封端核苷酸和核苷酸类似物，并且可杂有非核苷酸组分。如果存在，那么可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。如本文中所使用的术语多核苷酸可互换地指双股和单股分子。除非另外说明或需要，否则本文中所描述的本发明的任何实施例(其是多核苷酸)涵盖双股形式和已知或预测组成双股形式的两个互补单股形式中的每一种。
如本文中所使用的“转录调节序列”或“TRS”是指控制与其可操作地连接的基因或编码序列的转录的基因组区域。本发明中使用的转录调节序列通常包括至少一个转录启动子并且还可以包括一个或多个转录强化子和/或终止子。
“可操作地连接”是指两个或更多个组分的配置，其中所描述的组分处于允许其以协调方式发挥功能的关系。作为说明，如果TRS或启动子促进编码序列的转录，那么转录调节序列或启动子可操作地连接到编码序列。可操作地连接的TRS通常以顺式形式与编码序列连接，但其未必与其直接相邻。
“异源”意指来源于与其所比较的实体的其余部分遗传学上不同的实体。举例来说，通过基因工程技术引入不同不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且当被表达时，可编码异源多肽)。类似地，从其原生编码序列移除并且可操作地连接到不同编码序列的TRS或启动子是异源TRS或启动子。
如本文所使用的“封装”是指一系列亚细胞事件，其引起病毒载体的组装和衣壳化。因此，当在适当条件下将适合的载体引入封装细胞系中时，其可组装入病毒粒子。与病毒载体的封装相关的功能在本文中和本领域中描述。
“终止子”是指倾向于减少或阻止通读转录的多核苷酸序列(即其减少或阻止终止子的一侧上开始的转录继续进行到终止子的另一侧)。转录破坏程度通常是基底序列和/或终止序列的长度的函数。具体来说，如大量分子生物系统中众所周知，特定DNA序列(通常称为“转录终止序列”)是特异性序列，其倾向于破坏由RNA聚合酶进行的通读转录，可能通过引起RNA聚合酶分子停止和/或从所转录的DNA脱离。这类序列特异性终止子的典型实例包括聚腺苷酸化(“polyA”)序列，例如SV40polyA。除这类序列特异性终止子以外或代替这类序列特异性终止子，启动子与编码区之间的相对较长DNA序列的插入还倾向于破坏编码区的转录，通常与介入序列的长度成比例。这种作用可能由于RNA聚合酶分子始终具有一些变成从所转录的DNA脱离的倾向而产生，并且增加在达到编码区之前待遍历的序列的长度通常将增加在编码区转录完成之前或甚至可能在开始时的脱离可能性。因此终止子可阻止来自仅一个方向(“单向”终止子)或来自两个方向(“双向”终止子)的转录，并且可包含序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或其两者。本领域中已知多种这类终止序列；并且这类序列在本发明的情形内的说明性用途提供于下文中。
“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“封装细胞系”和其它这类术语指适用于本发明的高级真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人类细胞。这些细胞可以重组型载体、病毒或其它转移多核苷酸的受体形式使用，并且包括经转导的原始细胞的后代。应理解，单个细胞的后代可无需与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因体补体方面)。
“治疗性基因”、“预防性基因”、“目标多核苷酸”、“转基因”、“相关基因”等通常指待使用载体转移的基因。典型地，在本发明的情形下，这类基因位于rAAV载体内(所述载体由反向末端重复(ITR)区域侧接并且因此可复制和衣壳化到rAAV粒子中)。本发明中可使用目标多核苷酸产生rAAV载体以用于多种不同应用。这类多核苷酸包括(但不限于)：(i)适用于基因疗法的其它形式以减轻由结构蛋白质或酶的缺失、缺陷或次最佳含量引起的缺陷的多核苷酸编码蛋白质；(ii)转录到反义分子中的多核苷酸；(iii)转录到结合转录或转译因子的诱饵中的多核苷酸；(iv)编码细胞调节剂(如细胞激素)的多核苷酸；(v)可使受体细胞对特定药物(如疱疹病毒胸苷激酶基因)敏感的多核苷酸；和(vi)用于癌症疗法的多核苷酸，如用于治疗多种癌症的E1A肿瘤抑制基因或p53肿瘤抑制基因。为了实现受体宿主细胞中转基因的表达，其可操作地连接到启动子(其自有的或异源启动子)。本领域中已知许多适合的启动子，其选择取决于所需目标多核苷酸的表达水平；是否需要组成性表达、诱导性表达、细胞特异性或组织特异性表达等。rAAV载体还可以含有可选标记。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框架的多核苷酸，其能够在转录和转译之后编码特定蛋白质。
如用于多核苷酸的“重组型”意指多核苷酸是克隆、限制和/或接合步骤以及其它产生与在自然界中发现的多核苷酸不同的构筑体的程序的多种组合的产物。重组型病毒是包含重组型聚核苷酸的病毒粒子。所述术语分别包括原始多核苷酸构筑体和原始病毒构筑体的后代的复制品。
“控制元件”或“控制序列”是促进多核苷酸的功能性调节(包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、转译或降级)的分子的相互相用的核苷酸序列。所述调节可影响过程的频率、速度或特异性，并且可在自然界中增强或抑制。本领域中已知的控制元件包括例如转录调节序列，如启动子和强化子。启动子是能够在某些条件下结合RNA聚合酶和引起通常位于启动子下游(3'方向)的编码区的转录的DNA区域。启动子包括AAV启动子，例如P5、P19、P40和AAVITR启动子，以及异源启动子。
“表达载体”是包含编码相关多肽的区域的载体，并且用于实现所欲目标细胞中蛋白质的表达。表达载体还包含可操作地连接到编码区域以促进目标中蛋白质的表达的控制元件。控制元件和其可操作地连接以用于表达的基因的组合有时称为“表达卡匣”，其中许多是本领域中已知和可获得的，或可由本领域中可获得的组件容易地构筑。
“基因变化”是指其中基因元素除通过有丝分裂或减数分裂以外的手段引入细胞的过程。所述元素可对于细胞是异源，或其可以是细胞中已存在的元素的额外拷贝或改良版本。基因变化可例如通过用重组型质体或其它多核苷酸通过本领域中已知的方法(如电致孔、磷酸钙沉淀或与多核苷酸至脂质体复合物接触)转染细胞来实现。基因变化还可以例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。可将基因元素引入细胞中的染色体或微型染色体；但这一术语包括任何可改变细胞和其后代的表现型和/或基因型的变化。
如果序列可用于在细胞的体外扩展培养期间进行其功能，那么细胞称为用基因序列“稳定”改变、转导或转型。在一些实例中，由于引入还可由所改变的细胞的后代遗传的基因变化，这类细胞是“可遗传地”改变。
术语「多肽」、「肽」和「蛋白质」在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸的聚合物。所述术语还涵盖已经修饰的氨基酸聚合物；例如双硫键形成、糖基化、乙酰化、膦酰化、脂化或与标记组分结合。当在基因疗法和其组合物的情形下讨论时，多肽(如“CFTR”等)指各别完整多肽，或其任何片段或基因工程改造衍生物，其保持完整蛋白质的所需生物化学功能。类似地，对CFTR和其它这类用于基因疗法的基因(典型地称为待传递到受体细胞的“转基因”)的参考包括编码完整多肽或具有所需生物化学功能的任何片段或基因工程改造衍生物的多核苷酸。
“经分离的”质体、病毒或其它物质是指制备不含天然存在或最初制备的物质或类似物质中还可以存在的至少一些其它组分的物质。因此，举例来说，经分离的物质可使用将其从来源混合物富集的纯化技术制备。富集度可根据绝对依据(如单位体积溶液的重量)测量，或其可相对于来源混合物中存在的第二种潜在干扰性物质测量。
如果感染性AAV粒子与感染性辅助病毒粒子的比率是至少约102:1；例如至少约104:1，包括至少约106:1或至少约108:1，那么AAV的制备称为“实质上不含”辅助病毒。制备过程还可以不含等量辅助病毒蛋白质(即如果上文提到的辅助病毒粒子杂质以经破坏形式存在，那么蛋白质将作为这类辅助病毒含量的结果存在)。通常可根据SDS凝胶上是否存在考马斯染色带(Coomassiestainingbands)(例如出现除对应于AAV衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3的染色带以外的染色带)来观察病毒和/或细胞蛋白质污染物。
当用于描述病毒制备、复制或封装时，“功效”是指所述方法的适用性：具体来说，生长率和每个细胞产生的病毒粒子的数目。“高效”制备指在指定培养期的过程中每个细胞产生至少100个病毒粒子；例如每个细胞至少约10,000个或至少约100,000个粒子。
根据本发明处理的“个体”或“对象”是指脊椎动物，尤其哺乳动物物种成员并且包括(但不限于)家畜、体育动物和灵长类动物，包括人类。
个体或细胞的“处理”是任何类型的试图改变个体或细胞在处理开始时的天然过程的介入，例如引发个体中的预防性、治愈性或其它有利作用。举例来说，可进行个体的处理以降低或限制由任何病理学病状引起的病理学，包括(但不限于)遗传性或诱导性基因缺乏症；病毒、细菌或寄生虫生物体引起的感染；赘生性或再生不全性病状；或免疫系统功能障碍，如自身免疫或免疫抑制。处理包括(但不限于)投予组合物，如医药组合物，和投予已用组合物处理的相容细胞。处理可以预防性或治疗性方式进行；也就是说，在病理性事件开始或与致病因子接触之前或之后进行。
除非另有指示，否则本发明的实践将使用分子生物学、病毒学、微生物学、重组型DNA和免疫学中的常规技术，其属于本领域技术范围内。在文献中全面解释了这类技术。参见例如萨布鲁克等人,1989；盖特(Gait),1984；弗瑞旭尼(Freshney),1987；酶学方法(MethodsinEnzymology)系列(学术出版公司(AcademicPress,Inc.))；米勒等人,1987；维尔(Weir)等人,1996；奥斯贝(Ausubel)等人,1998；科利根(Coligan)等人，1991；科利根等人,1995；和斯科普斯(Scopes),1994。
I.嵌合病毒
人类呼吸道上皮细胞对大部分病毒载体感染具有高抵抗性，包括腺相关病毒(rAAV)，其是临床试验中最广泛使用的基因疗法载体。人类博卡病毒1(HBoV1)，一种自发性人类细小病毒，其可能是与婴儿和幼儿中的哮喘相关的急性呼吸道感染(ARTI)的致病因子(阿兰德(Allander)等人,2007；克里斯滕森(Christensen)等人,2010；邓(Deng)等人,2012；唐(Don)等人,2010)，可有效感染来自顶端细胞膜的HAE，导致后代病毒的复制和细胞病理学(黄(Huang)等人,2012a)。不幸的是，极低感染倍率(MOI)(每个细胞10-3DNase耐受性粒子(DRP))下的HAE的HBoV1感染引起产生性感染(参见实例2)。最近，克隆全长5543-ntHBoV1全基因组(包括两端处的末端倒序序列)，并且已建立用于HBoV1制备的细胞培养系统(实例1)。鉴于来自HAE的顶端表面的HBoV1感染的高效，假设HoBV1适用于工程改造用于人类呼吸道基因疗法的重组型载体。
HBoV1是AAV和其它细小病毒科(Parvoviridaefamily)成员的相关物。HBoV1属于博卡病毒属(genusBocavirus)，而AAV属于依赖病毒属(genusDependovirus)(迪杰森(Tijssen)等人,2011)。HBoV1和AAV皆是小型单股DNA病毒，但90％衣壳化HBoV1基因组具有负股，而对于AAV，相同比率的正和负股经衣壳化(施尔德根(Schildgen)等人,2012)。这两种病毒的裂解阶段生命周期显著不同；AAV需要与辅助病毒的共感染，而HBoV1自主地在受纳细胞中复制后代(黄等人,2012a；迪克曼(Dijkman)等人,2009)。HBoV1基因体尺寸是5543nt，比AAV2(4679-nt)的尺寸大18.5％(863nt)，并且其结构特征包括在5'(140nt)和3'(200nt)端处具有独特倒序序列的不对称发夹，其涉及复制和衣壳化，和转录所有病毒结构和非结构蛋白质的单个P5启动子(黄等人,2012；陈(Chen)等人,2010)。这与在AAV基因组中发现的反向末端重复和多个内部启动子不同。HBoV1基因体编码三个主要开放阅读框架(ORF)。其中两个编码非结构蛋白质NS1/NS2和NP1，其是病毒复制所必需的。第三个ORF编码两种结构衣壳蛋白质VP1和VP2。相比之下，AAVcapORF编码三种衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3(施德根(Schidgen)等人,2012)。HBoV1衣壳表面布局与其它小病毒具有共同特征(二十面体衣壳)，并且与人类细小病毒B19最类似(瓜达(Gurda)等人,2010)。与克隆的AAV基因体类似，编码HBoV1原病毒基因体的质体是感染性，并且可用于通过转染到HEK293细胞中来产生感染性粒子而无需辅助病毒共感染(实例1)。
当rAAV基因体衣壳化到人类细小病毒B19衣壳中时，首先建立细小病毒科之间的跨属伪封装(彭纳扎刚(Ponnazhagan)等人，1998)。这一所得跨属嵌合体能够将rAAV基因体传递到对rAAV感染具有抗性的人类骨髓细胞中(彭纳扎刚等人,1998)。因此，假设将rAAV基因体假型化到HBoV1衣壳中可产生具有用于CF和其它肺部疾病的基因疗法的独特特性的新颖嵌合载体。
rHBoV1载体和嵌合rAAV2/HBoV1载体的制备描述于下文中。第一病毒是常规重组型载体(rHBoV1载体)。破坏或摧毁携载外来基因的HBoV基因体的开放阅读框架封装于HBoV1衣壳内。在HEK293细胞中通过反式互补由rHBoV1原病毒质体与HBoV1辅助质体的共转染产生rHBoV1载体。rHBoV1原病毒质体具有外来基因(长度是约5.2kb或更大，其可容纳可操作地连接到外来基因的开放阅读框架的异源启动子，例强启动子)和所有用于复制和封装的顺式元件，辅助质体仅编码HBoV病毒蛋白质的表达卡匣。HBoV1病毒的一个重要特征是其基因体在受纳细胞中自主复制，与rAAV不同，rAAV是依赖性细小病毒并且需要辅助病毒共感染用于复制。
通过在rHBoV1载体制备的反式互补中获得成功，通过保留HBoV1rep基因的编码序列，但用转基因置换结构基因来研发所谓的复制型rHBoV1载体。这一类型的载体可传递大量的用于疗法(如CF、AAT不足、COPD或肺癌)的呼吸道细胞中的治疗性基因表达。这类复制HBoV1载体作为针对WTHBoV1感染的疫苗可具有高效用。
另一种所研发的载体是AAV2-HBoV1嵌合病毒，其将rAAV基因体封装到HBoV1衣壳粒子中。还通过与rAAV载体类似的程序在HEK293细胞中产生载体，但用HBoV1衣壳取代衣壳基因。这种AAV/HBoV1载体组合AAV和HBoV1转导生物学的优点，与rHBoV1载体相比具有较少安全性问题，因为已经在许多临床前研究和临床试验中充分研究rAAV载体基因组，但与rAAV相比具有较高呼吸道细胞向性。更重要的是，大型HBoV1封装能力使得能够衣壳化高达约5.5kb或约6.0kb的过大的rAAV基因体。与rAAV相比能力大20％便足以容纳强表达卡匣以用于有效基因表达。rAAV基因体通过稳定的圆形转导中间物和双股基因体多联体提供持久性基因表达的优点。实际上，AAV/HBoV1载体具有比rHBoV1载体更持久的转基因表达的特征。此外，HEK293细胞中rAAV基因组的救援和复制极有效，使得AAV/HBoV1载体的产率也优于rHBoV1载体。
利用HBoV1的较大封装能力，制备具有5.5kb过大的rAAV基因体的rAAV2/HBoV1-CFTR载体，所述基因体具有5.2kbCFTR表达卡匣，其具有包括人类CMV即刻基因强化子和鸡β-肌动蛋白启动子(CBA启动子)的强嵌合启动子。所述载体显示顶端感染后CFHAE中CFTR介导氯离子电流的约30％恢复。因此，载体可在呼吸道上皮细胞的表面上有效传递正常CFTR蛋白质表达并且矫正CFHAE中的缺陷性CFTR特异性氯离子传递。此外，HBoV1基因体可将长度为约2.7kb到约2.8kb的rAAV基因体的自身互补双股形式衣壳化，所述载体可避免基因体转化并且允许增强的或更快速的转基因表达。AAV/HBoV嵌合载体还可扩展到用于其它肺病(如α-抗胰蛋白酶不足、哮喘和肺癌)的其它疗法，以及婴儿中针对野生型HBoV感染的疫苗接种。
本发明的病毒的衣壳和/或基因组可以是嵌合型，例如作为引导进化的结果(参见例如李等人,2009)。
II.rAAV载体
除预防性或治疗性基因产物以外，重组型AAV载体和/或病毒还可以包含不编码蛋白质的多核苷酸，包括例如编码反义mRNA(mRNA的补体)的多核苷酸，其可用于通过与正常mRNA形成双螺旋来阻断正常mRNA的转译，和编码核酶(RNA催化剂)的多核苷酸。此外，可使用所选择的rAAV载体配对，所述rAAV载体具有由适当置放的剪接受体位点和/或剪接供体位点侧接的开放阅读框架部分，或具有转录调节序列，如异源强化子、异源启动子或异源强化子和启动子。参见例如美国专利第6,436,392号，其公开内容以引用的方式并入本文中。举例来说，第一AAV载体可包括第一DNA片段，其包含AAV的5'反向末端重复；第二DNA片段，其包含可操作地连接到DNA片段的启动子，所述DNA片段包含基因的外显子和剪接供体位点，其中所述第二DNA片段不编码全长多肽；和第三DNA片段，其包含AAV的3'反向末端重复；以及第二AAV载体，其包含以下连接：第一DNA片段，其包含AAV的5'反向末端重复；第二DNA片段，其包含剪接受体位点和具有至少一个其它外显子的DNA片段，其与第一AAV载体的DNA片段共同编码全长多肽；和第三DNA片段，其包含AAV的3'反向末端重复。在一个实例中，第一AAV载体包括以下：第一核酸区段，其包含AAV的5'反向末端重复；第二核酸区段，其包含基因中包括转录调节区的一部分；第三核酸区段，其包含剪接供体位点；以及第四核酸区段，其包含AAV的3'反向末端重复；和第二AAV载体，其包含以下连接：第一核酸区段，其包含AAV的5'反向末端重复；第二核酸区段，其包含剪接受体位点；第三核酸区段，其包含基因的一部分，所述基因的一部分与第一AAV载体的核酸区段共同包含有包含编码功能性多肽的开放阅读框架的基因；以及第四核酸区段，其包含AAV的3'反向末端重复。在另一个实例中，第一AAV载体包括以下：第一核酸区段，其包含AAV的5'反向末端重复；第二核酸区段，其包含剪接受体位点；第三核酸区段，其包含基因的一部分；以及第四核酸区段，其包含AAV的3'反向末端重复；和第二组合物，其包含第二AAV载体，其包含：第一核酸区段，其包含AAV的5'反向末端重复；第二核酸区段，其包含基因的一部分，所述基因的一部分与以上具有所述部分的核酸区段共同包含有包含编码功能性多肽的开放阅读框架的基因，其中所述基因部分包括转录调节区；第三核酸区段，其包含剪接供体位点；第四核酸区段，其包含AAV的3'反向末端重复；所述载体在宿主细胞中产生RNA转录，其包含来自连接于来自第二AAV载体的序列的第一AAV载体的序列，其序列经定位使得剪接供体位点相对于剪接受体位点位于5'，并且所述转录是对编码功能蛋白质的mRNA的剪接。
任何血清型的腺相关病毒皆适合于制备rAAV，因为多种血清型是功能上和结构上相关，甚至在基因水平下(参见例如布莱克洛(Blacklow),1988；和罗斯(Rose),1974)。所有AAV血清型表观上呈现由同源rep基因介导的类似复制特性；并且皆通常具有三个相关衣壳蛋白质，如AAV2中表达的衣壳蛋白质。相关性程度由异双螺旋分析进一步说明，其揭露沿基因体长度的血清型之间的广泛交叉杂交；以及末端处存在对应于ITR的类似的自粘接片段。类似感染性模式还暗示每个血清型中的复制功能受到类似调节控制。在多种AAV血清型中，AAV2最常用的。
本发明的AAV载体通常包含对AAV异源的多核苷酸。由于在基因疗法情形下向目标细胞提供功能(如上调或下调某一表现型的表达)的能力，通常对多核苷酸感兴趣。这类异源多核苷酸或“转基因”通常具有足够长度以提供所需功能或编码序列。
