ES2967509T3 - Vectores AAV todo-en-uno para el tratamiento de enfermedades inducidas por coronavirus - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un enfoque novedoso para tratar infecciones por coronavirus, particularmente infecciones causadas por variantes de MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2. Basada en atacar y escindir eficazmente virus de ARN monocatenario, la presente invención proporciona ARN guía CaslBd para guiar la proteína CaslBd a un sitio objetivo en el genoma de Coronaviridae humanizado que se conserva entre MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV- 2. La invención divulgada proporciona además un vector de AAV que comprende un casete de expresión de ARN guía CaslBd así como un CaslBd para tratar infecciones por coronavirus, especialmente infecciones por COVID-19. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vectores AAV todo-en-uno para el tratamiento de enfermedades inducidas por coronavirus
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biomedicina. Específicamente, la invención proporciona vectores AAV que comprenden secuencias que codifican Cas13d y ARN guía para escindir ARN viral monocatenario, incluyendo la provisión de dichos ARN guía.
Antecedentes de la invención
El reciente y actual brote del nuevo coronavirus SARS-CoV-2 ha provocado una incidencia dramáticamente alta de infecciones y muertes en todo el mundo. El número básico de reproducción(Rü) del virus (aproximadamente 3) provocará inevitablemente un aumento aún mayor del número de casos de coronavirus. Se sabe que la cepa vírica SARS-CoV-2 es extremadamente infecciosa y se propaga principalmente a través de las vías respiratorias, por gotitas o secreciones respiratorias. La infección por SARS-CoV-2 suele provocar lesiones pulmonares pronunciadas y síndrome respiratorio agudo grave. El SARS-CoV-2 es un miembro de la familia de los coronavirus(Coronaviridae),que es una extensa familia de virus ARN monocatenarios, frecuentemente considerados causantes de diversas enfermedades y dolencias humanas que van desde el resfriado común a enfermedades agudas como el MERS (MERS-CoV) y el SARS (SARS-CoV) [1]. Aunque existe una necesidad urgente de una estrategia de tratamiento clínico eficaz, en la actualidad no se dispone de terapias curativas o preventivas ni de un fármaco candidato prometedor para tratar el SARS-CoV-2.
Los sistemas CRISPR/Cas que pueden dirigirse y escindir eficazmente ARNs monocatenarios (ssRNAs) pueden ofrecer potencialmente un enfoque terapéutico contra el SARS-CoV-2. Teniendo en cuenta las diversas proteínas Cas, Cas13, en particular la variante Cas13d, parece ser un candidato prometedor para un enfoque de este tipo, ya que estudios recientes han puesto de relieve la capacidad de Cas13 para dirigirse y escindir ssRNAs de manera eficiente y específica en varios sistemas modelo, incluso en células de mamíferos [2]. Recientemente se han publicado las primeras consideraciones para atacar al SARS-CoV-2 utilizando Cas13d en lugar de Cas9 [12].
Así, la presente invención proporciona un nuevo candidato a fármaco y régimen terapéutico para tratar infecciones causadas por virus de la familiaCoronaviridae, en particular, infecciones derivadas de SARS-CoV, MERS-CoV y el recientemente identificado SARS-CoV-2, iniciando la escisión mediada por Cas13 de ARN monocatenario en células de mamífero infectadas. En consecuencia, la invención proporciona ARN guía que guían a la proteína Cas13, preferentemente una proteína Cas13d, a sus respectivos sitios diana en el genoma de virus derivados de la familiaCoronaviridae, en particular, de los miembros de la familia SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2. La invención proporciona además vectores AAV que comprenden ARN guía Cas13 para introducir Cas13, preferentemente Cas13d, en células humanas.
Sumario de la invención
La presente invención describe el uso de Cas13 como diana y clivaje de ARN monocatenario para diana y clivaje del genoma de un virus de ARN monocatenario de la familiaCoronaviridae, en particular de los miembros de la familia MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2. Los ARN guía asociados a Cas13, preferentemente Cas13d, pueden tener su sitio diana posicionado en regiones conservadas entre miembros de la familia delos Coronaviridae,ORFlab, S, E, M y N. Los vectores AAV que comprenden un Cas13d así como un casete de expresión de ARN guía se utilizan como vehículo para el transporte de Cas13d a una célula infectada con un virus.
Así, se proporciona un ARN guía para uso con Cas13 que tiene menos de 1000 aminoácidos, preferentemente para uso con un Cas13d, en el que el sitio diana del ARN guía es una secuencia comprendida por el virus SARS-CoV-2. El sitio diana del ARN guía puede ser una secuencia conservada entre los genomas de virus asociados a humanos de la familiaCoronaviridae.
El sitio diana del ARN guía puede ser una secuencia conservada entre los genomas de SARS-CoV-2, MERS-CoV y SARS-CoV.
El sitio diana del ARN guía puede ser una secuencia comprendida por una o más de las regiones Orflab, S, E, M y N en los genomas respectivos de SARS-CoV-2, MERS-CoV y SARS-CoV.
La secuencia de ARN guía puede comprender una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:39.
Específicamente, la invención se dirige a un ARN guía para su uso con una proteína Cas13, en el que el sitio diana del ARN guía es una secuencia comprendida por un genoma de SARS-CoV-2, en el que la secuencia de ARN guía comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31.
Los ARN guía particularmente adecuados incluyen las secuencias espadadoras de cualquiera de los SEQ ID NOs: 4, 7, 15, 23, 27 y 31.
La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína Cas13d y un casete de expresión de ARN guía que codifica un ARN guía Cas13, en el que la secuencia de ARN guía se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31 y que comprenden un promotor U6.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica más de un ARN guía.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica ARN guía que comprende las secuencias de SEQ ID NOs: 4, 7 y 15; SEQ ID NOs: 15, 23 y 31; SEQ ID NOs: 15, 27 y 31; SEQ ID NOs: 23, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 15, 23, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 7, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 23 y 31; SEQ ID NOs: 7, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 7, 15, 23, 27 y 31.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica ARN guía que comprende las secuencias de SEQ ID NOs: 4, 7 y 15; SEQ ID NOs: 4, 15, 23, 27 y 31; y SEQ ID NOs: 4, 7, 27 y 31.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico es un plásmido.
En una realización preferente, la molécula de ácido nucleico es un plásmido único.
En otra realización, la proteína Cas13d codificada por dicha secuencia no comprende una señal de localización nuclear (NLS).
En otra realización, la proteína Cas13d codificada por dicha secuencia es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión N-terminal (N-NTD) de la proteína nucleocápside del SARS-CoV-2.
