CN115667512A - 用于治疗冠状病毒诱导疾病的一体式腺相关病毒 (aav) 载体 - Google Patents

用于治疗冠状病毒诱导疾病的一体式腺相关病毒 (aav) 载体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗冠状病毒感染的新方法，特别是由MERS‑CoV、SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2变体引起的感染。基于有效靶向和切割单链RNA病毒，本发明提供了Cas13d向导RNA，以将Cas13d蛋白向导至人源化冠状病毒科基因组中MERS‑CoV、SARS‑CoV和SARS‑CoV‑2之间保守区域的靶位点。本发明还提供了一种AAV载体，其包含这种Cas13d向导RNA表达盒，以及AAV载体用于治疗冠状病毒感染，尤其是COVID‑19感染。

Description

用于治疗冠状病毒诱导疾病的一体式腺相关病毒 (AAV) 载体
技术领域
本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明提供了包含编码Cas13d的序列和用于切割单链病毒RNA的向导RNA的腺相关病毒 (AAV) 载体，也包括提供这样的向导RNA。
背景技术
最近正在发生的新冠状病毒SARS-CoV-2的爆发导致了世界范围内的感染和死亡的发生率非常高。病毒的基本繁殖数(R0) (约为3)将不可避免地导致冠状病毒病例数的甚至更高的增加。已知SARS-CoV-2病毒株极具感染性，主要通过飞沫或呼吸道分泌物通过呼吸道传播。SARS-CoV-2感染通常导致明显的肺损伤和严重的急性呼吸综合征。SARS-CoV-2是冠状病毒家族(冠状病毒科)的成员，冠状病毒家族是广泛的单链RNA病毒家族，通常被认为会导致多种人类疾病，包括普通感冒和急性疾病，如MERS（MERS CoV）和SARS（SARS CoV）[1]。尽管迫切需要有效的临床治疗策略，但是目前还没有可用的治疗或预防性疗法或有希望的药物候选物用于治疗SARS-CoV-2。
能够有效靶向和切割单链RNA（ssRNAs）的CRISPR/Cas系统可能提供一种治疗SARS-CoV-2的方法。考虑到各种Cas蛋白，Cas13，特别是Cas13d变体，似乎是用于这种方法的有希望的候选物，因为最近的研究已经突出了Cas13在包括哺乳动物细胞的若干模型系统中有效且特异性地靶向和切割ssRNA的能力[2]。
参考文献
[1]国际病毒分类委员会冠状病毒科研究组，“严重急性呼吸综合征相关冠状病毒种：2019年分类nCoV并命名为SARS-CoV-2”，《自然微生物学》(5)：536-544，2020。
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[9]Abbott TR等，“CRISPR作为抗击新冠状病毒和流感的预防策略的开发”，《bioRxiv》，2020。
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[11]Grieger CJ 和 Samulski RJ，“腺相关病毒血清型的包装容量：较大基因组对传染性和进入后步骤的影响”，《病毒学杂志》79 (15)：9933-9944，2005。
发明内容
本发明提供了一种新的候选药物和治疗方案，通过启动Cas13介导的对感染哺乳动物细胞的单链RNA的切割，用于治疗由冠状病毒科病毒引起的感染，特别是由SARS-CoV、MERS-CoV和最近鉴定的SARS-CoV-2引起的感染。因此，本发明提供了向导RNA，其将Cas13蛋白、优选Cas13d蛋白向导至它们各自的靶位点，所述靶位点来自冠状病毒科家族、特别是家族成员SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的病毒基因组中。本发明还提供了包含Cas13向导RNA的AAV载体，用于引入Cas13，优选Cas13d，向人类细胞。
本发明描述了利用Cas13靶向和单链RNA切割以靶向和切割冠状病毒科的单链RNA病毒的基因，特别是家族成员MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2的基因组的用途。与Cas13相关的向导RNA，优选Cas13d相关的向导RNA，使其靶位点可能位于在冠状病毒科家族成员之间保守区中，ORF1ab、S、E、M和N的腺相关病毒（AAV）载体包含Cas13d以及向导RNA表达盒可以用作将Cas13d转运到被病毒感染的细胞中的载体。
因此，在一个实施方案中，本申请提供了用于具有少于1000个氨基酸的Cas13的向导RNA，优选用于Cas13d的向导RNA，其中所述向导RNA靶位点是SARS-CoV-2病毒所包含的序列。在另一个实施方案中，向导RNA靶位点是在冠状病毒科的人相关病毒的基因组之间的保守序列。
在另一个实施方案中，向导RNA靶位点是在SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV的基因组之间的保守序列。
在一个优选的实施方案中，向导RNA靶位点是由SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV各自基因组中的Orf1ab、S、E、M和N区中的一个或多个所包含的序列。
在一个更优选的实施方案中，向导RNA序列包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：39的序列。
特别合适的向导RNA包括任何SEQ ID NO：4，7，15，23，27和31的间隔序列。
本发明还提供了核酸分子，其包含编码Cas13d蛋白的序列和编码Cas13d的向导RNA的向导RNA表达盒，并且包含U6启动子。
在另一个实施方案中，核酸分子编码一种以上的向导RNA。
在另一个实施方案中，所述核酸分子编码向导RNA包含序列SEQ ID NO：4，7和15；SEQ ID NO：15，23和31；SEQ ID NO：15，27和31；SEQ ID NO：23，27和31；SEQ ID NO：4，15，23、27和31；SEQ ID NO：4，7，27和31；SEQ ID NO：4，23和31；SEQ ID NO：7，27和31；SEQ IDNO：4，7、15、23、27和31；或SEQ ID NO：29，30和31。