如本领域中已知，取决于例如目标细胞内所需转录水平和/或特异性，当所欲目标细胞中需要异源多核苷酸的转录时，其可操作地连接到其自身或异源启动子。不同类型的启动子和强化子适用于这一情形。组成性启动子提供持续基因转录水平，并且在需要持续表达治疗性或预防性多核苷酸时可以是优选的。诱导型启动子在不存在诱导剂情况下通常呈现低活性，并且在存在诱导剂的情况下上调。其在仅在某些时间或某些位置需要表达时或在需要使用诱导剂滴定表达水平时可以是优选的。启动子和强化子还可以是组织特异性，也就是说，其仅在某些细胞类型中呈现其活性，可能由于仅在这些细胞中发现的基因调节元件。
启动子的说明性实例是来自猴病毒40的SV40晚期启动子、杆状病毒(Baculovirus)多面体增强子/启动子元件、单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirus)胸苷激酶(HSVtk)、来自巨细胞病毒(CMV)的即刻早期启动子和多种反转录病毒启动子，包括LTR元件。诱导型启动子包括重金属离子诱导型启动子(如小鼠乳房肿瘤病毒(mMTV)启动子或多种生长激素启动子)，和来自T7噬菌体的启动子，其在T7RNA聚合酶存在下具有活性。作为说明，组织特异性启动子的实例包括多种表面活性素启动子(用于肺中的表达)、肌球蛋白启动子(用于海鼠中的表达)和白蛋白启动子(用于肝中的表达)。本领域中已知并且通常可使用许多其它启动子，并且可在序列资料库(如GenBank资料库)中获得许多这类启动子的序列。
当所欲目标细胞中还需要转译时，异源多核苷酸将优选还包含促进转译的控制元件(如核糖体结合位点或“RBS”和聚腺苷酸化信号)。因此，异源多核苷酸通常包含至少一个可操作地连接到适合启动子的编码区，并且还可以包含例如可操作地连接的强化子、核糖体结合位点和聚-A信号。异源多核苷酸可包含一个编码区，超过一个编码区，其受相同或不同启动子控制。全部单元(含有控制元件和编码区的组合)通常称为表达卡匣。
通过重组技术将异源多核苷酸整合到AAV基因体编码区中或代替AAV基因体编码区(即代替AAVrep和cap基因)，但通常通过AAV反向末端重复(ITR)区域在任一侧上侧接。这意味着ITR在编码序列的上游和下游出现，或呈直接并列形式，例如(但未必)不存在任何AAV来源的介入序列以降低可再生复制胜任型AAV基因体的再结合的可能性。然而，单个ITR可足以进行通常与包含两个ITR的配置相关的功能(参见例如WO94/13788)，并且具有仅一个ITR的载体构筑体因此可与本发明的封装和制备方法结合使用。
rep的原生启动子是自我调节型，并且可限制所产生的AAV粒子的量。rep基因还可操作地连接到异源启动子，无论rep是作为载体构筑体的一部分或单独提供。任何不由rep基因表达显著下调的异源启动子是适合的；但优选是诱导型启动子，因为rep基因的组成性表达可对宿主细胞具有不良影响。本领域中已知许多诱导型启动子；作为说明，包括重金属离子诱导型启动子(如金属硫蛋白启动子)；类固醇激素诱导型启动子(如MMTV启动子或生长激素启动子)；以及如来自T7噬菌体的启动子，其在T7RNA聚合酶存在下具有活性。诱导型启动子的一个子类是由辅助病毒诱导的启动子，其用于补充rAAV载体的复制和封装。还描述许多辅助病毒诱导型启动子，包括腺病毒早期基因启动子，其可由腺病毒E1A蛋白质诱导；腺病毒主要晚期启动子；疱疹病毒启动子，其可由疱疹病毒蛋白质(如VP16或1CP4)诱导；以及牛痘或痘病毒诱导型启动子。
已描述用于鉴别和测试辅助病毒诱导型启动子的方法(参见例如WO96/17947)。因此，本领域中已知确定候选启动子是否可由辅助病毒诱导以及其是否将适用于产生高效封装细胞的方法。简单来说，一个这类方法涉及用假设的辅助病毒诱导型启动子(本领域中已知或使用众所周知的技术鉴别，如连接到无启动子的“报导子”基因)置换AAVrep基因的p5启动子。接着，将例如连接到阳性可选标记(如抗生素抗性基因)的AAVrep-cap基因(p5被置换)稳定整合到适合的宿主细胞(如下文例示的HeLa或A549细胞)中。接着测试能够在选择条件(例如在抗生素存在下)下相对良好生长的细胞在添加辅助病毒时表达rep和cap基因的能力。作为rep和/或cap表达的初始测试，可容易地使用免疫荧光筛选细胞以检测Rep和/或Cap蛋白质。接着可通过用于引入rAAV载体的复制和封装的功能性测试确定封装功能和效率的证实。使用这一方法，将来源于小鼠金属硫蛋白基因的辅助病毒诱导型启动子鉴别为p5启动子的适合的替代物，并且用于产生高效价rAAV粒子(如WO96/17947中所描述)。
在任何情况皆需要移除一个或多个AAV基因以降低产生复制胜任型AAV(“RCA”)的可能性。因此，可移除rep、cap或其两者的编码或启动子序列，因为可以反式提供由这些基因提供的功能。
所得载体称为在这些功能中具有“缺陷性”。为了复制和封装载体，用一个或多个封装基因补充缺失的功能，所述封装基因共同编码多种缺失rep和/或cap基因产物的所需功能。在一个实施例中，封装基因或基因卡匣不由AAVITR侧接并且在一个实施例中，不与rAAV基因体共有任何实质同源性。因此，为了将载体序列与单独提供的封装基因之间的复制期间的同源重组最小化，需要避免两个多核苷酸序列的重叠。同源性水平和对应的再结合频率随着同源序列的长度和其共有的一致性水平增加而增加。如本领域中已知，可理论上确定并且以实验方式确认将在既定系统中造成问题的同源性水平。然而，如果重叠序列小于约25个核苷酸序列(如果其与其全部长度至少80％一致)，或小于约50个核苷酸序列(如果其与其全部长度至少70％一致)，那么可实质上降低或消除再结合。当然，甚至优选更低的同源性水平，因为其将进一步降低再结合可能性。即使不存在任何重叠同源性，似乎仍存在一些残留的产生RCA的频率。可通过“拆分”AAV的复制和衣壳化功能来获得产生RCA(例如通过非同源再结合)的频率的甚至进一步降低，如由艾伦(Allen)等人,WO98/27204所描述。
在本发明中，rAAV载体构筑体和互补封装基因构筑体可以许多不同形式实施。可使用病毒粒子、质体和稳定转型宿主细胞将这类构筑体短暂或稳定地引入封装细胞。
在本发明的某些实施例中，以细菌质体、AAV粒子或其任何组合的形式提供AAV载体和互补封装基因(若存在)。在其它实施例中，以基因方式改变(优选以遗传方式改变)的真核细胞形式提供AAV载体序列、封装基因或其两者。以遗传方式改变以表达AAV载体序列、AAV封装基因或其两者的宿主细胞的研发可提供以可靠水平表达的物质的确定来源。
因此在本发明的情形中可使用多种不同的以基因方式改变的细胞。作为说明，哺乳动物宿主细胞可与稳定整合rAAV载体的至少一个完整拷贝一起使用。包含至少一个可操作地连接到启动子的AAVrep基因的AAV封装质体可用于提供复制功能(如美国专利5,658,776中所描述)。或者，具有可操作地连接到启动子的AAVrep基因的稳定哺乳动物细胞系可用于提供复制功能(参见例如特瑞皮(Trempe)等人,WO95/13392)；伯斯坦(Burstein)等人(WO98/23018)；和约翰逊(Johnson)等人(美国第5,656,785号)。提供如上文所描述的衣壳化蛋白质的AAVcap基因可与AAVrep基因一起提供或单独提供(参见例如上文参考的申请案和专利以及艾伦等人(WO98/27204))。其它组合是可能的并且包括在本发明的范围内。
III.嵌合病毒或rBoV的用途
嵌合病毒或rBoV可用于投予个体以达到基因疗法或疫苗接种的目的。疗法适用的疾病包括(但不限于)由病毒、细菌或寄生虫感染引起的疾病、多种恶性病和过度增殖病状、自身免疫病状和先天性缺陷。
可进行基因疗法以增强细胞内或由细胞分泌的特定蛋白质的表达水平。本发明的载体可用于以基因方式改变细胞以用于基因标记、替代缺失或缺陷性基因或插入治疗性基因。或者，可向细胞提供多核苷酸以降低表达水平。这可以用于抑制不合需要的表现型，如在恶性肿瘤病程期间扩增或过表达的基因或在微生物感染过程期间引入或过表达的基因的产物。可通过提供治疗性或预防性多核苷酸来降低表达水平，包含能够例如与目标基因或RNA转录(反向疗法)形成稳定杂交、能够充当核糖核酸酶以使相关mRNA裂解或能够充当目标基因的产物的锈铒的序列。
可进行疫苗接种以保护细胞免受感染性病原体感染。作为传统疫苗方法，本发明的载体可用于传递转基因编码病毒、细菌、肿瘤或真菌抗原和其在宿主细胞中的后续表达。暴露于免疫系统以引起免疫反应的抗原可呈类病毒粒子疫苗或病毒编码蛋白质的子单元疫苗形式。或者，作为被动免疫方法，本发明的载体可用于传递编码中和抗体的基因和其在宿主非造血组织中的后续表达。可通过直接提供来自载体介导的转基因表达的中和抗体来进行针对病原体感染的类疫苗保护，避免依赖于天然免疫系统用于安装所需体液免疫反应。
通过本发明的方法引入嵌合或rBoV载体可涉及使用多种在本领域中可用和众所周知的传递技术(手术和非手术型)。这类传递技术包括例如血管导管插入术、套管插入术、注射、吸入、气管内、皮下、涂擦、局部、经口、经皮、动脉内、静脉内和/或腹膜内投药。载体还可以借助于瓣膜引入，作为说明，包括血管接枝物(PTFE和达克伦(dacron))、心脏瓣膜、血管内支架、血管内铺设以及其它非血管假体。关于载体溶液的传递、频率、组合物和剂量范围的一般技术属于本领域的技术范围内。
具体来说，对于将本发明的载体传递到组织，可使用任何将载体引入宿主动物的生理学或生物学方法。载体意指裸重组型载体和封装到病毒包覆蛋白质中的载体DNA，如在投药方面众所周知。已证明仅在磷酸盐缓冲生理食盐水中溶解嵌合或rHBoV载体便足以提供适用于肌肉组织表达的媒剂，并且不存在关于可与载体共同投予的载剂或其它组分的已知限制(但在载体情况下，应以正常方式避免可降解DNA的组合物)。医药组合物可以待通过经皮传递来传递到肌肉的可注射配方或局部配方形式制备。先前已研发用于肌肉内注射和经皮传递的大量配方并且可用于本发明的实践。载体可与任何药学上可接受的载剂一起使用以便于投药和操作。
出于肌肉内注射的目的，可使用佐剂(如芝麻油或花生油)或水性丙二醇中的溶液，以及无菌水溶液。必要时，这类水溶液可经缓冲，并且首先使液体稀释剂与生理食盐水或葡萄糖具有等张性。可在适合与表面活性剂(如羟基丙基纤维素)混合的水中制备呈游离酸(DNA含有酸性磷酸酯基)或药理学上可接受的盐形式的嵌合或rHBoV载体的溶液。病毒粒子的分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中和在油中制备。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在这一方面，所使用的无菌水性培养基皆可通过所属领域的技术人员众所周知的标准技术容易地获得。
适合于可注射用途的医药形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且流动性必须达到存在流畅注射能力的程度。其必须在制造和储存条件下稳定并且必须被保存以免微生物(例如细菌和真菌)的污染活动。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用涂层(例如卵磷脂)、在分散液情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在多种情况下，优选的将是包括等张剂，例如糖或氯化钠。可通过使用药剂延迟吸收(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液是按如下方式制备：将所需量的嵌合或rHBoV载体视需要与上文列举的多种其它成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将灭菌活性成分并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法包括(但不限于)真空干燥和冷冻干燥技术，其由其预先无菌过滤溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。
出于局部投药的目的，在适用于并入经皮贴片的容器中制备稀的无菌水溶液(浓度通常是约0.1％到5％)(其它方面与上述非经肠溶液类似)，并且可包括已知载剂，如医药级二甲亚砜(DMSO)。
感兴趣的是通过向呼吸道上皮供应适当功能性囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)来矫正囊肿性纤维化的基因缺陷。因此，设想使用编码原生CFTR蛋白质的嵌合或rHBoV载体以及其突变体和片段。
本发明的组合物可体内以及体外使用。体内基因疗法包含直接向个体投予本发明的载体。医药组合物可以液体溶液或悬浮液、乳液或适用于在使用之前在液体中溶解或悬浮的固体形式提供。对于投予呼吸道，一种投药模式是通过气雾剂，其使用在与适合的气溶装置一起使用时提供固体或液体气雾剂的组合物。另一种呼吸道投药模式是使用弹性光纤气管镜以灌输载体。通常，病毒载体位于医药学上适合的无热原质缓冲液(如林格氏平衡盐溶液(Ringer'sbalancedsaltsolution)(pH7.4))中。虽然不是必需的，但可任选地以适用于精确量投药的单位剂型形式提供医药组合物。
取决于治疗目标，投予有效量的病毒。有效量可以单次或分次剂量提供。当低百分比的转导可治愈基因缺陷时，那么治疗目标通常符合或超出这一转导水平。在一些情况下，这一转导水平可通过转导目标细胞的仅约1％到5％，但更通常是所需组织类型的细胞的20％，通常是所需组织类型的细胞的至少约50％、至少约80％、至少约95％或至少约99％来获得。作为指导，由支气管镜检查法提供的单次剂量中的载体粒子的数目通常是至少约1×1012个，例如约1×1013、1×1014、1×1015或1×1016个粒子，包括DNAse抗性和DNAse敏感性粒子。在DNAse抗性粒子方面，剂量将通常在1×1012与1×1016个粒子之间，更通常在约1×1012与1×1015个粒子之间。尽管每180天进行一次治疗便足够，但可视需要常常重复治疗，如每两周或每三周一次。
为了确认宿主细胞中存在所需DNA序列，进行多种分析法。这类分析法包括例如所属领域的技术人员众所周知的“分子生物”分析法，如南方印迹法和北方印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析法，如检测是否存在由载体中的基因表达的多肽，例如通过免疫手段(免疫沉淀反应、免疫亲和力管柱、ELISA和免疫印迹法)或通过属于本发明范围内的任何其它适用于鉴别特定核酸分子的存在和/或表达的分析法。
为了检测和定量由所引入的DNA片段产生的RNA，可使用RT-PCR。在PCR的这一应用中，首先需要使用酶(如逆转录酶)将RNA逆转录成DNA，并且接着使用常规PCR技术扩增DNA。在大多数情况下，PCR技术(尽管适用)将不说明RNA产物的完整性。其它关于RNA产物的性质的信息可通过北方印迹法获得。这一技术证明存在RNA物质并且提供关于RNA完整性的信息。还可以使用斑点或狭缝印迹北方交杂(Northernhybridizations)确定存在或不存在RNA物质。这些技术是北方印迹法的改良形式并且仅证明存在或不存在RNA物质。
尽管可使用南方印迹法和PCR检测所讨论的DNA片段，但其不提供关于是否表达DNA片段的信息。可通过特定鉴别所引入的DNA序列的多肽产物或评估由宿主细胞中所引入的DNA片段的表达引起的表现型变化来评估表达。
因此，可通过若干准则监测基因变化的效用，包括分析生理流体样品，例如尿液、血浆、血清、血液、脑脊髓液或鼻或肺洗液。通过活检或外科切除术移除的样品可通过现场杂交、使用载体特异性探针的PCR扩增、RNAse保护、免疫组织学或免疫荧光细胞计数来进行分析。当通过支气管镜检查法投予载体时，可进行肺功能测试，并且可针对存在发炎性细胞激素来评估支气管灌洗。还可以监测所治疗的个体的临床特征，并且确定细胞是否表达意图通过治疗性或预防性多核苷酸传达的功能。
是否使用体内或体外疗法的决定以及特定组合物、剂量和投药途径的选择将视许多不同因素而定，包括(但不限于)病状和所治疗的个体的特征。这类特征的评估和适合的治疗性或预防性疗程的设计最终是处方医师的职责。
前述说明尤其提供用于产生重组型嵌合病毒或rHBoV的高效价制剂的方法，所述制剂实质上不含辅助病毒(例如腺病毒)和细胞蛋白质。应理解，所属领域的技术人员可在不偏离本发明的精神的情况下对这些方法做出变化。
IV.适用于本发明的实践的试剂
适用于本发明的试剂类别包括(但不限于)抗生素、化学治疗剂(例如蒽环霉素(anthracyclines))、蛋白酶体调节剂、降脂剂、粘液溶解剂和食品添加剂。示例性试剂包括蛋白酶体抑制剂(瓦格纳等人,2002；杨等人,2000；西森博格等人,2001)，以及调节蛋白酶体和泛素路径(例如结合于蛋白体和/或调节蛋白体、泛素、泛素载体蛋白质或泛素连接酶的活性)的试剂。这些试剂的实例包括(但不限于)抗生素(例如埃普霉素(epoxomicin))、降脂药物(例如辛伐他汀(simvastatin))、食品添加剂(例如鞣酸)和化学治疗剂(例如顺铂、蒽环霉素(如多柔比星)和喜树碱(camptothecin))。在一个实施例中，试剂是LLnL(MG101)、Z-LLL(MG132)、硼替佐米(万珂)、埃普霉素、多柔比星、多希(doxil)、道诺霉素(daunorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、阿克拉霉素(aclarubicin)、辛伐他汀、鞣酸、喜树碱或顺铂(cisplatin)。
在一个实施例中，试剂是式(I)：R1-A-(B)n-C的化合物，其中R1是N端氨基酸阻隔基；每个A和B独立地是氨基酸；C是其中末端羧基已由甲酰基(CHO)置换的氨基酸；并且n是0、1、2或3；或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，R1是(C1-C10)烷酰基。在一个实施例中，R1是乙酰基或苯甲氧羰基。在一个实施例中，每个A和B独立地是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、异白氨酸、白氨酸、缬氨酸、正白氨酸或正缬氨酸。在一个实施例中，每个A和B是异白氨酸。在一个实施例中，C是丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、异白氨酸、白氨酸、缬氨酸、正白氨酸或正缬氨酸，其中末端羧基已由甲酰基(CHO)置换。在一个实施例中，C是正白氨酸或正缬氨酸，其中末端羧基已由甲酰基(CHO)置换。在一个实施例中，R1是(C1-C10)烷酰基或苯甲氧羰基；A和B各自是异白氨酸；C是正白氨酸或正缬氨酸，其中末端羧基已由甲酰基(CHO)置换；并且N是1。
试剂的另一个实例是式(II)化合物：
其中
R2是N端氨基酸阻隔基；
R3、R4和R5各自独立地是氢、(C1-C10)烷基、芳基或芳基(C1-C10)烷基；和
R6、R7和R8各自独立地是氢、(C1-C10)烷基、芳基或芳基(C1-C10)烷基；或其药学上可接受的盐。
在另一个实例中，适用于所述方法的试剂是式(III)化合物：
R-A-A1-R1
其中R是氢、氨基酸或肽，其中N端氨基酸可任选地在氨基处由乙酰基、酰基、三氟乙酰基或苯甲氧羰基保护；A是氨基酸或直接键；A1是氨基酸；和
R1是羟基或氨基酸，其中C端氨基酸可任选地在羧基处由(C1-C6)烷基、苯基、苯甲基酯或酰胺(例如C(＝O)NR2，其中每个R独立地是氢或(C1-C6)烷基)保护；
或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，试剂是H-Leu-Ala-OH、H-His-Ala-OH或其组合。
V.本发明的药剂的剂量、配方和投药途径
取决于例如受体的生理条件、投药目的是治疗性或预防性和有经验的从业者已知的其它因素，根据本发明鉴别的药剂的投药可以是连续或间断的。本发明的药剂的投药可以在预先选择时间段内是实质上连续的或可呈一系列间隔剂量形式。涵盖局部和全身投药。当本发明的药剂用于预防性目的时，本发明的药剂能够长期使用，例如通过全身投药。
如下文所讨论的一种或多种包含本发明的药剂的适合的单位剂型可任选地经配制以用于持续释放，可通过多种途径(包括经口或非经肠，包括通过经直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、胸内、肺内和鼻内途径)投予。举例来说，对于投予肝脏，可优选静脉内投药。对于投予肺，可优选呼吸道投药。适当时，配方宜以离散单位剂型形式呈递并且可通过药剂学中众所周知的方法中的任一种制备。这类方法可包括使药剂与液体载剂、固体基质、半固体载剂、细粉状固体载剂或其组合缔合并且接着视需要将产物引入所需传递系统或使其成形的步骤。
