ES2618935T3 - Parvovirus modificado útil para silenciamiento génico - Google Patents

Abstract

Un parvovirus para regular por disminución la expresión de un gen diana en una célula caracterizado porque deriva de una variante de deleción H-1 del parvovirus que contiene una deleción que engloba los nucleótidos 2022-2135, en el que un ácido nucleico específico de diana se inserta en una región no traducida en el sentido de 3' del gen de VP de parvovirus H-1 y puede expresarse bajo el control de un promotor o región promotora reconocible por una ARN polimerasa en la célula, en el que dicho ácido nucleico específico de diana puede transcribirse en una iARN, y en el que dicho parvovirus puede replicarse y propagarse en la célula.

Description

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DESCRIPCION

Parvovirus modificado util para silenciamiento genico

La presente invencion se refiere a una entidad para regular por disminucion eficazmente la expresion de un gen de interes en una celula. Con este fin, la presente invencion proporciona un parvovirus de roedor modificado, de replicacion competente, para regular por disminucion un gen diana caracterizado porque dicho parvovirus contiene un acido nucleico espedfico de diana expresable que puede transcribirse en una iARN. La presente invencion tambien proporciona celulas u organismos que comprenden dicho parvovirus.

La interferencia por ARN (iARN) no solo ha revolucionado el procedimiento de identificacion y caracterizacion funcional de nuevos genes, sino que representa una opcion terapeutica prometedora para tratar enfermedades humanas, en particular cancer (1, 2). El motivo de este exito radica en la alta especificidad y eficacia de moleculas inductoras de iARN con respecto a genes diana que los tratamientos convencionales no pueden alcanzar. Los ARN pequenos tales como microARN (miARN) o ARN de interferencia pequenos (ARNip) tienen la capacidad de unirse a secuencias de ARNm complementarias desencadenando su degradacion o bloqueando su traduccion (1). Pueden disenarse ARNip para silenciar la expresion de cualquier gen, expandiendo las posibilidades de intervencion teoricamente a la totalidad del genoma. Para el cancer, ya se ha demostrado que los ARNip (y miARN) son una herramienta poderosa en la regulacion por disminucion de la expresion de genes que controlan la senalizacion, proliferacion, diferenciacion, apoptosis y senescencia celulares (1, 2). Esta lista tambien incluye factores de transcripcion que no pueden manipularse generalmente mediante enfoques convencionales. El silenciamiento eficaz de oncogenes mutados o genes antiapoptoticos tales como K-Ras, p53 mutado, c-myc, Her2/neu, bcl-2, bcr-ab1l, survivina y E6 del virus del papiloma humano 16 que conduce a detencion y/o apoptosis celular son solo unos cuantos ejemplos del exito de tal enfoque en la terapia contra el cancer al nivel preclmico [para una revision veanse (3) y (4)].

La ruta de iARN se encuentra en muchas eucariotas incluyendo animales y se inicia por la enzima Dicer, que escinde moleculas de ARN bicatenario (ARNbc) largas en fragmentos cortos de ~20 nucleotidos que se denominan ARNip. Cada ARNip esta desenrrollado en dos ARNmc monocatenarios, concretamente la hebra pasajera y la hebra grna. La hebra pasajera se degradara, y la hebra grna se incorpora en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El resultado mejor estudiado es el silenciamiento genico postranscripcional, que se produce cuando la hebra grna experimenta apareamiento de bases con una secuencia complementaria de una molecula de ARN mensajero e induce escision por la protema Argonauta, el componente catalftico del complejo RISC. En algunos organismos se sabe que este proceso se disemina de manera sistemica a pesar de las concentraciones molares limitadas inicialmente de ARNip.

A pesar de su gran potencial, deben superarse varios inconvenientes para introducir exitosamente terapias a base de iARN en la practica clmica. Estos incluyen la evitacion de efectos inespedficos no deseados, la activacion de la inmunidad innata y la semivida corta de las moleculas de ARNip con potencial de inactivacion diluidas en cada ronda de division celular (5). Sin embargo, el principal obstaculo sigue siendo la administracion segura y eficaz de moleculas desencadenantes de iARN en las celulas diana que da como resultado escasa captacion celular y acumulacion no espedfica en tejidos (2, 5).

Los ARN en horquilla cortos (ARNhc) son otra clase de efectores de iARN (6). Los ARNhc se transcriben en el nucleo a partir de un vector de expresion que porta un casete de expresion de ARNhc compuesto habitualmente por un promotor de ARN polimerasa II (Pol II) o III (Pol III) y una secuencia de ADN bicatenario corta con un bucle en horquilla. El transcrito de ARNhc se exporta entonces al citoplasma y se procesa como cualquier ARNip (5, 6). Se sintetizan constantemente ARNhc en las celulas huesped, lo que conduce a un silenciamiento genico mas duradero. Sin embargo, la administracion intracelular de los vectores que expresan ARNhc a traves de transfeccion es escasamente eficaz, lo que requiere nuevos modos de administracion (6). Para este fin, se han dirigido numerosos estudios hacia el aprovechamiento de virus como veldculo de transferencia para ARNhc. Esto tambien esta favorecido por el hecho de que los casetes de ARNhc son habitualmente de tamano pequeno y pueden insertarse generalmente en cualquier genoma viral sin afectar a la capacidad de empaquetamiento del virus. Ejemplos de viriones modificados por ingeniena genetica con este fin se basan en retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus del herpes simple, virus vaccinia y poliovirus (7). Estos virus son normalmente patogenos humanos, por tanto se vuelven de replicacion defectuosa a traves de modificaciones geneticas de sus genomas. Esto hace que no puedan diseminarse a traves del tumor. Abbas-Terki et al. describen un vector lentiviral de replicacion defectuosa que tiene insertado un casete de ARNhc y se utiliza para el silenciamiento genico (24). La incapacidad de propagarse tambien se encuentra para los virus adenoasociados (VAA) que se usan comunmente en terapia genica y contra el cancer y tambien se investigaron como candidatos para la administracion de ARNhc (8, 9). Maxwell et al. describen un parvovirus de replicacion defectuosa LuIII con un promotor P4 modificado por ingeniena que expresa la luciferasa (25). Su vector es de replicacion defectuosa debido a la modificacion del promotor P4 y/o la expresion de un transgen heterologo mediante la delecion de otras partes del genoma del parvovirus. Tambien es importante

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mencionar que para muchos de los virus mencionados anteriormente, la exposicion previa de seres humanos a infeccion viral que provoca anticuerpos neutralizantes protectores puede poner en peligro el tratamiento a base de virus (10).

