JP2022529470A - 導入遺伝子発現のための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたR43HL137583の下での政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)を使用した遺伝子治療は、単一遺伝子欠損の治療を含む、新たな治療法である。嚢胞性線維症(CF)は、米国だけで少なくとも30,000人、世界中で少なくとも70,000人が罹患している致命的な常染色体劣性疾患である。CF患者の平均生存年齢は約40歳である。CFは、上皮細胞膜を通して塩化物及び重炭酸イオンを伝導するチャネルである嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる。CFTR機能の障害は、気道の炎症と進行性の気管支拡張症を引き起こす。CFは単一遺伝子病因であり、患者集団において様々なCFTR突然変異があるため、遺伝子治療は潜在的にCFの普遍的な治療法を提供する。
いくつかの実施形態において、プロテアソーム調節剤は、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、トリペプチジルアルデヒド、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びイキサゾミブである。
いくつかの実施形態において、細胞は、rAAV及び増強剤と順番に接触する。
いくつかの実施形態において、細胞をrAAV及び増強剤と接触させることは、細胞をrAAVのみと接触させることと比較して、導入遺伝子の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、発現の増加は、約100%、約200%、約300%、約400%、約500%、約600%、又はそれ以上である。
別の態様において、本開示は、それを必要とする対象の障害を治療する方法を特徴とし、この方法は、対象に(i)AV.TL65カプシドタンパク質及び治療用導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV);及び(ii)AAV形質導入の増強剤を投与することを含み、前記投与が対象の細胞における導入遺伝子の発現をもたらす。
いくつかの実施形態において、投与は、吸入、噴霧化、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、及び/又は気管支内によるものである。いくつかの実施形態において、細胞は気道細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は気道上皮細胞である。いくつかの実施形態において、気道上皮細胞は肺上皮細胞である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、F5エンハンサー及び/又はtg83プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、F5エンハンサーは、配列番号1又は配列番号14のポリヌクレオチド配列、あるいは配列番号1又は配列番号14に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、F5は配列番号1のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、F5エンハンサーは、配列番号14のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、tg83プロモーターは配列番号2のポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、CFTRの誘導体は、CFTRΔR導入遺伝子(例えば、ヒトCFTRΔR導入遺伝子)である。いくつかの実施形態において、ヒトCFTRΔR導入遺伝子は、配列番号4の配列、又は配列番号4に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含むポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号7の配列、又は配列番号7に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有するそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、AV.TL65カプシドタンパク質は、
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のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、プロテアソーム調節剤は、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、トリペプチジルアルデヒド、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、トリペプチジルアルデヒドはN-アセチル-l-ロイシル-l-ロイシル-l-ノルロイシン(LLnL)である。