当本发明的药剂准备用于口服投药时，其可与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合以形成医药配方，或单位剂型。这类配方中的总活性成分占配方的0.1到99.9重量％。“医药学上可接受”意指载剂、稀释剂、赋形剂和/或盐必须与配方中的其它成分相容并且对其受体无害。用于口服投药的活性成分可以粉末或颗粒、溶液、悬浮液或乳液形式存在；或位于可用基质中，如用于从口嚼锭摄入活性成分的合成树脂。活性成分还可以药团、舐剂或糊剂形式呈递。
含有本发明的药剂的医药配方可使用众所周知和易于获得的成分通过本领域中已知的程序制备。举例来说，药剂可与常用赋形剂、稀释剂或载剂一起配制，并且形成片剂、胶囊、悬浮液、粉末等。适用于这类配方的赋形剂、稀释剂和载剂的实例包括以下填充剂和填料，如淀粉、糖、甘露醇和硅衍生物；结合剂，如羧甲基纤维素、HPMC和其它纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯-吡咯烷酮；保湿剂，如甘油；崩解剂，如碳酸钙和碳酸氢钠；用于延缓溶解的试剂，如链烷烃；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如鲸蜡基醇、单硬脂酸甘油酯；吸附载剂，如高岭土和膨润土；以及润滑剂，如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁，和固体聚乙二醇。
举例来说，含有本发明的药剂的片剂或囊剂可包括缓冲剂，如碳酸钙、氧化镁和碳酸镁。囊剂和片剂还可以包括非活性成分，如纤维素、预胶凝化淀粉、二氧化硅、羟基丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素、淀粉、滑石、二氧化钛、苯甲酸、柠檬酸、玉米淀粉、矿物油、聚丙二醇、磷酸钠和硬脂酸锌等。含有本发明的药剂的硬或软明胶胶囊可含有非活性成分，如明胶、微晶纤维素、月桂基硫酸钠、淀粉、滑石和二氧化钛等，以及液体媒剂，如聚乙二醇(PEG)和植物油。此外，本发明的药剂的包覆肠溶包衣的囊剂或片剂经设计以抵抗在胃中崩解并且在十二指肠中的更加中性到碱性环境中溶解。
本发明的药剂还可以配制成酏剂或溶液以用于便利的口服投药，或配制成适合于非经肠投药的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉内途径。
本发明的药剂的医药配方还可以呈水性或无水溶液或分散液形式，或呈乳液或悬浮液形式。
因此，治疗剂可经调配用于非经肠投药(例如通过注射，例如快速注射或连续输注)，并且可在安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或在具有附加防腐剂的多剂量容器中以单位剂型形式呈递。活性成分可采用如于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有如悬浮剂、稳定剂分散剂分散剂等配制剂。或者，活性成分可呈粉末形式，其通过无菌分离无菌固体或通过从在使用之前用适合媒剂(例如无菌、无热原质水)复原的溶液冻干获得。
这些配方可含有先前技术中众所周知的医药学上可接受的媒剂和佐剂。除水以外，可例如使用从生理学观点看来可接受的一种或多种有机溶剂制备溶液，其选自溶剂(如丙酮、乙醇、异丙醇)、乙二醇醚(如以名称“多瓦诺(Dowanol)”市售的产品)、聚二醇和聚乙二醇、短链酸的C1-C4烷基酯(例如乳酸乙酯或乳酸异丙酯)、脂肪酸甘油三酯(如以名称“米格优(Miglyol)”市售的产品)、十四烷酸异丙酯、动物油、矿物质油和植物油以及聚硅氧烷。
本发明的组合物还可以含有增稠剂，如纤维素和/或纤维素衍生物。其还可以含有胶，如黄原胶、瓜尔胶或碳胶或阿拉伯胶，或聚乙二醇、膨润土和蒙脱石等。
若需要，可添加佐剂，其选自抗氧化剂、表面活性剂、其它防腐剂、成膜剂、角质溶解剂或粉刺消溶剂(comedolyticagent)、香料和着色剂。还可以添加其它活性成分，无论用于所描述的病状或一些其它病状。
举例来说，在抗氧化剂中，可提及叔丁基氢醌、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯和α-生育酚以及其衍生物。主要调节用于局部应用的盖伦形式(galenicalform)呈乳膏、乳状物、凝胶、分散液或微乳剂、或多或少增稠的洗剂、被浸透的衬垫、软膏或棍棒形式，或以喷雾或泡沫形式形成气雾剂配方，或呈一块肥皂形式。
另外，药剂良好适用于呈持续释放剂型等形式的配方。可由此构成配方，其仅或例如在肠道或呼吸道的特定部分中(可能在一段时间内)释放活性成分。包衣、包膜和保护性基质可由例如聚合物质(如聚乳酸交酯-乙醇酸酯)、脂质体、微乳剂、微米粒子、纳米粒子或蜡制成。这些包衣、包膜和保护性基质适用于涂布留置装置，例如支架、导管、腹膜透析管等。
本发明的药剂可通过用于经皮投药的贴片传递。关于适用于药剂的经皮传递的贴片的实例，参见美国专利第5,560,922号。用于经皮传递的贴片可包含衬底层和聚合物基质，其中具有分散或溶解的药剂，以及一种或多种皮肤穿透增强剂。衬底层可由不可由药剂渗透的任何适合的材料制成。衬底层充当基质层的保护盖并且还提供支撑功能。可形成衬底使得其是与聚合物基质实质上相同尺寸的层，或其可具有较大尺寸使得其可延伸超出聚合物基质的侧面或覆盖聚合物基质的侧面并且接着可以衬底层的延伸表面可作为粘着构件的底座的形式向外延伸。或者，聚合物基质可含有粘着剂聚合物(如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙酸乙烯酯共聚物)或由其配制。对于长期应用，可能需要使用微孔和/或可透气衬底层合物，由此可最小化皮肤的水合或浸软作用。
适用于制造衬底层的材料的实例是高和低密度聚乙烯、聚丙烯、聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯、聚酯(如聚(邻苯二甲酸亚乙酯))的薄膜；金属箔；这类适合的聚合物薄膜的金属箔层合物等。用于衬底层的材料可以是这类聚合物薄膜与金属箔(如铝箔)的层合物。在这类层合物中，层合物的聚合物薄膜将通常与粘着性聚合物基质接触。
衬底层可具有任何适合的厚度，所述厚度将提供所需保护和支撑功能。适合的厚度将是约10到约200微米。
通常，这些用于形成生物学上可接受的粘着性聚合物层的聚合物是能够形成药剂可以受控速率通过的成形体、薄壁或包衣的聚合物。适合的聚合物是生物学和医药学上相容的，不会引起过敏并且不可溶于与装置接触的体液或组织和与其相容。避免使用可溶聚合物，因为基质由皮肤水分的溶解或腐蚀将影响药剂的释放速率以及剂量单元原地保留以便于移除的能力。
用于制造粘着性聚合物层的示例性材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚氨基甲酸酯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、聚硅氧弹性体，尤其医用级聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、交联聚甲基丙烯酸酯聚合物(水凝胶)、聚偏二氯乙烯、聚(对苯二甲酸亚乙酯)、丁基橡胶、表氯醇橡胶、乙烯乙烯醇共聚物、乙烯-乙烯氧基乙醇共聚物；聚硅氧共聚物，例如聚硅氧烷-聚碳酸酯共聚物、聚硅氧烷-聚氧化乙烯共聚物、聚硅氧烷-聚甲基丙烯酸酯共聚物、聚硅氧烷至烯烃共聚物(例如聚硅氧烷-乙烯共聚物)、聚硅氧烷-亚烷基硅烷共聚物(例如聚硅氧烷-亚乙基硅烷共聚物)等；纤维素聚合物，例如甲基纤维素或乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素和纤维素酯；聚碳酸酯；聚四氟乙烯；等。
生物学上可接受的粘着剂聚合物基质可选自玻璃化转变温度低于室温的聚合物。聚合物可(但非必须)在室温下具有结晶度。可将交联单体单元或位点并入这类聚合物。举例来说，可将交联单体并入聚丙烯酸酯聚合物，其提供用于在将药剂分散于聚合物中之后交联基质的位点。用于聚丙烯酸酯聚合物的已知交联单体包括多元醇的聚甲基丙烯酸酯，如二丙烯酸亚丁酯和二甲基丙烯酸亚丁酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯等。其它提供这类位点的单体包括丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯、顺丁烯二酸二烯丙酯等。
塑化剂和/或保湿剂可分散于粘着性聚合物基质内。水可溶多元醇通常适用于这一目的。将保湿剂并入配方中可使剂量单元能够吸收皮肤表面上的水分，其又有助于降低皮肤刺激和防止传递系统的粘着性聚合物层失效。
由经皮传递系统释放的药剂必须能够渗透每一层皮肤。为了增加药剂渗透速率，经皮药物传递系统必须尤其能够增加最外层皮肤(角质层)的渗透性，所述角质层提供对分子渗透的大部分抗性。用于药剂的经皮传递的贴片的制造方法是本领域中众所周知的。
对于通过吸入来投予上(鼻)呼吸道或下呼吸道，本发明的药剂宜由吹入器、喷雾器或加压包或其它用于传递气雾剂喷雾的便利构件传递。加压包可以包含适合的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供用于传递定量数量的阀门来确定剂量单位。
或者，对于通过吸入或吹入投药，组合物可呈干燥粉末形式，例如药剂与适合的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以单位剂型形式在例如胶囊或药筒中呈递，或例如可借助于吸入器、吹入器或定剂量吸入剂投予粉末的明胶或泡壳包。
对于鼻内投药，药剂可通过鼻滴液、液体喷雾投予，如通过塑料瓶雾化器或定剂量吸入剂。典型雾化器是米索米特(Mistometer)(温梭普(Wintrop))和米迪海勒(Medihaler)(赖克(Riker))。
本发明的药剂的局部传递还可以通过多种在疾病位点处或其附近投予药剂的技术进行。定点或靶向局部传递技术的实例并不意图是限制性，而是说明可使用的技术。实例包括局部传递管(如灌注或留置管)，例如输液针管、分流和支架或其它可植入装置、位点特异性载剂、直接注射或直接施用。
对于局部投药，药剂可如本领域中已知的方式配制以用于直接施用于目标区域。用于这一目的的常规形式包括伤口敷料、包衣绷带或其它聚合物覆盖物、软膏、乳膏、洗剂、糊剂、胶状物、喷雾剂和气雾剂。软膏和乳膏可例如用添加适合的增稠剂和/或胶凝剂的水性或油性基质配制。洗剂可以用水性或油性基底配制，并且一般来说还将含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。活性成分还可以通过离子导入疗法传递，例如美国专利第4,140,122号；第4,383,529号；或第4,051,842号中所披露。局部配方中本发明的药剂的重量百分比将视多种因素而定，但通常将是配方总重量的0.01％到95％，并且通常是0.1至25重量％。
滴剂(如滴眼剂或滴鼻剂)可用还包含一种或多种分散剂、溶解剂或悬浮剂的水性或非水性基质配制。液体喷雾剂宜由加压包传递。滴剂可通过简单的滴眼剂密封瓶或通过适于逐滴传递液体内含物、通过特殊成形密封件传递。
药剂可进一步经配制以用于口腔或咽喉中的局部投药。举例来说，活性成分可配制成含片，其进一步包含调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；片剂，其在惰性基质(如明胶和丙三醇或蔗糖和阿拉伯胶)中包含组合物；以及漱口剂，其在适合的液体载剂中包含本发明的组合物。
本文中所描述的配方和组合物还可以含有其它成分，如抗菌剂，或防腐剂。此外，活性成分还可以与其它药剂(例如支气管扩张剂)组合使用。
本发明的药剂可单独或与药物学上可接受的载剂组合投予哺乳动物。如上所述，通过化合物的溶解度和化学性质、所选择的投药途径和标准医药学实践来确定活性成分与载体的相对比例。
本发明药剂的剂量将随投药形式、所选择的特定化合物和接受治疗的特定患者的生理学特征而变化。通常，最初将使用小剂量并且如果需要，将以小递增量递增直到在所述情形下达到最佳作用。
VI.示例性实施例
在一个实施例中，本发明提供经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体。在一个实施例中，博卡病毒衣壳是HBoV衣壳。在一个实施例中，HBoV衣壳是HBoV1、HBoV2、HBoV3或HBoV4衣壳。在一个实施例中，基因体包含编码异源基因产物(例如治疗性蛋白质)的表达卡匣。在一个实施例中，rAAV基因体是rAAV-2基因体。在一个实施例中，rAAV基因体是rAAV-1、rAAV-3、rAAV-4、rAAV-5、rAAV-6、rAAV-7、rAAV-8或rAAV-9基因体。在一个实施例中，rAAV基因体是来源于AAV的非人类物种。在一个实施例中，表达卡匣包括在纤毛呼吸道细胞中表达的启动子，例如FOXJ1启动子。在一个实施例中，基因体包括反式剪接结构域。由病毒基因体编码的基因产物可以是病毒、细菌、肿瘤或真菌抗原。在一个实施例中，转基因编码中和型抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，基因产物是囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白、α1-抗胰蛋白酶、表面活性剂蛋白质SP-D、SP-A或SP-C、红血球生成素、RSV蛋白质、HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS蛋白质、细胞激素，例如IFN-α、IFN-γ、TNF、IL-1、IL-17或IL-6。还提供用于在哺乳动物细胞中表达异源基因产物的方法，其使用经分离的嵌合病毒以可有效表达异源基因产物(例如治疗性基因产物、催化性RNA、预防性基因产物、多肽或肽)的量感染细胞。在一个实施例中，病毒是从昆虫细胞或哺乳动物细胞分离。还提供用于增强哺乳动物细胞的嵌合病毒转导的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞与包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体(其包含编码异源基因产物的转基因)的经分离的嵌合病毒和至少一种可有效地额外或协同增强rAAV转导的量的药剂接触。在一个实施例中，哺乳动物细胞是哺乳动物肺细胞。在一个实施例中，药剂是蛋白酶体抑制剂(porteasomeinhibitor)、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂。
经分离的嵌合病毒可用于用以抑制或治疗与内源性基因产物的异常表达相关的病状的方法中。所述方法包括使具有罹患病状的风险或罹患病状的哺乳动物与有效量的经分离的嵌合病毒(其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体)接触，其中rAAV基因体包含编码至少一部分功能性基因产物的转基因，所述功能性基因产物于哺乳动物中的表达可抑制或治疗病状的至少一种症状。在一个实施例中，基因产物是囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白、α1-抗胰蛋白酶、表面活性剂蛋白质SP-D、SP-A或SP-C、红血球生成素、RSV蛋白质、HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、SARS蛋白质、细胞激素，例如IFN-α、IFN-γ、TNF、IL-1、IL-17或IL-6。在一个实施例中，哺乳动物进一步与可促进转导的量的至少一种蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、抗生素或食品添加剂接触。在一个实施例中，所述至少一种药剂是LLnL(MG101)、Z-LLL(MG132)、硼替佐米(万珂)、埃普霉素、多柔比星、多希、道诺霉素、艾达霉素、表柔比星、阿克拉霉素、辛伐他汀、鞣酸、喜树碱或顺铂。药剂可用于用以增强哺乳动物细胞的病毒转导的方法中。哺乳动物细胞与包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体的嵌合病毒以及可有效地增强病毒转导的量的药剂(与未与所述药剂接触的哺乳动物细胞相比)接触。在一个实施例中，药剂是蛋白酶体抑制剂。还提供用于增强哺乳动物细胞中转基因的表达的方法，其中哺乳动物细胞与一定量的药剂(其是蛋白酶体抑制剂)以及包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体(其包含转基因)的嵌合病毒接触。药剂的量可促进rAAV的转导，从而与未与所述药剂接触的哺乳动物细胞相比增强转基因的表达。
还提供一种方法，其中哺乳动物经历用包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体的经分离的嵌合病毒进行的病毒基因疗法，其中基因体包含转基因，其在哺乳动物中的表达是治疗性的，投予可有效地增强哺乳动物细胞中转基因的表达的量的药剂(与未与所述药剂接触的哺乳动物细胞相比)，所述药剂是蛋白酶体抑制剂。在一个实施例中，rAAV编码治疗性肽或治疗性多肽。在一个实施例中，细胞或哺乳动物在所述细胞或哺乳动物与病毒接触之前与药剂接触。在一个实施例中，细胞或哺乳动物在所述细胞或哺乳动物与药剂接触之前与病毒接触。在一个实施例中，细胞或哺乳动物同时与病毒和药剂接触。在一个实施例中，药剂和病毒是投予肺。在一个实施例中，病毒是经口投予。在一个实施例中，病毒是经鼻投予。在一个实施例中，病毒是投予血管。
还提供使哺乳动物免疫的方法。所述方法包括投予哺乳动物经分离的嵌合病毒，其包含可有效地阻止或抑制微生物感染或复制的量的人类博卡病毒衣壳蛋白质和编码预防性基因产物的rAAV基因体。在一个实施例中，基因产物是病毒、细菌、真菌或寄生虫的抗原。在一个实施例中，基因产物是针对病毒、细菌、真菌或寄生虫的中和型抗体。
本发明提供经分离的rHBoV，其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和重组型HBoV基因体。在一个实施例中，基因体包含编码异源基因产物的表达卡匣。在一个实施例中，基因产物编码治疗性蛋白质。在一个实施例中，基因产物是病毒、细菌、肿瘤或真菌抗原。在一个实施例中，基因产物是囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白、α1-抗胰蛋白酶、表面活性剂蛋白质SP-D、SP-A或SP-C、红血球生成素、HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、RSV蛋白质、SARS蛋白质或细胞激素，例如IFN-α、IFNγ、TNF、IL-1、IL-17或IL-6。经分离的rHBoV可用于在哺乳动物细胞中表达异源基因产物。细胞用可有效地表达异源基因产物(例如治疗性基因产物、催化性RNA、预防性基因产物、多肽或肽)的量的病毒感染。还提供用于增强哺乳动物细胞的嵌合病毒转导的方法。所述方法包括使哺乳动物细胞与包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体(其包含编码异源基因产物的转基因)的经分离的rHBoV和至少一种可有效地额外或协同增强rAAV转导的量的药剂接触。在一个实施例中，哺乳动物细胞是哺乳动物肺细胞。在一个实施例中，药剂是蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、抗生素或食品添加剂。
还提供用于抑制或治疗与内源性基因产物的异常表达相关的病状的方法。所述方法包括使具有罹患病状的风险或罹患病状的哺乳动物与有效量的包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rHBoV基因体的经分离的rHBoV接触，其中rHBoV基因体包含编码至少一部分功能性基因产物的转基因，所述功能性基因产物于哺乳动物中的表达可抑制或治疗病状的至少一种症状。在一个实施例中，基因产物是囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白、α1-抗胰蛋白酶、表面活性剂蛋白质SP-D、SP-A或SP-C、红血球生成素、HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、RSV蛋白质、SARS蛋白质、SARS蛋白质、IFN-α、IFNγ、TNF、IL-1、IL-17或IL-6。在一个实施例中，进一步包含使哺乳动物与可促进转导的量的至少一种蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂接触。在一个实施例中，药剂是LLnL(MG101)、Z-LLL(MG132)、硼替佐米(万珂)、埃普霉素、多柔比星、多希、道诺霉素、艾达霉素、表柔比星、阿克拉霉素、辛伐他汀、鞣酸、喜树碱或顺铂。