En otra realización, la molécula de ácido nucleico se puede obtener insertando una secuencia espaciadora de un ARN guía en el plásmido pAAV-U6-ARNg-CMV-Cas13d de SEQ ID NO:40; o insertando al menos una secuencia espaciadora de al menos ARN guía en el plásmido pAAV-U6-ARNg-CMV-Cas13d-red triguia de SEQ ID NO:41, en el plásmido pAAV-U6-ARNg-quadguia-CMV-Cas13d-V3-básico de SEQ ID NO:42, en el plásmido pAAV-U6-ARNg-CMV-Cas13d-Sapl de SEQ ID NO:43, o en el plásmido pAAV-U6-ARNg-CMV-Cas13d-NTO-Aarl de SEQ ID NO:44. La invención proporciona además un vector AAV que comprende la molécula de ácido nucleico.
En una realización preferente, el vector AAV se selecciona del grupo de AAV1, AAV2, AAV5, AAV6 y AAV9, preferentemente un vector AAV2.
En otra realización preferente, el vector AAV es un vector AAV9.
En otra realización, se ha reducido el tamaño de la columna vertebral del vector AAV en comparación con el transcrito de longitud completa.
La invención proporciona además un vector adenoviral que comprende la molécula de ácido nucleico.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el vector AAV o el vector adenoviral.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un ARN guía como el descrito anteriormente y al menos un ARNm que codifica una proteína Cas13.
En una realización, la proteína Cas13 es una proteína Cas13d o una proteína Cas13a.
En otra realización, la proteína Cas13d codificada por dicho ARNm no comprende una señal de localización nuclear (NLS).
En otra realización, la proteína Cas13d codificada por dicho ARNm es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión N-terminal (N-NTD) de la proteína nucleocápside del SARS-CoV-2.
En otro aspecto, la invención también proporciona un vector AAV, el vector adenoviral, o una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de una enfermedad o síndrome causado por virus asociados a seres humanos.
En una realización, la enfermedad o síndrome es el resultado de una infección con un coronavirus que está genéticamente relacionado con el grupo que consiste en MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2.
En una realización preferente, la enfermedad es COVID-19.
En otra realización, tras la expresión, la proteína Cas13d escinde el virus asociado a seres humanos.
En una realización preferente, el vector AAV, el vector adenoviral o la composición farmacéutica se administrará a través de las vías respiratorias superiores, preferentemente por administración intranasal o intratraqueal o en una composición en aerosol, por ejemplo, mediante un inhalador o nebulizador.
En otra realización preferente, el vector AAV, el vector adenoviral o la composición farmacéutica se administran a un paciente mediante un ventilador.
En otra realización preferente, el vector AAV, el vector adenoviral o la composición farmacéutica se administran al miocardio del paciente.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1muestra un árbol filogenético esquemático de las siete proteínas Cas13 actualmente conocidas, por ejemplo, según se informa en [3].
La Figura 2es un esquema que ilustra una alineación de genomas derivados de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Los guiones cortos debajo de la alineación indican la ubicación de los ARN guía Cas13d que están diseñados para dirigirse a las regiones de secuencias conservadas entre los genomas SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV.
La Figura 3muestra un mapa vectorial del plásmido AAV2 que comprende la secuencia codificante Cas13d, así como un casete de expresión de ARN guía Cas13d pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d.Figura 3A:Mapa vectorial con un único ARN guía (véase SEQ ID NO:40).Figura 3B:Mapa vectorial que ilustra tres sitios de inserción para las secuencias espaciadoras de ARN guía (véase SEQ ID NO:41).
La Figura 4ilustra una alineación de secuencias de los respectivos genomas derivados de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV, así como las secuencias utilizadas para la alineación.
La Figura 5muestra la eficacia inhibidora de las construcciones de ARN guía únicas de la invención en un ensayo reportero de luciferasa.
La Figura 6Amuestra un primer diseño experimental para probar construcciones de ARN guía de la invención en células pulmonares epiteliales humanas infectadas por SARS-CoV-2.La Figura 6Bmuestra la eficacia inhibidora de varias combinaciones de construcciones de ARN guía en el diseño experimental dela Figura6A.
La Figura 7Amuestra un segundo diseño experimental para probar construcciones de ARN guía de la invención en células pulmonares epiteliales humanas infectadas con SARS-CoV-2.La Figura 7Bmuestra la eficacia inhibidora de varias combinaciones de construcciones de ARN guía en el diseño experimental dela Figura 7A.
La Figura 8muestra la eficacia inhibidora de varias combinaciones de construcciones de ARN guía y construcciones de ARN multiguía en el diseño experimental dela Figura 7A.
Descripción detallada de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Definiciones
Vector AAV:El término "vector AAV", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un virus adenoasociado (AAV) capaz de introducir una secuencia de ácido nucleico en células diana. El vector puede comprender una secuencia que codifica Cas13d y/o un casete de expresión de ARN guía que codifica un ARN guía y comprende un promotor U6.
Vector backbone:El término "columna vertebral del vector" se refiere a las secuencias nativas de ácido nucleico de un vector AAV.
Cas13d:Tal como se utiliza en el presente documento, el término "Cas13d" se refiere a una endonucleasa Cas de un sistema CRISPR/Cas13d, incluida la endonucleasa RfxCas13d.
Conservado:El término "conservado" se refiere en la presente memoria a secuencias o porciones de secuencias dentro de genomas virales de ciertos miembros de la familiaCoronaviridaeque son compartidas por al menos otros dos miembros de la familiaCoronaviridae.
Coronavirus:El término "coronavirus" se refiere a cualquier virus de la familiaCoronaviridae.Un coronavirus capaz de infectar células humanas también se denomina en el presente documento coronavirus asociado a seres humanos.
COVID-19:El término "COVID-19", tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a la enfermedad conocida comoEnfermedad por Coronavirus 2019,causada por una infección de SARS-CoV-2, un tipo de coronavirus.
Derivado:El término "derivado", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un virus que está estrechamente relacionado con un virus tal y como se describe en el presente documento. En particular, un virus es un derivado de otro virus si sus respectivos genomas muestran una similitud de secuencia de al menos el 50%.ARN guía:El término "ARN guía" se utiliza en la presente memoria para designar un componente de un sistema CRISPR/Cas. En el presente caso, "ARN guía" se refiere a un ARN guía de un sistema CRISPR/Cas13, por ejemplo, una proteína Cas13d. Un ARN guía es una secuencia corta de ARN no codificante que "guía" a la proteína Cas hasta su objetivo y lugar de corte. El ARN guía comprende una secuencia de ácido nucleico que se une a un sitio diana complementario en una secuencia de ácido nucleico diana. A modo de ejemplo, el ácido nucleico diana de Cas13d es una secuencia de ARN monocatenario.
Virus asociado al ser humano:El término "virus asociado al ser humano" se refiere a cualquier virus capaz de infectar una célula humana.
Infección:El término "infección", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la invasión de los tejidos corporales de un organismo por agentes patógenos, la multiplicación de dichos agentes, así como la reacción del tejido huésped a los agentes patógenos y a las toxinas que producen. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "infección" se refiere a una infección vírica de una célula.
Tracto respiratorio inferior:Tal como se utiliza en la presente memoria, este término se refiere a la parte de la laringe situada por debajo de las cuerdas vocales, la tráquea, los bronquios, los bronquiolos y los pulmones, incluidos los bronquiolos respiratorios, los conductos alveolares, los sacos alveolares y los alvéolos.