Por tanto, el objeto de la presente invencion es proporcionar medios para regular por disminucion eficazmente la expresion de un gen deseado en una celula u organismo.

Segun la invencion esto se consigue proporcionando la materia definida en las reivindicaciones. La presente invencion describe el primer parvovirus autonomo que porta un casete de expresion de ARNhc (denominado H-1PV- silencer). Parvovirus de roedor tales como parvovirus de rata H-1PV y su homologo de raton virus diminuto del raton (MVM) han atrafdo una gran atencion por su potencial anticancengeno dado que no son patogenos para seres humanos y tienen propiedades oncolfticas y oncosupresoras (11). La inmunidad antiviral preexistente no es habitualmente un problema para estos virus puesto que los seres humanos no se exponen normalmente a una infeccion por parvovirus de roedor. El genoma del parvovirus consiste en un ADN monocatenario de aproximadamente 5100 bases que contiene dos promotores, P4 y P38 que regulan la expresion de las protemas no estructurales (NS1 y NS2) y de la capsida (VP1 y VP2), respectivamente. La activacion del promotor P4 es una etapa cntica en el ciclo vital de PV. La actividad del promotor P4 se modula mas tarde mediante su propio producto genico NS1, pero su activacion inicial depende completamente de factores celulares del huesped, que se expresan principalmente durante la fase S del ciclo celular (12). Esta dependencia, junto con el hecho de que el virus no puede estimular la proliferacion de celulas quiescentes, contribuye al oncotropismo del virus, que se replica preferentemente en celulas en proliferacion, transformadas o malignas. Ademas, la citotoxicidad del parvovirus tambien se estimula por cambios celulares asociados con transformacion neoplasica (11, 13). NS1 es la protema toxica viral principal (13). Se ha mostrado que H-1PV activa varias rutas de muerte en celulas cancerosas. En particular, dependiendo del tipo de celula y las condiciones de crecimiento, H-1PV puede inducir apoptosis (14-16), necrosis (17) o muerte celular dependiente de catepsina B (18). Aunque el potencial anticancengeno de los PV esta respaldado por un gran conjunto de estudios preclmicos, puede esperarse que la eficacia sea un factor limitante en aplicaciones clmicas. Es posible que algunas celulas cancerosas sobrevivan al tratamiento con virus, provocando recidiva tumoral. El simple hecho de que estos virus se han aislado de tumores en crecimiento, indica que solos no siempre son lo suficientemente potentes como para detener el crecimiento o provocar la regresion completa de lesiones neoplasicas (13).

Durante los experimentos que dieron como resultado la presente invencion pudo mostrarse que la insercion de un casete de ARNhc en un sitio particular del genoma del parvovirus es compatible con la capacidad de empaquetamiento del parvovirus y no interfiere con la replicacion viral ni la citotoxicidad. El virus expresa altos niveles de ARNhc y es muy eficaz en el silenciamiento genico. La gran ventaja del H-1PV-silencer en comparacion con vectores de replicacion defectuosa reside en su capacidad para replicarse y propagarse en celulas en proliferacion, por ejemplo, celulas cancerosas. Cada celula infectada/transducida podna volverse teoricamente un productor de partfculas virales novedosas. Viriones de progenie a traves de rondas secundarias de infeccion podnan diseminarse a traves del tumor y suministrar eficazmente y expresar ARNhc terapeuticos. En este entorno, la senal de silenciamiento podna amplificarse mas alla del inoculo inicial. Juntos, los vectores a base de parvovirus y la tecnologfa de ARNhc compensan las limitaciones del otro: el oncotropismo natural de parvovirus debe suministrar espedfica y eficazmente y mediar en la transduccion de los ARNhc en celulas en proliferacion, por ejemplo, celulas cancerosas, y el ARNhc por otro lado debe capacitar a los virus a destruir celulas (cancerosas) menos sensibles a virus. Esta invencion prepara el camino para el desarrollo de estrategias terapeuticas novedosas para tratar enfermedades como cancer que combinan las propiedades anticancengenas poderosas de parvovirus de roedor y moleculas desencadenantes de iARN.

En resumen, el parvovirus de roedor de la presente invencion, en comparacion con otros vectores utilizados en la actualidad para el suministro/la expresion de ARNhc (por ejemplo, vectores basados en AAV o lentivirales), mantiene su capacidad para replicarse y propagarse en celulas cancerosas. Segun se explica con mas detalle posteriormente, cada celula infectada/transducida teoricamente se puede convertir en productora de partfculas virales novedosas. Los viriones de la progenie a traves de segundas rondas de infeccion se pueden esparcir a traves del tumor y suministrar y expresar de forma eficaz ARNhc terapeuticos. En este contexto, la senal de silenciamiento se amplifica mas alla del inoculo inicial. Con los otros vectores en uso (incluidos los vectores descritos en (24) y (25)), esto no es posible debido a que son de replicacion defectuosa. La ventaja mas importante de la presente invencion consiste en que el parvovirus de roedor reivindicado es capaz de expresar ARNhc en niveles elevados y su replicacion es competente. En el vector de la presente invencion, el promotor no ha sido modificado y/o se expresa un transgen heterologo mediante la delecion de otras partes del genoma del parvovirus (por ejemplo, la region VP). En la presente invencion, el casete que expresa el ARNhc se inserta sin alterar otros elementos del genoma parvoviral. Se ha creado un nuevo virus que, de forma similar al virus de tipo natural, mantiene la capacidad de empaquetarse, multiplicarse y esparcirse en celulas cancerosas. Se ha creado una nueva funcion (es decir, la capacidad de expresar ARNhc) sin perder otras caractensticas del virus.