此外，本发明提供用于增强哺乳动物细胞的病毒转导的方法，其中哺乳动物细胞与包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rHBoV基因体的rHBoV以及可有效地增强病毒转导的量的药剂(与未与所述药剂接触的哺乳动物细胞相比)接触，例如所述药剂是蛋白酶体抑制剂。所述药剂和rHBoV可用于用以增强哺乳动物细胞中转基因的表达的方法中。所述方法包括使哺乳动物细胞与一定量的药剂(其是蛋白酶体抑制剂)和包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rHBoV基因体(其包含转基因)的rHBoV接触，其中所述量促进转导，从而与未与药剂接触的哺乳动物细胞相比增强转基因的表达。可将药剂投予经历用包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rHBoV基因体的经分离的rHBoV进行的病毒基因疗法的哺乳动物，其中所述基因体包含转基因，其于哺乳动物中的表达可以是治疗性的。药剂可以是蛋白酶体抑制剂并且以可有效地增强哺乳动物细胞中转基因的表达的量(与未与所述药剂接触的哺乳动物细胞相比)投予。在一个实施例中，rHBoV编码治疗性肽或治疗性多肽。在一个实施例中，细胞或哺乳动物在所述细胞与病毒接触之前与药剂接触。在一个实施例中，细胞或哺乳动物在所述细胞与药剂接触之前与病毒接触。在一个实施例中，细胞或哺乳动物同时与病毒和药剂接触。在一个实施例中，药剂和病毒是投予肺。在一个实施例中，病毒是经口投予。在一个实施例中，病毒是经鼻投予。在一个实施例中，病毒是投予血管。
包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和编码预防性基因产物的rHBoV基因体的经分离的rHBoV可用于用以使哺乳动物免疫的方法中。病毒是以可有效地阻止或抑制微生物感染或复制的量投予哺乳动物。
还提供使哺乳动物免疫的方法，其包括投予哺乳动物可有效地阻止或抑制HBoV感染或复制的量的经分离的嵌合病毒，其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体。在一个实施例中，嵌合病毒是投予肺。还提供包含嵌合病毒的疫苗。
还提供使哺乳动物免疫的方法，其包含：投予哺乳动物可有效地阻止或抑制HBoV感染或复制的量的经分离的rHBoV，其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rHBoV基因体。在一个实施例中，嵌合病毒是投予肺。还提供包含病毒的疫苗。
现将通过以下非限制性实例进一步描述本发明。
实例1
材料和方法
细胞培养物
细胞系和原代细胞。人类胚胎肾脏293(HEK293)细胞(CRL-1573)、HeLa(CCL-2)、MDCK(CCL-34)、MRC-5(CCL-171)、LLC-MK2(CCL-7)和Vero-E6(CRL-1586)是从美国菌种保藏中心(AmericanTypeCultureCollection/ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯市(Manassas,VA))获得，并且在具有10％胎牛血清(FCS)的杜贝克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium/DMEM)中培养。来源于人类呼吸道上皮细胞的细胞系是A549(ATCCCCL-185)、BEAS-2B(ATCCCRL-9609)、16HBE14o-(从迪特格鲁纳特博士(Dr.DieterGruenert)处获得)以及NuLi-1和CuFi-8(组织和细胞培养物核心(TissueandCellCultureCore),基因疗法中心(CenterforGeneTherapy),爱荷华大学(UniversityofIowa))。NuLi-1和CuFi-8通过表达hTERT和HPVE6/E7基因分别从正常和囊肿性纤维化人类初级呼吸道细胞永生化(扎布纳(Zabner)等人,2003)。初级科龙迪克(Clonetics)正常人类支气管/气管上皮细胞(NHBE)是从隆萨公司(Lonza)(马里兰州沃克斯维尔(Walkersville,MD))购得。细胞根据由供应商提供的说明在培养基中培养。
人类呼吸道上皮培养基。极化初级HAE(称为初级B-HAE)是通过在包被胶原的半渗透细胞膜插入物(0.6cm2，Millicell-PCF；马萨诸塞州比勒利卡的密理博公司(Millipore,Billerica,MA))上生长经分离的人类呼吸道(气管支气管)上皮细胞(由不同供体产生三种HAE培养基)，并且接着使其在空气-液体介面(ALI)处分化而产生；这是在爱荷华大学的基因疗法中心的组织和细胞培养物核心进行(扎布纳等人,2003；卡普(Karp)等人,2002；颜等人,2004；颜等人,2006)。在ALI培养3-4周之后，使用上皮伏特-欧姆计(Volt-OhmMeter)(密理博公司)基于上皮电阻(TEER)确定HAE的极性并且评估与感染能力的关系；HBoV1感染需要需要超过1,000V.cm2的值。根据与上述相同的方法，但分别使用永生化呼吸道上皮细胞系CuFi-8和NuLi-1产生CuFi-HAE和NuLi-HAE。培养初级B-HAE、CuFi-HAE和NuLi-HAE、分化并且保持在含有2％UltroserG(法国塞尔吉圣克里斯托弗的颇尔公司(PallBioSepra,SepraCergy-Staint-Christophe,France)的(50％:50％)DMEM:F12中。
病毒的分离和病毒DNA的提取
在巴西萨尔瓦多(Salvador,Brazil)从患有社区获得性肺炎的儿童获得鼻咽分泌物，所述儿童患有急性HBoV1感染(血清转化、病毒血症和每毫升抽吸超过104gcHBoV1)(纳西门托-卡瓦略(Nascimento-Carvalho)等人,2012)。根据坎多拉(Kantola)等人(2010)中描述的方法提取病毒DNA。
所使用的引物和通过聚合酶链反应(PCR)进行的序列扩增
HBoV1游离基因体的头端对尾端接合的序列表明HBoVLEH和REH在结构和序列方面分别与BPVLEH和MVCREH共有类似性(孙(Sun)等人,2009；卢斯布林克(Lusebrink)等人,2011)。根据制造商说明使用福讯(Phusion)高保真度PCR试剂盒(马萨诸塞州伊普威治的NEB公司(NEB,Ipswich,MA))以扩增HBoV1的左端发夹(LEH)和右端发夹(REH)。简单来说，在98℃下进行DNA变性30秒，接着进行35次以下循环：在98℃下变性10秒；在55℃下粘接15秒；以及在72℃下扩展30秒。在最后一次循环之后，在72℃下继续扩展10分钟。在2％琼脂糖凝胶中通过电泳来分析PCR产物。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,CA))提取DNA带，并且所提取的DNA使用与正向和反向扩增引物上的扩展序列互补的引物在MCLAB(加利福尼亚州南旧金山(SouthSanFrancisco,CA))直接测序。在pGEM-T载体(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))中克隆PCR产生的DNA，并且接着对从个别纯系的培养物分离的DNA进行测序。
全长HBoV1纯系和其突变体的构造
pBB载体的构造。通过将59-SalI-SacII-KpnI-SmaIApaI-SphI-KpnI-HindIII-XhoI-39的连接子插入载体主链(pProEXHTb载体；英杰公司)来构筑pBBSmaI载体，所述载体主链是通过移除所有B19V序列(SalI消化)由B19V感染性纯系pM20(值(Zhi)等人,2004)产生。所有克隆工作是在Sure2(加利福尼亚州拉荷亚的安捷伦公司(Agilent,LaJolla,CA))的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株中进行。HBoV1的所有核苷酸编号是指HBoV1全长基因体(基因库寄存号：JQ923422)。
左端发夹的克隆。由病毒DNA扩增DNA片段SalI-BglII-nt93-518(BspEI)-576-XhoI-HindIII(含有HBoV1序列nt93-576)并且插入SaII/HindIII消化的pBBSmaI中以产生pBB2.1。根据所获得的LEH序列合成另一种DNA，即SalI-nt1-86-BclI(含有HBoV1nt1-86序列)，并且置放于pBB2.1中的SalI与BglII位点之间，其中BclI和BglII位点的接合可复制HBoV1序列nt87-92。所得含有59HBoV1nt1-576序列的质体(具有完整LEH)称为pBB-LEH。
右端发夹的克隆。由病毒DNA扩增DNA片段SalI-nt4097-4139(BglII)-5427(KasI)-ApaI(含有HBoV1nt4097-5427序列)并且插入SaII/ApaI消化的pBBSmaI中，产生pBB2.2。基于REH序列合成另一个DNA片段ApaI-nt5460(KasI)-5543-XhoI(含有HBoV1nt5460-5543序列)并且置放于pBB2.2中的ApaI与HindIII序列之间，产生pBBREH(D5428-5459)。通过基于REH序列合成的KasI连接子恢复涵盖nt5428-5459的两个KasI位点之间的缺失短片段并且插入KasI消化的pBB-REH(D5428-5459)中。所得含有39HBoV1nt4097-5543序列的质体(具有完整REH)称为pBB-REH。
pIHBoV1的克隆。将从pBB-LEH的SalI/XhoI消化获得的HBoV1DNA片段SalI-nt1-518(BspEI)-576-XhoI接合到SalI消化的pBB-REH中，产生pBB-LEH(BspEI/BglII)REH。将这一质体由BspEI/BglII进行的消化而产生的较大片段接合到HBoV1DNA片段nt518(BspEI)-4139(BglII)，其是由病毒DNA扩增。含有全长HBoV1(nt1-5543)的最终构筑体称为pIHBoV1。
pIHBoV1突变体的构造。通过使HBoV1nt542从T到A突变以及nt2588从G到A突变来构筑pIHBoV1NS1(2)和pIHBoV1NP1(2)，分别产生可引起NS1和NP1ORF早期终止的终止密码子。类似地，通过使HBoV1nt3205从T到A突变以及nt3540从T到G突变、破坏VP1和VP2ORF来分别产生pIHBoV1VP1(2)和pIHBoV1VP2(2)。
转染
在60mm培养皿中生长的细胞用2mg质体转染；如邱(Qiu)等人(2002)中所描述使用脂染胺和普拉斯(Plus)反应剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司/生命技术公司(Invitrogen/LifeTechnologies,Carlsbad,CA))。对于一些转染实验，HEK293细胞用2mg含有腺病毒5(Ad5)E2a、E4orf6和VA基因的pHelper质体(安捷伦公司)共转染，或用第5型腺病毒(Ad)以MOI＝5进行感染，如邱等人(2002)中所描述。
南方印迹分析
从经转染的细胞提取低分子量(Hirt)DNA，用DpnI消化(或保持未消化)并且通过南方印迹法分析，如邱等人(2006)中所描述。
西方印迹分析
使细胞溶解，通过SDS-8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，并且用抗体如所指示进行印迹，如刘等人(2004)中所描述。
HBoV1的制备和纯化
在十五个150mm培养盘上于DMEM-10％FCS中培养HEK293细胞，并且使用LipoD293(马里兰州盖瑟斯堡的西格纳金公司(SignaGen,Gaithersburg,MD))，每个培养皿用15mgpIHBoV1转染。在5％CO2和37℃下保持48小时之后，收集细胞，再悬浮于10mL磷酸盐缓冲生理食盐水，pH7.4(PBS)中，并且通过使其经历四个冷冻(-196℃)和解冻(37℃)循环来溶解。接着使细胞裂解物以10,000rpm旋转30分钟。收集上清液并且用连续CsCl梯度进行评估。简单来说，通过添加CsCl将密度调节到1.40g/mL，并且将样品装载到11ml离心机试管中且在索福TH641旋转器(SorvallTH641rotor)中在20℃下以36,000rpm旋转36小时。
用皮斯顿梯度洗脱器(PistonGradientFractionator)(加拿大新不伦瑞克省弗雷德里克顿的拜康公司(BioComp,Fredericton,NB,Canada))收集550mL洗脱份(20个洗脱份)，并且通过阿比折射计(Abbe'sRefractometer)确定每个洗脱份的密度。从每个洗脱份提取病毒DNA并且如下文所述使用HBoV1特异性qPCR相对于HBoV1gc的数目进行定量。将这些含有最高数目的HBoV1gc的洗脱份针对PBS进行透析，并且接着通过电子显微镜观察且用于感染HAE培养物。
通过电子显微法(EM)观察
将最终纯化的病毒制剂浓缩约5倍，并且在涂有碳膜的300筛目铜EM网格上吸附1分钟，接着用去离子水洗涤5秒并且用1％乙酸铀酰酯染色1分钟。将网格风干，并且用配备有场发射枪的200kVTecnaiF20G2穿透电子显微镜进行检验。
病毒感染
完全分化初级B-HAE(三种不同亚型中的每一种)、CuFi-HAE和NuLi-HAE在Millicell插入物(0.6cm2；密理博公司)中培养并且用150μL纯HBoV1(1×107gc/mL于磷酸盐缓冲生理食盐水，pH7.4中；PBS)从顶端表面接种(感染倍率MOI是约750gc/细胞；平均2×106个细胞/插入物)。对于每种HAE，进行2小时培育，接着从顶端腔室抽吸病毒并且用200mLPBS洗涤细胞三次以移除未结合的病毒。接着HAE进一步在ALI中培养。
对于常规单层细胞，在腔式载玻片(Lab-TekII；拜力公司(NalgeNunc))中培养的细胞用纯HBoV1以MOI＝1,000gc/细胞进行感染。
免疫荧光分析
在HBoV1感染之后，ALI薄膜在室温下用含3.7％多聚甲醛的PBS固定15分钟。将固定的薄膜切割成若干小片，在PBS中历时5分钟洗涤三次，并且用0.2％TritonX-100在室温下渗透15分钟。接着薄膜与初级抗体(在具有2％FCS的PBS中以1:100稀释)一起在37℃下培育1小时。接着与异硫氰酸荧光素或若丹明结合的二级抗体一起培育。用由尼康EZ-C1(NikonEZ-C1)软件控制的EclipseC1Plus共焦显微镜(纽约梅尔维尔的尼康公司(Nikon,Melville,NY))获得共聚焦图像。所使用的初级抗体是抗(HBoV1)NS1、NP1和VP1/2抗体，如陈等人(2010)中所报导。
对于在腔式载玻片中培养的感染细胞，如陈等人(2010)中先前所描述进行IF分析。
定量PCR(qPCR)分析
在多个时间点从顶端和底外侧表面收集病毒样品。通过向顶端腔室中添加200mLPBS，在37℃和5％CO2下培育样品10分钟，并且从顶端腔室移除和储存200mLPBS来进行顶端洗涤和收集。随后，从每个底外侧腔室收集50mL培养基。
样品的等分试样(100mL顶端或50mL底外侧)与25个单位的核酸酶(密苏里州圣路易斯的西格马公司(Sigma,StLouis,MO))一起在37℃下培育2小时，并且接着在56℃下用20mL蛋白酶K(15mg/mL)消化10分钟。使用齐安普血液微型试剂盒(QIAampbloodminikit)(凯杰公司)提取病毒DNA，并且在100mL或50mL去离子水中洗脱。通过先前已使用的qPCR方法，相对于HBoV1gc的数目对所提取的DNA进行定量(参见林(Lin)等人,2007)。简单来说，用应用生物系统公司7500快速系统(AppliedBiosystems7500Fastsystem)(加利福尼亚州福斯特市(FosterCity,CA))，使用含有HBoV1序列(nt1-5299)的pskHBoV1质体(陈等人,2010)作为对照(1gc＝5.4610212mg)以建立用于绝对定量的标准曲线。由PrimerExpress(版本2.0.0；应用生物系统公司/生命技术公司)设计扩增引物和PrimeTime双重标记探针并且在IDT公司(IDTInc.)(爱荷华州珊瑚镇(Coralville,Iowa))合成。其序列如下(基因库：JQ411251)：正向引物，5'-GCACAGCCACGTGACGAA-3'(SEQIDNO:1；nt2391到2408)；反向引物，5'-TGGACTCCCTTTTCTTTTGTAGGA-3'(SEQIDNO:2；nt2466到2443)；和PrimeTime探针，5'6FAM-TGAGCTCAGGGAATATGAAAGACAAGCATCG-3'IowaBlackFQ(SEQIDNO:3；nt2411到2441)。根据标准协议，使用PremixExTaq(威斯康星州麦迪逊的宝生物(美国)公司(TakaraBioUSA,Madison,WI))进行qPCR。2.5mL所提取的DNA以25mL反应体积使用。
组织学分析
在感染的最后一天，Millicell插入物上的HAE用PBS洗涤并且固定在4％多聚甲醛中约30分钟。将固定的薄膜切割成若干小片，并且用PBS洗涤三次。将每个薄膜片段转移到15mL圆锥形试管中的20％蔗糖中并且滴到底部；接着将其以允许薄膜垂直于刀片分段的定向垂直嵌入低温保护剂OCT中。以10mm厚度切割低温恒温器切片，置放在载玻片上并且用苏木精(hematoxylin)和曙红(eosin)(H&E公司)染色。用尼康80i荧光显微镜以x60放大率获得图像。
结果
HBoV1基因体的末端发夹通常是博卡病毒属中的发夹。发现在HBoV1感染的HAE中鉴别的HBoV1游离基因体的头端对尾端接合(席尔德格伦(Schildgren)等人,2012；垃斯布林克(Lasebrink)等人,2011)具有两个序列(3'-CGCGCGTA-5'和3'-GATTAG-5')，其与BPV1左端发夹(LEH)的某些部分相同(孙等人,2009；陈等人,1986)。这一结果表明头端序列是HBoV1LEH的一部分。使用头端序列作为反向引物(RHBoV1_LEH)的39末端。LEH的发夹与正向引物(FHBoV1_nt1)(其锚定由BPV1LEH预测的HBoV1基因体的39末端)一起从病毒DNA提取物(1.26108gc/mL)扩增，所述病毒DNA提取物是由从HBoV1感染患者获得的鼻咽分泌物(HBoV1Salvador1分离物)制备(纳西门托-卡瓦略等人,2012)。在约150bp下仅检测到一条特异性DNA带。
这一DNA的测序显示新颖的HBoV1LEH序列。因为原型博卡病毒BPV1和MVC的LEH不对称(孙等人,2009；陈等人,1986)，用位于发夹中的正向引物(FHBoV1_LEH)和靶向nt576处LEH下游的序列的反向引物(RHBoV1_nt576)进行另一个PCR反应。正如约600bp带所料，DNA片段的测序确认存在新颖的接合序列和LEH。
发现HBoV1头端对尾端接合的尾端含有序列(5'-GCGCCTTAGTTATATATAACAT-3'；SEQIDNO:4)，其与另一种原型博卡病毒MVC的右端发夹(REH)的序列相同(孙等人,2009)。因此，推测整个HBoV1REH在结构方面与其MVC对应部分类似。使用靶向这一序列的反向引物(RHBoV1_nt5464)和位于REH上游的正向引物(FHBoV1_nt5201)，扩增特定的约300bp长度的DNA片段。测序证实存在所预测的REH的倒序发夹，并且显示发夹末端处的两个新颖核苷酸。
这些结果表明HBoV1基因体结构通常是博卡病毒属。
全长HBoV1纯系(pIHBoV1)能够在HEK293细胞中复制和产生后代病毒
