ES2948378T3 - Transgén con codones optimizados para el tratamiento de la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 (PFIC3) - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a un vector de terapia génica para su uso en el tratamiento de la colestasis intrahepática familiar progresiva tipo 3. Más específicamente, la presente invención se refiere a un vector de virus adenoasociado que comprende una secuencia optimizada con codones que codifica la isoforma A de MDR3 para el tratamiento de PFIC3. . (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Transgén con codones optimizados para el tratamiento de la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 (PFIC3)

Sector de la técnica

La presente divulgación se refiere a un vector de terapia génica para su uso en el tratamiento de la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3. De manera más específica, la presente invención se refiere a un vector de virus adenoasociado que comprende una secuencia con codones optimizados que codifica la isoforma A de MDR3 para el tratamiento de la PFIC3.

Estado de la técnica

La colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 (PFIC3, del inglés progressive familia! intrahepatic cholestasis type 3) es una enfermedad genética asociada con mutaciones en el gen del casete 4 de unión a trifosfato de adenosina, subfamilia B (ABCB4, del inglés adenosine triphosphate-binding cassette, subfamily B, 4), que codifica la proteína 3 de resistencia a múltiples fármacos (MDR3, del inglés multidrug resistance protein 3) (Jacquemin E. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2012; 36 Supl 1:526-35). Esta proteína, que se expresa predominantemente en la membrana canalicular de los hepatocitos, es una flopasa implicada en la translocación de fosfatidilcolina desde la membrana del hepatocito a la bilis. La fosfatidilcolina es necesaria para neutralizar la toxicidad de las sales biliares mediante la generación de micelas mixtas. Las mutaciones en el gen ABCB4 impiden la formación adecuada de micelas, lo que produce canalículos biliares y lesión del epitelio biliar, que conduce a la colestasis (Jacquemin E. et al. Gastroenterology. 2001; 120:1448-1458).

Actualmente no existe una cura para la PFIC3 y, por lo tanto, la necesidad médica insatisfecha es muy elevada. Aunque la terapia con ácido ursodesoxicólico (UDCA. del inglés ursodeoxycholic acid) puede mejorar los síntomas en algunos pacientes, actualmente no existe un tratamiento curativo para la PFIC3 fuera del trasplante de hígado. La intervención quirúrgica en forma de derivación biliar mejora los resultados de los pacientes. Sin embargo, las complicaciones posquirúrgicas, tales como infecciones y problemas con las bolsas de estoma, afectan la calidad de vida de los pacientes, mientras que el riesgo de cirrosis y de cáncer de hígado aún permanece. Los trasplantes de hígado son un tratamiento eficaz, pero conllevan los riesgos que implica un procedimiento tan complicado, así como la posibilidad de que la afección vuelva a surgir (van der Woerd W. L. et al. World J gastroenterol. 2017; 23(5):763-775).

La terapia génica que corrige el gen defectuoso responsable del desarrollo de la enfermedad es un tratamiento prometedor para varias enfermedades. Sin embargo, la técnica permanece aún en estudio. La integración y expresión estables de ABCB4 en células hepáticas para tratar o prevenir la PFIC3 se divulgan en el documento WO2015/139093. Sin embargo, estos sistemas de vectores integrantes presentan una desventaja principal que es el posible riesgo de provocar mutagénesis por inserción. La terapia de ARN para tratar una afección hepática, tal como la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 (PFIC3), que utiliza varios genes terapéuticos potenciales, incluido el ABCB4, solo se sugirió en el documento WO2017/100551. Por lo tanto, todavía existe una necesidad de desarrollar métodos de terapia génica que eviten la mutagénesis por inserción y, mientras tanto, permitan una expresión transgénica estable y a largo plazo. En el presente documento se describe una terapia génica para la PFIC3 con secuencias con codones optimizados que codifican la isoforma A de MDR3 que permite una elevada expresión exitosa en el hígado colestásico para revertir la causa de la toxicidad en la bilis de los pacientes afectados.

Objeto de la invención

Sorprendentemente, los inventores encontraron que, contrariamente a la isoforma A de MDR3 de tipo silvestre, la secuencia con codones optimizados de la isoforma A de MDR3 cuando se administra in vivo mostró una expresión eficaz específicamente en las membranas canaliculares de los hepatocitos. En ratones inactivados Abcb4'/_ que reproducen la mayoría de los síntomas de la PFIC3, la administración de versiones con codones optimizados codificantes de VAA de la isoforma A de MDR3 logra un efecto terapéutico a largo plazo, tal como una restauración significativa de los niveles de los biomarcadores séricos de la PFIC3, disminución del tamaño del hígado y del bazo, aumento de la fosfatidilcolina biliar y corrección de las anomalías de la morfología hepática.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente divulgación se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un transgén que codifica la isoforma A de MDR3, estando dicho transgén representado por la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

En realizaciones específicas, dicha construcción de ácido nucleico comprende además un promotor que inicia la expresión del transgén tras la introducción en una célula hospedadora, preferentemente un promotor específico del hígado, más preferentemente un promotor a-1-antitripsina o un promotor inducible por sales biliares. En realizaciones específicas, dicho vector comprende además una secuencia señal de poliadenilación, por ejemplo, una secuencia señal de poliadenilación sintética que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.

En realizaciones específicas, dicha construcción de ácido nucleico comprende además una secuencia 5'ITR y una 3'ITR, preferentemente una secuencia 5'ITR y una 3'ITR de un virus adenoasociado (VAA), en particular, una secuencia 5'ITR y una 3'ITR del serotipo VAA2.

En realizaciones más específicas, dicha construcción de ácido nucleico comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

En otro aspecto, dicha construcción de ácido nucleico está comprendida en un vector de expresión, preferentemente un vector vírico, más preferentemente un vector de VAA.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una partícula vírica que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la invención, y que comprende preferentemente proteínas de la cápside de virus adenoasociados, tales como proteínas de la cápside seleccionadas del grupo que consiste en VAA3 de tipo 3A, VAA3 de tipo 3B, NP40, NP59, NP84, LK03, VAA3-ST, Anc80 y serotipo VAA8.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una célula hospedadora que comprende la construcción de ácido nucleico o el vector de expresión de la invención, o a una célula hospedadora transducida con una partícula vírica de la invención.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende la construcción de ácido nucleico, vector de expresión, célula hospedadora o partícula vírica de la invención, en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables, que comprende opcionalmente otros principios activos.

La invención también se refiere a un producto de la invención para su uso en forma de un medicamento, tal como la prevención y/o el tratamiento de la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 en un sujeto que lo necesite. En una realización específica, el sujeto es un recién nacido, un lactante, un niño o un adulto, preferentemente un recién nacido, un lactante o un niño, más preferentemente un recién nacido o un lactante.

En el presente documento también se divulga un proceso para producir partículas víricas como se describe anteriormente, que comprende las etapas de: a) cultivar una célula hospedadora como se describe anteriormente en un medio de cultivo y b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células. La presente divulgación también se refiere a un kit que comprende la construcción de ácido nucleico, vector de expresión, célula hospedadora, partícula vírica o composición farmacéutica como se describe anteriormente, en uno o más recipientes, opcionalmente que comprende además instrucciones o materiales de embalaje.

Descripción de las figuras

Figura 1: Imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de células Huh7 transfectadas con plásmidos que expresan las isoformas de MDR3 humanas indicadas. ts: secuencia de tipo silvestre, co: secuencia con codones optimizados. Los núcleos se tiñeron con DAPI.

Figura 2: Imágenes de microscopía confocal de células Huh7 transfectadas con plásmidos que expresan las isoformas de MDR3 humanas indicadas. Para las isoformas Bts, Bco, Cts y Cco se muestran proyecciones ortogonales para demostrar la localización citoplasmática de MDR3. ts: secuencia de tipo silvestre, co: secuencia con codones optimizados. Los núcleos se tiñeron con DAPI.

Figura 3: Expresión de MDR3 en secciones de hígado de ratones inyectados con plásmidos pVAA-MDR3 a través de IHD (transferencia de ADN no marcado). Se muestran tres imágenes de un ratón inyectado con la isoforma Aco de MDR3 (paneles de la izquierda), y se muestran ambos ratones inyectados con la isoforma Ats de MDR3 (paneles de la derecha).

Figura 4: Concentración de FC en la bilis en ratones Abcb4'/_ de 3 semanas de edad tratados con vectores VAAAnc80-MDR3-Aco. Las dosis de VAA se indican debajo del eje abscisas. Los machos (M) son símbolos rellenos y las hembras (H) son símbolos abiertos.

Figura 5: Niveles séricos de alanina transaminasa (ALT) y sales biliares (SB) en ratones Abcb4'/_ tratados con VAAAnc80-MDR3-Aco. Los machos se indican con símbolos rellenos, las hembras con símbolos abiertos. Las muestras se recogieron a los 5 días, 1,2 y 3 semanas después del tratamiento, d, días; TS, ratones Abcb4+/+; KO, ratones Abcb4^-/-.

Figura 6: Pesos del bazo y del hígado (como porcentaje del peso corporal) de ratones Abcb4-/" (KO) tratados con VAAAnc80-MDR3-Aco a las 2 semanas de edad y sacrificados 3 semanas después en comparación con ratones ABCB4^-/- no tratados (cuadrados) o ratones de tipo silvestre (ts) (triángulos). Los machos (M) se indican con símbolos rellenos, las hembras (H) con símbolos abiertos. *, p <0,05; ns, no significativo.

Figura 7: Tinción con rojo sirio (A a C) y tricromo de Masson (D a F) del hígado en ratones macho Abcb4-/-(KO) tratados a las 2 semanas de edad con solución salina (A y D) o VAAAnc80-MDR3-Aco a 1,5 * 1013 (B y E) o 5 * 1013 (C y F) y sacrificados 3 semanas después. (G) La cuantificación del porcentaje de la zona positiva para la tinción con rojo sirio se realizó a través del programa informático Imaged. *: p <0,05; ns: no significativo.

