ES2876412T3 - Construcciones de ácido nucleico y vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson - Google Patents

Construcciones de ácido nucleico y vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson Download PDF

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Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende a) una secuencia de nucleótidos de un promotor eucariota; b) una secuencia de nucleótidos codificante de una ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B) truncada en la cual los sitios asociados a metales pesados N-terminal HMA 1, HMA 2, HMA 3 y HMA 4 están totalmente eliminados y HMA 5 y HMA 6 permanecen sin eliminar; y c) una secuencia de señal de poliadenilación, d) flanqueada por una repetición terminal invertida (ITR) 5' y una ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV).

Description

DESCRIPCIÓN
Construcciones de ácido nucleico y vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson
Sector de la técnica
La presente divulgación se refiere a construcciones de ácido nucleico y a vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson y de otras afecciones.
Estado de la técnica
Merle et al. revisaron el estado de la técnica relativo a la terapia génica de la enfermedad de Wilson (Current Gene Therapy 2007; 7: 217-220), y este se resume y se completa en el presente documento con las referencias divulgadas más adelante.
La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno autosómico recesivo heredado del metabolismo del cobre con una frecuencia media de 1:30.000. La EW está causada por mutaciones del gen ATP7B, codificante de una ATPasa transportadora del cobre de tipo P, que se encuentra en el cromosoma 13. ATP7B se expresa principalmente en los hepatocitos y funciona en el transporte transmembrana del cobre. La ausencia o la reducción de la función de la proteína ATP7B conduce a una reducción de la excreción hepatocelular del cobre en la bilis, y produce una acumulación del cobre principalmente en el hígado y, posteriormente, en el sistema neurológico y en otros tejidos. La incapacidad de incorporar el cobre en la ceruloplasmina es una consecuencia adicional de la pérdida de la proteína ATP7B funcional.
EW puede presentarse clínicamente como una enfermedad hepática, como un trastorno neurológico progresivo o como una enfermedad psiquiátrica. En general, los pacientes con EW hepática la presentan al final de la infancia o adolescencia, y presentan características de hepatitis aguda, insuficiencia hepática fulminante o enfermedad hepática crónica progresiva. Las manifestaciones neurológicas de la EW normalmente se presentan más tarde que la enfermedad hepática, con mayor frecuencia en la segunda o tercera década, e incluyen síntomas extrapiramidales, cerebelares y relacionados con el cerebro.
El objetivo del tratamiento médico de la EW es eliminar el depósito tóxico del cobre del organismo y evitar su reacumulación. En la actualidad, hay tres fármacos contra el cobre aprobados para la EW: D-penicilamina, la trientina y las sales de cinc. La terapia médica es eficaz en la mayoría, pero no en todos los pacientes con EW. El trasplante de hígado es una opción terapéutica en pacientes con EW que presentan insuficiencia hepática fulminante o insuficiencia hepática progresiva. Se ha demostrado que corrige el fenotipo de la EW y proporciona una excelente supervivencia a largo plazo.
Sin embargo, una interrupción de la terapia o un tratamiento inadecuado pueden provocar la muerte en pocos meses. Debido a que la medicación para la Ew debe tomarse regularmente, la adherencia al tratamiento, en algunos pacientes, especialmente, en pacientes adolescentes con EW, es baja.
Bajo terapia, los síntomas neurológicos residuales son relativamente comunes e incluso pueden aparecer síntomas progresivos. Debido a que las opciones actuales de tratamiento médico no son eficaces en todos los pacientes con EW y la adherencia a la terapia es un problema, una solución más amplia podría implicar la terapia génica.
Teóricamente, la expresión de ATP7B de tipo silvestre en los hepatocitos revertiría todas las anomalías relacionadas con la enfermedad, y salvaría el hígado y evitaría los síntomas neurológicos. El objetivo final de una terapia génica ideal para la EW sería administrar ATP7B, en cantidad suficiente, específicamente a los hepatocitos durante toda la vida.
Todos los estudios publicados sobre la transferencia de genes adenovíricos para la EW han usado vectores adenovíricos de primera generación que solo producen la expresión transgénica transitoria. Terada et al. [Terada et al. J. Biol. Chem. 1998; 273:1815-1820; Terada et al. FEBS Lett. 1999; 448: 53-56] demostraron la transferencia exitosa de genes mediante la administración de genes mediada por adenovirus en el modelo de ratas LEC. Se observó el restablecimiento de la síntesis de holoceruloplasmina, de la actividad de ceruloplasmina oxidasa en suero y de la excreción del cobre en la bilis, indicando un efecto terapéutico de la transferencia génica. Estos efectos fueron de una duración muy limitada, con un nivel máximo en el día tres y una disminución a partir de entonces. Ha-Hao et al. [Z. Gastroenterol. 2002; 40: 209-216] también demostraron un mayor contenido del cobre en las heces de ratas LEC tras la transferencia del gen ATP7B mediado por adenovirus, indicando una mayor excreción del cobre en la bilis. Además, se demostró el efecto terapéutico mediante el restablecimiento de la holoceruloplasmina y de su actividad ferroxidasa. Sin embargo, una vez más, la duración del efecto terapéutico en estos experimentos fue solo transitoria, con una duración limitada de unos cuantos días.
Hasta la fecha, todavía no se han probado los vectores adenovíricos "cobardes" para esta aplicación.