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Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Representacion esquematica del pH-1PV silencer que contiene un casete de expresion de ARNhc

Se inserto el casete de iARN que consiste en el promotor H1 de ARN polimerasa III en la region no codificante del genoma en el sentido de 3' del gen de VP que codifica para las protemas de la capsida VP1 y VP2. Se insertaron enzimas de restriccion BamHI y Not I unicas para la clonacion de ARNhc. Tambien se ilustran los promotores P4 y P38 de parvovirus. ITR, repeticion terminal invertida. Figura no dibujada a escala.

Figura 2: Silenciamiento genico eficaz conseguido usando el vector de pH-1PV silencer

Se transfectaron celulas HEK 293T con los ADN indicados. Tras 12 h, se infectaron las celulas con Ad5-GFP y se hicieron crecer durante 48 h adicionales antes de analizarse mediante microscopfa de fluorescencia para determinar la intensidad de GFP. Las barras representan el valor medio de un experimento tfpico realizado por triplicado con desviacion estandar relativa. Se cuantifico la intensidad de GFP usando el software ImageJ que usa cinco imagenes diferentes que contienen cada una al menos 200 celulas (23).

Figura 3: Produccion del H-1PV silencer

(A) Produccion de virus. Se produjeron virus segun el protocolo descrito en el ejemplo 1. Tras la purificacion viral, se cuantificaron los tttulos de virus mediante qPCR en tiempo real y ensayos de placas.

(B) Ejemplo de amplificacion viral a traves de infeccion. Se infectaron celulas NB324K con los virus indicados. Tras 5 dfas, se lisaron las celulas, se purificaron los virus de extractos celulares y se cuantificaron los tttulos de virus mediante qPCR en tiempo real y ensayos de placas.

(C) Ejemplo de ensayo de placas usando el H-1PV tn y H-1PV-sil-GFP.

Figura 4: La citotoxicidad de H-1PV intrinseca no se ve alterada tras la insercion del casete de iARN

Se sometieron a prueba celulas NB324K para determinar su sensibilidad a la infeccion por virus mediante ensayo de LDH. Se usaron virus a MOI de 1, 5 y 10 para la infeccion. Se realizo la medicion de LDH tras 72 h de la infeccion.

Figura 5: Silenciamiento genico eficaz conseguido usando el H-1PV silencer

(A) Contenido de ARNhc. Se extrajeron ARNhc de celulas infectadas por virus o transfectadas con plasmido y se detectaron usando el kit de deteccion de miARN mirVana segun el manual de instrucciones. + = control positivo: celulas transfectadas con pSilencer3.1-GFP; - = control negativo: celulas transfectadas con pSilencer3.1-control.

(B) qRT-PCR. Se realizo el aislamiento de ARN totales de celulas infectadas por virus y la smtesis de ADNc segun los protocolos descritos en el ejemplo 1. Se realizaron qRT-PCR usando conjuntos de cebadores espedficos para EGFP y GAPDH (usados como gen de mantenimiento).

(C) Analisis de microscopfa de fluorescencia: ejemplo de una imagen representativa. Se infectaron celulas con H- 1-sil-GFP y H-1-sil-control y luego se superinfectaron con Ad-GFP. Tras 72 horas, se analizaron las celulas mediante la senal de GFP de microscopfa de fluorescencia. Se uso la tincion de Hoechst para la visualizacion de nucleos.

(D) Analisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se infectaron celulas NB324K con H-1-sil-GFP y H-1-sil- control a las MOI indicadas. 12 horas mas tarde, se superinfectaron las celulas con Ad-GFP. Se analizo el contenido de protema EGFP mediante SDS-PAGE en los extractos celulares totales de estos cultivos celulares. Se uso p-tubulina como control de carga.

La presente invencion proporciona un parvovirus para regular por disminucion la expresion de un gen diana en una celula caracterizado porque deriva de una variante de delecion H-1 del parvovirus que contiene una delecion que engloba los nucleotidos 2022-2135, en el que un acido nucleico espedfico de diana se inserta en una region no traducida en el sentido de 3' del gen de VP de parvovirus H-1 y puede expresarse bajo el control de un promotor o region promotora reconocible por una ARN polimerasa en la celula, en el que dicho acido nucleico espedfico de diana puede transcribirse en una iARN, y en el que dicho parvovirus puede replicarse y propagarse en la celula.

La invencion es como se expone en las reivindicaciones adjuntas a esta descripcion.

El acido nucleico espedfico de diana se inserta de tal manera que la replicacion viral y la citotoxicidad no se ven afectadas.

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El acido nucleico espedfico de diana se inserta en el sentido de 3' del gen de VP de parvovirus que codifica para las protemas de la capsida del parvovirus.

El termino “parvovirus” tal como se usa en el presente documento comprende virus de tipo natural, virus que se replican y derivados de replicacion competente modificados de los mismos, virus provistos con CPG asf como virus relacionados o vectores basados en tales virus o derivados. Pueden determinarse facilmente parvovirus, derivados, etc. adecuados que son utiles para terapia, dentro de la experiencia de la tecnica basandose en la descripcion en el presente documento, sin excesivo esfuerzo empmco. Para la presente invencion, se prefieren virus que pueden replicarse y propagarse en la celula huesped.

El termino “gen diana” tal como se usa en el presente documento se toma para referirse a cualquier acido nucleico de interes que esta presente en una celula de un animal, hongo o protista. El gen diana puede transcribirse en un ARN biologicamente activo o puede ser parte de una molecula de ARN mas grande de la que se transcriben otras partes en un ARN biologicamente activo. El gen diana puede ser un gen endogeno, puede ser un transgen que se introdujo a traves de intervencion humana en los ancestros de la celula, o puede ser un gen introducido en la celula por un organismo infeccioso o patogeno. El gen diana tambien puede ser de origen viral. Ademas, la secuencia que se selecciona como diana puede seleccionarse de regiones traducidas o no traducidas o regiones de intrones o preferiblemente exones, es decir, la region codificante, o la 5'UTR o 3'UTR, o una combinacion de cualquiera o todas estas.

