JP2023520814A - コロナウイルス誘発性疾患を治療するためのオールインワンａａｖベクター - Google Patents

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Abstract

本発明は、コロナウイルス感染、特にＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異型の感染を治療する新規のアプローチに関する。本発明は、一本鎖ＲＮＡウイルスを効果的に標的化し、切断することに基づき、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間で保存されているヒト化コロナウイルス科のゲノム内の標的部位にＣａｓ１３ｄタンパク質をガイドするＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡを提供する。開示の発明は、コロナウイルス感染、特にＣＯＶＩＤ－１９感染を治療するためのＣａｓ１３ｄとともにかかるＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡ発現カセットを含むＡＡＶベクターを更に提供する。

Description

本発明は、生物医学の分野に関する。具体的には、本発明は、一本鎖ウイルスＲＮＡを切断するためのＣａｓ１３ｄをコードする配列とガイドＲＮＡとを含むＡＡＶベクターを提供し、かかるガイドＲＮＡの提供を含む。
新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の近年進行中の大流行は、世界的に感染及び死亡の劇的に高い発生率をもたらしている。このウイルスの基本再生産数（Ｒ０）（およそ３）は、必然的にコロナウイルス症例数の更なる増加をもたらす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス株は、極めて感染力が強いことが知られており、主に飛沫又は呼吸器分泌物により、気道を介して広がる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染は、顕著な肺損傷及び重症急性呼吸器症候群を引き起こすことが多い。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、風邪からＭＥＲＳ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）及びＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）等の急性疾患に至るまで様々なヒトの疾病及び疾患を引き起こすと一般的に考えられる一本鎖ＲＮＡウイルスの広範なファミリーであるコロナウイルスファミリー（コロナウイルス科）のメンバーである（１）。効果的な臨床治療戦略が緊急に必要とされているが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を治療するための利用可能な治癒的若しくは予防的療法、又は有望な薬物候補は現在存在しない。
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を効果的に標的化し、切断することができるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療アプローチを提供する可能性があり得る。様々なＣａｓタンパク質を検討すると、哺乳動物細胞を含む幾つかのモデル系においてｓｓＲＮＡを効率的かつ特異的に標的化し、切断するＣａｓ１３の能力が最近の研究により強調されていることから、Ｃａｓ１３、特にＣａｓ１３ｄ変異体が、かかるアプローチに有望な候補であると思われる（２）。
このため、本発明は、感染哺乳動物細胞に対して一本鎖ＲＮＡのＣａｓ１３媒介切断を開始することによってコロナウイルス科ファミリーのウイルスの感染、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及び最近特定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を治療する新たな薬物候補及び治療レジメンを提供する。したがって、本発明は、Ｃａｓ１３タンパク質、好ましくはＣａｓ１３ｄタンパク質をコロナウイルス科ファミリーから派生するウイルス、特にファミリーメンバーＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム内のそれぞれの標的部位にガイドするガイドＲＮＡを提供する。本発明は、Ｃａｓ１３、好ましくはＣａｓ１３ｄをヒト細胞に導入するためのＣａｓ１３ガイドＲＮＡを含むＡＡＶベクターを更に提供する。
本発明では、コロナウイルス科ファミリーの一本鎖ＲＮＡウイルス、特にファミリーメンバーＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムを標的化し、切断するための一本鎖ＲＮＡのＣａｓ１３標的化及び切断の使用を説明する。Ｃａｓ１３、好ましくはＣａｓ１３ｄと関連するガイドＲＮＡは、コロナウイルス科のファミリーのメンバー間で保存されている領域であるＯＲＦ１ａｂ、Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮに位置する標的部位を有し得る。Ｃａｓ１３ｄとともにガイドＲＮＡ発現カセットを含むＡＡＶベクターは、ウイルスに感染した細胞へのＣａｓ１３ｄの輸送のためのビヒクルとして使用される。
このため、一実施形態においては、１０００アミノ酸未満のＣａｓ１３とともに使用され、好ましくはＣａｓ１３ｄと併用されるガイドＲＮＡが提供され、ガイドＲＮＡ標的部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによって構成される配列である。
別の実施の形態においては、ガイドＲＮＡ標的部位はコロナウイルス科ファミリーのヒト関連ウイルスのゲノム間で保存されている配列である。
更なる実施の形態においては、ガイドＲＮＡ標的部位はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのそれぞれのゲノム間で保存されている配列である。
好ましい実施の形態においては、ガイドＲＮＡ標的部位はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのそれぞれのゲノム内のＯｒｆ１ａｂ領域、Ｓ領域、Ｅ領域、Ｍ領域及びＮ領域の１つ以上によって構成される配列である。
更に好ましい実施の形態においては、ガイドＲＮＡの配列は配列番号１～配列番号３９からなる群より選択される配列を含む。
特に好適なガイドＲＮＡは、配列番号４、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１のいずれかのスペーサー配列を含む。
本発明は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードする配列と、Ｃａｓ１３ｄガイドＲＮＡをコードするガイドＲＮＡ発現カセットとを含み、Ｕ６プロモーターを含む核酸分子を更に提供する。
別の実施の形態においては、核酸分子は、ガイドＲＮＡを２つ以上コードする。
別の実施の形態においては、核酸分子は、配列番号４、配列番号７及び配列番号１５；配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１；配列番号１５、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号２３及び配列番号３１；配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；又は配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１の配列を含むガイドＲＮＡをコードする。
別の実施の形態においては、核酸分子は、配列番号４、配列番号７及び配列番号１５；配列番号４、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；並びに配列番号４、配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１の配列を含むガイドＲＮＡをコードする。
別の実施の形態においては、核酸分子は、プラスミドである。
好ましい実施の形態においては、核酸分子は、単一プラスミドである。
別の実施の形態においては、上記配列によってコードされるＣａｓ１３ｄタンパク質は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まない。
別の実施の形態においては、上記配列によってコードされるＣａｓ１３ｄタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質のＮ末端結合ドメイン（Ｎ－ＮＴＤ）を含む融合タンパク質である。
別の実施の形態においては、核酸分子は、ガイドＲＮＡのスペーサー配列を配列番号４０のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄに挿入するか、又は少なくとも１つのガイドＲＮＡの少なくともスペーサー配列を配列番号４１のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ａｒｒａｙ－ｔｒｉｇｕｉｄｅ、配列番号４２のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ｑｕａｄｇｕｉｄｅ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－Ｖ３－ｂａｓｉｃ、配列番号４３のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ＳａｐＩ、若しくは配列番号４４のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ＮＴＤ－ＡａｒＩに挿入することによって得られる。