从患者提取的病毒DNA克隆HBoV1Salvador1分离物i的非结构(NS)和衣壳(VP)蛋白质编码(NSVP)基因并且进行测序。接着，将LEH、NSVP基因和REH接合到pBBSmaI中。分离物的全长基因体的这一序列寄存在基因库(JQ923422)，其以引用的方式并入本文中。
研究腺病毒辅助功能是否是HEK293细胞中的pIHBoV1复制所需要的。具体来说，将pIHBoV1单独或与pHelper一起转染到HEK293细胞(未经处理或用腺病毒感染)中。有趣的是，发现pIHBoV1在不存在辅助病毒的情况下良好复制。实际上，在每种测试情况下并且在类似含量下检测所复制的博卡病毒DNA的所有三种代表性形式(孙等人,2009；罗(Luo)等人,2011)(抗DpnI消化性dRFDNA、mRFDNA和ssDNA)。抗DpnI消化性DNA带是细胞中新近复制的DNA，因为DpnI消化仅使由原核细胞产生的质体DNA裂解，所述质体DNA在dam位点处甲基化(沃赫贝(Wohbe)等人,1985)。相比之下，经pIHBoV1转染的初级呼吸道上皮细胞(NHBE)中不存在病毒基因体的这些DNA形式，并且即使在存在腺病毒的情况下，以极低含量(比经pIHBoV1转染的HEK293细胞中低超过20倍)存在于经pIHBoV1转染的人类呼吸道上皮细胞系BEAS-2B、A549和16HBE14o-中。因此，这些细胞中的复制似乎在这些情形下不存在或不良。
为了确认DNA复制的特异性和DpnI耐受性DNA带的一致性，破坏pIHBoV1中的ORF编码病毒蛋白质NS1、NP1、VP1和VP2；通过西方印迹分析确认对应的病毒蛋白质的表达的基因敲除。当NS1ORF被破坏时，未检测到抗DpnI消化性DNA，证实这一DNA的复制需要NS1。值得注意的是，当NP1ORF被破坏时，检测到RFDNA带，但其极弱，表明还涉及NP1。当敲除VP2ORF时，ssDNA带消失，但当VP1被破坏时并不这样(仍表达VP2)，这些结果符合细小病毒ssDNA基因体的封装中衣壳形成的作用(科特莫尔(Cotmore)等人,2005；郑(Cheng)等人,2009；普莱夫卡(Plevka)等人,2011)。
经pIHBoV1转染的HEK293细胞中存在ssDNA带表明产生后代病毒粒子。进行大规模pIHBoV1转染和CsCl平衡离心以纯化所产生的病毒。部分分离CsCl梯度，并且在1.40mg/mL的密度下发现最高HBoV1gc(1-5×108gc/mL)，其通常是细小病毒粒子。电子显微分析表明经纯化的病毒显示典型的二十面体结构，其直径是约26nm。
总起来说，这些结果证实获得能够在经转染的HEK293细胞中复制和产生后代病毒的HBoV1的全长纯系。
由经pIHBoV1转染的细胞产生的HBoV1后代病毒具有感染性
在极化初始HAE中检验由经pIHBoV1转染的HEK293细胞纯化的HBoV1病毒粒子的感染性，这是已知容许HBoV1感染的体外培养模型(迪克曼等人,2009)。产生B-HAE的三个集合(不同供体，培养批号B29-11、B31-11和B33-11)，并且这些集合用HBoV1从顶端侧面感染。最初，B-HAE培养物用各种量的病毒感染，并且当使用约750gc/细胞的感染倍率(MOI)时，大部分细胞(约80％)在感染后(注射后)第5天对抗NS1染色呈阳性(表明已复制病毒基因体并且表达由其编码的基因)。接着使用这一MOI进行顶端感染。值得注意的是，B29-11、B31-11和B33-11HAE各自支持产生性HBoV1感染。受感染的B31-11HAE在注射后第12天的免疫荧光(IF)分析表明几乎所有细胞皆表达NS1和NP1，并且大部分受感染的细胞表达衣壳蛋白质(VP1/2)。
通过从HAE培养物的顶端和底外侧腔室收集样品并且进行HBoV1特异性定量PCR(qPCR)来每天监测在HBoV1感染之后的后代病毒的产生。在B33-11B-HAE的情况下，顶端释放显然是在注射后第3天开始，接着持续增加在注射后第5-7天达到约108gc/mL的峰值，接着略微降低直到注射后第10天并且保持在约107gc/mL的水平直到注射后第22天。由0.6cm2的一个Millicell插入物在24小时区间内产生的全部病毒大于2×1010gc。这一结果表明初始B-HAE的产生性HBoV1感染是持久性的。值得注意的是，在来自两种供体的B-HAE培养物中，病毒还持续从底外侧释放，始终保持与顶端分泌同步，但水平比来自顶端表面的释放低约一个对数级。将由受感染的B-HAE释放的后代病毒粒子的基因组扩增和测序。结果表明与HBoV1Salvador分离物(基因库JQ923422)的序列相同的序列。另外，未在模拟感染的B-HAE中检测到病毒。
综合起来，这些结果说明由pIHBoV1转染产生的HBoV1病毒粒子能够感染性极化来自来源于多种供体的细胞的初始HAE培养物并且从受感染的初始HAE释放相同的后代病毒粒子。更重要的是，我们发现产生性HBoV1感染是持久性的。
初始B-HAE的HBoV1感染具有呼吸道损伤特征
尽管未在受HBoV1感染的B-HAE中发现毛细胞病变效应，但与受HBoV1感染的上皮细胞(B33-11)对比的模拟物的组织学分析显示形态差异：受感染的BHAE在注射后第7天并不具有显而易见的鞭毛，并且平均起来，与模拟感染物相比在注射后第22天显著更薄。在B-HAE的感染期间监测上皮电阻(TEER)，并且发现在注射后第6天，其从约1,200的值降低到约400Ω.cm2，而模拟感染B-HAE保持初始TEER。值得注意的是，受感染的B-HAE中的TEER降低伴随有HBoV1分泌增加。
为了确认HBoV1感染在破坏上皮的障壁功能中的作用，检验紧密接合蛋白质Zonaoccludens-1(ZO-1)的分布(冈萨雷斯-马里斯卡尔(Gonzalez-Mariscal)等人,2003)。与模拟感染B-HAE相比，受感染的B-HAE在注射后第7天开始展示ZO-1从细胞边缘的解离，其可能起到降低TEER的作用。综合起来，这些结果表明HBoV1感染破坏HAE的完整性并且这可涉及极性破坏和紧密接合蛋白质ZO-1的再分布。为了确认HBoV1感染在鞭毛损失中的作用，我们检验b-微管蛋白IV(其是鞭毛的标记物)的表达(马特罗索维奇(Matrosovich)等人,2004；维勒纳夫(Villenave)等人,2012)。与模拟感染B-HAE相比，在经HBoV1感染的B-HAE中，β-微管蛋白IV的表达在注射后第7天显著降低，并且在注射后第22天未检测到。这些结果证实HBoV1感染引起受感染的B-HAE中鞭毛的损失。值得注意的是，受感染的B-HAE展示细胞核放大的变化，其在注射后第22天变成显而易见，表明呼吸道上皮细胞肥大。
总起来说，发现产生性HBoV1感染破坏紧密接合障壁，引起鞭毛损失和呼吸道上皮细胞肥大。当产生上皮细胞极性损失时，这些是呼吸道损伤的标志。
永生化人类呼吸道上皮细胞系在细胞极化时支持HBoV1感染
尽管初始HAE培养物支持HBoV1感染，但其有效性受到供体之间的可变性、组织可得性和高成本的限制。研究替代性细胞培养物模型支持HBoV1感染的能力。使用纯HBoV1，检验其它细胞在常规单层培养物中支持感染的能力，包括HEK293细胞、其它容许常见呼吸道病毒的常见上皮细胞株(雷纳(Reina)等人,2001)，包括HeLa、MDCK、MRC-5、LLC-MK2和Vero-E6，以及若干经转型或永生化人类呼吸道上皮细胞系(A549、BEAS-2B、16HBE14o-(科曾斯(Cozens)等人,1994)、NuLi-1和CuFi-8(扎布纳等人,2013))，以及初始NHBE细胞。所有细胞对HBoV1感染呈阴性，如通过IF分析确定。推测因为一些呼吸道病毒感染极化HAE但不感染未分化细胞(皮尔克(Pyrc)等人,2010)，极化上皮细胞的一些特征可能对于HBoV1感染是关键的。因此，永生化细胞(NuLi-1和CuFi-8)在空气-液体介面(ALI)处极化一个月。一旦通过检测到TEER>500Ω.cm2确认极化，那么用HBoV1在与用于初始B-HAE培养物相同的条件下感染培养物。值得注意的是，IF分析显示在注射后第10天，经HBoV1感染的CuFi-HAE(从CuFi-8细胞分化)一致地对NS1呈阳性，而经HBoV1感染的NuLi-HAE(从NuLi-1细胞分化)并非如此。此外，CuFi-HAE表达HBoV1NS1、NP1和VP1/VP2蛋白质。来自顶端表面的病毒释放的动力学与受类似效价的病毒感染的初始B-HAE类似(最大26107gc/mL)，但不可检测来自底外侧表面的病毒释放。HBoV1感染还引起上皮厚度降低，以及紧密接合蛋白质ZO-1从上皮细胞边缘解离。
总体来说，这些结果说明永生化细胞系CuFi-8(扎布纳等人,2003)在于ALI中培养和极化时支持HBoV1感染，并且复制在初始HAE中发现的感染表现型，包括破坏呼吸道上皮结构。
说明
克隆全长HBoV1基因体并且鉴别其末端发夹。由这一纯系转染到HEK293细胞中而产生的病毒粒子能够感染性极化HAE培养物。因此，建立反向遗传系统，其克服关键障碍以使用HAE的体外培养模型系统研究HBoV1的分子生物学和发病机理。
值得注意的是，HBoV1末端发夹似乎是LEH处原型博卡病毒BPV1的杂交残余体，但具有REH处的MVC(席尔德格伦等人,2012)。HEK293细胞中HBoV1DNA的复制显示细小病毒DNA的典型复制型中间物。尽管头端-尾端接合在自发性小病毒复制中出人意料，但其可能在滚动发夹依赖性DNA复制的循环期间产生(科特莫尔(Cotmore)等人,1987)。因此，相信HBoV1DNA的复制基本上遵循自发性小病毒的滚动发夹依赖性DNA复制模型，其中分别进行REH和LEH处的末端和接合解析(科特莫尔等人,1987)。细小病毒DNA的复制取决于细胞周期的进入S阶段或是否存在辅助病毒(科特莫尔等人,1987；伯恩斯(Berns)等人,1990)。在这一方面，费解的是，成熟、未受损伤的呼吸道上皮细胞在有丝分裂方面是静态(<1％细胞分裂)(王(Wang)等人,1999；利(Leigh)等人,1995；阿克瑟斯(Axers)等人,1988)，与极化HAE中的大部分细胞相同(在细胞周期的G0阶段中)。然而，重组型腺相关病毒(AAV；在细小病毒科的依赖病毒属中)顶端感染HAE并且表达报导子基因。重组型AAV的基因表达需要将ssDNA病毒基因体转化成能够被转录的双股DNA形式。这一转化涉及DNA合成。因此，假设HBoV1使用类似方法合成其复制形式DNA。值得注意的是，野生型AAV在腺病毒被共感染时顶端感染初始HAE并且复制。HBoV1如何在正常HAE中复制的精确机制将是关于进一步研究的感兴趣的话题。
呼吸道上皮(纤毛伪分层柱状上皮)代表针对吸入微生物的第一障壁并且主动阻止呼吸道病原体进入。其由纤毛细胞、基础细胞和分泌杯状细胞和粘膜免疫系统一起组成，提供用于吸入微生物的粘液纤毛清除的局部防御机制。极化纤毛初始HAE(其由在ALI中生长经分离的气管支气管上皮细胞平均一个月而产生)形成伪分层粘液纤毛上皮并且显示与肺的体内人类软骨呼吸道上皮类似的形态学和表现型特征。最近的研究表明这一模型系统复制呼吸道病毒与其宿主细胞之间的相互作用的重要特征。
在当前研究中，检验从三种不同供体获得的初时B-HAE培养物。初始B-HAE的HBoV1感染是持久性的并且引起上皮细胞的形态变化，即破坏紧密障壁接合、鞭毛损失和上皮细胞肥大。已知前者(密封单层的极化上皮细胞的周边的质膜结构)的缺失课损害维持矢量分泌、吸收和传递所需的细胞障壁。ZO-1(其在这里被监测)有趣与紧密接合相关并且保持这些结构的标准标记物。类似地，鞭毛在呼吸道上皮细胞中起重要作用，在于其驱动粘附于由杯状细胞向外分泌的粘液的吸入粒子。HBoV1感染可损害障壁功能，并且因此潜在地增加呼吸道上皮细胞对过敏原的渗透性和对由微生物引起的二次感染的敏感性。所观察到的病毒从受感染的初始HAE的底外侧表面排出(即使处于较低水平(比顶端表面低约1log))符合HBoV1感染破坏伪分层上皮障壁的极性和引起底外侧腔室泄漏的事实。这一解释还由CuFi-HAE的HBoV1感染支持，其中紧密接合结构的破坏不太重要并且病毒仅从顶端膜释放。由HBoV1引起的泄漏还表明一种机制，其是在受HBoV1感染的患者中发现的病毒血症的原因。其它疾病病理学可由感染引起的呼吸道上皮细胞的鞭毛损失解释，鞭毛不足通常引起细支气管炎。因此，所述资料提供HBoV1是极化HAE的发病因素的直接证据，所述极化HAE充当肺的体外模型。因为通常在因急性哮喘住院的婴儿中检测到HBoV1和其它呼吸道病毒，在经HBoV1感染的HAE中观察到明显的病理学变化，表明先前的HBoV1感染可能促进患者中协同感染驱动发病机理的进程。
来自经pIHBoV1的后代病毒(由临床Salvador1分离物克隆)感染的HAE的顶端腔室的病毒释放的动力学与HBoV1Bonn1分离物(临床样品)造成的感染类似(迪克曼等人,2009)。相信本发明的初始HAE的HBoV1感染的研究再现来自临床样品的病毒的感染。此外，病毒是由pIHBoV1-b纯系产生，所述纯系含有来自原型HBoV1st2分离物的NSVP基因(阿兰德等人,2005)。由这一st2病毒引起的初始B-HAE的感染产生与在本文中使用Salvador1分离物所观察的类似水平的病毒产生。相信用实验室产生的HBoV1Salvador1进行的研究代表HAE中临床样品的HBoV1的感染。当前研究中用于感染的MOI较高。然而，应注意，这一效价是基于病毒粒子的实际数目，因为不存在用于确定HBoV1制剂的感染性效价的可行方法。还应考虑在纯化过程期间，即在CsCl平衡超离心期间发生的大量细小病毒灭活(麦克莱尔(McClare)等人,2011)。HAE的病毒感染最可能反映具有高呼吸道分泌物病毒负载的患者中肺呼吸道的HBoV1感染(亚迪(Jartii)等人,2011)。
pIHBoV1在未分化人类呼吸道上皮细胞中并不良好复制的事实表明HAE的极化和分化对HBoV1DNA复制是关键的。然而，来源于正常人类呼吸道上皮细胞的极化NuLi-HAE不支持HBoV1感染，但来源于从囊肿性纤维化患者分离的呼吸道上皮细胞的CuFi-HAE支持。CuFi-HAE相比于其它HAE的独特之处在于其保持发育上皮细胞的能力，所述上皮细胞由于囊肿性纤维化基因中的突变而在Na+而非Cl2中主动传递(扎布纳等人,2003)。鉴于呼吸道上皮的高复杂度，我们推测HBoV1感染的许可程度取决于病毒感染的多个步骤，例如病毒的连接、进入、细胞内运输和DNA复制。然而，来源于CuFi-8细胞系的极化CuFi-HAE模型代表新颖的稳定细胞培养物模型，其提供关于HBoV1的感染特征的意外发现。尽管CuFi-HAE的HBoV1感染再现障壁紧密接合的破坏，如还在初始B-HAE中所见，底外侧上不存在病毒暗示在HAE中，HBoV1的分泌是顶端极化的。推测这些细胞中较轻度的紧密接合损害可阻止来自受感染的CuFi-HAE的底外侧的病毒释放。其它研究将集中于了解CuFi-HAE对HBoV1感染的许可程度和HAE易于由囊肿性纤维化表现型感染的原因。
已证实HBoV1在患者的上气道中保持可检测状态达数周和数月，甚至达到半年(布莱辛(Blessing)等人,2009；马丁(Martin)等人,2010；布里厄(Brieu)等人,2008；莱赫托兰塔(Lehtoranta)等人,2010)。然而，仍未知支持这一持续性的机制，即其是否归因于持续性复制和排出、在初次感染之后的被动持续或反复出现的粘膜表面污染。本发明的体外HAE培养物中的结果表明HBoV1能够由顶端和底外侧表面复制和排出达至少三周，支持病毒从呼吸道的排出是长期过程的概念。这可进一步说明为何已报导高比率的HBoV1与其它呼吸道病毒之间的共感染或共检测。因为重组型AAV在转导组织中保持呈游离基因体形式，其延长基因表达，还有可能的是，HBoV1基因体可以游离基因体形式呈递以用于长期表达和复制。显而易见的是，潜伏HBoV1感染的这一特征下的机制支持进一步研究。然而，与另一种人类病原性B19V相比，HBoV1似乎并不在人类组织中保持许多年(诺里亚(Norja)等人,2010)。
总之，HBoV1的反向遗传系统模拟体内人类软骨呼吸道上皮细胞的天然HBoV1感染。HBoV1与其它呼吸道病毒的共感染和在肺疾病的病状中的发病机理是未来研究的焦点。
实例2
感染HAE的顶端洗液中的后代HBoV1病毒粒子在极化原发性HAE中是高度感染 性的.
在实例1中，HBoV1病毒粒子由用HBoV1感染性纯系转染的HEK293细胞产生，其进一步浓缩并且经由氯化铯平衡超速离心法纯化。在这一过程期间，出现显著病毒失活(麦克卢尔(McClure)等人,2011)，并且病毒的精确感染性难以测定。然而，后代病毒粒子在高效价(约1.0×107vgc/μL)下从感染HAE的顶端表面持久分泌(黄等人,2012)。因此，假设从顶端表面洗涤的后代病毒粒子模拟来自HBoV1感染肺呼吸道的自然分泌病毒粒子并且因此是高度传染性的。
为了测试这一假设，从爱荷华大学的基因治疗中心的组织和细胞培养核心(TissueandCellCultureCoreoftheCenterforGeneTherapy,UniversityofIowa)在0.6cm2的MillicellTM插入物(密理博)中获得极化原发性HAE培养物。这些培养物通过使分离人类呼吸道(气管支气管)上皮细胞在ALI生长制得，如先前所述(卡普等人,2002；颜等人,2004；扎布纳等人,1996)。插入物保持在具有1mLALI培养基的6孔组织培养板的孔中。从纯化HBoV1感染原发性HAE培养物的顶端洗液(黄等人,2012)收集的HBoV1后代病毒粒子的感染在来自顶端表面的在介于100到0.001vgc/细胞的MOI下的原发性HAE培养物中分析。将稀释于150μLALI培养基中的HBoV1病毒粒子(黄等人,2012)施用到顶端腔室。HAE培养物在37℃和5％CO2下培育2小时。在移除接种物并且用0.4mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤顶端表面三次之后，使培养物返回到培育箱中。通过从HAE培养物的顶端和基底外侧腔室收集样品来每日监测顶端感染后后代病毒粒子的产生。值得注意地，HBoV1病毒粒子从所有这些接种的HAE培养物释放。然而，病毒分泌到峰值的时间在较低MOI下较长。对于100、10、1、0.1、0.01以及0.001vgc/细胞的MOI，这些时间分别是感染后(p.i.)6、9、12、15、23以及24天。尽管在峰值下释放病毒粒子的产率连同降低MOI一起略微降低，但在100-0.1vgc/细胞的MOI下感染中始终检测到约108vgc/μL的产率，并且在0.01和0.001vgc/细胞的MOI下检测到约107vgc/μL的产率。模拟感染的HAE不具有从两个表面的病毒释放(不可通过定量PCR检测)。这些结果表明HBoV1在HAE中缓慢或持久复制。
接着，在多种MOI下感染过程期间监测上皮电阻(TEER)。感染HAE培养物的所有TEER随着与输入MOI相关的降低的开始(对于100、10、1、0.1、0.01以及0.001vgc/细胞的MOI分别在p.i.3、5、7、7、9、11天)大幅度降低。在一定程度上，TEER的下降曲线与病毒释放的增加倾向相关。然而，所有接种的HAE培养物的最终TEER到感染结束时下降到小于400Ω·cm2的值，与模拟感染的HAE相比的约2-3倍降低。也组织学上观察到呼吸道上皮的破坏。与模拟感染的HAE相比，在感染结束时展示为上皮厚度和纤毛存在的呼吸道上皮损坏程度与输入病毒的MOI相关。值得注意地，用100vgc/细胞的MOI接种的HAE展示进行性组织学变化。在p.i.12天，用100vgc/细胞的MOI接种的HAE的修平类似于在p.i.26-28天针对用0.1到0.001vgc/细胞的MOI接种的HAE观察到的修平。此外，由HBoV1感染所引起的上皮损伤经以下分析证实：1)共检测HBoV1NS1与显著降低的β-微管蛋白IV(纤毛的标记物(马特罗索维奇等人,2004；维勒纳夫等人,2010))，其在100-0.1vgc/细胞的MOI下在感染HAE中不存在并且在0.01和0.001vgc/细胞的MOI下极低；2)紧密连接蛋白闭锁小带-1(ZO-1)(11)的分解；以及3)在晚感染时的核增大。感染后早期，NS1表达细胞主要几乎不或不含有β-微管蛋白IV并且具有离解ZO-1染色(MOI＝100vgc/细胞，p.i.5天)，表明病毒最初感染非纤毛细胞或纤毛在病毒复制过程中较早排出。
总体上表明从ALI顶端表面洗涤的分泌后代HBoV1病毒粒子在极化原发性HAE中是高度感染性的并且甚至在低到0.001vgc/细胞的MOI下引起感染假复层呼吸道上皮的严重损伤。
HBoV1能够从基底外侧表面感染极化原发性HAE.