MERS:El término "MERS" hace referencia a la enfermedadSíndrome Respiratorio de OrienteMedio, que es una enfermedad o síndrome causado por una infección por MERS-CoV, un tipo de coronavirus.
SARS:El término "SRAS" hace referencia a la enfermedad conocida comoSíndrome Respiratorio Agudo Severo,causada por una infección del SRAS-CoV, un tipo de coronavirus.
Transducción:El término "transducción", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la introducción deliberada de ácidos nucleicos en una célula por medio de un vehículo vírico. En particular, "transducción" se refiere a la introducción de un vector AAV en una célula.
Tracto respiratorio superior:En el presente documento, este término se refiere a la nariz y las fosas nasales, los senos paranasales, la faringe y la parte de la laringe situada por encima de las cuerdas vocales.
Ventajas ejemplares de la invención
La invención divulgada en la actualidad se relaciona con la focalización y escisión de un genoma viral utilizando una proteína Cas13, preferentemente una proteína Cas13d, para inhibir o eliminar de ese modo la capacidad de replicación del virus.
Por lo tanto, la invención proporciona un ARN guía para guiar una proteína Cas13, preferentemente una proteína Cas13d, a una diana y sitio de corte respectivos en el genoma viral. Los inventores diseñaron los a Rn guía instantáneos basándose en la observación de que los coronavirus transmitidos de animales a seres humanos tienen una o más regiones conservadas en común, y que estas regiones conservadas pueden ser responsables de la capacidad altamente infecciosa atribuible a dichos coronavirus asociados a seres humanos. En concreto, los presentes inventores identificaron y caracterizaron 31 secuencias diferentes de ARN guía dirigidas a esas regiones altamente conservadas de las respectivas secuencias virales (SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:31).
En las familias actualmente conocidas de proteínas Cas, la Clase II, Tipo VI Cas13 es la endonucleasa dirigida a ARN que tiene el tamaño más pequeño, de aproximadamente 930 aminoácidos. El Cas13d ha mostrado que posee un alto nivel de actividad catalítica y especificidad en células de mamíferos. Así pues, Cas13d parece especialmente adecuado para la transducción eficaz y la selección y degradación específicas de virus ARN monocatenarios, como los coronavirus.
[0059]La invención proporciona además un vector AAV que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias que codifican para al menos un ARN guía, en el que la secuencia de ARN guía se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31así como una secuencia que codifica un Cas13d y que comprende un promotor U6. Los vectores AAV se han utilizado ampliamente para la administración de genes. Sin embargo, a diferencia de los sistemas de transducción AAV comunes, los ácidos nucleicos de los vectores AAV utilizados en la presente invención son sistemas de un solo componente. Por consiguiente, todos los elementos necesarios para la transducción de las células diana y la expresión de las proteínas pertinentes están comprendidos en un único ácido nucleico vectorial, lo que facilita el procedimiento de transducción. Para acelerar aún más la transducción y aumentar su eficacia, el ácido nucleico del vector también se reduce a un tamaño mínimo. Estas construcciones AAV-Cas13-gRNA todo en uno muestran una eficacia superior y menos efectos secundarios en comparación con los sistemas convencionales de dos vectores de ácido nucleico. Dado que los vectores AAV2 han mostrado una elevada capacidad de transducción en el pulmón durante un ensayo clínico de fase III, los vectores AAV en la presente memoria divulgados se basan preferentemente en vectores AAV2.
Los presentes vectores AAV pueden comprender secuencias de codificación para un único ARN guía Cas13, preferentemente Cas13d, o una combinación de dos o más ARN guía Cas13, preferentemente Cas13d, como se describe en el presente documento. El uso de más de un ARN guía puede aumentar aún más la eficacia a la hora de dirigirse al virus y escindirlo. Además, una combinación de varios ARN guía también puede aumentar la eficacia y especificidad en la selección de otros virus mutados, por ejemplo, derivados de los virus descritos en el presente documento.
Se han diseñado secuencias espaciadoras de ARN guía adecuadas basándose en alineaciones de secuencias de varias cepas deCoronaviridaeasociadas a seres humanos (SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:31). Especialmente teniendo en cuenta el MERS-CoV para el diseño de los ARN guía, que muestra menos similitud de secuencia con los otros dos coronavirus estrechamente relacionados SARS-CoV y SARS-CoV-2, permite identificar aquellas regiones del genoma viral que permiten al virus dirigirse a las células humanas. Estas secuencias espaciadoras de ARN guía, así como otras secuencias espaciadoras diseñadas en consecuencia, permiten la orientación específica y la escisión también de cepasde Coronaviridaeque sólo podrían llegar a ser clínicamente relevantes en el futuro.
Realizaciones de la invención
El brote actual de COVID-19 causado por una infección con el recién identificado SARS-CoV-2 ya ha provocado cerca de 1.000.000 de infecciones y 50.000 muertes en todo el mundo en sólo unos meses. Aunque aparentemente existe una necesidad urgente, hasta la fecha no se dispone de un medicamento eficaz y se calcula que el desarrollo de una vacuna llevará entre 12 y 18 meses. Por lo tanto, existe una gran demanda de nuevos enfoques terapéuticos prometedores.
El SARS-CoV-2 recientemente identificado pertenece a la familiaCoronaviridae,una gran familia de virus ARN monocatenarios de sentido positivo. Los virus de la familiaCoronaviridaesuelen infectar el sistema respiratorio y se consideran responsables de una serie de enfermedades y dolencias humanas que van desde el resfriado común hasta enfermedades más graves como el MERS (MERS-CoV) y el SARS (SARS-CoV)[1]. Se ha informado de que el SARS-CoV-2 contiene 10 proteínas diferentes (ORF1ab, S, ORF3a, E, M, ORF6, ORF7a, ORF8, N,<o>R<f>10) (entrada GenBank MN908947.3). En la Figura 4 se muestra una alineación de secuencias entre los genomas derivados de MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2.
Los sistemas CRISPR/Cas, recientemente identificados y evolucionados, han revolucionado la edición de genes al proporcionar un sistema altamente eficaz, específico y sencillo para la modificación de genes en células eucariotas. Una caspasa (Cas) como proteína efectora, y un ARN guía para guiar a la proteína Cas hacia una secuencia diana específica dentro de un ácido nucleico representan los únicos componentes necesarios de un sistema que permite la escisión precisa de ácidos nucleicos y/o la modificación genética de células o incluso de organismos enteros [4]. Dentro de las familias conocidas de proteínas Cas, la Clase II, Tipo VI Cas13 ha sido recientemente descubierta y clasificada como cuatro subtipos diferentes: Cas13a, Cas13b, Cas13c y Cas13d [5]. Cas13d es de pequeño tamaño, muestra una elevada actividad catalítica y especificidad en células de mamíferos, y se dirige y escinde ARN monocatenario. Por lo tanto, Cas13d ofrece un nuevo enfoque interesante para combatir la invasión viral mediante la degradación de ARN viral monocatenario.