本発明は、核酸分子を含むＡＡＶベクターを更に提供する。
好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６及びＡＡＶ９の群から選択され、好ましくはＡＡＶ２ベクターである。
更に好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。
別の実施の形態においては、ＡＡＶベクター骨格は、完全長転写産物と比較してサイズが縮小されている。
本発明は、核酸分子を含むアデノウイルスベクターを更に提供する。
本発明は、ＡＡＶベクター又はアデノウイルスベクターを含む医薬組成物も提供する。
本発明は、上述の少なくとも１つのガイドＲＮＡと、Ｃａｓ１３タンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡとを含む医薬組成物も提供する。
一実施形態においては、Ｃａｓ１３タンパク質はＣａｓ１３ｄタンパク質又はＣａｓ１３ａタンパク質である。
別の実施の形態においては、上記ｍＲＮＡによってコードされるＣａｓ１３ｄタンパク質は核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まない。
別の実施の形態においては、上記ｍＲＮＡによってコードされるＣａｓ１３ｄタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質のＮ末端結合ドメイン（Ｎ－ＮＴＤ）を含む融合タンパク質である。
本発明は、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、又は医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ヒト関連ウイルスにより誘導される疾患又は症候群を治療する方法に更に関する。
一実施形態においては、ウイルスにより誘導される疾患又は症候群はＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶからなる群に遺伝的に関連しているコロナウイルスの感染の結果である。
好ましい実施の形態においては、疾患はＣＯＶＩＤ－１９である。
別の実施の形態においては、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は発現によりヒト関連ウイルスを切断する。
好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物は、上気道を介して、好ましくは鼻腔内投与若しくは気管内投与によって、又はエアロゾル組成物中で、例えば吸入器／噴霧器を用いて投与される。
別の好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物は、人工呼吸器を用いて患者に投与される。
更に好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物は、患者の心筋に投与される。
更なる態様においては、本発明は、ヒト関連ウイルスによる疾患又は症候群の治療に使用される上記のＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物も提供する。
一実施形態においては、疾患又は症候群はＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群に遺伝的に関連しているコロナウイルスの感染の結果である。
好ましい実施の形態においては、疾患はＣＯＶＩＤ－１９である。
別の実施の形態においては、Ｃａｓ１３ｄタンパク質は発現によりヒト関連ウイルスを切断する。
好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物は、上気道を介して、好ましくは鼻腔内投与若しくは気管内投与によって、又はエアロゾル組成物中で、例えば吸入器若しくは噴霧器を用いて投与される。
別の好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物は、人工呼吸器を用いて患者に投与される。
更に好ましい実施の形態においては、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物は患者の心筋に投与される。
例えば（３）に報告されるような現在知られている７つのＣａｓ１３タンパク質の系統樹の図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに由来するゲノムのアラインメントを示す図である。アラインメントの下の短いダッシュ記号は、ゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶの間の保存配列領域を標的化するように設計されたＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡの位置を示す。 Ｃａｓ１３ｄコード配列とともにＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡ発現カセットを含むＡＡＶ２プラスミドｐＡＡＶ２－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄのベクターマップを示す図である。シングルガイドＲＮＡを特徴とするベクターマップである（配列番号４０を参照されたい）。 Ｃａｓ１３ｄコード配列とともにＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡ発現カセットを含むＡＡＶ２プラスミドｐＡＡＶ２－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄのベクターマップを示す図である。ガイドＲＮＡスペーサー配列の３つの挿入部位を示すベクターマップである（配列番号４１を参照されたい）。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに由来するそれぞれのゲノムの配列アラインメント、並びにアラインメントに用いた配列を示す図である。 ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける本発明のシングルガイドＲＮＡ構築物の阻害効率を示す図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト上皮肺細胞において本発明のガイドＲＮＡ構築物を試験するための第１の実験設計を示す図である。 図６Ａの実験設計におけるガイドＲＮＡ構築物の幾つかの組合せの阻害効率を示す図である。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト上皮肺細胞において本発明のガイドＲＮＡ構築物を試験するための第２の実験設計を示す図である。 図７Ａの実験設計におけるガイドＲＮＡ構築物の幾つかの組合せの阻害効率を示す図である。 図７Ａの実験設計におけるガイドＲＮＡ構築物及びマルチガイドＲＮＡ構築物の幾つかの組合せの阻害効率を示す図である。
定義
ＡＡＶベクター：「ＡＡＶベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸配列を標的細胞に導入することが可能なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を指す。このベクターは、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列及び／又はガイドＲＮＡをコードするガイドＲＮＡ発現カセットを含み、Ｕ６プロモーターを含み得る。
ベクター骨格：「ベクター骨格」という用語は、ＡＡＶベクターのネイティブ核酸配列を指す。
Ｃａｓ１３ｄ：本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ１３ｄ」という用語は、ＲｆｘＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄシステムのＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。
保存されている：「保存されている」という用語は、本明細書において、コロナウイルス科ファミリーの或る特定のメンバーのウイルスゲノム内の配列又は配列部分が、コロナウイルス科ファミリーの少なくとも２つの他のメンバーに共通することを指す。
コロナウイルス：「コロナウイルス」という用語は、本明細書で使用される場合、コロナウイルス科のファミリーの任意のウイルスを指す。ヒト細胞に感染することが可能なコロナウイルスは、本明細書においてヒト関連コロナウイルスとも称される。
ＣＯＶＩＤ－１９：「ＣＯＶＩＤ－１９」という用語は、本明細書で使用される場合、コロナウイルスの一種であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染に起因する、新型コロナウイルス感染症（Coronavirus Disease 2019）として知られる疾患を指す。
誘導体：「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるウイルスと密接に関連したウイルスを指す。特に、ウイルスは、それぞれのゲノムが少なくとも５０％の配列類似性を示す場合、別のウイルスの誘導体である。
ガイドＲＮＡ：「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を指すために本明細書で使用される。本発明の場合は、「ガイドＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３システム、例えばＣａｓ１３ｄタンパク質のガイドＲＮＡを指す。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をその標的切断部位に「ガイドする」短い非コードＲＮＡ配列である。ガイドＲＮＡは、標的核酸配列中の相補的な標的部位に結合する核酸配列を含む。例として、Ｃａｓ１３ｄの標的核酸は一本鎖ＲＮＡ配列である。