在另一个实施方案中，所述核酸分子编码向导RNA包含序列SEQ ID NO：4，7和15；SEQ ID NO：4，15，23，27和31；和SEQ ID NO：4，7，27和31。
在另一个实施方案中，核酸分子是质粒。
在优选的实施方案中，核酸分子是单个质粒。
在另一个实施方案中，由所述序列编码的Cas13d蛋白不包含核定位信号(NLS)。
在另一个实施方案中，由所述序列Cas13d蛋白编码的是包含SARS-CoV-2核壳蛋白的N-末端结合结构域(N-NTD)的融合蛋白。
在另一个实施方案中，核酸分子可通过将向导RNA的间隔序列插入SEQ ID NO：40的质粒pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d中来获得；或通过将至少一种向导RNA的至少一个间隔序列插入SEQ ID NO：41的质粒pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Array Triguide，SEQ ID NO：42的质粒pAAV-U6-gRNA-Quadguide-CMV-Cas13d-V3-Basic，SEQ ID NO：43的质粒pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-SapI，或SEQ ID NO：44的质粒pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTD-AarI中。
本发明还提供了包含所述核酸分子的腺相关病毒（AAV）载体。
在优选的实施方案中，AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6和AAV9，优选AAV2载体。
在另一个优选实施方案中，AAV载体是AAV9载体。
在另一个实施方案中，AAV载体主链与全长转录物相比大小减小。
本发明还提供了包含所述核酸分子的腺病毒载体。
本发明还提供了包含AAV载体或腺病毒载体的药物组合物。
本发明还提供了包含至少一种如上所述的向导RNA和至少一种编码Cas13蛋白的mRNA的药物组合物。
在一个实施方案中，Cas13蛋白是Cas13d蛋白或Cas13a蛋白。
在另一个实施方案中，由所述mRNA编码的Cas13d蛋白不包含核定位信号(NLS)。
在另一个实施方案中，由所述mRNA编码的Cas13d蛋白是包含SARS-CoV-2核壳蛋白的N-末端结合结构域(N-NTD)的融合蛋白。
本发明还涉及治疗与人相关病毒诱导的疾病或综合征的方法，包括向有需要的患者施用AAV载体、腺病毒载体或药物组合物。
在一个实施方案中，病毒诱导的疾病或综合征是由与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV遗传相关的冠状病毒感染引起的。
在优选的实施方案中，所述疾病是COVID-19。
在另一个实施方案中，在表达后，Cas13d蛋白切割人相关病毒。
在优选的实施方案中，AAV载体、腺病毒载体或药物组合物通过上呼吸道给药，优选鼻内或气管内给药，或以气雾剂组合物的形式，例如通过吸入器/喷雾器。
在另一个优选的实施方案中，AAV载体、腺病毒载体或药物组合物通过呼吸机施用于患者。
在另一优选实施方案中，将AAV载体、腺病毒载体或药物组合物给予患者的心肌。
在另一方面，本发明还提供如上所述的AAV载体、腺病毒载体或药物组合物，用于治疗人相关病毒引起的疾病或综合征。
在一个实施方案中，所述疾病或综合征是由与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2遗传相关的冠状病毒感染引起的。
在优选的实施方案中，所述疾病是COVID-19。
在另一个实施方案中，在表达后，Cas13d蛋白切割人相关病毒。
在优选的实施方案中，AAV载体、腺病毒载体或药物组合物通过上呼吸道给药，优选鼻内或气管内给药，或以气雾剂组合物的形式，例如通过吸入器或喷雾器。
在另一个优选的实施方案中，AAV载体、腺病毒载体或药物组合物通过呼吸机施用于患者。
在另一优选实施方案中，将AAV载体、腺病毒载体或药物组合物给予患者的心肌。
附图说明
图1显示了七种目前已知的Cas13蛋白的系统发生树示意图，例如如在[3]中所记载的。
图2是显示来源于SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的基因组比对的示意图。比对下方的短虚线表示Cas13d向导RNA的位置，所述向导RNA被设计为靶向基因组SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV之间的保守序列区。
图3显示了包含Cas13d编码序列以及Cas13d向导RNA表达盒pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d的AAV2质粒的载体图谱。图3A：载体图谱，特征为单一向导RNA(参见SEQ ID NO：40)。图3B：载体图谱，其说明了向导RNA间隔序列的三个插入位点(参见SEQ ID NO：41)。
图4显示了来源于SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的各个基因组的序列比对以及用于比对的序列。
图5显示了本发明的单向导RNA构建体在荧光素酶报告基因测定中的抑制效率。
图6A显示了用于在SARS-CoV-2感染的人上皮肺细胞中测试本发明的向导RNA构建体的第一个实验设计。图6B显示了在图6A的实验设计中几种向导RNA构建体组合的抑制效率。
图7A显示了用于在SARS-CoV-2感染的人上皮肺细胞中测试本发明的向导RNA构建体的第二个实验设计。图7B显示了在图7A的实验设计中几种向导RNA构建体组合的抑制效率。
图8显示了在图7A的实验设计中，向导RNA构建体和多导向RNA构建体的几种组合的抑制效率。
具体实施方式
定义
AAV载体：本文所用的术语“AAV载体”指能够将核酸序列导入靶细胞的腺相关病毒(AAV)。载体可以包含编码Cas13d的序列和/或编码向导RNA的向导RNA表达盒，并包含U6启动子。载体主链：术语“载体主链”指AAV载体的天然核酸序列。
Cas13d：如本文所用，术语“Cas13d”是指CRISPR/Cas13d系统的Cas核酸内切酶，包括RfxCas13d核酸内切酶。
保守的：术语“保守的”在此指冠状病毒科家族的某些成员的病毒基因组内的序列或序列部分，其由冠状病毒科家族的至少两个其他成员共享。
