CN113038970A - 用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(pfic3)的密码子优化的转基因 - Google Patents
用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(pfic3)的密码子优化的转基因 Download PDFInfo
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Abstract
本公开涉及用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型的基因治疗载体。更具体地，本发明涉及腺相关病毒载体，其包含编码用于治疗PFIC3的MDR3亚型A的密码子优化序列。
Description
技术领域
本公开涉及用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型的基因治疗载体。更具体地，本发明涉及腺相关病毒载体，其包含编码用于治疗PFIC3的MDR3亚型A的密码子优化序列。
背景技术
进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)是一种与三磷酸腺苷结合盒，亚家族B，4(ABCB4)基因突变相关的遗传疾病，该基因编码多药抗性蛋白3(MDR3)(Jacquemin E.ClinRes Hepatol Gastroenterol.2012；36 Suppl 1:S26-35)。该蛋白主要在肝细胞的小管膜中表达，是一种磷脂酶，参与磷脂酰胆碱从肝细胞膜向胆汁的转运。磷脂酰胆碱是通过产生混合胶束来中和胆盐的毒性所需的。ABCB4基因中的突变阻止适当的胶束形成，引起胆小管和胆道上皮损伤，从而导致胆汁淤积(Jacquemin E.et al.Gastroenterology.2001；120:1448-1458)。
目前尚无治愈PFIC3的方法，因此未满足的医疗需求非常高。尽管熊去氧胆酸(UDCA)疗法可能会改善某些患者的症状，但除肝移植以外，目前尚无治愈PFIC3的方法。胆道改道形式的手术干预改善患者的预后。但是，诸如感染和造口袋问题的术后并发症影响患者的生活质量，而肝硬化和肝癌的风险仍然存在。肝移植是一种有效治疗，但伴随着该复杂过程带来的风险以及病情复发的可能(van der Woerd WL et al.World Jgastroenterol.2017；23(5):763-775)。
纠正导致疾病发展的缺陷基因的基因疗法是用于多种疾病的有前景的治疗疗法。但是，该技术仍在研究中。WO2015/139093中公开了ABCB4在肝细胞中稳定整合和表达以治疗或预防PFIC3。但是，这些整合载体系统存在的主要缺点是其潜在的引起插入诱变的风险。仅WO2017/100551中提出了使用包括ABCB4在内的各种潜在治疗基因来治疗肝脏疾病(诸如进行性家族性肝内胆汁淤积症3(PFIC3))的RNA疗法。因此，仍然需要开发避免插入诱变并同时允许稳定且长期的转基因表达的基因治疗方法。本文描述了使用编码MDR3亚型A的密码子优化序列的PFIC3基因疗法，其可在胆汁淤积性肝中成功高表达，从而逆转引起患病患者胆汁中毒性的原因。
发明简述
令人惊讶地，发明人发现与野生型MDR3亚型A相反，当在体内施用时，MDR3亚型A的密码子优化序列显示了在肝细胞的小管膜中的特异性有效表达。在重现大多数PFIC3症状的Abcb4-/-敲除小鼠中，施用编码密码子优化版本的MDR3亚型A的AAV达到长期治疗效果，诸如PFIC3血清生物标志物水平的显著恢复，肝脏和脾脏大小的减少，胆汁磷脂酰胆碱的增加以及肝脏形态异常的纠正。
因此，本公开的第一方面涉及核酸构建体，其包含编码MDR3亚型A的转基因，所述转基因由序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的序列表示。
在特定实施方案中，所述核酸构建体进一步包含在引入宿主细胞后启动转基因表达的启动子，优选肝特异性启动子，更优选α-1-抗胰蛋白酶启动子或胆盐诱导型启动子。在特定实施方案中，所述载体还包含聚腺苷酸化信号序列，例如具有序列SEQ ID NO:3的合成聚腺苷酸化信号序列。
在特定实施方案中，所述核酸构建体进一步包含5’ITR和3’ITR序列，优选腺相关病毒(AAV)的5’ITR和3’ITR序列，特别是来自AAV2血清型的5’ITR和3’ITR序列。
在更特定的实施方案中，所述核酸构建体包含核酸序列SEQ ID NO:4或与SEQ IDNO:4具有至少90％同一性的核酸序列，或由其组成。
在另一方面，所述核酸构建体包含在表达载体中，优选在病毒载体中，更优选在AAV载体中。
本公开的另一方面涉及病毒颗粒，其包含本发明的核酸构建体或表达载体，且优选包含腺相关病毒的衣壳蛋白，诸如选自下组的衣壳蛋白：AAV3 3A型、AAV3 3B型、NP40、NP59、NP84、LK03、AAV3-ST、Anc80和AAV8血清型。
本公开的另一方面涉及宿主细胞，其包含本发明的核酸构建体或表达载体，或宿主细胞，其用本发明的病毒颗粒转导。
本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的核酸构建体、表达载体、宿主细胞或病毒颗粒，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体，任选包含其他活性成分。
本发明还涉及本发明的产品，其用作药物，诸如在有需要的受试者中预防和/或治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型。在特定实施方案中，所述受试者是新生儿、婴儿、儿童或成人，优选新生儿、婴儿或儿童，更优选新生儿或婴儿。
本文还公开了用于制备如上所述的病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：a)在培养基中培养如上所述的宿主细胞，和b)从细胞培养上清液和/或在细胞内收获病毒颗粒。
本公开还涉及试剂盒，其在一个或多个容器中包含如上所述的核酸构建体、表达载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物，任选地其还包含说明书或包装材料。
附图说明
图1：用表达所示人MDR3亚型质粒转染的Huh7细胞的免疫荧光显微镜图像。Wt：野生型序列，co：密码子优化的序列。细胞核用DAPI染色。
图2：用表达所示人MDR3亚型的质粒转染的Huh7细胞的共聚焦显微镜图像。对于亚型Bwt、Bco、Cwt和Cco，正交投影显示MDR3的细胞质定位。wt：野生型序列，co：密码子优化的序列。细胞核用DAPI染色。
图3：通过HDI(裸DNA转移)注射pAAV-MDR3质粒的小鼠肝脏切片中MDR3的表达。显示了注射MDR3亚型Aco的一只小鼠的三张图像(左图)，以及注射MDR3亚型Awt的两只小鼠的图像(右图)。
图4：用AAVAnc80-MDR3-Aco载体处理的3周龄Abcb4-/-小鼠的胆汁PC浓度。AAV剂量显示在x轴下方。雄性(M)是实心符号，雌性(F)是空心符号。
图5：AAVAnc80-MDR3-Aco治疗的Abcb4-/-小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和胆盐(BS)水平。雄性用实心符号表示，雌性用空心符号表示。在处理后5天、1周、2周和3周采集样本。天，天数；WT，Abcb4+/+小鼠；KO，Abcb4–/–小鼠。
图6：与未经处理的Abcb4–/–(正方形)或野生型(wt)小鼠(三角形)相比，在2周龄时用AAVAnc80-MDR3-Aco处理并在3周后处死的Abcb4–/–小鼠(KO)的脾脏和肝脏重量(占体重的百分比)。雄性(M)用实心符号表示，雌性(F)用空心符号表示。*,p<0.05；ns,不显著。
图7：在2周龄时用生理盐水(A&D)或1.5x1013的AAVAnc80-MDR3-Aco(B&E)或5x1013的AAVAnc80-MDR3-Aco(C&F)处理并在3周后处死的雄性Abcb4–/–小鼠(KO)的肝脏的SiriusRed(A-C)和Masson's Trichrome(D-F)染色。(G)通过ImageJ软件对Sirius Red染色阳性的面积百分比进行定量。*，p<0.05；ns，不显著。
图8：与未经处理的Abcb4–/–(正方形)或wt小鼠(三角形)相比，在2周龄时用AAVAnc80-MDR3-Aco处理并在3周后处死的Abcb4–/–小鼠(KO)的胆汁PC浓度。雄性(M)用实心符号表示，雌性(F)用空心符号表示。****，p<0.0001；ns，不显著。
图9：AAV8-MDR3-Aco处理的Abcb4–/–小鼠中的血清生物标志物。雄性(M)用实心符号表示，雌性(F)用空心符号表示。处理后的周数显示在x轴的正下方，每组的AAV剂量显示在下方。
图10：与未经处理的Abcb4–/–(KO)或野生型(wt)小鼠相比，用AAV8-MDR3-Aco处理并在12周后处死的Abcb4–/–小鼠(KO)的脾脏和肝脏重量(占体重的百分比)。雄性(M)用实心符号表示，雌性(F)用空心符号表示。***，p<0.001**，p<0.01，ns，不显著。
图11：用盐水(上)或5x1013 VG/kg的AAV8-MDR3-Aco(中)处理的Abcb4–/–小鼠的肝脏切片的抗MDR3抗体进行IHC染色，并在一周后收获。野生型小鼠(WT)肝脏切片染色作为比较和阳性对照(下)。
图12：用于Abcb4–/–小鼠中AAV8-MDR3-Aco剂量范围研究的血清生物标志物水平。在施用载体后1至10周对所示的血清标志物进行分析。雄性(M)用实心符号表示，雌性(F)用空心符号表示。AAV剂量显示在x轴下方。
图13：A)在5周龄时经处理的Abcb4–/–小鼠的血清碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、B)天冬氨酸转氨酶(AST)和胆盐(BS)水平。野生型(WT)动物用灰色空白圆表示，盐水处理的Abcb4–/–小鼠用黑色正方形表示，AAV-MDR3-Aco处理的Abcb4–/–小鼠用黑色实心圆表示。图中左侧是雄性，且右侧是雌性。
图14：在5周龄时经处理的Abcb4–/–小鼠的肝脏(a)和脾脏(b)重量(占体重的百分比)、胆汁PC(c)、纤维化(d)和MDR3蛋白表达(e)。野生型(WT)动物用灰色菱形表示，盐水处理的Abcb4–/–小鼠用空心圆表示，AAV-MDR3-Aco处理的Abcb4–/–小鼠用黑色三角形表示。
发明详述
本发明涉及包含编码MDR3亚型A的密码子优化序列(NCBI参考序列：NP_000434.1)的转基因。ABCB4基因(又称MDR3基因)编码的膜相关蛋白是ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族成员。该基因编码一个完整的转运蛋白和以磷脂酰胆碱为底物的膜蛋白p-糖蛋白家族的成员，该蛋白可能参与磷脂从肝细胞向胆汁的转运。该基因的选择性剪接产生三种潜在的亚型，分别为A、B和C。
如本文所用，术语“转基因”是指编码基因产物的外源DNA或cDNA。基因产物可以是RNA、肽或蛋白质。除了基因产物的编码区之外，转基因可包括一个或多个元件或与之相关以促进或增强表达，诸如启动子、增强子、响应元件、报告元件、隔绝元件、聚腺苷酸化信号和/或其它功能元件。本发明的实施方案可利用任何已知的合适启动子、增强子、响应元件、报告元件、隔绝元件、聚腺苷酸化信号和/或其它功能元件。适合的元件和序列是本领域技术人员熟知的。
核酸构建体
更特别地，本发明涉及核酸构建体，其包含编码MDR3亚型A的转基因，所述转基因由序列SEQ ID NO:1或2或与序列ID NO:1或2具有至少90％同一性的序列表示。
术语“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换地用于指代由单体核苷酸组成或包含单体核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可以是DNA或RNA。核苷酸序列可以化学修饰或人工合成。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、吗啉核酸和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些序列中的每一个都通过分子骨架的变化与天然产生的DNA或RNA相区别。此外，还可以使用硫代磷酸核苷酸。其他脱氧核苷酸类似物包括可用于本发明核苷酸中的甲基磷酸酯、磷酰胺、二硫代磷酸酯、N3’P5’-磷酰胺和寡核苷酸硫代磷酸酯及其2’-O-烯丙基类似物和2’-O-甲基核糖核苷酸甲基磷酸酯。