Otros sistemas de vectores víricos no integrantes comúnmente usados, el virus adenoasociado (AAV, Adeno-Associated Virus), no se ha probado para la EW hasta la fecha, principalmente, porque el gen ATP7B (de aproximadamente 4,4 kb de longitud) deja un espacio mínimo para asignar el resto de secuencias requeridas (por ejemplo, promotor, secuencia de señal de poli A, etc.) dentro del vector AAV, cuya capacidad de empaquetamiento es de 4,4-4,7 kb. La solicitud de patente alemana DE 100156121A1 (publicada en 2003) propuso un vector vírico recombinante adenoasociado para la terapia génica de la EW que posee un promotor acortado sensible al metal (promotor de la metalotioneína I) para producir expresión inducible por cobre o cinc del transgén ATP7B. No obstante, este documento no proporciona, ni se ha desvelado con posterioridad, información alguna sobre la eficacia terapéutica y el rendimiento del vector.
Por otro lado, se han probado varios vectores lentivíricos portadores de ATP7B de tipo silvestre en modelos animales de EW. Merle et al. [Sean. J. Gastroenterol. 2006; 41: 974-982] informaron de la terapia génica sistémica en ratas LEC con vectores lentivíricos con expresión de ATP7B bajo el control de un promotor de fosfogliceroquinasa. Veinticuatro semanas después de la transferencia génica, se redujo el contenido del cobre en el hígado significativamente, y la histología hepática mejoró en las ratas tratadas en comparación con los controles no tratados, pero el efecto fue solo parcial. La actividad de la ceruloplasmina oxidasa en suero aumentó dos semanas después de la transferencia de genes en comparación con los controles, sin embargo, disminuyó a niveles más bajos 24 semanas después del tratamiento. Más recientemente, Roybal et al. [Gene Therapy 2012; 19: 1085-1094] han informado sobre la transferencia temprana de genes gestacionales en ratones ATP7 ~-~ con un lentivirus portador de ATP7B humano bajo el control de la transcripción de un promotor específico del hígado que contenía elementos de apolipoproteína E y alfa-1 antitripsina. La administración en el útero del vector proporcionó una reducción en los niveles del cobre en el hígado, la preservación de la histología hepática normal, el restablecimiento de la incorporación del cobre a la ceruloplasmina y la mejora de la biosíntesis del colesterol. Sin embargo, la eficacia del tratamiento fue muy variable entre ratones y disminuyó con el tiempo y nunca logró la corrección completa de los diferentes parámetros patológicamente alterados. Huster et al. [J Biol Chem vol. 278, n.° 34, 22 de agosto de 2003, páginas 32212-32218] presentaron estudios relacionados con las funciones de los sitios de unión al cobre N-terminal en la actividad catalítica in vitro de la proteína de la enfermedad de Wilson.
Objeto de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. Los inventores han diseñado y ensayado varios vectores víricos portadores de transgenes codificantes de diferentes formas truncadas de la enzima ATP7B: por ejemplo, el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366), codificante de ATP7B(d223-366) [ATP7B-T1]; y el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), codificante de ATP7B(d57-486) [ATP7B-T2]. Cuando se administra a ratones con ATP7B inactivado (un modelo de animal reconocido de la enfermedad de Wilson), el vector de AAV portador de ATP7B-T2 corregía las principales características patológicas de la enfermedad de Wilson durante 24 semanas como mínimo después del tratamiento, mientras que el vector de AAV portador de ATP7B-T1 solo tenía un efecto parcial. La excreción de Cu (contenido de Cu en la orina) y el contenido de Cu en el hígado se redujeron significativamente en los ratones con la enfermedad de Wilson tratados con el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), y la actividad de ceruloplasmina se restableció significativamente. Por otro lado, la administración del vector produjo la normalización de los niveles de transaminasas en suero y de la histología hepática, junto con una notable reducción del infiltrado inflamatorio, de la proliferación de los conductos biliares y de la fibrosis.
Además, una dosis de 1 x 1010 gv/ratón del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B demostró ser una "dosis subóptima" para la construcción wt tanto para la obtención de una normalización de la actividad de ceruloplasmina en suero como para la reducción de la acumulación de Cu en el hígado (Figuras 10A y 11A); mientras que se demostró que el vector portador de la forma truncada proporciona efectos terapéuticos estadísticamente significativos (frente a no tratados) a dicha dosis subóptima (Figuras 10B y 11B). Por otra parte, la diferencia observada en la actividad entre las construcciones ATP7B y T2 de longitud completa a una dosis de 1 x 1010 gv/ratón era también estadísticamente significativa para estos dos efectos terapéuticos (Figuras 12 y 14).