ヒト関連ウイルス：「ヒト関連ウイルス」という用語は、ヒト細胞に感染することが可能な任意のウイルスを指す。
感染：「感染」という用語は、本明細書で使用される場合、生物の身体組織への病原体の侵入、かかる病原体の増殖、並びに病原体及びそれらが産生する毒素に対する宿主組織の反応を指す。本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、細胞のウイルス感染を指す。
下気道：本明細書で使用される場合、この用語は、声帯より下の喉頭の部分、気管、気管支、細気管支及び肺を指し、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢及び肺胞を含む。
ＭＥＲＳ：「ＭＥＲＳ」という用語は、疾患の中東呼吸器症候群を指し、コロナウイルスの一種であるＭＥＲＳ－ＣｏＶによる感染に起因する疾患又は症候群である。
ＳＡＲＳ：「ＳＡＲＳ」という用語は、コロナウイルスの一種であるＳＡＲＳ－ＣｏＶによる感染に起因する、重症急性呼吸器症候群として知られる疾患を指す。
形質導入：「形質導入」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスビヒクルを用いた細胞への核酸の意図的な導入を指す。特に、「形質導入」は、細胞へのＡＡＶベクターの導入を指す。
上気道：本明細書で使用される場合、この用語は、鼻及び鼻腔、副鼻腔、咽頭、並びに声帯より上の喉頭の部分を指す。
本発明の例示的な利点
本開示の発明は、Ｃａｓ１３タンパク質、好ましくはＣａｓ１３ｄタンパク質を用いてウイルスゲノム、例えばコロナウイルスの場合には一本鎖ＲＮＡゲノムを標的化及び切断し、それによりウイルスの複製能を阻害又は排除することに関する。
したがって、本発明は、Ｃａｓ１３タンパク質、好ましくはＣａｓ１３ｄタンパク質を、ウイルスゲノム内のそれぞれの標的切断部位にガイドするためのガイドＲＮＡを提供する。本発明者らは、動物からヒトに伝播したコロナウイルスが１つ以上の保存領域を共通して有し、これらの保存領域が、かかるヒト関連コロナウイルスに帰属する高い感染力に関与する可能性があるという観察に基づき、本ガイドＲＮＡを設計した。具体的には、本発明者らは、それぞれのウイルス配列のそれらの高度に保存された領域を標的化する３１個の異なるガイドＲＮＡ配列を特定し、特性を評価した（配列番号１～配列番号３１）。
現在知られているＣａｓタンパク質のファミリーにおいて、クラスＩＩタイプＶＩのＣａｓ１３は、およそ９３０アミノ酸の最も小さなサイズを有するＲＮＡ標的化エンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ１３ｄは、哺乳動物細胞において高レベルの触媒活性及び特異性を有することが示されている。このため、Ｃａｓ１３ｄは、コロナウイルス等の一本鎖ＲＮＡウイルスの効果的な形質導入並びに特異的な標的化及び分解に特に適しているようである。
本発明は、これらのガイドＲＮＡとともに１０００アミノ酸未満のＣａｓ１３タンパク質、好ましくはＣａｓ１３ｄをコードする配列を含むＡＡＶベクターを更に提供する。ＡＡＶベクターは、遺伝子送達アプローチに広く使用されている。しかしながら、一般的なＡＡＶ形質導入系とは対照的に、本発明に使用されるＡＡＶベクター核酸は一成分系である。その結果として、標的細胞の形質導入及び関連タンパク質の発現に必要とされる全ての要素が単一のベクター核酸によって構成されるため、形質導入手順が容易となる。形質導入を更に促進し、形質導入効率を高めるために、ベクター核酸も最小限のサイズに縮小する。かかるオールインワンＡＡＶ－Ｃａｓ１３－ｇＲＮＡ構築物は、従来の２ベクター核酸系と比較して優れた効率及びより少ない副作用を示す。ＡＡＶ２ベクターが第ＩＩＩ相臨床試験の際に肺において高い形質導入能を示したため、本明細書に開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ベクターをベースとするのが好ましい。
本ＡＡＶベクターは、本明細書に記載される単一のＣａｓ１３ガイドＲＮＡ、好ましくはＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡ、又は２つ以上のＣａｓ１３ガイドＲＮＡ、好ましくはＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡの組合せのコード配列のいずれを含んでいてもよい。２つ以上のガイドＲＮＡを使用することで、ウイルスを標的化し、切断する効力を更に高めることができる。加えて、幾つかのガイドＲＮＡの組合せにより、更なる突然変異ウイルス、例えば本明細書に記載のウイルスの誘導体を標的化する際の効力及び特異性を高めることもできる。
本発明の好適なガイドＲＮＡスペーサー配列は、幾つかのヒト関連コロナウイルス科株の配列アラインメントに基づいて設計された（配列番号１～配列番号３１）。ガイドＲＮＡの設計について、他の２つの近縁のコロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対し、より低い配列類似性を示すＭＥＲＳ－ＣｏＶを特に考慮に入れることで、ウイルスがヒト細胞を標的化することを可能にするウイルスゲノムの領域を特定することができる。これらのガイドＲＮＡスペーサー配列及び相応に設計された他のスペーサー配列は、将来臨床的にのみ関連する可能性があるコロナウイルス科株についても特異的な標的化及び切断を可能にする。
本発明の実施形態
新たに特定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染によるＣＯＶＩＤ－１９の現在の大流行は、僅か数ヶ月で既に１００００００人近くの感染及び５００００人の死亡を世界中で引き起こしている。明らかに緊急の必要性があるが、効果的な薬物はこれまで利用可能でなく、ワクチンの開発には約１２ヶ月～１８ヶ月かかる見通しである。このため、有望な新しい治療アプローチが強く求められている。
新たに特定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスの大きなファミリーであるコロナウイルス科のファミリーに属する。コロナウイルス科ファミリーのウイルスは通常、呼吸器系に感染し、風邪からＭＥＲＳ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）及びＳＡＲＳ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）等のより重篤な疾患に至るまで多数のヒトの疾病及び疾患の原因となると考えられている（１）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、１０個の異なるタンパク質（ＯＲＦ１ａｂ、Ｓ、ＯＲＦ３ａ、Ｅ、Ｍ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ８、Ｎ、ＯＲＦ１０）を含むことが報告されている（ＧｅｎＢａｎｋエントリＭＮ９０８９４７．３）。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するゲノム間の配列アラインメントを図４に示す。
近年特定され、発展したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、真核細胞における遺伝子組換えの非常に効果的、特異的かつ単純なシステムをもたらすことで遺伝子編集を革命的に変化させた。エフェクタータンパク質としてのカスパーゼ（Ｃａｓ）、及びＣａｓタンパク質を核酸内の特定の標的配列にガイドするためのガイドＲＮＡのみが、核酸の正確な切断及び／又は細胞若しくは更には生物全体の遺伝子組換えを可能とするシステムの必要とされる構成要素である（４）。
Ｃａｓタンパク質の既知のファミリーにおいて、クラスＩＩタイプＶＩのＣａｓ１３が近年発見され、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ及びＣａｓ１３ｄの４つの異なるサブタイプとして分類された（５）。Ｃａｓ１３ｄはサイズが小さく、哺乳動物細胞において高い触媒活性及び特異性を示し、一本鎖ＲＮＡを標的化し、切断する。したがって、Ｃａｓ１３ｄは、一本鎖ウイルスＲＮＡを分解することによってウイルス侵入に対抗するための興味深い新たなアプローチを提供する。
しかしながら、ウイルス感染に対抗するためにＣａｓ１３ｄを使用する上での大きな障害は、（感染）細胞へのＣａｓタンパク質及びそのガイドＲＮＡの送達である。
アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス科ファミリーの非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。幾つかの血清型が特定されており、中でもＡＡＶ２が最もよく知られているようである。アデノ随伴ウイルスは、低い病原性及び低い免疫原性等のそれらを効果的な遺伝子送達ツールとする或る特定の特性を示す一方で、指向性が広い（６）。
このため、本発明は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードする配列とともに、標的配列を切断し、ウイルスを分解するためにウイルスゲノム内の特定の標的部位を標的化するＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡを含むＡＡＶベクターを患者に投与することによってヒト関連コロナウイルス誘発疾患及び／又は症候群、特にＣＯＶＩＤ－１９を治療する新規の治療アプローチを提供する。本発明は、ウイルスゲノム内の非常に有望な標的部位と相互作用するように操作された、かかるガイドＲＮＡを更に提供する。