Sin embargo, un obstáculo importante en el uso de Cas13d para combatir infecciones virales es la entrega de la proteína Cas y su ARN guía en células (infectadas).
Los virus adenoasociados son virus de ADN monocatenario sin envoltura de la familiaParvoviridae. Se han identificado varios serotipos, entre los cuales el AAV2 es probablemente el más conocido. Los virus adenoasociados presentan ciertas características que los convierten en una herramienta eficaz de administración de genes, como su baja patogenicidad y baja inmunogenicidad, al tiempo que son ampliamente tropicales [6].
Así, la presente invención proporciona un enfoque terapéutico novedoso para tratar enfermedades y/o síndromes inducidos por coronavirus asociados a humanos, en particular COVID-19, administrando al paciente un vector AAV que comprende una secuencia que codifica para una proteína Cas13d, así como un ARN guía Cas13 para dirigirse a sitios diana específicos dentro del genoma viral con el fin de escindir la secuencia diana y degradar el virus, donde la secuencia de ARN guía comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31.
La invención proporciona además ARN guía que están diseñados para interactuar con sitios diana muy prometedores dentro del genoma viral.
ARN guía
Los ARN guía Cas13, preferentemente los ARN guía Cas13d, de la presente invención se dirigen a secuencias diana de ARN monocatenario dentro de los genomas de coronavirus asociados a humanos o derivados de los mismos. El sitio diana de los ARN guía en la presente memoria divulgados se dirige específicamente a las secuencias conservadas y/o a porciones de secuencias de varios miembros de la familiaCoronaviridae, preferentemente entre MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2.
Los ARN guía Cas13d típicos se dirigen a una secuencia diana de 22-30 nt (espaciador) [2]. Así, el ARN guía puede dirigirse a cualquier secuencia diana de 22-30 nt dentro del genoma de un coronavirus. Los ARN guía típicos que se utilizan en la presente memoria se discuten en Konermann et al. [3].
Las secuencias de ARN guía pueden diseñarse según uno de los siguientes enfoques de diseño:
(1) Se produce una alineación de secuencias del genoma de diferentes cepas de coronavirus, preferentemente de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Las secuencias espaciadoras de 22-30 nt se diseñan de forma que la región semilla coincida perfectamente con regiones de solapamiento del 100% entre las secuencias alineadas del genoma viral. El resto de la secuencia espaciadora es idéntica a al menos una de las secuencias virales, preferentemente SARS-CoV2, pero puede coincidir sólo parcialmente con las secuencias restantes. Así, según este enfoque, la eficacia de corte es particularmente alta contra los tres coronavirus, mientras que la afinidad del ARN guía es máxima para el virus con el que la secuencia espaciadora coincide perfectamente.
(2) Se produce una alineación de secuencias del genoma de diferentes cepas de coronavirus, preferentemente de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Las secuencias espaciadoras de 22-30 nt se diseñan de forma que la región semilla coincida perfectamente con al menos una de las secuencias virales, preferentemente SARS-CoV-2. A diferencia del primer enfoque, se toleran las discordancias en la región semilla de la secuencia espaciadora con las respectivas secuencias diana dentro de algunas de las secuencias víricas. Las secuencias espaciadoras de ARN guía diseñadas mediante este enfoque tienen afinidades de unión muy altas, pero tienen una eficacia de corte reducida frente a aquellos virus con los que la secuencia espaciadora no coincide perfectamente.
(3) Se produce una alineación de secuencias del genoma de diferentes cepas de coronavirus, preferentemente de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV. Las secuencias espaciadoras de 22-30 nt están diseñadas de tal manera que las secuencias espaciadoras de ARN guía tienen el mejor ajuste global para todos los miembros de la familiaCoronaviridaeque han sido sometidos a la alineación de secuencias. Basándose en el requisito de que las secuencias espaciadoras de ARN guía tengan una similitud de secuencia del 100% con las secuencias diana respectivas de todos los miembros de coronavirus alineados en la región semilla, se puede conseguir una similitud de secuencia global de las secuencias espaciadoras de ARN guía con las secuencias respectivas de los miembros de coronavirus alineados de hasta el 95%. Este enfoque permite la mayor probabilidad de que los ARN guía también se dirijan a futuras variantes de coronavirus.
Así, el ARN guía puede dirigirse a una secuencia diana dentro de regiones conservadas de genomas de virus de la familiaCoronaviridae, preferentemente la de coronavirus asociados a humanos.
El ARN guía puede dirigirse a una secuencia diana dentro de regiones conservadas de genomas de MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2 o derivados de los mismos.
El ARN guía puede estar dirigido a una secuencia diana dentro del genoma del SARS-CoV-2 o derivados del mismo. El ARN guía puede comprender una secuencia espaciadora de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1 - 39 o combinaciones de los mismos, como se muestra en la Tabla 1 del presente documento.
El ARN guía puede, por ejemplo, comprender una secuencia espaciadora de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38 o SEQ ID NO:39, o cualquier combinación de las mismas.
El ARN guía puede comprender una secuencia espaciadora de cualquiera de los SEQ ID NOs: 1-31, o combinaciones de las mismas.
La secuencia espaciadora de ARN guía puede, por ejemplo, comprender una secuencia espaciadora de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 o SEQ ID NO:31, o cualquier combinación de las mismas.
El ARN guía puede comprender además una secuencia espaciadora de cualquiera de los SEQ ID NOs: 3, 4, 11-20, 22, 29 o 31, o sus combinaciones.
La secuencia espadadora de ARN guía puede comprender, por ejemplo, una secuencia espadadora de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:31, o combinaciones de las mismas.
El ARN guía puede comprender una secuencia espadadora de cualquiera de los SEQ ID NOs: 3, 4, 11, 12, 19, 20, 22 o 29, o sus combinaciones.
La secuencia espaciadora de ARN guía puede comprender, por ejemplo, una secuencia espaciadora de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:29, o combinaciones de las mismas.
El ARN guía también puede comprender una secuencia espaciadora de cualquiera de los SEQ ID NOs: 13-18 o 31. El ARN guía puede comprender una secuencia espaciadora de cualquiera de los SEQ ID NOs: 4, 6, 11-16 y 31. Los ARN guía particularmente adecuados incluyen las secuencias espaciadoras de cualquiera de los SEQ ID NOs: 4, 7, 15, 23, 27 y 31.
La secuencia espaciadora de ARN guía puede, por ejemplo, comprender una secuencia espaciadora de SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:31, o combinaciones de las mismas.