AV.TL65カプシドタンパク質は、他のAAV血清型と比較して、気道上皮細胞の頂端形質導入に大幅な増強をもたらす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるExcoffon et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(10):3865-3870,2009に記載されているように、このカプシドタンパク質は、AAV2、AAV5、又はAAV9カプシドタンパク質で型決定されたrAAVと比較して、レポーター導入遺伝子ルシフェラーゼの発現において少なくとも10~100倍の改善を与える。本開示は、少なくとも部分的に、AV.TL65カプシドタンパク質で血清型決定されたrAAVベクターによって運ばれる導入遺伝子の形質導入及び/又は発現が、本明細書に記載されるような1つ又は複数の増強剤と組み合わせて使用することにより、最小限の毒性でさらに大幅に改善できるという予期せぬ発見に基づいている。例えば、実施例1に記載するように、AV.TL65ルシフェラーゼ-mCherryをドキソルビシンやイダルビシンなどの増強剤と組み合わせると、増強剤なしのAV.TL65ルシフェラーゼ-mCherryと比較して、600倍を超える気液界面(ALI)ヒト気管支上皮(HBE)培養物のルシフェラーゼ発現の非毒性の増強がもたらされた。したがって、本明細書に記載の方法は、AV.TL65カプシドタンパク質を含むrAAVからの導入遺伝子の高効率の形質導入及び発現を可能にし、例えば、嚢胞性線維症などの障害を治療する改善された方法での使用を見出す。一態様において、嚢胞性線維症を有する対象は、ヒト新生児である。一態様において、嚢胞性線維症を有する対象は、若年のヒトである。本開示はまた、(i)AV.TL65カプシドタンパク質及び導入遺伝子(例えば、CFTRΔR)を含むポリヌクレオチドを含むrAAV;及び(ii)AAV形質導入の増強剤を含む医薬組成物を提供する。
「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスを指し、天然に存在する野生型ウイルス自体又はその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、他の意味に解すべき場合を除いて、すべての亜型、血清型、偽型、及び天然型と組換え型の両方を包含する。AAVゲノムは一本鎖DNAで構成されており、DNA鎖の両端の逆方向末端反復配列(ITR)と、複製タンパク質及びカプシドタンパク質をそれぞれコードするrep及びcapの2つのオープンリーディングフレームとを含む。外来ポリヌクレオチドは、天然のrep及びcap遺伝子を置換することができる。AAVは、様々な形質導入プロファイル、又は本明細書で使用されるように、異なる組織タイプに対する「向性」を有する様々な異なる血清型カプシドで作製することができる。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、及びAAVrh10とのカプシドタンパク質反応性に基づいて識別され、他のAAVから区別されるAAVを指す。例えば、血清型AAV2は、AAV2のcap遺伝子からコードされたカプシドタンパク質を含むAAV、及び同じAAV2血清型の5’及び3’ITR配列を含むゲノムを指すために使用される。偽型AAVとは、1つの血清型のカプシドタンパク質及び第2の血清型の5’-3’ITRを含むウイルスゲノムを含むAAVを指す。偽型rAAVは、カプシド血清型の細胞表面結合特性、及びITR血清型と一致する遺伝的特性を有すると予想される。偽型rAAVは、当技術分野で説明されている標準的な技術を使用して生成される。
本明細書で使用される場合、「投与する」とは、本明細書に記載の組成物(例えば、rAAV、増強剤、及び/又はその医薬組成物)の投薬量を対象に与える方法を意味する。本明細書に記載の方法で利用される組成物は、任意の適切な経路で投与することができ、これには例えば、吸入、噴霧、エアロゾル化、鼻腔内、気管内、気管支内、経口、非経口(例えば、静脈内、皮下、又は筋肉内)、経口、鼻、直腸、局所、又は頬腔が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アトマイザー噴霧器を使用して(例えば、MADgic(商標)喉頭気管粘膜噴霧装置を使用して)気管内及び/又は気管支内にエアロゾル化された粒子で投与される。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、局所投与又は全身投与することができる。投与方法は、様々な要因(例えば、投与される組成物の成分及び治療される状態の重症度)に応じて変化し得る。
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「遺伝子送達」という用語は、遺伝子導入のために外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを指し、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコンの組み込み及び発現を含み得る。
AAVの「ヘルパーウイルス」は、AAV(例えば、野生型AAV)が哺乳類細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアなどのポックスウイルスを含む、AAVのための様々なそのようなヘルパーウイルスが当技術分野で知られている。アデノウイルスにはいくつかの異なるサブグループが含まれるが、サブグループCのアデノウイルス5型が最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類及び鳥類起源の多数のアデノウイルスが知られており、ATCCなどの寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)及びエプスタイン・バーウイルス(EBV)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)及び仮性狂犬病ウイルス(PRV)が含まれ、これらもATCCなどの寄託機関からも入手できる。