原发性HAE的HBoV1顶端感染是持久性的并且所述后代病毒粒子从顶端和基底外侧表面分泌(实例1)。然而，HBoV1是否从基底外侧表面感染原发性HAE仍然是难以捉摸的。为了解决这一问题，未处理原发性HAE基底外侧用顶端洗涤HBoV1病毒粒子接种，如上文在1vgc/细胞的MOI下所使用。
关于基底外侧感染，将HBoV1病毒粒子稀释于1mLALI培养基中HAE培养物的基底外侧腔室中。培养物在37℃和5％CO2下培育2小时。接着移除基底外侧接种物并且用1mLPBS洗涤两次。在添加新培养基之后，使培养物返回到培育箱中。通过从顶端和基底外侧腔室收集样品来每日监测基底外侧接种之后后代病毒粒子的产生。在基底外侧接种之后，缓慢增加顶端病毒分泌，但在p.i.16天到约5×107vgc/μL的峰值。在整个感染过程中病毒粒子释放维持在超过106vgc/μL的水平下。在基底外侧接种之后也从基底外侧表面释放后代病毒粒子，但在感染过程内在比顶端表面小约1个对数的水平下，其与在顶端感染之后所观察到的类似。这一结果表明从基底外侧表面HBoV1感染HAE也是持久产生性的，与在顶端感染之后观察到的类似。
还在基底外侧感染期间监测TEER。虽然模拟感染的HAE培养物的TEER在实验阶段期间始终在约1000Ω·cm2的水平下，基底外侧接种的HAE的TEER逐渐下降并且在p.i.15天到约400Ω·cm2的值，在顶端接种的HAE(MOI＝1)中略微较早(p.i.13天)可见。这一结果符合病毒释放动力学，指示HBoV1感染破坏上皮障壁。基底外侧接种的HAE展示与在模拟感染的HAE中相比的紧密连接的明显离解。
在感染结束时，在p.i.22天，进行基底外侧接种的HAE的组织学分析。相比于模拟对照，感染HAE展示不存在纤毛和明显更薄上皮。这一观察结果通过不存在β-微管蛋白IV表达进一步确认。感染HAE还展示在晚期感染时的细胞核增大(DAPI)。
综合来说，这些结果表明HBoV1能够从基底外侧表面感染性极化原发性HAE。其还展示基底外侧感染是持久产生性的，引起纤毛损失，并且最终破坏上皮的紧密连接障壁。然而，与顶端HBoV1感染相比，基底外侧感染较不有效，表明HBoV1感染具有更强顶端向性。基底外侧感染表明HBoV1病毒血症(坎多拉等人,2008；纳西门托-卡瓦略等人,2012)可促进遍及患者中的肺呼吸道的病毒感染。
总的来说，这项研究展示HBoV1在顶端和基底外侧表面在低MOI下生产性感染极化原发性HAE。成熟和未受损伤的呼吸道上皮在有丝分裂上静止(<1％的细胞分裂)(艾尔斯等人,1988；利等人,1995；王等人,1999)。
实例3
材料和方法
质粒.pIHBoV1是含有5543bp全长HBoV1基因组的感染性纯系质粒(黄等人,2012)。prHBoV1-CBAluc是衍生自pIHBoV1的重组HBoV1(rHBoV1)转移质粒并且通过用含有CMV强化子/鸡β-肌动蛋白启动子驱动荧光素酶基因的2.74kb片段代替HBoV1基因组的2.64kbHindIII/BglII片段构筑。在所得prHBoV1-CBAluc质粒中完全移除在HBoV1DNA复制中发挥必需作用的NP1基因。为了降低经由重组的救援野生型病毒的机率，5'保持NS基因编码区通过使用平接消除BspE1位点进一步破坏，并且3'VP部分编码区通过使145bpPstI移到EcoRI片段进一步缺失。辅助质粒pHBoV1KUm630具有5299bpHBoV1基因组(99到5395-nt)而无末端重复(陈等人,2010)，其中P5启动子和3'polyA信号保留以用于病毒基因的表达。pAV-Rep2和pAD4.1是支持rAAV2基因组救援和从如先前所述的293细胞中的原病毒质粒复制的辅助质粒。pAV2-F5tg83luc是rAAV2顺式转移质粒，含有具有180bp合成启动子驱动萤火虫荧光素酶基因的4.85kbrAAV原病毒基因组。pAV2-CF5tg83luc是pAV2-F5tg83luc的较长形式，并且通过插入180bp合成启动子上游的600bp填充序列以产生长度是5.4kb的rAAV2原病毒基因组衍生。pAV2-CBAhCFTR具有尺寸过大的5.5kbrAAV2原病毒基因组，所述基因组含有具有580bpCMVIE强化子加β-肌动蛋白启动子(CBA启动子)的人类CFTR表达卡匣、50bp合成polyA信号以及含有56bp5'UTR和45bp3'UTR的4443bp人类CFTRcDNA。
重组病毒产生.rAAV载体、rAAV2/2.F5tg83luc以及AV2/1.F5tg83luc通过三重质粒共转染使用无腺病毒系统在HEK293细胞中产生，如颜等人(2006)中所描述；这一系统使用分别在2:3:1的比率下转染的rAAV反式辅助质粒pAVRC2.3、腺病毒辅助质粒pADHelper4.1、以及rAAV2原病毒质粒pAV2-F5tg83luc。rHBoV1载体原液(HBc.CBAluc)通过分别以3:1的比率将辅助pHBoV1KUm630和原病毒质粒prHBoV1-CBAluc共转染到HEK293细胞中产生。嵌合rAAV2/HBoV1载体通过在分别以1.5:3:3:1的比率将pAV-Rep2、pAd4.1、pHBoV1KUm630与rAAV顺式原病毒质粒一起共转染到HEK293细胞中之后假型化HBoV1衣壳内的rAAV基因组产生。用于嵌合载体生产的rAAV原病毒质粒是pAV2-F5tg83luc(4.8kb)、pAV2-CF5tg83luc(5.4kb)以及pAV2-CBAhCFTR(5.5kb)。在转染后72小时从细胞团回收所有病毒并且如颜等人(2013)中所描述如针对rAAV载体生产处理细胞粗裂解物。在DNaseI消化之后，通过两轮CsCl超速离心来纯化所有病毒并且用PBS透析。作为DNaseI耐受性粒子(DRP)的病毒制剂的效价通过TaqMan实时定量PCR测定并且用狭线印迹分析使用针对荧光素酶基因的32P标记的探针确认(颜等人,2013)。
西方印迹法.通过10％SDS-PAGE解析5×109DRP的rAAV2和嵌合rAAV2/HBoV1。在转移到硝化纤维膜之后，对小鼠抗AAV衣壳单克隆抗体B1(1:1000)和大鼠抗HBoV1VP2抗血清(识别VP1和VP2蛋白质)(陈等人,2010)(1:200)进行双色西方印记法。红外检测使用1:10,000稀释度的二级抗体山羊抗小鼠-IRDye700(对于AAV红色)和山羊抗大鼠-IRDye800(对于HBoV1绿色)。图像接着使用奥德赛红外线图像系统(OdysseyInfraredImageSystem)扫描。
细胞培养和病毒感染条件.HEK293和IB3细胞作为单层在补充有10％胎牛血清和青霉素-链霉素的杜贝克改良伊格尔培养基(DMEM)中培养，并且维持在37℃培育箱中5％CO2下。未分化永生化CF人类呼吸道细胞(CuFi8)作为单层在支气管上皮细胞生长培养基(BEGM，龙沙)中培养(扎布纳等人,2003)。极化原发性人类呼吸道上皮如先前描述从肺移植呼吸道组织(颜等人,2004；卡普等人,2002)产生并且获自爱荷华大学的基因治疗中心的组织和细胞培养核心。上皮在12mmMillicell膜插入物(密理博)上生长并且用2％USG培养基在空气-液体界面处分化，随后使用。使用与原发性HAE类似的条件进行CuFi8细胞在ALI的极化。为了顶端感染极化呼吸道上皮，将1×1010DRP的病毒稀释于USG培养基中到50μl的最终体积并且施用到Millicell插入物的上部腔室。关于基底外侧感染，将1×1010DRP的病毒直接添加到培养基中底部腔室中。病毒通常暴露于上皮16小时并且接着移除。此时，Millicell插入物用少量USG培养基简单洗涤并且仅在底部腔室中供应有新USG培养基。大约1-2×106个细胞在每一Millicell插入物中并且因此感染倍率(MOI)估计是约5,000到10,000DRP/细胞。通过荧光素酶报导子分析在感染后的多个时间点使用细胞裂解物或IVIS生物光子成像评估转导。
测量荧光素酶报导子表达.使用荧光素酶分析系统(普洛麦格)在配备有自动注射器(特纳生物系统(TurnerBiosystems))的20/20光度计中测定在细胞裂解物中的荧光素酶酶活性。使用IVIS生物光子成像系统根据制造商的说明书进行活细胞中的荧光素酶活性的定量。在仅添加VivoGlo荧光素底物(普洛麦格)到基底外侧培养基之后15分钟采集图像，并且用生动图像(LivingImage)2.51软件(赛诺金公司)处理图像的定量。
分析内化病毒基因组.完全分化的人类极化呼吸道上皮感染有rAAV或嵌合rAAV/HBoV1载体的1×1010个粒子。在4小时感染阶段之后，移除病毒，并且用PBS充分洗涤上皮。Millicell插入物接着在底部腔室中供应有新培养基并且放于37℃培育箱中18小时。在收集细胞用于所有病毒内化分析之前，用40mLPBS在50mL圆锥形管中充分洗涤Millicell插入物三次。细胞接着通过胰蛋白酶消化从Millicell插入物的负载膜剥离。细胞团接着用1mLPBS再洗涤三次，随后进行亚细胞分离和病毒基因组定量。在4℃下利用病毒结合1小时的对照实验展现使用这一洗涤和胰蛋白酶消化方法从细胞表面移除>98％病毒(数据未展示)。核用核EZpre试剂盒(西格玛)如陈等人(2011)中所描述分离。在核制备期间合并细胞质部分并且1/10在斯匹德瓦克(SpeedVac)中干燥。将核团粒和干燥细胞质部分溶解于50μL消化缓冲液(50mMKCl、2.5mMMgCl2、10mMTrispH8.0、0.5％NP40、0.5％吐温-20以及400μg/ml蛋白酶K)中。在56℃下消化45分钟并且在95℃下热失活15分钟之后，0.1μL细胞核和1μL细胞质消化物用于塔克曼PCR以定量病毒基因组。当在CuFiALI培养物，非极化CuFi和HEK293细胞单层中进行总病毒内化分析时，使用相同洗涤和胰蛋白酶消化程序来移除细胞表面结合病毒粒子。然而，洗涤的细胞团直接用以上消化缓冲液溶解并且用于病毒基因组定量。
通过塔克曼PCR定量分析rAAV基因组.使用塔克曼实时PCR来定量病毒原液的物理效价和来自AAV感染细胞的细胞裂解物中的病毒基因组的拷贝，如颜等人(2006)中所描述。使用的PCR引物是5'-TTTTTGAAGCGAAGGTTGTGG-3'(SEQIDNO:6)(正向)和5'-CACACACAGTTCGCCTCTTTG-3'(SEQIDNO:7)(反向)并且扩增rAAV2.Luc基因组的73bp片段。由IDT(爱荷华州科拉尔维尔(Coralville,IA))合成塔克曼探针(5'-ATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAAT-3')(SEQIDNO:8)。这一探针在5'端处用6-羧基荧光素(FAM)标记作为报导子并且在3'端处用黑洞淬灭剂1(DarkHoleQuencher1，BHQ1)标记作为淬灭剂。进行PCR反应并且使用拜耳雷德MyIQTM实时PCR检测系统和软件分析。
短路电流测量.使用上皮电压线箍(型号EC-825)和自身所含的Ussing腔室系统(都购自康涅狄格州哈姆登的华纳仪器公司(WarnerInstruments,Inc.,Hamden,CT))如林等人(2007)中所描述测量上皮短路电流(Isc)。在整个实验中，腔室保持在37℃下，并且将腔室溶液充气。腔室的基底外侧填充有含有135mMNaCl、1.2mMCaCl2、1.2毫米MgCl2、2.4mMKH2PO4、0.2mMK2HPO4以及5mMHepes，pH7.4的缓冲林格氏溶液。腔室的顶端侧填充有低氯离子林格氏溶液，其中135mM葡糖酸纳替代NaCl。使用多通道电压/电流线箍(生理仪器(PhysiologicInstruments))用快速数据采集(QuickDataAcq)软件在每5秒电流脉冲下将VCCMC8上皮电压钳制在0，以记录短路电流。将以下化学物质依次添加到顶端腔室中：(1)氨氯吡脒(100μM)以便抑制通过ENaC的上皮钠传导；(2)4,4'-二异硫氰基-芪-2,2'-二磺酸(DIDS)(100μM)以抑制非CFTR氯离子通道；(3)cAMP促效剂弗斯可林(10μM)/3-异丁基-l-甲基黃嘌呤(IBMX)(100μM)以活化CFTR氯离子通道；以及(4)10μMCFTRinh-GlyH-101(N-(2-萘基)-[(3,5-二溴-2,4-二羟苯基)亚甲基]甘氨酸酰肼)以经由CFTR阻断Cl-分泌。通过在每一实验条件(化学刺激)之前及之后历经45秒取平线区测量平均值的差来进行ΔIsc计算。
CFTR免疫染色.在短路电流测量之后，从Millicell插入物中切出负载膜上的HAE并且嵌入在OCT培养基中。将10μm冷冻切片固定在4％多聚甲醛中随后阻断并且使用由相等量(在1:200稀释度下)的三种小鼠抗CFTR抗体(纯系MM13-4(密理博)、纯系M3A7(密理博)以及纯系13-1(研发系统(R&Dsystem)))组成的抗CFTR抗体混合液免疫荧光染色并且最后与驴抗小鼠FITC标记的二级抗体一起培育。
结果
产生重组HBoV1(rHBoV1)载体和其在HAE模型系统中的转导特性.全长HBoV1基因组的质粒纯系(pIHBoV1)可用于在HEK293细胞中转染之后在不需要辅助病毒功能的情况下产生感染性HBoV1病毒粒子(黄等人,2012)首先尝试通过测试HBoV1病毒蛋白质是否可能反式互补并且救援HEK293细胞中rHBoV1基因组的复制和封装来产生rHBoV1。发现于感染性质粒(pIHBoV1)、rHBoV1原病毒质粒(prHBoV1-CBAluc)以及反式辅助质粒(pHBoV1KUm630)中的野生型HBoV1基因组的结构示意性地展示于图1A中。prHBoV1-CBAluc含有编码CBA启动子驱动荧光素酶基因的5.5kbrHBoV1原病毒基因组。pHBoV1KUm630支持rHBoV1基因组救援和从prHBoV1-CBAluc复制的能力通过将这些质粒共转染到HEK293细胞中确认。从经转染的细胞提取的HirtDNA在DpnI消化之后通过南方印迹法评估以消除甲基化质粒背景信号。如图1B中所示，rHBoV1复制中间物仅在用prHBoV1-CBALuc和pHBoV1KUm630，而非仅用prHBoV1-CBALuc共转染的细胞中观察到。尽管来自共转染的所检测复制中间物低于来自野生型HBoV1原病毒质粒pIHBoV1的水平，我们推断pHBoV1KUm630质粒的确以反式提供必需辅助功能来支持rHBoV1基因组复制(图1C)。为了产生重组病毒，将prHBoV1-CBAluc和pHBoV1KUm630共转染到HEK293中随后用CsCl平衡超速离心法从细胞裂解物纯化。来自这一梯度的洗脱份通过塔克曼PCR针对病毒基因组评估并且展现在1.45到1.40g/mL的密度下的峰(图1C)，表明病毒DNA的成功衣壳化。三十个150mm板的病毒产率产生总共1.25×1011个rHBoV1基因组拷贝(vc)或DNA酶I耐受性粒子(DRP)。这是由在HEK293细胞(每十个150mm盘约2×1011个DRP)中转染pIHBoV1获得的野生型HBoV1的产率的大约20％(黄等人,2012)。
在感染HEK293细胞、IB3细胞(CF人类呼吸道细胞系)、CuFi8细胞(条件性转型CF呼吸道细胞系(扎布纳等人,2003))的单层以及衍生自CuFi细胞和原发性人类呼吸道上皮细胞(图1D)的ALI培养物之后接着评估两次CsCl分带的rHBoV1CBAluc的转导特性。结果展现rHBoV1.CBAluc仅能够转导(即，表达其编码转基因)衍生自原发性或CuFi呼吸道细胞的极化和分化ALI培养物。这些发现类似于用野生型HBoV1产生性感染所需的条件(黄等人,2012)。在用rHBoV1.CBAluc顶端感染极化HAE之后，最大转基因表达出现在感染后3天并且在感染后11天逐渐下降(图1E)。
经由跨属小病毒假型化使HBoV1病毒粒子中的重组AAV2基因组衣壳化.尽管野生型HBoV1和rHBoV1病毒粒子可在质粒转染之后在HEK293细胞中组装，但病毒产率相对较低。相比之下，rAAV载体复制在具有适当辅助质粒的HEK293中极有效。我们推断支持HBoV1复制的HEK293细胞机制可能较不有效因为HEK293细胞不是用于HBoV1产生性感染的生物受纳细胞系。因此，探索具有HBoV1衣壳的假型化rAAV2基因组是否将产生在这些细胞中具有较高产率的rAAV2/HBoV1嵌合载体。使用这一方法，在用pAD4.1(编码所有必需辅助功能以便AAV从腺病毒复制)、pAV-Rep2(编码AAV2Rep基因)以及pHBoV1KUm630(编码HBoV1衣壳和NS基因)共转染之后，将来自顺式rAAV原病毒质粒(pAV2-F5tg83luc)的4.85kbrAAV基因组成功地封装到HBoV1病毒粒子中。存在若干使用表达所有HBoV1病毒蛋白以支持rAAV2基因组的衣壳化的辅助质粒的原因。第一，支持封装所需的HBoV1基因的暂时调节和转录概况仍然未知。第二，HBoV1NS和NP1蛋白质在衣壳组装中的功能作用不清楚。最后，有可能NS蛋白质与AAV2ITR相关并且这可能潜在地帮助促进AAV2基因组封装到HBoV1衣壳中。在共转染之后三天，大量DNaseI-耐受性病毒粒子从粗裂解物通过CsCl分带(图2A)回收。从转染混合液省略pAV-Rep2未能产生DNaseI耐受性病毒粒子。值得注意的，嵌合rAAV2/HBoV1病毒粒子的密度是约1.435g/mL，类似于rHBoV1病毒粒子(图1A)。这一密度比rAAV2/2病毒粒子的1.414g/ml密度略微较重(图1A)。当在类似规模上产生时嵌合rAAV/HBoV1载体的典型产率比rAAV2载体小10到20倍，但比rHBoV1载体大2到4倍。相比之下，rAAV基因组伪封装到人类小病毒B19衣壳中比我们针对rAAV2/HBoV1观察到的较不有效得多(彭纳扎刚等人,1998)。
检查rAAV2基因组救援和复制展现rAAV2从rAAV2/HBoV1生产系统中的DNA(RFDNA)复制与rAAV2生产期间的相比约2到3倍较不丰富(图2B，比较泳道2和4)。这符合描述小病毒衣壳在病毒粒子形成中发挥反馈作用的先前报告(郑等人,2010；黄等人,2012)。支持这点，观察到与在共转染pAV2.F5tg83luc和AAV2Rep-Cap辅助质粒pAVRC2.3(图2B，泳道2)之后相比，在共转染AAV2原病毒质粒(pAV2.F5tg83luc和pAV2.CF5tg83luc)和pAV2-Rep辅助子(遗失完整AAV衣壳基因)(图2B，泳道1和泳道3)之后存在较少rAAV2RFDNA。值得注意的是，HBoV1病毒蛋白质的表达似乎不干扰rAAV2基因组救援和复制(图2B，比较泳道4与泳道1或3)。透射电子显微法(EM)展现rAAV2/HBoV1病毒粒子具有直径是26nM的典型小病毒二十面体结构(图2C)，其类似于野生型HBoV1病毒粒子(黄等人,2012)。通过EM病毒粒子的内部的密度还表明>99％的病毒粒子完全封装有DNA。通过西方印迹法用抗HBoV1VP2抗血清检查嵌合rAAV2/HBoV1病毒粒子展现存在HBoV1VP1和VP2蛋白质，但使用抗AAV2衣壳单克隆抗体B1在rAAV/HBoV1原液中未检测到AAV2VP蛋白质(图2D)。
表征rAAV2/HBoV1病毒粒子的病毒基因组极性和能力.野生型AAV2与HBoV1病毒粒子之间的一个显著差异是封装基因组的极性——约50％的AAV病毒粒子含有正DNA股，而另一半含有负DNA股，而HBoV1超过90％的时间选择性衣壳化负DNA股(席尔德格伦等人,2012)。HBoV1的两个末端倒序序列不对称(尺寸、一级序列以及预测结构不同(黄等人,2012))，而对于AAV，末端倒序序列是相同反相重复。小病毒基因组中的末端序列对于形成多联双螺旋复制中间物和切除单股后代基因组用于封装是重要的(科特莫尔等人,1996)。鉴于rAAV2/HBoV1载体基因组在其基因组末端具有相同反相重复，假设rAAV2/HBoV1将采纳正股和负股的未偏倚封装。实际上的确如此。针对荧光素酶转基因使用正义和反义探针，rAAV2/HBoV1病毒粒子DNA展现大约相等比例的正股和负股，而rHBoV1载体DNA展现封装负股的偏好(约87％)。这些差异可能部分造成在rAAV2/HBoV1产生中与rHBoV1相比的2-3倍高的产率。
AAV与HBoV1基因组之间的第二个主要差异是其尺寸——AAV基因组长度是4679nt，而HBoV1长度是5543nt。rAAV载体的封装能力已经充分研究并且具有4.9到5.0kb的限制(董(Dong)等人,1996；瓦(Wa)等人,2010)。这是通过rAAV传递CFTR基因的显著障碍，并且可潜在地用rAAV2/HBoV1载体克服。因此，假设rAAV2/HBoV1粒子可凭借其封装高达5.5kb的尺寸过大的rAAV基因组的能力提供用于CFTR传递的显著优势，如在rHBoV1的情况下所观察(图1D)。为了探索这一可能性，用长度相差600bp的相同荧光素酶表达卡匣(4.8kb的pAV2/HBc.F5tg83Luc和5.4kb的pAV2/HBc.CF5tg83Luc)产生两个rAAV原病毒基因组。这些原病毒质粒中的每一个用于产生rAAV2/2(4.8kb)和/或rAAV2/HBoV1(4.8和5.4kb)病毒，并且通过碱性变性琼脂糖凝胶电泳随后南方印迹法分析评估病毒DNA。5.4kbrAAV2HBoV1的病毒产率类似于4.8kbrAAV2/HBoV1。病毒DNA的南方印迹法分析仅显示无明显截断形式的合适尺寸的基因组(图3B)。这些发现表明HBoV1假型化精确处理并且封装短和长rAAV基因组而不改变基因组完整性。
病毒基因组重组在许多病毒的进化中发挥重要作用，并且股重组也在单股病毒复制期间出现(马丁等人,2011)。肠人类博卡病毒感染还与高水平的病毒基因组重组相关(卡普尔等人,2010)。评估是否辅助子与原病毒质粒之间的重组产物被封装到rHBoV1和rAAV2/HBoV1病毒粒子中。使用荧光素酶转基因探针和HBoV1辅助子特异性病毒探针(即，HindIII/BglII2.64kb片段经rHBoV1载体中的荧光素酶卡匣替换)进行来自纯化rAAV2/HBoV1rHBoV1的病毒基因组的狭缝印迹分析。这一分析的结果展现纯化rHBoV1原液中的17％病毒基因组含有仅在辅助质粒中发现的HBoV1序列(图3C)。包括侧接rHBoV1.CBAluc基因组中的荧光素酶卡匣的1.4kb和1.1kbHBoV1基因组片段是这些重组事件的最可能的原因。尽管NS和VP蛋白质编码结构域在rHBoV1.CBAluc基因组中突变(图1A)，如果重组在双交换事件中出现在这些突变之外，那么复制胜任型rHBoV1基因组将预期在rHBoV1病毒原液中。复制胜任型病毒的存在可能是rHBoV1感染的HAEALI培养物的转基因表达的时间依赖性下降(图1E)的原因中的一个。相比于rHBoV1，HBoV1辅助基因组在纯化rAAV2/HBoV1病毒中未检测到，如所预期，因为原病毒与辅助质粒之间不存在序列同源性。因此，用于rHBoV1的封装策略的进一步发展需要消除产生复制胜任型HBoV1(即,NS和VP基因在单独辅助质粒上表达和用于在原病毒基因组中封装的最少顺式元件)机率。然而，将需要调节NS/VP病毒基因和HBoV1基因组封装的改良知识，随后可应用在产生rAAV中消除复制胜任型病毒的类似策略。