本文所使用的术语“核酸构建体”是指通过使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。核酸构建体是一种核酸分子，可以是单链或双链的，其被修饰成包含核酸序列的片段，这些片段以一种在天然界中不存在的方式组合和并列。核酸构建体通常是“载体”，即用于将外源性产生的DNA导入宿主细胞的核酸分子。
如本文所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”是指两个多核苷酸序列的排列位置中匹配(相同的核酸残基)的数目。当序列比对时，通过比较序列来确定序列同一性，以便在最小化序列空位的同时最大化重叠和同一性。特别地，可以使用多个数学全局或局部比对算法中的任意一个来确定序列同一性，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选地使用全局对齐算法比对(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman and Wunsch,1970,JMol Biol.；48(3):443-53)，其在整个长度上最优地比对序列，而基本上不同长度的序列优选地使用局部比对算法比对(例如Smith和Waterman algorithm(Smith and Waterman,1981,J Theor Biol；91(2):379-80)或Altschul algorithm(Altschul SF et al.,1997,Nucleic Acids Res；25(17):3389-402.；Altschul SF et al.,2005,Bioinformatics；21(8):1451-6))。用于确定核酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可在internet网站上获得的可公开获得的计算机软件诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，％核酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数被设置为默认值，即Scoring matrix＝BLOSUM62，Gap open＝10，Gap extend＝0.5，Endgap penalty＝假，End gap open＝10以及End gap extend＝0.5。
如本文所用，所述核酸构建体包含编码根据本发明的MDR3亚型A的转基因和表达所述编码序列所需的一个或多个控制序列。一般而言，所述核酸构建体包含编码序列和在所述编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列，所述编码序列是表达所选基因产物所需的。因此，核酸构建体典型地包含启动子序列、编码序列和通常包含聚腺苷酸化位点和/或转录终止子的3’非翻译区。所述核酸构建体还包含其他的调控元件，例如增强子序列、促进在载体内插入DNA片段的多聚连接体序列和/或剪接信号序列。
在一个实施方案中，所述核酸构建体包含启动子。所述启动子在导入宿主细胞时启动转基因表达。如本文所用，术语“启动子”是指指导与其可操作连接的核酸的转录的调控元件。启动子可以调节可操作连接的核酸的转录速率和效率。启动子也可操作地连接到增强(“增强子”)或抑制(“抑制子”)核酸的启动子依赖性转录的其它调控元件。这些调控元件包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和活化剂蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接作用于调控来自启动子(包括例如衰减子、增强子，以及沉默子)的转录量的任何其他核苷酸序列。启动子位于与其可操作地连接的基因或编码序列的转录起始位点附近，在同一条链上和DNA序列的上游(朝向正义链的5’区)。启动子可以是大约100-1000个碱基对长。启动子中的位置相对于特定基因的转录起始位点被指定(即，上游位置是从-1开始倒数的负数，例如-100是上游100个碱基对的位置)。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指功能性关系中多核苷酸(或多肽)元件的连接。当一个核酸与另一个核酸序列建立起功能性关系时，其被“可操作地连接”。例如，如果启动子或转录调控序列影响编码序列的转录，其被可操作地连接至编码序列。可操作地连接意味着被连接的DNA序列典型地是连续的；在需要连接两个蛋白质编码区的地方，它们是连续的且在阅读框中。
在具体实施方案中，本发明的核酸构建体进一步包含可操作地连接到本发明转基因的肝特异性启动子。在本发明的上下文中，“肝特异性启动子”是比在身体的任何其他组织中更活跃的在肝脏中的启动子。典型地，肝特异性启动子的活性在肝脏中要比在其他组织中大很多。例如，该启动子的活性可至少为2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍(例如，由其在给定组织中驱动表达的能力与其在其他细胞或组织中驱动表达的能力相比而确定)。因此，肝特异性启动子允许与其相连的基因在肝脏中活性表达，并阻止其在其他细胞或组织中表达。
在一个实施方案中，肝特异性启动子包含α1抗胰蛋白酶基因启动子(AAT或A1AT)(SEQ ID NO:6)、胆盐诱导型启动子(SEQ ID NO:7或8)的核苷酸序列或嵌合启动子序列EalbPa1AT，其包含结合白蛋白基因增强子元件(Ealb)的α1抗胰蛋白酶基因启动子序列(AAT或Pa1AT)。所有这些启动子序列都具有肝特异性启动子的特性。
这些核酸构建体实施方案中的每一个还可包括聚腺苷酸化信号序列；包括或不包括其他可选的核苷酸元件。如本文所用，术语“聚腺苷酸化信号”或“poly(A)信号”是指基因的3’非翻译区(3’UTR)内的特定识别序列，其被转录成前体mRNA分子并引导基因转录的终止。Poly(A)信号是作为用于新形成的前体mRNA在其3’端的核内裂解的信号，以及作用于仅由腺嘌呤碱基组成(聚腺苷酸化过程；poly(A)尾巴)的RNA延伸的3’端的信号。Poly(A)尾巴对mRNA的核输出、翻译和稳定性具有重要意义。在本发明的上下文中，聚腺苷酸化信号是可在哺乳动物细胞中指导哺乳动物基因和/或病毒基因的聚腺苷酸化的识别序列。
Poly(A)信号典型地由以下组成：a)共有序列AAUAAA，该序列被证明是3’端切割和前信使RNA(pre mRNA)聚腺苷酸化以及促进下游转录终止所需要的，以及b)AAUAAA的上游和下游的其他元件，其控制AAUAAA作为poly(A)信号的利用效率。哺乳动物基因中的这些基序有相当大的可变性。
在一个实施方案中，任选地结合如上或如下所述的各个实施方案的一个或多个特征，本发明核酸构建体的聚腺苷酸化信号序列是哺乳动物基因或病毒基因的聚腺苷酸化信号序列。合适的聚腺苷酸化信号包括SV40早期聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、HSV胸苷激酶聚腺苷酸化信号、鱼精蛋白基因聚腺苷酸化信号、腺病毒5EIb聚腺苷酸化信号、生长激素聚腺苷酸化信号、PBGD聚腺苷酸化信号、设计在硅上的(合成的)聚腺苷酸化信号等。
在具体实施方案中，所述核酸构建体的聚腺苷酸化信号序列是基于兔β-珠蛋白基因的合成的poly(A)信号序列，更特别地，是具有序列SEQ ID NO:3的合成的poly(A)。
表达载体
本发明的核酸构建体可包含在表达载体中。如本文所用，术语“表达载体”是指用作转移遗传物质的载体的核酸分子，特别是在体外或体内将核酸递送到宿主细胞中的核酸分子。表达载体也指能够在与这种序列相容的宿主细胞或宿主生物体中影响基因(转基因)表达的核酸分子。表达载体典型地至少包括适合的转录调控序列和任选的3’-转录终止信号。还可存在影响表达所需的或有帮助的附加因子，诸如能够应答精确的诱导信号(内源性或嵌合转录因子)或特定于某些细胞、器官或组织的表达增强子元件。载体包括但不限于质粒、噬菌粒、黏粒、转座因子、病毒和人工染色体(例如YAC)。优选地，本发明的载体是适合于在基因或细胞治疗中使用的载体，并且特别适合于靶向肝细胞。
在一些实施方案中，表达载体是病毒载体，诸如衍生自莫洛尼小鼠白血病病毒载体(MoMLV)、MSCV、SFFV、MPSV或SNV的载体；慢病毒载体(例如衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)或马传染性贫血病毒(EIAV))；腺病毒(Ad)载体；腺相关病毒(AAV)载体；猴病毒40(SV-40)载体；牛乳头状瘤病毒载体，Epstein-Barr病毒；疱疹病毒载体；痘苗病毒载体；哈维小鼠肉瘤病毒载体；小鼠乳腺肿瘤病毒载体；Rous肉瘤病毒载体。
如本领域所知，取决于考虑使用的特定病毒载体，应在本发明载体中引入适合的序列以获得功能性病毒载体，诸如用于AAV载体的AAV ITR或用于慢病毒载体的LTR。在具体实施方案中，所述载体是AAV载体。
AAV作为一种潜在的人类基因治疗载体引起了广泛的关注。病毒的有利特性之一是其与任何人类疾病都没有关联，其能够感染分裂和不分裂的细胞，以及衍生自可被感染的不同组织的广泛细胞系。AAV基因组由含有4681个碱基的、线性的单链DNA分子组成(Berns和Bohenzky,1987,Advances in Virus Research(Academic Press,Inc.)32:243-307)。基因组的每一端都有反向末端重复序列(ITR)，其以顺式作为DNA复制的起点并作为用于病毒的包装信号。ITR的长度约为145bp。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，分别为AAV rep和cap基因。这些基因编码与病毒子复制和包装有关的病毒蛋白。特别地，从AAV rep基因合成至少四种病毒蛋白质，rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，根据它们的表观分子量命名。AAV cap基因编码至少三种蛋白质VP1、VP2和VP3。对于AAV基因组的细节描述，见例如，Muzyczka,N.1992 Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129。
因此，在一个实施方案中，包含本发明转基因的核酸构建体或表达载体进一步包含5’ITR和3’ITR序列，优选腺相关病毒的5’ITR和3’ITR序列。
如本文所用，术语“反向末端重复(ITR)”是指位于病毒的5’末端(5’ITR)的核苷酸序列和位于病毒的3’末端(3’ITR)的核苷酸序列，其包含回文序列，且可折叠形成T形发夹结构，该T形发夹结构在DNA复制起始时起到引物的作用。它们也是病毒基因组整合到宿主基因组中所需要的；为了从宿主基因组拯救；以及将病毒核酸包埋至成熟的病毒粒子。ITR是以顺式(in cis)在载体基因组复制和包装至病毒颗粒中所需的。
用于本发明载体中的AAV-ITR可具有野生型核苷酸序列或可通过插入、缺失或替换而改变。AAV载体的反向末端重复序列(ITR)的血清型可选自任何已知的人类或非人类AAV血清型。在特定实施方案中，表达病毒载体可通过使用任何AAV血清型的ITR来进行，包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、羊AAV，以及现在已知或未来发现的任何其他AAV血清型。
在一个实施方案中，核酸构建体进一步包含血清型AAV2的AAV的5’ITR和3’ITR。
在具体实施方案中，本发明的核酸构建体包含SEQ ID NO:4或5或与SEQ ID NO:4或5具有至少90％同一性的序列，或由其组成。
在一个实施方案中，根据本发明的核酸构建体或AAV载体基因组包含在重组杆状病毒基因组中。如本文所用，术语“重组杆状病毒基因组”是指包含杆状病毒遗传元件的核酸，其用于在允许杆状病毒感染和复制的宿主细胞(典型地是昆虫细胞)中自主复制重组杆状病毒基因组。术语“重组杆状病毒基因组”明确包括包含与杆状病毒异源的核酸的基因组。同样地，术语“重组杆状病毒基因组”不一定指完整的杆状病毒基因组，因为基因组可能缺少对于完成感染周期不必要的病毒序列。特别地，重组杆状病毒基因组可包括用于rAAV产生的异源AAV基因和/或诸如包封在rAAV中的密码子优化的MDR3亚型A的转基因，以用于基因治疗。用于本公开的杆状病毒遗传元件优选地从AcMNPV杆状病毒(Autographacalifornica多粒包埋型核多角体病毒)获得。
在具体实施方案中，所述第一和第二杆状病毒基因组中编码杆状病毒组织蛋白酶和几丁质酶的基因被破坏或删除。特别地，AcMNPV杆状病毒的基因v-cath(Ac127)和chiA(Ac126)可被破坏或删除，使得相应的组织蛋白酶或几丁质酶不被表达或以非活性形式被表达(即没有酶促组织蛋白酶或几丁质酶活性)。在具体实施方案中，至少对于p24基因(Ac129)、优选地对于三种杆状病毒基因p10(Ac137)、p24和p26(Ac136)，进一步破坏或删除所述重组杆状病毒基因组。在具体实施方案中，所述重组杆状病毒基因组包括功能性p74杆状病毒基因(Ac138)(即所述基因已被删除或被破坏)。