組換えAAVベクターは、特に嚢胞性線維症や鎌状赤血球貧血などの疾患に対する、ヒト遺伝子治療のための潜在的に強力なツールである。遺伝子治療への他のアプローチに対するrAAVベクターの主な利点は、エピソームに存在するために、又は宿主細胞に安定して組み込まれるために、標的細胞が継続的に複製される必要が大抵の場合ないことである。本明細書で提供されるのは、AV.TL65カプシドタンパク質及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含むrAAVであり、これは、本明細書に記載されるように、AAV形質導入の増強剤と組み合わせることができる。
遺伝子治療のためのrAAV及びその医薬組成物の使用
AAVベクターは、遺伝子治療又はワクチン接種の目的で個体に投与するために使用することができる。rAAV療法に適した疾患には、ウイルス、細菌、又は寄生虫感染によって誘発される疾患、様々な悪性腫瘍及び過剰増殖状態、自己免疫状態、及び先天性欠損症(嚢胞性線維症など)が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の組成物(例えば、rAAV、医薬組成物、及び/又は増強剤)は、in vivo及びex vivoで使用することができる。in vivo遺伝子治療は、本開示のベクターを対象に直接投与することを含む。医薬組成物は、液体溶液又は懸濁液として、乳濁液として、又は使用前に液体に溶解又は懸濁させるのに適した固体形態として供給することができる。気道への投与の場合、投与の1つの例示的な形態は、適切なエアロゾル化装置と共に使用されるときに固体又は液体エアロゾルのいずれかを提供する組成物を使用するエアロゾルによるものである。気道への別の投与方法は、柔軟な光ファイバー気管支鏡を使用してベクターを注入することである。典型的には、ウイルスベクターは、リンゲルの平衡塩類溶液(pH7.4)などの薬学的に適切なパイロジェンフリーの緩衝液中にある。必須ではないが、医薬組成物は、任意選択で、正確な量の投与に適した単位剤形で供給され得る。
本明細書に記載の組成物(例えば、rAAV、医薬組成物、及び/又は増強剤)は、哺乳類に単独で、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することができる。上記のように、有効成分と担体の相対的な比率は、化合物の溶解性及び化学的性質、選択された投与経路、及び標準的な製薬慣行によって決定される。
本明細書に記載されるように、AV.TL65カプシドタンパク質を含むrAAVを、AAV形質導入の増強剤と組み合わせて使用して、導入遺伝子の形質導入及び/又は発現の大幅な増加を達成することができる。任意の適切な増強剤を使用できる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,749,491号は、適切な増強剤を記載している。増強剤は、プロテアソーム調節剤であり得る。プロテアソーム調節剤は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルルビシン、又はミトキサントロン)、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びイキサゾミブ)、トリペプチジルアルデヒド(例えば、N-アセチル-l-ロイシル-l-ロイシル-l-ノルロイシン(LLnL))、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、増強剤はドキソルビシンである。他の実施形態では、増強剤はイダルビシンである。
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみを目的としており、それらに照らして様々な修正又は変更が当業者に示唆され、本願及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲に含まれることが理解される。
嚢胞性線維症(CF)は、上皮細胞膜を通して塩化物及び重炭酸イオンを伝導するチャネルである嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)をコードする遺伝子の突然変異によって引き起こされる、生命を脅かす常染色体劣性疾患である。CFTR機能の障害は、気道の炎症と進行性の気管支拡張症を引き起こす。CFは単一遺伝子病因であり、患者集団において様々なCFTR突然変異があるため、遺伝子治療は潜在的にCFの普遍的な治療法を提供する。現在のCFの標準治療は、例えばlumacaftor/VX-809(チャネル修復剤)、ivacaftor/VX-770(チャネル増強剤)、ORKAMBI(商標)(これらの薬物の組み合わせ)、又はTRIKAFTA(商標)(elexacaftor/ivacaftor/tezacaftor)などのモジュレーターを使用して欠陥のあるCFTRの活性を調節しようとするものである。これらのアプローチは有望であるが、既知のCFTR変異のサブセットのみに対する特異性によって制限される。