Figura 8: Concentración de FC en la bilis de ratones Abcb4-/-(KO) tratados con VAAAnc80-MDR3-Aco a las 2 semanas de edad y sacrificados 3 semanas después en comparación con ratones Abcb4^-/- no tratados (cuadrados) o ratones ts (triángulos). Los machos (M) se indican con símbolos rellenos, las hembras (H) con símbolos abiertos. ****, p <0,0001; ns, no significativo.

Figura 9: Biomarcadores séricos en ratones Abcb4^-/- tratados con VAA8-MDR3-Aco. Los machos (M) se indican con símbolos rellenos, las hembras (H) con símbolos abiertos. Las semanas desde el tratamiento se indican inmediatamente debajo del eje de abscisas y las dosis de VAA para cada grupo se indican a continuación.

Figura 10: Pesos del bazo y del hígado (como porcentaje del peso corporal) de ratones Abcb4-/-(KO) tratados con VAA8-MDR3-Aco y sacrificados 12 semanas después en comparación con ratones ABCB4-/-(KO) no tratados o ratones de tipo silvestre (ts). Los machos (M) se indican con símbolos rellenos, las hembras (H) con símbolos abiertos. ***, p <0,001 **, p <0,01; ns, no significativo.

Figura 11: Tinción IHC con anticuerpo anti-MDR3 de secciones de hígado de ratones Abcb4^-/- tratados con solución salina (arriba) o VAA8-MDR3-Aco a 5 * 1013 GV/kg (medio) y recogidas una semana después. La tinción de una sección de hígado de ratón de tipo silvestre (TS) se incluye como comparador y control positivo (abajo).

Figura 12: Niveles de biomarcadores séricos para un estudio de búsqueda de intervalo de dosis de VAA8-MDR3-Aco en ratones Abcb4^-/-. Los marcadores séricos indicados se analizaron de 1 a 10 semanas después de la administración del vector. Los machos (M) se indican con símbolos rellenos, las hembras (H) con símbolos abiertos. Las dosis de VAA se indican debajo del eje abscisas.

Figura 13: Niveles de A) fosfatasa alcalina (FA) sérica y alanina transaminasa (ALT), B) aspartato transaminasa (AST) y sales biliares (SB) a partir de ratones Abcb4^-/- tratados a las 5 semanas de edad. Los animales de tipo silvestre (TS) se indican con círculos grises abiertos, los ratones Abcb4^-/- tratados con solución salina se indican con cuadrados negros y los ratones Abcb4^-/- tratados con VAA-MDR3-Aco se indican con círculos rellenos de negro. Los machos se muestran en gráficos de la izquierda y las hembras en los de la derecha.

Figura 14: Pesos del hígado (a) y del bazo (b) (como porcentaje del peso corporal), FA de la bilis (c), fibrosis (d) y expresión de la proteína MDR3 (e) en ratones Abcb4^-/- tratados a las 5 semanas de edad. Los animales de tipo silvestre (TS) se indican con rombos grises, los ratones Abcb4^-/- tratados con solución salina se indican con círculos huecos y los ratones Abcb4^-/- tratados con VAA-MDR3-Aco se indican con triángulos negros.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un transgén que comprende una secuencia con codones optimizados que codifica la isoforma A de MDR3 (secuencia de referencia NCBI: NP_000434.1). La proteína asociada a la membrana codificada por el gen ABCB4, también llamado gen MDR3, es un miembro de la superfamilia de transportadores de casetes de unión a ATP (ABC, del inglés ATP-binding cassette). Este gen codifica un transportador completo y un miembro de la familia de proteínas de membrana glucoproteína p con fosfatidilcolina como sustrato que puede estar implicado en el transporte de fosfolípidos desde los hepatocitos hepáticos a la bilis. El empalme alternativo de este gen da como resultado tres posibles isoformas, denominadas A, B y C.

Como se utiliza en el presente documento, el término "transgén" se refiere a ADN exógeno o ADNc que codifica un producto génico. El producto génico puede ser un ARN, un péptido o una proteína. Además de la región codificante del producto génico, el transgén puede incluir o estar asociado con uno o más elementos para facilitar o mejorar la expresión, tales como un promotor, potenciador(es), elemento(s) de respuesta, elemento(s) indicador(es), elemento(s) aislante(s), señal(es) de poliadenilación y/u otros elementos funcionales. Las realizaciones de la invención pueden utilizar cualquier promotor adecuado conocido, potenciador(es), elemento(s) de respuesta, elemento(s) indicador(es), elemento(s) aislante(s), señal(es) de poliadenilación y/u otros elementos funcionales. Los elementos y secuencias adecuados serán bien conocidos por los expertos en la materia.

Construcción de ácido nucleico

Más en particular, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un transgén que codifica la isoforma A de MDR3, estando dicho transgén representado por la SEQ ID NO: 1 o 2, o que tiene al menos un 90 % identidad con la SEQ ID NO: 1 o 2.

Las expresiones "secuencia de ácido nucleico" y "secuencia de nucleótidos" se pueden usar indistintamente para referirse a cualquier molécula compuesta de o que comprenda nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico puede ser un oligonucleótido o un polinucleótido. Una secuencia de nucleótidos puede ser un ADN o ARN. Una secuencia de nucleótidos puede ser modificada químicamente o artificial. Las secuencias de nucleótidos incluyen ácidos nucleicos peptídicos (ANP), morfolinos y ácidos nucleicos bloqueados (ANB), así como ácidos nucleicos de glicol (ANG) y ácido nucleico de treosa (ANT). Cada una de estas secuencias se distingue del ADN o ARN de origen natural por los cambios en la estructura de la molécula. Además, se pueden utilizar nucleótidos de fosforotioato. Otros análogos de desoxinucleótidos incluyen metilfosfonatos, fosforoamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforoamidatos y fosforotioatos de oligorribonucleótidos y sus análogos de 2'-0-alilo y metilfosfonatos de 2-0-metil-ribonucleótido, que pueden utilizarse en un nucleótido de la invención.

La expresión "construcción de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico artificial producida a partir del uso de tecnología de ADN recombinante. Una construcción de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que se ha modificado para contener segmentos de secuencias de ácido nucleico, que se combinan y se yuxtaponen de una manera, que, de otro modo, no existiría en la naturaleza. Normalmente, una construcción de ácido nucleico es un "vector", es decir, una molécula de ácido nucleico que se usa para administrar ADN creado de manera exógena a una célula hospedadora.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia" o "identidad" se refiere al número de coincidencias (restos de ácidos nucleicos idénticos) en las posiciones de un alineamiento de dos secuencias de polinucleótidos. La identidad de secuencia se determina mediante la comparación de las secuencias cuando están alineadas para maximizar la superposición y la identidad a la vez que se minimizan los huecos de secuencia. En particular, la identidad de secuencia se puede determinar utilizando cualquiera de una serie de algoritmos matemáticos globales o locales de alineación, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferentemente utilizando algoritmos de alineación global (por ejemplo, el algoritmo de Needleman y Wunsch; Needleman y Wunsch, 1970, J Mol Biol.; 48(3):443-53) que alinea las secuencias óptimamente en la totalidad de la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferentemente utilizando un algoritmo de alineación local (por ejemplo, el algoritmo de Smith y Waterman (Smith y Waterman, 1981, J Theor Biol. ;91 (2):379-80) o el algoritmo de Altschul (Altschul S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res.;25(17):3389-402.; Altschul S. F. et al., 2005, Bioinformatics. ;21(8):1451-6)). El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico se puede lograr de varias maneras que se encuentran dentro de las capacidades de la materia, por ejemplo, utilizando el programa informático disponible públicamente en sitios web de Internet tales como http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ o http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando. A efectos del presente documento, el % de valores de identidad de secuencia de ácido nucleico se refiere a los valores generados utilizando el programa de alineación de secuencias por pares EMBOSS Needle que crea una alineación global óptima de dos secuencias utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch, en donde todos los parámetros de búsqueda se establecen en los valores predeterminados, es decir, matriz de puntuación = BLOSUM62, hueco abierto = 10, hueco extendido = 0,5, penalización por hueco final = falso, hueco final abierto = 10 y hueco final extendido = 0,5.

Como se utiliza en el presente documento, dicha construcción de ácido nucleico comprende un transgén que codifica la isoforma A de MDR3 de acuerdo con la invención y una o más secuencias de control necesarias para la expresión de dicha secuencia codificante. En general, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia codificante y secuencias reguladoras precediendo (secuencias no codificantes en 5') y siguiendo (secuencias no codificantes en 3') a la secuencia codificante que son necesarias para la expresión del producto génico seleccionado. Por lo tanto, una construcción de ácido nucleico normalmente comprende una secuencia promotora, una secuencia codificante y una región no traducida en 3' que normalmente contiene un sitio de poliadenilación y/o un terminador de la transcripción. La construcción de ácido nucleico puede comprender también elementos reguladores adicionales, tales como, por ejemplo, secuencias potenciadoras, una secuencia polienlazadora que facilita la inserción de un fragmento de ADN dentro de un vector y/o una secuencia señal de corte y empalme.

En una realización, la construcción de ácido nucleico comprende un promotor. Dicho promotor inicia la expresión de transgenes tras la introducción en una célula hospedadora. Como se utiliza en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un elemento regulador que dirige la transcripción de un ácido nucleico al que está unido operativamente. Un promotor puede regular tanto el ritmo como la eficacia de la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. Un promotor puede estar unido operativamente también a otros elementos reguladores que potencian ("potenciadores") o que reprimen ("represores") la transcripción dependiente de promotores de un ácido nucleico. Estos elementos reguladores incluyen, sin limitación, sitios de unión a factores de transcripción, sitios de unión a proteínas represoras y activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la materia para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor, incluyendo, por ejemplo, atenuadores, potenciadores y silenciadores. El promotor está ubicado cerca del sitio de inicio de la transcripción del gen o de la secuencia codificante a la que está unido operativamente, sobre la misma cadena y cadena arriba de la secuencia de ADN (hacia la región 5' de la cadena codificante). Un promotor puede tener aproximadamente de 100 a 1000 pares de bases de longitud. Las posiciones en un promotor se designan en relación con el sitio de inicio de la transcripción para un determinado gen (es decir, las posiciones cadena arriba son números negativos que se cuentan desde -1, por ejemplo, -100 es una posición a 100 pares de bases cadena arriba).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "unido/a operativamente" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos (o polipéptidos) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia promotora o una secuencia reguladora de la transcripción está unida operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Unido/a operativamente significa que las secuencias de ADN que están unidas normalmente son contiguas; cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y en marco de lectura.