冠状病毒：本文所用的术语“冠状病毒”指冠状病毒科的任何病毒。能够感染人细胞的冠状病毒在本文中也称为人相关冠状病毒。
COVID-19：本文所用的术语“COVID-19”是指称为2019年冠状病毒病的疾病，其由SARS-CoV-2，一种冠状病毒，的感染引起。
衍生物：如本文所用的术语“衍生物”是指与本文所述的病毒密切相关的病毒。特别地，如果病毒的各自基因组显示至少50%的序列相似性，则该病毒是另一种病毒的衍生物。
向导RNA：术语“向导RNA”在此用于表示CRISPR/Cas系统的组分。在本发明的情况下，“向导RNA”指CRISPR/Cas13系统的向导RNA，例如Cas13d蛋白。向导RNA是将Cas蛋白“向导”至其靶标和切割位点的非编码的短RNA序列。向导RNA包含与目标核酸序列中的互补靶位点结合的核酸序列。例如，Cas13d的目标核酸是单链RNA序列。
人相关病毒：术语“人相关病毒”指能够感染人细胞的任何病毒。
感染：本文所用的术语“感染”是指病原体侵入生物体的身体组织，这类病原体的繁殖，以及宿主组织对病原体和它们产生的毒素的反应。如本文所用，术语“感染”是指细胞的病毒感染。
下呼吸道：如本文所用，该术语指声带、气管、支气管、细支气管和肺下方的喉部部分，包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。
MERS：术语“MERS”指疾病中东呼吸综合征，其是由MERS-CoV，一种冠状病毒，感染引起的疾病或综合征。
SARS：术语“SARS”指称为严重急性呼吸综合征的疾病，其由SARS-CoV，一种冠状病毒的感染引起。
转导：本文所用的术语“转导”是指通过病毒载体将核酸有意导入细胞。特别地，“转导”指将AAV载体导入细胞。
上呼吸道：如本文所用，该术语指鼻和鼻道、鼻旁窦、咽以及声带上方的喉部部分。
本发明的示例性优点
本发明涉及病毒基因组的靶向和切割，例如在冠状病毒为单链RNA基因组的情况下，使用Cas13蛋白、优选Cas13d蛋白，来抑制或消除病毒的复制能力。
因此，本发明提供了一种向导RNA，用于将Cas13蛋白、优选Cas13d蛋白向导至病毒基因组中的相应靶标和切割位点。本发明人基于以下观察设计了本发明的向导RNA：从动物传播给人类的冠状病毒具有一个或多个共同的保守区，并且这些保守区可能是造成这种与人相关的冠状病毒的高度感染能力的原因。具体而言，本发明人鉴定并表征了31种不同的向导RNA序列，这些向导RNA序列靶向相应病毒序列的那些高度保守区(SEQ ID NO：1至SEQID NO：31)。
在目前已知的Cas蛋白家族中，II类，VI型Cas13是具有最小尺寸的RNA靶向核酸内切酶，其有大约930个氨基酸。Cas13d已被证明在哺乳动物细胞中具有高水平的催化活性和特异性。因此，Cas13d似乎特别适合于单链RNA病毒如冠状病毒的有效转导和特异性靶向和降解。
本发明还提供了AAV载体，其包含这些向导RNA以及编码具有少于1000个氨基酸的Cas13蛋白，优选Cas13d的序列。AAV载体已广泛用于基因递送方法。然而，与普通AAV转导系统相反，本发明中使用的AAV载体核酸是单组分系统。因此，转导靶细胞和表达相关蛋白所需的所有元件都包含在单个载体核酸中，从而有利于转导过程。为了进一步加速转导并提高转导效率，载体核酸也被减至最小尺寸。与常规的双载体核酸系统相比，这种一体式AAV-Cas13-gRNA构建体显示了更高的效率和更少的副作用。由于AAV2载体在III期临床试验期间在肺中显示高转导能力，本文公开的AAV载体优选基于AAV2载体。
本AAV载体可包含单一Cas13，优选Cas13d，向导RNA的编码序列，或两种或更多种Cas13的组合，优选Cas13d，和所述的向导RNA。使用一种以上的向导RNA可以进一步提高靶向和切割病毒的效力。此外，几种向导RNA的组合还可以提高对进一步突变病毒的效力和特异性，例如本文所述病毒的衍生物。
本发明的合适的向导RNA间隔序列是基于几种人相关冠状病毒科病毒株的序列比对(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：31)设计的。尤其是将MERS-CoV考虑到向导RNA序列的设计中，其与另两种密切相关的冠状病毒SARS-CoV和SARS-CoV-2具有较低序列相似性，进而可以识别病毒基因组中使病毒靶向人细胞的那些区域。这些向导RNA间隔序列以及相应设计的其它间隔序列也允许特异性靶向和切割用于冠状病毒科菌株，其可能在未来才具有临床相关性。
实施例
由新发现的SARS-CoV-2感染引起的新冠肺炎疫情的爆发已经导致在全球范围内仅在几个月内有将近1,000,000感染和50,000死亡。虽然显然存在迫切的需要，但是迄今为止还没有有效的药物，并且疫苗的开发估计需要大约12-18个月。因此，非常需要有前景的新治疗方法。
新发现的SARS-CoV-2属于冠状病毒科家族，是正单链RNA病毒的一大家族。冠状病毒科的病毒通常感染呼吸系统，并被认为是造成许多人类疾病和病症的原因，所述疾病和病症的范围从普通感冒到更严重的疾病，例如MERS (MERS-CoV)和SARS (SARS-CoV) [1]。已经报道SARS-CoV-2包含10种不同的蛋白(ORF1ab，S，ORF3a，E，M，ORF6，ORF7a，ORF8，N，ORF10) (GenBank条目号MN908947.3)。图4显示了衍生自MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2的基因组之间的序列比对。
最近发现和进化的CRISPR/Cas系统为真核细胞的基因修饰提供了一个高效、特异和简单的系统，从而彻底改变了基因编辑。作为效应蛋白的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cas)和用于将Cas蛋白向导至核酸内的特定靶序列的向导RNA代表了系统的唯一需要的组分，其允许精确切割核酸和/或遗传修饰的细胞，甚至整个有机体的[4]。
在已知的Cas蛋白家族中，II类，VI型Cas13最近已经被发现并分类为四种不同的亚型：Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d [5]。Cas13d尺寸小，在哺乳动物细胞中显示高催化活性和特异性，并能靶向和切割单链RNA。因此，Cas13d提供了通过降解单链病毒RNA来抗击病毒侵入的令人兴奋的新方法。
然而，使用Cas13d对抗病毒感染的主要障碍是将Cas蛋白及其向导RNA递送至(感染的)细胞中。