遺伝子治療を使用して嚢胞性線維症(CF)肺疾患を治療するには、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の反復投与が必要な場合がある。しかし、肺のrAAVを介した免疫応答についてはほとんど知られていない。ここでは、フェレットが、AV.TL65の肺へのCFTR送達及び中和抗体(NAb)応答の特性評価の前臨床試験のための適した種であることを実証した。AV.TL65-hCFTRΔRは、ヒトとフェレットの両方の気道上皮培養物を効率的に形質導入し、CF気道培養物のCFTR Cl-電流を補完した。AV.TL65-hCFTRΔRを新生仔及び若年フェレットの肺に送達すると、内因性fCFTRよりも200~300%高いレベルでhCFTRmRNAが生成された。AV.TL65の単回投与(AV.TL65-gLuc)又は反復投与(AV.TL65-fCFTRΔRに続いてAV.TL65-gLuc)を、新生仔及び幼若フェレットで行った。反復投与は、幼若フェレットで導入遺伝子発現を有意に減少させ(11分の1)、気管支肺胞洗浄液(BALF)NAbを増加させたが、どちらの年齢層でもほぼ同等の血漿NAb応答があったにもかかわらず、新生仔フェレットではそうならなかった。特に、両方の年齢層は、反復投与後のBALF抗カプシド結合IgG、IgM、及びIgA抗体の減少を示した。幼若フェレットに特有なのは、2回目のベクター投与後の血漿抗カプシド結合IgMの抑制であった。したがって、年齢依存性の免疫系の成熟とアイソタイプスイッチングは、AV.TL65の反復投与後の高親和性肺NAbの発生に影響を与える可能性があり、肺のAAV中和反応を鈍らせる経路を提供する可能性がある。
結果
フェレットは、肺へのAV.TL65遺伝子治療の評価に適した前臨床種である。
2つのrAAVベクター(AV.TL65-SP183-fCFTRΔR及びAV.TL65-SP183-gLuc)を使用して、フェレット肺へのAV.TL65の反復投与の実現可能性を評価した。AV.TL65-SP183-fCFTRΔRを、最初のウイルス感染用に選択した。これは、このベクターが導入遺伝子(つまり、フェレットCFTRすなわちfCFTR)に対する免疫応答を開始するべきではないためである。2回目のウイルス感染については、導入遺伝子発現の時間的及び定量的分析を可能にするしっかりしたレポーターが必要であったため、分泌型gLucレポーターベクターAV.TL65-SP183-gLucを選択した。単回投与群のフェレットはAV.TL65-SP183-gLucベクターのみで感染させ、反復投与群のフェレットは最初にAV.TL65-SP183-fCFTRΔRで、次にAV.TL65-SP183-gLucで感染させた。最初に、若い動物での反復投与を評価した(図4)。新生仔フェレットでこれらの研究を開始し、1週齢の反復投与群をAV.TL65-SP183-fCFTRΔRで感染させ、3週間後に反復投与群と単回投与(ナイーブ)群の両方をAV.TL65-SP183-gLucウイルスで感染させた(図4A)。ルシフェラーゼ活性を、AV.TL65-SP183-gLucによる感染後14日間の血液サンプルと、実験終了時のBALFでモニタリングした。この研究からの発見は、血漿中のgLuc活性が感染後5日までにピークに達し、両方の投与群で14日まで安定したままであることを示した(図4B)。また、2つの投与群間で血漿gLuc活性のレベルに有意差はなかった。同様に、感染後14日でのBALFのgLuc活性も、2つの投与群間で有意差はなかった(図4C)。血漿及びBALFの両方で、gLuc活性は、ナイーブ(非感染)対照のバックグラウンドレベルをはるかに上回っていた(図4B及び4C)。
以前にこのウイルスに曝露された幼若フェレットの肺におけるAV.TL65形質導入の効率の低下を考慮して、我々は、試験動物のBALF及び血漿中のNAbを評価することを試みた。抗AV.TL65NAbの力価を、ヒト気道細胞株であるA594細胞におけるAV.TL65-SP183-fLuc形質導入の阻害のIC50として決定した。単回投与及び反復投与の新生仔フェレットにおける同様のレベルの導入遺伝子発現と一致して、BALFのNAb力価は2つの投与条件間で有意差はなかった(図6A)。対照的に、幼若フェレットのBALFのNAb力価は、単回投与群と比較して、反復投与で有意に高かった(図6B)。さらに、単回投与群と反復投与群の両方のより高齢の動物を用いた実験におけるNAbの絶対力価は、新生仔試験群よりも高く(3~5倍)、より高齢のフェレットでより完全に発達した免疫応答を示唆している。
AAV2/AAV5カプシドシャッフリングライブラリから進化した、AV.TL65のVP2及び最も豊富なVP3カプシドタンパク質は、VP1に単一のA581T変異を持つAAV5に由来する。AV.TL65のVP1は、AAV2 VP1の1~131aaからのN末端固有配列(VP1u)とそれに続くA581T変異を含むAAV5カプシドの128~724aaとを有するAAV2及びAAV5カプシドのハイブリッドである。AAVのVP1uには、エンドソームからのビリオンの脱出に重要であると考えられているホスホリパーゼA2(PLA2)触媒ドメインが含まれている。AV.TL65に感染したフェレットの血漿及びBALF中のAV.TL65カプシド特異的免疫グロブリン(IgG、IgM、及びIgA)を評価するために、コーティング抗原としてAAVウイルス粒子を使用するELISAアッセイを開発した。