另一方面，本发明的核酸构建体或表达载体可通过使用合成的5’ITR和/或3’ITR，也可以使用来自不同血清型病毒的5’ITR和3’ITR来实现。病毒载体复制所需的所有其他病毒基因可如下所述，在病毒产生细胞(包装细胞)内以反式(in trans)提供。因此，它们包含在病毒载体中是任选的。
在一个实施方案中，本发明的核酸构建体或病毒载体包含病毒的5’ITR、ψ包装信号，和3’ITR。“ψ包装信号”是病毒基因组的顺式作用核苷酸序列，在某些病毒(例如腺病毒、慢病毒……)中，其对在复制中将病毒基因组包装到病毒衣壳中的过程是必要的。
重组AAV病毒颗粒的构建在本领域中是公知的，并且已经在例如以下中描述：US5,173,414和US5,139,941；WO 92/01070,WO 93/03769，Lebkowski et al.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent et al.(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Carter,B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129；和Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801。
病毒颗粒
可以将本发明的核酸构建体或表达载体包装到病毒衣壳中以得到“病毒颗粒”，也称为“病毒载体颗粒”。在具体实施方案中，将核酸构建体或表达载体包装到AAV衍生的衣壳中以得到“腺相关病毒颗粒”或“AAV颗粒”。本发明涉及一种病毒颗粒，其包含本发明的核酸构建体或表达载体，且优选地包含腺相关病毒的衣壳蛋白。
术语AAV载体颗粒涵盖任何重组AAV载体颗粒或基因工程化的突变体AAV载体颗粒。重组AAV颗粒可以通过将包含衍生自特定AAV血清型的ITR的核酸构建体或病毒表达载体衣壳化到由对应于相同或不同血清型的AAV的天然或突变Cap蛋白形成的病毒颗粒上来制备。
腺相关病毒的病毒衣壳蛋白包括衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。各种AAV血清型的衣壳蛋白序列之间的差异导致使用不同的细胞表面受体进入细胞。结合其他细胞内加工途径，对每种AAV血清型，引起不同的组织趋向性。已经发展了几种技术来修饰和改善天然产生的AAV病毒颗粒的结构和功能特性(Bünning H et al.J Gene Med,2008；10:717-733；Paulket al.Mol ther.2018；26(1):289-303；Wang L et al.Mol Ther.2015；23(12):1877-87；Vercauteren et al.Mol Ther.2016；24(6):1042-1049；Zinn E et al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)。
因此，在根据本公开的AAV病毒颗粒中，可以将包含给定AAV血清型的ITR的核酸构建体或病毒表达载体，例如，包装至：a)由衍生自相同或不同的AAV血清型的衣壳蛋白[例如AAV2 ITR和AAV5衣壳蛋白；AAV2 ITR和AAV8衣壳蛋白；AAV2 ITR和Anc80衣壳蛋白；AAV2ITR和AAV9衣壳蛋白]构成的病毒颗粒；b)由来自不同AAV血清型或突变体的衣壳蛋白混合物[例如AAV ITR和AAV1及AAV5衣壳蛋白]构成的镶嵌病毒颗粒；c)由通过在不同AAV血清型或变体之间进行结构域交换而被截短的衣壳蛋白[例如AAV2 ITR和具有AAV3结构域的AAV5衣壳蛋白]构成的嵌合病毒颗粒。
技术人员将理解，根据本公开使用的AAV病毒颗粒可包含来自任何AAV血清型的衣壳蛋白，包括AAV1、AAV2、AAV3(包括3A和3B型)、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV，合成的AAV变体(诸如NP40、NP59、NP84)(Paulk et al.Mol ther.2018.26(1):289-303)、LK03(Wang L et al.Mol Ther.2015.23(12):1877-87)、AAV3-ST(Vercauteren et al.Mol Ther.2016.24(6):1042-1049)、Anc80(Zinn E et al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)和任何现在已知的或此后发现的AAV血清型。
在特定实施方案中，AAV病毒颗粒包含来自选自下组的血清型的衣壳蛋白：AAV1、AAV3B、AAV5、AAV7、AAV8和AAV9，其更适合于递送至肝细胞的(Nathwani et al.Blood2007；109:1414–1421；Kitajima et al.Atherosclerosis 2006；186:65-73)。
在具体实施方案中，AAV病毒颗粒包含来自Anc80的衣壳蛋白，Anc80是病毒AAV血清型1、2、8和9的预测祖先，其可作为靶向肝、肌肉和视网膜的高效基因治疗载体(Zinn Eet al.,Cell Rep.2015；12(6):1056-68)。在更具体的实施方案中，病毒颗粒包含Anc80L65VP3衣壳蛋白(Genbank登录号：KT235804)。
因此，在另一方面，本发明涉及病毒颗粒，其包含本发明的核酸构建体或表达载体且优选地包含腺相关病毒的衣壳蛋白，诸如来自Anc80和AAV8血清型的衣壳蛋白，更优选AAV8血清型的衣壳蛋白。
在具体实施方案中，病毒颗粒包含在重组杆状病毒中包含的AAV载体基因组。因此，将包含AAV rep和cap的第二重组杆状病毒基因组用于产生AAV病毒颗粒。在具体实施方案中，rep和cap蛋白从不同的杆状病毒晚期启动子表达，优选以反向定向表达。在可与前述实施方案结合的特定实施方案中，第二杆状病毒基因组包括编码rep蛋白的异源核酸，例如，在杆状病毒多面体(PPh)启动子的转录控制下的来自AAV2的rep蛋白。在其他实施方案中，第二杆状病毒基因组包括在p10杆状病毒启动子的转录控制下的编码cap蛋白的异源核酸。用于在昆虫细胞中正确表达和/或增加VP和病毒体的产量或改变趋向性或降低病毒体抗原性的对野生型AAV序列的其他修饰也是本领域已知的。通过使用编码AAV血清型的repORF(开放阅读框)和不同血清型AAV的cap ORF的辅助杆状病毒构建体，将给定AAV血清型的ITR侧翼的载体包装至由不同血清型的结构衣壳蛋白组装而成的病毒体中是可行的。也可以通过相同的程序包装镶嵌的、嵌合的或靶向的载体。
病毒-聚糖相互作用是宿主细胞入侵的关键决定因素。在具体实施方案中，AAV病毒颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中所述取代将新的聚糖结合位点引入AAV衣壳蛋白中。在更具体的实施方案中，氨基酸取代是在AAV2中的氨基酸266，氨基酸463-475和氨基酸499-502或在AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或也包括Anc80和Anc80L65在内的任何其他AAV血清型中的相应氨基酸位置。
引入的新的聚糖结合位点可以是己糖结合位点[例如，半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)或岩藻糖(fuc)结合位点]；唾液酸(Sia)结合位点[例如Sia残基，诸如N-乙酰神经氨酸(NeuSAc)或N-羟乙酰神经氨酸(NeuSGc)]；或二糖结合位点，其中该二糖是连接至半乳糖的唾液酸，例如以Sia(α2,3)Gal或Sia(α2,6)Gal的形式。在国际专利公开WO2014144229和Shen等(J.Biol.Chem.2013；288(40):28814-28823)中给出了将新结合位点从AAV血清型引入另一种血清型的AAV的衣壳蛋白的详细指导。在具体实施方案中，将来自AAV9的Gal结合位点引入AAV2 VP3主链中，从而产生双聚糖结合的AAV菌株，该菌株能够使用HS和Gal受体两者进入细胞。优选地，所述双聚糖结合的AAV菌株是AAV2G9。Shen等通过直接取代参与的氨基酸残基并立即将AAV9VP3衣壳蛋白亚单元上的Gal识别位点调至AAV2VP3亚单元编码区的相应残基的侧翼，从而得到AAV2G9(AAV2 VP3编号Q464V、A467P、D469N、I470M、R471A、D472V、S474G、Y500F和S501A)。
在另一个实施方案中，根据本公开使用的病毒颗粒可以是腺病毒颗粒，诸如Ad5病毒颗粒。与AAV病毒颗粒一样，Ad病毒颗粒的衣壳蛋白也可以进行工程化，以改变它们的趋向性和细胞靶向特性，其他的腺病毒血清型也可以采用。
用于制备病毒载体的方法
可以通过常规方法和方案来制备携带如上所述的表达病毒载体的病毒颗粒，所述方法和方案的选择需考虑到为表达载体的实际实施方案和待生产的载体的病毒颗粒所选择的结构特征。
简而言之，病毒颗粒可以在宿主细胞，更特别地在特定的病毒产生细胞(包装细胞)中产生，该细胞在辅助载体或病毒或其他DNA构建体的存在下，用待包装的核酸构建体或表达载体转染。
如本文所用，术语“包装细胞”是指可以用本发明的核酸构建体或表达载体转染的细胞或细胞系，且以反式(in trans)提供了完整的复制和包装病毒载体所需的所有缺失功能。典型地，包装细胞以组成型或诱导型方式表达一种或多种所述缺失的病毒功能。所述包装细胞可以是黏附细胞或悬浮细胞。
典型地，制备病毒颗粒的方法包括以下步骤：
a)在培养基中培养包含如上所述的核酸构建体或表达载体的包装细胞；和
b)从细胞培养上清液和/或在细胞内收获病毒颗粒。
可以使用常规方法来制备AAV病毒颗粒的病毒颗粒，其包括与携带转基因的本发明核酸构建体或表达载体(例如质粒)；编码rep和cap基因但不携带ITR序列的核酸构建体(例如AAV辅助质粒)；以及具有提供AAV复制所必需的腺病毒功能的第三种核酸构建体(例如质粒)共转染的瞬时细胞。AAV复制所必需的病毒基因在本文中称为病毒辅助基因。典型地，所述AAV复制所必需的基因是腺病毒辅助基因，诸如E1A、E1B、E2a、E4或VA RNA。优选地，腺病毒辅助基因是Ad5或Ad2血清型。
根据本公开的AAV颗粒的大规模生产还可以通过例如用重组杆状病毒的组合感染昆虫细胞来进行(Urabe et al.Hum.Gene Ther.2002；13:1935-1943)。SF9细胞用分别表达AAV rep、AAV cap和待包装的AAV载体的两种或三种杆状病毒载体共感染。重组杆状病毒载体将提供病毒复制和/或包装所需的病毒辅助基因功能。Smith等2009(MolecularTherapy,vol.17,no.11,pp 1888-1896)进一步描述了用于在昆虫细胞中大规模制备AAV颗粒的双重杆状病毒表达系统。
适合的培养基是本领域技术人员熟知的。依据待培养的细胞的类型，组成此类培养基的成分可能会有所不同。除了营养成分外，渗透压和pH被认为是培养基的重要参数。细胞生长培养基包含本领域技术人员众所周知的多种成分，包括氨基酸、维生素、有机和无机盐、糖类来源、脂质、微量元素(CuSO4、FeSO4、Fe(NO3)3、ZnSO4……)，每种成分的存在量均能支持细胞的体外培养(即细胞的存活和生长)。该成分可能还包括不同的辅助物质，诸如缓冲物质(如碳酸氢钠、Hepes、Tris等)、氧化稳定剂、可抵抗机械应力的稳定剂、蛋白酶抑制剂、动物生长因子、植物水解物、抗结块剂、消泡剂。细胞生长培养基的特性和组成的不同取决于特定的细胞需求。商业上可用的细胞生长培养基的实例有：MEM(最小必需培养基)、BME(基础Eagle培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、Iscoves DMEM(Iscove改良Duscocco培养基)、GMEM、RPMI 1640、Leibovitz L-15、McCoy’s、Medium 199、Ham(Ham’s培养基)F10及其衍生物、Ham F12、DMEM/F12等。
根据本公开使用的病毒载体的构建和制备的进一步指导可在用于基因治疗的病毒载体、方法和方案中找到。系列：Methods in Molecular Biology,Vol.737.Merten andAl-Rubeai(Eds.)；2011Humana Press(Springer)；GeneTherapy.M.Giacca.2010Springer-Verlag；Heilbronn R.and Weger S.Viral Vectorsfor Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics.In:Drug Delivery,Handbook of Experimental Pharmacology 197；M.