腺相关病毒是细小病毒科的无包膜单链DNA病毒。已经确定了几种血清型，其中AAV2可能是最著名的。腺相关病毒表现出某些特征，使它们成为有效的基因递送工具，例如低致病性和低免疫原性，同时具有广泛的趋向性[6]。
因此，本发明提供了一种新的治疗方法，用于治疗人相关冠状病毒诱导的疾病和/或综合征，特别是COVID-19，该方法通过给予患者AAV载体来进行，所述AAV载体包含编码Cas13d蛋白的序列以及Cas13d向导RNA，所述向导RNA用于靶向病毒基因组内的特定靶位点以切割靶序列并降解病毒。本发明还提供了所述的向导RNA，其经工程改造以与病毒基因组内的非常有前景的靶位点相互作用。
向导RNA
本发明的Cas13向导RNA，优选Cas13d向导RNA，指向人相关冠状病毒或其衍生物的基因组内的单链RNA靶序列。本申请公开的向导RNA的靶位点特异性地指向冠状病毒科家族的几个成员的保守序列和/或序列部分，优选在MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2之间。
典型的Cas13d向导RNA靶向22-30 nt靶序列(间隔区) [2]。因此，本发明的向导RNA可以指向冠状病毒基因组内的任何22-30 nt靶序列。Konermann等人[3]讨论了本文中使用的典型指导RNA。
本发明的向导RNA序列是根据以下设计方法之一设计的：
(1)对不同冠状病毒株的基因组序列的序列比对，优选SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的基因组序列的序列比对。设计22-30 nt的间隔序列，使得种子区域与比对的病毒基因组序列之间100%重叠的区域完全匹配。间隔区序列的其余部分与至少一个病毒序列相同，优选SARS-CoV2，但可能仅部分匹配其余序列。因此，根据该方法，对所有三种冠状病毒的切割效率都特别高，而对于间隔序列完全匹配的病毒，向导RNA的亲和力实现最大化。
(2)对不同冠状病毒株的基因组序列的序列比对，优选SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的基因组序列的序列比对。设计22-30 nt的间隔序列，使得种子区与至少一个病毒序列完全匹配，优选SARS-CoV-2。与第一种方法相反，在一些病毒序列内，间隔序列的种子区与各自的靶序列的不匹配是可以容忍的。通过这种方法设计的向导RNA间隔序列具有非常高的结合亲和力，但是针对与间隔序列不完全匹配的那些病毒的切割效率降低。
(3)对不同冠状病毒株的基因组序列的序列比对，优选SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的基因组序列的序列比对。设计22-30 nt的间隔序列，使得向导RNA间隔序列对于已经进行序列比对的冠状病毒科家族的所有成员具有最佳的总体匹配度。基于向导RNA间隔序列与种子区所有比对的冠状病毒成员的各自靶序列具有100%序列相似性的要求，向导RNA间隔序列与比对的冠状病毒成员中各自序列的总体序列相似性可达到高达95%。这种方法的向导RNA适用未来冠状病毒变体为靶向的可能性最大。
因此，在一个实施方案中，向导RNA指向冠状病毒科病毒基因组保守区内的靶序列，优选人相关冠状病毒基因组。
在一个优选的实施方案中，向导RNA指向MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2或其衍生物的基因组保守区内的靶序列。
在一个优选的实施方案中，向导RNA指向SARS-CoV-2基因组或其衍生物内的靶序列。
在一个优选的实施方案中，向导RNA包含SEQ ID NO：1-39中任一间隔序列或其组合，如本申请表1所示。
例如，向导RNA可以包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39的间隔序列，或其任何组合。
在另一个优选的实施方案中，向导RNA包含SEQ ID NO：1-31中任一间隔序列或其组合。
例如，向导RNA间隔序列可以包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31的间隔序列，或其任何组合。
在更优选的实施方案中，向导RNA包含SEQ ID NO：3、4、11-20、22、29或31的间隔序列，或其组合。
向导RNA间隔序列可以包括例如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31，或其组合的间隔序列。
在最优选的实施方案中，向导RNA包含SEQ ID NO：3、4、11、12、19、20、22或29的间隔序列，或其组合。
向导RNA间隔序列可以包含例如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：29，或其组合的间隔序列。
在另一个最优选的实施方案中，该向导RNA包含SEQ ID NO：13-18或31中任一的间隔序列。
在另一个最优选的实施方案中，该向导RNA包含SEQ ID NO：4、6、11-16和31中任一的间隔序列。
特别合适的向导RNA间隔序列包括SEQ ID NO：4、7、15、23、27和31。
向导RNA间隔序列可以包含例如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：31，或其组合的间隔序列。
表1：本发明的向导RNA间隔序列
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 584225DEST_PATH_IMAGE002
在上述列出的间隔序列中，名为“gRNA _ XX-O-1”至“gRNA _ XX-O-18”的序列靶向ORF1ab基因，“gRNA _ XX-S-1”至“gRNA _ XX-S-4”的序列靶向“S”刺突蛋白基因，“gRNA_ XX-E-1”至“gRNA _ XX-E-4”的序列靶向包膜蛋白基因，“gRNA _ XX-M-1”至“gRNA _ XX-M-2”的序列靶向膜蛋白基因，“gRNA _ XX-N-1”至“gRNA _ XX-N-3”的序列靶向核壳蛋白基因。
Cas13d
根据本发明，选择Cas13，优选Cas13d作为用于切割和靶向冠状病毒基因组的核酸内切酶。由于其小尺寸和在哺乳动物细胞中的高靶向和切割效力和特异性，该CRISPR/Cas成员似乎特别适合于抗病毒方法。