Tabla 1: Secuencias espaciadoras de ARN guía según se describe en el presente documento
De las secuencias espadadoras enumeradas anteriormente, las denominadas gRNA_XX-O-1 a gRNA_XX-O-18 se dirigen al gen ORFlab, las secuencias gRNA_XX-S-1 a gRNA_XX-S-4 se dirigen al gen de la proteína de la espiga "S", las secuencias gRNA_XX-E-1 a gRNA_XX-E-4 se dirigen al gen de la proteína de la envoltura, las secuencias gRNA_XX-M-1 a gRNA_XX-M-2 se dirigen al gen de la proteína de la membrana, y las secuencias gRNA_XX-N-1 a gRNA_XX-N-3 se dirigen al gen de la proteína de la nucleocápside.
Cas13d
Según la presente invención, Cas13, preferentemente Cas13d, se selecciona como endonucleasa para escindir y dirigir genomas de coronavirus. Debido a su pequeño tamaño y a su alta eficacia y especificidad en células de mamíferos, este miembro de CRISPR/Cas parece especialmente adecuado para un enfoque antivírico.
Cas13d, como las otras enzimas de la familia Cas13, tiene la propiedad de procesar independientemente sus propias matrices CRISPR en ARNs guía maduros que contienen una repetición directa 5' de 30 pares de bases seguida de un espaciador 3' variable que varía de 22 a 30 pb de longitud.
Hasta la fecha, se han identificado siete proteínas Cas13d diferentes (Figura 1): EsCas13d, RffCas13d, UrCas13d, RaCas13d, P1E0 Cas13d, Adm Cas13d y RfxCas13d. Entre estas variantes de Cas13d, se ha descrito que RfxCas13d muestra una alta eficacia de RNA knock-down con una mínima actividad sin diana [2].
Así, en algunas realizaciones, puede utilizarse cualquier endonucleasa Cas13d.
En realizaciones preferentes, se utiliza la endonucleasa RfxCas13d.
Vector AAV que comprende una secuencia que codifica Cas13d y que comprende un casete de expresión de ARN guía
Un vector AAV de la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico que comprende un casete de expresión de ARN guía Cas13d que codifica para al menos un ARN guía, en el que la secuencia de ARN guía se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31 y una secuencia que codifica una proteína Cas13d y que comprende un promotor U6. El vector AAV sirve de vehículo para el transporte del sistema CRISPR/Cas13d a una célula, incluidas las infectadas por un virus.
Los vectores AAV representan una conocida herramienta de administración de genes adecuada para una variedad de aplicaciones. Dependiendo del serotipo AAV respectivo, los vectores AAV presentan un tropismo notable y permiten así la transducción dirigida de células diana. Por ejemplo, el AAV9 ha mostrado que muestra un tropismo por las células miocárdicas y, por lo tanto, los vectores basados en AAV9 se consideran adecuados para la administración de genes a estas células (véase, por ejemplo, la Patente EP n° 3132041 de Kupattet al.).Del mismo modo, los vectores basados en AAV2 han mostrado su potencial para el tratamiento de la fibrosis quística en humanos, como comentan Gugginoet al.[7] (véase también [8]).
Los vectores AAV tienen un límite de empaquetamiento de sólo aprpximadamente 4,7 kb, lo que, para la mayoría de los enfoques de transducción, implica el uso de más de un vector para permitir la transferencia de todos los elementos genéticos requeridos.
Sin embargo, seleccionando el Cas13d relativamente pequeño y, cuando sea necesario, eliminando adicionalmente elementos prescindibles del vector AAV, la presente invención proporciona un único vector AAV que comprende todos los elementos necesarios para la expresión de Cas13d y su ARN guía en una célula transducida.
Del mismo modo, pueden utilizarse otras proteínas Cas13 que no superen el tamaño de empaquetamiento del vector AAV. Así, las proteínas Cas13 que tienen menos de 1000 aminoácidos son adecuadas para los vectores según la presente invención.
En la Figura 3A y la Figura 3B se representa un mapa esquemático ejemplar del plásmido vector AAV2 que codifica Cas13d y un ARN guía.
El vector AAV de la presente invención puede basarse en un número de serotipos AAV, incluyendo, pero sin limitarse a, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, o AAV9.
En realizaciones preferentes, el vector AAV se basa en AAV1, AAV2, AAV5 o AAV9.
En realizaciones aún más preferentes, el vector AAV se basa en AAV2.
En otra realización aún más preferente, el vector AAV se basa en AAV9.
En las realizaciones más preferentes, el plásmido vector AAV es pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d (véase la SEQ ID NO:40).
En otra realización preferente, el plásmido vector AAV es pAAV2-U6-gRNA-CMV-Cas13d-red-triguia (ver SEQ ID NO:41) que permite la inserción de tres secuencias gRNA.
En otra realización preferente, el plásmido vector AAV es pAAV-U6-gRNA-cuadguia-CMV-Cas13d-V3-básico (véase SEQ ID NO:42) que permite la inserción de cuatro secuencias de ARN guía. La generación de un vector AAV utilizando el plásmido vector de SEQ ID NO:42 dará lugar al empaquetamiento de 5064 pb de ADN, con la secuencia de SEQ ID NO: 45 en el vector AAV.
Es posible reducir el tamaño de la carga del vector AAV no incluyendo secuencias de localización nuclear (NLSs) en la secuencia codificada de la proteína Cas13d. La proliferación del SARS-CoV-2 se produce en el citosol. Así, utilizando una proteína Cas13d sin NLSs, se puede potenciar la acumulación de Cas13d en el citosol, al tiempo que se reduce el tamaño de la proteína y del constructo que la codifica. Un plásmido vector adecuado que codifica una proteína Cas13d sin NLS es pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-Sapl (véase S<e>Q ID NO:43). La generación de un vector AAV utilizando el plásmido vector de SEQ ID NO:43 conducirá al empaquetamiento de 4833 pb de ADN, que tiene la secuencia de SeQ ID NO: 46 en el vector AAV.
Preferentemente, el vector AAV contiene menos de 5kb de ADN. La eficacia del empaquetamiento y la expresión en las células disminuye significativamente a partir de tamaños superiores a 5 kb [11].
Para promover aún más la unión de la proteína Cas13d al genoma del SARS-CoV-2, se puede fusionar un dominio de unión al ARN N-terminal (N-NTD) a la proteína Cas13d. N-NTD es el dominio de unión al ARN de la proteína nucleocápside (N) del SARS-CoV-2. La función principal de la proteína nucleocápside durante la infección es unirse al ARN vírico y formar un complejo ribonucleoproteico helicoidal (RNP), con el fin de proteger el genoma vírico y mantener una replicación vírica fiable. El dominio de unión N-terminal (N-NTD) de la proteína de la nucleocápside captura el genoma del ARN viral y el dominio C-terminal ancla el complejo RNP a la membrana viral a través de su interacción con la proteína M. Así pues, se espera que la fusión de la N-NTD con la proteína Cas13d promueva la formación de un complejo que incluya la Cas13d y el genoma vírico y, de este modo, guíe a la Cas13d hacia la proximidad espacial con el genoma vírico. Un plásmido vector adecuado que codifica una proteína Cas13d con N-NTD fusionado a su C-terminal es pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d-NTD-Aarl (véase SEQ ID NO:44). La generación de un vector AAV utilizando el plásmido vector de SEQ ID NO:44 dará lugar al empaquetamiento de 5238 pb de ADN, con la secuencia de SEQ ID NO: 47 en el vector AAV.