Estas observaciones indicaron que tanto una construcción de ácido nucleico codificante de la forma truncada ATP7B(d57-486) como los vectores que la portan, en particular los vectores de AAV, permiten superar los efectos patológicos más relevantes de una acumulación de cobre asociada a una deficiencia o disfunción de ATP7B y, por lo tanto, puede ser muy adecuado para la terapia génica aplicada a una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, tal como la enfermedad de Wilson o una enfermedad y/o afección asociada con una disminución de la exocitosis lisosómica dependiente de ATP7B y la acumulación del cobre. Por otra parte, inesperadamente se demostró que la forma truncada ATP7B(d57-486) y los vectores que la portan, lograban la normalización de algunas de estas manifestaciones patológicas de la enfermedad en dosis en las que la proteína ATP7B de longitud completa y los vectores que la codifican demostraron ser menos efectivos.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la divulgación se refiere a una construcción de ácido nucleico (en adelante también denominada "construcción de ácido nucleico de la divulgación"), que comprende: a) una secuencia de nucleótidos de un promotor eucariota; b) una secuencia de nucleótidos codificante de una ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B) truncada en la cual los sitios asociados a metales pesados N-terminal HMA 1, HMA 2, HMA 3 y HMA 4 están totalmente eliminados y HMA 5 y HMA 6 permanecen sin eliminar; y c) una secuencia de señal de poliadenilación.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vector de expresión (en adelante, también denominado "vector de expresión de la divulgación"), que comprende una construcción de ácido nucleico de la divulgación.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una partícula vírica (en adelante, también denominada "partícula vírica de la divulgación"), que comprende una construcción nucleica o un vector de expresión de la divulgación. Preferiblemente, la construcción de ácido nucleico constituye la secuencia genómica del vector vírico.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un producto de la divulgación, es decir, un producto que comprende una construcción de ácido nucleico de la divulgación, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "producto de la divulgación", como se usa en el presente documento, se refiere a y cubre indistintamente cualquiera de entre: a) la construcción de ácido nucleico de la divulgación; b) el vector de expresión de la divulgación; c) la célula hospedadora de la divulgación; y d) la partícula vírica de la divulgación.
En otro aspecto, la divulgación se refiere adicionalmente a un kit que comprende una construcción de ácido nucleico, vector, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación en uno o más recipientes.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un producto de la divulgación para su uso en medicina (como medicamento o composición medicinal). Este uso en medicina incluye el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre. Dicho de otra manera, la divulgación se refiere: al uso de un producto de la divulgación en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre; y a un método de tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre en un sujeto o un paciente, que comprende administrar al sujeto o paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto de la divulgación. En un aspecto más particular, el producto de la divulgación se usa para el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
En otro aspecto, la divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un producto de la divulgación como se ha descrito anteriormente, para los usos propuestos en medicina y métodos terapéuticos descritos en el presente documento.
En un aspecto adicional más, la divulgación se refiere a un proceso de producción de partículas víricas de la divulgación que comprende las etapas de:
a) cultivar una célula hospedadora que contenga una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación en un medio de cultivo; y
b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.
En un aspecto relacionado, la presente divulgación se refiere al uso de la construcción de ácido nucleico de la divulgación o del vector de expresión de la divulgación para la producción de partículas víricas.
Descripción de las figuras
Figura 1: Representación esquemática de la construcción de ácido nucleico del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B que porta el ATP7B humano; el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) que porta la forma truncada ATP7B(d223-366) [ATP7B-T1]; y el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) que porta la forma truncada ATP7B(d57-486) [ATP7B-T2]. Los elementos de las construcciones son: a) promotor del gen alfa-1-antitripsina (AAT); b) secuencia de nucleótidos codificante respectivamente de ATP7B humano, ATP7B-T1 o ATP7B-T2; c) la señal de poliadenilación (pA) y que flanquea el genoma del vector d) las secuencias de repetición terminal invertida de AAV2 (ITR).
Figura 2: Niveles de alanina transaminasa (ALT) en suero en ratones macho de tipo silvestre [WT], ratones macho deficientes en ATP7B [ratones con enfermedad de Wilson, WD] y ratones macho WD tratados con los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; o AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Se administró una dosis de vector de 3 x1010 gv/ratón cuando los animales tenían 6 semanas de edad. Los niveles de ALT se midieron 4, 9, 14 y 24 semanas después del tratamiento [semanas] y se expresan como UI/l (UI: unidades internacionales). ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 3: Contenido total de cobre en orina en ratones de tipo silvestre [WT], ratones macho con la enfermedad de Wilson [WD] y ratones macho WD tratados con los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; o AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD ATP7B-T2]. Dosis de vector: 3 x 1010 gv/ratón. El contenido de cobre se midió 4, 9, 14 y 24 semanas después del tratamiento [semanas] en orina de 24 horas y se expresa como nanogramos de Cu (ng/24h).
Figura 4: Actividad ceruloplasmina en suero en ratones macho de tipo silvestre [WT], ratones macho con la enfermedad de Wilson [WD] y ratones macho WD tratados con los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; o AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD ATP7B-T2]. Dosis de vector: 3 x 1010 gv/ratón. La actividad de ceruloplasmina se midió 4 semanas después del tratamiento, y se expresa como la absorbancia medida a 570 nm de longitud de onda [Abs (570 nm)]. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 5. Contenido de cobre en el hígado en ratones de tipo silvestre [WT], ratones macho con la enfermedad de Wilson [WD] y ratones macho WD tratados con los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; o AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD ATP7B-T2]. Dosis de vector: 3 x 1010 gv/ratón. El contenido de cobre se determinó tras sacrificar a los animales 24 semanas después del tratamiento mediante espectroscopia de absorción atómica; y se expresa como jg /g (|jg de Cu/g de tejido hepático seco). ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 6: Imágenes histológicas de hígados de ratones macho de tipo silvestre [WT], ratones macho con la enfermedad de Wilson [WD] y ratones macho WD tratados con los vectores AAv2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; o AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD ATP7B-T2]. Dosis de vector: 3 x 1010 gv/ratón. Las imágenes se tomaron después de sacrificar a los animales (30 semanas de vida). A: Imágenes de cortes hepáticos teñidos con hematoxilina y eosina. B: Imágenes de muestras histológicas teñidas mediante la técnica de sulfuro de plata de Timm para la detección de depósitos del cobre.