El gen diana usado en la presente invencion puede provocar una enfermedad en un organismo o puede estar implicado en la provocacion de la enfermedad y es un gen en el que se requiere la reduccion de la expresion genica particular para prevenir o aliviar la enfermedad. Los procesos biologicos afectados por la enfermedad que pueden revertirse mediante regulacion por disminucion de la diana genica espedfica incluyen proliferacion celular, migracion o metastasis celular, apoptosis, senalizacion de estres y union celular. El/los gen(es) diana puede(n) codificar para enzimas, factores de transcripcion, citocinas, factores de crecimiento, factores de motilidad o adhesion celular, factores del ciclo celular, supresores de tumores o inhibidores del ciclo celular.

El termino “acido nucleico espedfico de diana” tal como se usa en el presente documento se refiere a un acido nucleico que comprende al menos 15, 20, 25, 50, 100 o 200 nt consecutivos que tiene al menos aproximadamente el 75%, particularmente al menos aproximadamente el 80%, mas particularmente al menos aproximadamente el 85%, bastante particularmente de manera aproximada el 90%, especialmente de manera aproximada el 95% de identidad de secuencia con el complemento de una secuencia de nucleotidos transcrita del gen diana.

En la presente invencion un gen diana puede regularse por disminucion en una celula in vivo o una celula in vitro. La celula puede ser una celula primaria o una celula que se ha cultivado durante un periodo de tiempo o las celulas pueden estar compuestas por una lmea celular cultivada. La celula puede ser una celula enferma, tal como una celula cancerosa o celula tumoral o una celula infectada por un virus. La celula puede ser una celula madre que da lugar a celulas progenitoras, celulas mas maduras y completamente maduras de todos los linajes celulares hematopoyeticos, una celula progenitora que da lugar a celulas maduras de todos los linajes celulares hematopoyeticos, una celula progenitora asignada que da lugar a un linaje hematopoyetico espedfico, una celula progenitora de linfocitos T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T maduro, una celula progenitora mieloide o una celula de monocito/macrofago. La celula puede ser una celula madre o celula madre embrionaria. La celula puede ser una celula nerviosa, celula neural, celula epitelial, celula muscular, celula cardiaca, celula hepatica, celula renal, celula madre, celula madre embrionaria o fetal.

Por tanto, en una realizacion preferida de la presente invencion, el gen diana es un gen que provoca una enfermedad, por ejemplo, un gen de virus animal patogeno, un gen relacionado con cancer, un oncogen, un gen antiapoptotico, un gen cntico para el crecimiento de celulas tumorales, metastasis, angiogenesis o quimiorresistencia, un gen inmunomodulador o un gen que codifica para una citocina, factor de crecimiento, enzima o factor de transcripcion.

El gen diana puede ser, por ejemplo, un gen de un virus animal patogeno, por ejemplo virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del herpes simple 1 (VHS-1), VHS-2, citomegalovirus (CMV), un virus de la hepatitis tal como virus de la hepatitis B, hepatitis C o hepatitis D, virus del papiloma, virus de ARN tales como poliovirus, VSV, virus influenza, morbilivirus o un virus de ARN bicatenario tal como un reovirus. El virus puede ser patogeno para animales distintos de seres humanos, por ejemplo virus de la glosopeda, virus de la peste bovina, virus de la lengua azul, virus de la fiebre porcina, circovirus porcino, virus de la viruela caprina, virus del Nilo Occidental, virus Henipah, virus de la enfermedad de Marek, virus de la anemia del pollo, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la gripe aviar, virus de la bursitis infecciosa, virus de acuicultura tales como iridovirus, paramixovirus o virus del smdrome de la mancha blanca.

Preferiblemente, dicho parvovirus de roedor se formula como una composicion farmaceutica, en la que el parvovirus

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esta presente en una dosis eficaz y se combina con un portador farmaceuticamente aceptable. “Farmaceuticamente aceptable” pretende abarcar cualquier portador que no interfiera con la eficacia de la actividad biologica de los principios activos y que no sea toxico para el paciente al que se le administra. Se conocen bien en la tecnica ejemplos de portadores farmaceuticos adecuados e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones esteriles etc. Los portadores farmaceuticamente compatibles adicionales pueden incluir geles, materiales de matriz bioabsorbibles, elementos de implantacion que contienen el parvovirus (agente terapeutico) o cualquier otro veldculo adecuado, medios o material(es) de administracion o de dispensacion. Tales portadores pueden formularse mediante metodos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis eficaz.

Una “dosis eficaz” se refiere a cantidades de los principios activos que son suficientes para efectuar un tratamiento. Una “dosis eficaz” puede determinarse usando metodos conocidos por un experto en la tecnica (vease por ejemplo, Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., Nueva York, pags. 1-46 ((1975)).

La administracion del parvovirus puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo mediante administracion intravenosa, intratumoral, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, topica o intradermica. La via de administracion, por supuesto, depende de la clase de terapia. Vfas de administracion preferidas son administracion intravenosa (i.v.), intratumoral o endobronquial. Si se usan partfculas de virus infecciosas que tienen la capacidad de penetrar a traves de la barrera hematoencefalica, el tratamiento podna realizarse o al menos iniciarse mediante inyeccion intravenosa de, por ejemplo, virus H1.

El regimen de dosificacion del parvovirus puede determinarse facilmente dentro de la tecnica, por el medico encargado basandose en datos, observaciones y otros factores clmicos del paciente, incluyendo por ejemplo la talla del paciente, el area de superficie corporal, la edad, el sexo, el parvovirus modificado particular, etc. que va a administrarse, el momento y la via de administracion, el tipo de tumor mesenquimatoso, la salud general del paciente y otras terapias farmacologicas a las que el paciente esta sometiendose.