En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención comprende además un promotor específico del hígado unido operativamente al transgén de la invención. En el contexto de la presente invención, un "promotor específico del hígado" es un promotor que es más activo en el hígado que en cualquier otro tejido del cuerpo. Normalmente, la actividad de un promotor específico del hígado será considerablemente mayor en el hígado que en cualquier otro tejido. Por ejemplo, dicho promotor puede ser al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 veces más activo (por ejemplo, según lo determinado por su capacidad para impulsar la expresión en un tejido dado en comparación con su capacidad para impulsar la expresión en otras células o tejidos). Por consiguiente, un promotor específico del hígado permite una expresión activa en el hígado del gen unido a él e impide su expresión en otras células o tejidos.

En una realización, el promotor específico del hígado es una secuencia de nucleótidos del promotor del gen de la antitripsina a1 (AAT o A1AT) (S^e Q ID NO: 6), un promotor inducible por sales biliares (SEQ ID NO: 7 u 8) o una secuencia promotora quimérica EalbPa1AT que comprende una secuencia promotora del gen de la antitripsina a1 (AAT o Pa1AT) combinada con un elemento potenciador del gen de la albúmina (Ealb). Todas estas secuencias promotoras tienen propiedades de promotores específicos del hígado.

Cada una de estas realizaciones de construcciones de ácido nucleico puede incluir también una secuencia señal de poliadenilación; junto con otros elementos nucleotídicos opcionales o no. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "señal de poliadenilación" o "señal de poli(A)" se refiere a una secuencia de reconocimiento específica dentro de la región no traducida en 3' (3'UTR) del gen, que se transcribe en la molécula precursora de ARNm y guía la terminación de la transcripción del gen. La señal de poli(A) actúa como una señal para la escisión endonucleolítica del ARNm precursor recién formado en su extremo 3', y para la adición a este extremo 3' de un tramo de ARN que solo consiste en bases de adenina (proceso de poliadenilación; cola poli(A)). La cola poli(A) es importante para la exportación nuclear, la traducción y la estabilidad del ARNm. En el contexto de la invención, la señal de poliadenilación es una secuencia de reconocimiento que puede dirigir la poliadenilación de genes de mamíferos y/o genes víricos, en células de mamífero.

Las señales de poli(A) normalmente consisten en a) una secuencia de consenso AAUAAA, que se ha demostrado que es necesaria tanto para la escisión en el extremo 3' como para la poliadenilación del ARN premensajero (pre-ARNm), así como para potenciar la terminación de la transcripción cadena abajo; y b) elementos adicionales cadena arriba y cadena abajo de AAUAAA que controlan la eficiencia de la utilización de AAUAAA como una señal de poli(A). Hay una considerable variabilidad en estos motivos en genes de mamíferos.

En una realización, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico de la invención es una secuencia señal de poliadenilación de un gen de mamífero o un gen vírico. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen, entre otras, una señal de poliadenilación temprana de SV40, una señal de poliadenilación tardía de SV40, una señal de poliadenilación de timidina cinasa de HSV, una señal de poliadenilación del gen de protamina, una señal de poliadenilación del adenovirus 5 EIb, una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento, una señal de poliadenilación de PBGD, una señal de poliadenilación diseñada por ordenador (sintética) y similares.

En una realización particular, la secuencia señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico es una secuencia señal de poli(A) sintética basada en el gen de la p-globina de conejo, más particularmente una poli(A) sintética que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3.

Vector de expresión

La construcción de ácido nucleico de la invención puede estar comprendida en un vector de expresión. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a una molécula de ácido nucleico utilizada como vehículo para transferir material genético y, en particular, para administrar un ácido nucleico en una célula hospedadora, ya sea in vitro o in vivo. Vector de expresión también se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de efectuar la expresión de un gen (transgén) en células hospedadoras u organismos hospedadores compatibles con dichas secuencias. Los vectores de expresión normalmente incluyen al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas, y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción en 3'. También puede haber factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, tales como elementos potenciadores de la expresión capaces de responder a una señal inductiva precisa (factores de transcripción endógenos o quiméricos) o específicos de determinadas células, órganos o tejidos. Los vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos, fásmidos, cósmidos, elementos transponibles, virus y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Preferentemente, el vector de la invención es un vector adecuado para su uso en terapia génica o celular, y en particular es adecuado para dirigirse a células hepáticas.

En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector vírico, tales como vectores procedentes de los vectores del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV, del inglés Moloney murine leukemia virus), MSCV, SFFV, MPSV o SNV, vectores lentivíricos (por ejemplo, procedentes del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) y virus de la anemia infecciosa equina (VAIE), vectores adenovíricos (Ad), vectores víricos adenoasociados (VAA), vectores del virus de simio 40 (VS-40), vectores del virus del papiloma bovino, virus de Epstein-Barr, vector del virus del herpes, vectores del virus vaccinia, vectores del virus del sarcoma murino de Harvey, vectores del virus del tumor mamario murino y vectores del virus del sarcoma de Rous.

Como es conocido en la materia, dependiendo del vector vírico específico considerado para su uso, deben introducirse secuencias adecuadas en el vector de la invención para obtener un vector vírico funcional, tal como ITR de VAA para un vector de VAA o LTR para vectores lentivíricos. En una realización particular, dicho vector es un vector de VAA.

Los VAA han despertado un interés considerable como un posible vector para la terapia génica humana. Entre las propiedades favorables para el virus están su falta de asociación con cualquier enfermedad humana, su capacidad para infectar tanto células que se dividen como las que no y el amplio intervalo de estirpes celulares procedentes de diferentes tejidos que se pueden infectar. El genoma de los VAA comprende una molécula de ADN lineal monocatenaria que contiene 4681 bases (Berns y Bohenzky, 1987, "Advances in Virus Research" (Academic Press, Inc.) 32:243-307). El genoma incluye repeticiones terminales invertidas (ITR, del inglés inverted terminal repeats) en cada extremo, que funcionan en cis como orígenes de replicación de ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR tienen aproximadamente 145 pb de longitud. La parte interna no repetida del genoma incluye dos grandes marcos abiertos de lectura, conocidos como los genes rep y cap de VAA, respectivamente. Estos genes codifican las proteínas víricas que participan en la replicación y en el empaquetamiento del virión. En particular, se sintetizan al menos cuatro proteínas víricas a partir del gen rep de VAA, Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, nombradas de acuerdo con su peso molecular aparente. El gen cap de VAA codifica al menos tres proteínas, VP1, VP2 y VP3. Para una descripción detallada del genoma de VAA, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. 1992 Current T opics in Microbiol and Immunol. 158:97-129.

Por lo tanto, en una realización, la construcción de ácido nucleico que comprende el transgén de la invención comprende además una secuencia 5'ITR y una 3'ITR, preferentemente una secuencia 5'ITR y una 3'ITR de un virus adenoasociado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "repetición terminal invertida (ITR)" se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada en el extremo 5' (5'ITR) y una secuencia de nucleótidos ubicada en el extremo 3' (3'ITR) de un virus, que contiene secuencias palindrómicas y que puede plegarse para formar estructuras de horquilla en forma de T que funcionan como cebadores durante el inicio de la replicación del ADN. También son necesarias para la integración del genoma vírico en el genoma del hospedador; para el rescate del genoma del hospedador; y para la encapsidación del ácido nucleico vírico en viriones maduros. Las ITR se necesitan en cis para la replicación del genoma del vector y su empaquetamiento en las partículas víricas.

Las ITR de VAA para su uso en los vectores de la invención pueden tener una secuencia de nucleótidos de tipo silvestre o pueden estar alteradas mediante la inserción, supresión o sustitución. El serotipo de las repeticiones terminales invertidas (ITR) del vector de VAA puede seleccionarse de cualquier serotipo de VAA conocido humano o no humano. En realizaciones específicas, la expresión del vector vírico puede llevarse a cabo utilizando ITR de cualquier serotipo de VAA, incluidas las VAA1, VAA2, VAA3 (incluidos los tipos 3A y 3B), VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, VAA12, VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino, VAA ovino y cualquier otro serotipo de VAA conocido en la actualidad o que se descubra más adelante.

En una realización, la construcción de ácido nucleico comprende además una 5'ITR y una 3'ITR de un VAA del serotipo VAA2.

En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la invención comprende o consiste en la SEQ ID NO: 4 o 5, o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4 o 5.

En una realización, la construcción de ácido nucleico o el genoma del vector del VAA de acuerdo con la invención están comprendidos en un genoma de baculovirus recombinante. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "genoma de baculovirus recombinante" se refiere a un ácido nucleico que comprende elementos genéticos de baculovirus para la replicación autónoma de un genoma de baculovirus recombinante en una célula hospedadora que permite la infección y replicación de baculovirus, normalmente células de insecto. La expresión "genoma de baculovirus recombinante" incluye expresamente genomas que comprenden ácidos nucleicos que son heterólogos al baculovirus. De forma similar, la expresión "genoma de baculovirus recombinante" no se refiere necesariamente a un genoma de baculovirus completo ya que el genoma puede carecer de secuencias víricas que no son necesarias para completar un ciclo de infección. En particular, los genomas de baculovirus recombinantes pueden incluir los genes heterólogos de VAA útiles para la producción de VAAr y/o el transgén tal como la isoforma A de MDR3 con codones optimizados para encapsidarse en el VAAr para su uso en terapia génica. Los elementos genéticos baculovíricos para su uso en la presente divulgación se obtienen preferentemente del baculovirus AcMNPV (Nucleopoliedrovirus multinucleocápside Autographa californica).