Figura 7: Análisis de la inflamación del hígado, de la proliferación de los conductos biliares y de la fibrosis. Imágenes de hígados de ratones macho de tipo silvestre [WT], ratones macho con la enfermedad de Wilson [WD] y ratones macho WD tratados con los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV-ATP7B], AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [WD AAV-T1]; o AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD ATP7B-T2]. Dosis de vector: 3 x 1010 gv/ratón. El análisis se realizó tras sacrificar a los animales (30 semanas de vida). CD45: Imágenes de cortes hepáticos inmunoteñidos con anti-CD45 para detectar infiltrados inflamatorios del hígado. PANCK: Imágenes de cortes hepáticos inmunoteñidos con anti-PANCK para detectar la proliferación de los conductos biliares. RS: Imágenes de cortes hepáticos teñidos con Rojo Sirio para detectar la fibrosis.
Figura 8: Niveles de alanina transaminasa (ALT) en suero en ratones hembra de tipo silvestre [WT], ratones hembra con enfermedad de Wilson [WD] y ratones hembra WD tratados con el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Se administraron diferentes dosis de los vectores a diferentes grupos de ratones hembra WD de 6 semanas de edad (respectivamente 1 x 1010, 3 x 1010, 1 x 1011 gv/ratón). Los niveles de ALT se midieron 4, 9, 14 y 24 semanas después del tratamiento [semanas] y se expresan como UI/l. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 9: Niveles del contenido de cobre en orina en ratones hembra de tipo silvestre [WT], ratones hembra con enfermedad de Wilson [WD] y ratones hembra WD tratados con el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV-T2]. Se administraron diferentes dosis del vector a diferentes grupos de ratones hembra WD de 6 semanas de edad (respectivamente 1 x 1010, 3 x 1010, 1 x 1011 gv/ratón). Los niveles de cobre en orina se midieron 4, 9, 14 y 24 semanas después del tratamiento [Semanas] y se expresa como nanogramos de Cu en orina de 24 horas (ng/24 h). ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 10: La actividad de ceruloplasmina en suero se midió en ratones hembra de tipo silvestre [WT], ratones hembra con enfermedad de Wilson [WD] y ratones hembra WD tratados con el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD+AAV-T2] o el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD+AAV-ATP7B]. Para cada grupo experimental, se administraron diferentes dosis del vector a diferentes grupos de ratones hembra WD de 6 semanas de edad (respectivamente 1 x 1010, 3 x 1010, 1 x 1011 gv/ratón). La actividad de ceruloplasmina se midió 4 semanas después del tratamiento, y se expresa como la absorbancia medida a 570 nm de longitud de onda [Abs (570 nm)]. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 11: El contenido de cobre en hígado se midió en ratones hembra de tipo silvestre [WT], ratones hembra con enfermedad de Wilson [WD] y ratones hembra WD tratados con el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV ATP7B] o el vector AAV2/8-AAT-ATp7B(d57-486) [WD AAV T2]. Para cada grupo experimental, se administraron diferentes dosis del vector a diferentes grupos de ratones hembra WD de 6 semanas de edad (respectivamente 1 x 1010, 3 x 1010, 1 x 1011 gv/ratón). La concentración de cobre se midió 24 semanas después del tratamiento y se expresa como jg /g de tejido seco. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 12: Contenido de cobre en el hígado en ratones macho de tipo silvestre [WT, n = 15], ratones macho con enfermedad de Wilson [WD; n = 25] y ratones macho WD tratados con el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV ATP7B; n=7] o el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2; n = 7]. Para cada grupo experimental, se administraron a ratones WD una dosis subóptima del vector (1 x 1010 gv/ratón) cuando los animales tenían 6 semanas de edad. La concentración de cobre se midió 24 semanas después del tratamiento y se expresa como jg /g de tejido seco. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Figura 13: Contenido de cobre en el hígado en ratones macho de tipo silvestre [WT, n = 15], ratones macho con enfermedad de Wilson [WD; n = 25] y ratones macho WD tratados con el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2; n=13] o el vector AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) [WD AAV coT2; n = 4]. Para cada grupo experimental, se administraron a ratones macho WD de 6 semanas de edad una dosis subóptima del vector (1 x 1010 gv/ratón). La concentración de cobre se midió 24 semanas después del tratamiento y se expresa como jg/g de tejido seco. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney]. Figura 14: Actividad de ceruloplasmina en suero de ratones macho de tipo silvestre [WT, n = 15], ratones macho con enfermedad de Wilson [WD; n=25], y grupos de ratones macho WD tratados con uno de los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B [WD AAV ATP7B; n = 10], AAV2/8-AAT-coATP7B [WD AAV coATP7B; n = 8], AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [WD AAV T2; n=13] y AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) [WD AAV coT2; n = 4]. Para cada grupo experimental, se administraron a ratones macho WD de 6 semanas de edad una dosis subóptima del vector (1 x 1010 gv/ratón). La actividad oxidasa de ceruloplasmina se midió 4 semanas después del tratamiento, y se expresa como la absorbancia medida a 570 nm de longitud de onda [Abs (570 nm)]. ns: no significativo; *: p<0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].