Como otra tecnica de administracion espedfica, el parvovirus puede administrarse al paciente desde una fuente implantada en el paciente. Por ejemplo, un cateter, por ejemplo, de silicona u otro material biocompatible, puede conectarse a un deposito subcutaneo pequeno (deposito Rickham) instalado en el paciente, por ejemplo, durante la eliminacion del tumor, o mediante un procedimiento separado, para permitir que el parvovirus se inyecte localmente en diversos momentos sin intervencion quirurgica adicional. El parvovirus tambien puede inyectarse en un tumor mediante tecnicas quirurgicas estereotacticas o mediante tecnicas de direccionamiento de neuronavegacion.

La administracion del parvovirus tambien puede realizarse mediante infusion continua de partfculas virales o lfquidos que contienen partfculas virales a traves de cateteres implantados a bajas velocidades de flujo usando sistemas de bombas adecuados, por ejemplo, bombas de infusion peristalticas o bombas de administracion potenciada por conveccion (CED, convection enhanced delivery).

Aun otro metodo de administracion del parvovirus es desde un dispositivo implantado construido y dispuesto para dispensar el parvovirus al tejido deseado. Por ejemplo, pueden emplearse obleas que se han impregnado con el parvovirus, por ejemplo, parvovirus H1, en las que la oblea esta unida a los extremos de la cavidad de reseccion al termino de la eliminacion quirurgica del tumor. Pueden emplearse obleas multiples en tal intervencion terapeutica. Pueden inyectarse celulas que producen activamente el parvovirus, por ejemplo, parvovirus H1, en el tumor, o en la cavidad tumoral tras la eliminacion de tumor.

En una realizacion preferida adicional de la presente invencion, el parvovirus de roedor es parvovirus H1 (H1PV) o un parvovirus relacionado tal como LuIII, virus diminuto del raton (MmV), parvovirus de raton (MPV), virus diminuto de la rata (RMV), parvovirus de rata (RPV) o virus de rata (RV).

En una realizacion particularmente preferida de la presente invencion, el acido nucleico espedfico de diana se inserta en el nucleotido 4683 del genoma de H-1PV de tipo natural. Sin embargo, tambien se considera la insercion del casete en otras regiones del genoma del parvovirus asf como otras moleculas desencadenantes de iARN tales como microARN y/o oligonucleotidos antisentido. En una realizacion particularmente preferida adicional de la presente invencion, el promotor o region promotora reconocible por aRn polimerasas son promotores de ARN polimerasa II (Pol II) tales como por ejemplo promotores de CMV y ubiquitina C humana o ARN polimerasa III (Pol III) tales como U6, H1, 7SK y ARNt. Un ejemplo de un promotor de ARN polimerasa III (Pol iIi) particularmente preferido es el promotor H1 de ARN polimerasa III.

En una realizacion particularmente preferida adicional de la presente invencion, el acido nucleico espedfico de diana es un ARNhc. Un ARNhc es un aRn en horquilla pequeno o un ARN en horquilla corto que es una secuencia de ARN que produce un giro en horquilla cerrado que puede usarse para silenciar la expresion genica por medio de

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interferencia por ARN. La estructura de horquilla del ARNhc se escinde mediante la maquinaria celular para dar ARNip, que luego se une al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Este complejo se une a y escinde los ARNm que corresponden al ARNip que esta unido al mismo.

En una realizacion particularmente preferida adicional de la presente invencion, el acido nucleico espedfico de diana, por ejemplo, ARNhc, tiene una longitud de al menos 15 nucleotidos.

La presente invencion tambien se refiere a un parvovirus de roedor tal como se caracterizo anteriormente para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por un gen de virus animal patogeno, un gen relacionado con cancer, un oncogen, un gen antiapoptotico, un gen cntico para el crecimiento de celulas tumorales, metastasis, angiogenesis o quimiorresistencia, o una enfermedad asociada con la expresion aberrante de un gen inmunomodulador o un gen que codifica para una citocina, factor de crecimiento, enzima o factor de transcripcion.

En una realizacion preferida, dicho parvovirus puede usarse para tratar un tumor, preferiblemente para tratar un tumor cerebral.

En una realizacion preferida adicional, dicho parvovirus puede usarse para el tratamiento de un tumor caracterizado porque las celulas de dicho tumor son resistentes a la quimioterapia y/o la radioterapia.

Los pacientes que pueden tratarse mediante el parvovirus segun la invencion incluyen seres humanos asf como animales no humanos. Los ejemplos de estos ultimos incluyen, sin limitacion, animales tales como vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros y gatos.

La presente invencion tambien proporciona una celula de un animal, hongo o protista que comprende un parvovirus tal como se describio anteriormente en el presente documento. En una realizacion, la celula esta in vitro. La celula es preferiblemente una celula de animal, una celula humana aislada, una celula humana in vitro, una celula de vertebrado no humano, una celula de mairnfero no humano, celula de pez, celula de res, celula de cabra, celula de cerdo, celula de oveja, celula de roedor, celula de hamster, celula de raton, celula de rata, celula de cobaya, celula de conejo, celula de primate no humano, celula de nematodo, celula de crustaceo, celula de gamba, celula de cangrejo, celula de langosta, celula de insecto, celula de mosca de la fruta, celula de insecto coleoptero, celula de insecto dfptero, celula de insecto lepidoptero o celula de insecto hemnptero.

Finalmente, la presente invencion tambien proporciona un animal, hongo o protista no humano, transgenico que comprende un parvovirus tal como se describio anteriormente en el presente documento. Pueden producirse animales no humanos transgenicos mediante la inyeccion del parvovirus en el pronucleo de un ovocito no humano fertilizado, mediante trasplante de celulas no humanas, preferiblemente celulas indiferenciadas no humanas en un embrion no humano en desarrollo para producir un embrion quimerico, trasplante de un nucleo de una celula recombinante no humana en un embrion enucleado no humano u ovocito no humano activado y similares. Metodos para la produccion de animales transgenicos estan bien establecidos en la tecnica y, por ejemplo, se describen en la patente estadounidense 4.873.191.