ガイドＲＮＡ
本発明のＣａｓ１３ガイドＲＮＡ、好ましくは、Ｃａｓ１３ｄガイドＲＮＡは、ヒト関連コロナウイルス又はその誘導体のゲノム内の一本鎖ＲＮＡ標的配列に指向される。本明細書に開示されるガイドＲＮＡの標的部位は、コロナウイルス科ファミリーの幾つかのメンバー、好ましくはＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の間の保存配列及び／又は配列部分に特異的に指向される。
典型的なＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡは、２２ｎｔ～３０ｎｔの標的配列（スペーサー）を標的化する（２）。このため、本発明のガイドＲＮＡは、コロナウイルスゲノム内の任意の２２ｎｔ～３０ｎｔの標的配列に指向され得る。本明細書で使用される典型的なガイドＲＮＡは、Konermann et al.に論考されている（３）。
本発明のガイドＲＮＡ配列は、以下の設計アプローチの１つに従って設計される：
（１）コロナウイルスの異なる株、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのゲノム配列の配列アラインメントを生成する。２２ｎｔ～３０ｎｔのスペーサー配列を、シード領域がアラインメントしたウイルスゲノム配列間の１００％オーバーラップ領域と完全に一致するように設計する。スペーサー配列の残りは、ウイルス配列の少なくとも１つ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２と同一であるが、残りの配列と部分的にのみ一致していてもよい。このため、このアプローチによると、３つ全てのコロナウイルスに対して切断効率が特に高く、ガイドＲＮＡの親和性は、スペーサー配列が完全に一致するウイルスに対して最大となる。
（２）コロナウイルスの異なる株、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのゲノム配列の配列アラインメントを生成する。２２ｎｔ～３０ｎｔのスペーサー配列を、シード領域がウイルス配列の少なくとも１つ、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と完全に一致するように設計する。第１のアプローチとは対照的に、スペーサー配列のシード領域と一部のウイルス配列内のそれぞれの標的配列とのミスマッチは許容される。このアプローチによって設計されたガイドＲＮＡスペーサー配列は、非常に高い結合親和性を有するが、スペーサー配列が完全には一致しないウイルスに対して切断効率が低下する。
（３）コロナウイルスの異なる株、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのゲノム配列の配列アラインメントを生成する。２２ｎｔ～３０ｎｔのスペーサー配列を、ガイドＲＮＡスペーサー配列が配列アラインメントに供したコロナウイルス科ファミリーの全てのメンバーに対して最良の全体的適合を有するように設計する。ガイドＲＮＡスペーサー配列が、シード領域においてアラインメントした全てのコロナウイルスメンバーのそれぞれの標的配列に対して１００％の配列類似性を有するという要件に基づき、アラインメントしたコロナウイルスメンバーにおけるそれぞれの配列に対するガイドＲＮＡスペーサー配列の最大９５％の全体的な配列類似性が達成可能である。このアプローチは、ガイドＲＮＡが将来のコロナウイルス変異型も標的化する最高の確率を可能にする。
このため、一実施形態においては、ガイドＲＮＡは、コロナウイルス科ファミリーのウイルスのゲノム、好ましくはヒト関連コロナウイルスのゲノムの保存領域内の標的配列に指向される。
好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はそれらの誘導体のゲノムの保存領域内の標的配列に指向される。
好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム、又はその誘導体内の標的配列に指向される。
好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、本明細書の表１に示すように、配列番号１～配列番号３９のいずれか又はその組合せのスペーサー配列を含む。
ガイドＲＮＡは例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８若しくは配列番号３９、又はそれらの任意の組合せのスペーサー配列を含み得る。
別の好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号１～配列番号３１のいずれか又はその組合せのスペーサー配列を含む。
ガイドＲＮＡスペーサー配列は例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、若しくは配列番号３１、又はそれらの任意の組合せのスペーサー配列を含み得る。
更に好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号１１～配列番号２０、配列番号２２、配列番号２９若しくは配列番号３１のいずれか、又はそれらの組合せのスペーサー配列を含む。
ガイドＲＮＡスペーサー配列は例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２９、若しくは配列番号３１、又はそれらの組合せのスペーサー配列を含み得る。
最も好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２若しくは配列番号２９のいずれか、又はそれらの組合せのスペーサー配列を含む。
ガイドＲＮＡスペーサー配列は例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２若しくは配列番号２９、又はそれらの組合せのスペーサー配列を含み得る。
別の最も好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号１３～配列番号１８又は配列番号３１のいずれかのスペーサー配列を含む。
別の最も好ましい実施形態においては、ガイドＲＮＡは、配列番号４、配列番号６、配列番号１１～配列番号１６及び配列番号３１のいずれかのスペーサー配列を含む。
特に好適なガイドＲＮＡは、配列番号４、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１のいずれかのスペーサー配列を含む。
ガイドＲＮＡスペーサー配列は例えば、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８若しくは配列番号３１、又はそれらの組合せのスペーサー配列を含み得る。
Figure 2023520814000001
Figure 2023520814000002
上に挙げたスペーサー配列のうち、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｏ－１～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｏ－１８と称されるものは、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｓ－１配列～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｓ－４配列は、「Ｓ」スパイクタンパク質遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｅ－１配列～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｅ－４配列は、エンベロープタンパク質遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｍ－１配列～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｍ－２配列は、膜タンパク質遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｎ－１～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｎ－３は、ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子を標的とする。
Ｃａｓ１３ｄ
本発明によると、Ｃａｓ１３、好ましくはＣａｓ１３ｄがコロナウイルスゲノムを切断及び標的化するためのエンドヌクレアーゼとして選択される。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓメンバーは、その小さなサイズ並びに哺乳動物細胞における高い標的化及び切断の効力及び特異性から、抗ウイルスアプローチに特によく適しているようである。
Ｃａｓ１３ｄは、他のＣａｓ１３ファミリー酵素と同様、それ自身のＣＲＩＳＰＲアレイを、３０塩基対の５’ダイレクトリピートに続いて長さが２２ｂｐ～３０ｂｐの範囲である可変３’スペーサーを含む成熟ガイドＲＮＡへと独立してプロセシングする特性を有する。
これまで、ＥｓＣａｓ１３ｄ、ＲｆｆＣａｓ１３ｄ、ＵｒＣａｓ１３ｄ、ＲａＣａｓ１３ｄ、Ｐ１Ｅ０ Ｃａｓ１３ｄ、Ａｄｍ Ｃａｓ１３ｄ及びＲｆｘＣａｓ１３ｄの７つの異なるＣａｓ１３ｄタンパク質が特定されている（図１）。これらのＣａｓ１３ｄ変異型のうち、ＲｆｘＣａｓ１３ｄは、最小限のオフターゲット活性で高いＲＮＡノックダウン効力を示すことが報告されている（２）。
このため、幾つかの実施形態においては、任意のＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼを使用することができる。