如同其它Cas13家族酶一样，Cas13d具有独立地将其自身的CRISPR阵列独立加工成成熟的向导RNA的特性，该向导RNA含有一个30个碱基对的5 '直接重复序列，其后是长度范围为22至30 bp的可变3 '间隔区。
迄今为止，已经鉴定了七种不同的Cas13d蛋白(图1)：EsCas13d、RffCas13d、UrCas13d、RaCas13d、P1E0 Cas13d、Adm Cas13d和RfxCas13d。在这些Cas13d变体中，已经报道RfxCas13d显示具有低脱靶活性和高RNA敲除效力[2]。
因此，在一些实施方案中，可以使用任何的Cas13d核酸内切酶。
在优选的实施方案中，使用RfxCas13d核酸内切酶。
包含编码Cas13d的序列并且包含向导RNA表达盒的AAV载体
本发明的AAV载体包含Cas13d向导RNA表达盒和编码Cas13d蛋白的序列。AAV载体用作将CRISPR/Cas13d系统转运到细胞中的载体，所述细胞包括感染病毒的细胞。
AAV载体是一种众所周知的适于多种应用的基因递送工具。依赖于各自的AAV血清型，AAV载体表现出显著的向性，因此允许靶细胞的定向转导。例如，AAV9已被证明对心肌细胞显示向性，因此认为基于AAV9的载体适于将基因递送至这些细胞(参见例如Kupatt等的专利EP3132041)。类似地，基于AAV2的载体已显示治疗人的囊性纤维化的潜力，如Guggino等[7] (也参见[8])所讨论的。[116] AAV载体具有仅约4.7 kb的包装限制，对于大多数转导方法而言，其需要使用多于一个的载体，以便转移所需的所有遗传元件。
然而，通过选择相对小的Cas13d，并且在必要时另外从AAV载体中除去非必需元件，本发明提供了一种包含单个AAV载体，其包含Cas13d及其向导RNA在转导细胞中表达所需的所有元件。
类似地，可以使用不超过AAV载体包装大小的其它Cas13蛋白。因此，具有少于1000个氨基酸的Cas13蛋白非常适合为本发明的载体。
图3A和图3B描述了编码Cas13d和向导RNA的AAV2载体质粒的示例性示意图。
本发明的AAV载体可基于多种AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。
在优选实施方案中，AAV载体基于AAV1、AAV2、AAV5或AAV9。
在更多的优选实施方案中，AAV载体基于AAV2。
在另一个更优选的实施方案中，AAV载体基于AAV9。
在最优选的实施方案中，AAV载体质粒是pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d (参见SEQID NO：40)。
在另一个优选实施方案中，AAV载体质粒是pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Array-Triguide (参见SEQ ID NO：41)，其允许插入三个向导RNA序列。
在另一个优选实施方案中，AAV载体质粒是pAAV-U6-gRNA-quadguide-CMV-Cas13d-V3-basic(参见SEQ ID NO：42)，其允许插入四个向导RNA序列。使用SEQ ID NO：42的载体质粒产生AAV载体将导致5064 bp的具有SEQ ID NO：45的序列的DNA包装到AAV载体中。
通过在Cas13d蛋白的编码序列中不包括核定位序列(NLS)可以减小AAV载体货物的大小。SARS-CoV-2增殖发生在胞质溶胶中。因此，通过使用无NLS的Cas13d蛋白，可以增强Cas13d在胞浆中的积累，同时减小蛋白质和编码它的构建体的大小。编码无NLSs的Cas13d蛋白的合适载体质粒是pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-SapI (参见SEQ ID NO：43)。使用SEQID NO：43的载体质粒产生AAV载体将导致4833 bp的具有SEQ ID NO：46的序列的DNA包装到AAV载体中。
优选地，AAV载体含有小于5kb的DNA。当细胞大小大于5kb时，包装效率和细胞表达显著下降[11]。
为了进一步促进Cas13d蛋白与SARS-CoV-2基因组的结合，可以将N-末端RNA结合结构域(N-NTD)融合到Cas13d蛋白。N-NTD是SARS-CoV-2核壳(N)蛋白的RNA结合结构域。感染期间核壳蛋白的主要功能是结合病毒RNA并形成螺旋核糖核蛋白(RNP)复合物，以保护病毒基因组并维持可靠的病毒复制。核壳蛋白的N-末端结合结构域(N-NTD)捕获病毒RNA基因组，C-末端结构域通过其与M蛋白的相互作用将RNP复合物锚定到病毒膜上。因此，N-NTD与Cas13d蛋白的融合有望促进包含Cas13d和病毒基因组的复合物的形成，从而引导Cas13d与病毒基因组在空间上接近。编码N-NTD融合到其C-末端的Cas13d蛋白的合适载体质粒是pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTD-AarI (参见SEQ ID NO：44)。使用SEQ ID NO：44的载体质粒产生AAV载体将导致5238 bp的具有SEQ ID NO：47的序列的DNA包装到AAV载体中。
根据本发明的AAV载体基于哪种血清型，AAV载体可对某些细胞类型、含有这些细胞类型的组织和器官显示向性。
因此，通过选择AAV载体的特定血清型，本发明的AAV载体可指向人体中的各种细胞类型和器官。
在优选的实施方案中，AAV载体对人呼吸系统的细胞显示向性，并指向人类呼吸系统的细胞。
在更优选的实施方案中，AAV载体是指向人呼吸系统细胞的AAV2载体。
在另一个优选实施方案中，AAV载体指向人心肌细胞。
在更优选的实施方案中，AAV载体是指向人心肌细胞的AAV9载体。
本发明的AAV载体可编码单一Cas13d向导RNA或多种向导RNA的组合。因此，AAV载体可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个向导RNA。
在优选的实施方案中，AAV载体编码单一的向导RNA。
在另一个优选的实施方案中，AAV载体编码两种向导RNA。
在最优选的实施方案中，AAV载体编码三种、四种或五种向导RNA。优选地，向导RNA的间隔序列靶向SARS-CoV-2基因组的不同基因。