この方法を検証するために、AV.TL65ウイルスが1~2か月間隔で4回肺に送達された、生後1か月のフェレットから収集した血漿を使用した。コーティング抗原としてAAV5粒子を使用すると、ナイーブ血漿とAV.TL65免疫血漿との間のIgG結合の差異が、1:50希釈から見られ、1:1250希釈までにナイーブ血漿の結合は見られなくなったが、AV.TL65免疫血漿では抗体結合は高いままであった(図7A)。対照的に、コーティング抗原としてAAV2を使用した場合、すべての希釈率で免疫血漿とナイーブ血漿の間で血漿IgG結合に差はなく、IgGの検出感度はAAV5よりもはるかに低かった(図7B)。これらの発見は、AV.TL65の表面抗原エピトープがAAV5カプシドと同様の免疫原性を提示することを示唆しており、これらの理由から、我々は試験動物のBALF及び血漿中の抗カプシド抗体アイソタイプの分類のためのコーティング抗原としてAAV5を使用することにした。
組換えAV.TL65ウイルスベクターの作製
pAV.TL65repcap(Excoffonら、2009年、上記)は、AV1-SP183-hCFTRΔR、及びAV.TL65-SP183-hCFTRΔR、AV.TL65-SP183-fCFTRΔR、AV.TL65-SP183-fLuc、AV.TL65-SP183-gLucの産生のためのAV.TL65カプシドを生成するために使用されるAAVヘルパープラスミドである。パッケージングに使用されたrAAVプロウイルスプラスミドは、pAV2.F5tg83-hCFTRΔR及びpAV2.F5tg83-fCFTRΔR、ならびにpAV2-F5tg83fLuc(ホタルルシフェラーゼレポーター)及びpAV2-F5tg83gLuc(ガウシアルシフェラーゼレポーター)であった。AV.TL65ベクターは、トリプルプラスミドトランスフェクション法を使用して、フィラデルフィア小児病院(CHOP)のベクターコアで作製された。簡単に説明すると、AAVヘルパーpAV.TL65repcapとアデノウイルスヘルパーpAdを、AAVプロウイルスベクターの1つと一緒にHEK293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたHEK293細胞から生成されたrAAVベクターは、CsCl密度勾配で精製された。導入遺伝子に特異的なプライマーとプローブを使用した定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によって力価を決定し、銀染色後のSDS-PAGEによってベクターストックの純度を評価した。
フェレットがAV.TL65の分析に適した種であるかどうかを評価するために、最初に、ヒトとフェレットに由来する高分化気管気管支ALI培養物でin vitro形質導入実験を行った。レポーターベクターAV.TL65-SP183gLucを、ヒト(2個体のドナーからのn=6トランスウェル)及びフェレット(2個体のドナーからのn=6トランスウェル)の気道上皮ALI培養物の頂端に、10,000DRP(DNase耐性粒子)/細胞のMOI(感染多重度)で接種した。感染期間中、培養培地に最終濃度4μMのドキソルビシンを添加し、ガウシアルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの測定用に設計されたレニラルシフェラーゼ活性アッセイキット(Promega)の製造元の指示に従って、5日間の感染後にガウシアルシフェラーゼ活性の相対発光単位(RLU)を測定した。感染していない2つのトランスウェルを対照として設定した。
hCFTRΔRの発現及びCFTR機能の補完に対するAV.TL65-SP183-hCFTRΔR及びAV1-SP183-hCFTRΔRの有効性を、CF患者の近位気道に由来する極性化したヒトALI培養物(F508del/F508del)で評価した。各ベクターを、ALI培養物(2個体のドナーからのn=4トランスウェル)の頂端に、ドキソルビシン(2.5μM)及びLLnL(20μM)の存在下で、100,000DRP/細胞のMOIで適用した。これらの2つのプロテアソーム調節剤は、いくつかのAAV血清型により形質導入を増強することが示されている。感染後12日目に、CFTR媒介Cl-電流を前述のようにUssingチャンバーで測定し、cAMP刺激(IBMX/フォルスコリン)及びCFTR阻害(GlyH101)後の短絡電流(ΔIsc)の変化を測定した。非感染ALI培養物(2個体のドナーからのn=4トランスウェル)をベースライン対照として使用した。ΔIscの測定後、各ウイルス感染群からの2つのインサートをプールし、RNeasy(商標)Plus Miniキット(Qiagene)を使用して全RNAを溶解した。mRNAをcDNAに変換した後、ベクター由来のhCFTRΔRmRNAをTaqMan(商標)PCRで定量し、ヒトGAPDHmRNAに対して正規化した。
3日齢の新生仔フェレット(n=3)又は1か月齢の幼若フェレット(n=3)に、ドキソルビシン(最終濃度250μM)と混合した体重1グラムあたり4×1010DRPのAV.TL65-SP183-hCFTRΔRウイルスを気管内投与した。模擬感染群(n=3)のフェレットには、PBS中のDox(250μM)のみを接種した。感染後11日目に動物を安楽死させ、気管及び肺組織を別々に採取し、急速凍結し、そして全RNA抽出のために粉砕した。導入遺伝子hCFTRΔRのベクター由来mRNA及び内因性fCFTRをTaqMan(商標)で定量し、hCFTRΔR及びfCFTRΔRのコピー数をGAPDHに対して正規化し、hCFTRΔR/fCFTRの比率として表した。