(Ed.).2010Springer-Verlag；pp.143-170；Adeno-Associated Virus:Methods andProtocols.R.O.Snyder and P.Moulllier(Eds).2011 Humana Press(Springer)；BünningH.et al.Recent developments in adeno-associated virus technology.J.GeneMed.2008；10:717-733；Adenovirus:Methods and Protocols.M.Chillón and A.Bosch(Eds.)；Third Edition.2014 Humana Press(Springer)。
宿主细胞
在另一方面，本发明涉及宿主细胞，其包含本发明的核酸构建体或表达载体。更特别地，根据本发明的宿主细胞是特异性的病毒产生细胞，也称为包装细胞，其在辅助载体或病毒或其他DNA构建体存在下用本发明的核酸构建体或表达载体转染，并以反式提供了完整复制和包装病毒颗粒所需的所有缺少的功能。所述包装细胞可以是黏附细胞或悬浮细胞。
例如，所述包装细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，包括猿猴、人、狗和啮齿动物细胞。人细胞的实例是PER.C6细胞(WO01/38362)、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCCCCL-75)、HEK-293细胞(ATCC CRL-1573)、HeLa细胞(ATCC CCL2)和胎儿恒河猴肺细胞(ATCCCL-160)。非人的灵长类细胞的实例是Vero细胞(ATCC CCL81)、COS-1细胞(ATCC CRL-1650)或COS-7细胞(ATCC CRL-1651)。狗细胞的实例是MDCK细胞(ATCC CCL-34)。啮齿动物细胞的实例是仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或CHO细胞。
作为哺乳动物来源的替代，用于制备病毒颗粒的包装细胞可以衍生自禽类，诸如鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡。禽细胞系的实例包括禽胚胎干细胞(WO01/85938和WO03/076601)，永生化的鸭视网膜细胞(WO2005/042728)和禽胚胎干细胞衍生的细胞，包括鸡细胞(WO2006/108846)或鸭细胞，诸如EB66细胞系(WO2008/129058&WO2008/142124)。
在另一个实施方案中，细胞可以是杆状病毒感染和复制包装细胞所允许的任何细胞。在具体实施方案中，所述细胞是昆虫细胞，诸如SF9细胞(ATCC CRL-1711)、Sf21细胞(IPLB-Sf21)、MG1细胞(BTI-TN-MG1)或High FiveTM细胞(BTI-TN-5B1-4)。
因此，在具体实施方案中，任选地结合如上或如下所述的各种实施方案的一个或多个特征，宿主细胞包括：
-根据本发明的包含编码MDR3亚型A的转基因的核酸构建体或表达载体(例如，根据本发明的AAV载体)，
-核酸构建体，例如质粒，其编码不携带ITR序列的AAV rep和/或cap基因；和/或
-核酸构建体，例如质粒或病毒，其包含病毒辅助基因。
在另一方面，本发明涉及用本发明的病毒颗粒转导的宿主细胞，并且本文所用的术语“宿主细胞”是指易受目标病毒感染并适于体外培养的任何细胞系。
本发明的宿主细胞可用于离体基因治疗目的。在该实施方案中，用本发明的病毒颗粒转导细胞，随后将其移植到患者或受试者中。移植的细胞可以具有自体、异体或异源来源。对于临床用途，通常将在良好生产规范(GMP)条件下进行细胞分离。移植前，典型地检查细胞质量以及不存在微生物或其他污染物，并可以进行肝脏预处理，诸如进行放射和/或免疫抑制治疗。此外，可以将宿主细胞与生长因子一起移植以刺激细胞增殖和/或分化，诸如肝细胞生长因子(HGF)。
在具体实施方案中，该宿主细胞用于肝脏的离体基因治疗。优选地，所述细胞是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，这些细胞包括但不限于人类，非人类的灵长类动物，诸如猿、黑猩猩、猴和猩猩，驯养的动物，包括狗和猫，以及牲畜，诸如马、牛、猪、绵羊和山羊，或其他哺乳动物物种，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、仓鼠等。本领域技术人员将根据要移植的患者或受试者选择更合适的细胞。
所述宿主细胞可以是具有自我更新和多能性的细胞，诸如干细胞或诱导的多能干细胞。干细胞优选是间充质干细胞。间充质干细胞(MSC)能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞中的至少一种，且可从任何类型的组织中分离。通常，MSC将从骨髓、脂肪组织、脐带或外周血中分离。获得其的方法是本领域技术人员众所周知的。诱导多能干细胞(也称为iPS细胞或iPSC)是可以直接从成年细胞得到的一种多能干细胞。Yamanaka等通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转移到小鼠和人成纤维细胞中，并迫使细胞表达该基因，从而诱导iPS细胞(WO 2007/069666)。Thomson等随后使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc制备了人iPS细胞(WO 2008/118820)。
所述宿主细胞也可以是肝细胞。肝细胞移植程序，包括细胞分离和随后移植到人或小鼠受体中，已描述在例如Filippi and Dhawan，Ann NY Acad Sci.2014,1315 50-55；Yoshida et al.,Gastroenterology 1996,111:1654-1660；Irani et al.MolecularTherapy 2001,3:3,302-309；和Vogel et al.J Inherit Metab Dis 2014,37:165-176中。将病毒载体离体转导至肝细胞的方法已描述在例如Merle et al.,Scandinavian Journalof Gastroenterology 2006,41:8,974-982中。
药物组合物
本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒或宿主细胞，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指由监管机构或公认的药典(诸如欧洲药典)批准用于动物和/或人。术语“赋形剂”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、载体或媒介物。
任何适合的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂均可用于制备药物组合物(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April 1997)。药物组合物典型地在生产和储存条件下是无菌的和稳定的。药物组合物可以配制成溶液(例如盐、葡萄糖溶液或缓冲溶液，或其他药学上可接受的无菌液体)、微乳液、脂质体或其他适合容纳高产品浓度的有序结构(例如微粒或纳米颗粒)。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包膜，通过在分散的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、或氯化钠。
通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。本发明的产品可以以控释制剂的形式施用，例如以包含缓释聚合物或其他保护产品免于快速释放的载体的组合物的形式(包括植入物和微囊递送系统)施用。例如，可以使用可生物降解和生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLG)。优选地，将所述药物组合物配制成溶液，更优选配制成任选缓冲的盐溶液。补充的活性化合物也可加入至本发明的药物组合物中。例如，可以在Canadian Pharmacists Association的Compendium ofPharmaceutical and Specialties(CPS)中找到有关共同施用其他治疗剂的指引。
在一个实施方案中，药物组合物是肠胃外药物组合物，包括适合于静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内施用的组合物。这些药物组合物仅是示例性的，并不限制适合于其他肠胃外和非肠胃外施用途径的药物组合物。本文所述的药物组合物可以单一单位剂量或多剂量形式包装。
治疗用途
在另一方面，本发明涉及本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物，其在有需要的受试者中用作药物。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指哺乳动物。可以从所公开的治疗方法中受益的哺乳动物物种包括但不限于人类；非人类灵长类动物，诸如猿、黑猩猩、猴子和猩猩；驯养的动物，包括狗和猫；以及家畜，诸如马、牛、猪、绵羊和山羊；或其他哺乳动物物种，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、仓鼠等。在具体实施方案中，所述受试者是新生儿、婴儿或儿童，更特别是新生儿或婴儿。本文所用的“新生儿”是指少于28天的婴儿，且本文所用的“婴儿”是指29天至2岁的儿童。
在另一方面，本发明涉及本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物，其用于在有需要的受试者中治疗肝脏疾病，特别是家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”(treatment/treat/treating)是指旨在改善患者健康状况的任何行为，诸如治疗、阻止、预防和延缓疾病。在某些实施方案中，该术语是指改善或根除疾病或与疾病有关的症状。在其他实施方案中，该术语是指最小化由于向患有这种疾病的受试者施用一种或多种治疗剂而导致的疾病的扩散或恶化。
在具体实施方案中，肝脏疾病选自下组：妊娠肝内胆汁淤积症3型(ICP3)、胆固醇结石病、药物诱导的胆汁淤积症、短暂性新生儿胆汁淤积症、成人特发性肝硬化、胆管癌和家族性胆汁淤积症3型(PFIC3)。在更具体的实施方案中，所述肝脏疾病是家族性胆汁淤积症3型(PFIC3)。
在相关方面，本发明涉及本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗肝脏疾病，优选用于治疗家族性胆汁淤积症3型(PFIC3)的药物中的用途。
在另一方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗和/或预防肝脏疾病，优选家族性胆汁淤积症3型(PFIC3)的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物。
在本发明的上下文中，“有效量”是指治疗有效量。如本文所用，“治疗有效量”是指在达到期望的治疗结果所需的剂量和时间段的有效量，诸如血清中生物标志物水平的降低，诸如γ-谷氨酰转移酶(GGT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)，胆盐(BS)和胆红素，胆汁磷脂酰胆碱的或其他磷脂浓度的恢复。本发明产品或包含它的药物组合物的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该产品或药物组合物引起期望的个体反应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。治疗有效量也典型地是其中产品或药物组合物的任何毒性或有害作用都被治疗有益效果所抵消的量。
用本发明的产品进行的治疗可以减轻、改善或降低家族性胆汁淤积症(PFIC3)的一种或多种症状的严重程度。例如，治疗可以降低血清中生物标志物的水平，诸如γ-谷氨酰转移酶(GGT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)，胆盐(BS)和胆红素；或恢复胆汁磷脂酰胆碱的或其他磷脂浓度；且因此可减轻、改善或降低胆管炎、胆管增生、胆管纤维化、门脉高压、肝硬化、胃肠道出血、黄疸、胆汁淤积、瘙痒和肝衰竭的严重程度。
本发明的产品典型地将包含在药物组合物或药品中，任选地与药物载体、稀释剂和/或佐剂组合。该组合物或药物产品包括足以提供所需治疗效果的有效量的本发明产品，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施方案中，用于其治疗用途的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物通过肠胃外途径，特别是通过静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内途径施用于受试者或患者。
在一个实施方案中，用于其治疗用途的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物通过间质途径施用，即通过注射到或注射入组织间隙施用。组织靶标可以是特异性的，例如肝脏组织，或者可以是几种组织的组合，例如肌肉和肝脏组织。示例性的组织靶标可以包括肝、骨骼肌、心肌、脂肪沉积物、肾脏、肺、血管内皮、上皮和/或造血细胞。在优选实施方案中，通过肝内注射，即注射到肝组织的间隙空间中来施用。
施用于受试者或患者的本发明产品的量可根据个体受试者或患者的特定情况(包括个体的年龄、性别和体重)；疾病的性质和阶段，疾病的危害性；施用途径；和/或已向受试者或患者开出的伴随用药而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。