Los ejemplos a continuacion explican la invencion en mas detalle.

Ejemplo 1

Materiales y metodos

(A) Cultivo celular

Se hicieron crecer celulas NB324K y HEK293T en medio esencial mmimo (MEM) y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) respectivamente, complementados con suero de ternero fetal al 5 (MEM) o al 10% (DMEM), penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 |ig/ml y L-glutamina 2 mM (todos de Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Se mantuvieron todas las celulas a 37°C en una atmosfera del 5% de CO2, el 95% de humedad.

(B) Construccion de plasmidos

Se clono el casete de expresion de ARNhc H1 de Pol III en los plasmidos pSR19 (19) y ApSR19 (20). El primero contiene la totalidad del genoma de H-1PV tn y el segundo una version con delecion que carece de los nucleotidos 2022-2135 (que codifican para la region del extremo C-terminal de la protema NS2 de parvovirus). Se uso el sitio de enzima de restriccion HPAi (nucleotidos 4687-4693 segun la secuencia de referencia del NCBI NC_001358.1) para la clonacion. Se amplifico el casete mediante PCR usando como ADN molde el vector pSilencer3.1 (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.) y los siguientes cebadores Dir H1 POL III 5'- GTTAACGAATTCATATTTGCATGT-3' e INV H1 POL III 5'-

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GTTAACGCGGCCGCGGATCCGAGTGGTCTCATACAGAAC-3'. El casete contiene los sitios de restriccion unicos BamH1-NotI para una clonacion facil de los ARNhc en el plasmido. Se nombraron los dos plasmidos pH-1PV- silencer 1 y pH-1PV-silencer 2. Para la clonacion del ARNhc se usaron los siguientes pares de oligonucleotidos: hebra superior de ARNhc-EGFP 5'-GATCCGCTGGAGTACAACTACAACTTCAAGAGAGTTGTAGTTGTACT CCAGCTTTTTTGGAAGC-3' y hebra inferior de ARNhc-EGFP 5'-

GGCCGCTTCCAAAAAAGCTGGAGTACAACTACAACTCTCTTGAAGTTGTAGTTGTACTCCAG CG-3'; hebra superior de control negativo de ARNhc 5'-

GATCCACAGCAGAGCAGATCGTTCTTCAAGAGAGAACGATCTGCTCTGCTGTTTTTGGAAGC-3' y hebra inferior de control negativo de ARNhc 5'-

GGCCGCTTCCAAAAACAGCAGAGCAGATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATCTGCTCTGCTGTG-3'. Se aparearon los oligonucleotidos a 96°C y se clonaron directamente en los plasmidos pH-1PV-silencer 1 y 2 previamente digeridos con BamH1-NotI. Tambien se uso un enfoque similar para la clonacion de los ARNhc en el vector pSilencer3.1-H1 puro (Ambion). En este caso se usaron los sitios de restriccion BamHI/HindIII y los siguientes oligonucleotidos solapantes: hebra superior de ARNhc-EGFP Ambion: 5'-

GATCCGCTGGAGTACAACTACAACTTCAAGAGAGTT GTAGTTGTACTCCAGCTTTTTTGGAAA-3' y hebra inferior de ARNhc-EGFP Ambion 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGGAGTACAACTACAACT

CTCTTGAAGTTGTAGTTGTACTCCAGC G-3'; hebra superior de control negativo de ARNhc Ambion 5'- GATCCACAGCAGAGCAGATCGTTCTTCAAGAGAGAACGATCTGCTCTGCTGTTTTTGGAAA-3' y hebra inferior de control negativo de ARNhc Ambion 5'-AGCTTTTCCAAAAACAGCAGAGCAG

ATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATCTGCTCTGCTGTG-3'. Se propagaron todos los clones en la cepa SURE de Escherichia coli (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) y se verifico el ADN mediante secuenciacion.

(C) Produccion y titulacion de virus

Se produjeron todos los virus en celulas HEK293T. Se cultivaron las celulas en frascos de cultivo T75 y se transfectaron de manera transitoria a una confluencia del 12,5% con 4-10 |ig/frasco de plasmido viral. Tras 4 dfas, se recogieron las celulas dentro de su medio y se lisaron mediante 3 ciclos de congelacion y descongelacion y se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugacion. Se amplificaron adicionalmente los virus producidos infectando celulas NB324K y se purificaron a traves de centrifugacion en gradiente de iodixanol (21). Se realizo la titulacion viral mediante qPCR y ensayo de placas segun (22) y se expreso o bien como genoma viral (Gv) o bien como unidad formadora de placas (UFP) por ml.

(D) Transfeccion de plasmido viral

Para el experimento descrito en la figura 2, se hicieron crecer celulas HEK293T en una placa de 10 cm y se transfectaron a una confluencia de aproximadamente el 40% usando FuGENE HD (Roche, Mannheim, Alemania) segun las instrucciones del fabricante. Se diluyeron 2 |jg de ADN en medio libre de suero hasta una concentracion final de 20 ng/|il y luego se anadieron 7,5 |il de Fugene a la mezcla. Tras 30 min de incubacion a temperatura ambiente, se anadio la mezcla gota a gota a las celulas.

(E) Infeccion por virus

Para los experimentos descritos en la figura 4, se sembraron 1,5 x 105 celulas NB324K en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche antes de infectarse con H-1PV tn, H-1PV-silencer-GFP o H-1PV-silencer-control, si no se especifica de manera diferente, a la MOI de 5 (UFP/celula). 12 horas tras la infeccion, se superinfectaron las celulas con adenovirus, que expresaba la protema EGFP usado a una MOI de 80 unidades de transduccion fluorescentes verdes (GFU)/celula y se hicieron crecer durante 72 horas adicionales antes de procesarse.