En una realización particular, los genes que codifican catepsina y quitinasa de baculovirus en dichos primer y segundo genomas baculovíricos se rompen o eliminan. En particular, los genes v-cath (Ac127) y chiA (Ac126) del baculovirus AcMNPV puede romperse o eliminarse de modo que la catepsina o quitinasa correspondiente no se expresen o se expresen como formas inactivas (es decir, no tienen actividad enzimática de catepsina o quitinasa). En una realización particular, dichos genomas de baculovirus recombinantes se rompen o eliminan adicionalmente para al menos el gen p24 (Ac129), preferentemente para los tres genes baculovíricos p10 (Ac137), p24 y p26 (Ac136). En una realización particular, dichos genomas de baculovirus recombinantes incluyen el gen baculovírico p74 funcional (Ac138) (es decir, dicho gen no se ha eliminado ni alterado).

Por otro lado, la construcción de ácido nucleico o el vector de expresión de la invención se puede llevar a cabo utilizando 5'ITR y/o 3'ITR sintéticas; y también mediante el uso de una 5'ITR y una 3'ITR procedentes de virus de diferentes serotipos. Todos los demás genes víricos necesarios para la replicación del vector vírico pueden proporcionarse en trans dentro de las células productoras de virus (células de empaquetamiento) como se describe a continuación. Por tanto, su inclusión en el vector vírico es opcional.

En una realización, la construcción de ácido nucleico o el vector vírico de la invención comprende un 5'ITR, una señal de empaquetamiento ^y y una 3'ITR de un virus. "La señal de empaquetamiento ^y " es una secuencia de nucleótidos de acción en cis del genoma del virus, que, en algunos virus (por ejemplo, adenovirus, lentivirus, etc.) es esencial para el proceso de empaquetamiento del genoma del virus en la cápside vírica durante la replicación.

La construcción de partículas víricas de VAA recombinantes se conoce en general en la materia y se ha descrito, por ejemplo, en los documentos US 5.173.414 y US 5.139.941; en los documentos WO 92/01070 y WO 93/03769, Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol and Immunol. 158:97-129; y Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801.

Partícula vírica

La construcción de ácido nucleico o el vector de expresión de la invención pueden empaquetarse en una cápside de virus para generar una "partícula vírica", también llamada "partícula de vector vírico". En una realización particular, la construcción de ácido nucleico o el vector de expresión se empaquetan en una cápside procedente de un VAA para generar una "partícula vírica adenoasociada" o "partícula VAA". La presente invención se refiere a una partícula vírica que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la invención y que preferentemente comprende proteínas de la cápside de virus adenoasociados.

El término partícula de vector de VAA abarca cualquier partícula de vector de VAA recombinante o partícula de vector de VAA mutante, modificada por ingeniería genética. Se puede preparar una partícula VAA recombinante mediante la encapsidación de la construcción de ácido nucleico o del vector de expresión vírica que incluye ITR procedentes de un serotipo de VAA particular en una partícula vírica formada por proteínas Cap naturales o mutantes correspondientes a un VAA del mismo o diferente serotipo.

Las proteínas de la cápside vírica de un virus adenoasociado incluyen proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Las diferencias entre las secuencias de las proteínas de la cápside de los diferentes serotipos de VAA dan lugar al uso de diferentes receptores de la superficie celular para la entrada celular. Junto con vías alternativas de procesamiento intracelular, esto da lugar a distintos tropismos tisulares para cada serotipo del VAA. Se han desarrollado varias técnicas para modificar y mejorar las propiedades estructurales y funcionales de las partículas víricas de VAA de origen natural (Bunning H. et al. J Gene Med, 2008; 10: 717-733; Paulk et al. Mol ther. 2018,26(1):289-303; Wang L. et al. Mol Ther. 2015. 23(12): 1877-87; Vercauteren et al. Mol Ther. 2016,24(6):1042-1049; Zinn E. et al., Cell Rep.

2015;12(6):1056-68).

Por lo tanto, en la partícula vírica de VAA de acuerdo con la presente divulgación, se puede empaquetar la construcción de ácido nucleico o el vector de expresión vírico que incluye ITR de un serotipo de VAA dado, por ejemplo, en: a) una partícula vírica constituida por proteínas de la cápside procedentes del mismo o diferente serotipo de VAA [por ejemplo, ITR de VAA2 y proteínas de la cápside de VAA5; It R de VAA2 y proteínas de la cápside de VAA8; It R de VAA2 y proteínas de la cápside de Anc80; ITR de VAA2 y proteínas de la cápside de VAA9]; b) una partícula vírica de mosaico constituida por una mezcla de proteínas de la cápside de diferentes serotipos o mutantes de VAA [por ejemplo, ITR de VAA2 con proteínas de la cápside de VAA1 y VAA5]; c) una partícula vírica quimérica constituida por proteínas de la cápside que se han truncado mediante el intercambio de dominios entre diferentes serotipos o variantes de VAA [por ejemplo, ITR de VAA2 con proteínas de la cápside de VAA5 con dominios de VAA3].

El experto en la materia apreciará que la partícula vírica de VAA para su uso de acuerdo con la presente divulgación puede comprender proteínas de la cápside de cualquier serotipo de VAA, incluido VAA1, VAA2, VAA3 (incluidos los tipos 3A y 3B), VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, VAA12, VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino, VAA ovino, variantes sintéticas de VAA, tales como NP40, NP59, NP84 (Paulk et al. Mol ther.

2018,26(1):289-303), LK03 (Wang L. et al. Mol Ther. 2015. 23(12):1877-87), VAA3-ST (Vercauteren et al. Mol Ther.

2016,24(6):1042-1049), Anc80 (Zinn E. et al., Cell Rep. 2015;12(6):1056-68) y cualquier otro serotipo de VAA ahora conocido o descubierto posteriormente.

En una realización específica, la partícula vírica de VAA comprende proteínas de la cápside de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en un VAA1, VAA3B, un VAA5, un VAA7, un VAA8 y un VAA9, que son más adecuados para la administración a las células hepáticas (Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414-1421; Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73).

En una realización particular, la partícula vírica de VAA comprende proteínas de la cápside de Anc80, un ancestro predicho de los serotipos víricos de VAA 1, 2, 8 y 9, que se comporta como un vector de terapia génica altamente potente dirigido al hígado, músculo y retina (Zinn E. et al., Cell Report. 2015;12(6):1056-68). En una realización más particular, la partícula vírica comprende la proteína de la cápside VP3 Anc80L65 (número de registro del Genbank: KT235804).

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una partícula vírica que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la invención y que preferentemente comprende proteínas de la cápside de virus adenoasociados, tales como proteínas de la cápside de los serotipos Anc80 y VAA8, más preferentemente el serotipo VAA8.

En una realización particular, la partícula vírica comprende el genoma del vector de VAA comprendido en el baculovirus recombinante. Por lo tanto, se utiliza un segundo genoma de baculovirus recombinante que comprende rep y cap de VAA para producir partículas víricas de VAA. En una realización particular, las proteínas rep y cap se expresan a partir de distintos promotores tardíos de baculovirus, preferentemente en orientación inversa. En una realización específica, que puede combinarse con las realizaciones anteriores, el segundo genoma de baculovirus incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica las proteínas rep, por ejemplo, proteínas rep de VAA2 bajo el control transcripcional del promotor poliedro (PPh) de baculovirus. En otra realización, el segundo genoma de baculovirus incluye un ácido nucleico heterólogo que codifica las proteínas cap bajo el control transcripcional del promotor p10 de baculovirus. También se conocen en la materia otras modificaciones de las secuencias de VAA de tipo silvestre para la expresión adecuada en células de insecto y/o para aumentar el rendimiento de VP y virión o para alterar el tropismo o reducir la antigenicidad del virión. Mediante el uso de una construcción baculovírica auxiliar que codifica el ORF (Open Reading Frame, marco de lectura abierto) de rep de un serotipo de VAA y el ORF de cap de un serotipo de VAA diferente, es factible empaquetar un vector flanqueado por ITR de un serotipo de VAA dado en viriones ensamblados a partir de proteínas estructurales de la cápside de un serotipo diferente. También es posible, mediante este mismo procedimiento, empaquetar vectores de mosaico, quiméricos o dirigidos. Las interacciones entre el virus y el glucano son determinantes críticos de la invasión de la célula hospedadora. En una realización particular, la partícula vírica de VAA comprende proteínas de la cápside que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos, en donde las sustituciones introducen un nuevo sitio de unión a glucano en la proteína de la cápside de VAA. En una realización más particular, las sustituciones de aminoácidos están en el aminoácido 266, en los aminoácidos 463 a 475 y en los aminoácidos 499 a 502 de VAA2 o las posiciones de aminoácidos correspondientes de VAA1, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10 o cualquier otro serotipo de VAA, también incluidos Anc80 y Anc80L65.

El nuevo sitio de unión a glucano introducido puede ser un sitio de unión a hexoxa [por ejemplo, un sitio de unión a una galactosa (Gal), una manosa (Man), una glucosa (Glu) o una fucosa (fuc)]; un sitio de unión a ácido siálico (Sia) [por ejemplo, un resto Sia tal como ácido N-acetilneuramínico (NeuSAc) o ácido N-glucolilneuramínico (NeuSGc)]; o un sitio de unión a disacárido, en donde el disacárido es un ácido siálico unido a galactosa, por ejemplo, en forma de Sia(a2,3)Gal o Sia(a2,6)Gal. Se proporciona una guía detallada para introducir un nuevo sitio de unión a partir de un serotipo de VAA en una proteína de la cápside de un VAA de otro serotipo en la publicación de patente internacional WO2014144229 y en Shen et al. (J. Biol. Chem. 2013; 288(40):28814-28823). En una realización particular, el sitio de unión a Gal de VAA9 se introduce en la cadena principal de VP3 de VAA2, produciendo una cepa de VAA de unión a glucano doble que puede utilizar receptores de HS y Gal para la entrada celular. Preferentemente, dicha cepa de VAA de unión a glucano doble es VAA2G9. Shen et al. generaron VAA2G9 mediante la sustitución de restos de aminoácidos directamente implicados y que flanquean inmediatamente el sitio de reconocimiento de Gal en la subunidad de la proteína de la cápside VP3 de VAA9 en los restos correspondientes de la región de codificación de la subunidad VP3 de VAA2 (numeración de VP3 de VAA2 Q464V, A467P, D469N, I470M, R471A, D472V, S474G, Y500F y S501A).