本发明中使用的向导RNA的合适组合具有SEQ ID NOs的间隔序列：SEQ ID NO：4，7和15；SEQ ID NO：15，23和31；SEQ ID NO：15，27和31；SEQ ID NO：23，27和31；SEQ ID NO：4，15，23，27和31；SEQ ID NO：4，7，27和31；SEQ ID NO：4，23和31；SEQ ID NO：7，27和31；SEQID NO：4，7，15，23，27和31；和SEQ ID NO：29，30和31。
用于本发明特别优选的向导RNA具有SEQ ID NO的间隔序列：SEQ ID NO：4，7和15；SEQ ID NO：4，15，23，27和31；和SEQ ID NO：4，7，27和31。
在优选的实施方案中，AAV载体对同一启动子下的向导RNA组合进行编码。
用于治疗病毒感染的编码Cas13d和Cas13d向导RNA的AAV载体
本发明提供了一种治疗人相关冠状病毒感染的新的治疗方法。通过将AAV载体导入细胞，并且在Cas13表达时，Cas13被向导RNA向导至病毒基因组内的靶序列，以进行切割从而破坏基因组序列。在已经感染冠状病毒的细胞Cas13中，病毒序列被切割，导致病毒降解，并抑制病毒污染的任何额外传播。在尚未感染的细胞中，Cas13向导RNA系统的表达通过在进入细胞后立即降解病毒遗传物质，而为细胞提供保护机制。
为了到达靶细胞，AAV载体被递送到含有靶细胞的组织和器官中。
根据目前的报道，冠状病毒引起的疾病主要表现在感染受试者的呼吸系统中，导致轻度至重度的呼吸症状和反应。特别地，MERS、SARS和COVID-19冠状变体通常导致肺炎、肺窘迫和急性呼吸综合征，通常由过度免疫系统的细胞因子风暴引起或驱动。其它科学出版物报道了表明至少有COVID-19变体也可能对一些患者的心肌产生不利影响的发现。因此，在患者治疗期间，AAV载体被递送到呼吸系统，特别是肺和/或心肌。
因此，在一个实施方案中，将用于治疗人相关冠状病毒诱导的疾病的AAV载体给予患者的呼吸系统。
在另一实施方案中，将AAV载体给予患者的下呼吸道。
在优选实施方案中，AAV载体通过吸入方式给药至上呼吸道。
AAV载体可直接给予气管组织。
在特异性治疗MERS、SARS和/或COVID-19的实施方案中，可将AAV载体施用到患者的上呼吸道。
在治疗MERS、SARS和/或COVID-19的另一个实施方案中，可将AAV载体施用到患者的下呼吸道。
包含向导RNA表达盒和编码Cas13d序列的AAV载体可包含在组合物中。
在一个实施方案中，组合物可以是片剂、胶囊、糖浆、膜、液体、溶液、粉末、糊剂、气雾剂、注射剂、霜剂、凝胶、洗剂或滴剂的形式。
在另一个实施方案中，组合物是气雾剂的形式，并且通过吸入器、喷雾器或蒸发器施用。
在优选的实施方案中，组合物是气雾剂的形式，并通过吸入器给药。
在一个更优选的实施方案中，组合物是气雾剂的形式，并通过吸入器施用到上呼吸道。
在另一个优选实施方案中，通过呼吸机向患者施用AAV载体或包含AAV载体的组合物。
腺病毒载体
本发明的所有方面也可用腺病毒载体代替AAV载体来实施。腺病毒载体具有更高包装尺寸限制的优点。
因此，腺病毒载体可以包含编码Cas13d的序列和向导RNA表达盒。腺病毒载体可以被递送到靶细胞，并且可以用于治疗人相关冠状病毒感染，例如SARS-CoV-2感染。
独立于病毒载体递送向导RNA和Cas13d蛋白
本发明的向导RNA也可以不使用病毒载体的情况下被递送至靶细胞。例如，可以使用参考文献[10]中描述的方法，包括递送通过伴随合成的向导RNA的体外转录产生的Cas13mRNA。可以使用50:1的向导RNA与Cas13d mRNA的摩尔比。mRNA和向导RNA可以通过囊泡的方式递送。
本发明提供了一种治疗人相关冠状病毒感染如SARS-CoV-2感染的方法，通过将合成的向导RNA和编码Cas13蛋白的mRNA递送至有需要的患者的呼吸道。参考文献[10]中描述了该方法的详细信息。Cas13蛋白可以是Cas13a蛋白。Cas13蛋白可以是Cas13d蛋白。mRNA和向导RNA可以通过囊泡的方式递送。
实施例
实施例1
本文公开的AAV载体的使用代表了用于预防和/或治疗冠状病毒诱导的疾病和综合征的有前景的新治疗方法。因此，目前正在进行一些临床试验，以测试这些载体载体在治疗各种疾病方面的适用性。临床试验以及各自的AAV载体测试结果如下表2所示。
表2：参与临床试验的AAV载体
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实施例2-向导RNA序列的设计
为了产生编码Cas13d和向导RNA的AAV载体以治疗人相关冠状病毒诱导的疾病，设计了向导RNA间隔序列。
与涉及SARS-CoV和MERS-CoV的情况类似，引起COVID-19的病原体SARS-CoV-2成功地在从动物到人的传播中存活。基于这一观察，本发明人认为在SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的基因组之间应该存在高度保守区，其是造成这些病毒在人类中高致病性和感染性的原因。本发明人还得出结论，此类保守基因组区域提供了用于CRISPR/Cas介导的切割的有希望的靶位点，涉及向导RNA，该向导RNA将Cas13蛋白、优选Cas13d蛋白，导向其靶位点和切割位点，从而切割和降解病毒核酸。
因此，对SARS-CoV，MERS-CoV和SARS-CoV-2冠状病毒变体来源的核酸序列进行了序列比对，并确定了五个高度保守区：ORF1ab、S、E、M和N (见图4)。鉴定了31个向导RNA间隔序列，其靶向保守区，代表了病原体切割和降解的非常有前景的靶位点（SEQ ID NO：1至SEQID NO：31）。
为了鉴定所有三种SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV变体之间的相似序列，使用三种主要方法：
(1)在第一种方法中，鉴定了间隔序列，其包含含有在所有三种病毒基因组的序列之间精确重叠的7个碱基对区的种子序列。该序列作为向导RNA间隔序列的种子区(向导RNA间隔序列的第15-21位碱基；[2])。该间隔序列的剩余部分完全匹配SARS-CoV-2序列，但仅部分匹配MERS-CoV和SARS-CoV变体。种子区被认为是Cas13d的向导RNA的靶向特异性的关键序列。因此，在关键种子序列与靶序列不匹配的情况下，Cas13d不能切割靶序列。因此，用这种方法，对所有三种冠状病毒的切割效率达到最佳，同时向导RNA对SARS-CoV-2的亲和力达到最大。
