CN114340683A - 用于转基因表达的方法和组合物 - Google Patents

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颜子颖
唐应华
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Abstract

本公开内容提供了在细胞中表达转基因的方法、在有此需要的对象中治疗病症的方法以及药物组合物。特别地，该方法包括使细胞(例如患有例如囊性纤维化的病症的对象的细胞)和与AAV转导的增强因子组合的重组腺相关病毒(rAAV)接触，在一个实施方案中，该病毒包含AV.TL65衣壳蛋白和包含转基因的多核苷酸，从而在细胞中表达该转基因。本公开内容还提供了包含与一种或更多种增强因子组合的rAAV的药物组合物，在一个实施方案中，该rAAV包含AV.TL65衣壳蛋白和包含转基因的多核苷酸。

Description

用于转基因表达的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月15日提交的美国申请No.62/833,979、2019年10月25日提交的美国申请No.62/926,317和2020年1月29日提交的美国申请No.62/967,219的申请日权益，其公开内容通过引用并入本文。
政府权利声明
本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R43HL137583的政府支持下进行的。政府拥有本发明中的某些权利。
背景技术
使用腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)进行基因治疗是新兴的治疗方式，包括用于治疗单基因缺陷。囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)是致命的常染色体隐性病症，仅在美国就有至少30,000人受到影响，并且全世界至少有70,000人受到影响。CF患者的平均存活年龄为约40岁。CF是由编码囊性纤维化穿膜传导调节蛋白(cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR)的基因中的突变引起的，CFTR是引导氯离子和碳酸氢根离子穿过上皮细胞膜的通道。受损的CFTR功能导致气道炎症和进行性支气管扩张。由于CF的单基因病因学和患者群体中的多种CFTR突变，基因治疗可能为CF提供普遍的治愈。
人细小病毒家族的成员腺相关病毒(AAV)是非致病性病毒，其复制依赖于辅助病毒。因此，重组AAV(recombinant AAV，rAAV)载体是基因治疗临床前研究和临床试验中最频繁使用的载体之一。事实上，使用rAAV2的CF肺病临床试验表明，病毒基因组相对于其他基因转移剂(例如重组腺病毒)在气道组织中具有良好安全特性和长持久性(如通过活检评估的)二者。然而，基因转移未能在CF患者中改善肺功能，因为未检测到rAAV载体来源的CFTRmRNA的转录。
因此，本领域仍然需要在基于AAV的基因治疗方法中的改进的转基因表达方法。
发明概述
本公开内容尤其提供了在细胞中表达转基因的方法、在有此需要的对象中治疗病症的方法以及药物组合物。在一个方面中，对象是人新生儿。在一个方面中，对象是人青少年。
在一个方面中，本公开内容的特征在于在细胞中表达转基因的方法，该方法包括使细胞与以下接触：(i)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)，其包含AV.TL65衣壳蛋白或其变体以及包含转基因的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子(augmenter)，从而在细胞中表达转基因。在一个实施方案中，变体衣壳蛋白与SEQ ID NO:13具有至少80％氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，增强因子是蛋白酶体调节剂。
在一些实施方案中，蛋白酶体调节剂是蒽环类、蛋白酶体抑制剂、三肽基醛或其组合。
在一些实施方案中，蒽环类是多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合。
在一些实施方案中，蒽环类是多柔比星、伊达比星或其组合。
在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。
在一些实施方案中，三肽基醛是N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL)。
在一些实施方案中，使细胞依次与rAAV和增强因子接触。
在另一些实施方案中，使细胞同时与rAAV和增强因子接触。
在一些实施方案中，与使细胞仅与rAAV接触相比，使细胞与rAAV和增强因子接触实现转基因的表达提高。在一些实施方案中，表达的提高为约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％或更高。
在一些实施方案中，接触包括向对象施用rAAV和增强因子。
在另一个方面中，本公开内容的特征在于在有此需要的对象中治疗病症的方法，该方法包括向对象施用(i)重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AV.TL65衣壳蛋白以及包含治疗性转基因的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子，其中施用实现转基因在对象细胞中表达。
在一些实施方案中，施用通过吸入、雾化(nebulization)、气溶胶化(aerosolization)、鼻内、气管内、支气管内、经口、静脉内、皮下和/或肌内进行。
在一些实施方案中，施用通过吸入、雾化、气溶胶化、鼻内、气管内和/或支气管内进行。
在一些实施方案中，细胞是气道细胞。在一些实施方案中，细胞是气道上皮细胞。在一些实施方案中，气道上皮细胞是肺上皮细胞。
在一些实施方案中，病症是囊性纤维化。
在一些实施方案中，多核苷酸包含F5增强子和/或tg83启动子。在一些实施方案中，F5增强子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14的多核苷酸序列，或者其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，F5包含SEQ IDNO:1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，F5增强子包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。在一些实施方案中，tg83启动子包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，转基因是CFTR或其衍生物。
在一些实施方案中，CFTR的衍生物是CFTRΔR转基因(例如人CFTRΔR转基因)。在一些实施方案中，人CFTRΔR转基因由包含SEQ ID NO:4的序列或其与SEQ ID NO:4具有至少80％核酸序列同一性的变体的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，多核苷酸在5'至3'方向上包含F5增强子、tg83启动子和CFTRΔR转基因。
在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的序列，或其与SEQ ID NO:7具有至少80％核酸序列同一性的变体。
在一些实施方案中，多核苷酸还在3'方向上包含3'非翻译区(3'untranslatedregion，3'-UTR)，该3'非翻译区包含SEQ ID NO:5的序列，或其与SEQ ID NO:5具有至少80％核酸序列同一性的变体。
在一些实施方案中，多核苷酸还在3'方向上包含合成的多腺苷酸化位点，该多腺苷酸化位点包含SEQ ID NO:6的序列，或其与SEQ ID NO:6具有至少80％核酸序列同一性的变体。
在一些实施方案中，多核苷酸还在多核苷酸的5'末端处包含5'腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列(inverted terminal repeat，ITR)并且在多核苷酸的3'末端处包含3'AAV ITR。在一些实施方案中，5'AAV ITR包含SEQ ID NO:15的序列，或其与SEQ ID NO:15具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，3'AAV ITR包含SEQ ID NO:16的序列，或其与SEQ ID NO:16具有至少80％核酸序列同一性的变体。
在一些实施方案中，多核苷酸包含：包含SEQ ID NO:15序列的5'AAV ITR、包含SEQID NO:14序列的F5增强子(其可包含5'EcoRI位点和3'XhoI位点，如在SEQ ID NO:1中)、包含SEQ ID NO:2序列的tg83启动子、包含SEQ ID NO:3序列的5'UTR、包含SEQ ID NO:4序列的hCFTRΔR转基因、包含SEQ ID NO:5序列的3'UTR、包含SEQ ID NO:6序列的多腺苷酸化位点(s-pA)和包含SEQ ID NO:16序列的3'AAV ITR。
在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:17的序列，或其与SEQ ID NO:17具有至少80％核酸序列同一性的变体。
在一些实施方案中，AV.TL65衣壳蛋白包含以下氨基酸序列：
Figure BDA0003409437690000041
变体多核苷酸或多肽序列可以是与天然或参考序列具有至少80％、至少85％、至少至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性，例如SEQ ID No.1至12和14至17中任一个的变体多核苷酸，或SEQ ID NO:13的变体多肽。
在另一个方面中，本公开内容的特征在于药物组合物，其包含(i)rAAV，所述rAAV包含AV.TL65衣壳蛋白以及包含转基因的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子。
在一些实施方案中，增强因子是蛋白酶体调节剂。
在一些实施方案中，蛋白酶体调节剂是蒽环类、蛋白酶体抑制剂、三肽基醛或其组合。
在一些实施方案中，蒽环类是多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合。
在一些实施方案中，蒽环类是多柔比星、伊达比星或其组合。在一些实施方案中，增强因子是多柔比星。在另一些实施方案中，增强因子是伊达比星。
在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。
在一些实施方案中，三肽基醛是N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL)。
附图简述
图1A和1B是示出以下的一系列图：用AV.TL65+蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitor，PI)处理与用单独的AAV处理的细胞中萤光素酶活性的比率(图1A)和用AV.TL65+PI处理与用单独的AAV处理的细胞中LDH活性的比率(图1B)。这些结果来自感染(AV.TL65，10K MOI)之后4天时的CF(HBE和HTE，dF508/dF508，第0代)细胞。用含PI的AV.TL65处理的CFHBE中的相对发光单位超过不含PI的AV.TL65的200倍。如通过LDH活性测量的，含PI的AV.TL65的毒性大多低于不含PI的AV.TL65的毒性的150％。
图2是示出以下的一系列图：在指定的处理条件下个体供体的细胞的转导和相对LDH活性，当平均时，得到图1A和1B中呈现的数据。