En otra realización, la partícula vírica para su uso de acuerdo con la presente divulgación puede ser una partícula adenovírica, tal como una partícula vírica Ad5. Como es el caso de la partícula vírica de VAA, las proteínas de la cápside de las partículas víricas de Ad también pueden genomanipularse para modificar su tropismo y sus propiedades de direccionamiento celular, y también se pueden emplear serotipos adenovíricos adicionales.

Un proceso para producir partículas víricas

La producción de partículas víricas que portan el vector vírico de expresión como se ha divulgado anteriormente puede realizarse mediante métodos y protocolos convencionales, que se seleccionan teniendo en cuenta las características estructurales escogidas para la realización real del vector de expresión y de la partícula vírica del vector que se vaya a producir.

En resumen, las partículas víricas pueden producirse en una célula hospedadora, más particularmente en una célula que produce virus específicos (célula de empaquetamiento), que se transfecta con la construcción de ácido nucleico o vector de expresión para empaquetarse, en presencia de un vector o virus auxiliar u otra(s) construcción(ones) de ADN.

La expresión "células de empaquetamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula o estirpe celular que se puede transfectar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión de la invención y que proporciona en trans todas las funciones carentes que se necesitan para la replicación completa y el empaquetamiento de un vector vírico. Normalmente, las células de empaquetamiento expresan de manera constitutiva o inducible una o más de dichas funciones víricas que faltan. Dichas células de empaquetamiento pueden ser células adherentes o en suspensión.

Normalmente, un procedimiento para producir partículas víricas comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en un medio de cultivo; y

b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.

Se pueden utilizar métodos convencionales para producir partículas víricas de las partículas víricas de VAA, que consisten en la cotransfección celular transitoria con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido) llevando el transgén de la invención; una construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido auxiliar de VAA) que codifica genes rep y cap, pero no porta secuencias ITR; y con una tercera construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) que proporciona las funciones adenovíricas necesarias para la replicación del VAA. Los genes víricos necesarios para la replicación del VAA se denominan en el presente documento genes auxiliares víricos. Normalmente, dichos genes necesarios para la replicación del VAA son genes auxiliares adenovíricos, tales como E1A, E1B, E2a, E4 o ARN de VA. Preferentemente, los genes auxiliares adenovíricos son del serotipo Ad5 o Ad2.

La producción a gran escala de partículas de VAA de acuerdo con la divulgación también se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la infección de células de insecto con una combinación de baculovirus recombinantes (Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943). Las células SF9 se infectan conjuntamente con dos o tres vectores de baculovirus respectivamente que expresan rep de VAA, cap de VAA y el vector de VAA que se va a empaquetar. Los vectores de baculovirus recombinantes proporcionarán las funciones del gen auxiliar vírico necesarias para la replicación y/o el empaquetamiento del virus. Smith et al. 2009 (Molecular Therapy, vol. 17, n.° 11, pág. 1888-1896) describe adicionalmente un sistema de expresión de baculovirus doble para la producción a gran escala de partículas de VAA en células de insectos.

Los medios de cultivo adecuados serán conocidos por un experto en la materia. Los ingredientes que componen dichos medios pueden variar según el tipo de célula que se vaya a cultivar. Además de la composición de nutrientes, la osmolaridad y el pH se consideran parámetros importantes de los medios de cultivo. El medio de crecimiento celular comprende diversos ingredientes bien conocidos por el experto en la materia, que incluyen aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, fuentes de hidratos de carbono, lípidos, oligoelementos (CuSCM, FeSCM, Fe(NÜ3)₃, ZnSÜ4, etc.), estando cada ingrediente presente en una cantidad que mantiene el cultivo de una célula in vitro (es decir, la supervivencia y el crecimiento de las células). Los ingredientes también pueden incluir diferentes sustancias auxiliares, tales como sustancias tampón (como bicarbonato de sodio, Hepes, Tris, etc.), estabilizadores de la oxidación, estabilizadores para contrarrestar el estrés mecánico, inhibidores de proteasas, factores de crecimiento animales, hidrolizados vegetales, agentes antiaglomerantes, agentes antiespumantes. Las características y composiciones de los medios de crecimiento celular varían dependiendo de las necesidades celulares en particular. Son ejemplos de medios de crecimiento celular disponibles en el mercado: MEM (medio esencial mínimo), ^b M^e (Basal Médium Eagle, medio de Eagle basal), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Médium, Medio de Eagle modificado por Dulbecco), DMEM de Iscove (modificación de Iscove del medio de Dulbecco), GMEM, RPMI 1640, Leibovitz L-15, medio de McCoy, Medio 199, Ham (medio de Ham) F10 y derivados, Ham F12, DMEM/F12, etc.

Se puede encontrar orientación adicional para la construcción y producción de vectores víricos para terapia génica de acuerdo con la divulgación en "Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols". Serie: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten y Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer); Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag; Heilbronn R. y Weger S. "vírico Vectors for Gene T ransfer: Current Status of Gene Therapeutics". En: "Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology", 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; págs.

143-170; "Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols". R.O. Snyder y P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer); Bünning H. et al. "Recent developments in adeno-associated virus technology". J. Gene Med. 2008; 10:717-733; "Adenovirus: Methods and Protocols". M. Chillon y A. Bosch (Eds.); Tercera edición. 2014 Humana Press (Springer)

Células hospedadoras

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la invención. Más en particular, la célula hospedadora de acuerdo con la invención es una célula productora de virus específicos, también denominada célula de empaquetamiento que se transfecta con la una construcción de ácido nucleico o el un vector de expresión de acuerdo con la invención, en la presencia de un vector auxiliar o virus o construcciones de ADN proporcionan juntas en trans todas las funciones que faltan que son necesarias para la replicación completa y el empaquetamiento de la partícula vírica. Dichas células de empaquetamiento pueden ser células adherentes o en suspensión.

Por ejemplo, dichas células de empaquetamiento pueden ser células eucariotas tales como células de mamífero, incluidas células de simio, humanas, de perro y de roedor. Son ejemplos de células humanas las células PER.C₆ (documento WO01/38362), MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células HEK-293 (ATCC CRL-1573), células HeLa (ATCC CCL2) y células pulmonares fetales de macaco (ATCC CL-160). Son ejemplos de células de primate no humano las células Vero (ATCC CCL81), células COS-1 (ATCC CRL-1650) o células COS-7 (ATCC CRL-1651). Son ejemplos de células de perro las células MDCK (ATCC CCL-34). Son ejemplos de células de roedor las células de hámster, tales como BHK21-F, células HKCC o células CHO.

Como alternativa a las fuentes de mamífero, las células de empaquetamiento para producir las partículas víricas pueden proceder de fuentes aviares tales como el pollo, pato, ganso, codorniz o faisán. Los ejemplos de estirpes celulares aviares incluyen células madre embrionarias aviares (documentos WO01/85938 y WO03/076601), células de retina de pato inmortalizadas (documento WO2005/042728) y células procedentes de células madre embrionarias aviares, incluidas células de pollo (documento WO2006/108846) o células de pato, tal como la estirpe celular EB66 (documentos WO2008/129058 y WO2008/142124).

En otra realización, las células pueden ser células cualesquiera que permiten la infección por baculovirus y las células de empaquetamiento de replicación. En una realización particular, dichas células son células de insectos, tales como las células SF9 (ATCC CRL-1711), células Sf21 (IPLB-Sf21), células MG1 (BTI-TN-MG1) o células High Five™ (BTI-TN-5B1-4).

Por consiguiente, en una realización particular, opcionalmente junto con una o más características de las diferentes realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la célula hospedadora comprende:

- Una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un transgén que codifica la isoforma A de MDR3 de acuerdo con la invención (p. ejemplo, el vector VAA de acuerdo con la invención),

- una construcción de ácido nucleico, por ejemplo, un plásmido, que codifica los genes rep y/o cap de VAA que no lleva(n) las secuencias de ITR; y/o

- una construcción de ácido nucleico, por ejemplo, un plásmido o virus, que comprende genes auxiliares víricos.

En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora transducida con una partícula vírica de la invención y la expresión "célula hospedadora", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier estirpe celular que es susceptible a la infección por un virus de interés y que se puede cultivar in vitro.

La célula hospedadora de la invención puede utilizarse para fines de terapia génica ex vivo. En dichas realizaciones, las células se transducen con la partícula vírica de la invención y posteriormente se trasplantan al paciente o sujeto. Las células trasplantadas pueden tener un origen autólogo, alogénico o heterólogo. Para uso clínico, el aislamiento celular generalmente se llevará a cabo según las prácticas correctas de fabricación (BPF, del inglés Good Manufacturing Practices). Antes del trasplante, normalmente se comprueba la calidad celular y la ausencia de microbios u otros contaminantes y se puede llevar a cabo un preacondicionamiento del hígado, como con radiación y/o un tratamiento inmunosupresor. Además, las células hospedadoras pueden trasplantarse junto con factores de crecimiento para estimular la proliferación y/o diferenciación celular, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, del inglés Hepatocyte Growth Factor).

En una realización particular, la célula hospedadora se usa para terapia génica ex vivo en el hígado. Preferentemente, dichas células son células eucariotas tales como células de mamíferos, que incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos, tales como simios; chimpancés; monos y orangutanes, animales domésticos, incluidos perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, vacas, cerdos, ovejas y cabras u otras especies de mamíferos que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsteres y similares. Un experto en la materia escogerá las células más apropiadas según el paciente o sujeto en el que se vaya a realizar el trasplante.

Dicha célula hospedadora puede ser una célula con propiedades de autorrenovación y pluripotencia, tales como células madre o células madre pluripotentes inducidas. Las células madre son preferentemente células madre mesenquimatosas. Las células madre mesenquimatosas (MSC, del inglés Mesenchymal Stem Cell) son capaces de diferenciarse en al menos uno de un osteoblasto, un condrocito, un adipocito o un miocito, y pueden aislarse de cualquier tipo de tejido. En general, las MSC se aislarán de la médula ósea, tejido adiposo, cordón umbilical o de la sangre periférica. Los métodos de obtención de las mismas son bien conocidos por un experto en la materia. Las células madre pluripotentes inducidas (también conocidas como células iPS o iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) son un tipo de célula madre pluripotente que puede generarse directamente a partir de células adultas. Yamanaka et al. indujeron células iPS mediante la transferencia de los genes Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc a fibroblastos de ratón y humanos, y forzando a las células a expresar los genes (Documento WO 2007/069666). Thomson et al. produjeron posteriormente células iPS humanas usando Nanog y Lin28 en lugar de Klf4 y c-Myc (Documento WO 2008/118820).