Descripción detallada de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
Todos los términos que se usan en el presente documento en esta solicitud, a menos que se indique otra cosa, se entenderán en su significado habitual como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos y expresiones como se usan en la presente solicitud son como se exponen a continuación y se pretende que se apliquen de manera uniforme a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones a menos que una definición expuesta expresamente de otro modo proporcione una definición más amplia.
Las expresiones "secuencia de ácido nucleico" y "secuencia de nucleótidos" se pueden usar indistintamente para referirse a cualquier molécula compuesta de o que comprenda nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico puede ser un oligonucleótido o un polinucleótido. Una secuencia de nucleótidos puede ser un ADN o ARN. Una secuencia de nucleótidos puede ser modificada químicamente o artificial. Las secuencias de nucleótidos incluyen ácidos nucleicos peptídicos (ANP; en inglés, PNA), morfolinos y ácidos nucleicos bloqueados (ANB; en inglés, l Na ), así como ácidos nucleicos de glicol (ANG; en inglés, GNA) y ácido nucleico de treosa (ANT; en inglés, TNA). Cada una de estas secuencias se distingue del ADN o ARN de origen natural por los cambios en la estructura de la molécula. También, se pueden utilizar nucleótidos de fosforotioato. Otros análogos de desoxinucleótidos incluyen metilfosfonatos, fosforoamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforoamidatos y fosforotioatos de oligorribonucleótidos y sus análogos de 2'-0-alilo y metilfosfonatos de 2-0-metil-ribonucleótido, los cuales pueden utilizarse en un nucleótido de la divulgación.
La expresión "construcción de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico artificial producida a partir del uso de tecnología de ADN recombinante. Una construcción de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado para contener segmentos de secuencias de ácido nucleico, que se combinan y se yuxtaponen de una manera, que, de otro modo, no existiría en la naturaleza. Normalmente, una construcción de ácido nucleico es un "vector", es decir, una molécula de ácido nucleico que se usa para administrar ADN creado de manera exógena a una célula hospedadora.
La expresión "vector de expresión" o el término "vector", como se usan en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos recombinante que es capaz de efectuar la expresión de un gen (transgén) en células hospedadoras u organismos hospedadores compatibles con dichas secuencias. Junto con el transgén, los vectores de expresión normalmente incluyen al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas, y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción 3'. También puede haber factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, tales como elementos potenciadores de la expresión capaces de responder a una señal inductiva precisa (factores de transcripción endógenos o quiméricos) o específicos de determinadas células, órganos o tejidos.
El término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a mamíferos. Las especies de mamíferos que pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento divulgados incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos tales como simios; chimpancés; monos y orangutanes, animales domésticos, incluyendo perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, ganado bovino, cerdos, ovejas y cabras u otras especies de mamíferos que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsteres y similares.
La expresión "células de empaquetamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula o estirpe celular que puede transfectarse con un vector auxiliar o un virus o una construcción de ADN, y que proporciona en trans todas las funciones carentes que se requieren para la replicación completa y el empaquetamiento de un vector vírico. Normalmente, las células de empaquetamiento expresan de manera constitutiva o inducible una o más de dichas funciones víricas que faltan.
UNA CONSTRUCCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO DE LA DIVULGACIÓN
Secuencia de nucleótidos del promotor eucariota
Como se usa en el presente documento, la expresión "promotor eucariota" se refiere a una región de secuencia de ADN que inicia la transcripción de un determinado gen, o una o más secuencias de codificación, en células eucariotas. Un promotor puede funcionar en concierto con otras regiones o elementos reguladores para dirigir el nivel de transcripción del gen o la/s secuencia/s de codificación. Estos elementos reguladores incluyen, sin limitación, sitios de unión de factores de transcripción, sitios de unión de proteínas represoras y activadoras y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la materia para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor, incluyendo, por ejemplo, atenuadores, potenciadores y silenciadores. El promotor está ubicado cerca del sitio de inicio de la transcripción del gen o de la secuencia codificante a la que está unido operativamente, sobre la misma cadena y en dirección 5' de la secuencia de ADN (hacia la región 5' de la cadena codificante). Un promotor puede tener aproximadamente 100-1000 pares de bases de longitud. Las posiciones en un promotor se designan en relación con el sitio de inicio de la transcripción para un determinado gen (es decir, las posiciones en dirección 5' son números negativos que se cuentan desde -1, por ejemplo, -100 es una posición a 100 pares de bases en dirección 5').
La expresión "promotor central" o "promotor mínimo" se refiere a la parte mínima de una secuencia promotora requerida para iniciar adecuadamente la transcripción. Incluye el sitio de inicio de la transcripción (SIT) y elementos directamente en dirección 5'; un sitio de unión para la ARN polimerasa (ARN polimerasa II); y sitios de unión de factores de transcripción generales. Comúnmente, un promotor también comprende una secuencia de promotor proximal (en dirección 5' del promotor central), que contiene otros elementos reguladores primarios (tales como potenciadores, silenciadores, elementos límite/aislantes); y una secuencia promotora distal (en dirección 3' del promotor central), que puede contener elementos reguladores adicionales, normalmente, con una influencia más débil en el nivel de transcripción del gen.
De acuerdo con la divulgación, la secuencia promotora eucariota está unida operativamente a la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre truncada. Como se usa en el presente documento, la expresión "unido/a operativamente" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos (o polipéptidos) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia promotora o una secuencia reguladora de la transcripción está unida operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Unido/a operativamente significa que las secuencias de ADN que están unidas normalmente son contiguas; cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y en marco de lectura.