嵌合rAAV2/HBoV1载体介导从人类极化呼吸道上皮的顶端而非基底外侧膜的高度 有效转导.接着检查rAAV2/HBoV1嵌合载体的转导特征。编码荧光素酶转基因的rAAV2/HBoV1载体在甚至高MOI(50,000DRP/细胞)下未能转导HEK293细胞，而类似rAAV2/2载体在低得多的MOI(2,500DRP/细胞)下有效地表达荧光素酶(图4A)。在原发性HAE和CuFiALI培养物中的实验确认AV2/HBc.F5tg83luc(4.8kb基因组)和AV2/HBc.CF5tg83luc(5.4kb基因组)在顶端感染之后产生类似水平的荧光素酶表达(数据未展示)，表明在这一范围内的载体尺寸不影响转导。接着将rAAV2/HBoV1的转导与rAAV载体在相同感染条件下的转导相比。这一直接比较仅在AV2/HBc.F5tg83luc、AV2/1.F5tg83luc以及AV2/2.F5tg83luc(具有衍生自pAV2-F5tg83luc的相同原病毒基因组)的情况下是可能的，因为pAV2-CF5tg83luc基因组(5.4kb)太大以致于不能封装到AAV衣壳中。在用AV2/HBc.F5tg83luc和AV2/2.F5tg83luc顶端和基底外侧感染之后原发性HAE的转导模式惊人地不同(图4B)。如先前所观察，rAAV2/2以强基底外侧偏好转导HAE(颜等人,2006；颜等人,2004)——在顶端感染之后的荧光素酶表达比在基底外侧感染之后低210倍(图4B)。相比之下，与基底外侧感染相比，rAAV2/HBoV1展现在原发性HAE的顶端感染之后的206倍更大水平的转导(图4B)。重要地，在用AV2/HBc.F5tg83luc顶端感染之后获得的转基因表达水平比AV2/2.F5tg83luc大70倍，并且比AV2/1.F5tg83luc大5.6倍。如先前所展现，rAAV2/1缺乏用于在极化HAE中转导的极性偏倚，并且具有与rAAV2相比更好的顶端转导功效(颜等人,2006)。
因为HBoV1是近期发现的病毒，几乎不知道关于在HAE中的HBoV1-细胞相互作用。野生型HBoV1可在低到0.001DRP/细胞的MOI下感染HAE(邓等人,2013)，表明病毒从HAE的顶端表面进入是非常有效的。然而，随着病毒复制的增加的变数，HBoV1内化和细胞内运输到核的效率难以直接评估。复制缺陷性rAAV2/HBoV1嵌合病毒的产生提供直接评估这些过程并且进一步比较在rAAV载体的转导中这些步骤的效率的机会。为这个目的，在顶端感染之后18小时，在HAE的原发性ALI培养物中比较病毒粒子吸收和病毒基因组分布。作为对照，我们包括两个rAAV假型化载体rAAV2/1(AV2/1.CMVluc)和rAAV2/2(AV2/2.CMVluc)，已知其以不同功效从顶端膜转导HAE(颜等人,2006)。rAAV1迄今已展示为用于HAE转导的最有效AAV血清型中的一个，在顶端感染之后具有较多病毒粒子吸收和较快细胞核易位(颜等人,2013；颜等人,2006)。另外，评估含有相同病毒基因组的AV2/HBc.F5tg83luc和AV2/2.F5tg83luc病毒。这些比较的结果展现AV2/1.CMVluc和AV2/HBc.F5tg83luc分别展示与rAAV2/2载体(AV2/2.CMVluc和AV2/2.F5tg83luc)相比的约14倍和约32倍更多的从原发性HAE的顶端膜的病毒吸收(图4C)。AV2/HBc.F5tg83luc病毒吸收与AV2/1.CMVluc相比也2.3倍更有效(P＝0.026)。此外，rAAV2/HBoV1到核中的进入后处理似乎比rAAV2/2更快，与rAAV2/2的约7％相比，在感染后18小时，在细胞核部分中检测到约15％的内化AV2/HBc.F5tg83luc基因组(图4C和D)。有趣的是，对于rAAV2/1(86.4/13.6％)和rAAV2/HBoV1(85.0/15.0％)，病毒基因组的细胞质/细胞核分布类似(图4C和D)。相比于测试的两种rAAV血清型，rAAV2/HBoV1不佳地从基底外侧膜转导HAE(图4B)。总的来说，这些发现表明在原发性分化HAE的顶端感染之后rAAV2/HBoV1病毒吸收和细胞核易位高度有效。
在感染阶段期间调节蛋白酶体活性在用rAAV2/HBoV1顶端感染之后极大地增强转 导.尽管rAAV2/HBoV1在HAEALI中顶端感染之后展示高转导功效，大多数(85％)的内化rAAV2/HBoV1病毒粒子在感染后18小时保留在细胞质中。这表明对于HBoV1，也可存在如针对HAE的rAAV2和rAAV1转导所观察(段等人,2000；段等人,1998)的限制病毒的有效细胞核传递的细胞内障壁。因此，rAAV2/HBoV1的转导功效可进一步通过克服这些障碍来改良。减弱的内体处理/细胞内运输是限制顶端感染之后极化HAE的rAAV载体转导的主要障碍中的一个。这一障碍可通过在感染时或在感染之后的某一阶段内施用蛋白酶体抑制剂部分克服(段等人,2000；张等人,2008；颜等人,2004)。这些研究表明三肽基醛N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL)和蒽环霉素衍生物多柔比星(Dox)可增强rAAV2、rAAV5以及rAAV1病毒处理和易位到核，产生较高水平的转导。这两种独特类别的蛋白酶体活性调节剂的组合投药可在原发性HAE的顶端rAAV2/2感染之后诱导超过1000倍的转导(颜等人,2006；颜等人,2004)。尽管在一级序列层级下在HBoV1与AAV2衣壳蛋白之间存在显著差异，这两种病毒保留一些保存性核衣壳序列并且还与其它小病毒粒子共享类似表面二十面体布局(瓜达等人,2010)。因此，假设用蛋白酶体抑制剂的处理还可增强HAE通过rAAV2/HBoV1的转导，并且力图研究在存在和不存在LLnL和Dox下rAAV2/2与rAAV2/HBoV1之间的转导的动力学。比较rAAV2/2与rAAV2/HBoV1的结果(图5A和B)展现在感染后3-7天之间转基因表达的类似增加，伴随在感染后7-11天的平线区。对于两种载体，在感染时用蛋白酶体抑制剂处理增强在所有时间点下的大于1000倍的转导，并且在第11天阶段不存在转基因表达减少。这些发现表明rAAV2/HBoV1共有与如在大部分其它rAAV血清型下观察到的转导类似的蛋白酶体依赖性障碍。
人类呼吸道上皮的极化为HBoV1衣壳介导的基因转移所需.HBoV1产生性地感染极化人类呼吸道上皮的顶端膜的机制仍然不清楚。在先前研究中，我们观察到用野生型HBoV1感染CuFi细胞单层不支持病毒复制和产生后代病毒粒子(黄等人,2012)，这是类似于缺乏用表达荧光素酶的rHBoV1转导单层CuFi细胞的发现(图1D)。相比之下，当极化时，CuFi细胞有效地在用野生型HBoV1顶端而非基底外侧感染之后产生后代病毒(黄等人,2012)。这些发现表明极化影响产生性感染(如表达病毒受体/共受体或表达参与HBoV1病毒粒子的细胞内处理的因子)所需的细胞因子。因为病毒复制不出现在嵌合rAAV2/HBoV1载体内，这是定义受极化影响的在HBoV1感染之后的步骤的机会。为这个目的，用rAAV2/HBoV1进行实验以解决呼吸道上皮细胞的极化是否经由涉及受体结合/吸收或进入后细胞内处理病毒粒子的步骤影响HBoV1衣壳介导的转导。因为泛素-蛋白酶体路径影响HAEALI培养物中的rAAV2/HBoV1转导，我们还检查蛋白酶体抑制剂对这两个步骤的感染的影响。
在37℃下用等量的AV2/HBc.F5tg83luc病毒培育在单层(即，非极化)或极化ALI培养条件下的相等数目的CuFi细胞4小时。在移除未结合载体之后，将感染细胞溶解用于通过塔克曼PCR定量内化载体基因组或培养额外20小时随后评估转基因表达(图5C)这一分析的结果展现用AV2/HBc.F5tg83luc顶端转导极化CuFiALI培养物与基底外侧转导相比72倍更有效，这是符合原发性HAEALI培养物的AV2/HBc.F5tg83luc感染的发现(图4B)。在这些条件下，与基底外侧感染相比在4小时顶端感染之后约40倍更多的病毒经CuFi上皮吸收(图5C)，表明极化增强在顶端膜上的HBoV1受体/共受体的丰度。有趣的是，AV2/HBc.F5tg83luc以与在极化CuFi上皮的顶端感染之后所观察类似的效率进入CuFi细胞单层(图5C)，尽管非极化CuFi培养物的转导显著降低(图4B)。另外，用不容许HBoV1感染的AV2/HBc.F5tg83luc感染的HEK293细胞的病毒吸收和转导分析显示在无转基因表达的情况下的大量病毒吸收(图5C)。在CuFi和HEK293单层培养物中的这两个观察结果表明进入后障壁而非受体介导的吸收也在rAAV2/HBoV1转导中起重要作用。
为了进一步研究rAAV2/HBoV1转导的进入后障壁，评估蛋白酶体抑制剂的影响总的来说，在感染之后在评估的所有条件(极化CuFiALI的顶端或基底外侧感染或非极化CuFi单层的感染)下蛋白酶体抑制剂对病毒吸收几乎不具有影响(图5C)。相比之下，在4小时感染阶段期间的蛋白酶体抑制剂施用在顶端感染极化CuFi上皮之后增强转导45倍，而仅或多或少地增强在基底外侧感染极化CuFi上皮(5倍)或感染CuFi单层(4.3倍)之后的转导(图5C)。这些结果表明HBoV1病毒粒子的细胞内处理的蛋白酶体依赖性障碍从极化CuFi上皮的顶端膜更大。此外，CuFi单层似乎具有也是较不蛋白酶体依赖性的HBoV1病毒粒子处理的最大进入后阻障。累积地，这些结果表明呼吸道上皮细胞的极化/分化改变HBoV1病毒粒子的受体介导的吸收和细胞内处理。
具有具强CBA-hCFTR表达卡匣的5.5kb基因组的rAAV2/HBoV1载体可矫正CF HAE中的CFTR介导的氯离子电流.施用rAAV载体用于CF基因疗法已经受病毒的相对较小封装能力和全长CFTRcDNA的较大尺寸(4443bp的编码序列)妨碍。这需要使用极小合成较弱启动子和/或对于氯离子通道功能不重要的CFTR结构域的缺失(张等人,1998)。这些途径对于CFTR介导的基因疗法都是次优的。rAAV2/HBoV1载体将具有足够空间来容纳强转录调节元件用于人类CFTR基因表达。为了提供关于这一方法的概念验证，构筑具有含有由强CBA启动子驱动的5.2kb人类CFTR表达卡匣的5.5kb基因组的rAAV2原病毒质粒。当将这一原病毒质粒封装到HBoV1病毒粒子中时，所得病毒产率(AV2/HBc.CBAhCFTR)平均是来自转染HEK293细胞的十个150mm盘的1.5×1011DRP(具有荧光素酶报导子的rAAV2/HBoV1载体的类似产生水平)。通过碱性琼脂糖凝胶分析确认AV2/HBc.CBAhCFTR内的5.5kbrAAV基因组的完整性(数据未展示)。
为了验证AV2/HBc.CBAhCFTR病毒的功能，用来自顶端表面的1010DPR(5,000-10,000DRP/细胞)在蛋白酶体抑制剂存在下感染原发性分化CFHAE并且在感染之后10天评估CFTR功能。CFTR功能评估为在用IBMX和弗斯可林刺激并且用GlyH101(CFTR抑制剂)抑制之后cAMP介导的短路电流(Isc)的变化。DIDS和氨氯吡脒用于在cAMP诱导之前阻断非CFTR氯离子通道和ENaC介导的钠离子电流。比较在用AV2/HBc.CF5tg83Luc(对照载体)和AV2/HBc.CBAhCFTR顶端感染之后CFTR介导氯离子电流的互补的结果展示在图6A中。观察在AV2/HBc.CBAhCFTR感染之后相比于对照AV2/HBc.CF5tg83Luc感染样品的cAMP诱导性Isc的显著变化，并且通过添加CFTR抑制剂GlyH101阻断这一电流。图6B概括针对两个感染条件和非CF对照的在cAMP促效剂诱导之后的ΔIsc(cAMP)和在GlyH101抑制之后的ΔIsc(glyH)。在AV2/HBc.CBAhCFTR感染之后的矫正水平(ΔIsc(cAMP)＝2.60+/-0.96μA/cm2并且ΔIsc(glyH)＝2.98+/-0.73μA/cm2)反映在非CFHAE中观察到的约30％的ΔIsc(cAMP)和ΔIsc(glyH)。hCFTR蛋白质在AV2/HBc.CBAhCFTR感染的CFHAE顶端表面上的表达也通过免疫荧光染色确认(图6C)。在AV2/HBc.F5tg83Luc感染样品中观察到极少免疫反应性，如可预期，因为ΔF508-CFTR在原发性CFHAE中有效降解(弗洛狄,2001)。
讨论
新发现并且部分表征的HBoV1为CF呼吸道基因治疗载体的设计提供若干潜在有吸引力的优势。第一，野生型HBoV1在极低MOI下有效地从顶端表面感染HAE，表明其衣壳蛋白质高度适合于呼吸道感染。第二，野生型HBoV1具有5500nt的基因组，表明较大CFTR表达卡匣可有效地封装到重组HBoV1病毒中。出于这些原因，我们成功地产生复制缺陷性rHBoV1和假型化rAAV2/HBoV1载体并且研究其在HAE中的转导概况。我们的发现表明rAAV2/HBoV1载体可实际上是用于CF的基因疗法的rAAV载体的有吸引力的替代物。另外，我们的评估这些新颖重组基于HBoV1的载体的研究已揭示关于极化/分化怎样影响HBoV1衣壳介导的感染和从HAE的顶端和基底外侧膜转导的引起关注的生物学。
尽管暂时已经已知跨属小病毒伪封装是可能的，但对于基于HBoV1的载体功效呈现地高得多。举例来说，rAAV2基因组衣壳化在小病毒B19衣壳中的功效产生约109DRP/ml的病毒效价(彭纳扎刚等人,1995)，同时rAAV2/HBoV1载体的产率是约2×1011DPR/ml。rAAV2/HBoV1的产率比rHBoV1略微较高(约2-4倍)，但与在转染感染性纯系pIHBoV1之后在HEK293细胞中的野生型HBoV1产生类似(黄等人,2012)。然而，仍然清楚仍需要病毒封装的改良，因为对于rAAV2，rAAV2/HBoV1载体的产率保持约10％的水平。
HBoV1衣壳的一个独特方面是与基底外侧表面相比其更高效地从顶端表面转导(>100倍)极化呼吸道上皮的事实。HAE转导的这一膜极性与迄今研究的所有其它rAAV血清型不同。举例来说，rAAV2、rAAV5以及rAAV6以约100倍偏好从基底外侧膜优先转导HAE(颜等人,2013；颜等人，2006；段等人,1998)，而rAAV1展示对于从顶端和基底外侧膜转导的相等偏好(颜等人,2006)。在HBoV1衣壳的情况下，极化似乎对于诱导从顶端膜有效转导所需的病毒受体和/或共受体重要。实际上，与基底外侧相比，从极化CuFi上皮的顶端膜的增强病毒基因组吸收表明HBoV1受体的表达可能通过极化调节。蛋白酶体抑制剂有效增强从顶端膜而非基底外侧膜的rAAV2/HBoV1转导的能力还表明关于内化HBoV1病毒粒子的衣壳处理生物学，这两个膜的感染不同。
有趣的是，非极化CuFi细胞的HBoV1感染的过程代表与极化细胞的顶端或基底外侧感染独特不同的生物过程。在这一情形下，CuFi单层展示rAAV2/HBoV1的有效吸收，如在CuFiALI培养物的顶端感染之后可见，但基本上缺乏蛋白酶体反应，如在CuFiALI培养物的基底外侧感染之后观察到。这些发现的一个可能解释可为引导病毒经由蛋白酶体-相互作用路径产生性处理的顶端膜处的某些结合受体和共受体对的分配(图7)。举例来说，在极化之后，有效地处理内化病毒的结合受体/共受体可往返于顶端膜，引起从基底外侧膜的低病毒吸收(图7A)。在CuFi单层的情况下，有效结合受体可保留在表面上并且与使病毒往返于细胞内区室的更丰富第二共受体相互作用，所述区室对于转导较不有效并且对蛋白酶体抑制不反应(图7B)。这种第二低效共受体可螯合在极化细胞的基底外侧膜中，因此防止干扰顶端感染(图7A)。这仅仅是许多中的一个情况，并且假定在极化之后结合受体和共受体的表达不变化。三个CuFi模型之间转导生物学的差异的替代解释可涉及受极化和分化影响的独特表达的结合受体和/或共受体。
如同大多数rAAV血清型，原发性HAE从顶端膜的rAAV2/HBoV1转导通过在顶端感染时添加蛋白酶体抑制剂显著增强(>1000倍)(图5B)。已经展示蛋白酶体抑制剂通过促进衣壳的泛素化增强rAAV病毒粒子到核的运输(颜等人,2002)并且我们的展示在蛋白酶体抑制剂处理之后rAAV2/HBoV1病毒吸收不改变的结果符合在感染之后在进入后点的作用。然而，仍然不清楚蛋白酶体敏感进入后障壁的机制是否对于rAAV和HBoV1病毒粒子是类似的。举例来说，尽管我们观察到在原发性HAE的顶端感染之后rAAV2/HBoV1与rAAV2/1之间的类似细胞质和细胞核分布模式，但与先前针对rAAV1所观察相比，rAAV2/HBoV1对通过蛋白酶体抑制剂的转导的增强约10倍更敏感(颜等人,2006)。rAAV与HBoV1之间的病毒粒子处理和脱壳的机制差异可为这些观察结果的原因并且确保进一步研究。
rAAV2/HBoV1与rAAV载体之间的最重要的差异中的一个是转基因卡匣的封装能力。与rAAV载体的4.9kb相比，rAAV2/HBoV1载体可携载高达5.5kb的基因组。尽管HBoV1衣壳内基因组封装的上限在这一研究中未评估，但基因组尺寸(600bp)的12％增加对于传递CFTR表达卡匣是极显著的。rAAV2/HBoV1封装允许使用强CBA启动子驱动的CFTR表达卡匣，并且引起CFHAE中CFTR依赖性氯离子电流的极合理的矫正。基于rAAV有效封装比野生型基因组多约5％DNA的能力，期望基于HBoV1的载体可能够有效封装长度高达5.8kb的基因组是合理的。另外，可有可能将自身互补(sc)双股形式的rAAV基因组(长度是2.7到2.8kb)衣壳化到HBoV1衣壳中。
总之，研发两种新颖类型的重组基于HBoV1的载体用于针对人类呼吸道的有效基因疗法。然而，嵌合rAAV2/HBoV1载体具有用于人类基因疗法的优于真正rHBoV1载体的三种明显优势。第一，rAAV2/HBoV1载体产率在HEK293细胞生产系统中比rHBoV1显著更大。第二，rAAV2基因组已经用于临床试验中并且避免可能伴随使用新病毒基因组的潜在安全性问题。第三，施用rHBoV1载体可能受可经由辅助质粒的同源重组产生的载体原液中的复制胜任型病毒的污染妨碍。这后一问题可能是理论上的，因为在用rHBoV1感染之后我们未在HAE中观察到细胞病理学。尽管如此，进一步载体研发为rHBoV1的施用所需来最小化复制胜任型病毒的可能并且改良载体产率。
尽管这一新颖rAAV2/HBoV1载体系统的前景，在考虑临床应用之前若干未知情况需要进一步研究。举例来说，在大多数CF患者中是否有预先存在的对HBoV1衣壳的呼吸道体液免疫性，并且如果是，这影响rAAV2/HBoV1感染吗？研究已表明大约71％的从出生到41岁范围内的人类含有针对HBoV的循环抗体(席尔德格伦等人,2005)，然而，关于呼吸道中针对这一病毒的中和抗体一无所知。鉴于HBoV1感染主要地出现在一岁内，假定此类免疫性对于继发性感染具有保护性。然而，健康儿童和成人的粪便中HBoV的频繁检测以及血清流行病学研究表明病毒排出可出现较长时段和/或患者可具有频繁复发性感染(卡普尔等人,2010)。继发性感染或记忆免疫反应也似乎通常出现，并且虽然HBoV1原发性感染与呼吸道疾病强烈相关，但HBoV1的二级免疫-活化不是(梅里洛托等人,2012)。仍然不清楚此类体液免疫性是否可防止从呼吸道表面感染或起限制HBoV1的复制和的扩展作用(科尔纳等人,2011)。野生型HBoV1在原发性感染之后在呼吸道中展示长期和低水平持续性的事实(马丁等人,2010；阿兰德等人,2005)表明这一病毒可具有逃避免疫检测的方法。rHBoV1和rAAV2/HBoV1载体的研发应允许使用组合重组报导子病毒与来自HBoV1感染患者的血清或支气管肺泡灌洗样品的HAE重建实验解决此类问题。尽管这些未知情况，基于HBoV1的重组载体的研发可具有针对CF基因疗法和/或婴儿的疫苗接种的独特效用来防止野生型HBoV1感染。
有趣的是，非极化CuFi细胞的HBoV1感染的过程代表与极化细胞的顶端或基底外侧感染独特不同的生物过程。在这一情形下，CuFi单层展示rAAV2/HBoV1的有效吸收，如在CuFiALI培养物的顶端感染之后可见，但基本上缺乏蛋白酶体反应，如在CuFiALI培养物的基底外侧感染之后观察到。这些发现的一个可能解释可为引导病毒经由蛋白酶体-相互作用路径产生性处理的顶端膜处的某些结合受体和共受体对的分配(图7)。举例来说，在极化之后，有效地处理内化病毒的结合受体/共受体可往返于顶端膜，引起从基底外侧膜的低病毒吸收(图7A)。在CuFi单层的情况下，有效结合受体可保留在表面上并且与使病毒往返于细胞内区室的更丰富第二共受体相互作用，所述区室对于转导较不有效并且对蛋白酶体抑制不反应(图7B)。这种第二低效共受体可螯合在极化细胞的基底外侧膜中，因此防止干扰顶端感染(图7A)。这仅仅是许多中的一个情况，并且假定在极化之后结合受体和共受体的表达不变化。三个CuFi模型之间转导生物学的差异的替代解释可涉及受极化和分化影响的独特表达的结合受体和/或共受体。
如同大多数rAAV血清型，原发性HAE从顶端膜的rAAV2/HBoV1转导通过在顶端感染时添加蛋白酶体抑制剂显著增强(>1000倍)(图5B)。已经展示蛋白酶体抑制剂通过促进衣壳的泛素化增强rAAV病毒粒子到核的运输(颜等人,2002)并且我们的展示在蛋白酶体抑制剂处理之后rAAV2/HBoV1病毒吸收不改变的结果符合在感染之后在进入后点的作用。然而，仍然不清楚蛋白酶体敏感进入后障壁的机制是否对于rAAV和HBoV1病毒粒子是类似的。举例来说，尽管在原发性HAE的顶端感染之后rAAV2/HBoV1与rAAV2/1之间观察到类似细胞质和细胞核分布模式，但与先前针对rAAV1所观察相比，rAAV2/HBoV1对通过蛋白酶体抑制剂的转导的增强约10倍更敏感(颜等人,2006)。rAAV与HBoV1之间的病毒粒子处理和脱壳的机制差异可为这些观察结果的原因并且确保进一步研究。
rAAV2/HBoV1与rAAV载体之间的最重要的差异中的一个是转基因卡匣的封装能力。与rAAV载体的4.9kb相比，rAAV2/HBoV1载体可携载高达5.5kb的基因组。尽管HBoV1衣壳内基因组封装的上限在这一研究中未评估，但基因组尺寸(600bp)的12％增加对于传递CFTR表达卡匣是极显著的。rAAV2/HBoV1封装允许使用强CBA启动子驱动的CFTR表达卡匣，并且引起CFHAE中CFTR依赖性氯离子电流的极合理的矫正。基于rAAV有效封装比野生型基因组多约5％DNA的能力，期望基于HBoV1的载体可能够有效封装长度高达5.8kb的基因组是合理的。