Dichas células hospedadoras también pueden ser hepatocitos. Los procedimientos de trasplante de hepatocitos, incluyendo el aislamiento de células y el posterior trasplante a un receptor humano o ratón se describe, por ejemplo, en Filippi y Dhawan, Ann NY Acad Sci. 2014, 1315 50-55; Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660; Irani et al. Molecular Therapy 2001, 3:3, 302-309; y Vogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176. Un método para la transducción ex vivo de un vector vírico en hepatocitos se describe, por ejemplo, en Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982.

Composiciones farmacéuticas

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico, un vector de expresión, una partícula vírica o una célula hospedadora de la invención junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora o farmacopea reconocida, tal como la European Pharmacopeia (farmacopea europea), para usar en animales y/o seres humanos. El término "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, portador o vehículo con el que se administra el agente terapéutico.

Cualquier vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado se puede utilizar en la preparación de una composición farmacéutica (Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, abril de 1997). Las composiciones farmacéuticas normalmente son estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma de soluciones (por ejemplo, solución salina, solución de dextrosa o solución tamponada, u otros líquidos estériles farmacéuticamente aceptables), microemulsiones, liposomas u otra estructura ordenada adecuada para aceptar una alta concentración de producto (por ejemplo, micropartículas o nanopartículas). El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición.

Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. El producto de la invención puede administrarse en una formulación de liberación controlada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta u otros vehículos que protejan al producto contra la liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar, por ejemplo, polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos/poliglicólicos (PLG). Preferentemente, dicha composición farmacéutica se formula como una solución, más preferentemente, como una solución salina opcionalmente tamponada. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas de la invención. En el Compendio de Productos Farmacéuticos y Especialidades (CPS, del inglés Compendium of Pharmaceutical and Specialties) de la Asociación Canadiense de Farmacéuticos, por ejemplo, se puede encontrar orientación sobre la administración conjunta de terapias adicionales.

En una realización, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica parenteral, que incluye una composición adecuada para administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Estas composiciones farmacéuticas son solo ilustrativas y no limitan las composiciones farmacéuticas adecuadas para otras vías de administración parenterales y no parenterales. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden empaquetar en formas de dosificación unitarias o multidosis.

Usos terapéuticos

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico, vector de expresión, partícula vírica, célula hospedadora o composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento en un sujeto que lo necesite.

El término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a mamíferos. Las especies de mamíferos que pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento divulgados incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos, tales como simios, chimpancés, monos y orangutanes, animales domésticos, incluidos perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, vacas, cerdos, ovejas y cabras u otras especies de mamíferos que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsteres y similares. En una realización particular, dicho sujeto es recién nacido, un lactante o, un niño, más particularmente un recién nacido o un lactante. Como se utiliza en el presente documento, "recién nacido" se refiere a un bebé que tiene menos de 28 días y "lactante", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un niño que tiene entre 29 días y 2 años.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico, vector de expresión, partícula vírica, célula hospedadora o composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática, en particular, la colestasis familiar de tipo 3 (PFIC3) en un sujeto que lo necesita. Como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento", "tratar" y "tratando" se refieren a cualquier acto destinado a mejorar el estado de salud de los pacientes, tal como terapia, prevención, profilaxis y retardo de la enfermedad. En determinadas realizaciones, dichos términos se refieren al alivio o erradicación de una enfermedad o de los síntomas asociados con una enfermedad. En otras realizaciones, este término se refiere a minimizar la propagación o el empeoramiento de la enfermedad como resultado de la administración de uno o más agentes terapéuticos a un sujeto con dicha enfermedad.

En una realización particular, la enfermedad hepática se selecciona entre el grupo que consiste en: colestasis intrahepática del embarazo de tipo 3 (ICP3), enfermedad de cálculos biliares de colesterol, colestasis inducida por fármacos, colestasis de recién nacido transitoria, cirrosis idiopática del adulto, colangiocarcinoma y colestasis familiar de tipo 3 (PFIC3). En una realización más particular, dicha enfermedad hepática es la colestasis familiar de tipo 3 (PFIC3).

En un aspecto relacionado, la invención se refiere al uso de una construcción de ácido nucleico, vector de expresión, partícula vírica, célula hospedadora o composición farmacéutica de la invención en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática, preferentemente para su uso en el tratamiento de la colestasis familiar de tipo 3 (PFIC3).

En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención, un método para tratar y/o prevenir una enfermedad hepática, preferentemente la colestasis familiar de tipo 3 (PFIC3), en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción de ácido nucleico, vector de expresión, una partícula vírica, una célula hospedadora o una composición farmacéutica de la invención.

En el contexto de la invención, una "cantidad eficaz" significa una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado, tal como disminuciones en los niveles de biomarcadores en suero, tal como gamma-glutamiltransferasa (GGT), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (FA), aspartato transaminasa (AST), sales biliares (SB) y bilirrubina, restauración de la fosfatidilcolina biliar u otras concentraciones de fosfolípidos. La cantidad terapéuticamente eficaz del producto de la invención, o la composición farmacéutica que lo comprende, puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del producto o de la composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es normalmente aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del producto o de la composición farmacéutica se ve compensado por los efectos beneficiosos terapéuticamente.

El tratamiento con un producto de la invención puede aliviar, mejorar o reducir la intensidad de uno o más síntomas de la colestasis familiar de tipo 3 (PFIC3). Por ejemplo, el tratamiento puede disminuir los niveles de biomarcadores en suero, tales como gamma-glutamiltransferasa (GGT), alanina transaminasa (ALT), fosfatasa alcalina (FA), aspartato transaminasa (AST), sales biliares (SB) y bilirrubina; o restaurar las concentraciones de fosfatidilcolina biliar u otros fosfolípidos; y, por consiguiente, puede aliviar, mejorar o reducir la intensidad de la colangitis, proliferación ductular, fibrosis biliar, hipertensión portal, cirrosis, hemorragia gastrointestinal, ictericia, colestasis, prurito e insuficiencia hepática.

El producto de la invención normalmente se incluirá en una composición farmacéutica o un medicamento, opcionalmente en combinación con un vehículo, diluyente y/o adyuvante farmacéutico. Dicha composición o dicho producto medicinal comprende el producto de la invención en una cantidad eficaz, suficiente para proporcionar un efecto terapéutico deseado, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización, la construcción de ácido nucleico, vector de expresión, la partícula vírica, la célula hospedadora o la composición farmacéutica para su uso terapéutico se administra al sujeto o paciente por vía parenteral, en particular, por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular.

En una realización, la construcción de ácido nucleico, vector de expresión, la partícula vírica, la célula hospedadora o la composición farmacéutica para su uso terapéutico se administra por vía intersticial, es decir, por inyección a o en los intersticios de un tejido. La diana tisular puede ser específica, por ejemplo, tejido del hígado, o puede ser una combinación de varios tejidos, por ejemplo, los tejidos musculares y hepáticos. Las dianas tisulares ilustrativas pueden incluir hígado, músculo esquelético, músculo del corazón, depósitos adiposos, riñón, pulmón, endotelio vascular, células epiteliales y/o hematopoyéticas. En una realización preferida, se administra por inyección intrahepática, es decir, inyección en el espacio intersticial del tejido hepático.

La cantidad de producto de la invención que se administra al sujeto o paciente puede variar dependiendo de las circunstancias particulares del sujeto o paciente individual, incluyendo, la edad, el sexo y el peso del individuo; la naturaleza y el estadio de la enfermedad, la agresividad de la enfermedad; la vía de administración; y/o la medicación simultánea que se haya recetado al sujeto o paciente. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima.

Para cualquier sujeto en particular, las pautas posológicas específicas pueden ajustarse con el tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son solo ilustrativos y no limitan los intervalos de dosificación que puedan seleccionar los médicos.

En una realización, se puede administrar una partícula vírica de VAA de acuerdo con la invención al sujeto o paciente para el tratamiento de la enfermedad de PFIC3 en una cantidad o dosis comprendida dentro de un intervalo de 5 x 1011 a 1 x 1016 gv/kg (gv: genomas víricos; kg: peso corporal del sujeto o del paciente). En una realización más particular, la partícula vírica de VAA se administra en una cantidad comprendida dentro de un intervalo de 1 x 1013 a 1 x 1015 gv/kg. En una realización más particular, la partícula vírica de VAA se administra a una dosis de al menos 2 x 1013 gv/kg, preferentemente 4,5 x 1013 gv/kg, más preferentemente 5 x 1013 gv/kg y más preferentemente 8 x 1013 gv/kg.