图3A至3D。rAAV载体性能的体外与体内比较。(A)在存在增强因子的情况下，将CF(F508del/F508del)人极化ALI气道培养物用AV1-SP183-hCFTRΔR或AV.TL65-SP183-hCFTRΔR(MOI＝100,000个DRP/细胞)顶端感染。然后在感染之后12天时在Ussing室中进行短路电流(Isc)测量。显示的是对毛喉素(forskolin)/IBMX和GlyH101(CFTR抑制剂)的ΔIsc响应。数据显示为来自两个供体的n＝4个transwell的平均值±SD。将未感染的ALI培养物用作基线对照(来自两个供体的n＝4)。(B)Isc测量之后，将来自每组的两个transwell插入物合并并裂解，以通过逆转录酶定量PCR(reverse transcriptase quantitative-PCR，RT-qPCR)量化载体来源的hCFTRΔR mRNA拷贝，并相对于人GAPDH mRNA拷贝进行归一化。然后将值表示为hCFTRΔR/GAPDH的比率。数据显示为n＝2的平均值±范围。(C)在存在增强因子的情况下，将人和雪貂极化ALI气管支气管上皮细胞用AV.TL65-SP183gLuc以100,000个DNA酶抗性颗粒(DNase-resistant particle，DRP)/细胞的感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)顶端感染。在感染之后5天时，将高斯萤光素酶(gaussia luciferase)活性测量为相对发光单位(relative luminescence unit，RLU)。数据显示为来自每个物种的两个供体的n＝6个transwell的平均值±SD。(D)使三日龄雪貂或一月龄雪貂气管内感染与增强因子混合的AV.TL65-SP183-hCFTRΔR(4×1010个DRP/克体重)。对模拟感染组接种含增强因子的PBS。然后在感染之后11天时收获气管和肺，用于通过具有GAPDH mRNA拷贝数归一化的RT-qPCR量化载体来源的hCFTRΔR和内源性fCFTR mRNA拷贝。数据表示hCFTRΔR与fCFTRΔR的mRNA拷贝的比率(hCFTRΔR/fCFTR)。数据显示为每组中n＝3只动物的平均值+/-SD。ns，无显著性差异。
图4A至4C。在新生雪貂中重复给药AV.TL65。(A)研究设计涉及三组新生雪貂，其通过气管内施用接受1×1013个DRP/kg的0、1或2剂病毒。对接受一剂的雪貂在4周龄时施用报道载体AV.TL65-SP183-gLuc，而对接受两剂的雪貂在1周龄时施用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR并在4周龄时施用AV.TL65-SP183-gLuc。在指定的年龄时收集血浆和BALF样品。(B)在AV.TL65-SP183-gLuc递送之后的指定时间点的血浆中的高斯萤光素酶活性。(C)在AV.TL65-SP183-gLuc递送之后14天时BALF中的高斯萤光素酶活性。结果显示为每组n＝6只动物的平均值±SD。用单因素ANOVA随后用Tukey事后检验(Tukey’s post-test)分析统计学显著性。ns，不显著。RLU，相对发光单位。
图5A至5C。在幼年雪貂中重复给药AV.TL65。(A)研究设计涉及三组幼年雪貂，其通过气管内施用接受1×1013个DRP/kg的0、1或2剂病毒。对接受一剂的雪貂在8周龄时施用报道载体AV.TL65-SP183-gLuc，而对接受两剂的雪貂在4周龄时施用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR并在8周龄时施用AV.TL65-SP183-gLuc。在指定的年龄时收集血浆和BALF样品。(B)在AV.TL65-SP183-gLuc递送之后的指定时间点的血浆中的高斯萤光素酶活性。(C)在AV.TL65-SP183-gLuc递送之后14天时BALF中的高斯萤光素酶活性。结果显示为每组n＝9至10只动物的平均值±SD。用单因素ANOVA随后用Tukey事后检验分析统计学显著性：**P<0.01，****P<0.0001。RLU，相对发光单位。
图6A至6D。经感染的雪貂的BALF和血浆中AV.TL65中和抗体的滴度。(A、B)使用转导抑制测定评价如图4A中收集的新生雪貂样品在(A)BALF和(B)血浆中的NAb。将BALF或血浆的连续稀释液与AV.TL65-fLuc一起孵育，然后感染A549细胞。将NAb的滴度计算为如通过萤火虫萤光素酶活性评估的导致转导的50％抑制(IC50)的BALF或血浆的浓度(稀释比率)。将仅感染AV.TL65-fLuc的细胞用作基线对照，并且将模拟感染细胞用作空白。(C、D)使用上述转导抑制测定评价如图5A中收集的幼年雪貂样品在(C)BALF和(D)血浆中的NAb。结果显示为每组n＝6只新生动物和每组n＝9至10只幼年动物的平均值±SD。用单因素ANOVA随后用Tukey事后检验分析统计学显著性：**P<0.01，****P<0.0001。ns，不显著。
图7A至7B。用于量化抗衣壳抗体同种型的基于ELISA的测定的开发。从肺感染AV-TL65四次(从1月龄开始以1至2个月的间隔)的雪貂产生免疫血浆。原初血浆来源于年龄相仿的雪貂。将ELISA板用(A)AAV5或(B)AAV2包被，并随后评价免疫和原初雪貂血浆的结合。第二检测抗体针对IgG。结果显示为对每个样品的两次技术重复的平均值±范围。
图8A至8F。经AV.TL65感染的雪貂血浆中IgG、IgM和IgA衣壳结合抗体的量化。(A至F)(A至C)新生和(D至F)幼年雪貂血浆中(A、D)IgG、(B、E)IgM和(C、F)IgA衣壳结合抗体的量化。结果显示为每组n＝6只新生动物和每组n＝9至10只幼年动物的平均值+/-SD。用单因素ANOVA随后用Tukey事后检验分析统计学显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。单剂量组和重复剂量组之间的未标记比较没有显著性差异。
图9A至9F。经AV.TL65感染的雪貂BALF中IgG、IgM和IgA衣壳结合抗体的量化。(A至F)(A至C)新生和(D至F)幼年雪貂BALF中(A、D)IgG、(B、E)IgM和(C、F)IgA衣壳结合抗体的量化。结果显示为每组n＝6只新生动物和每组n＝9至10只幼年动物的平均值+/-SD。用单因素ANOVA随后用Tukey事后检验分析统计学显著性：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。单剂量组和重复剂量组之间的未标记比较没有显著性差异。
发明详述
与其他AAV血清型相比，AV.TL65衣壳蛋白赋予气道上皮细胞的顶端转导显著增强。如Excoffon et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(10):3865-3870,2009中所述(其通过引用整体并入本文)，这种衣壳蛋白与用AAV2、AAV5或AAV9衣壳蛋白分型的rAAV相比赋予报道转基因萤光素酶的表达提高至少10至100倍。本公开内容至少部分地基于以下出乎意料的发现：通过与一种或更多种本文所述的增强因子组合使用，由用AV.TL65衣壳蛋白血清分型的rAAV载体携带的转基因的转导和/或表达可显著提高至甚至更高的程度，同时毒性最小。例如，如实施例1中所述，与没有增强因子的AV.TL65萤光素酶-mCherry相比，将AV.TL65萤光素酶-mCherry与增强因子(例如多柔比星或伊达比星)组合提供了气-液界面(air-liquid interface，ALI)人支气管上皮(human bronchial epithelial，HBE)培养物的萤光素酶表达无毒性增强超过600倍。因此，本文描述的方法允许来自包含AV.TL65衣壳蛋白的rAAV的转基因的高效转导和表达，并且发现可用于例如治疗例如囊性纤维化的病症的改进方法中。在一个方面中，患有囊性纤维化的对象是人新生儿。在一个方面中，患有囊性纤维化的对象是人青少年。本公开内容还提供了药物组合物，其包含(i)rAAV，所述rAAV包含AV.TL65衣壳蛋白以及包含转基因(例如CFTRΔR)的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子。
定义
术语“AAV”是指腺相关病毒，并且可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除非另有要求的情况，否则该术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在和重组形式二者。AAV基因组由单链DNA构成，并且包含在DNA链两端处的末端反向重复序列(ITR)和两个开放阅读框：分别编码复制和衣壳蛋白的rep和cap。外来多核苷酸可替代天然的rep和cap基因。AAV可用多种不同血清型衣壳制成，这些衣壳具有不同的转导谱，或者如本文所用，对不同组织类型具有“向性(tropism)”。如本文所用，术语“血清型”是指通过衣壳蛋白与限定抗血清的反应性而被鉴定并且基于衣壳蛋白与限定抗血清的反应性而区别于其他AAV的AAV，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10。例如，血清型AAV2用于指包含由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白和包含来自相同AAV2血清型的5'和3'ITR序列的基因组的AAV。假型AAV是指包含来自一种血清型的衣壳蛋白和包括第二种血清型的5'-3'ITR的病毒基因组的AAV。预期假型rAAV会具有衣壳血清型的细胞表面结合特性和与ITR血清型一致的遗传特性。假型rAAV使用本领域中所述的标准技术产生。
术语“约”在本文中用于意指所列举值的±10％的值。
如本文所用，“施用”意指将本文所述的组合物(例如，rAAV、增强因子和/或其药物组合物)的剂量给予对象的方法。在本文所述的方法中使用的组合物可通过任何合适的途径施用，所述途径包括例如通过吸入、雾化、气溶胶化、鼻内、气管内、支气管内、经口、肠胃外(例如静脉内、皮下或肌内)、经口、经鼻、经直肠、表面或经颊。在一些实施方案中，使用雾化器喷雾器(atomizer sprayer)(例如，具有
Figure BDA0003409437690000091
喉-气管黏膜雾化装置)以气溶胶化颗粒气管内和/或支气管内施用本文所述的组合物。本文所述方法中使用的组合物也可局部或全身施用。施用方法可取决于多种因素(例如，所施用组合物的组分和所治疗病症的严重程度)而变化。
术语“蒽环类”是指用于例如化学治疗中的一类药物。示例性的蒽环类包括多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星和米托蒽醌。
术语“AV.TL65”是指进化的嵌合AAV衣壳蛋白，其对人气道具有高度的向性。Excoffon等(同上)中描述了AV.TL65，并且AV.TL65在本领域中也称为AAV2.5T。AV.TL65是AAV2(a.a.1至128)和AAV5(a.a.129至725)之间的嵌合体，具有基于单点突变的替换(A581T)。AV.TL65衣壳的氨基酸序列在下面显示：
Figure BDA0003409437690000101
“控制元件”或“控制序列”是参与分子相互作用的核苷酸序列，其有助于多核苷酸的功能性调节，包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。调节可能影响过程的频率、速度或特异性，并且本质上可能是增强的或抑制的。本领域已知的控制元件包括例如转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并启动通常位于该启动子下游(在3'方向)的编码区的转录的DNA区。启动子包括AAV启动子，例如P5、P19、P40和AAV ITR启动子，以及异源启动子。
“表达载体”是包含编码目的多肽的区域的载体，并且用于在预期的靶细胞中实现蛋白质的表达。表达载体还包含与编码区有效连接的控制元件，以促进蛋白质在靶标中的表达。控制元件和与其可操作地连接以进行表达的一个或更多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是本领域已知和可用的，或者可以容易地从本领域可用的组分构建。
“基因”是指包含至少一个开放阅读框的多核苷酸，该开放阅读框在转录和翻译后能够编码特定蛋白质。
术语“基因递送”是指将外源多核苷酸引入细胞用于基因转移，并且可涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位、复制子整合和表达。
术语“基因转移”是指将外源多核苷酸引入细胞，其可涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位和复制子整合，但与后续的基因表达不同且不暗示后续的基因表达。
术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。
AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如，野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。AAV的多种这样的辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(例如牛痘)。腺病毒涵盖多种不同的亚组，但最常用的是亚组C的5型腺病毒。人、非人哺乳动物和禽来源的多种腺病毒是已知的并且可从保藏中心例如ATCC获得。疱疹家族的病毒包括例如单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)和EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，以及巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和假狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)；其也可从保藏中心例如ATCC获得。
“可检测标记基因”是允许携带该基因的细胞被特异性检测(例如区别于不携带该标记基因的细胞)的基因。多种这样的标记基因是本领域已知的。
“选择标记基因”是在存在相应选择性剂的情况下允许携带该基因的细胞被特异性选择或针对的基因。举例来说，抗生素抗性基因可用作阳性选择标记基因，其允许在存在相应抗生素的情况下宿主细胞被阳性选择。多种阳性和阴性选择标志物是本领域已知的，其中一些在下面描述。
“异源”意指来源于和与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过遗传改造技术被引入不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且当表达时，可编码异源多肽)。
“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“包装细胞系”和其他这样的术语表示可用于本公开内容的真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞。这些细胞可用作重组载体、病毒或其他转移多核苷酸的接受者，并且包括被转导的原始细胞的后代。应当理解，单细胞的后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组互补方面)。
“提高的转导或转导频率”、“改变的转导或转导频率”或者“增强的转导或转导频率”是指相对于未经处理的细胞，经处理的细胞中上述一种或更多种活性的提高。本文所述的提高转导效率的药剂可通过测量对一种或更多种转导活性的作用来确定，这可以包括测量转基因的表达、测量转基因的功能、或确定产生与未经该药剂处理的宿主细胞相比相同的转基因作用所必需的rAAV载体颗粒数目。本文所述的增强因子可使得包含AV.TL65衣壳蛋白的rAAV的转导或转导频率相对于参考水平(例如，在不存在增强因子的情况下rAAV的转导或转导频率)提高。
“分离的”质粒、病毒或其他物质是指没有至少一些其他组分的物质的制备物，这些组分可能也存在于该物质或类似物质天然存在的地方或是最初制备该物质或类似物质的地方。因此，例如可通过使用纯化技术从源混合物富集分离的物质来制备该分离的物质。富集可在绝对基础(例如每体积溶液的重量)上进行测量，或者其可相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物质进行测量。本公开内容实施方案的富集的提高越来越更加显著(some)。因此，例如2倍富集是显著的，10倍富集是更加显著的，100倍富集是更加显著的，1000倍富集是甚至更加显著的。
如本文所用，术语“可操作连接”或“可操作地连接”是指如此描述的组件(component)的物理或功能性并置以允许它们以其预期方式起作用。更具体地，例如两个DNA序列可操作地连接意指该两个DNA以使得至少一个DNA序列能够对另一个序列发挥生理作用这样的关系布置(顺式或反式)。例如，增强子和/或启动子可与转基因(例如治疗性转基因，例如CFTRΔR微小基因)可操作地连接。
如本文所用，“包装”是指导致病毒载体(特别是AAV载体)的组装和衣壳化的一系列亚细胞事件。因此，当在适当的条件下将合适的载体引入包装细胞系时，其可以组装成病毒颗粒。与病毒载体(特别是AAV载体)的包装相关的功能在本文和本领域中有所描述。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化或加帽的核苷酸和核苷酸类似物，并且可被非核苷酸组分中断。可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰(如果存在的话)。如本文所用，术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另有指明或要求，否则本文描述的公开内容的为多核苷酸的任何实施方案涵盖双链形式以及已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。该术语还涵盖经过修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、脂化或与标记组分的缀合。当在基因治疗及用于其的组合物的背景下讨论时，多肽例如“CFTR”等是指相应的完整多肽，或者保留所期望的完整蛋白质生化功能的其任何片段或经遗传改造衍生物。类似地，对CFTR和用于基因治疗的其他这样的基因(通常称为将被递送至接受者细胞的“转基因”)的提及，包括编码完整多肽或者具有所期望生化功能的任何片段或经遗传改造衍生物的多核苷酸。
“药物组合物”意指适合向对象施用、包含并入病毒载体(例如rAAV载体)或独立于病毒载体(例如，并入脂质体、微粒或纳米颗粒中))的治疗或生物活性剂(例如，包含转基因(例如CFTRΔR微小基因；参见例如Ostedgaard et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(7):2921-6,2011)的多核苷酸)的任何组合物。这些制剂中的任何一种都可通过本领域公知和接受的方法制备。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(21sted.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2005,和Encyclopedia ofPharmaceutical Technology,ed.J.Swarbrick,Informa Healthcare,2006，其各自在此通过引用并入。
“可药用稀释剂、赋形剂、载体或辅料”意指对象在生理上可接受同时保留与其一起施用的药物组合物的治疗特性的稀释剂、赋形剂、载体或辅料。
术语“蛋白酶体调节剂”和“蛋白酶体调节物”是指通过与蛋白酶体相互作用、结合，或改变蛋白酶体的功能，和/或传输或定位蛋白酶体来改变或增强rAAV转导或rAAV转导频率的药剂或药剂类别。蛋白酶体调节物可具有如本领域中描述的其他细胞功能，例如，化学治疗药物例如多柔比星。本公开内容的蛋白酶体调节物包括蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、三肽基醛(Z-LLL或LLnL)、抑制蛋白酶体的钙蛋白酶、组织蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶活性的药剂(参见例如，Wagner et al.,Hum.Gene Ther.,13:1349(2002)；Young et al.,J.Virol.,74:3953(2000)；和Seisenberger et al.,Science,294:1029(2001))。
应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤以及产生不同于自然界中发现的多核苷酸的构建体的其他过程的多种组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的后代。
“重组腺相关病毒(AAV)”或“rAAV载体”意指重组产生的AAV或AAV颗粒，其包含待体内、离体或体外递送至细胞中的非AAV来源的多核苷酸序列(例如，包含可与一个或更多个增强子和/或启动子可操作地连接的转基因的多核苷酸)。非天然存在的(例如，嵌合的)衣壳可用于本文所述的rAAV，例如AV.TL65。
“参考”意指用于比较目的的任何样品、标准或水平。“正常参考样品”或“野生型参考样品”可以是例如来自未患有病症(例如，囊性纤维化)的对象的样品。“阳性参考”样品、标准或值是来源于已知患有病症(例如囊性纤维化)的对象的样品、标准、值或数目，其可通过至少一种以下标准与对象的样品匹配：年龄、体重、疾病阶段和整体健康状况。
术语“对象”和“患者”在本文中可互换使用以指任何哺乳动物(例如人、灵长类、猫、狗、雪貂、牛、马、猪、山羊、大鼠，或小鼠)。在一个实施方案中，对象是人。
“终止子”是指倾向于减少或阻止通读转录的多核苷酸序列(即其减少或阻止源自终止子一侧的转录继续到终止子的另一侧)。转录被破坏的程度通常是碱基序列和/或终止子序列长度的函数。特别地，如在多种分子生物学系统中公知的，通常称为“转录终止序列”的特定DNA序列是倾向于破坏通过RNA聚合酶的通读转录的特定序列，大概是通过导致RNA聚合酶分子停止和/或脱离正在转录的DNA。这样的序列特异性终止子的典型实例包括多腺苷酸化(“polyA”)序列，例如SV40polyA。除了或代替这样的序列特异性终止子，在启动子和编码区之间插入相对长的DNA序列也倾向于破坏编码区的转录，通常与间插序列的长度成比例。这种效应的产生大概是因为RNA聚合酶分子总是有与被转录的DNA脱离的一些倾向，并且增加在到达编码区之前要穿过的序列的长度通常会提高在编码区转录完成或可能甚至开始之前发生脱离的可能性。终止子可因此阻止从仅一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)的转录，并且可由序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或二者构成。多种这样的终止子序列是本领域已知的；并且下面提供了在本公开内容的上下文中这样的序列的举例说明性用途。
“治疗性基因”、“预防性基因”、“靶多核苷酸”、“转基因”、“目的基因”等一般是指待使用载体转移的一种或更多种基因。通常，在本公开内容的上下文中，这样的基因位于rAAV载体内(该载体侧翼是末端反向重复序列(ITR)区域，并且因此可复制并衣壳化(encapsidate)进rAAV颗粒中)。在本公开内容中可使用靶多核苷酸来产生用于多种不同应用的rAAV载体。这样的多核苷酸包括但不限于：(i)编码可用于其他形式的基因治疗以减轻由结构蛋白或酶的缺失、缺陷或次优水平引起的缺陷的蛋白质的多核苷酸；(ii)转录成反义分子的多核苷酸；(iii)转录成结合转录或翻译因子的诱饵的多核苷酸；(iv)编码细胞调节物例如细胞因子的多核苷酸；(v)可使接受体细胞对特定药物易感的多核苷酸，例如疱疹病毒胸苷激酶基因；(vi)用于癌症治疗的多核苷酸，例如用于治疗多种癌症的E1A肿瘤抑制基因或p53肿瘤抑制基因；和(vii)用于基因编辑(例如CRISPR)的多核苷酸。为了实现转基因在接受体宿主细胞中的表达，在一个实施方案中，其与启动子可操作地连接，启动子是其自己的启动子或是异源启动子。大量合适的启动子是本领域已知的，其选择取决于靶多核苷酸的期望表达水平；是否期望组成型表达、诱导型表达、细胞特异性或组织特异性表达等。rAAV载体还可包含选择标志物。示例性转基因包括但不限于囊性纤维化穿膜传导调节蛋白(CFTR)或其衍生物(例如，CFTRΔR微小基因；参见例如，Ostedgaard etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(7):2921-6,2011，其通过引用整体并入本文)、α-抗胰蛋白酶、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、酪氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、因子VIII、肌养蛋白、促红细胞生成素、α1-抗胰蛋白酶、表面活性蛋白SP-D、SP-A或SP-C、促红细胞生成素或细胞因子例如IFN-α、IFNγ、TNF、IL-1、IL-17或IL-6，或为抗原(例如病毒、细菌、肿瘤或真菌抗原)的预防性蛋白质，或者中和抗体或其靶向抗原(例如来自人呼吸病毒例如流感病毒或RSV的抗原)表位的片段，包括但不限于HBoV蛋白质、流感病毒蛋白质、RSV蛋白质或SARS蛋白质。
“治疗有效量”意指为了以临床相关方式改善、抑制或缓解对象的病情或者病症或疾病(例如，囊性纤维化)的症状而施用的组合物的量。对象中的任何改善都被认为足以实现治疗。在一个实施方案中，足以治疗的量是降低、抑制或阻止囊性纤维化发生或一种或更多种症状的量，或者是降低对象患有囊性纤维化的一种或更多种症状的严重程度或持续时间长度的量(例如，相对于未用本文所述的组合物治疗的对照对象，降低至少约10％、约20％或约30％，或者降低至少约50％、约60％或约70％，或者降低至少约80％、约90％、约95％、约99％或更多)。用于实施本文所述方法(例如治疗囊性纤维化)的药物组合物的有效量取决于施用方式和所治疗对象的年龄、体重和一般健康而变化。医生或研究人员可决定适当的量和剂量方案。