总之，研发两种新颖类型的重组基于HBoV1的载体用于针对人类呼吸道的有效基因疗法。然而，嵌合rAAV2/HBoV1载体具有用于人类基因疗法的优于真正rHBoV1载体的三种明显优势。第一，rAAV2/HBoV1载体产率在HEK293细胞生产系统中比rHBoV1显著更大。第二，rAAV2基因组已经用于临床试验中并且避免可能伴随使用新病毒基因组的潜在安全性问题。第三，施用rHBoV1载体可能受可经由辅助质粒的同源重组产生的载体原液中的复制胜任型病毒的污染妨碍。这后一问题可能是理论上的，因为在用rHBoV1感染之后未在HAE中观察到细胞病理学。
实例4
其中使用强CMV启动子并且较早封端NS1ORF的优化HBoV1衣壳辅助子pCMVHBoV1NS1(-)Cap(图10A)产生产量的显著增加(到转染HEK293细胞的每20个145mm板约1.5×1012DRP)，其是与rAAV2/2(图9C)类似的水平。因为具有杆状病毒表达载体(BEV)的Sf9昆虫细胞中的rAAV载体生产高度有效并且可线性扩展，确立基于BEV的rAAV2/HBoV1载体生产系统以进一步增加产率。确切地说，构筑以下BEV载体(图10A)：AAV2Rep辅助杆状病毒(Bac-Rep)，其表达AAV2Rep78/Rep52；HBoV1Cap辅助病毒(Bac-Cap)，其表达HBoV1衣壳蛋白质VP1、VPx以及VP2；以及转移载体(Bac-rAAV)，其含有rAAV2基因组。确认了这些载体的表达和其促进rAAV2基因组复制的能力(图10B)。共感染200mL的Sf9细胞培养物(2×106个细胞/毫升)与相等MOI(5pfu/细胞)的每一种病毒以1×1012DRP的产率产生载体(图10C和D)，并且由Sf9和293细胞产生的载体具有转导CuFi-ALI的类似能力(图10E)。这些结果表明感染性rAAV2/HBoV1载体可在BEV-Sf9细胞系统中与在优化4-质粒共转染-293细胞系统中一样有效地产生(图9)。甚至在优化之前，从Sf9细胞产生rAAV2/HBoV1载体达到来自Sf9细胞的rAAV2/2载体产率的10％(图10D)。因为Sf9细胞中的rAAV载体生产可使用生物反应器按比例放大并且使用rep-和cap-表达Sf9细胞系进一步增加，假设生物反应器中的rAAV2/HBoV1生产可再增加十倍，到每升Sf9细胞培养物1014DRP以上的产率。
封装能力增加是rAAV2/HBoV1载体的重要优势中的一个，尤其在调节CFTR基因在HAE中的表达方面。尽管可将尺寸过大的rAAV2基因组(5.5kb)衣壳化在HBoV1衣壳中以允许在强CBA启动子的控制下有效表达FL-CFTRORF，再扩展5％将使得有可能利用驱动在呼吸道上皮的纤毛细胞中表达的FOXJ1启动子(维迪夫和德斯科特(Verdiev&Descoates),1999)，并且还将CFTR3'UTR(微RNA靶向位点)的大多数重要序列并入到rAAV2基因组中以便适当调节CFTR表达。
HBoV1衣壳封装5.9kb的较大rAAV2基因组而无载体生产的显著损失(图11)。并且如图12中所示，rAAV2/HBoV1载体有效地转导HAE-ALI培养物中的纤毛和K18-阳性上皮细胞。
实例5
编码人类全长CFTRORF的rAAV2/HBoV1载体.由于rAAV的封装能力的限制，83-bp合成启动子(tg83)用于驱动FL-CFTRORF在AV2/2.tg83-CFTR中的表达(图13B)。针对短强化子的>50,000个独特序列的合成寡核苷酸(约100bp)库的筛选(施拉巴赫(Schalabach)等人,2010)显示F5强化子将tg83启动子活性升高到与HAE-ALI中的强CMV启动子的60％一样高的水平(图13A。这一启动子经工程改造到AV2/HBc.F5tg83luc和AV2.HBc.F5tg83luc-CMVmcherry(图12)载体中。并入短(185nt)但有效F5tg83启动子以用于在rAAV2/2载体中的CFTR表达需要使用缩短CFTRORF，例如在R结构域[CFTR(ΔR)]处部分缺失(159bp)(奥斯特加德等人,2002；吉伦等人,2011)，除AAV2/2载体的天然(虽然低)顶端向性以外其可能损害CFTR功能(图13B)。然而，F5tg83可充当驱动FL-CFTRORF在rAAV2/HBoV1载体中的表达的理想启动子。AV2/HBc.F5tg83hCFTR载体具有至少600bp的空间以便进一步优化调节CFTR表达。通过并入含有已经据报告调节CFTR表达的微RNA(例如miR101、miR-145以及miR-494)(吉伦等人,2011；梅焦尔尼等人,2011)的靶向位点的短CFTR3'UTR序列，转录(后)调节策略将允许自发调节CFTR表达，并且因此产生内源水平的CFTR表达和更多生理互补模式。为了并入较长调节元件，如1-kb纤毛细胞特异性启动子，用于从5.8kb的AV2/HBc.FOXJ1hCFTR载体(图13C)定点CFTR表达的FOXJ1(奥斯特洛夫斯基(Ostrowski)等人,2003)需要HBoV1衣壳的可扩展封装能力。
为了产生在HBoV1衣壳中假型化的新颖rAAV2构筑体(AV2.F5tg83hCFTR、AV2.F5tg83hCFTR(正)以及AV2.FOXJ1hCFTR)(图13C)并且为了比较其在用AV2/HBc.CBAhCFTR矫正CFTR-特异性Cl-缺陷中的效用，测试衍生自永生化人类CF呼吸道细胞系CuFi8(基因型：ΔF508/ΔF508)的CuFi-ALI中新颖载体的功能。测量用于cAMP调节Cl-通道活性互补的短路电流(Isc)的变化，并且在p.i.10天检查顶端表面上完全处理的CFTR蛋白质的含量。为了测试在更生理水平下CFTR的表达将恢复CFTR活性的假设，进行在使用这些载体(其中四个载体剂量跨越50倍范围)感染的CF异种移植物中的CFTR表达水平和功能的并行比较评估。测量上皮电位差(TEPD)来评估CFTR互补水平。接着收集呼吸道流体用于体外杀菌分析，以及评估细菌清除率的体内细菌攻击实验(在终止实验时)。CFTR在表面上皮上的表达将通过IF染色在顶端膜，使用梅塔莫夫(Metamorph)软件和/或用于完全处理的B和C的免疫沉淀激酶分析定量。载体衍生的CFTRmRNA和移植样品中细胞内载体基因组拷贝(vgc)数将通过qPCR如先前由我们的实验室所描述定量。
与严重CF肺病相关的大多数CFTR突变位于外显子10下游(图14C)。SMaRT方法将在mRNA水平下修复CFTR故障，并且将仅影响内源性表达CFTR的那些细胞。这一修复技术依赖于载体衍生的mRNA前体和内源CFTRmRNA前体中内含子结构域的杂交来触发重建无突变CFTRmRNA的反式剪接过程。载体AV2.CMV-PTM24CF(图14A)编码治疗前RNA分子(PTM)，所述分子由优化反式剪接结构域(图14B)和CFTR外显子10-26组成。反式剪接结构域靶向接近内含子9的3'剪接位点(SS)的PTM24-互补/结合RNA序列(结合结构域＝BD)，引起从内源(缺陷性)CFTRmRNA前体的内含子9的5'SS反式剪接到PTMRNA的3'SS，并且随后产生功能性CFTRmRNA(图14C)。PTM在AV2.CMV-PTM24CF中的效用已经在CF(ΔF508/ΔF508)HAE-ALI中验证(奥斯特洛夫斯基等人,2003)。顶端转导的高效率和rAAV2/HBoV1载体的扩展基因组能力可克服关于经由SMaRT方法矫正CFTR表达的rAAV载体的固有缺点的问题，并且具有完整3'UTR(1,557bp)的完全重建CFTRmRNA(奥斯特洛夫斯基等人,2003)经由转录后调节(例如通过miRNA调节)提供在内源水平下的精确调节的CFTR蛋白质表达。
测试5.55kbrAAV2PTM基因组AV2.CBA-PTM24CF-3UTR在救援CFTR功能中的效用(图14D)。当从第一代载体(AV2.CMV-PTM24CF)保留已经优化的PTM反式剪接结构域时，这一基因组还包括CFTRcDNA的1.5kb3'UTR并且使用CBA启动子代替CMV启动子。不转录3'UTR的AV2.CBA-PTM24CF将充当对照。针对其高封装能力和有效顶端转导使用HBoV1衣壳将rAAV2基因组AV2.CBA-PTM24CF-3UTR和AV2.CBA-PTM24CF假型化。将这些rAAV2/HBoV1PTM载体以5k的MOI顶端施用于CFHAE-ALI培养物，并且将在p.i.3天和1周评估CFTR表达的功能矫正。在p.i.4周，将终止实验并且将进行体内细菌攻击分析以评估移植物中的细菌清除率。
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所有出版物、专利以及专利申请案以引用的方式并入本文中。虽然在前述说明书中，已经关于本发明的某些优选实施例描述本发明，并且出于说明的目的已经阐述许多细节，但所属领域的技术人员将显而易见本发明容许额外实施例并且本文中的某些细节可在不脱离本发明的基本原理的情况下相当不同。

Claims (58)

1.一种经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质和重组型腺相关病毒AAV基因体。
2.根据权利要求1所述的病毒，其中所述基因体包含编码异源基因产物的表达卡匣。
3.根据权利要求2所述的病毒，其中所述基因产物编码治疗性蛋白质。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的病毒，其中所述rAAV基因体是rAAV-1、rAAV-2、rAAV-3、rAAV-4、rAAV-5、rAAV-6、rAAV-7、rAAV-8或rAAV-9基因体。
5.根据权利要求2到4中任一权利要求所述的病毒，其中所述基因产物是病毒、细菌、肿瘤、寄生虫或真菌抗原。
6.根据权利要求2到4中任一权利要求所述的病毒，其中所述基因产物是囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白、α1-抗胰蛋白酶、表面活性剂蛋白质SP-D、SP-A或SP-C、红血球生成素、HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、RSV蛋白质、中和型抗体或其抗原结合片段、SARS病毒蛋白质或细胞激素，例如IFN-α、IFN-γ、TNF、IL-1、IL-17或IL-6。
7.一种在哺乳动物细胞中表达异源基因产物的方法，其包含提供根据权利要求2到6中任一权利要求所述的病毒；和利用有效表达所述异源基因产物的量的所述病毒感染所述细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述基因产物是治疗性基因产物、催化性RNA、微RNA、RNA预反式剪接分子(PTM-RNA)、中和型抗体或其抗原结合片段、预防性基因产物、多肽或肽。
9.一种增强哺乳动物细胞的嵌合病毒转导的方法，其包含：使哺乳动物细胞与经分离的嵌合病毒和有效地加性地或协同地增强rAAV转导的量的至少一种药剂接触，所述经分离的嵌合病毒包含博卡病毒衣壳蛋白质和包含编码异源基因产物的转基因的rAAV基因体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物鼻上皮细胞、气管支气管细胞或肺细胞。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述药剂是蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂。
12.一种抑制或治疗与内源性基因产物的异常表达相关的病状的方法，其包含：使具有罹患病状的风险或罹患所述病状的哺乳动物与有效量的包含博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体的经分离的嵌合病毒接触，其中所述rAAV基因体包含编码至少一部分功能性基因产物的转基因，所述功能性基因产物于所述哺乳动物中的表达抑制或治疗所述病状的至少一种症状。
13.根据权利要求9到12中任一权利要求所述的方法，其中所述转基因编码囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、α-抗胰蛋白酶、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白或红血球生成素。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述哺乳动物进一步与促进转导的量的至少一种蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂接触。
15.根据权利要求9到14中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种药剂是LLnL、Z-LLL、硼替佐米(bortezomib)(万珂(Velcade))、埃普霉素(epoxomicin)、多柔比星(doxorubicin)、多希(doxil)、道诺霉素(daunorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、阿克拉霉素(aclarubicin)、辛伐他汀(simvastatin)、鞣酸、喜树碱(camptothecin)或顺铂(cisplatin)。
16.一种增强哺乳动物细胞的病毒转导的方法，其包含：使所述哺乳动物细胞与包含博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体的嵌合病毒以及有效增强所述病毒的转导的量的药剂接触，所述增强是相对于未与所述药剂接触的哺乳动物细胞来说，其中所述药剂是蛋白酶体抑制剂。
17.一种增强哺乳动物细胞中转基因的表达的方法，其包含：使所述哺乳动物细胞与一定量的药剂和嵌合病毒接触，所述药剂是蛋白酶体抑制剂并且所述嵌合病毒包含博卡病毒衣壳蛋白质和包含所述转基因的rAAV基因体，其中所述量可促进rAAV的转导，从而相对于未与所述药剂接触的哺乳动物细胞增强所述转基因的表达。
18.一种方法，其包含：投予哺乳动物可有效增强所述哺乳动物的细胞中转基因的表达的量的至少一种药剂，所述哺乳动物经历用包含博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体的经分离的嵌合病毒进行的病毒基因疗法，其中所述基因体包含所述转基因，所述转基因于所述哺乳动物中的表达是治疗性的，其中所述增强是相对于未与所述药剂接触的哺乳动物中的细胞来说。
19.根据权利要求16到18中任一权利要求所述的方法，其中所述rAAV编码治疗性肽或治疗性多肽。
20.根据权利要求16到19中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞或哺乳动物在所述细胞或哺乳动物与所述病毒接触之前与所述药剂接触。
21.根据权利要求16到19中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞或哺乳动物在所述细胞或哺乳动物与所述药剂接触之前与所述病毒接触。
22.根据权利要求16到19中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞或哺乳动物同时与所述病毒和药剂接触。
23.根据权利要求16到22中任一权利要求所述的方法，其中所述药剂和所述病毒是投予肺、鼻上皮、胃肠道或血液。
24.根据权利要求16到22中任一权利要求所述的方法，其中所述病毒是经口或非经肠投予。
25.一种使哺乳动物免疫的方法，其包含：投予哺乳动物有效预防或抑制微生物感染或复制的量的经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质和编码预防性基因产物的rAAV基因体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述基因产物是病毒或细菌的抗原。
27.一种经分离的rBoV，其包含非人类博卡病毒衣壳蛋白质和rBoV基因体。
28.根据权利要求27所述的病毒，其中所述基因体包含编码异源基因产物的表达卡匣，所述异源基因产物是例如治疗性基因产物、催化性RNA、微RNA、PTM-RNA、中和型抗体或其抗原结合片段、预防性基因产物、多肽或肽。
29.一种在哺乳动物细胞中表达异源基因产物的方法，其包含提供根据权利要求27所述的病毒；和利用有效表达所述异源基因产物的量的所述病毒感染所述细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述基因产物是治疗性基因产物、催化性RNA、预防性基因产物、多肽或肽。
31.一种增强哺乳动物细胞的嵌合病毒转导的方法，其包含：使哺乳动物细胞与经分离的rBoV和有效地附加地或协同地增强转导的量的至少一种药剂接触，所述经分离的rBoV包含博卡病毒衣壳蛋白质和包含编码异源基因产物的转基因的rBoV基因体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物肺、胃肠道、鼻上皮或气管细胞。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述药剂是蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂。
34.一种抑制或治疗与内源性基因产物的异常表达相关的病状的方法，其包含：使具有罹患病状的风险或罹患所述病状的哺乳动物与有效量的包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rBoV基因体的经分离的rBoV接触，其中所述rHBoV基因体包含编码至少一部分功能性基因产物的转基因，所述功能性基因产物于所述哺乳动物中的表达抑制或治疗所述病状的至少一种症状。
35.根据权利要求31到34中任一权利要求所述的方法，其中所述转基因编码囊性纤维化跨膜传导调控因子、β-血球蛋白、γ-血球蛋白、α-抗胰蛋白酶、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌缩蛋白或红血球生成素。
36.根据权利要求34所述的方法，其进一步包含使所述哺乳动物与促进转导的量的至少一种蛋白酶体抑制剂、化学治疗剂、降脂剂、粘液溶解剂、抗生素或食品添加剂接触。
37.根据权利要求31到33或36中任一权利要求所述的方法，其中所述药剂是LLnL、Z-LLL、硼替佐米(万珂)、埃普霉素、多柔比星、多希、道诺霉素、艾达霉素、表柔比星、阿克拉霉素、辛伐他汀、鞣酸、喜树碱或顺铂。
38.一种增强哺乳动物细胞的病毒转导的方法，其包含：使所述哺乳动物细胞与包含博卡病毒衣壳蛋白质和rBoV基因体的rBoV以及有效增强所述病毒的转导的量的药剂接触，所述增强是相对于未与所述药剂接触的哺乳动物细胞来说，其中所述药剂是蛋白酶体抑制剂。
39.一种增强哺乳动物细胞中转基因的表达的方法，其包含：使所述哺乳动物细胞与一定量的药剂和rHBoV接触，所述药剂是蛋白酶体抑制剂并且所述rHBoV包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和包含所述转基因的rBoV基因体，其中所述量促进转导，从而相对于未与所述药剂接触的哺乳动物细胞增强所述转基因的表达。
40.一种方法，其包含：投予哺乳动物有效增强所述哺乳动物的细胞中转基因的表达的量的药剂，所述哺乳动物经历用包含博卡病毒衣壳蛋白质和rBoV基因体的经分离的rBoV进行的病毒基因疗法，其中所述基因体包含所述转基因，所述转基因于所述哺乳动物中的表达是治疗性的，其中所述增强是相对于未与所述药剂接触的哺乳动物中的细胞来说。
41.根据权利要求38到40中任一权利要求所述的方法，其中所述rHBoV编码治疗性肽或治疗性多肽。
42.根据权利要求38到40中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞或哺乳动物在所述细胞与所述病毒接触之前与所述药剂接触。
43.根据权利要求38到40中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞或哺乳动物在所述细胞与所述药剂接触之前与所述病毒接触。
44.根据权利要求38到40中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞或哺乳动物同时与所述病毒和药剂接触。
45.根据权利要求38到44中任一权利要求所述的方法，其中所述药剂和所述病毒是投予肺、鼻上皮、胃肠道或血液。
46.根据权利要求38到44中任一权利要求所述的方法，其中所述病毒是经口或非经肠投予例如肺、鼻上皮或血液。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述病毒是投予肺、鼻上皮或血液。
48.一种使哺乳动物免疫的方法，其包含：投予哺乳动物有效预防或抑制微生物感染或复制的量的经分离的rBoV，其包含非人类博卡病毒衣壳蛋白质和编码预防性基因产物的rBoV基因体。
49.一种使哺乳动物免疫的方法，其包含：投予哺乳动物有效预防或抑制BoV感染或复制的量的经分离的嵌合病毒，其包含博卡病毒衣壳蛋白质和rAAV基因体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述嵌合病毒是投予肺、胃肠道、鼻上皮或血液。
51.一种疫苗，其包含根据权利要求1到6中任一权利要求所述的嵌合病毒或根据权利要求27或28所述的病毒。
52.一种使哺乳动物免疫的方法，其包含：投予哺乳动物有效预防或抑制HBoV感染或复制的量的经分离的rHBoV，其包含人类博卡病毒衣壳蛋白质和rHBoV基因体。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述嵌合病毒是投予肺、鼻上皮或血液。
54.根据权利要求9、12、16、17、18、25、31、34、38、39或40所述的方法，其中所述rBoV是人类rBoV。
55.根据权利要求9、12、16、17、18、25、31、34、38、39或40所述的方法，其中所述rBoV是非人类rBoV。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述rBoV是猪、猫或犬BoV。
57.根据权利要求1所述的病毒，其中所述rBoV是人类rBoV。
58.根据权利要求1所述的病毒，其中所述rBoV是非人类、哺乳动物rBoV。
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