De acuerdo con la divulgación, la secuencia promotora eucariota de la construcción de ácido nucleico comprende al menos el promotor central y, opcionalmente, otras regiones o elementos reguladores del mismo gen o de genes diferentes (es decir, promotores híbridos o quiméricos).
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el promotor eucariota es un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible.
Como se usa en el presente documento, un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de los tejidos eucariotas en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo.
Un "promotor específico de tejido" es un promotor solo activo en tipos específicos de tejidos o células. Es decir, un promotor específico de tejido, en el ámbito de la presente divulgación, es uno que es más activo en uno o varios tejidos particulares (por ejemplo, dos, tres o cuatro) que en otros tejidos (es decir, el promotor es capaz de impulsar un mayor expresión de la secuencia codificante a la que está operativamente unida en el tejido o tejidos para los que es específica que en los demás). Normalmente, el gen en dirección 3' de un promotor "específico de tejido" es activo en un grado mucho mayor en el tejido o tejidos para los que el promotor es específico que en cualquier otro tejido o tejidos. En este caso, puede haber poca o sustancialmente ninguna actividad del promotor en cualquier tejido que no sea el o los tejidos para los que es específico.
Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológicamente o por desarrollo, p. ej., mediante la aplicación de un inductor químico.
En la técnica se conocen muchos promotores [Sambrook and Russell (Molecular Cloning: a Laboratory Manual"; tercera edición; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press); y Green y Sambrook ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual, cuarta edición, 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press)].
Los promotores específicos de tejido adecuados se pueden encontrar en la Base de datos de promotores específicos de tejido, TiProD (Nucleic Acids Research 2006; J4: D104-D107).
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el promotor eucariota es un promotor específico del hígado. En el ámbito de la presente divulgación, un "promotor específico del hígado" es un promotor que es más activo en el hígado que en otro cualquier otro tejido del cuerpo. Normalmente, la actividad de un promotor específico del hígado será considerablemente mayor en el hígado que en cualquier otro tejido. Por ejemplo, dicho promotor puede ser al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 veces más activo (por ejemplo, según lo determinado por su capacidad para impulsar la expresión en un tejido dado en comparación con su capacidad para impulsar la expresión en otras células o tejidos). En consecuencia, un promotor específico del hígado permite una expresión activa en el hígado del gen ligado a él e impide su expresión en otras células o tejidos.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el promotor eucariota es una secuencia de nucleótidos del promotor del gen a1-antitripsina (AAT), o una secuencia promotora quimérica EalbPaIAT que comprende una secuencia promotora del gen a1-antitripsina (AAT o PaIAT) combinada con un elemento potenciador del gen de la albúmina (Ealb). Ambas secuencias promotoras tienen propiedades de promotores específicos del hígado.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia promotora eucariota es la secuencia delimitada por las bases 156..460 de la SEQ.ID.NO.1 (AAT); o la SEQ.ID.NO.5 (EalbPaIAT).
ATPasa 2 transportadora del cobre truncada (ATP7B)
La ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B) es una ATPasa transportadora de cationes de tipo P que funciona exportando cobre de las células.
El gen que codifica la enzima humana se encuentra en el cromosoma 13 (ubicación del cromosoma 13q 14.3; nombre del gen ATP7B). Hay información sobre el polipéptido ATP7B humano (secuencias de aminoácidos, estructura, dominios y otras características) disponible, por ejemplo, en Uniprot con número de registro: P35670 (http://www.uniprot.org/uniprot/P35670; Versión de entrada 168 (3 de septiembre de 2014), Versión de secuencia 4 (16 de junio de 2009)). La información sobre el gen ATP7B codificante de esta enzima está disponible en Entrez con el número de registro ID del gen: 540 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/540; actualizado el 19 de septiembre de 2014). Se han descrito 4 isoformas producidas por cortes y empalmes alternativos para ATP7B; se escoge la isoforma 1 (identificador P35670-1, 1.465 aminoácidos de longitud) como secuencia canónica.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la construcción de ácido nucleico de la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una forma truncada de un ATP7B humano, preferentemente, un ATP7B humano cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia canónica (SEQ.ID.NO.2), también denominada en el presente documento wtATP7B.
Varios motivos conservados están presentes en ATP7B que son característicos de la familia de proteínas ATPasa de tipo P. Estos motivos son necesarios para la catálisis de ATP e incluyen el dominio de unión de nucleótidos (dominio N), el dominio de fosforilación (dominio P) y el dominio accionador (dominio A). En estos motivos están presentes residuos de firma muy conservados; SEHPL en el dominio N, DKTG en el dominio P y TGE en el dominio A. La cola amino terminal del ATP7B humano contiene "seis sitios de unión a metales" (MBS), también denominados indistintamente como sitios o dominios "asociados a metales pesados (HMA)", cada uno de los cuales contiene la secuencia central MxCxxC. Estos HMA se unen al Cu(I) en una estequiometría de un átomo de Cu(I) por HMA. Estos HMA amino-terminales de ATP7B son necesarios para varios aspectos de su función, incluyendo la translocación del cobre, incorporación del cobre en cuproenzimas, actividad ATPasa, la localización y el tráfico, y las interacciones proteína-proteína. Los sitios HMA se identifican comenzando en el extremo amino, como dominios HMA 1 (aminoácidos 59 - 125 en la secuencia canónica), HMA 2 (aminoácidos 144 - 210), HMA 3 (258 - 327), HMA 4 (360 -426), HMA 5 (489 - 555), y HMA 6 (565 - 631).