如本文所用，“转导”及其变化形式是指将rAAV中的外源多核苷酸(例如转基因)引入宿主细胞中导致多核苷酸(例如转基因)在细胞中表达的过程的术语。该过程通常包括1)AAV在其与细胞表面受体结合之后的内吞作用，2)从内体或其他胞内区室向细胞胞质溶胶中逃逸，3)将病毒颗粒或病毒基因组运输到细胞核，4)病毒颗粒的脱壳，以及产生可表达的双链AAV基因组形式，包括环状中间体。rAAV可表达的双链形式可作为核附加体持续存在或任选地可整合到宿主基因组中。AAV在其与细胞表面受体结合之后的内吞作用、从内体或其他胞内区室向细胞胞质溶胶逃逸、将病毒颗粒或病毒基因组运输到细胞核，或者病毒颗粒的脱壳，以及产生表达性双链AAV基因组形式(包括环状中间体)中的任何一项或组合的改变可导致表达水平或表达持续性的改变，或者向细胞核的运输改变，或者表达引入的多核苷酸的宿主细胞或细胞群的类型或相对数目改变。通过rAAV引入的多核苷酸的表达或持久性改变可通过本领域公知的方法来确定，所述方法包括但不限于蛋白质表达(例如通过ELISA、流式细胞术和Western印迹)、通过杂交测定测量DNA和RNA产生(例如Northern印迹、Southern印迹和凝胶迁移运动测定)，或者定量或非定量逆转录、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)或数字液滴PCR测定。
个体或细胞的“治疗”是试图在治疗开始时改变个体或细胞的天然过程的任何类型的干预，例如在个体中引发预防性、治愈性或其他有益效果。例如，可对个体进行治疗以降低或限制由任何病理病症引起的病理状况，包括(但不限于)遗传或诱导的遗传缺陷(例如囊性纤维化)，病毒、细菌或寄生生物体感染，赘生或再生障碍性病症，或者免疫系统功能障碍例如自身免疫或免疫抑制。治疗包括(但不限于)施用组合物，例如药物组合物，和施用已经用组合物处理过的相容细胞。可以预防性或治疗性地进行治疗；即在病理事件开始之前或之后或者与病原物(etiologic agent)接触之前或之后。治疗可以减轻病理病症的一种或更多种症状。例如，囊性纤维化的症状是本领域已知的并且包括例如持续咳嗽、喘息、呼吸困难(breathlessness)、运动不耐受、反复肺感染、鼻道发炎或鼻塞、粪便恶臭或油腻、体重增加差和生长不良、肠阻塞、便秘、汗中盐浓度升高、胰腺炎和肺炎。检测到病症(例如囊性纤维化)的一种或更多种症状的改善或不存在，表明治疗成功。
如本文所用，“载体”是指包含多核苷酸或与多核苷酸缔合且可用于介导多核苷酸在体外或体内递送至细胞的大分子或大分子的缔合。举例说明性载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载剂。待递送的多核苷酸(有时称为转基因)可包含基因治疗中的目的编码序列(例如编码治疗性或目的蛋白质的基因)、疫苗开发中的目的编码序列(例如表达适合在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)和/或选择标志物或可检测标志物。
重组AAV载体和多核苷酸
重组AAV载体是人基因治疗的潜在强大工具，特别是对于例如囊性纤维化和镰状细胞性贫血的疾病。rAAV载体与其他基因治疗方法相比的主要优势是它们通常不需要靶细胞的持续复制以游离(episomally)地存在或稳定整合到宿主细胞中。本文提供了rAAV，其包含AV.TL65衣壳蛋白以及包含转基因的多核苷酸，如本文所述，所述转基因可与AAV转导的增强因子组合。
rAAV载体和/或病毒对于开发治疗性或预防性疫苗以防止疾病感染、进展和/或严重程度也是潜在强大的。rAAV载体用于疫苗开发的主要优点是其能够作为核附加体基本上在细胞的寿命内持续存在，并因此提供具有免疫学目的(of immunologic interest)的肽、多肽或蛋白质的长期表达。目的转基因包括病毒基因，例如HIV的包膜(env)或gag基因；细菌基因，例如链球菌细胞壁蛋白；真菌，例如球孢子菌病(cocidomycosis)；寄生虫，例如利什曼病(Leischmaniosis)，或癌症基因，例如p53。
rAAV载体和/或病毒也可包含一种或更多种可检测标志物。多种这样的标志物是已知的，举例来说，包括细菌β-半乳糖苷酶(lacZ)基因；人胎盘碱性磷酸酶(AP)基因和编码多种细胞表面标志物的基因，这些标志物已在体外和体内二者中用作报道分子。rAAV载体和/或病毒还可包含一种或更多种选择标志物。
重组AAV载体和/或病毒还可包含不编码蛋白质的多核苷酸，包括例如编码可用于通过与正常mRNA形成双链体来阻断其翻译的反义mRNA(mRNA的补体)的多核苷酸，和编码核酶(RNA催化剂)的多核苷酸。
AAV载体通常包含与AAV异源的多核苷酸。多核苷酸通常是令人感兴趣的，因为其能够在基因治疗的背景下为靶细胞提供功能，例如上调或下调某种表型的表达。这样的异源多核苷酸或“转基因”通常具有足够的长度以提供所期望的功能或编码序列。
在期望在预期的靶细胞中异源多核苷酸转录的情况下，其可以与其自身或异源启动子可操作地连接，如本领域已知的，这取决于例如靶细胞内所期望的转录水平和/或转录特异性。多种类型的启动子和增强子都适合用于这种情况。组成型启动子提供持续水平的基因转录，并且在期望在持续的基础上表达治疗性或预防性多核苷酸时是显著的。诱导型启动子在不存在诱导物的情况下通常表现出低活性，而在存在诱导物的情况下上调。当期望仅在某些时间时或某些位置处表达时，或者当可期望使用诱导剂滴定表达水平时，它们可能是显著的。启动子和增强子也可能是组织特异性的：也就是说，它们仅在某些细胞类型中表现出活性，这可能是由于在那些细胞中独特地发现的基因调节元件。
启动子的举例说明性实例是来自猿猴病毒40的SV40晚期启动子、杆状病毒多角体增强子/启动子元件、单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes Simplex Virus thymidine kinase，HSV tk)、来自巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的立即早期启动子和多种逆转录病毒启动子(包括LTR元件)。诱导型启动子包括重金属离子诱导型启动子(例如小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)启动子或多种生长激素启动子)，以及在存在T7 RNA聚合酶的情况下具有活性的来自T7噬菌体的启动子。举例来说，组织特异性启动子的实例包括多种表面活性素启动子(用于在肺中表达)、肌球蛋白启动子(用于在肌肉中表达)和白蛋白启动子(用于在肝中表达)。大量其他启动子是本领域已知并且通常可获得的，并且许多这样的启动子的序列可在例如GenBank数据库的序列数据库中获得。
在还期望在预期的靶细胞中翻译的情况下，异源多核苷酸可能还包含促进翻译的控制元件(例如核糖体结合位点或“RBS”和多腺苷酸化信号)。因此，异源多核苷酸通常包含与合适启动子有效连接的至少一个编码区，并且还可包含例如有效连接的增强子、核糖体结合位点和poly-A信号。异源多核苷酸可包含一个编码区，或在相同或不同启动子控制下的多于一个编码区。包含控制元件与编码区的组合的整个单元通常称为表达盒。
异源多核苷酸通过重组技术整合到AAV基因组编码区中或代替AAV基因组编码区(即代替AAV rep和cap基因)，但通常任一侧翼是AAV末端反向重复序列(ITR)区。这意味着ITR出现在编码序列的上游和下游二者，或者直接并置，例如(尽管不一定)没有任何AAV来源的间插序列，以降低可能再生能够复制的AAV基因组的重组的可能性。然而，单个ITR可能足以执行通常与包含两个ITR的构造相关的功能(参见例如WO 94/13788)，并且因此具有仅一个ITR的载体构建体可与本公开内容的包装和生产方法结合应用。
rep的天然启动子是自我调节的，并且可限制产生的AAV颗粒的量。rep基因还可与异源启动子可操作地连接，无论rep是作为载体构建体的部分提供还是单独提供。任何不被rep基因表达强烈下调的异源启动子都是合适的；但诱导型启动子是显著的，因为rep基因的组成型表达可对宿主细胞具有负面影响。多种诱导型启动子是本领域已知的；举例来说，包括重金属离子诱导型启动子(例如金属硫蛋白启动子)；类固醇激素诱导型启动子(例如MMTV启动子或生长激素启动子)；以及例如在存在T7 RNA聚合酶的情况下有活性的来自T7噬菌体的那些的启动子。诱导型启动子的一个亚类是由用于补充rAAV载体的复制和包装的辅助病毒诱导的那些。还描述了许多辅助病毒诱导型启动子，包括可由腺病毒E1A蛋白质诱导的腺病毒早期基因启动子；腺病毒主要晚期启动子；可由疱疹病毒蛋白质(例如VP16或1CP4)诱导的疱疹病毒启动子；以及牛痘或痘病毒诱导型启动子。
已经描述了用于确定和测试辅助病毒诱导型启动子的方法(参见例如WO 96/17947)。因此，确定候选启动子是否是辅助病毒诱导型的，以及它们是否可用于产生高效率包装细胞的方法是本领域已知的。简而言之，一种这样的方法涉及用推定的辅助病毒诱导型启动子(本领域已知的或使用公知技术(例如与无启动子的“报道”基因连接的技术)鉴定的)替代AAV rep基因的p5启动子。任选地与阳性选择标志物(例如抗生素抗性基因)连接的AAV rep-cap基因(p5被替代)随后被稳定地整合到合适的宿主细胞(例如HeLa细胞或以下示例的A549细胞)中。然后测试在选择条件下(例如在存在抗生素的情况下)能够相对良好生长的细胞在添加辅助病毒之后表达rep和cap基因的能力。作为对rep和/或cap表达的初步测试，可使用免疫荧光检测Rep和/或Cap蛋白质容易地筛选细胞。然后可通过对进入的rAAV载体的复制和包装的功能性测试来确定包装能力和效率。使用这种方法，来源于小鼠金属硫蛋白基因的辅助病毒诱导型启动子已被确定为p5启动子的合适替代，并用于产生高滴度的rAAV颗粒(如WO 96/17947中所述)。
鉴于多种AAV基因组的相对衣壳化尺寸限制，将大的异源多核苷酸插入基因组需要去除AAV序列的一部分。去除一种或更多种AAV基因以降低产生能够复制的AAV(“RCA”)的可能性在任何情况下都是期望的。因此，在一个实施方案中，rep、cap或二者的编码或启动子序列被去除，因为这些基因提供的功能可以以反式提供。
所得载体被称为在这些功能上“有缺陷”。为了复制和包装载体，用一种或更多种一起编码多种缺失的rep和/或cap基因产物的必要功能的包装基因补充缺失功能。包装基因或基因盒在一个实施方案中侧翼不是AAV ITR，并且在一个实施方案中不与rAAV基因组共有任何显著同源性。因此，为了使在载体序列与单独提供的包装基因之间复制期间的同源重组最小化，可期望避免两个多核苷酸序列的重叠。同源性水平和相应的重组频率随着增加的同源序列长度及其共有的同一性水平而提高。如本领域已知的，在给定系统中会引起关注的同源性水平可从理论上确定并通过实验确认。然而，通常来说，如果重叠序列小于约25个核苷酸序列(如果其在其整个长度上至少80％相同)，或重叠序列小于约50个核苷酸序列(如果其在其整个长度上至少70％相同)，则重组可以显著降低或消除。当然，甚至更低水平的同源性将进一步降低重组的可能性。显示出，即使在没有任何重叠的同源性的情况下也有一些产生RCA的残余频率。通过将AAV的复制和衣壳化功能“拆分”，甚至可获得产生RCA(例如通过非同源重组)的频率的进一步降低，如Allen et al.,WO 98/27204所述。
rAAV载体构建体和互补包装基因构建体在本公开内容中可以以多种不同形式实施。病毒颗粒、质粒和稳定转化的宿主细胞均可用于将这样的构建体瞬时或稳定地引入包装细胞中。
在本公开内容的某些实施方案中，AAV载体和互补包装基因(如果有的话)以细菌质粒、AAV颗粒或其任意组合的形式提供。在另一些实施方案中，AAV载体序列、包装基因或二者以经遗传改变的(例如可遗传改变的)真核细胞的形式提供。可遗传地改变以表达AAV载体序列、AAV包装基因或二者的宿主细胞的发展提供了以可靠水平表达的材料的确定来源(established source)。
因此，在本公开内容的上下文中可使用多种不同的经遗传改变的细胞。举例来说，哺乳动物宿主细胞可与稳定整合的rAAV载体的至少一个完整拷贝一起使用。包含至少一个与启动子可操作地连接的AAV rep基因的AAV包装质粒可用于提供复制功能(如美国专利No.5,658,776中所述)。或者，具有与启动子可操作地连接的AAV rep基因的稳定哺乳动物细胞系可用于提供复制功能(参见例如Trempe et al.,WO 95/13392)；Burstein et al.(WO 98/23018)；和Johnson et al.(美国专利No.5,656,785)。提供如上所述的衣壳化蛋白的AAV cap基因可与AAV rep基因一起提供或单独提供(参见例如上述申请和专利以及Allen et al.(WO 98/27204)。其他组合是可能的并且包括在本公开内容的范围内。