好ましい実施形態においては、ＲｆｘＣａｓ１３ｄエンドヌクレアーゼが使用される。
Ｃａｓ１３ｄをコードする配列を含み、ガイドＲＮＡ発現カセットを含むＡＡＶベクター
本発明のＡＡＶベクターは、Ｃａｓ１３ｄガイドＲＮＡ発現カセットとＣａｓ１３ｄタンパク質をコードする配列とを含む。このＡＡＶベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｄシステムを、ウイルスに感染したものを含む細胞に輸送するためのビヒクルとして働く。
ＡＡＶベクターは、様々な用途に適した既知の遺伝子送達ツールである。ＡＡＶベクターは、それぞれのＡＡＶ血清型に依存して、顕著な指向性を示すため、標的細胞の指向性形質導入を可能にする。例えば、ＡＡＶ９は心筋細胞に指向性を示すことが証明されており、ＡＡＶ９ベースのベクターは、これらの細胞への遺伝子送達に適していると考えられる（例えば、Kupatt et al.に対する欧州特許第３１３２０４１号を参照されたい）。同様に、ＡＡＶ２ベースのベクターは、Guggino et al.によって論考されているように、ヒトにおける嚢胞性線維症を治療する可能性を示している（７）（（８）も参照されたい）。
ＡＡＶベクターは、約４．７ｋｂのパッケージング限界しか有しないため、殆どの形質導入アプローチについて、必要とされる全ての遺伝要素の導入を可能にするために２つ以上のベクターの使用を伴う。
しかしながら、比較的小さなＣａｓ１３ｄを選択し、必要に応じて、重要でない要素をＡＡＶベクターから更に除去することで、本発明は、形質導入細胞におけるＣａｓ１３ｄ及びそのガイドＲＮＡの発現に必要とされる全ての要素を含む単一ＡＡＶベクターを提供する。
同様に、ＡＡＶベクターのパッケージングサイズを超えない他のＣａｓ１３タンパク質を使用することができる。このため、１０００アミノ酸未満のＣａｓ１３タンパク質は、本発明によるベクターによく適している。
Ｃａｓ１３ｄ及びガイドＲＮＡをコードするＡＡＶ２ベクタープラスミドの例示的な概略マップを図３Ａ及び図３Ｂに示す。
本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９を含むが、これらに限定されない多数のＡＡＶ血清型をベースとすることができる。
好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ９をベースとする。
更に好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２をベースとする。
別の更に好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９をベースとする。
最も好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ２－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄである（配列番号４０を参照されたい）。
別の好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクタープラスミドは、３つのｇＲＮＡ配列の挿入を可能にするｐＡＡＶ２－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ａｒｒａｙ－ｔｒｉｇｕｉｄｅである（配列番号４１を参照されたい）。
別の好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクタープラスミドは、４つのガイドＲＮＡ配列の挿入を可能にするｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ｑｕａｄｇｕｉｄｅ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－Ｖ３－ｂａｓｉｃである（配列番号４２を参照されたい）。配列番号４２のベクタープラスミドを用いてＡＡＶベクターを生成することで、配列番号４５の配列を有する５０６４ｂｐのＤＮＡがＡＡＶベクターにパッケージングされる。
Ｃａｓ１３ｄタンパク質のコード配列に核局在化配列（ＮＬＳ）を含めないことで、ＡＡＶベクターカーゴのサイズを小さくすることが可能である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増殖は、サイトゾルにおいて起こる。このため、ＮＬＳを含まないＣａｓ１３ｄタンパク質を使用することで、サイトゾルにおけるＣａｓ１３ｄの蓄積を増強することができ、同時にタンパク質及びそれをコードする構築物のサイズが小さくなる。ＮＬＳを含まないＣａｓ１３ｄタンパク質をコードする好適なベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ＳａｐＩである（配列番号４３を参照されたい）。配列番号４３のベクタープラスミドを用いてＡＡＶベクターを生成することで、配列番号４６の配列を有する４８３３ｂｐのＤＮＡがＡＡＶベクターにパッケージングされる。
ＡＡＶベクターは、５ｋｂ未満のＤＮＡを含むのが好ましい。５ｋｂより大きなサイズでは、パッケージング効率及び細胞内での発現が顕著に低下する（１１）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムへのＣａｓ１３ｄタンパク質の結合を更に促進するために、Ｎ末端ＲＮＡ結合ドメイン（Ｎ－ＮＴＤ）をＣａｓ１３ｄタンパク質に融合することができる。Ｎ－ＮＴＤは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質のＲＮＡ結合ドメインである。感染時のヌクレオカプシドタンパク質の主な機能は、ウイルスゲノムを保護し、確実なウイルス複製を維持するために、ウイルスＲＮＡに結合し、らせん状リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することである。ヌクレオカプシドタンパク質のＮ末端結合ドメイン（Ｎ－ＮＴＤ）は、ウイルスＲＮＡゲノムを捕捉し、Ｃ末端ドメインは、Ｍタンパク質とのその相互作用によってＲＮＰ複合体をウイルス膜に固定する。このため、Ｎ－ＮＴＤとＣａｓ１３ｄタンパク質との融合は、Ｃａｓ１３ｄ及びウイルスゲノムを含む複合体の形成を促進することで、Ｃａｓ１３ｄがウイルスゲノムと空間的に近接するようにガイドすると予想される。Ｃ末端にＮ－ＮＴＤが融合したＣａｓ１３ｄタンパク質をコードする好適なベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ＮＴＤ－ＡａｒＩである（配列番号４４を参照されたい）。配列番号４４のベクタープラスミドを用いてＡＡＶベクターを生成することで、配列番号４７の配列を有する５２３８ｂｐのＤＮＡがＡＡＶベクターにパッケージングされる。
本発明のＡＡＶベクターがベースとするそれぞれの血清型に応じて、ＡＡＶベクターは、これらの細胞型を有する或る特定の細胞型、組織及び器官に対して指向性を示すことができる。
このため、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターの特定の血清型を選択することによってヒトの体内の様々な細胞型及び器官に指向することができる。
好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは、ヒト呼吸器系の細胞に対して指向性を示し、それに指向される。
更に好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは、ヒト呼吸器系の細胞に指向されるＡＡＶ２ベクターである。
別の好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは、ヒト心筋細胞に指向される。
更に好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは、ヒト心筋の細胞に指向されるＡＡＶ９ベクターである。
本発明のＡＡＶベクターは、単一のＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡ又は幾つかのガイドＲＮＡの組合せをコードすることができる。このため、ＡＡＶベクターは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個又は３９個のガイドＲＮＡをコードし得る。
好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターはシングルガイドＲＮＡをコードする。
別の好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは２つのガイドＲＮＡをコードする。
最も好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは３つ、４つ又は５つのガイドＲＮＡをコードする。ガイドＲＮＡのスペーサー配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの異なる遺伝子を標的とするのが好ましい。
本発明に使用されるガイドＲＮＡの好適な組合せは、配列番号４、配列番号７及び配列番号１５；配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１；配列番号１５、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号２３及び配列番号３１；配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；並びに配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１のスペーサー配列を有する。