(2)在第二种方法中，通过在间隔序列的全长上增加向导RNA间隔序列和各自靶序列之间的序列相似性，增加间隔序列对病毒RNA的结合亲和力。与第一种方法不同，SARS-CoV和MERS-CoV中间隔序列的种子区域与各自的靶序列的不匹配是可以容忍的。然而，SARS-CoV-2中的种子区域序列和相应的目标序列之间的序列相似性为100%。通过这种方法设计的向导RNA间隔序列具有非常高的结合亲和力，但对MERS-CoV和SARS-CoV的切割效率降低。
(3)在第三种方法中，确定了为冠状病毒家族的所有三个成员提供最好的总体匹配的向导RNA。基于向导RNA间隔序列与种子区所有三个冠状病毒成员各自的靶序列具有100%序列相似性的要求，向导RNA间隔序列与三个冠状病毒成员各自序列的总体序列相似性达到95%。这种方法的向导RNA适用未来冠状病毒变体为靶向的可能性最大。
上述鉴定的向导RNA间隔序列已经与迄今已知的SARS-CoV-2的所有人相关病毒转录物进行了比对。从中选择出表现出高靶序列特异性并因此降低潜在的治疗诱导的副作用的风险的间隔序列，并将其各自插入pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d质粒，所述质粒包含向导RNA表达盒的U6启动子以及编码Cas13d蛋白的序列(也参见SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：40)。
实施例3-单一向导RNA序列效率的评价
通过pMir报道基因和一体式Cas13向导构建体的共转染，在荧光素酶测定中评估表1的39种向导RNA的抑制效力。使用靶向LacZ的向导RNA作为阴性对照。
第一筛选实验用非感染性材料进行。39个向导RNA (gRNAs)靶向6个不同区域：gRNA _ XX-O-1至gRNA _ XX-O-18靶向ORF1ab基因，gRNA _ XX-S-1至gRNA _ XX-S-4序列靶向“S”刺突蛋白基因，gRNA _ XX-E-1至gRNA _ XX-E-4序列靶向包膜蛋白基因，gRNA _XX-M-1至gRNA _ XX-M-2序列靶向膜蛋白基因，gRNA _ XX-N-1至gRNA _ XX-N-3靶向核壳蛋白基因。因此，我们通过PCR克隆了这6个区域，并将它们插入pMIR载体(3 ' -UTR荧光素酶载体)中，由此获得了6个荧光素酶构建体，命名为pMIR-report-SARS-COV-2-片段1-6。为了评估每种向导RNA的抑制效力，用一体式Cas13向导构建体和其相应的pMIR报道构建体共转染人胚肾(HEK293)细胞。使用LacZ向导用作阴性对照。在39个向导RNA中，最后选择7个向导序列进行进一步的实验(在图5中以红色突出显示)。
实施例4-测试SARS-CoV-2感染的人上皮肺细胞中的Cas13向导RNA系统
实验设计1
为了评价我们系统的抑制作用，我们首先将几种向导RNA构建体中的每一种包装到AAV2病毒中。每种AAV以10,000 vg /细胞(病毒基因组/细胞)的滴度，用于转导人支气管上皮Calu-3细胞(40,000细胞/孔)，其为体外冠状病毒研究的典型细胞系，具有不同的向导RNA构建体的组合。72小时后，用MOI (感染复数-指每个细胞的病毒颗粒数目)进一步感染SARS-CoV-2病毒的AAV转导细胞，在37℃孵育0.01小时后，除去感染培养基，用DPBS洗涤细胞2次。然后，在24 hpi (感染后小时)和48 hpi的时间点收集培养基。实验时间表如图6A所示。
通过噬菌斑分析测定SARS-CoV-2感染性。结果如图6B所示。菌斑测定显示，在大多数情况下，有效的单一向导RNA的组合导致抑制病毒复制的能力增加。在荧光素酶测定(实施例3)中被鉴定为有效的并在组合方法中测试的所有向导RNA均被证实在抑制活的人上皮肺细胞中的病毒复制方面是高度有效的。因此，原则上，所有表现出接近50%和更低降解效率的向导RNA组合都可以用于组合方法。
实验设计2
开发了一种新的实验设计(参见图7A)，涉及更高的AAV滴度(100,000 vg /细胞/构建体)以转导Calu-3细胞(30,000细胞/孔)。48小时后，用SARS-CoV-2病毒进一步感染AAV转导的细胞，在24 hpi和48 hpi的时间点收集培养基。
通过噬菌斑分析测定SARS-CoV-2感染性。结果如图7B所示。与未处理的对照样品相比，用不同向导RNA组合处理的所有三个样品(D-F)都显示出显著的效果。3种向导RNA的组合D显示24小时内SARS-CoV2滴度降低93%，48小时内降低94%。4种向导RNA的组合F在24小时内显示98%的减少，在48小时内显示95%的减少。5种向导RNA的组合E在24小时内显示94%的减少，在48小时内显示100%的减少。
实验还包括能够在一个AAV中递送若干向导RNA的多向导RNA构建体来重复该实验。这些包括SEQ ID NO：42的构建体和SEQ ID NO：44的构建体，其编码具有与其C-末端融合的NTD的Cas13d。结果如图8所示。
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Claims (41)

1.一种用于Cas13蛋白的向导RNA，具有小于1000个氨基酸的大小，所述向导RNA靶位点是SARS-CoV-2基因组所包含的序列。
2.如权利要求1所述的向导RNA，所述向导RNA靶位点是在冠状病毒科人相关病毒的基因组之间的保守序列。
3.如权利要求2所述的向导RNA，该向导RNA靶位点是SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV各自相应基因组之间的保守序列。
4.如权利要求3所述的向导RNA，所述向导RNA靶位点是由SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV各自基因组中的Orf1ab、S、E、M和N区中的一个或多个所包含的序列。
5.如权利要求1所述的向导RNA，所述向导RNA序列包含选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：39组的序列。
6.如权利要求5所述的向导RNA，所述向导RNA序列包含选自SEQ ID NOs：4、6、11-16及31组的序列。
7.如权利要求5所述的向导RNA，所述向导RNA序列包含选自SEQ ID NOs： 4、7、15、23、27及31组的序列。
8.一种核酸分子，其包含编码Cas13d蛋白的序列和如权利要求1-6中任一项向导RNA的编码Cas13d的向导RNA表达盒，并且包含U6启动子。