(F) Ensayo de LDH

Se determino la actividad lttica de virus mediante el ensayo de LDH (CytoTox 96; Promega, Mannheim, Alemania) segun las instrucciones del fabricante. Se sembraron celulas NB324K en placas de 96 pocillos (2.500 celulas/pocillo) en 50 |il de medio. Tras 24 h, se infectaron las celulas anadiendo 50 |il adicionales de medio que contema el virus a la MOI de 5 (ufp/celula). A las 72 h tras la infeccion, se procesaron las celulas para la determinacion de la liberacion de LDH. Se midieron los cambios colorimetricos usando un lector de microtitulacion a 492 nm.

(G) Extraccion y deteccion de ARNhc

Se llevo a cabo la extraccion de ARNhc de celulas NB324K infectadas por parvovirus usando el kit de aislamiento de miARN mirVana (Ambion, Life Technologies, Darmstadt, Alemania), segun el protocolo del fabricante. Se realizo la deteccion de ARNhc usando el kit de deteccion de miARN mirVana (Ambion) tal como se describe en el manual de instrucciones.

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(H) Extraccion de ARN y preparacion de ADNc

Se aislo el ARN total de celulas usando el kit de purificacion de ARN RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Se realizo la smtesis de ADNc usando el kit de RT-PCR QuantiTect Probe (Qiagen) segun el protocolo del fabricante usando cebadores hexamericos al azar (Promega), con (+RT) o sin (-RT) adicion de ADN polimerasa Hot-StarTaq.

(I) PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Se realizo la QRT-PCR usando un sistema de deteccion de secuencias TaqMan ABI Prism 7600 (Applied Biosystems, Alemania) usando mezcla madre para PCR Power SYBR Green (Applied Biosystems, Alemania). Para normalizar cada muestra para el control de ARN, se uso el gen de mantenimiento GAPDH como gen control. Se realizaron PCR usando los siguientes cebadores: GapdhDir5'-AGCAACTCCCACTCTTCCACCTT-3', GapdhInv 5'- ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCAT-3', EGFPDir 5'-CCACTACCTGAGCACCCAGTC-3', EGFPInv 5'- CACGAACTCCAGCAGGACCA-3'.

(J) Inmunotransferencia de tipo Western

Se tripsinizaron celulas infectadas con H-IPV-sil-GFP, H-IPV-sil-control y H-1PV de tipo natural y se lavaron dos veces con PBS. Se liso el sedimento celular en 500 |il de tampon de lisis que consistfa en Tris 50 mM-HCl pH 8, NaCl 200 mM, NP-40 al 0,5%, DTT 1 mM, glicerol al 10% y una mezcla de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim Alemania) y se mantuvieron en hielo durante 20 min. Tras la centrifugacion (10.000 rpm x 10 min) se recogio el sobrenadante y se midio la cantidad de protema mediante el ensayo BCA (Perkin Elmer) segun el manual del fabricante. Se cargaron los extractos celulares totales (30 |ig) y se separaron en geles de SDS al 12% y se transfirieron sobre membrana Hybond-P (GE Healthcare) mediante inmunotransferencia en humedo (Invitrogen, X-Cell Sure Lock). Se bloquearon las membranas en PBS, Tween 20 al 0,05%, leche desnatada en polvo al 5% durante 1 h a TA. Se incubaron las transferencias con los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4°C: GFP de conejo (Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg, Alemania), p-tubulina de raton (Sigma Life Science, Hamburgo, Alemania). Tras el lavado de la membrana se anadio el anticuerpo de cabra anti-conejo o de cabra anti- raton conjugado con peroxidasa (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces se lavaron las membranas y se visualizaron con el kit de deteccion Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer, Rodgan, Alemania).

(K) Microscopia fluorescente

Se hicieron crecer celulas NB324K en placas de 6 pocillos y luego se infectaron tal como se describio anteriormente. Tras 72 h, se lavaron las celulas dos veces con 1xPBS, se fijaron con paraformaldelmdo al 4% (PFA) a 4°C y se lavaron de nuevo con PBS. Se realizo la tincion de nucleos usando el colorante Hoechst 33342. Se examinaron las celulas fijas con el microscopio fluorescente Leica DMIL. Se cuantifico la intensidad de GFP usando el software ImageJ (23).

Ejemplo 2

Construccion de H-1PV de replicacion competente para el suministro y la expresion de ARNhc

Se concibio una estrategia para generar un virus H-1PV de replicacion competente que alberga un casete de expresion de ARNhc. Para la expresion de ARNhc se empleo el promotor H1 de ARN polimerasa III (tamano total de 170-180 bases) debido a la capacidad de empaquetamiento de ADN limitante de los PV (max. 300 pb) que lo mas probablemente no toleranan la insercion de otros casetes. Con el fin de evitar que la insercion altere cualquier ORF viral, se decidio incorporar el casete en la region no traducida de H-1PV en el sentido de 3' del gen de VP (que codifica para las protemas de la capsida), concretamente en el nucleotido 4683 (sitio de enzima de restriccion HpaI dentro del genoma de parvovirus). Se introdujeron sitios de restriccion unicos para facilitar la clonacion de ARNhc en el casete usando oligonucleotidos apareados con proyecciones apropiadas (figura 1). Se usaron dos estructuras principales de parvovirus diferentes para la insercion del casete, la pSR19 que contema el genoma de H-1PV de longitud completa (19) y la H-1 dr que contema una delecion que abarcaba los nucleotidos 2022-2135 (20). Esta delecion no interfiere con la replicacion del parvovirus ni la infeccion de celulas humanas y por tanto proporciona un espacio genetico un poco mas grande para la insercion de un transgen foraneo. Se nombraron los nuevos plasmidos pH-1PV Silencer 1 y pH-1PV Silencer 2. Los resultados presentados en el presente documente se refieren al pH- 1PV Silencer 2 (abreviado pH-1sil a continuacion en el presente documento) pero tambien se obtuvieron resultados similares usando el otro plasmido. Con el fin de someter a prueba la eficacia del nuevo plasmido para inducir silenciamiento genico, se introdujeron ARNhc dirigidos contra el gen que codifica para la protema fluorescente verde potenciada (EGFP) (pH-1sil-GFP) y ARNhc control (una secuencia de ARNhc desordenada que no reconoce ninguna secuencia genica conocida) (pH-1sil-control) y se transfectaron de manera transitoria los dos plasmidos en celulas HEK293T. Como controles positivo y negativo se uso un plasmido disponible comercialmente,

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concretamente el pSilencer3.1 (Ambion, Austin, Texas, EE.UU.) que portaba la misma EGFP o ARNhc desordenados. 16 horas tras la transfeccion, se infectaron celulas con virus Ad 5 recombinante que portaba el gen EGFP. Entonces se analizaron las celulas bajo un microscopio de fluorescencia. De manera similar al plasmido pSilencer3.1, pH-1sil-GFP era muy eficaz en el silenciamiento de EGFP, reduciendo su expresion en mas del 60% (figura 2).