Kit

En otro aspecto, la invención se refiere adicionalmente a un kit que comprende una construcción de ácido nucleico, vector de expresión, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la invención en uno o más recipientes. El kit puede incluir instrucciones o materiales de empaquetamiento que describen cómo administrar la construcción de ácido nucleico, vector de expresión, partícula vírica, célula hospedadora o composición farmacéutica contenida en el kit a un paciente. Los recipientes del kit pueden ser de cualquier material adecuado, por ejemplo, vidrio, plástico, metal, etc., y de cualquier tamaño, forma o configuración adecuados. En determinadas realizaciones, los kits pueden incluir una o más ampollas o jeringuillas que contienen los productos de la invención en una forma líquida o solución adecuada.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos

Seis variantes transgénicas de MDR3 analizadas in vitro por transfección

El gen ABCB4 codifica la proteína de resistencia a múltiples fármacos (MDR3), una proteína transportadora de fosfatidilcolina (FC) que se localiza en la membrana canalicular de los hepatocitos y es responsable de regular la concentración de FC en la bilis. La FC forma micelas mixtas con ácidos biliares y sirve para reducir el daño tisular y la toxicidad provocada por los ácidos biliares libres. Las mutaciones en ABCB4 pueden conducir a una deficiencia de la FC en la bilis que provoca toxicidad, lo que conduce a la colestasis. El trastorno resultante es la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 (Jacquemin, E. 2012, Clin Res Hepatol Gastroenterol; 36 Suμl 1:526-35). Pueden existir tres isoformas potenciales para MDR3, denominadas A, B y C. Se generaron plásmidos que contenían la versión de tipo silvestre (ts) o con codones optimizados (co) del ADNc de MDR3-A, -B o -C humana bajo el control transcripcional del promotor alfa 1-antitripsina (A1AT) específico de hígado. Estos plásmidos se transfectaron transitoriamente en la estirpe celular hepática humana Huh7 para analizar y comparar la expresión de las seis variantes. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron, se fijaron, se tiñeron con anticuerpos primarios de conejo anti-MDR3 y secundarios anti-Alexa488 de conejo, y se visualizaron mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal. Las imágenes de las células que se tiñeron positivas para la expresión de MDR3 mostraron que solo la isoforma A parecía localizarse en la membrana celular. Esto fue más evidente con la microscopía confocal, ya que los planos en serie de las células positivas para MDR3 mostraron una expresión clara localizada en la membrana (Figuras 1 y 2). Cabe destacar que, las secuencias para las posibles isoformas B y C (identificadas en el caso de C a través de la predicción genética de variantes de corte y empalme alternativas basadas en datos de marcadores de secuencia expresadas (EST)) varían de la isoforma A debido a la presencia de una adición de 7 aminoácidos cerca del dominio 2 de unión a nucleótido y una eliminación de 47 aminoácidos que incluyen el dominio transmembrana once, respectivamente. No hay confirmación experimental de la existencia natural de la isoforma C (entrada de UniProt P21439).

Solo la isoforma MDR3-A con codones optimizados es compatible con la producción eficaz del VAA

Con datos que muestran solo la isoforma A localizada en la membrana de las células Huh7 cuando se expresa a partir de un plásmido transfectado transitoriamente, los vectores de VAA se basan en la variante artificial Anc80 (Zinn E. et al., Cell Rep.; 2015, 12(6):1056-68) que codifican la variante de tipo silvestre (MDR3-Ats) o la transgénica con codones optimizados (MDR3-Aco) de la isoforma A de MDR3. El proceso de producción de vectores de VAA más convencional se basa en la transfección transitoria de células HEK293 con un conjunto de 2 o 3 plásmidos que proporcionan todas las funciones necesarias para la amplificación del genoma del vector, la producción de la cápside y el ensamblaje de las partículas víricas. Uno de estos plásmidos contiene el transgén flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) del VAA y debe producirse en cantidades suficientes para permitir la producción del vector. Se generaron plásmidos de VAA que contenían las secuencias MDR3-Ats y MDR3-Aco cadena abajo del promotor A1AT. Inesperadamente, los inventores encontraron problemas en el cultivo de bacterias que albergaban el plásmido de VAA MDR3-Ats, tales como un ritmo de crecimiento bacteriano reducido y mayores instancias de recombinación, como se ve en los análisis de digestión anormal con enzimas de restricción del ADN del plásmido aislado. Estos problemas se solucionaron parcialmente en la producción de plásmidos mediante la reducción de la temperatura de crecimiento a 30 °C, pero los contaminantes de ADN de plásmidos recombinados/impuros siguen sin resolverse. En cambio, el plásmido de VAA que contenía la secuencia MDR3-Aco era mucho más estable y podía producirse sin ninguno de los problemas técnicos anteriores.

Los vectores de VAA se produjeron con los plásmidos de MDR3 mediante transfección transitoria de células HEK293. En resumen, para producir partículas víricas VAAAnc80, se transfectaron conjuntamente treinta matraces de 150 cm2 que contenían monocapas de células HEK293T confluentes con plásmidos auxiliares póF6, pAAP2, pKAnc80L65 (Zinn E. et al., Cell Report; 2015, 12(6):1056-68) y el plásmido de VAA elegido que contenía la secuencia del vector a empaquetar (VAA-MDR3-Aco o VAA-MDR3-Ats) con polietilenimina (PEI). Después de 72 h de incubación, las partículas de VAA se purificaron del sobrenadante y las células mediante ultracentrifugación usando un gradiente de yodixanol como se describe en Vanrell L. et al., Mol Ther. 2011; 19(7): 1245-53. Finalmente, el virus purificado se concentró utilizando Amicon Ultra Centrifugal Filters-Ultracel 100K (Millipore) y se valoró mediante PCR cuantitativa utilizando oligonucleótidos específicos para el promotor A1AT (cebador directo: 5-TTGCTCCTCCGATAACTGGG-3' (SEQ ID NO: 9); Cebador inverso: 5'-CCCTGTCCTCGTCCGTATTT-3') (SEQ ID NO: 10). Las partículas víricas VAA8 se produjeron de la misma manera, pero usando pDP8 (PlasmidFactory, Alemania) como un único plásmido auxiliar. Las partículas víricas VAAAnc80-MDR3-Aco se produjeron de manera rutinaria en cantidades y concentraciones compatibles con estudios in vivo (Tabla 1) con valor título promedio de 4,6 x 1012 genomas víricos (GV)/ml. Sorprendentemente, 4 de 5 intentos de producir los vectores VAAAnc80 con la isoforma MDR3-Ats no lograron un rendimiento significativo (4 de 5 tenían valores inferiores a 5 x 1011 GV/ml, que eran demasiado bajos para aplicación in vivo). Esto indicó una característica intrínseca inesperada de la secuencia de codificación de la isoforma MDR3-Ats no solo cuando se transporta como un plásmido, como se ha observado anteriormente, pero también en el contexto de una partícula VAA. Se estimó que la producción de vectores VAA que albergan la versión MDR3-Ats necesitaría una resolución de problemas sustancial y/o una mayor cantidad de tiempo, recursos y materiales que la producción del MDR3-Aco con codones optimizados. Por tanto, se seleccionó la isoforma MDR3-Aco para un mayor desarrollo.

T l 1: R n imi n r i n vir VAA

Prueba in vivo de la expresión hepática de variantes de MDR3 TS y CO mediante inyección hidrodinámica (transfección de ADN plasmídico)

El modelo de ratón transgénico FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J (Abcb4^-/-) es homocigoto inactivado para el gen ABCB4 (Smit J. J. et al., Cell. 1993;75(3):451-62). La expresión in vivo de MDR3 se analizó en estos ratones después de la administración de plásmidos que contenían las variantes transgénicas de MDR3 mediante inyección hidrodinámica (IHD). Se inyectaron en la vena de la cola de ratones Abcb4^-/- macho de siete semanas de edad 25 μg del plásmido pVAA-MDR3 en un volumen total de 2,4 ml en menos de 5 segundos. Se probaron plásmidos con las isoformas de MDR3 Aco, Ats, Cco y Cts. Los animales se sacrificaron 24 h más tarde y los hígados se recogieron y se tiñeron para determinar la expresión de MDR3 mediante inmunohistoquímica (IHC). Ambos ratones inoculados con pVAA-MDR3-Aco mostraron expresión de MDR3. En particular, un ratón mostró expresión de MDR3 en cavidades discretas en todo el tejido hepático (Figura 3) con MDR3 claramente ubicado en la membrana canalicular de los hepatocitos. En cambio, la IHD con pVAA-MDR3-Ats dio como resultado que solo un animal mostrara expresión de MDR3 que podía detectarse alrededor de una sola célula en toda la muestra (Figura 3). Estos resultados sugieren que la secuencia MDR3-Aco se puede expresar de manera mucho más eficaz in vivo en comparación con MDR3-Ats. Finalmente, ni pVAA-MDR3-Cco ni pVAA-MDR3-Cts mostraron tinción positiva para MDR3 (datos no mostrados).

Prueba de vectores de VAA que albergan el transgén MDR3 en un modelo de ratón para la PFIC3

Se ha demostrado que el modelo de ratón Abcb4^-/- inactivado replica de manera fiable varios marcadores asociados con la PFIC3, tales como los niveles de transaminasa hepática sérica elevada, fosfatasa alcalina, sales biliares y bilirrubina; aumento del tamaño del hígado y el bazo; disminución de la concentración de fosfatidilcolina en la bilis; y anomalías morfológicas graves en el hígado, tales como la fibrosis, depósitos de colágeno e infiltrados celulares. El inicio de los síntomas en estos ratones aparece antes de las 4 semanas de edad. Los inventores probaron inicialmente si estos ratones eran susceptibles a la infección por VAA usando un vector VAA basado en la variante Anc80 que albergaba el transgén para un indicador de proteína verde fluorescente (PVF).

Se sacrificaron los ratones (de 3 o 4 semanas de edad) inoculados con 5 × 1012 GV/kg de peso corporal una semana más tarde, y las muestras de hígado se procesaron para cuantificar las copias del genoma del vector de VAA y las copias de ARNm de PVF mediante qPCR y RT-qPCR, respectivamente. Ni los ratones Abcb4'/_ de 3 ni los 4 semanas de edad se transducieron con el vector Anc80 a niveles significativos en comparación con los ratones TS inoculados a las mismas edades (datos no mostrados).

A continuación, a los ratones Abcb4'/' de 2 o 3 semanas de edad se les inyectó el vector VAAAnc80 que albergaba el transgén de MDR3-Aco en tres dosis diferentes (5 * 1012, 1,5 * 1013 y 5 * 1013 GV/kg). Los ratones tratados a las 3 semanas de edad y sacrificados 2 semanas después solo mostraron una mejora mínima en los síntomas de la PFIC3 (niveles de biomarcadores séricos, y tamaño del bazo y el hígado) en los machos con la dosis de 5 * 1013 (datos no mostrados), mientras que se observó un ligero aumento en la concentración de FC biliar tanto en machos como en hembras que recibieron la dosis más alta de VAA (p = 0,057 frente a ratones Abcb4'/_ tratados con solución salina) (Figura 4).