De acuerdo con la divulgación, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ATP7B truncado en el cual los sitios asociados a metales pesados N-terminal HMA 1, HMA 2, HMA 3, y HMA 4 están total o parcialmente eliminados.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de nucleótidos que codifica el ATP7B truncado mantiene los 56 aminoácidos de la secuencia de señal N-terminal de ATP7B.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la deleción en el ATP7B truncado comprende los aminoácidos 57 a 486 de la secuencia canónica.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de nucleótidos codifica un ATP7B truncado cuya secuencia de aminoácidos es la SEQ.ID.NO.7.
Debido a la redundancia de los codones, existen numerosas secuencias de nucleótidos que pueden generarse codificando polipéptidos ATP7B con la misma secuencia de aminoácidos.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre truncada es la secuencia codificante CDS de la SEQ.ID.NO.6, bases 473-3580.
En otra realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre truncada es la SEQ. ID. NO. 8, una secuencia con un sesgo de uso de codones optimizado para las células humanas.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre truncada es una secuencia en donde al menos 827, al menos 879, al menos 931 o al menos 983 de los codones codificantes de la ATPasa 2 transportadora del cobre truncada son idénticos a los codones de la secuencia codificante de la SEQ.ID.NO.8.
Secuencia de señal de poliadenilación
Como se usa en el presente documento, la expresión "señal de poliadenilación" o "señal de poli(A)" se refiere a una secuencia de reconocimiento específica dentro de la región 3' no traducida (UTR (UnTranslated Región) 3') del gen, que se transcribe en la molécula precursora de ARNm y guía la terminación de la transcripción del gen. La señal de poli(A) actúa como una señal para la escisión endonucleolítica del ARNm precursor recién formado en su extremo 3', y para la adición a este extremo 3' de un tramo de ARN que solo consiste en bases de adenina (proceso de poliadenilación; cola poli(A)). La cola poli(A) es importante para la exportación nuclear, la traducción y la estabilidad del ARNm. En el contexto de la divulgación, la señal de poliadenilación es una secuencia de reconocimiento que puede dirigir la poliadenilación de genes de mamíferos y/o genes víricos, en células de mamífero.
Las señales de poli(A) normalmente consisten en a) una secuencia de consenso AAUAAA, que se ha demostrado que es necesaria tanto para la escisión en el extremo 3' como para la poliadenilación del ARN pre-mensajero (pre-ARNm), así como para potenciar la terminación de la transcripción en dirección 3'; y b) elementos adicionales en dirección 5' y dirección 3' de AAUAAA que controlan la eficiencia de la utilización de AAUAAA como una señal de poli(A). Hay una considerable variabilidad en estos motivos en genes de mamíferos.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico de la divulgación es una secuencia de señal de poliadenilación de un gen de mamífero o un gen vírico. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen, entre otros, una señal de poliadenilación temprana de SV40, una señal de poliadenilación tardía de SV40, una señal de poliadenilación de timidina quinasa de HSV, una señal de poliadenilación del gen de protamina, una señal de poliadenilación del adenovirus 5 Elb, una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento, una señal de poliadenilación de PBGD, una señal de poliadenilación diseñada in silico (sintética) y similares.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico es una secuencia de señal de poli(A) sintética que también es capaz de dirigir y efectuar la escisión endonucleolítica y la poliadenilación del ARNm precursor procedente de la transcripción de la secuencia de nucleótidos codificante del ATP7B truncado.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la secuencia de señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico es la secuencia de señal de poli(A) sintética delimitada por las bases 4.877-4.932 de la SEQ.ID.NO.1.
Otros elementos nucleotídicos
En un aspecto, la construcción de ácido nucleico de la divulgación constituye el genoma recombinante de un vector de expresión para terapia génica, el vector de expresión de la divulgación; y, más concretamente, de un vector vírico para terapia génica.
Por tanto, en un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico de la divulgación comprende además una ITR 5' y una ITR 3' de un virus.
Como se usa en el presente documento, la expresión "repetición terminal invertida (ITR)" se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada en el extremo 5' (ITR 5') y una secuencia de nucleótidos ubicada en el extremo 3' (ITR 3') de un virus, que contiene secuencias palindrómicas y que puede plegarse para formar estructuras de horquilla en forma de T que funcionan como cebadores durante el inicio de la replicación del ADN. También son necesarias para la integración del genoma vírico en el genoma del hospedador; para el rescate del genoma del hospedador; y para la encapsidación de ácido nucleico vírico en viriones maduros. Las ITR se requieren en cis para la replicación del genoma del vector y su empaquetamiento en las partículas víricas.
En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5', una señal de empaquetamiento y y una ITR 3' de un virus. "La señal de empaquetamiento y " es una secuencia de nucleótidos de acción en cis del genoma del virus, que, en algunos virus (por ejemplo, adenovirus, lentivirus, etc.) es esencial para el proceso de empaquetamiento del genoma del virus en la cápside vírica durante la replicación.
En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5' y una ITR 3' de un virus seleccionado del grupo que consiste en parvovirus (en particular, virus adenoasociados), adenovirus, alfavirus, retrovirus (en particular, retrovirus gamma y lentivirus), virus del herpes y SV40; en un aspecto preferido, el virus es un virus adenoasociado (AAV), un adenovirus (Ad) o un lentivirus.