产生包含AV.TL65衣壳蛋白的rAAV的方法是本领域已知的。参见例如，Excoffonet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(10):3865-3870,2009和美国专利No.10,046,016，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，多核苷酸可包含美国专利申请No.16/082,767(其通过引用整体并入本文)中描述的任意增强子或启动子。
rAAV可包含含有本文所述或本领域已知的任意增强子和/或启动子的多核苷酸。例如，rAAV可包含含有F5增强子和/或tg83启动子的多核苷酸。在一些实施方案中，F5增强子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14的多核苷酸序列，或其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，F5包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，F5增强子包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。在一些实施方案中，tg83启动子包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列或其与SEQ ID NO:2具有至少80％核酸序列同一性的变体。
rAAV可包含任何合适的转基因。在一些实施方案中，转基因是CFTR或其衍生物。在一些实施方案中，CFTR的衍生物是CFTRΔR转基因(例如人CFTRΔR转基因)。在一些实施方案中，人CFTRΔR转基因由包含SEQ ID NO:4的序列或其与SEQ ID NO:4具有至少80％核酸序列同一性的变体的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，多核苷酸在5'至3'方向上包含F5增强子、tg83启动子和CFTRΔR转基因。例如，在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的序列，或其与SEQ IDNO:7具有至少80％核酸序列同一性的变体。
多核苷酸还可在3'方向上包含3'非翻译区(3'-UTR)，该3'非翻译区包含SEQ IDNO:5的序列，或其与SEQ ID NO:5具有至少80％核酸序列同一性的变体。
多核苷酸还可在3'方向上包含合成的多腺苷酸化位点，该位点包含SEQ ID NO:6的序列，或其与SEQ ID NO:6具有至少80％核酸序列同一性的变体。
多核苷酸还可包含一个或更多个ITR，例如在多核苷酸5'末端处的5'腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列(ITR)和在多核苷酸3'末端处的3'AAV ITR。可使用任何合适的5'ITR和/或3'ITR。在一些实施方案中，5'AAV ITR包含SEQ ID NO:15的序列，或其与SEQ IDNO:15具有至少80％核酸序列同一性的变体。在一些实施方案中，3'AAV ITR包含SEQ IDNO:16的序列，或其与SEQ ID NO:16具有至少80％核酸序列同一性的变体。ITR序列可以是回文的，例如如在SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中，其中5'端的ITR序列位于反向链上，而3'端的ITR序列位于正向链上。
在一些实例中，多核苷酸包含：包含SEQ ID NO:15序列的5'AAV ITR、包含SEQ IDNO:14序列的F5增强子(其可包含5'EcoRI位点和3'XhoI位点，如在SEQ ID NO:1中)、包含SEQ ID NO:2序列的tg83启动子、包含SEQ ID NO:3序列的5'UTR、包含SEQ ID NO:4序列的hCFTRΔR转基因、包含SEQ ID NO:5序列的3'UTR、包含SEQ ID NO:6序列的s-pA和包含SEQID NO:16序列的3'AAV ITR。
在一些具体实例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:17的序列，或其与SEQ ID NO:17具有至少80％核酸序列同一性的变体。
rAAV及其药物组合物用于基因治疗的用途
AAV载体可用于向个体施用以用于基因治疗或疫苗接种的目的。rAAV治疗合适的疾病包括但不限于由病毒、细菌或寄生虫感染诱导的疾病、多种恶性和过度增殖性病症、自身免疫性病症和先天性缺陷(例如囊性纤维化)。
可进行基因治疗以增强细胞内或细胞分泌的特定蛋白质的表达水平。本文所述的载体可用于经遗传改变细胞以用于基因标记、替代缺失或有缺陷的基因或者插入治疗性基因。或者，可向细胞提供降低表达水平的多核苷酸。这可用于抑制不期望的表型，例如在恶性过程中扩增或过表达的基因的产物，或在微生物感染过程中引入或过表达的基因。可通过提供治疗性或预防性多核苷酸来降低表达水平，该多核苷酸包含例如能够与靶基因或RNA转录物形成稳定杂交体的序列(反义治疗)，能够作为核酶切割相关mRNA的序列或能够作为靶基因产物的诱饵的序列。
特别令人感兴趣的是通过向气道上皮提供功能适当的囊性纤维化穿膜传导调节蛋白(CFTR)来校正囊性纤维化的遗传缺陷。因此，编码天然CFTR蛋白质及其突变体和片段(例如CFTRΔR)的rAAV载体及其药物组合物都是本公开内容的一些实施方案。
本公开内容提供了药物组合物，其包含(i)rAAV，所述rAAV包含AV.TL65衣壳蛋白以及包含转基因(例如CFTRΔR)的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子。在一些实施方案中，增强因子是蛋白酶体调节剂。在一些实施方案中，蛋白酶体调节剂是蒽环类、蛋白酶体抑制剂、三肽基醛或其组合。在一些实施方案中，蒽环类是多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合。在一些实施方案中，蒽环类是多柔比星、伊达比星或其组合。在一些实施方案中，蛋白酶体抑制剂是硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米。在一些实施方案中，三肽基醛是N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL)。
药物组合物的rAAV可包含含有本文所述或本领域已知的任意增强子和/或启动子的多核苷酸。例如，rAAV可包含含有F5增强子和/或tg83启动子的多核苷酸。在一些实施方案中，F5增强子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。在一些实施方案中，F5包含SEQ ID NO:1的多核苷酸序列。在另一些实施方案中，F5增强子包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列。在一些实施方案中，tg83启动子包含SEQ ID NO:2的多核苷酸序列，或其与SEQID NO:2具有至少80％核酸序列同一性的变体。
rAAV可包含任何合适的转基因。在一些实施方案中，转基因是CFTR或其衍生物。在一些实施方案中，CFTR的衍生物是CFTRΔR转基因(例如人CFTRΔR转基因)。在一些实施方案中，人CFTRΔR转基因由包含SEQ ID NO:4的序列或其与SEQ ID NO:4具有至少80％核酸序列同一性的变体的多核苷酸编码。
在一些实施方案中，多核苷酸在5'至3'方向上包含F5增强子、tg83启动子和CFTRΔR转基因。例如，在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:7的序列，或其与SEQ IDNO:7具有至少80％核酸序列同一性的变体。
多核苷酸还可在3'方向上包含3'-UTR，3'-UTR包含SEQ ID NO:5的序列，或其与SEQ ID NO:5具有至少80％核酸序列同一性的变体。
多核苷酸还可在3'方向上包含合成的多腺苷酸化位点，该位点包含SEQ ID NO:6的序列，或其与SEQ ID NO:6具有至少80％核酸序列同一性的变体。
多核苷酸还可包含一个或更多个ITR，例如，在多核苷酸5'末端处的5'腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列(ITR)和在多核苷酸3'末端处的3'AAV ITR。可以使用任何合适的5’ITR和/或3’ITR。在一些实施方案中，5’AAV ITR包含SEQ ID NO:15的序列。在一些实施方案中，3’AAV ITR包含SEQ ID NO:16的序列，或其与SEQ ID NO:16具有至少80％核酸序列同一性的变体。
在一些实例中，多核苷酸包含：包含SEQ ID NO:15序列的5'AAV ITR、包含SEQ IDNO:14序列的F5增强子(其可包含5'EcoRI位点和3'XhoI位点，如在SEQ ID NO:1中)、包含SEQ ID NO:2序列的tg83启动子、包含SEQ ID NO:3序列的5'UTR、包含SEQ ID NO:4序列的hCFTRΔR转基因、包含SEQ ID NO:5序列的3'UTR、包含SEQ ID NO:6序列的s-pA和包含SEQID NO:16序列的3'AAV ITR。
在一些具体实例中，多核苷酸包含SEQ ID NO:17的序列，或其与SEQ ID NO:17具有至少80％核酸序列同一性的变体。
本文所述的组合物(例如，rAAV、药物组合物和/或增强因子)可在体内使用以及离体使用。体内基因治疗包括将本公开内容的载体直接施用于对象。药物组合物可作为液体溶液剂或混悬剂、作为乳剂或作为适合在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式提供。对于向呼吸道中施用，一种示例性的施用方式是通过气溶胶，使用当与适当的气溶胶化器(aerosolubilizer)装置使用时提供固体或液体气溶胶的组合物。另一些进入呼吸道的施用方式是使用柔性纤维支气管镜来滴注(instill)载体。通常来说，病毒载体在药学上合适的无热原缓冲液中，例如林格平衡盐溶液(pH 7.4)中。虽然不是必需的，但药物组合物可任选地以适合于施用精确量的单位剂型提供。
本文所述的组合物(例如rAAV、药物组合物和/或增强因子)可通过任何合适的途径施用，例如通过吸入、雾化、气溶胶化、鼻内、气管内、支气管内、经口、肠胃外(例如，静脉内、皮下或肌内)、经口、经鼻、经直肠、表面或经颊。它们也可以局部或全身施用。在一些实施方案中，本文所述的组合物使用雾化器喷雾器(例如，具有
Figure BDA0003409437690000241
喉-气管黏膜雾化装置)以气溶胶化颗粒气管内和/或支气管内施用。在一些实施方案中，药物组合物肠胃外施用。在其他一些实施方案中，药物组合物全身施用。载体还可通过生物假体的方式引入，举例来说，生物假体包括血管移植物(PTFE和涤纶)、心脏瓣膜、血管内支架、血管内铺面(intravascular paving)以及其他非血管假体。关于载体溶液的递送、频率、组成和剂量范围的一般技术在本领域技术范围内。
对于通过吸入施用至上(鼻)或下呼吸道，本文所述的组合物(例如，rAAV、药物组合物和/或增强因子)可方便地从吹入器、雾化器(nebulizer)或加压包或其他方便的递送气溶胶喷剂的方式递送。加压包可包含合适的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀以递送计量的量来确定。
或者，对于通过吸入或吹入施用，组合物可以采用干粉的形式，例如药剂和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型形式存在于例如胶囊或筒中或例如明胶或泡罩包装中，粉末可在吸入器、吹入器或计量的剂量吸入器的帮助下从中施用。
对于鼻内施用，药剂可通过滴鼻剂、液体喷剂施用，例如通过塑料瓶雾化器(atomizer)或计量的剂量吸入器施用。典型的雾化器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
本文描述的组合物(例如，rAAV、药物组合物和/或增强因子)的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性以及技术人员已知的其他因素。本文所述的rAAV或药物组合物可在相同或不同部位处施用一次或多次。本公开内容的药剂的施用可在预选的时间段内基本上连续或可以以一系列间隔剂量进行。