9.如权利要求8所述的核酸分子，其编码多于一种如权利要求1-7所述的向导RNA。
10.如权利要求9所述的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：4，7和15；SEQ ID NO：15，23和31；SEQ ID NO：15，27和31；SEQ ID NO：23，27和31；SEQ ID NO：4，15，23，27和31；SEQ IDNO：4，7，27和31；SEQ ID NO：4，23和31；SEQ ID NO：7，27和31；SEQ ID NO：4，7，15，23，27和31；或SEQ ID NO：29，30和31。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：4，7和15；SEQ ID NO：4，15，23，27和31；和SEQ ID NO：4，7，27和31。
12.如权利要求8-11中任一项所述的核酸分子，所述核酸分子是质粒。
13.如权利要求12所述的核酸分子，所述核酸分子是单个质粒。
14.如权利要求8-13中任一项所述的核酸分子，由所述序列编码的所述Cas13d蛋白不包含核定位信号(NLS)。
15.如权利要求8-14中任一项所述的核酸分子，由所述序列编码的所述Cas13d蛋白是包含SARS-CoV-2核壳蛋白的N-末端结合结构域(N-NTD)的融合蛋白。
16.如权利要求13-15中任一项所述的核酸分子，所述核酸分子可通过将权利要求1-7中任一项所述的向导RNA的间隔序列插入到SEQ ID NO：40的质粒pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d中来获得；或通过将如权利要求1-7中任一项的至少一种向导RNA的至少一个间隔序列插入到SEQ ID NO：41的质粒pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Array-Triguide中，或SEQ IDNO：42的质粒pAAV-U6-gRNA-Quadguide-CMV-Cas13d-V3-Basic中，或SEQ ID NO：43的质粒pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-SapI中，或SEQ ID NO：44的质粒pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTD-AarI中。
17.一种AAV载体，其包含权利要求8-16中任一项所述的核酸分子。
18.如权利要求17所述的AAV载体，所述AAV载体是AAV2或AAV9载体。
19.如权利要求18所述的AAV载体，所述AAV载体主链的大小减小。
20.一种腺病毒载体，其包含权利要求8-16中任一项的核酸分子。
21.一种药物组合物，其包含如权利要求17-19中任一项的所述AAV载体或如权利要求20所述的腺病毒载体。
22.一种药物组合物，其包含如权利要求1-7中任一项所述的至少一种的向导RNA和至少一种编码Cas13蛋白的mRNA。
23.如权利要求22的药物组合物，所述Cas13蛋白是Cas13d蛋白或Cas13a蛋白。
24.如权利要求21-23任一项的药物组合物，由所述mRNA编码的所述Cas13d蛋白不包含核定位信号(NLS)。
25.如权利要求21-24任一项的药物组合物，由所述mRNA编码的所述Cas13d蛋白是包含SARS-CoV-2核壳蛋白的N-末端结合结构域(N-NTD)的融合蛋白。
26.一种治疗人相关病毒引起的疾病或综合征的方法，包括向有需要的患者施用如权利要求17-19中任一项所述的AAV载体、如权利要求20所述的腺病毒载体或如权利要求21-25中任一项所述的药物组合物。
27.如权利要求26的方法，所述疾病或综合征是由与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2遗传相关的冠状病毒感染引起的。
28.如权利要求27的方法，所述疾病是COVID-19。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，所述Cas13在表达时切割人相关病毒。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，所述AAV载体、腺病毒载体或所述药物组合物经由上呼吸道施用，优选鼻内或气管内施用，或通过吸入器或喷雾器以气雾剂组合物施用。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，所述AAV载体、腺病毒载体或所述药物组合物通过呼吸机施用。
32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，将所述AAV载体、腺病毒载体或所述药物组合物施用至心肌。
33.如权利要求17-19任一项所述的AAV载体的用途，其用于治疗人相关病毒引起的疾病或综合征。
34.如权利要求20所述的腺病毒载体的用途，其用于治疗由人相关病毒引起的疾病或综合征。
35.如权利要求21-25中任一项所述的药物组合物的用途，其用于治疗人相关病毒引起的疾病或综合征。
36.如权利要求33所述AAV载体的用途、如权利要求34所述腺病毒载体的用途或权利要求35所述药物组合物的用途，所述疾病或综合征是由与MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2遗传相关的冠状病毒感染引起的。
37.如权利要求36所述AAV载体、腺病毒载体或药物组合物的用途，所述疾病是COVID-19。
38.用于权利要求33-37中任一项的AAV载体、腺病毒载体或药物组合物的用途，所述Cas13在表达时切割人相关病毒。
39.如权利要求33-38任一项所述AAV载体、腺病毒载体或药物组合物的用途，所述AAV载体或药物组合物经由上呼吸道施用，优选鼻内或气管内施用，或通过吸入器或喷雾器以气雾剂组合物施用。
40.如权利要求33-39中任一项所述AAV载体、腺病毒载体或药物组合物的用途，所述AAV载体或药物组合物通过呼吸机施用。
41.如权利要求33-40任一项所述AAV载体、腺病毒载体或药物组合物的用途，所述AAV载体或药物组合物将被施用至心肌。
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