Dependiendo del serotipo respectivo en el que se base el vector AAV de la presente invención, el vector AAV puede mostrar un tropismo por ciertos tipos celulares, tejidos y órganos que albergan estos tipos celulares.
Así, el vector AAV de la presente invención puede dirigirse a varios tipos de células y órganos del cuerpo humano seleccionando un serotipo específico del vector AAV.
En realizaciones preferentes, el vector AAV muestra un tropismo para, y está dirigido a, células del sistema respiratorio humano.
En realizaciones aún más preferentes, el vector AAV es un vector AAV2 dirigido a células del sistema respiratorio humano.
En otra realización preferente, el vector AAV está dirigido a células miocárdicas humanas.
En realizaciones aún más preferentes, el vector AAV es un vector AAV9 dirigido a células del miocardio humano.
Los vectores AAV de la presente invención pueden codificar un único ARN guía Cas13d o una combinación de varios ARN guía. Así, un vector AAV puede codificar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 ARN guía.
En realizaciones preferentes, el vector AAV codifica un único ARN guía.
En otra realización preferente, el vector AAV codifica dos ARN guía.
En las realizaciones más preferentes, el vector AAV codifica tres, cuatro o cinco ARN guía. Preferentemente, las secuencias espaciadoras de los ARN guía se dirigen a diferentes genes del genoma del SARS-CoV-2.
Las combinaciones adecuadas de ARN guía para su uso en la presente invención tienen las secuencias espaciadoras de SEQ ID NOs: 4, 7 y 15; SEQ ID NOs: 15, 23 y 31; SEQ ID NOs: 15, 27 y 31; SEQ ID NOs: 23, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 15, 23, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 7, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 23 y 31; SEQ ID NOs: 7, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 7, 15, 23, 27 y 31.
Los ARN guía particularmente preferidos para su uso en la presente invención tienen las secuencias espaciadoras de SEQ ID NOs: 4, 7 y 15; SEQ ID NOs: 4, 15, 23, 27 y 31; y SEQ ID NOs: 4, 7, 27 y 31.
En realizaciones preferentes, el vector AAV codifica la combinación de ARN guía bajo el mismo promotor.
Vectores AAV que codifican Cas13d y ARN guía Cas13d para el tratamiento de infecciones víricas
La presente invención proporciona un enfoque terapéutico novedoso para tratar las infecciones por coronavirus asociadas a humanos. Al introducir un vector AAV en las células, y tras la expresión de Cas13, éste es guiado por un ARN guía hasta una secuencia diana dentro del genoma viral, para su escisión y, por tanto, la disrupción de la secuencia genómica. En las células ya infectadas Cas13 con un coronavirus, la secuencia viral se escinde, lo que conduce a la degradación viral y la inhibición de cualquier propagación adicional de la contaminación viral. En las células aún no infectadas, la expresión del sistema de ARN guía Cas13 ofrece un mecanismo de protección a dichas células al degradar inmediatamente el material genético vírico tras su entrada en la célula.
Para alcanzar una célula diana, el vector AAV se administra en tejidos y órganos que albergan las células diana.
Según los informes actuales, las enfermedades causadas por coronavirus se manifiestan principalmente en el sistema respiratorio de los sujetos infectados, provocando síntomas y reacciones respiratorias de leves a graves. En particular, las variantes de corona MERS, SARS y COVID-19 suelen provocar inflamación pulmonar, dificultad pulmonar y síndrome respiratorio agudo, a menudo causados o impulsados por tormentas de citoquinas del sistema inmunitario desbordado. Otras publicaciones científicas informan de hallazgos que sugieren que al menos la variante COVID-19 también puede afectar negativamente al miocardio en algunos pacientes. Por consiguiente, durante el tratamiento del paciente, el vector AAV se administra al sistema respiratorio, en particular a los pulmones, y/o al miocardio, según se indique.
Así, en una realización, el vector AAV para tratar la enfermedad inducida por coronavirus asociado a humanos se administra al sistema respiratorio del paciente.
En otra realización, el vector AAV se administra al tracto respiratorio inferior del paciente.
En una realización preferente, el vector AAV se administra al tracto respiratorio superior mediante inhalación.
El vector AAV puede administrarse directamente al tejido de la tráquea.
En una realización para tratar específicamente MERS, SARS y/o COVID-19, el vector AAV puede administrarse en el tracto respiratorio superior del paciente.
En otra realización del tratamiento de MERS, SARS y/o COVID-19, el vector AAV puede administrarse al tracto respiratorio inferior del paciente.
El vector AAV que comprende el casete de expresión de ARN guía y codifica la secuencia Cas13d puede estar comprendido por una composición.
En una realización, la composición puede presentarse en forma de comprimido, cápsula, jarabe, película, líquido, solución, polvo, pasta, aerosol, inyección, crema, gel, loción o gotas.
En otra realización, la composición se presenta en forma de aerosol y se administra a través de un inhalador, nebulizador o vaporizador.
En realizaciones preferentes, la composición se presenta en forma de aerosol y se administra a través de un inhalador.
En una realización aún más preferente, la composición se presenta en forma de aerosol y se administra a través de un inhalador a las vías respiratorias superiores.
En otra realización preferente, el vector AAV o una composición que comprende el mismo se administra al paciente a través de un ventilador.
Vectores adenovirales
Todos los aspectos de la presente invención también pueden practicarse con vectores adenovirales en lugar de vectores AAV. Los vectores adenovirales tienen la ventaja de una mayor limitación del tamaño del envase.
En consecuencia, un vector adenoviral puede comprender una secuencia que codifica Cas13d y un casete de expresión de ARN guía. El vector adenoviral puede administrarse a células diana y utilizarse para tratar infecciones por coronavirus asociadas a seres humanos, como una infección por SARS-CoV-2.
Administración de ARN guía y de la proteína Cas13d independientemente de los vectores virales
Los ARN guía de la presente invención también pueden administrarse a células diana sin el uso de vectores virales. Por ejemplo, se puede utilizar el método descrito en la referencia [10], que implica la administración de ARNm Cas13 generado por transcripciónin vitroconcomitantemente con ARN guía sintéticos. Puede utilizarse una proporción molar de ARN guía a ARNm de 50:1. El ARNm y los ARN guía pueden administrarse mediante vesículas.
La presente invención también proporciona el vector AAV, el vector adenoviral o la composición de la invención para su uso en el tratamiento de infecciones por coronavirus asociadas a seres humanos, como una infección por SARS-CoV-2, mediante el suministro de ARN guía sintético y un ARNm que codifica una proteína Cas13 al tracto respiratorio de un paciente que lo necesite. Los detalles de este método se describen en la referencia [10]. La proteína Cas13 puede ser una proteína Cas13a. La proteína Cas13 puede ser una proteína Cas13d. El ARNm y los ARN guía pueden entregarse mediante vesículas.