Se usaron los dos plasmidos pH-1sil para la produccion de parvovirus en comparacion con el plasmido H-1PV original (tn) (pSR19) segun el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se produjeron virus H-1PV tn y mutante a tftulos similares indicando que la insercion del casete no interfena la aptitud biologica global del virus (figura 3A). Ensayos de placas y de LDH en celulas NB324K confirmaron la capacidad de los virus que conteman ARNhc para replicarse e inducir lisis celular (figuras 3B-C y figura 4). Se nombraron los nuevos virus H-1PV-sil-GFP y H-1PV-sil- control.

Ejemplo 3

El virus H-1PV-sil expresa ARNhc

A continuacion, se demostro la capacidad del virus H-1PV-sil para expresar ARNhc. Se infectaron celulas NB324K con H-IPV-sil-GFP y H-1PV tn (usado como control negativo). Como control positivo para la expresion de ARNhc se transfectaron las celulas con el vector de ARNhc-EGFP pSilencer3.1. Tras 72 horas, se analizaron las celulas para determinar el contenido de ARNhc-GFP. Se detectaron altos niveles de ARNhc en celulas infectadas por H-1PV-sil- GFP (figura 5A).

Ejemplo 4

El virus H-1PV-sil puede reducir la expresion de EGFP

A continuacion, se examino la capacidad de H-IPV-silencer para inactivar la expresion de EGFP. Se infectaron celulas NB324K con virus H-IPV-sil-GFP o H-IPV-sil-control y 12 horas mas tarde se superinfectaron con Ad5 que expresaba protema EGFP. Se hicieron crecer las celulas durante 72 h adicionales antes de procesarse para la extraccion de ARN. La PCR cuantitativa en tiempo real mostro que se redujo drasticamente la expresion de EGFP en celulas infectadas con H-1-sil-GFP en mas del 80% en comparacion con la expresion encontrada en virus control (figura 5B).

Se realizo un experimento similar para comprobar la eficacia del silenciamiento al nivel de protemas. Los analisis de inmunofluorescencia e inmunotransferencia de tipo Western confirmaron ambos que H-1PV-silencer-GFP, pero no el virus control, era muy eficaz en el silenciamiento de la expresion de EGFP y que lo hace de una manera dependiente de la dosis (figuras 5C y D).

Conjuntamente estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que H-1PV o sus derivados pueden usarse como vehfculo para el suministro de ARNhc.

Bibliograffa

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Claims (14)

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REIVINDICACIONES

1. Un parvovirus para regular por disminucion la expresion de un gen diana en una celula caracterizado porque deriva de una variante de delecion H-1 del parvovirus que contiene una delecion que engloba los nucleotidos 2022-2135, en el que un acido nucleico espedfico de diana se inserta en una region no traducida en el sentido de 3' del gen de VP de parvovirus H-1 y puede expresarse bajo el control de un promotor o region promotora reconocible por una ARN polimerasa en la celula, en el que dicho acido nucleico espedfico de diana puede transcribirse en una iARN, y en el que dicho parvovirus puede replicarse y propagarse en la celula.

2. Parvovirus segun la reivindicacion 1, en el que el gen diana es un gen que provoca una enfermedad, preferiblemente en el que el gen que provoca una enfermedad es un gen de virus animal patogeno, un gen relacionado con cancer, un oncogen, un gen antiapoptotico, un gen cntico para el crecimiento de celulas tumorales, metastasis, angiogenesis o quimiorresistencia, un gen inmunomodulador o un gen que codifica para una citocina, factor de crecimiento, enzima o factor de transcripcion.

3. Parvovirus de roedor segun la reivindicacion 1, en el que el acido nucleico espedfico de diana se inserta en el nucleotido 4683 del genoma de H-1PV.

4. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el promotor o region promotora reconocible por una ARN polimerasa de la celula es un promotor de ARN polimerasa II (Pol II) o III (Pol III).

5. Parvovirus segun la reivindicacion 4, en el que el promotor de ARN polimerasa III (Pol III) es el promotor H1 de ARN polimerasa III.

6. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el acido nucleico espedfico de diana es un ARNhc.

7. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el acido nucleico espedfico de diana tiene una longitud de al menos 15 nucleotidos.

8. Parvovirus de roedor segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad provocada por un gen de virus animal patogeno, un gen relacionado con cancer, un oncogen, un gen antiapoptotico, un gen cntico para el crecimiento de celulas tumorales, metastasis, angiogenesis o quimiorresistencia, o una enfermedad asociada con la expresion aberrante de un gen inmunomodulador o un gen que codifica para una citocina, factor de crecimiento, enzima o factor de transcripcion.

9. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso segun la reivindicacion 8 caracterizado porque el uso es para tratar un tumor.

10. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso segun la reivindicacion 9 caracterizado porque el uso es para tratar un tumor cerebral.

11. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso segun la reivindicacion 9 o 10 caracterizado porque las celulas de dicho tumor son resistentes a la quimioterapia y/o la radioterapia.

12. Parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 caracterizado porque dicho parvovirus se administra mediante administracion intravenosa (i.v.), intratumoral o endobronquial.

13. Celula que contiene un parvovirus segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Animal no humano transgenico que comprende una celula segun la reivindicacion 13.