对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，随时间调整特定的剂量方案。本文阐述的剂量范围仅是示例性的，并不限制医生可以选择的剂量范围。
在一个实施方案中，可以将根据本发明的AAV病毒颗粒以5×1011-1×106vg/kg(vg：病毒基因组；kg：受试者或患者的体重)范围内的量或剂量施用于受试者或患者以治疗PFIC3疾病。在更具体的实施方案中，以在1×1013-1×1015vg/kg范围内的量施用AAV病毒颗粒。在更具体的实施方案中，以至少2×1013vg/kg，优选4.5×1013vg/kg，更优选5×1013vg/kg，和更优选8×1013vg/kg的剂量施用AAV病毒颗粒。
试剂盒
在另一方面，本发明进一步涉及试剂盒，其在一个或多个容器中包含本发明的核酸构建体、表达载体、宿主细胞、病毒颗粒或药物组合物。试剂盒可包括说明或包装材料，其描述了如何将试剂盒中包含的核酸构建体、表达载体、病毒颗粒、宿主细胞或药物组合物施用于患者。试剂盒的容器可以是任何适合的材料，例如玻璃、塑料、金属等，且可以是任何适合的尺寸、形状或构造。在某些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个安瓿瓶或注射器，其以适合的液体或溶液形式容纳本发明的产品。
通过举例的方式提供以下实施例，它们并不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖本文描述的具体和优选实施例的所有可能的组合。
具体实施方式
通过体外转染分析6种MDR3转基因变体
ABCB4基因编码多药耐药蛋白(MDR3)，一种位于肝细胞小管膜且负责调节胆汁中PC的浓度的磷脂酰胆碱(PC)转运蛋白。PC与胆汁酸形成混合胶束，可减少游离胆汁酸对组织的损伤和毒性。ABCB4中的突变可导致胆汁中PC缺乏，引起毒性，从而导致胆汁淤积。进行性家族性肝内胆汁淤积症3型是由此引起的疾病(Jacquemin,E.2012,Clin Res HepatolGastroenterol；36 Suppl 1:S26-35)。MDR3可能存在三种潜在的亚型，分别为A、B和C。在肝脏特异性α1-抗胰蛋白酶(A1AT)启动子的转录控制下，产生含有野生型(wt)或密码子优化(co)版本的人MDR3-A、-B或-C cDNA的质粒。将这些质粒瞬时转染到人肝细胞系Huh7中，以分析和比较六种变体的表达。转染48小时后，收集细胞，固定，用兔抗MDR3一抗和抗兔Alexa488二抗染色，并用免疫荧光和共聚焦显微镜观察。染色的MDR3表达阳性的细胞图像显示只有亚型A出现在细胞膜上。由于MDR3阳性细胞的连续平面显示出清晰的膜定位表达(图1和图2)，这在共焦显微镜下更为明显。值得注意的是，潜在亚型B和C的序列(在C的情况下，通过基于表达序列标签(EST)数据的交替剪接变体的基因预测来确定)与A亚型不同，这是由于分别在核苷酸结合域2附近存在7个氨基酸的添加和包括跨膜结构域11的47个氨基酸的缺失。没有实验证实C亚型的天然存在(UniProt entry P21439)。
仅密码子优化的MDR3-A亚型与高效的AAV载体的生产相容
有数据显示，当从瞬时转染的质粒表达时，Huh7细胞膜上只存在亚型A，基于编码MDR3亚型A的野生型(MDR3 Awt)或密码子优化的(MDR3 Aco)转基因变体的人工Anc80变体(Zinn E et al.,Cell Rep.；2015,12(6):1056-68)的AAV载体产生。最常规的AAV载体制备方法是基于一组2或3个质粒瞬时转染HEK293细胞，提供载体基因组扩增、衣壳产生和病毒颗粒组装所需的所有功能。这些质粒之一含有侧翼有两个AAV反向末端重复(ITR)的转基因，必须以足以允许产生载体的量产生。产生含有A1AT启动子下游MDR3-Awt和MDR3-Aco序列的AAV质粒。出乎意料的是，发明人在携带MDR3-Awt AAV质粒的细菌生长上遇到了问题，诸如细菌生长率降低和由分离质粒DNA的异常限制性内切酶消化分析所显示的更高的重组实例。通过将生长温度降低到30℃，这些问题在质粒生产中得到了部分解决，但重组/不纯质粒DNA污染仍未解决。相反，含有MDR3-Aco序列的AAV质粒更加稳定，并且可在没有任何上述技术问题的情况下生产。
用MDR3质粒瞬时转染HEK293细胞制备AAV载体。简而言之，为了产生AAVAnc80病毒颗粒，30个150cm2的装有融合的HEK293T细胞单层的烧瓶与辅助质粒pδF6、pAAP2、pKAnc80L65共转染(Zinn E et al.,Cell Report；2015,12(6):1056-68)，且所选择的包含载体序列的AAV质粒使用多亚乙基亚胺(PEI)包装(AAV-MDR3-Aco或AAV-MDR3-Awt)。孵育72小时后，如Vanrell L.et al.,Mol Ther.2011；19(7):1245-53中所述，使用碘沙醇梯度，通过超速离心从上清液和细胞中纯化AAV颗粒。最后，使用Amicon Ultra离心过滤器Ultracel100K(Millipore)浓缩纯化的病毒，并使用特异性针对A1AT启动子的寡核苷酸(正向引物：5’-TTGCTCCTCCGATAACTGGG-3’(SEQ ID NO:9)；反向引物：5’-CCCTGTCCTCGTCCGTATTT-3’)(SEQ ID NO:10)通过定量PCR滴定。AAV8病毒颗粒的产生方式相同，但使用pDP8(PlasmidFactory,Germany)作为单一辅助质粒。AAVAnc80-MDR3-Aco病毒颗粒的常规生产量和浓度与体内研究一致(表1)，平均滴度为4.6x1012病毒基因组(VG)/mL。令人惊讶的是，生产MDR3 Awt亚型的AAVAnc80载体的5次尝试中有4次未能获得任何显著的产量(5次中有4次滴度低于5x1011 VG/mL，这对于体内应用来说太低)。正如前面所观察到的，这意味着MDR3-Awt亚型编码序列的意想不到的内在特征，不仅在作为质粒携带时，且在位于AAV颗粒中也是如此。据估计，生产携带MDR3 Awt版本的AAV载体需要大量的障碍克服和/或比生产密码子优化的MDR3 Aco需要更多的时间、资源和材料。因此，选择亚型MDR3-Aco用于进一步的开发。
表1：AAV病毒产率
通过流体动力注射(质粒DNA转染)在体内检测MDR3 WT和CO变体的肝脏表达
转基因小鼠模型FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J(Abcb4–/–)是Abcb4基因的纯合敲除(Smit J.J.et al.,Cell.1993；75(3):451-62)。在通过流体动力注射(HDI)递送含有MDR3转基因变体的质粒后，分析这些小鼠的体内MDR3表达。5秒内，对7周龄雄性Abcb4–/–小鼠尾静脉注射25μg总体积2.4mL的质粒pAAV-MDR3。检测MDR3亚型Aco、Awt、Cco和Cwt的质粒。24h后处死动物，取肝脏并染色以用于通过免疫组织化学(IHC)检测MDR3的表达。接种pAAV-MDR3-Aco的小鼠均显示MDR3表达。特别地，一只小鼠在整个肝组织的小囊中显示出MDR3的表达(图3)，MDR3清楚地位于肝细胞的小管膜上。相比之下，用pAAV-MDR3-Awt进行HDI检测到只有一只动物显示出MDR3的表达，而整个样本中只有一个细胞可以检测到MDR3的表达(图3)。这些结果表明，与MDR3-Awt相比，MDR3-Aco序列可在体内更高效地表达。最后，pAAV-MDR3-Cco或pAAV-MDR3-Cwt均未显示MDR3阳性染色(数据未示出)。
携带MDR3转基因的AAV载体在PFIC3小鼠模型中的检测
Abcb4–/–敲除小鼠模型已显示可靠地复制几个PFIC3相关标志物，诸如升高的血清肝转氨酶、碱性磷酸酶、胆盐和胆红素水平；增加的肝脏和脾脏大小；降低的胆汁中磷脂酰胆碱浓度；肝脏的严重形态异常(诸如纤维化、胶原沉积和细胞浸润)。这些小鼠的症状出现在4周龄之前。发明者最初使用基于携带用于绿色荧光蛋白(GFP)报告的转基因的Anc80变体的AAV载体来测试这些小鼠是否易受AAV感染。
1周后处死接种5x1012vg/kg体重的小鼠(3周龄或4周龄)，且肝样品分别用qPCR和RT-qPCR进行AAV载体基因组拷贝数和GFP mRNA拷贝数的定量过程。与同年龄接种的野生型小鼠相比，3周龄和4周龄的Abcb4–/–小鼠均未发现Anc80载体以显著的水平转导(数据未示出)。
然后，给2周或3周龄的Abcb4–/–小鼠以3种剂量(5x1012、1.5x1013和5x1013 VG/kg)注射携带MDR3 Aco转基因的AAVAnc80载体。在3周龄时处理并在2周后处死的小鼠仅在5x1013剂量的雄性小鼠中表现出非常轻微的PFIC3症状(血清生物标志物水平和脾脏和肝脏大小)的改善(数据未示出)，而在接受最高AAV剂量的雄性和雌性小鼠中观察到胆汁PC浓度略有增加(与盐水处理的Abcb4–/–小鼠相比p＝0.057)(图4)。
但是，在两周龄时用5x1013 VG/kg的AAVAnc80-MDR3-Aco处理的小鼠显示在处理后3周内血清生物标志物有显著改善(图5)。当这些小鼠在处理后3周被处死时，在肝脏和脾脏重量以及肝脏组织学方面可看到向野生型特征的恢复(图6和7)。但是，用3倍低剂量(1.5x1013VG/kg)处理的小鼠与阴性对照盐水处理的ABCB4–/–小鼠相比，几乎没有改善。在经最高剂量处理的小鼠中，胆汁PC浓度也显著增加(图8)。
AAV血清型8载体在PFIC3小鼠中实现持续的治疗响应。
产生了携带MDR3-Aco转基因的血清型8的AAV载体，并在Abcb4-/-小鼠中检测。将AAV8-MDR3-Aco载体以1.5x1013或5x1013 VG/kg剂量施用于两周龄的小鼠。早在处理后1-2周，用最高剂量处理的小鼠的血清中的生物标志物水平(丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、胆盐(BS)和胆红素明显从患病动物的水平恢复到野生动物的水平(图9)。在肝脏和脾脏重量以及肝脏组织学方面，可以看到向野生型特征的恢复(图10)。在整个研究期间(直到处理后12周)，肝脏疾病的这种恢复一直维持。同时，经低剂量处理的小鼠的生物标志物水平与经盐水处理的Abcb4-/-小鼠没有差异。
在用AAV8-MDR3-Aco处理的PFIC3小鼠中实现了高水平的MDR3表达。
通过免疫组织化学(IHC)方法用抗人MDR3抗体在用5x1013vg/kg的AAV8-MDR3-Aco处理的Abcb4-/-小鼠肝脏中分析MDR3的表达。在肝脏中检测到大量MDR3表达，在肝细胞小管膜上有明确的蛋白质定位(图11)，这与在野生型小鼠中观察到的表达模式和强度相当(这些在相同条件下染色的小鼠提供了一个比较，因为用于产生抗hMDR3的合成肽与MDR3的小鼠版本序列具有100％的序列同一性)。经盐水处理的对照动物没有表现出预期的MDR3表达。
AAV8-MDR3处理在PFIC3小鼠中表现出剂量反应。
用五种不同剂量的AAV8-MDR3(5x1012、1x1013、2x1013、4x1013和8x1013 VG/kg)处理Abcb4–/–小鼠。处理后3周，血清生物标志物水平出现明显的剂量相关响应(图12)。
AAV血清型8载体在5周龄PFIC3小鼠中实现持续治疗响应。
将AAV8-MDR3-Aco载体以1x1014 VG/kg施用于5周龄的Abcb4–/–小鼠。在整个12周的随访中，生物标志物水平从患病状态恢复到降低至野生型动物的水平(图13)，如2周龄时处理时所见。雄性的效果相比雌性更一致。在17周龄时处死小鼠，AAV8-MDR3-Aco处理的小鼠显示出PFIC3疾病的表现明显减少，包括肝脏和脾脏体积减小(图14a-b)，胆汁PC增加(图14c)和肝纤维化降低(图14d)。使用对MDR3具有特异性的抗体通过免疫组织化学染色来检测MDR3蛋白的表达。雄性的表达水平为野生型水平的66％和雌性的31％(图14e)。雄性和雌性的胆汁PC分别恢复到野生型水平的54％和25％。
综上所述，发明人发现MDR3亚型A的密码子优化版本是开发潜在治疗PFIC3患者的基因治疗载体的最佳候选。在体外通过人肝细胞系中的DNA转染测试表达时，仅发现亚型A定位于细胞膜。令人惊讶的是，只有密码子优化的MDR3-A在作为裸DNA施用时显示出高效的体内表达。
当开始生产携带MDR3-A转基因的AAV载体(Anc80和AAV8)时，只有密码子优化的版本才能以预期的标准产量生产载体。
通过在Abcb4-/-KO小鼠模型中对这些携带MDR3 Aco转基因的AAV载体的测试，在2周龄时处理的小鼠显示出MDR3的高表达水平，其位于肝细胞的小管膜，且生物标志物水平显著恢复，达到了治疗效果。在利用祖先血清型Anc80的研究中，5x1013 VG/kg下的载体处理实现了PFIC3血清生物标志物水平的逆转(处理后3周内)，肝脏和脾脏大小减小，胆汁PC增加，且胆汁淤积小鼠中观察到的肝形态异常纠正。在5x1013 VG/kg的AAV8-MDR3-Aco下，指示PFIC3疾病的血清生物标志物水平在处理后3个月恢复到野生型动物中观察到的正常水平。此外，在肝脏和脾脏大小、胆汁PC和肝脏形态方面，这些AAV8-MDR3-Aco处理的小鼠在经处理3个月后也显示出PFIC3特征的显著改善。
用于实施本发明的序列
用于实施本发明的序列描述如下：
编码MDR3亚型A的密码子优化序列(co-MDR3(A))：(SEQ ID NO:1)