以下の実験計画法を使用して、新生仔及び幼若フェレットへのAV.TL65ベクターの反復投与を評価した。新生仔フェレット:AV.TL65-SP183-gLucレポーターベクターを、AV.TL65カプシドにナイーブであるか、1週齢でAV.TL65-SP183-fCFTARに以前に感染した4週齢のフェレットに気管内投与した。幼若フェレット:AV.TL65-SP183-gLucレポーターベクターを、AV.TL65カプシドにナイーブであるか、4週齢でAV.TL65-SP183-fCFTRΔRに以前に感染した8週齢のフェレットに気管内投与した。各用量について、動物は、AV.TL65-SP183gLuc又はAV.TL65-SP183-fCFTRΔRベクター(1×1013DRP/kg)及びドキソルビシン(200μM最終濃度)を含む接種物を受けた。1週齢の新生仔フェレットに、イソフルランと酸素の混合物による麻酔下でキットに投与された150μlの接種物の外科的気管内注入を行った。他の年齢では、ケタミンとキシラジンの混合物の皮下注射による麻酔下で、MicroSprayer(商標)エアロゾライザーを使用して気管内にウイルスを投与した。エアロゾル化のためのベクター/ドキソルビシン接種物の量は、フェレットの体重に対して正規化された(5ml/kg)。
AV.TL65-SP183-gLucレポートベクターの送達後0、5、10、及び14日目に、麻酔されたフェレットからヘパリン処理されたチューブに血漿を収集した。動物をEUTHASOL(商標)(Virbac AH Inc)で安楽死させ、300グラム体重あたり5mlのPBSの注入により、気管/肺カセットから気管支肺胞洗浄液(BALF)を収集した。血漿及びBALF中のgLuc活性を、サンプル収集後すぐに測定した。
マイクロ中和アッセイを、以前に報告された方法(Wu et al.Front Immunol.8:1649,2017)を変更したものを使用して行った。血漿及びBALF中のNAbの力価を、感染前の段階希釈血漿又はBALFとインキュベートしたAV.TL65-SP183-fLucウイルスによるA549細胞の感染後のレポーター遺伝子発現の減少として定量化した。簡単に説明すると、フェレットからのすべての血漿サンプルを熱で不活化した(56℃、30分)。血漿の5倍段階希釈(1:50から開始し、1:156,250で終了)をAV.TL65-SP183-fLucと総量100μlでインキュベートした。BALFの場合、同じ条件を適用したが、段階希釈は1:5から開始し、1:3125で終了した。これらの混合物を37℃で1時間インキュベートして抗体の結合と中和を促進し、48ウェルプレート(1×105/ウェル、MOI=5000DRP/細胞)のA549細胞の単層に、各希釈率につきデュプリケートで適用した。細胞を37℃/5%CO2でウイルス混合物とともに1時間インキュベートした後、2%ウシ胎仔血清を含むDMEMをウェルに添加し、さらに24時間インキュベートした。次に、細胞溶解物中のホタルルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼアッセイキット(Promega)で製造元の指示に従って測定した。このアッセイを実施するたびに、AV.TL65-SP183-fLucのみで感染させたA549細胞が100%形質導入の参照対照として機能した。各血漿又はBALFサンプルの中和力価を、最大阻害濃度の半分(IC50)として計算した。
ELISA手順を使用して、血漿及びBALF中の総カプシド結合IgG、IgM、及びIgAを捕捉及び定量化した。簡単に説明すると、炭酸緩衝液中のrAAV5を96ウェルELISAプレートに4℃で一晩結合させた(1×109DRP/ウェル)。試験した血漿サンプル(IgG及びIgMの場合は1:2000、IgAの場合は1:20に希釈)及び未希釈のBALFサンプルを各ウェルにアプライし、室温で1時間インキュベートした。PBS-T(0.05%Tween(商標)-20)で3回洗浄した後、希釈したHRP標識二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。HRP標識二次抗体は、ニワトリ抗フェレットIgG(Gallus Immunotech又はAbeam)及びヤギ抗フェレットIgM又はIgA(Life-Bio Inc)を含んでいた。次に、HRP反応生成物をプレートリーダーでの吸光度によって定量化した。
実験データは平均±SDとして表され、Prism7(GraphPad Software,Inc.米国カリフォルニア州サンディエゴ)がデータ分析に使用された。統計的有意性は、一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキー検定(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001、****P<0.0001)で分析された。
すべての動物実験は、アイオワ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施された。
Claims (28)
- 細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、細胞を(i)AV.TL65カプシドタンパク質、又はそのバリアント、ならびに導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV);及び(ii)AAV形質導入の増強剤と接触させることにより、細胞内で導入遺伝子を発現させることを含む方法。