Ejemplos
El uso de los vectores AAV en la presente memoria descritos representa un nuevo enfoque terapéutico prometedor para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y síndromes inducidos por coronavirus. Por ello, actualmente se están llevando a cabo varios ensayos clínicos para probar la idoneidad de estos vehículos vectores en el tratamiento de diversas enfermedades. Los ensayos clínicos, así como los respectivos vectores AAV probados, se indican en la Tabla 2, dada a continuación.
Tabla 2: Vectores AAV implicados en ensayos clínicos
Ejemplo 2 - Diseño de secuencias de ARNguía
Con el fin de crear un vector AAV que codifique un Cas13d y un ARN guía para tratar la enfermedad inducida por coronavirus asociada a humanos, se diseñaron secuencias espaciadoras de ARN guía.
De forma similar a los casos de SARS-CoV y MERS-CoV, el SARS-CoV-2, el patógeno que causa el COVID-19, ha sobrevivido con éxito a la transmisión de animal a ser humano. Basándose en esta observación, los inventores consideraron que deberían existir regiones altamente conservadas entre los genomas de SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 que son responsables de la alta patogenicidad y propiedades infecciosas de estos virus en humanos. Los inventores también llegaron a la conclusión de que dichas regiones genómicas conservadas ofrecen un sitio diana prometedor para la escisión mediada por CRISPR/Cas, que implica un ARN guía que guía una proteína Cas13, preferentemente una proteína Cas13d, a su sitio diana y de escisión para así escindir y degradar el ácido nucleico viral.
Así, se creó una alineación de secuencias de ácido nucleico derivadas de las variantes de coronavirus SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 y se identificaron cinco regiones altamente conservadas: ORF1ab, S, E, M y N (véase la figura 4). Se identificaron 31 secuencias espaciadoras de ARN guía dirigidas a las regiones conservadas y que representan objetivos muy prometedores para la escisión y degradación de patógenos (SEQ ID NO:1 a s Eq ID NO:31).
Para identificar secuencias similares entre las tres variantes de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV, se utilizan tres enfoques principales:
(1) En un primer enfoque, se identifican secuencias espaciadoras que comprenden una secuencia semilla que contiene una región de 7 pares de bases que se solapa con precisión entre las secuencias de los tres genomas del virus. Esta secuencia se incluyó como región semilla (15''21‘ base de una secuencia espaciadora de ARN guía; [2]) de las secuencias espaciadoras de ARN guía. El resto de esta secuencia espaciadora coincide perfectamente con la secuencia de SARS-CoV-2, pero sólo coincide parcialmente con las variantes de MERS-CoV y SARS-CoV. La región semilla se considera la secuencia crítica para la especificidad de un ARN guía de Cas13d. Por consiguiente, en caso de que la secuencia semilla crítica no coincida con la secuencia diana, Cas13d no puede escindir la secuencia diana. Así, con este enfoque, se consigue la mejor eficacia de corte contra los tres coronavirus, mientras que la afinidad del ARN guía se maximiza para el SARS-CoV-2.
(2) En un segundo enfoque, al aumentar la similitud de secuencia entre la secuencia espaciadora del ARN guía y la secuencia diana respectiva en toda la longitud de la secuencia espaciadora, se aumenta la afinidad de unión de la secuencia espaciadora al ARN viral. A diferencia del primer enfoque, se han tolerado las discordancias en la región semilla de la secuencia espaciadora con las respectivas secuencias diana dentro de SARS-CoV y MERS-CoV. Sin embargo, se da una similitud de secuencia del 100% entre la secuencia de la región semilla y una secuencia diana respectiva en SARS-CoV-2. Las secuencias espadadoras de ARN guía diseñadas mediante este enfoque tienen afinidades de unión muy altas, pero muestran una eficacia de corte reducida frente a MERS-CoV y SARS-CoV.
(3) En un tercer enfoque, se identifican los ARN guía que ofrecen el mejor ajuste global para los tres miembros de la familia coronavirus. Basándose en el requisito de que las secuencias espaciadoras de a Rn guía tengan una similitud de secuencia del 100% con las secuencias diana respectivas de los tres miembros del coronavirus en la región semilla, se consiguió una similitud de secuencia global de las secuencias espaciadoras de ARN guía con las secuencias respectivas de los tres miembros del coronavirus de hasta el 95%. Este enfoque permite la mayor probabilidad de que los ARN guía también se dirijan a futuras variantes de coronavirus.
Las secuencias espaciadoras de ARN guía identificadas anteriormente se han alineado con todos los transcritos virales asociados a humanos del SARS-CoV-2 conocidos hasta la fecha. Se han seleccionado secuencias espaciadoras que muestran una alta especificidad de secuencia diana y, por lo tanto, reducen el riesgo de posibles efectos secundarios inducidos por la terapia, y cada una de ellas se ha insertado en un plásmido pAAV-U6-gRNA-CMV-Cas13d que comprende,entre otras cosas, un promotor U6 para el casete de expresión del ARN guía, así como una secuencia que codifica la proteína Cas13d (véase también SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:40).
Ejemplo 3 - Evaluación de la eficacia de secuencias únicas de ARN guía
La potencia inhibidora de los 39 ARNg de la Tabla 1 se evaluó en un ensayo de luciferasa mediante la cotransfección de pMir-reporter y construcciones guía Cas13 todo en uno. Como control negativo se utilizó un ARN guía dirigido a LacZ.
Los primeros experimentos de cribado se realizaron con materiales no infecciosos. Los 39 ARN guía (ARNg) se dirigen a 6 regiones diferentes: gRNA_XX-O-1 a gRNA_XX-O-18 se dirigen al gen ORF1ab, las secuencias gRNA_XX-S-1 a gRNA_XX-S-4 se dirigen al gen de la proteína de la espiga "S", las secuencias gRNA_XX-E-1 a gRNA_XX-E-4 se dirigen al gen de la proteína de la envoltura, las secuencias gRNA_XX-M-1 a gRNA_XX-M-2 se dirigen al gen de la proteína de la membrana, y las secuencias gRNA_XX-N-1 a gRNA_XX-N-3 se dirigen al gen de la proteína de la nucleocápside. Así, clonamos las 6 regiones mediante PCR y las insertamos en el vector pMIR (un vector de luciferasa 3'-UTR). De este modo se obtuvieron 6 construcciones de luciferasa designadas como pMIR-report-SARS-COV-2-fragment 1-6. Para evaluar la potencia inhibidora de cada ARNg, se transfectaron conjuntamente células de riñón embrionario humano (HEK293) con el constructo guía Cas13 todo en uno y su correspondiente constructo reportero pMIR. La guíaLacZse utilizó como control negativo. De los 39 ARNg, al final se seleccionaron 7 guías para realizar más experimentos (resaltadas en rojo en la Fig. 5).