ATGGATCTGGAGGCCGCCAAGAAcGGCACCGCcTGGAGACCCACAAGCGCCGAGGGCGACTTCGAGCTGGGCATCAGCTCCAAGCAGAAGAGAAAGAAGACCAAGACAGTGAAGATGATCGGCGTGCTGACACTGTTCAGGTACTCCGACTGGCAGGATAAGCTGTTTATGTCTCTGGGCACCATCATGGCAATCGCCCACGGCAGCGGCCTGCCTCTGATGATGATCGTGTTCGGCGAGATGACCGACAAGTTTGTGGATACAGCCGGCAATTTCTCCTTTCCCGTGAACTTCTCTCTGAGCCTGCTGAACCCTGGCAAGATCCTGGAGGAGGAGATGACAAGATATGCCTACTATTACTCTGGCCTGGGAGCAGGCGTGCTGGTGGCAGCATACATCCAGGTGAGCTTCTGGACCCTGGCAGCAGGCCGGCAGATCAGAAAGATCAGGCAGAAGTTCTTTCACGCCATCCTGCGCCAGGAGATCGGCTGGTTTGACATCAATGATACCACAGAGCTGAACACCCGGCTGACAGACGACATCTCTAAGATCAGCGAGGGCATCGGCGATAAAGTGGGCATGTTCTTTCAGGCCGTGGCCACATTCTTTGCCGGCTTCATCGTGGGCTTTATCAGGGGCTGGAAGCTGACCCTGGTCATCATGGCCATCTCTCCAATCCTGGGCCTGAGCGCCGCCGTGTGGGCAAAGATCCTGTCCGCCTTCTCTGACAAGGAGCTGGCCGCCTACGCCAAGGCAGGAGCAGTGGCAGAGGAGGCCCTGGGCGCCATCCGCACCGTGATCGCCTTTGGCGGCCAGAATAAGGAGCTGGAGCGGTATCAGAAGCACCTGGAGAACGCCAAGGAGATCGGCATCAAGAAGGCCATCTCCGCCAATATCTCTATGGGCATCGCCTTCCTGCTGATCTATGCCAGCTACGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCAGCACCCTGGTCATCAGCAAGGAGTACACCATCGGCAATGCCATGACAGTGTTCTTTAGCATCCTGATCGGAGCCTTCTCCGTGGGACAGGCAGCACCATGCATCGACGCCTTCGCCAACGCCAGAGGCGCAGCCTACGTGATCTTTGACATCATCGATAACAATCCAAAGATCGACTCCTTTTCTGAGCGGGGCCACAAGCCCGATTCCATCAAGGGCAATCTGGAGTTCAACGACGTGCACTTTAGCTATCCCTCCCGCGCCAATGTGAAGATCCTGAAGGGCCTGAACCTGAAGGTGCAGTCCGGACAGACAGTGGCCCTGGTGGGCTCTAGCGGATGCGGCAAGTCTACCACAGTGCAGCTGATCCAGCGGCTGTATGACCCAGATGAGGGCACCATCAACATCGACGGCCAGGACATCCGCAACTTCAATGTGAACTACCTGCGGGAGATCATCGGCGTGGTGTCTCAGGAGCCCGTGCTGTTTAGCACCACAATCGCCGAGAATATCTGTTATGGCCGCGGCAACGTGACAATGGATGAGATCAAGAAGGCCGTGAAGGAGGCCAATGCCTACGAGTTCATCATGAAGCTGCCCCAGAAGTTTGACACCCTGGTGGGAGAGAGAGGCGCCCAGCTGAGCGGAGGCCAGAAGCAGAGGATCGCCATCGCCAGAGCCCTGGTGAGGAACCCTAAGATCCTGCTGCTGGACGAGGCCACCTCCGCCCTGGATACAGAGTCTGAGGCAGAGGTGCAGGCCGCCCTGGATAAGGCCCGCGAGGGACGGACCACAATCGTGATCGCCCACAGACTGAGCACAGTGAGGAATGCCGACGTGATCGCCGGCTTCGAGGATGGCGTGATCGTGGAGCAGGGCAGCCACTCCGAGCTGATGAAGAAGGAGGGCGTGTACTTCAAGCTGGTGAACATGCAGACCTCTGGCAGCCAGATCCAGTCCGAGGAGTTTGAGCTGAATGACGAGAAGGCAGCAACAAGGATGGCACCTAACGGATGGAAGAGCAGACTGTTCAGGCACTCCACCCAGAAGAATCTGAAGAACTCTCAGATGTGCCAGAAGAGCCTGGACGTGGAAACCGATGGACTGGAGGCAAATGTGCCACCCGTGAGCTTCCTGAAGGTGCTGAAGCTGAACAAGACAGAGTGGCCATATTTTGTGGTGGGCACCGTGTGCGCAATCGCAAATGGCGGCCTGCAGCCAGCCTTCAGCGTGATCTTTTCCGAGATCATCGCCATCTTCGGCCCTGGCGACGATGCCGTGAAGCAGCAGAAGTGTAACATCTTTTCCCTGATCTTCCTGTTTCTGGGCATCATCTCTTTCTTTACCTTCTTTCTGCAGGGCTTCACATTTGGCAAGGCCGGCGAGATCCTGACACGGAGACTGAGAAGCATGGCCTTCAAGGCCATGCTGAGGCAGGATATGTCCTGGTTTGACGATCACAAGAACAGCACCGGCGCCCTGTCCACCAGACTGGCAACAGACGCAGCACAGGTGCAGGGAGCAACCGGCACAAGGCTGGCCCTGATCGCCCAGAATATCGCCAACCTGGGCACAGGCATCATCATCTCTTTCATCTACGGCTGGCAGCTGACCCTGCTGCTGCTGGCAGTGGTGCCAATCATCGCCGTGAGCGGCATCGTGGAGATGAAGCTGCTGGCCGGCAATGCCAAGAGAGACAAGAAGGAGCTGGAGGCAGCAGGCAAGATCGCAACCGAGGCCATCGAGAACATCCGCACCGTGGTGAGCCTGACACAGGAGCGGAAGTTCGAGTCCATGTATGTGGAGAAGCTGTATGGCCCTTACCGCAATTCCGTGCAGAAGGCCCACATCTACGGCATCACCTTTTCCATCTCTCAGGCTTTCATGTATTTTTCTTACGCCGGCTGCTTCCGGTTTGGCGCCTATCTGATCGTGAACGGCCACATGAGGTTCCGCGATGTGATCCTGGTGTTCTCTGCCATCGTGTTTGGAGCAGTGGCCCTGGGACACGCCTCCTCTTTTGCCCCTGACTATGCAAAGGCAAAGCTGTCCGCCGCACACCTGTTCATGCTGTTTGAGAGACAGCCTCTGATCGATAGCTACTCCGAGGAGGGCCTGAAGCCAGACAAGTTCGAGGGCAATATCACATTCAACGAGGTGGTGTTTAATTATCCAACCAGGGCCAACGTGCCCGTGCTGCAGGGCCTGAGCCTGGAGGTGAAGAAGGGACAGACACTGGCCCTGGTGGGCAGCTCCGGATGCGGCAAGTCCACCGTGGTGCAGCTGCTGGAGAGATTCTACGACCCTCTGGCAGGCACCGTGCTGCTGGATGGACAGGAGGCCAAGAAGCTGAATGTGCAGTGGCTGAGAGCCCAGCTGGGCATCGTGTCTCAGGAGCCAATCCTGTTCGATTGTAGCATCGCCGAGAATATCGCCTACGGCGACAACTCTAGGGTGGTGAGCCAGGATGAGATCGTGAGCGCCGCAAAGGCAGCAAACATCCACCCTTTTATCGAGACCCTGCCACACAAGTATGAGACACGCGTGGGCGACAAGGGCACCCAGCTGTCCGGAGGACAGAAGCAGAGGATCGCAATCGCCCGCGCCCTGATCAGGCAGCCCCAGATCCTGCTGCTGGATGAAGCCACCTCCGCCCTGGACACAGAGTCTGAGAAGGTGGTGCAGGAGGCCCTGGACAAAGCCCGCGAGGGACGGACATGTATTGTCATTGCTCACAGACTGAGCACCATCCAGAATGCCGACCTGATCGTGGTGTTCCAGAACGGCAGGGTGAAGGAGCACGGCACACACCAGCAGCTGCTGGCCCAGAAGGGCATCTACTTTTCTATGGTGAGCGTGCAGGCCGGCACCCAGAACCTGTAG
编码MDR3亚型A的密码子优化序列(co-MDR3(A)-2)：(SEQ ID NO:2)
ATGGATCTGGAAGCTGCCAAAAATGGCACAGCTTGGAGGCCCACCTCTGCTGAAGGGGATTTTGAGCTGGGCATCAGCAGCAAGCAGAAGAGAAAAAAGACCAAGACAGTGAAGATGATTGGGGTGCTGACCCTGTTCAGATACTCTGACTGGCAGGACAAGCTGTTCATGAGCCTGGGCACCATCATGGCCATTGCTCATGGTTCTGGCCTGCCTCTGATGATGATTGTGTTTGGGGAGATGACAGACAAGTTTGTGGACACAGCTGGCAACTTCAGCTTCCCTGTGAACTTCAGCCTGAGCCTGCTGAACCCTGGCAAGATCCTGGAAGAGGAAATGACCAGATACGCCTACTACTACTCTGGCCTTGGAGCTGGTGTCCTGGTGGCTGCCTATATCCAGGTGTCCTTTTGGACCCTGGCTGCTGGCAGACAGATCAGAAAGATCAGGCAGAAATTCTTCCATGCCATCCTGAGGCAAGAGATTGGATGGTTTGACATCAATGACACCACAGAGCTGAACACCAGGCTGACAGATGACATCAGCAAGATCTCTGAAGGCATTGGGGACAAAGTGGGGATGTTCTTCCAGGCTGTGGCCACCTTCTTTGCTGGCTTCATTGTGGGCTTTATCAGAGGCTGGAAACTGACCCTGGTCATCATGGCTATCAGCCCCATCCTGGGACTGTCTGCTGCTGTGTGGGCCAAAATCCTGTCTGCCTTCTCTGACAAAGAACTGGCAGCCTATGCCAAGGCTGGTGCTGTGGCTGAAGAAGCCCTGGGAGCCATCAGAACAGTGATTGCCTTTGGAGGGCAGAACAAAGAGCTGGAAAGATACCAGAAACACCTGGAAAATGCCAAAGAGATAGGCATCAAGAAGGCCATCTCTGCCAACATCAGCATGGGCATTGCCTTTCTGCTCATCTATGCCAGCTATGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCAGCACCCTGGTTATCAGCAAAGAGTACACCATTGGCAACGCCATGACAGTGTTCTTCAGCATCCTGATTGGAGCCTTTTCTGTTGGCCAGGCTGCCCCTTGCATTGATGCCTTTGCTAATGCCAGAGGGGCTGCTTATGTGATCTTTGACATTATTGACAACAACCCCAAGATTGACAGCTTCTCTGAGAGAGGCCACAAGCCTGACAGCATCAAGGGCAACCTTGAGTTCAATGATGTGCACTTCAGCTACCCCAGCAGGGCCAATGTGAAAATCCTGAAGGGCCTGAACCTGAAGGTGCAGTCTGGACAGACAGTGGCCCTTGTGGGATCTTCTGGCTGTGGCAAGAGCACCACAGTGCAGCTGATCCAGAGACTGTATGACCCTGATGAGGGCACAATCAACATTGATGGCCAGGACATCAGAAACTTCAATGTGAACTACCTGAGGGAAATCATAGGGGTTGTGTCCCAAGAGCCTGTGCTGTTCAGCACCACCATTGCTGAGAACATCTGCTATGGCAGGGGCAATGTCACAATGGATGAGATCAAGAAAGCTGTGAAAGAGGCCAATGCCTATGAGTTCATCATGAAGCTGCCCCAGAAGTTTGACACCCTTGTTGGAGAAAGAGGGGCCCAGCTGTCTGGTGGCCAGAAGCAGAGAATTGCCATTGCCAGGGCTCTTGTCAGAAACCCTAAGATCCTGCTGCTGGATGAGGCCACATCTGCCCTGGATACAGAGTCTGAGGCAGAGGTGCAGGCTGCACTGGATAAGGCTAGAGAGGGAAGAACAACCATTGTGATTGCCCACAGACTGAGCACAGTCAGAAATGCAGATGTGATTGCAGGCTTTGAGGATGGGGTCATAGTGGAACAGGGCAGCCACTCTGAGCTGATGAAGAAAGAAGGGGTGTACTTCAAGCTGGTCAACATGCAGACCAGTGGCAGCCAGATCCAGTCTGAGGAATTTGAGCTGAATGATGAGAAGGCTGCCACCAGAATGGCCCCTAATGGCTGGAAGTCTAGGCTGTTTAGACACAGCACCCAGAAGAACCTCAAGAACAGCCAGATGTGCCAGAAAAGCCTGGATGTTGAGACAGATGGCCTGGAAGCCAATGTGCCTCCTGTGTCCTTCCTGAAAGTGCTGAAGCTGAACAAGACAGAGTGGCCCTACTTTGTTGTGGGCACAGTGTGTGCCATTGCAAATGGTGGCCTGCAGCCAGCTTTCTCTGTGATCTTCTCTGAAATCATTGCCATCTTTGGCCCTGGGGATGATGCTGTGAAGCAGCAGAAGTGCAATATCTTTTCCCTGATCTTCCTGTTCCTGGGGATCATCAGTTTCTTCACATTCTTTCTGCAAGGCTTCACCTTTGGCAAGGCTGGGGAGATCCTGACTAGAAGGCTGAGATCTATGGCCTTCAAAGCCATGCTGAGACAGGACATGTCTTGGTTTGATGACCACAAGAACTCCACAGGGGCCCTGAGCACAAGACTGGCTACAGATGCTGCTCAGGTGCAGGGTGCTACAGGCACTAGACTGGCCCTGATTGCACAGAACATTGCCAACCTTGGCACAGGCATCATCATTAGCTTCATCTATGGCTGGCAGCTGACACTGCTCCTGCTGGCTGTTGTGCCCATCATTGCAGTGTCTGGCATTGTGGAAATGAAGTTGCTGGCTGGCAATGCCAAGAGGGACAAGAAAGAGCTTGAGGCAGCAGGCAAGATTGCCACAGAGGCCATTGAGAATATCAGGACAGTGGTGTCTCTGACCCAAGAAAGAAAGTTTGAGTCTATGTATGTGGAAAAGCTGTATGGGCCCTATAGGAACTCTGTGCAAAAGGCCCACATCTATGGGATCACCTTCTCCATCAGCCAGGCTTTCATGTACTTTAGCTATGCTGGCTGCTTCAGATTTGGGGCCTACCTGATTGTGAATGGCCACATGAGATTCAGGGATGTGATCCTGGTGTTTTCTGCCATTGTCTTTGGAGCTGTGGCTCTGGGCCATGCCTCTAGCTTTGCCCCTGACTATGCCAAAGCCAAACTGTCTGCAGCCCACCTGTTCATGCTGTTTGAGAGACAGCCCCTGATTGACTCCTACTCTGAGGAAGGACTGAAGCCTGATAAGTTTGAGGGCAACATCACCTTCAATGAGGTGGTGTTCAACTACCCTACCAGAGCTAATGTGCCAGTGCTGCAGGGACTCTCCCTGGAAGTGAAGAAAGGGCAGACTCTGGCTCTTGTGGGCAGCTCAGGATGTGGCAAGTCTACAGTGGTGCAGCTGCTGGAAAGGTTCTATGATCCCCTGGCAGGCACAGTGCTGTTGGATGGCCAAGAGGCTAAAAAGCTGAATGTGCAGTGGCTGAGAGCACAGCTGGGAATTGTGTCTCAAGAACCCATCCTGTTTGACTGCAGCATAGCAGAGAACATAGCCTATGGGGACAACTCCAGAGTGGTTTCTCAGGATGAGATTGTCTCTGCTGCCAAGGCAGCCAACATTCACCCCTTCATTGAGACACTGCCCCACAAATATGAGACAAGAGTGGGAGACAAGGGAACCCAGCTCAGTGGTGGACAGAAACAAAGGATTGCTATAGCTAGGGCCCTGATCAGACAGCCTCAGATTCTGCTCCTTGATGAAGCAACCTCTGCTCTGGACACTGAATCTGAGAAGGTGGTGCAAGAGGCCCTGGACAAAGCCAGAGAGGGTAGAACCTGCATTGTCATTGCTCACAGGCTGTCTACCATCCAGAATGCTGATCTGATTGTGGTGTTCCAGAATGGGAGAGTGAAAGAGCATGGCACCCACCAGCAACTGCTGGCCCAGAAGGGCATCTACTTCAGCATGGTGTCTGTGCAGGCAGGGACCCAGAACCTGTAA
合成的poly A序列(SEQ ID NO:3)
AATAAAGACCTCTTATTTTCATTCATCAGGTGTGGTTGGTTTTTTTGTGTGGGGGC
rAAV-MDR3-Aco 1(SEQ ID NO:4)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGAATTCCATGGTACCAGGCATCAAGAcacgtgCGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAAGGCCTGTCGACGGATCCGCCGCCACCATGGATCTGGAGGCCGCCAAGAAcGGCACCGCcTGGAGACCCACAAGCGCCGAGGGCGACTTCGAGCTGGGCATCAGCTCCAAGCAGAAGAGAAAGAAGACCAAGACAGTGAAGATGATCGGCGTGCTGACACTGTTCAGGTACTCCGACTGGCAGGATAAGCTGTTTATGTCTCTGGGCACCATCATGGCAATCGCCCACGGCAGCGGCCTGCCTCTGATGATGATCGTGTTCGGCGAGATGACCGACAAGTTTGTGGATACAGCCGGCAATTTCTCCTTTCCCGTGAACTTCTCTCTGAGCCTGCTGAACCCTGGCAAGATCCTGGAGGAGGAGATGACAAGATATGCCTACTATTACTCTGGCCTGGGAGCAGGCGTGCTGGTGGCAGCATACATCCAGGTGAGCTTCTGGACCCTGGCAGCAGGCCGGCAGATCAGAAAGATCAGGCAGAAGTTCTTTCACGCCATCCTGCGCCAGGAGATCGGCTGGTTTGACATCAATGATACCACAGAGCTGAACACCCGGCTGACAGACGACATCTCTAAGATCAGCGAGGGCATCGGCGATAAAGTGGGCATGTTCTTTCAGGCCGTGGCCACATTCTTTGCCGGCTTCATCGTGGGCTTTATCAGGGGCTGGAAGCTGACCCTGGTCATCATGGCCATCTCTCCAATCCTGGGCCTGAGCGCCGCCGTGTGGGCAAAGATCCTGTCCGCCTTCTCTGACAAGGAGCTGGCCGCCTACGCCAAGGCAGGAGCAGTGGCAGAGGAGGCCCTGGGCGCCATCCGCACCGTGATCGCCTTTGGCGGCCAGAATAAGGAGCTGGAGCGGTATCAGAAGCACCTGGAGAACGCCAAGGAGATCGGCATCAAGAAGGCCATCTCCGCCAATATCTCTATGGGCATCGCCTTCCTGCTGATCTATGCCAGCTACGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCAGCACCCTGGTCATCAGCAAGGAGTACACCATCGGCAATGCCATGACAGTGTTCTTTAGCATCCTGATCGGAGCCTTCTCCGTGGGACAGGCAGCACCATGCATCGACGCCTTCGCCAACGCCAGAGGCGCAGCCTACGTGATCTTTGACATCATCGATAACAATCCAAAGATCGACTCCTTTTCTGAGCGGGGCCACAAGCCCGATTCCATCAAGGGCAATCTGGAGTTCAACGACGTGCACTTTAGCTATCCCTCCCGCGCCAATGTGAAGATCCTGAAGGGCCTGAACCTGAAGGTGCAGTCCGGACAGACAGTGGCCCTGGTGGGCTCTAGCGGATGCGGCAAGTCTACCACAGTGCAGCTGATCCAGCGGCTGTATGACCCAGATGAGGGCACCATCAACATCGACGGCCAGGACATCCGCAACTTCAATGTGAACTACCTGCGGGAGATCATCGGCGTGGTGTCTCAGGAGCCCGTGCTGTTTAGCACCACAATCGCCGAGAATATCTGTTATGGCCGCGGCAACGTGACAATGGATGAGATCAAGAAGGCCGTGAAGGAGGCCAATGCCTACGAGTTCATCATGAAGCTGCCCCAGAAGTTTGACACCCTGGTGGGAGAGAGAGGCGCCCAGCTGAGCGGAGGCCAGAAGCAGAGGATCGCCATCGCCAGAGCCCTGGTGAGGAACCCTAAGATCCTGCTGCTGGACGAGGCCACCTCCGCCCTGGATACAGAGTCTGAGGCAGAGGTGCAGGCCGCCCTGGATAAGGCCCGCGAGGGACGGACCACAATCGTGATCGCCCACAGACTGAGCACAGTGAGGAATGCCGACGTGATCGCCGGCTTCGAGGATGGCGTGATCGTGGAGCAGGGCAGCCACTCCGAGCTGATGAAGAAGGAGGGCGTGTACTTCAAGCTGGTGAACATGCAGACCTCTGGCAGCCAGATCCAGTCCGAGGAGTTTGAGCTGAATGACGAGAAGGCAGCAACAAGGATGGCACCTAACGGATGGAAGAGCAGACTGTTCAGGCACTCCACCCAGAAGAATCTGAAGAACTCTCAGATGTGCCAGAAGAGCCTGGACGTGGAAACCGATGGACTGGAGGCAAATGTGCCACCCGTGAGCTTCCTGAAGGTGCTGAAGCTGAACAAGACAGAGTGGCCATATTTTGTGGTGGGCACCGTGTGCGCAATCGCAAATGGCGGCCTGCAGCCAGCCTTCAGCGTGATCTTTTCCGAGATCATCGCCATCTTCGGCCCTGGCGACGATGCCGTGAAGCAGCAGAAGTGTAACATCTTTTCCCTGATCTTCCTGTTTCTGGGCATCATCTCTTTCTTTACCTTCTTTCTGCAGGGCTTCACATTTGGCAAGGCCGGCGAGATCCTGACACGGAGACTGAGAAGCATGGCCTTCAAGGCCATGCTGAGGCAGGATATGTCCTGGTTTGACGATCACAAGAACAGCACCGGCGCCCTGTCCACCAGACTGGCAACAGACGCAGCACAGGTGCAGGGAGCAACCGGCACAAGGCTGGCCCTGATCGCCCAGAATATCGCCAACCTGGGCACAGGCATCATCATCTCTTTCATCTACGGCTGGCAGCTGACCCTGCTGCTGCTGGCAGTGGTGCCAATCATCGCCGTGAGCGGCATCGTGGAGATGAAGCTGCTGGCCGGCAATGCCAAGAGAGACAAGAAGGAGCTGGAGGCAGCAGGCAAGATCGCAACCGAGGCCATCGAGAACATCCGCACCGTGGTGAGCCTGACACAGGAGCGGAAGTTCGAGTCCATGTATGTGGAGAAGCTGTATGGCCCTTACCGCAATTCCGTGCAGAAGGCCCACATCTACGGCATCACCTTTTCCATCTCTCAGGCTTTCATGTATTTTTCTTACGCCGGCTGCTTCCGGTTTGGCGCCTATCTGATCGTGAACGGCCACATGAGGTTCCGCGATGTGATCCTGGTGTTCTCTGCCATCGTGTTTGGAGCAGTGGCCCTGGGACACGCCTCCTCTTTTGCCCCTGACTATGCAAAGGCAAAGCTGTCCGCCGCACACCTGTTCATGCTGTTTGAGAGACAGCCTCTGATCGATAGCTACTCCGAGGAGGGCCTGAAGCCAGACAAGTTCGAGGGCAATATCACATTCAACGAGGTGGTGTTTAATTATCCAACCAGGGCCAACGTGCCCGTGCTGCAGGGCCTGAGCCTGGAGGTGAAGAAGGGACAGACACTGGCCCTGGTGGGCAGCTCCGGATGCGGCAAGTCCACCGTGGTGCAGCTGCTGGAGAGATTCTACGACCCTCTGGCAGGCACCGTGCTGCTGGATGGACAGGAGGCCAAGAAGCTGAATGTGCAGTGGCTGAGAGCCCAGCTGGGCATCGTGTCTCAGGAGCCAATCCTGTTCGATTGTAGCATCGCCGAGAATATCGCCTACGGCGACAACTCTAGGGTGGTGAGCCAGGATGAGATCGTGAGCGCCGCAAAGGCAGCAAACATCCACCCTTTTATCGAGACCCTGCCACACAAGTATGAGACACGCGTGGGCGACAAGGGCACCCAGCTGTCCGGAGGACAGAAGCAGAGGATCGCAATCGCCCGCGCCCTGATCAGGCAGCCCCAGATCCTGCTGCTGGATGAAGCCACCTCCGCCCTGGACACAGAGTCTGAGAAGGTGGTGCAGGAGGCCCTGGACAAAGCCCGCGAGGGACGGACATGTATTGTCATTGCTCACAGACTGAGCACCATCCAGAATGCCGACCTGATCGTGGTGTTCCAGAACGGCAGGGTGAAGGAGCACGGCACACACCAGCAGCTGCTGGCCCAGAAGGGCATCTACTTTTCTATGGTGAGCGTGCAGGCCGGCACCCAGAACCTGTAGCATATGATATCAATAAAGACCTCTTATTTTCATTCATCAGGTGTGGTTGGTTTTTTTGTGTGGGGGCTCGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
rAAV-MDR3-Aco 2(SEQ ID NO:5)