本文所述的组合物(例如rAAV、药物组合物和/或增强因子)可与一种或更多种另外的治疗剂组合施用。可使用任何合适的另外的治疗剂，包括CF的标准护理治疗。在一些实施方案中，所述一种或更多种另外的治疗剂包括抗生素(例如，阿奇霉素(azithromycin)
Figure BDA0003409437690000251
阿莫西林(amoxicillin)和克拉维酸(clavulanic acid)
Figure BDA0003409437690000252
氯唑西林(cloxacillin)和双氯西林(diclocacillin)、替卡西林(ticarcillin)和克拉维酸
Figure BDA0003409437690000253
头孢氨苄(cephalexin)、头孢地尼(cefdinir)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)；磺胺甲
Figure BDA0003409437690000254
唑(sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim)
Figure BDA0003409437690000255
红霉素(erythromycin)/磺胺异
Figure BDA0003409437690000256
唑(sulfisoxazole)、红霉素、克拉霉素(clarithromycin)、四环素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、替加环素(tigecycline)、万古霉素(vancomycin)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meripenem)、多黏菌素E甲磺酸(Colismtimethate)/
Figure BDA0003409437690000257
利奈唑胺(linezolid)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)或其组合)，黏液稀释剂(例如高张盐水或阿法链道酶(dornase alfa)
Figure BDA0003409437690000258
)、CFTR调节物(例如依伐卡托(ivacaftor)
Figure BDA0003409437690000259
鲁玛卡托(lumacaftor)、鲁玛卡托/依伐卡托
Figure BDA00034094376900002510
替扎卡托(tezacaftor)/依伐卡托
Figure BDA00034094376900002511
或
Figure BDA00034094376900002512
(拉卡托(elexacaftor)/依伐卡托/替扎卡托))、黏液溶解剂(例如乙酰半胱氨酸、氨溴索、溴己新、羧甲司坦、厄多司坦(erdosteine)、美司坦和阿法链道酶)、免疫抑制剂、生理盐水、高张盐水或其组合。
例如，本文所述的任何一种组合物(例如，rAAV、药物组合物和/或增强因子)可与一种或更多种免疫抑制剂组合施用。可使用任何合适的免疫抑制剂。例如，免疫抑制剂的非限制性实例包括皮质类固醇(例如吸入皮质类固醇(例如倍氯米松(beclomethasone)
Figure BDA0003409437690000261
布地奈德(budesonide)
Figure BDA0003409437690000262
布地奈德/福莫特罗(formoterol)
Figure BDA0003409437690000263
环索奈德(ciclesonide)
Figure BDA0003409437690000264
氟替卡松(fluticasone)(FLOVENT
Figure BDA0003409437690000265
)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)(FLOVENT
Figure BDA0003409437690000266
)、糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)(ARNUITY
Figure BDA0003409437690000267
)、丙酸氟替卡松/沙美特罗(salmeterol)
Figure BDA0003409437690000268
糠酸氟替卡松/芜地溴铵(umeclidinium)/维兰特罗(vilanterol)(TRELEGY
Figure BDA0003409437690000269
)、糠酸莫米松(mometasone furoate)
Figure BDA00034094376900002610
或莫米松(mometasone)/福莫特罗
Figure BDA00034094376900002611
泼尼松(predisone)或甲基泼尼松龙(methylprednisone))、多克隆抗淋巴细胞抗体(例如抗淋巴细胞球蛋白(anti-lymphocyte globulin，ALG)和抗胸腺细胞球蛋白(anti-thymocyteglobulin，ATG)抗体，其可以是例如马或兔来源的)、单克隆抗淋巴细胞抗体(例如抗CD3抗体(例如莫罗单抗(murmomab)和阿仑单抗)或抗CD20抗体(例如利妥昔单抗))、白介素2(interleukin-2，IL-2)受体拮抗剂(例如达利珠单抗和巴利昔单抗)、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢素A和他克莫司(tacrolimus))、细胞周期抑制剂(例如硫唑嘌呤、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)和霉酚酸(mycophenolic acid，MPA))、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制剂(例如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素)和依维莫司(everolimus))、氨甲蝶呤、环磷酰胺、蒽环类(例如多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合)、紫杉烷(例如，
Figure BDA00034094376900002612
(紫杉醇))及其组合(例如钙调磷酸酶抑制剂、细胞周期抑制剂和皮质类固醇的组合)。
在一些具体实施方案中，本文所述的任何一种组合物(例如rAAV、药物组合物和/或增强因子)可以与一种或更多种皮质类固醇(例如，吸入皮质类固醇(例如倍氯米松
Figure BDA00034094376900002613
布地奈德
Figure BDA00034094376900002614
布地奈德/福莫特罗
Figure BDA00034094376900002615
环索奈德
Figure BDA00034094376900002616
氟替卡松(FLOVENT
Figure BDA00034094376900002617
)、丙酸氟替卡松(FLOVENT
Figure BDA00034094376900002618
)、糠酸氟替卡松(ARNUITY
Figure BDA00034094376900002619
)、丙酸氟替卡松/沙美特罗
Figure BDA00034094376900002620
糠酸氟替卡松/芜地溴铵/维兰特罗(TRELEGY
Figure BDA00034094376900002621
)、糠酸莫米松
Figure BDA00034094376900002622
或莫米松/福莫特罗
Figure BDA00034094376900002623
泼尼松或甲基泼尼松龙)组合施用。
免疫抑制剂(例如，本文所述的任何免疫抑制剂)可通过吸入施用或全身(例如静脉内或皮下)施用。
本文所述的组合物(例如，rAAV、药物组合物和/或增强因子)可单独或与可药用载体组合施用于哺乳动物。如上所述，活性成分和载体的相对比例由化合物的溶解度和化学性质、所选择的施用途径和标准药物实践确定。
本发明组合物的剂量将随着施用形式、所选择的特定化合物和接受治疗的特定患者的生理特征而变化。可期望利用最低有效病毒浓度以降低不期望的作用(例如毒性)的风险。
增强因子
如本文所述，包含AV.TL65衣壳蛋白的rAAV可与AAV转导的增强因子组合使用，以实现转基因转导和/或表达的显著提高。可使用任何合适的增强因子。例如，美国专利No.7,749,491描述了合适的增强因子，该专利通过引用整体并入本文。增强因子可以是蛋白酶体调节剂。蛋白酶体调节剂可以是蒽环类(例如多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星或米托蒽醌)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米)、三肽基醛(例如N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL))，或其组合。在一些实施方案中，增强因子是多柔比星。在另一些实施方案中，增强因子是伊达比星。
rAAV和增强因子可以在同一组合物或不同组合物(例如药物组合物)中与细胞接触，或施用于对象。rAAV和增强因子的接触或施用可以依次(例如rAAV之后是增强因子，反之亦然)或同时进行。
实施例
通过参考以下实施例将更充分地理解本公开内容。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于举例说明性目的，并且本领域技术人员根据其将想到多种修改或变化，并且这些修改或变化将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围之内。
实施例1：将AAV-CFTR递送至来自囊性纤维化患者的支气管上皮细胞增强氯离子电导(conductance)的功能恢复
囊性纤维化(CF)是危及生命的常染色体隐性疾病，其由编码囊性纤维化穿膜传导调节蛋白(CFTR)的基因中的突变引起，CFTR是引导氯离子和碳酸氢根离子穿过上皮细胞膜的通道。受损的CFTR功能导致气道炎症和进行性支气管扩张。由于CF的单基因病因学和患者群体中的多种CFTR突变，基因治疗可能为CF提供普遍的治愈。目前，CF的标准护理尝试使用调节物调节有缺陷的CFTR的活性，调节物例如鲁玛卡托/VX-809(通道校正剂)、依伐卡托/VX-770(通道增强剂)
Figure BDA0003409437690000281
(药物的组合)，或
Figure BDA0003409437690000282
(拉卡托/依伐卡托/替扎卡托)。虽然这些方法很有前景，但它们受限于它们对于仅已知CFTR突变的子集的特异性。
我们已经产生了新AAV载体，其特征是高效转导人顶端膜中的气道上皮的衣壳。具体来说，我们使用AV.TL65-SP183-CFTRΔR来递送R域部分缺失的CFTR微小基因和AV.TL65萤光素酶mCherry(双报道载体)来表达萤光素酶和荧光mCherry蛋白质。AV.TL65-SP183-CFTRΔRrAAV载体包含含有以下的多核苷酸：包含SEQ ID NO:15序列的5'AAV ITR、包含SEQID NO:14序列的F5增强子(其可包含5'EcoRI位点和3'XhoI位点，如在SEQ ID NO:1中)、包含SEQ ID NO:2序列的tg83启动子、包含SEQ ID NO:3序列的5'UTR、包含SEQ ID NO:4序列的hCFTRΔR微小基因、包含SEQ ID NO:5序列的3'UTR、包含SEQ ID NO:6序列的s-pA和包含SEQ ID NO:16序列的3'AAV ITR。例如，经包装的多核苷酸可包含SEQ ID NO:17的序列。我们还利用小分子增强因子(蛋白酶体抑制剂)通过刺激病毒转基因的内体加工和核运输来显著增强重组AAV转导。我们已经表明，与没有蛋白酶体抑制剂的AV.TL65萤光素酶mCherry相比，将AV.TL65萤光素酶mCherry与多柔比星或伊达比星组合提供了来自5个独立CF(纯合dF508/dF508 CFTR)和非CF供体的气-液界面(ALI)人支气管上皮(HBE)培养物的萤光素酶表达无毒性增强超过600倍。在另一个实验中，与没有蛋白酶体抑制剂的AAV相比，多柔比星和伊达比星+AV.TL65-gLuc-mCherry将AAV的转导提高了超过200倍(图1A，虚线)。与没有蛋白酶体抑制剂的AAV相比，添加至AV.TL65-gLuc-mCherry的多柔比星而非伊达比星具有低于150％的LDH(毒性)活性(图1B；虚线)。使用多柔比星和伊达比星，第0代(P0)细胞的转导效率提高了200倍以上，其中多柔比星的LDH<1.5×基线并且伊达比星的LDH>1.5×基线。