Ejemplo 4 - Prueba del sistema de ARN guía Cas13 en células pulmonares epiteliales humanas infectadas con SARS-CoV-2
Diseño experimental 1
Para evaluar el efecto inhibidor de nuestro sistema, primero empaquetamos cada una de varias construcciones de ARN guía en virus AAV2. Cada AAV se aplicó con un título de 10.000 vg/célula (genomas virales por célula) para transducir células epiteliales bronquiales humanas Calu-3 (40.000 células/pocillo), que es una línea celular típica para estudiosin vitrode coronavirus, con diferentes combinaciones de construcciones de ARN guía. Transcurridas 72 horas, las células transducidas por AAV se infectaron con el virus SARS-CoV-2 con una MOI (multiplicidad de infección - se refiere al número de partículas virales por célula) de 0,01. 1 hora después de la incubación a 37°C, se eliminó el medio infeccioso y las células se lavaron 2 veces con DPBS. Posteriormente, se recogió el medio de cultivo en los puntos temporales de 24 hpi (horas postinfección) y 48 hpi. El programa experimental se muestra en la Fig. 6A.
La infectividad del SARS-CoV-2 se midió mediante un ensayo de placa. Los resultados se muestran en la Fig. 6B. El ensayo en placa muestra que, en la mayoría de los casos, una combinación de ARN guía únicos eficaces da como resultado una mayor capacidad para inhibir la replicación vírica. Todos los ARN guía que se identificaron como eficientes en el ensayo de luciferasa (Ejemplo 3) y se probaron en el ensayo de enfoque combinacional resultaron ser altamente eficientes en la supresión de la replicación viral en células pulmonares epiteliales humanas vivas. Así, en principio, todas las combinaciones de ARN guía que mostraron una eficacia de degradación cercana al 50% o inferior pueden utilizarse para el enfoque combinacional.
Diseño experimental 2
Se desarrolló un nuevo diseño experimental (véase la Fig. 7A), involucrando un título más alto de AAV (100,000 vg/célula por constructo) para transducir células Calu-3 (30,000 células/pocillo). Después de 48 horas, las células transducidas por AAV se infectaron con el virus SARS-CoV-2 y el medio de cultivo se recogió a las 24 y 48 horas.
La infectividad del SARS-CoV-2 se midió mediante un ensayo de placa. Los resultados se muestran en la Fig. 7B. Las tres muestras (D-F) que fueron tratadas con diferentes combinaciones de ARNg mostraron efectos significativos en comparación con la muestra de control no tratada. La combinación D de 3 ARN guía mostró una reducción del 93% del título de SARS-CoV2 en 24 horas y del 94% en 48 horas. La combinación F de 4 ARN guía mostró una reducción del 98% en 24 horas y del 95% en 48 horas. La combinación E de 5 ARN guía mostró una reducción del 94% en 24 horas y del 100% en 48 horas.
El experimento se repitió incluyendo también construcciones de ARN multiguía que podían entregar varios ARN guía en un AAV. Éstas incluían el constructo de cuádruple guía de SEQ ID NO:42 y el constructo de SEQ ID NO: 44 que codifica Cas13d con NTD fusionado a su C-terminal. Los resultados se muestran en la Fig. 8.
REFERENCIAS
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un ARN guía para su uso con una proteína Cas13, en el que el sitio diana del ARN guía es una secuencia comprendida por un genoma de SARS-CoV-2, en el que la secuencia de ARN guía comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 7, 11, 15, 23, 27, 31.
2. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína Cas13d y un casete de expresión de ARN guía que codifica un ARN guía según la reivindicación 1 o más de un ARN guía según la reivindicación 1 y que comprende un promotor U6.
3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, que codifica un ARN guía que comprende las secuencias de SEQ ID NOs: 4, 7 y 15; SEQ ID NOs: 15, 23 y 31; SEQ ID NOs: 15, 27 y 31; SEQ ID NOs: 23, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 15, 23, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 7, 27 y 31; SEQ ID NOs: 4, 23 y 31; SEQ ID NOs: 7, 27 y 31; o SEQ ID NOs: 4, 7, 15, 23, 27 y 31, preferentemente SEQ ID NOs: 4, 7, 27 y 31.
4. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en la que la molécula de ácido nucleico es un plásmido, preferentemente un plásmido único.
5. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en la que dicha proteína Cas13d codificada por dicha secuencia no comprende una señal de localización nuclear (NLS) y/o es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión N-terminal (N-NTD) de la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2.
6. La molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en la que la molécula de ácido nucleico se obtiene insertando una secuencia espaciadora de un ARN guía según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el plásmido pAAV2-U6-ARNg-CMV-Cas13d de SEQ ID NO:40; o insertando al menos una secuencia espaciadora de al menos un ARN guía según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en el plásmido pAAV2-U6-ARNg-CMV-Cas13d-red-triguia de SEQ ID NO:41, el plásmido pAAV-U6-ARNg-quadguia-CMV-Cas13d-V3-básico de SEQ ID NO:42, el plásmido pAAV-U6-ARNg-CMV-Cas13d-Sapl de SEQ ID NO:43, o el plásmido pAAV-U6-ARNg-CMV-Cas13d-NTD-Aarl de SEQ ID NO:44.
7. Un vector AAV que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, preferentemente en el que el vector AAV es un vector AAV2 o AAV9 y/o en el que la columna vertebral del vector AAV se ha reducido de tamaño.
8. Un vector adenoviral que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6.
9. Una composición farmacéutica que comprende el vector AAV de la reivindicación 7 o el vector adenoviral de la reivindicación 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende al menos un ARN guía de la reivindicación 1 y al menos un ARNm que codifica una proteína Cas13, preferentemente en la que dicha proteína Cas13 codificada por dicho ARNm es una Cas13d y no comprende una señal de localización nuclear (NLS).
11. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en la que dicha proteína Cas13d codificada por dicho ARNm es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión N-terminal (N-NTD) de la proteína nucleocápside del SARS-CoV-2.
12. Un vector AAV según la reivindicación 7, un vector adenoviral según la reivindicación 8, o una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o síndrome causado por un virus humano asociado en un paciente que lo necesite.
13. El vector AAV, el vector adenoviral, o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, en el que la enfermedad o síndrome es el resultado de una infección con un coronavirus que está genéticamente relacionado con el grupo que consiste en MERS-CoV, SARS-CoV y SARS-CoV-2, preferentemente en el que la enfermedad es COVID-19.
14. El vector AAV, el vector adenoviral, o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en el que el Cas13 tras su expresión escinde el virus asociado a seres humanos.
15. El vector AAV, el vector adenoviral, o la composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el vector AAV, el vector adenoviral, o la composición farmacéutica se administra a través del tracto respiratorio superior, preferentemente por vía intranasal o intratraqueal o en una composición en aerosol a través de un inhalador o nebulizador, preferentemente a través de un ventilador.
16. El vector AAV, el vector adenoviral, o la composición farmacéutica para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en el que el vector AAV, el vector adenoviral, o la composición farmacéutica se administra al miocardio.
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