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGAATTCCATGGTACCAGGCATCAAGACACGTGCGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAAGGCCTGTCGACGGATCCGCCGCCACCATGGATCTGGAAGCTGCCAAAAATGGCACAGCTTGGAGGCCCACCTCTGCTGAAGGGGATTTTGAGCTGGGCATCAGCAGCAAGCAGAAGAGAAAAAAGACCAAGACAGTGAAGATGATTGGGGTGCTGACCCTGTTCAGATACTCTGACTGGCAGGACAAGCTGTTCATGAGCCTGGGCACCATCATGGCCATTGCTCATGGTTCTGGCCTGCCTCTGATGATGATTGTGTTTGGGGAGATGACAGACAAGTTTGTGGACACAGCTGGCAACTTCAGCTTCCCTGTGAACTTCAGCCTGAGCCTGCTGAACCCTGGCAAGATCCTGGAAGAGGAAATGACCAGATACGCCTACTACTACTCTGGCCTTGGAGCTGGTGTCCTGGTGGCTGCCTATATCCAGGTGTCCTTTTGGACCCTGGCTGCTGGCAGACAGATCAGAAAGATCAGGCAGAAATTCTTCCATGCCATCCTGAGGCAAGAGATTGGATGGTTTGACATCAATGACACCACAGAGCTGAACACCAGGCTGACAGATGACATCAGCAAGATCTCTGAAGGCATTGGGGACAAAGTGGGGATGTTCTTCCAGGCTGTGGCCACCTTCTTTGCTGGCTTCATTGTGGGCTTTATCAGAGGCTGGAAACTGACCCTGGTCATCATGGCTATCAGCCCCATCCTGGGACTGTCTGCTGCTGTGTGGGCCAAAATCCTGTCTGCCTTCTCTGACAAAGAACTGGCAGCCTATGCCAAGGCTGGTGCTGTGGCTGAAGAAGCCCTGGGAGCCATCAGAACAGTGATTGCCTTTGGAGGGCAGAACAAAGAGCTGGAAAGATACCAGAAACACCTGGAAAATGCCAAAGAGATAGGCATCAAGAAGGCCATCTCTGCCAACATCAGCATGGGCATTGCCTTTCTGCTCATCTATGCCAGCTATGCCCTGGCCTTTTGGTATGGCAGCACCCTGGTTATCAGCAAAGAGTACACCATTGGCAACGCCATGACAGTGTTCTTCAGCATCCTGATTGGAGCCTTTTCTGTTGGCCAGGCTGCCCCTTGCATTGATGCCTTTGCTAATGCCAGAGGGGCTGCTTATGTGATCTTTGACATTATTGACAACAACCCCAAGATTGACAGCTTCTCTGAGAGAGGCCACAAGCCTGACAGCATCAAGGGCAACCTTGAGTTCAATGATGTGCACTTCAGCTACCCCAGCAGGGCCAATGTGAAAATCCTGAAGGGCCTGAACCTGAAGGTGCAGTCTGGACAGACAGTGGCCCTTGTGGGATCTTCTGGCTGTGGCAAGAGCACCACAGTGCAGCTGATCCAGAGACTGTATGACCCTGATGAGGGCACAATCAACATTGATGGCCAGGACATCAGAAACTTCAATGTGAACTACCTGAGGGAAATCATAGGGGTTGTGTCCCAAGAGCCTGTGCTGTTCAGCACCACCATTGCTGAGAACATCTGCTATGGCAGGGGCAATGTCACAATGGATGAGATCAAGAAAGCTGTGAAAGAGGCCAATGCCTATGAGTTCATCATGAAGCTGCCCCAGAAGTTTGACACCCTTGTTGGAGAAAGAGGGGCCCAGCTGTCTGGTGGCCAGAAGCAGAGAATTGCCATTGCCAGGGCTCTTGTCAGAAACCCTAAGATCCTGCTGCTGGATGAGGCCACATCTGCCCTGGATACAGAGTCTGAGGCAGAGGTGCAGGCTGCACTGGATAAGGCTAGAGAGGGAAGAACAACCATTGTGATTGCCCACAGACTGAGCACAGTCAGAAATGCAGATGTGATTGCAGGCTTTGAGGATGGGGTCATAGTGGAACAGGGCAGCCACTCTGAGCTGATGAAGAAAGAAGGGGTGTACTTCAAGCTGGTCAACATGCAGACCAGTGGCAGCCAGATCCAGTCTGAGGAATTTGAGCTGAATGATGAGAAGGCTGCCACCAGAATGGCCCCTAATGGCTGGAAGTCTAGGCTGTTTAGACACAGCACCCAGAAGAACCTCAAGAACAGCCAGATGTGCCAGAAAAGCCTGGATGTTGAGACAGATGGCCTGGAAGCCAATGTGCCTCCTGTGTCCTTCCTGAAAGTGCTGAAGCTGAACAAGACAGAGTGGCCCTACTTTGTTGTGGGCACAGTGTGTGCCATTGCAAATGGTGGCCTGCAGCCAGCTTTCTCTGTGATCTTCTCTGAAATCATTGCCATCTTTGGCCCTGGGGATGATGCTGTGAAGCAGCAGAAGTGCAATATCTTTTCCCTGATCTTCCTGTTCCTGGGGATCATCAGTTTCTTCACATTCTTTCTGCAAGGCTTCACCTTTGGCAAGGCTGGGGAGATCCTGACTAGAAGGCTGAGATCTATGGCCTTCAAAGCCATGCTGAGACAGGACATGTCTTGGTTTGATGACCACAAGAACTCCACAGGGGCCCTGAGCACAAGACTGGCTACAGATGCTGCTCAGGTGCAGGGTGCTACAGGCACTAGACTGGCCCTGATTGCACAGAACATTGCCAACCTTGGCACAGGCATCATCATTAGCTTCATCTATGGCTGGCAGCTGACACTGCTCCTGCTGGCTGTTGTGCCCATCATTGCAGTGTCTGGCATTGTGGAAATGAAGTTGCTGGCTGGCAATGCCAAGAGGGACAAGAAAGAGCTTGAGGCAGCAGGCAAGATTGCCACAGAGGCCATTGAGAATATCAGGACAGTGGTGTCTCTGACCCAAGAAAGAAAGTTTGAGTCTATGTATGTGGAAAAGCTGTATGGGCCCTATAGGAACTCTGTGCAAAAGGCCCACATCTATGGGATCACCTTCTCCATCAGCCAGGCTTTCATGTACTTTAGCTATGCTGGCTGCTTCAGATTTGGGGCCTACCTGATTGTGAATGGCCACATGAGATTCAGGGATGTGATCCTGGTGTTTTCTGCCATTGTCTTTGGAGCTGTGGCTCTGGGCCATGCCTCTAGCTTTGCCCCTGACTATGCCAAAGCCAAACTGTCTGCAGCCCACCTGTTCATGCTGTTTGAGAGACAGCCCCTGATTGACTCCTACTCTGAGGAAGGACTGAAGCCTGATAAGTTTGAGGGCAACATCACCTTCAATGAGGTGGTGTTCAACTACCCTACCAGAGCTAATGTGCCAGTGCTGCAGGGACTCTCCCTGGAAGTGAAGAAAGGGCAGACTCTGGCTCTTGTGGGCAGCTCAGGATGTGGCAAGTCTACAGTGGTGCAGCTGCTGGAAAGGTTCTATGATCCCCTGGCAGGCACAGTGCTGTTGGATGGCCAAGAGGCTAAAAAGCTGAATGTGCAGTGGCTGAGAGCACAGCTGGGAATTGTGTCTCAAGAACCCATCCTGTTTGACTGCAGCATAGCAGAGAACATAGCCTATGGGGACAACTCCAGAGTGGTTTCTCAGGATGAGATTGTCTCTGCTGCCAAGGCAGCCAACATTCACCCCTTCATTGAGACACTGCCCCACAAATATGAGACAAGAGTGGGAGACAAGGGAACCCAGCTCAGTGGTGGACAGAAACAAAGGATTGCTATAGCTAGGGCCCTGATCAGACAGCCTCAGATTCTGCTCCTTGATGAAGCAACCTCTGCTCTGGACACTGAATCTGAGAAGGTGGTGCAAGAGGCCCTGGACAAAGCCAGAGAGGGTAGAACCTGCATTGTCATTGCTCACAGGCTGTCTACCATCCAGAATGCTGATCTGATTGTGGTGTTCCAGAATGGGAGAGTGAAAGAGCATGGCACCCACCAGCAACTGCTGGCCCAGAAGGGCATCTACTTCAGCATGGTGTCTGTGCAGGCAGGGACCCAGAACCTGTAACATATGATATCAATAAAGACCTCTTATTTTCATTCATCAGGTGTGGTTGGTTTTTTTGTGTGGGGGCTCGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
α1抗胰蛋白酶启动子(SEQ ID NO:6)
CGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACA
人最小胆盐输出泵(ABCB11)基因启动子(SEQ ID NO:7)
TTCCCAAGCACACTCTGTGTTTGGGGTTATTGCTCTGAGTATGTTTCTCGTATGTCACTGAACTGTGCTTGGGCTGCCCTTAGGGACATTGATCCTTAGGCAAATAGATAATGTTCTTGAAAAAGTTTGAATTCTGTTCAGTGCT
小鼠最小胆盐输出泵(ABCB11)基因启动子(SEQ ID NO:8)
GGTTCCTGCTTTGAGTATGTTCGACCTTTCCTCTCATGTCACTGAACTGTGCTAGATCTGGACTTTAGGCCATTGACCTATAAGCAAATAGATAGTGTTCTTAAAAAAGCCTGATTTCTGTTCAATGCTTTATTACCATGAAAAC。
Claims (16)
1.核酸构建体，其包含编码MDR3亚型A的转基因，所述转基因是序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的序列。
2.权利要求1所述的核酸构建体，其进一步包含肝特异性启动子，优选α-1-抗胰蛋白酶启动子或胆盐诱导型启动子。
3.权利要求1或2所述的核酸构建体，其进一步包含聚腺苷酸化信号序列，特别是具有序列SEQ ID NO:3的合成聚腺苷酸化信号序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸构建体，其进一步包含5’ITR和3’ITR序列，优选腺相关病毒的5’ITR和3’ITR序列，更优选来自AAV2血清型的5’ITR和3’ITR序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸构建体，其包含核酸序列SEQ ID NO:4或与SEQID NO:4具有至少90％同一性的核酸序列。
6.表达载体，其包含根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体。
7.权利要求6所述的表达载体，其中所述载体是病毒载体，优选腺相关病毒(AAV)载体。
8.病毒颗粒，其包含根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体或权利要求6或7所述的表达载体。
9.AAV颗粒，其包含根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体或权利要求6或7所述的表达载体，且优选包含腺相关病毒的衣壳蛋白，诸如选自下组的衣壳蛋白：AAV3 3A型、AAV33B型、NP40、NP59、NP84、LK03、AAV3-ST、Anc80和AAV8血清型。
10.宿主细胞，其包含根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体或权利要求6或7所述的表达载体，或宿主细胞，其用权利要求8或9所述的病毒颗粒转导。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体、权利要求6或7所述的载体、权利要求8或9所述的病毒颗粒或权利要求10所述的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂。
12.根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体、权利要求6或7所述的载体、权利要求8或9所述的病毒颗粒、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11所述的药物组合物，其在有需要的受试者中用作药物。
13.根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体、权利要求6或7所述的载体、权利要求8或9所述的病毒颗粒、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11所述的药物组合物，其用于在有需要的受试者中预防和/或治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)。
14.根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体、权利要求6或7所述的载体、权利要求8或9所述的病毒颗粒、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11所述的药物组合物，其用于在有需要的受试者中预防和/或治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)，其中所述受试者是新生儿、婴儿、儿童或成人，优选新生儿、婴儿或儿童，更优选新生儿或婴儿。
15.制备根据权利要求8或9所述的病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：
a)在培养基中培养根据权利要求10所述的包含核酸构建体或表达载体的宿主细胞，和
b)从细胞培养上清液和/或在细胞内收获病毒颗粒。
16.试剂盒，其在一个或多个容器中包含根据权利要求1-5任一项所述的核酸构建体、权利要求6或7所述的载体、权利要求8或9所述的病毒颗粒、权利要求10所述的宿主细胞或权利要求11所述的药物组合物，任选地其还包含说明书或包装材料。
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