我们还表明，当与多柔比星或伊达比星配对时AV.TL65-SP183-CFTRΔR产生了来自6个独立CF供体的ALI HBE培养物中经毛喉素刺激的、经CFTR介导的氯离子转运的平均校正，其是6个独立的非CF供体的最少104％。此外，我们已经表明，在来自两个独立HBE CF细胞供体系的ALI HBE培养物中，经毛喉素刺激电流的这种互补作用(complementation)是标准护理治疗药物鲁玛卡托和依伐卡托的高至四倍。总之，我们开发了使用AAV病毒载体来增强CFTR表达以校正来自CF患者的HBE细胞中的氯离子通道缺陷的方法。
序列表
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实施例2：向雪貂肺重复给药AV.TL65引发以年龄依赖性方式减弱转导的抗体应答
使用基因治疗治疗囊性纤维化(CF)肺疾病可必需重复给药重组腺相关病毒(rAAV)。然而，对rAAV介导的肺免疫应答知之甚少。在这里，我们表明雪貂是用于临床前测试AV.TL65将CFTR递送至肺并表征中和抗体(NAb)应答的合适物种。AV.TL65-hCFTRΔR有效转导人和雪貂二者的气道上皮培养物，并补充CF气道培养物中的CFTR Cl–电流。将AV.TL65-hCFTRΔR递送至新生和幼年雪貂肺产生的hCFTR mRNA水平是内源性fCFTR水平的200至300％高。在新生和幼年雪貂中进行AV.TL65的单剂量(AV.TL65-gLuc)或重复给药(AV.TL65-fCFTRΔR随后是AV.TL65-gLuc)。尽管两个年龄组的血浆NAb应答接近等同，但重复给药在幼年雪貂中显著降低了转基因表达(11倍)并提高了支气管肺泡灌洗液(BALF)Nab，而在新生雪貂中则没有。值得注意的是，在重复给药之后，两个年龄组都表现出BALF抗衣壳结合IgG、IgM和IgA抗体的减少。幼年雪貂的独特之处在于在第二次载体施用之后血浆抗衣壳结合IgM的抑制。因此，年龄依赖性免疫系统成熟和同种型转换可影响AV.TL65重复给药之后高亲和力肺NAb的发展，并可为肺中钝性AAV中和反应提供途径。
如下更详细地进行以上结果。
结果
雪貂是用于评价对肺的AV.TL65基因治疗的合适的临床前物种
为了评价AV.TL65(AV2.5T)衣壳变体是否能够补充气道中的CFTR功能，我们测试了在顶端感染之后AV.TL65-SP183-hCFTRΔR病毒校正人CF ALI培养物中CFTR介导的Cl-电流的能力。由于rAAV1先前已被证明是人ALI培养物顶端转导的最佳血清型之一，因此我们还将相同的AV2-F5tg83-hCFTRΔR病毒基因组假包装到AAV1衣壳中，并与AV.TL65进行了比较分析。该比较表明，与用携带相同基因组(AV1.SP183-hCFTRΔR)的rAAV1病毒感染之后相比，AV.TL65-SP183-hCFTRΔR病毒的顶端感染产生更高水平的CFTR介导的Cl-电流(图3A)和CFTR mRNA(图3B)。
为了评价AV.TL65是否也能够转导雪貂气道上皮，我们首先使用分泌的高斯萤光素酶(gLuc)报道载体AV.TL65-SP183gLuc在来源于人和雪貂的分化良好的气管支气管ALI培养物中进行体外转导测定(图3C)。用AV.TL65-SP183gLuc对这些培养物的顶端感染表明两个物种之间的gLuc转基因表达水平没有显著差异。为了确认在体内AV.TL65对雪貂肺的向性，我们评价了在气管内递送之后AV.TL65-SP183-hCFTRΔR在新生和幼年雪貂中的转导效率。在这些研究中，将转基因来源的hCFTRΔR mRNA的表达以内源性fCFTR mRNA为参照作为转导效率的指标(即hCFTRΔR/fCFTR mRNA拷贝的比率)。使用该度量，在新生和幼年雪貂二者中，肺中的hCFTRΔR mRNA表达是内源性fCFTR mRNA的2至3倍高(图3D)。相比之下，hCFTRΔRmRNA的气管表达在新生动物中低于内源性fCFTR mRNA，并且在幼年动物中接近等同。用AV.TL65气管的转导新生动物低且幼年动物高度可变可能是由于递送方法造成，该方法使用手术将病毒滴注到气管中部。总体而言，这些体外和体内研究表明，雪貂是研究肺对AV.TL65感染中的免疫学应答的合适物种。
先前将AV.TL65暴露于幼年雪貂但不是新生雪貂的肺损害第二次施用的转导
我们利用两种rAAV载体(AV.TL65-SP183-fCFTRΔR和AV.TL65-SP183-gLuc)来评价对雪貂肺重复给药AV.TL65的可行性。选择AV.TL65-SP183-fCFTRΔR用于第一次病毒感染，因为该载体不应对转基因(即雪貂CFTR或fCFTR)产生(mount)免疫应答。对于第二次病毒感染，我们想要允许对转基因表达进行时序和定量分析的稳健的报道子，并因此选择了分泌型gLuc报道基因载体AV.TL65-SP183-gLuc。将单剂量组中的雪貂仅用AV.TL65-SP183-gLuc载体感染，并将重复剂量组的雪貂首先用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR感染，然后用AV.TL65-SP183-gLuc感染。我们首先评价了较年轻动物的重复给药(图4)。我们在新生雪貂中开始了这些研究，这些新生雪貂在1周龄时用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR感染重复剂量组，并随后在三周之后用AV.TL65-SP183-gLuc病毒感染重复剂量和单剂量(原初)组二者(图4A)。在感染AV.TL65-SP183-gLuc之后14天期间监测血液样品中萤光素酶活性，并在实验结束时监测BALF中的萤光素酶活性。来自该研究的发现表明，在两个给药组中血浆中的gLuc活性在感染之后5天达到峰值，并保持稳定至14天(图4B)。两个给药组之间的血浆gLuc活性水平也没有显著差异。类似地，两个给药组之间感染之后14天BALF中的gLuc活性也没有显著差异(图4C)。在血浆和BALF二者中，gLuc活性远高于原初(未感染)对照中的背景水平(图4B和4C)。
这项对新生雪貂的研究表明，重复施用AV.TL65是可行的，没有显著降低对肺的转导；然而，仍然存在新生雪貂中发育不足的免疫系统可产生针对AAV衣壳的耐受免疫状态的可能性。由于这些原因，我们通过以下在幼年雪貂中重复实验：在1月龄时(大约代表1至2岁的学步儿)用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR对重复剂量组开始第一次感染，随后在4周之后将gLuc报道载体(AV.TL65-SP183-gLuc)递送至单剂量组和重复剂量组二者(图5A)。来自该第二项研究的发现表明，两组在感染之后5天的血浆gLuc活性最大，然而，重复剂量组在所有测试时间点的血浆gLuc活性都较低(15至34倍)。与单剂量和重复剂量新生组中稳定的血浆gLuc表达(图4B)相反，我们观察到两个幼年组的血浆gLuc活性逐渐下降，重复剂量动物的趋势更急剧。(图5B)。同样地，在重复剂量幼年组中BALF gLuc活性也显著降低(11倍)(图5C)。累积起来，这些研究表明了在幼年而不是新生雪貂中NAb针对AAV衣壳应答的潜力。
AV.TL65的重复给药在BALF和血浆中引起更高的NAb应答
鉴于在先前暴露于该病毒的幼年雪貂肺中AV.TL65转导的效率降低，我们试图评价测试动物的BALF和血浆中的NAb。将抗AV.TL65 NAb的滴度确定为抑制A594细胞(人气道细胞系)中AV.TL65-SP183-fLuc转导的IC50。与单次给药和重复给药的新生雪貂中转基因表达水平相似一致，在两种给药条件之间BALF中的NAb滴度没有显著差异(图6A)。相比之下，在重复剂量组中幼年雪貂BALF中的NAb滴度与单剂量组相比显著更高(图6B)。此外，在单剂量组和重复剂量组二者的较年长动物的实验中，NAb的绝对滴度比新生测试组高(3至5倍)，表明较年长雪貂中的免疫应答发展得更充分。
对血浆样品的类似分析表明，在对照原初组(图6C和D)和AV.TL65感染之前的测试组中没有预先存在的NAb。在两个年龄组中，单剂量和重复剂量动物在感染之后表现出血浆NAb滴度逐渐的时间依赖性增加，并且重复剂量的幼年雪貂产生的血浆NAb滴度略微高于(2至2.8倍)新生雪貂。幼年雪貂在单剂量感染之后在血浆中也更快地产生NAb，在感染之后5天出现NAb，而与之相比新生雪貂在感染之后10天出现NAb。除了幼年雪貂感染之后14天的时间点外，两个年龄重复剂量组中的血浆NAb水平也显著高于单剂量组的血浆NAb水平。
用于量化抗AV.TL65衣壳抗体同种型的基于ELISA的测定的开发
从AAV2/AAV5衣壳改组文库进化而来，VP2和AV.TL65的最丰富的VP3衣壳蛋白来源于AAV5，在VP1中具有单个A581T突变。AV.TL65的VP1是AAV2和AAV5衣壳的杂交体，其N端独特序列(VP1u)来自AAV2 VP1的1至131aa，随后是带有A581T突变的AAV5衣壳的128至724aa。AAV的VP1u包含磷脂酶A2(PLA2)催化结构域，该结构域被认为对病毒体从内体逃逸至关重要。为了评价经AV.TL65感染雪貂的血浆和BALF中的AV.TL65衣壳特异性免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)，开发了使用AAV病毒颗粒作为包被抗原的ELISA测定。为了验证该方法，我们使用了从1月龄雪貂收集的血浆，对于该雪貂，AV.TL65病毒以1至2个月的间隔被递送至肺四次。使用AAV5颗粒作为包被抗原，见到原初血浆和AV.TL65免疫血浆之间的差异IgG结合从1:50稀释开始，，并且至1:1250稀释时，原初血浆结合不存在，而AV.TL65免疫血浆抗体结合仍然很高(图7A)。相比之下，当将AAV2用作包被抗原时，在所有稀释度下免疫血浆和原初血浆之间的血浆IgG结合没有差异，并且检测IgG的灵敏度比AAV5要低得多(图7B)。这些发现表明，AV.TL65的表面抗原表位显示出与AAV5衣壳相似的免疫原性，并且出于这些原因我们选择使用AAV5作为包被抗原以用于对测试动物的BALF和血浆中的抗衣壳抗体同种型进行分类。
我们接下来使用这种ELISA方法对测试动物的BALF和血浆中的抗衣壳抗体同种型(IgG、IgM和IgA)进行分类(图7和8)。一般而言，新生和幼年雪貂在单次和重复给药组二者的血浆中引发相似的AAV5反应性IgG应答，但重复感染之后滴度更高(图8A和8D)。相比之下，考虑到动物年龄和给药方案，血浆AAV5反应性IgM(图8B和8E)和IgA(图8C和F)应答表明与IgG应答存在差异。例如，衣壳结合血浆IgM水平仅在重复剂量组的幼年动物中受到抑制(图8B和8E)，而衣壳结合血浆IgA水平在重复给药之后在两个年龄组中均受到抑制。此外，新生动物最初在第二次病毒暴露之后最初产生大的抗衣壳IgA应答，其随时间减弱，而幼年动物则缺少这种应答(图8C和8F)。这些发现表明，抗体同种型转换的年龄依赖性差异可能受到先前暴露于AV.TL65的影响。与预期相反，对于新生和幼年动物二者，与重复剂量组相比，在单剂量组中BALF中的AAV5反应性IgG、IgM和IgA显著较高(图9)。此外，尽管两次暴露于病毒的幼年动物的BALF中NAb水平较高，但衣壳结合IgG、IgM和IgA的绝对水平在两个年龄组和给药条件之间一般相似(图6A和6B)。
材料和方法
重组AV.TL65病毒载体的产生
pAV.TL65repcap(Excoffon et al.,2009,同上)是AAV辅助质粒，其用于产生用于产生AV1-SP183-hCFTRΔR和AV.TL65-SP183-hCFTRΔR、AV.TL65-SP183-fCFTRΔR、AV.TL65-SP183-fLuc、AV.TL65-SP183-gLuc的AV.TL65衣壳。用于包装的rAAV前病毒质粒是pAV2.F5tg83-hCFTRΔR和pAV2.F5tg83-fCFTRΔR，以及pAV2-F5tg83fLuc(萤火虫萤光素酶报道子)和pAV2-F5tg83gLuc(高斯萤光素酶报道子)。AV.TL65载体是在费城儿童医院(Children's Hospital of Philadelphia，CHOP)的Vector Core中使用三质粒转染方法产生的。简而言之，将AAV辅助pAV.TL65repcap和腺病毒辅助pAd与AAV前病毒载体中的一种一起转染到HEK293细胞中。将从经转染的HEK293细胞产生的rAAV载体在CsCl密度梯度上进行纯化。使用对转基因具有特异性的引物和探针通过定量实时聚合酶链反应(quantitativereal-time polymerase chain reaction，qPCR)确定滴度，并通过银染之后进行SDS-PAGE来评价载体储备的纯度。
AV.TL65载体在人和雪貂气道上皮中的体外评价