本発明に使用される特に好ましいガイドＲＮＡは、配列番号４、配列番号７及び配列番号１５；配列番号４、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；並びに配列番号４、配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１のスペーサー配列を有する。
好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは、同じプロモーター下でガイドＲＮＡの組合せをコードする。
ウイルス感染の治療のためのＣａｓ１３ｄ及びＣａｓ１３ｄガイドＲＮＡをコードするＡＡＶベクター
本発明は、ヒト関連コロナウイルス感染を治療する新規の治療アプローチを提供する。ＡＡＶベクターを細胞に導入することで、Ｃａｓ１３発現後に、ゲノム配列の切断、ひいては破壊のためにＣａｓ１３がガイドＲＮＡによってウイルスゲノム内の標的配列にガイドされる。コロナウイルスに既に感染した細胞においては、ウイルス配列が切断され、ウイルスが分解され、ウイルス汚染の任意の付加的な拡大が阻害される。未だ感染していない細胞においては、Ｃａｓ１３ガイドＲＮＡシステムの発現は、ウイルス遺伝物質を細胞に侵入した後に即座に分解することで、かかる細胞の保護機構を提供する。
標的細胞に到達するために、ＡＡＶベクターは、標的細胞を有する組織及び器官に送達される。
現在までの報告によると、コロナウイルスに起因する疾患は、主に感染被験体の呼吸器系に現れ、軽度ないし重度の呼吸器症状及び反応を引き起こす。特に、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ及びＣＯＶＩＤ－１９コロナ変異型は一般に、免疫系の過活動によるサイトカインストームに起因するか又はそれによって駆動されることが多い肺炎症、呼吸困難（pulmonary distress）及び急性呼吸器症候群を引き起こす。他の科学文献では、少なくともＣＯＶＩＤ－１９変異型が一部の患者において心筋にも悪影響を与える可能性があることを示唆する所見が報告されている。その結果として、患者の治療時に、ＡＡＶベクターは、示されるように呼吸器系、特に肺、及び／又は心筋に送達される。
このため、一実施形態においては、ヒト関連コロナウイルス誘発疾患の治療のためのＡＡＶベクターは、患者の呼吸器系に投与される。
別の実施形態においては、ＡＡＶベクターは患者の下気道に投与される。
好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクターは、吸入によって上気道に投与される。
ＡＡＶベクターは、気管組織に直接投与することができる。
ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ及び／又はＣＯＶＩＤ－１９を特異的に治療する一実施形態においては、ＡＡＶベクターを患者の上気道に投与してもよい。
ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ及び／又はＣＯＶＩＤ－１９を治療する別の実施形態においては、ＡＡＶベクターを患者の下気道に投与してもよい。
ガイドＲＮＡ発現カセットを含み、Ｃａｓ１３ｄ配列をコードするＡＡＶベクターは、組成物によって構成されていてもよい。
一実施形態においては、組成物は錠剤、カプセル、シロップ、フィルム、液体、溶液、粉末、ペースト、エアロゾル、注射、クリーム、ゲル、ローション又は滴剤の形態とすることができる。
別の実施形態においては、組成物はエアロゾルの形態であり、吸入器、噴霧器又は気化器によって投与される。
好ましい実施形態においては、組成物はエアロゾルの形態であり、吸入器によって投与される。
更に好ましい実施形態においては、組成物はエアロゾルの形態であり、吸入器によって上気道に投与される。
別の好ましい実施形態においては、ＡＡＶベクター又はそれを含む組成物は、人工呼吸器によって患者に投与される。
アデノウイルスベクター
本発明の全ての態様は、ＡＡＶベクターの代わりにアデノウイルスベクターを用いて実施することもできる。アデノウイルスベクターは、より高いパッケージングサイズ制限の利点を有する。
したがって、アデノウイルスベクターは、Ｃａｓ１３ｄをコードする配列とガイドＲＮＡ発現カセットとを含み得る。アデノウイルスベクターは、標的細胞に送達することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染等のヒト関連コロナウイルス感染の治療に使用することができる。
ウイルスベクターとは独立したガイドＲＮＡ及びＣａｓ１３ｄタンパク質の送達
本発明のガイドＲＮＡは、ウイルスベクターを用いずに標的細胞に送達することもできる。例えば、合成ガイドＲＮＡと同時にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成したＣａｓ１３ ｍＲＮＡの送達を含む、参照文献（１０）に記載されている方法を用いることができる。５０：１のガイドＲＮＡとＣａｓ１３ｄ ｍＲＮＡとのモル比が用いられ得る。ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、ベシクルを用いて送達することができる。
本発明は、合成ガイドＲＮＡ及びＣａｓ１３タンパク質をコードするｍＲＮＡを、それを必要とする患者の気道に送達することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染等のヒト関連コロナウイルス感染を治療する方法を提供する。この方法の詳細は、参照文献（１０）に記載されている。Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａタンパク質であってもよい。Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ｄタンパク質であってもよい。ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、ベシクルを用いて送達することができる。
実施例１
本明細書に開示されるＡＡＶベクターの使用は、コロナウイルス誘発疾患及び症候群の予防及び／又は治療に有望な新たな治療アプローチである。したがって、様々な疾患の治療におけるこれらのベクタービヒクルの適合性を試験するために多数の臨床試験が現在進行中である。臨床試験及び試験したそれぞれのＡＡＶベクターを下記表２に示す。
Figure 2023520814000003
実施例２－ガイドＲＮＡ配列の設計
ヒト関連コロナウイルス誘発疾患の治療のためのＣａｓ１３ｄ及びガイドＲＮＡをコードするＡＡＶベクターを作製するために、ガイドＲＮＡスペーサー配列を設計した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに関する事例と同様、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、動物からヒトへの伝播を首尾よく切り抜けた。この観察に基づき、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム間に、ヒトにおけるこれらのウイルスの高い病原性及び感染特性の原因となる高度に保存された領域が存在するはずであると考えた。本発明者らはまた、かかる保存ゲノム領域が、Ｃａｓ１３タンパク質、好ましくはＣａｓ１３ｄタンパク質をその標的及び切断部位にガイドすることで、ウイルス核酸を切断及び分解するガイドＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介切断に有望な標的部位を与えるとも結論付けた。
このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス変異型に由来する核酸配列の配列アラインメントを作成し、ＯＲＦ１ａｂ、Ｓ、Ｅ、Ｍ及びＮの５つの高度に保存された領域を特定した（図４を参照されたい）。保存領域を標的化し、病原体の切断及び分解に非常に有望な標的となる３１個のガイドＲＮＡスペーサー配列を特定した（配列番号１～配列番号３１）。
３つ全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ変異型の間の同様の配列を特定するために、３つの主なアプローチを用いる。
（１）第１のアプローチでは、３つ全てのウイルスゲノムの配列間で正確にオーバーラップする７塩基対の領域を含むシード配列を含むスペーサー配列を特定する。この配列をガイドＲＮＡスペーサー配列のシード領域（ガイドＲＮＡスペーサー配列の１５番目～２１番目の塩基；（２））として含めた。このスペーサー配列の残りは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列と完全に一致するが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ変異型とは部分的にしか一致しない。シード領域は、Ｃａｓ１３ｄのガイドＲＮＡの標的化特異性に不可欠な配列と考えられる。その結果として、不可欠なシード配列と標的配列とのミスマッチの場合、Ｃａｓ１３ｄは標的配列を切断することができない。このため、このアプローチを用いると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するガイドＲＮＡの親和性を最大にしながら、３つ全てのコロナウイルスに対して最良の切断効率が達成される。
（２）第２のアプローチでは、スペーサー配列の全長にわたってガイドＲＮＡスペーサー配列とそれぞれの標的配列との間の配列類似性を高めることで、ウイルスＲＮＡに対するスペーサー配列の結合親和性を上昇させる。第１のアプローチとは異なり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ内のそれぞれの標的配列に対するスペーサー配列のシード領域のミスマッチが許容されている。しかしながら、シード領域配列とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のそれぞれの標的配列との間の１００％の配列類似性を前提とする。このアプローチによって設計されたガイドＲＮＡスペーサー配列は、非常に高い結合親和性を有するが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに対して切断効率の低下を示す。