- 前記増強剤はプロテアソーム調節剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアソーム調節剤は、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、トリペプチジルアルデヒド、又はそれらの組み合わせである、請求項2に記載の方法。
- 前記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、イダルビシン、又はそれらの組み合わせである、請求項4に記載の方法。
- 前記プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びイキサゾミブを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記トリペプチジルアルデヒドはN-アセチル-l-ロイシル-l-ロイシル-l-ノルロイシン(LLnL)である、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞は、前記rAAV及び前記増強剤と順番に接触する、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞は、前記rAAV及び前記増強剤と同時に接触する、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を前記rAAV及び前記増強剤と接触させることは、前記細胞を前記rAAVのみと接触させることと比較して、導入遺伝子の発現の増加をもたらす、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 発現の増加は、約100%、約200%、約300%、約400%、約500%、約600%、又はそれ以上である、請求項10に記載の方法。
- 前記接触は、前記rAAV及び前記増強剤を対象に投与することを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- それを必要とする対象の障害を治療する方法であって、前記対象に(i)AV.TL65カプシドタンパク質、又はそのバリアント、及び治療用導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV);及び(ii)AAV形質導入の増強剤を投与することを含み、前記投与が対象の細胞における導入遺伝子の発現をもたらす方法。
- 前記投与は、吸入、噴霧化、又はエアロゾル化によるものであるか、鼻腔内、気管内、気管支内、経口、静脈内、皮下、及び/又は筋肉内投与である、請求項12又は13に記載の方法。
- 前記投与は、吸入、噴霧化、又はエアロゾル化によるものであるか、鼻腔内、気管内、及び/又は気管支内投与である、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞は気道上皮細胞である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記気道上皮細胞は肺上皮細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記障害は嚢胞性線維症である、請求項13~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子はCFTR又はその誘導体である、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- CFTRの前記誘導体は、CFTRΔR導入遺伝子である、請求項19に記載の方法。
- 前記AV.TL65カプシドタンパク質は、
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL(配列番号13)
のアミノ酸配列を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。 - (i)AV.TL65カプシドタンパク質、又はそのバリアント、及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを含むrAAV;及び(ii)AAV形質導入の増強剤を含む医薬組成物。
- 前記増強剤はプロテアソーム調節剤である、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記プロテアソーム調節剤は、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、トリペプチジルアルデヒド、又はそれらの組み合わせである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、イダルビシン、又はそれらの組み合わせである、請求項25に記載の医薬組成物。
- 前記プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、又はイキサゾミブを含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記トリペプチジルアルデヒドはN-アセチル-l-ロイシル-l-ロイシル-l-ノルロイシン(LLnL)である、請求項24に記載の医薬組成物。
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