为了评价雪貂是否是用于分析AV.TL65的合适物种，我们最初在来源于人和雪貂的分化良好的气管支气管ALI培养物中进行了体外转导实验。将报道载体AV.TL65-SP183gLuc以10,000个DRP(DNA酶抗性颗粒)/细胞的MOI(感染复数)顶端接种到人(n＝6个来自两个供体的transwell)和雪貂(n＝6个来自两个供体的transwell)的气道上皮ALI培养物上。在感染期期间，在培养基中补充多柔比星，最终浓度为4μM，并在感染5天之后根据Renilla萤光素酶活性测定试剂盒(Promega)的制造商说明测量高斯萤光素酶活性的相对发光单位(RLU)，该试剂盒设计成用于测量高斯萤光素酶和Renilla萤光素酶。两个未感染的transwell被设定为对照。
用AV1-SP183-hCFTRΔR和AV.TL65-SP183-hCFTRΔR病毒感染人CF气道上皮之后CFTR介导的电流的体外比较
在来源于CF患者(F508del/F508del)近气道的极化的人ALI培养物中评价了AV.TL65-SP183-hCFTRΔR和AV1-SP183-hCFTRΔR表达hCFTRΔR和CFTR功能互补的有效性。在存在多柔比星(2.5μM)和LLnL(20μM)的情况下，将每种载体以100,000个DRP/细胞的MOI顶端施加至ALI培养物(n＝4个来自两个供体的transwell)。这两种蛋白酶体调节剂已显示增强数种AAV血清型的转导。在感染之后12天，如前所述在Ussing室中测量CFTR介导的Cl–电流以确定在cAMP刺激(IBMX/毛喉素)和CFTR抑制(GlyH101)之后短路电流的变化(ΔIsc)。将未感染的ALI培养物(n＝4个来自两个供体的transwell)用作基线对照。在测量ΔIsc之后，将来自每个病毒感染组的两个插入片段合并并使用
Figure BDA0003409437690000501
Plus Mini试剂盒(Qiagene)裂解总RNA。将mRNA转化为cDNA之后，将载体来源的hCFTRΔR mRNA通过
Figure BDA0003409437690000502
PCR进行定量，并相对于人GAPDH mRNA进行归一化。
新生和幼年雪貂肺中AV.TL65转导分析
使三日龄新生雪貂(n＝3)或一月龄幼年雪貂(n＝3)气管内接受4×1010个DRP/克体重的与多柔比星(终浓度250μM)混合的AV.TL65-SP183-hCFTRΔR病毒。将模拟感染组中的雪貂(n＝3)仅用PBS中的Dox(250μM)接种。在感染之后11天时对动物实施安乐死，分开收获气管和肺组织，快速冷冻并粉碎用于提取总RNA。将转基因hCFTRΔR和内源性fCFTR的载体来源的mRNA通过
Figure BDA0003409437690000503
进行量化，并将hCFTRΔR和fCFTRΔR的拷贝数相对于GAPDH进行归一化，并随后表示为hCFTRΔR/fCFTR的比率。
向雪貂施用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR和/或AV.TL65-SP183-gLuc用于体液应答研究
我们使用以下实验设计评价了向新生和幼年雪貂重复给药AV.TL65载体。新生雪貂：将AV.TL65-SP183-gLuc报道载体气管内施用至对AV.TL65衣壳未免疫(naive)或先前在1周龄时用AV.TL65-SP183-fCFTΔR感染的4周龄雪貂。幼年雪貂：将AV.TL65-SP183-gLuc报道载体气管内施用至对AV.TL65衣壳未免疫或先前在4周龄时用AV.TL65-SP183-fCFTRΔR感染的8周龄雪貂。对于每个剂量，动物接受包含AV.TL65-SP183gLuc或AV.TL65-SP183-fCFTRΔR载体(1x 1013个DRP/kg)和多柔比星(200μM终浓度)的接种物。在用异氟烷和氧气的混合物进行麻醉下，在1周龄新生雪貂中进行外科气管内注射，向试剂盒施用150μl接种物。对于其他年龄，在通过皮下注射氯胺酮与甲苯噻嗪的混合物的麻醉下使用
Figure BDA0003409437690000511
气溶胶化器气管内施用病毒。将用于气溶胶化的载体/多柔比星接种物的体积相对于雪貂体重进行归一化(5ml/kg)。
用于测量高斯萤光素酶活性的出血和支气管肺泡灌洗液收集
在AV.TL65-SP183-gLuc报道载体递送之后0、5、10和14天时，将来自麻醉的雪貂血浆收集到肝素化管中。将动物用
Figure BDA0003409437690000512
(Virbac AH Inc)实施安乐死，并通过滴注5ml PBS/300克体重从气管/肺盒收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。在样品收集之后立即测量血浆和BALF中的gLuc活性。
使用血浆和BALF进行抗体中和测定
使用对先前报道的方法(Wu et al.Front Immunol.8:1649,2017)的修改进行微中和测定。将血浆和BALF中NAb的滴度量化为感染之前与连续稀释的血浆或BALF一起孵育的AV.TL65-SP183-fLuc病毒感染A549细胞之后报道基因表达的降低。简而言之，将来自雪貂的所有血浆样品都进行热灭活(56℃，30分钟)。将血浆的五倍连续稀释液(以1:50开始并且以1:156,250结束)与AV.TL65-SP183-fLuc一起孵育，总体积为100μl。对于BALF，施加相同的条件，但连续稀释液以1:5开始并且以1:3125结束。将这些混合物在37℃下孵育1小时以促进抗体结合和中和，并随后将其施加至48孔板中的A549细胞单层(1×105/孔，MOI＝5000个DRP/细胞)，对于每种稀释度一式两份。在将细胞与病毒混合物在37℃/5％CO2下孵育1小时之后，向孔中补充包含2％胎牛血清的DMEM，并孵育另外24小时。然后用萤火虫萤光素酶测定试剂盒(Promega)根据制造商的说明测量细胞裂解物中的萤火虫萤光素酶活性。每次进行该测定时，将仅用AV.TL65-SP183-fLuc感染的A549细胞用作100％转导的参考对照。将每个血浆或BALF样品的中和滴度计算为半数最大抑制浓度(IC50)。
血浆和BALF中衣壳结合IgG、IgM和IgA的ELISA测量
使用ELISA程序捕获和量化血浆和BALF中的总衣壳结合IgG、IgM和IgA。简而言之，将碳酸盐缓冲液中的rAAV5在4℃下与96孔ELISA板结合过夜(1×109个DRP/孔)。将受试血浆样品(IgG和IgM稀释至1:2000，并且IgA稀释至1:20)和未经稀释的BALF样品施加至每个孔，并在室温下孵育1小时。在PBS-T(0.05％吐温20)中洗涤3次之后，添加经稀释的HRP缀合的二抗并在室温下孵育1小时。HRP缀合的二抗包括鸡抗雪貂IgG(Gallus Immunotech或Abcam)和山羊抗雪貂IgM或IgA(Life-Bio Inc)。然后通过读板仪中的吸光度对HRP反应产物进行量化。
统计学分析
实验数据表示为平均值±SD，并且使用Prism7(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,CA,USA)进行数据分析。用单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)随后用Tukey检验分析统计学显著性(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，****P<0.0001)。
动物护理中的道德声明
所有动物实验均根据爱荷华大学机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committees of the University of Iowa)批准的协议进行。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。虽然在前述的说明书中已经结合本发明的一些实施方案描述了本发明，并且出于举例说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说明显的是，本发明易于有另外的实施方案并且在不脱离本发明基本原理的情况下，可对本文中的某些细节作出相当大的变化。

Claims (28)

1.在细胞中表达转基因的方法，所述方法包括使所述细胞与以下接触：(i)重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AV.TL65衣壳蛋白或其变体以及包含转基因的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子，从而在所述细胞中表达所述转基因。
2.权利要求1所述的方法，其中所述增强因子是蛋白酶体调节剂。
3.权利要求2所述的方法，其中所述蛋白酶体调节剂是蒽环类、蛋白酶体抑制剂、三肽基醛或其组合。
4.权利要求3所述的方法，其中所述蒽环类包括多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合。
5.权利要求4所述的方法，其中所述蒽环类是多柔比星、伊达比星或其组合。
6.权利要求3所述的方法，其中所述蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米、卡非佐米或伊沙佐米。
7.权利要求3所述的方法，其中所述三肽基醛是N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL)。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中使所述细胞依次与所述rAAV和所述增强因子接触。
9.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中使所述细胞同时与所述rAAV和所述增强因子接触。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中与使所述细胞仅与所述rAAV接触相比，使所述细胞与所述rAAV和所述增强因子接触实现所述转基因的表达提高。
11.权利要求10所述的方法，其中所述表达提高为约100％、约200％、约300％、约400％、约500％、约600％或更高。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述接触包括向对象施用所述rAAV和所述增强因子。
13.在有此需要的对象中治疗病症的方法，所述方法包括向所述对象施用(i)重组腺相关病毒(rAAV)，其包含AV.TL65衣壳蛋白或其变体以及包含治疗性转基因的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子，其中所述施用实现所述转基因在所述对象的细胞中表达。
14.权利要求12或13所述的方法，其中所述施用通过吸入、通过雾化或通过气溶胶化进行，或者所述施用为鼻内、气管内、支气管内、经口、静脉内、皮下和/或肌内施用。
15.权利要求14所述的方法，其中所述施用通过吸入、通过雾化或通过气溶胶化进行，或者所述施用为鼻内、气管内和/或支气管内施用。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述细胞是气道上皮细胞。
17.权利要求16所述的方法，其中所述气道上皮细胞是肺上皮细胞。
18.权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述病症是囊性纤维化。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述转基因是CFTR或其衍生物。
20.权利要求19所述的方法，其中CFTR的所述衍生物是CFTRΔR转基因。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述AV.TL65衣壳蛋白包含以下氨基酸序列：
Figure FDA0003409437680000021
22.药物组合物，其包含(i)rAAV，所述rAAV包含AV.TL65衣壳蛋白或其变体以及包含转基因的多核苷酸；和(ii)AAV转导的增强因子。
23.权利要求22所述的药物组合物，其中所述增强因子是蛋白酶体调节剂。
24.权利要求23所述的药物组合物，其中所述蛋白酶体调节剂是蒽环类、蛋白酶体抑制剂、三肽基醛或其组合。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述蒽环类包括多柔比星、伊达比星、阿柔比星、柔红霉素、表柔比星、戊柔比星、米托蒽醌或其组合。
26.权利要求25所述的药物组合物，其中所述蒽环类是多柔比星、伊达比星或其组合。
27.权利要求24所述的药物组合物，其中所述蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米、卡非佐米或伊沙佐米。
28.权利要求24所述的药物组合物，其中所述三肽基醛是N-乙酰基-l-亮氨酰-l-亮氨酰-l-正亮氨酸(LLnL)。
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