（３）第３のアプローチでは、コロナウイルスファミリーの３つ全てのメンバーについて最良の全体的適合をもたらすガイドＲＮＡを特定する。ガイドＲＮＡスペーサー配列が、シード領域における３つ全てのコロナウイルスメンバーのそれぞれの標的配列に対して１００％の配列類似性を有するという要件に基づき、３つのコロナウイルスメンバーにおけるそれぞれの配列に対するガイドＲＮＡスペーサー配列の最大９５％の全体的な配列類似性が達成された。このアプローチは、ガイドＲＮＡが将来のコロナウイルス変異型も標的化する最高の確率を可能にする。
上記の特定されたガイドＲＮＡスペーサー配列を、これまでに知られているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全てのヒト関連ウイルス転写産物とアラインメントした。高い標的配列特異性を示すため、潜在的な治療誘発性副作用のリスクを低下させるスペーサー配列をそれらから選択し、特にガイドＲＮＡ発現カセットのＵ６プロモーターとともにＣａｓ１３ｄタンパク質をコードする配列を含むｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄプラスミドにそれぞれ挿入した（配列番号１～配列番号４０も参照されたい）。
実施例３－シングルガイドＲＮＡ配列の効率の評価
表１の３９個のｇＲＮＡの阻害効力をｐＭｉｒレポーター及びオールインワンＣａｓ１３ガイド構築物の同時トランスフェクションによるルシフェラーゼアッセイにおいて評定した。ＬａｃＺを標的化するガイドＲＮＡを陰性対照として使用した。
最初のスクリーニング実験は、非感染性物質を用いて行った。３９個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、６つの異なる領域を標的化する：ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｏ－１～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｏ－１８は、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｓ－１配列～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｓ－４配列は、「Ｓ」スパイクタンパク質遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｅ－１配列～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｅ－４配列は、エンベロープタンパク質遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｍ－１配列～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｍ－２配列は、膜タンパク質遺伝子を標的とし、ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｎ－１～ｇＲＮＡ＿ＸＸ－Ｎ－３は、ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子を標的とする。このため、ＰＣＲによって６つの領域をクローニングし、それらをｐＭＩＲベクター（３’－ＵＴＲルシフェラーゼベクター）に挿入した。これにより、ｐＭＩＲ－レポート－ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２－フラグメント１～６と指定される６つのルシフェラーゼ構築物を得た。各ｇＲＮＡの阻害効力を評定するために、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞にオールインワンＣａｓ１３ガイド構築物及びその対応するｐＭＩＲレポーター構築物を同時トランスフェクトした。ＬａｃＺガイドを陰性対照として使用した。３９個のｇＲＮＡのうち、最終的に７つのガイドを選択し、更なる実験を行った（図５において赤色で強調表示する）。
実施例４－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ヒト上皮肺細胞におけるＣａｓ１３－ガイドＲＮＡシステムの試験
実験設計１
本発明者らのシステムの阻害効果を評定するために、初めに幾つかのガイドＲＮＡ構築物のそれぞれをＡＡＶ２ウイルスに充填した。各ＡＡＶを１００００ｖｇ／細胞（１細胞当たりのウイルスゲノム数）の力価で適用し、コロナウイルスｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の典型的な細胞株であるヒト気管支上皮Ｃａｌｕ－３細胞（４００００細胞／ウェル）に異なる組合せのガイドＲＮＡ構築物を形質導入した。７２時間後に、ＡＡＶ形質導入細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを０．０１のＭＯＩ（感染多重度－１細胞当たりのウイルス粒子の数を指す）で更に感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後に、感染培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した。その後、培養培地を２４ｈｐｉ（感染後時間数）及び４８ｈｐｉの時点で回収した。実験スケジュールを図６Ａに示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性をプラークアッセイによって測定した。結果を図６Ｂに示す。プラークアッセイから、大抵の場合、効果的なシングルガイドＲＮＡの組合せによりウイルス複製を阻害する能力が高まることが示される。ルシフェラーゼアッセイ（実施例３）において効率的であると特定され、組合せアプローチの試みにおいて試験された全てのガイドＲＮＡは、生きたヒト上皮肺細胞におけるウイルス複製の抑制に非常に効率的であることが判明した。このため、原則として、５０％以下に近い分解効率を示したガイドＲＮＡの全ての組合せを組合せアプローチに使用することができる。
実験設計２
より高いＡＡＶ力価（１構築物当たり１０００００ｖｇ／細胞）をＣａｌｕ－３細胞（３００００細胞／ウェル）の形質導入に用いる新たな実験設計を開発した（図７Ａを参照されたい）。４８時間後に、ＡＡＶ－形質導入細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを更に感染させ、培養培地を２４ｈｐｉ及び４８ｈｐｉの時点で回収した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性をプラークアッセイによって測定した。結果を図７Ｂに示す。異なるｇＲＮＡの組合せで処理した３つ全てのサンプル（Ｄ～Ｆ）は、非処理の対照サンプルと比較して有意な効果を示した。３つのガイドＲＮＡの組合せＤは、２４時間以内にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２力価の９３％の低下を示し、４８時間以内に９４％の低下を示した。４つのガイドＲＮＡの組合せＦは、２４時間以内に９８％の低下を示し、４８時間以内に９５％の低下を示した。５つのガイドＲＮＡの組合せＥは、２４時間以内に９４％の低下を示し、４８時間以内に１００％の低下を示した。
１つのＡＡＶで幾つかのガイドＲＮＡを送達することができるマルチガイドＲＮＡ構築物も含めて実験を繰り返した。これらには、配列番号４２のｑｕａｄｇｕｉｄｅ構築物及びＮＴＤがＣ末端に融合したＣａｓ１３ｄをコードする配列番号４４の構築物が含まれていた。結果を図８に示す。
参照文献
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Claims (41)

  1. １０００アミノ酸未満のサイズを有するＣａｓ１３タンパク質と併用されるガイドＲＮＡであって、ガイドＲＮＡ標的部位がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムによって構成される配列である、ガイドＲＮＡ。
  2. 前記ガイドＲＮＡ標的部位がコロナウイルス科のヒト関連ウイルスのゲノム間で保存されている配列である、請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
  3. 前記ガイドＲＮＡ標的部位がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのそれぞれのゲノム間で保存されている配列である、請求項２に記載のガイドＲＮＡ。
  4. 前記ガイドＲＮＡ標的部位がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのゲノム内のＯｒｆ１ａｂ領域、Ｓ領域、Ｅ領域、Ｍ領域及びＮ領域の１つ以上によって構成される配列である、請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
  5. 前記ガイドＲＮＡの配列が配列番号１～配列番号３９からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
  6. 前記ガイドＲＮＡの配列が配列番号４、配列番号６、配列番号１１～配列番号１６及び配列番号３１からなる群より選択される配列を含む、請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