Sin embargo, los ratones tratados a las dos semanas de edad con VAAAnc80-MDR3-Aco a 5 * 1013 GV/kg mostraron marcadas mejoras en los biomarcadores séricos hasta 3 semanas después del tratamiento (Figura 5). Cuando estos ratones se sacrificaron 3 semanas después del tratamiento, se observó una reversión hacia las características de tipo silvestre en el peso del hígado y el bazo y la histología del hígado (Figuras 6 y 7). Sin embargo, los ratones tratados con una dosis 3 veces menor (1,5 * 1013 GV/kg) mostraron poca o ninguna mejora con respecto a los ratones ABCB4' /_ tratados con solución salina de control negativo. La concentración de FC en la bilis también aumentó significativamente en los ratones tratados con la dosis más elevadas (Figura 8).

Los vectores de serotipo 8 de VAA logran una respuesta terapéutica sostenida en ratones con PFIC3.

El vector VAA del serotipo 8 que alberga el transgén de MDR3-Aco se generó y probó en ratones Abcb4'/\ El vector VAA8-MDR3-Aco se administró a ratones a las dos semanas de edad con dosis de 1,5 * 1013 o 5 * 1013 GV/kg. Tan pronto como 1 a 2 semanas después del tratamiento, los niveles de los biomarcadores en suero (alanina transaminasa (ALT), fosfatasa alcalina (FA), aspartato transaminasa (AST), sales biliares (SB) y bilirrubina) de los ratones tratados con la dosis más elevada revirtieron claramente desde los niveles mostrados en los animales enfermos hasta los niveles de los animales de tipo silvestre (Figura 9). Se observó una reversión hacia las características de tipo silvestre en el peso del hígado y el bazo, y en la histología del hígado (Figura 10). Esta reversión de la enfermedad hepática se mantuvo durante toda la duración del estudio (hasta 12 semanas después del tratamiento). Por otro lado, los niveles de biomarcadores de los ratones tratados con dosis más bajas no variaron de los de los ratones Abcb4'/' tratados con solución salina.

Expresión de MDR3 lograda en niveles elevados en ratones con PFIC3 tratados con VAA8-MDR3-Aco.

La expresión de MDR3 se analizó mediante inmunohistoquímica (IHC) con un anticuerpo anti-MDR3 humana en hígados de ratones Abcb4^-/- tratados con VAA8-MDR3-Aco a 5 * 1013 GV/kg. Se detectó una expresión sustancial de MDR3 en hígados con una clara localización de la proteína en las membranas canaliculares de los hepatocitos (Figura 11), que fue comparable con el patrón y la intensidad de expresión observados en ratones de tipo silvestre (estos ratones teñidos en las mismas condiciones proporcionaron un comparador ya que el péptido sintético para generar el anti-hMDR3 tenía una identidad de secuencia del 100 % con la secuencia de la versión de ratón de MDR3). Los animales de control tratados con solución salina no mostraron expresión de MDR3 como se esperaba.

El tratamiento con VAA8-MDR3 en ratones con PFIC3 muestra una respuesta a la dosis.

Los ratones Abcb4^-/- se trataron con cinco dosis diferentes de VAA8-MDR3 (5 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 4 * 1013, y 8 * 1013 GV/kg). Después de 3 semanas después del tratamiento, se observa una clara respuesta relacionada con la dosis para los niveles de los biomarcadores séricos (Figura 12).

Los vectores de VAA de serotipo 8 logran una respuesta terapéutica sostenida en ratones con PFIC3 de 5 semanas de edad.

El vector VAA8-MDR3-Aco se administró a ratones Abcb4^-/- de 5 semanas de edad a 1 * 1014 GV/kg. A lo largo de un seguimiento de 12 semanas, los niveles de los biomarcadores revirtieron del estado de enfermedad a los niveles observados en animales de tipo silvestre (Figura 13), como se observó cuando se trataron a las 2 semanas de edad.

El efecto fue más coherente en los machos que en las hembras. A las 17 semanas de edad, los ratones se sacrificaron y los ratones tratados con VAA8-MDR3-Aco mostraron una evidencia claramente reducida de la enfermedad PFIC3, incluido un tamaño reducido del hígado y el bazo (Figura 14 a y b), FC biliar aumentada (Figura 14c) y fibrosis hepática reducida (Figura 14d). La expresión de la proteína MDR3 se midió mediante tinción con inmunohistoquímica usando un anticuerpo específico para MDR3. Los niveles de expresión fueron del 66 % de los niveles de tipo silvestre en machos y del 31 % en hembras (Figura 14e). La FC biliar se restauró al 54 % y al 25 % de los niveles de tipo silvestre en machos y hembras, respectivamente.

En conclusión, los inventores han descubierto que una versión con codones optimizados de la isoforma A de MDR3 es el mejor candidato para desarrollar un vector de terapia génica para tratar potencialmente a pacientes con PFIC3. Solo se encontró que la isoforma A se localizaba en la membrana celular cuando se probó la expresión mediante transfección de ADN en una estirpe celular hepática humana in vitro. Sorprendentemente, solo la MDR3-A con codones optimizados mostró una expresión in vivo eficaz cuando se administra como ADN no marcado.

Cuando se inicia la producción de vectores de VAA (Anc80 y VAA8) que albergan el transgén de MDR3-A, solo la versión con codones optimizados era viable para la producción de vectores con el rendimiento convencional esperado.

A partir de las pruebas de estos vectores de VAA que albergan el transgén de MDR3-Aco en un modelo de ratón Abcb4^-/- KO, los ratones tratados de 2 semanas de edad mostraron niveles elevados de expresión de MDR3 con localización en las membranas canaliculares de los hepatocitos y una restauración significativa de los niveles de los biomarcadores, logrando un efecto terapéutico. En estudios que utilizaron el serotipo ancestral Anc80, el tratamiento con el vector a 5 * 1013 GV/kg logró la reversión de los niveles del biomarcador sérico PFIC3 (hasta 3 semanas después del tratamiento), disminución del tamaño del hígado y el bazo, aumento de la FC biliar y una corrección de las anomalías de la morfología hepática observadas en ratones colestásicos. A 5 * 1013 GV/kg de VAA8-MDR3-Aco, los niveles de los biomarcadores séricos indicativos de la enfermedad PFIC3 se revirtieron a los niveles normales observados en animales de tipo silvestre hasta 3 meses después del tratamiento. Por otra parte, en el tamaño del hígado y el bazo, la FC biliar y la morfología del hígado, estos ratones tratados con VAA8-MDR3-Aco también demostraron una marcada mejora en las características de PFIC33 meses después de haber sido tratados.

Secuencias para su uso en la práctica de la invención

Las secuencias para su uso en la práctica de la invención se describen a continuación:

Secuencia con codones optimizados que codifica la isoforma A de MDR3 (co-MDR3(A)): (SEQ ID NO: 1)

Secuencia con codones optimizados que codifica la isoforma A de MDR3 (co-MDR3(A)-2) (SEQ ID NO: 2)

Secuencia poli A sintética (SEQ ID NO: 3)

VAAr-MDR3-Aco 1 (SEQ ID NO: 4)

VAAr-MDR3-Aco 2 (SEQ ID NO: 5)

Promotor de alfa 1 antitripsina (SEQ ID NO: 6)

Promotor del gen de la bomba de exportación de sal biliar mínima humana (ABCB11) (SEQ ID NO: 7)

Promotor del gen de la bomba de exportación de sal biliar mínima de ratón (ABCB11) (SEQ ID NO: 8)

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende un transgén que codifica la isoforma A de MDR3, teniendo dicho transgén la secuencia SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

2. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende además un promotor específico del hígado, preferentemente un promotor a-1-antitripsina o un promotor inducible por sales biliares.

3. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2 que comprende además una secuencia señal de poliadenilación, en particular, una secuencia señal de poliadenilación sintética de secuencia SEQ ID NO: 3.

4. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende además una secuencia 5'ITR y una 3'ITR, preferentemente una secuencia 5'ITR y una 3'ITR de un virus adenoasociado, más preferentemente una secuencia 5'ITR y una 3'ITR del serotipo VAA2.

5. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 4 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

6. Un vector de expresión que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El vector de expresión de la reivindicación 6 en donde dicho vector es un vector vírico, preferentemente un vector vírico adenoasociado (VAA).

8. Una partícula vírica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de expresión de la reivindicación 6 o 7.

9. Una partícula de VAA que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un vector de expresión de la reivindicación 6 o 7 y que comprende preferentemente proteínas de la cápside de virus adenoasociados, tales como proteínas de la cápside seleccionadas del grupo que consiste en: VAA3 de tipo 3A, VAA3 de tipo 3B, NP40, NP59, NP84, LK03, VAA3-ST, Anc80 y serotipo VAA8.

10. Una célula hospedadora aislada que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un vector de expresión de las reivindicaciones 6 o 7, o una célula hospedadora aislada transducida con una partícula vírica de la reivindicación 8 o 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un vector de la reivindicación 6 o 7, una partícula vírica de la reivindicación 8 o 9, o una célula hospedadora de la reivindicación 10 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un vector de la reivindicación 6 o 7, una partícula vírica de la reivindicación 8 o 9, una célula hospedadora de la reivindicación 10 o una composición farmacéutica de la reivindicación 11 para su uso como medicamento en un sujeto que lo necesite.

13. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un vector de la reivindicación 6 o 7, una partícula vírica de la reivindicación 8 o 9, una célula hospedadora de la reivindicación 10 o una composición farmacéutica de la reivindicación 11 para su uso para la prevención y/o tratamiento de la colestasis intrahepática familiar progresiva de tipo 3 (PFIC3) en un sujeto que lo necesite, preferentemente dicho sujeto es un recién nacido, un lactante, un niño o un adulto, más preferentemente un recién nacido, un lactante o un niño, más preferentemente un recién nacido o un lactante.

14. Un método para producir partículas víricas de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10 en un medio de cultivo, y

b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.

15. Un kit que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un vector de la reivindicación 6 o 7, una partícula vírica de la reivindicación 8 o 9, una célula hospedadora de la reivindicación 10 o una composición farmacéutica de la reivindicación 11, en uno o más recipientes, opcionalmente que comprende además instrucciones o materiales de embalaje.