  7. 前記ガイドＲＮＡの配列が配列番号４、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１からなる群より選択される配列を含む、請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
  8. Ｃａｓ１３ｄタンパク質をコードする配列と、請求項１～６のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡをコードするガイドＲＮＡ発現カセットとを含み、Ｕ６プロモーターを含む核酸分子。
  9. 請求項１～７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡを２つ以上コードする、請求項８に記載の核酸分子。
  10. 配列番号４、配列番号７及び配列番号１５；配列番号１５、配列番号２３及び配列番号３１；配列番号１５、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号２３及び配列番号３１；配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１；配列番号４、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；又は配列番号２９、配列番号３０及び配列番号３１の配列を含むガイドＲＮＡをコードする、請求項９に記載の核酸分子。
  11. 配列番号４、配列番号７及び配列番号１５；配列番号４、配列番号１５、配列番号２３、配列番号２７及び配列番号３１；並びに配列番号４、配列番号７、配列番号２７及び配列番号３１の配列を含むガイドＲＮＡをコードする、請求項１０に記載の核酸分子。
  12. プラスミドである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  13. 単一プラスミドである、請求項１２に記載の核酸分子。
  14. 前記配列によってコードされる前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まない、請求項８～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  15. 前記配列によってコードされる前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質のＮ末端結合ドメイン（Ｎ－ＮＴＤ）を含む融合タンパク質である、請求項８～１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  16. 請求項１～７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡのスペーサー配列を配列番号４０のプラスミドｐＡＡＶ２－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄに挿入するか、又は請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのガイドＲＮＡの少なくとも１つのスペーサー配列を配列番号４１のプラスミドｐＡＡＶ２－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ａｒｒａｙ－ｔｒｉｇｕｉｄｅ、配列番号４２のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ｑｕａｄｇｕｉｄｅ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－Ｖ３－ｂａｓｉｃ、配列番号４３のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ＳａｐＩ、若しくは配列番号４４のプラスミドｐＡＡＶ－Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－Ｃａｓ１３ｄ－ＮＴＤ－ＡａｒＩに挿入することによって得られる、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  17. 請求項８～１６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むＡＡＶベクター。
  18. ＡＡＶ２ベクター又はＡＡＶ９ベクターである、請求項１７に記載のＡＡＶベクター。
  19. ＡＡＶベクター骨格のサイズが縮小されている、請求項１８に記載のＡＡＶベクター。
  20. 請求項８～１６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むアデノウイルスベクター。
  21. 請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター又は請求項２０に記載のアデノウイルスベクターを含む医薬組成物。
  22. 請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのガイドＲＮＡと、Ｃａｓ１３タンパク質をコードする少なくとも１つのｍＲＮＡとを含む医薬組成物。
  23. 前記Ｃａｓ１３タンパク質がＣａｓ１３ｄタンパク質又はＣａｓ１３ａタンパク質である、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 前記ｍＲＮＡによってコードされる前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まない、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 前記ｍＲＮＡによってコードされる前記Ｃａｓ１３ｄタンパク質が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質のＮ末端結合ドメイン（Ｎ－ＮＴＤ）を含む融合タンパク質である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. 請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター、又は請求項２１～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ヒト関連ウイルスによる疾患又は症候群を治療する方法。
  27. 前記疾患又は症候群がＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群に遺伝的に関連しているコロナウイルスの感染の結果である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記疾患がＣＯＶＩＤ－１９である、請求項２７に記載の方法。
  29. Ｃａｓ１３が発現により前記ヒト関連ウイルスを切断する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ＡＡＶベクター、前記アデノウイルスベクター又は前記医薬組成物を、上気道を介して、好ましくは鼻腔内若しくは気管内に、又は吸入器若しくは噴霧器によってエアロゾル組成物中で投与する、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＡＡＶベクター、前記アデノウイルスベクター又は前記医薬組成物を人工呼吸器によって投与する、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ＡＡＶベクター、前記アデノウイルスベクター又は前記医薬組成物を心筋に投与する、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ヒト関連ウイルスによる疾患又は症候群の治療用の、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  34. ヒト関連ウイルスによる疾患又は症候群の治療用の、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
  35. ヒト関連ウイルスによる疾患又は症候群の治療用の、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  36. 前記疾患又は症候群がＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群に遺伝的に関連しているコロナウイルスの感染の結果である、請求項３３に記載の使用のためのＡＡＶベクター、請求項３４に記載の使用のためのアデノウイルスベクター、又は請求項３５に記載の使用のための医薬組成物。
  37. 前記疾患がＣＯＶＩＤ－１９である、請求項３６に記載の使用のためのＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物。
  38. Ｃａｓ１３が発現により前記ヒト関連ウイルスを切断する、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物。
  39. 前記ＡＡＶベクター又は前記医薬組成物が上気道を介して、好ましくは鼻腔内若しくは気管内に、又は吸入器若しくは噴霧器によってエアロゾル組成物中で投与される、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物。
  40. 前記ＡＡＶベクター又は前記医薬組成物が人工呼吸器によって投与される、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物。
  41. 前記ＡＡＶベクター又は前記医薬組成物が心筋に投与される、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター又は医薬組成物。
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