En la invención, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV, como se define en las reivindicaciones.
El genoma de AAV comprende una molécula de ADN lineal, monocatenaria, que contiene 4.681 bases (Berns y Bohenzky, (1987) "Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307). El genoma incluye repeticiones terminales invertidas (ITR) en cada extremo que funcionan en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR tienen aproximadamente 145 pb de longitud. La parte interna no repetida del genoma incluye dos grandes marcos abiertos de lectura, conocidos como los genes rep y cap de AAV, respectivamente. Estos genes codifican las proteínas víricas que participan en la replicación y en el empaquetamiento del virión. En particular, se sintetizan al menos cuatro proteínas víricas a partir del gen rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, nombradas de acuerdo con su peso molecular aparente. El gen cap de AAV codifica al menos tres proteínas, V p l, VP2 y VP3. Para una descripción detallada del genoma de AAV, véanse, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129.
La construcción de viriones de AAV recombinantes se conoce en general en la técnica, y se ha descrito, por ejemplo, en los documentos US 5.173.414 y US 5.139.941; documento WO 92/01070, documento WO 93/03769, (Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) "Vaccines 90" (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; y Kotin, R. M. (1994) "Human Gene Therapy" 5:793-801.
La divulgación puede llevarse a cabo usando ITR de cualquier serotipo de AAV, incluyendo AAV1, AAV2, AAV3 (incluyendo los tipos 3A y 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino y cualquier otro serotipo de AAV conocido en la actualidad o que se descubra más adelante.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en un AAV1, un a AV2 y un AAV4. En una realización preferida, la construcción de ácido nucleico comprende las secuencias de ITR delimitadas por las bases 1..141 y las bases 4.968..5.107 de SEQ.ID.NO.1, que son las secuencias de ITR de un AAV2.
Las ITR son los únicos elementos víricos del AAV que se requieren en cis para la replicación del genoma de AAV y su empaquetamiento en las partículas víricas.
En un aspecto, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5', una señal de empaquetamiento y y una ITR 3' de un adenovirus de cualquiera de los serotipos dentro de cualquiera de los subgrupos de clasificación (A-F). En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, esta secuencias ITR 5', de la señal y e ITR 3' proceden de un adenovirus del subgrupo C, más preferentemente, de un adenovirus de serotipo 2 (Ad2) o serotipo 5 (Ad5).
Por otro lado, en otros aspectos, la divulgación puede llevarse a cabo usando ITR 5' y/o ITR 3' sintéticas; y también mediante el uso de una ITR 5' y una ITR 3' procedente de virus de diferentes serotipos.
Todos los demás genes víricos necesarios para la replicación del vector vírico pueden proporcionarse en trans dentro de las células productoras de virus (células de empaquetamiento) como se describe a continuación. Por lo tanto, su inclusión en la construcción de ácido nucleico de un genoma de vector vírico de acuerdo con la divulgación es opcional.
En la invención, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el vector de expresión es un vector de AAV, como se define en las reivindicaciones.
En una realización particular, la construcción de ácido nucleico de la divulgación constituye un vector de AAV seleccionado del grupo de combinaciones que consiste en
a) un vector que comprende secuencias de nucleótidos de una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV2, una secuencia de promotor de AAT, y una secuencia de nucleótidos codificante de un ATP7B(d57-486) humano truncado;
b) un vector que comprende secuencias de nucleótidos de una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV2, una secuencia de promotor de AAT, y la secuencia de nucleótidos con optimización de codones SEQ.ID.NO.8 codificante de un ATP7B(d57-486) humano truncado;
c) un vector que comprende secuencias de nucleótidos de una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV2, una secuencia de promotor híbrido EalbPa1AT, y una secuencia de nucleótidos codificante de un ATP7B(d57-486) humano truncado; y
d) un vector que comprende secuencias de nucleótidos de una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV2, una secuencia de promotor híbrido EalbPa1AT, y una secuencia de nucleótidos con optimización de codones SEQ.ID.NO.8 codificante de un ATP7B(d57-486) humano truncado.
Cada una de estas realizaciones de vector de AAV también incluye una secuencia de señal de poliadenilación, tal como una secuencia de señal poli(A) sintética de SEQ. ID. NO. 1 o cualquier otra señal poli(A) adecuada; juntas o no con otros elementos nucleotídicos opcionales.
En otro aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el vector de expresión es un vector adenovírico. Este vector adenovírico de acuerdo con la divulgación puede ser, en particular, un adenovirus de primera, segunda o tercera generación [véase Adenovirus. Methods and Protocols". Chillon M. y Bosch A. (Eds); Tercera Edición; 2014 Springer] o cualquier otro sistema de vectores adenovíricos ya conocido o descrito más adelante.
En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el vector vírico de la divulgación es un "adenovirus de tercera generación", que también puede denominarse "adenovirus cobardes", "adenovirus dependiente de auxiliar (HD-Ad)" o "adenovirus de alta capacidad (HC-Ad)". Un adenovirus de tercera generación tiene todas las regiones codificantes víricas eliminadas ("cobarde"); depende de un adenovirus auxiliar para replicarse (dependiente del auxiliar); y puede transportar y administrar a la célula hospedadora inserciones de hasta 36 Kpb de material genético foráneo (alta capacidad). Un adenovirus "cobarde" mantiene las repeticiones terminales invertidas ITR (5' y 3') y la señal de empaquetamiento (y ).
La construcción de ácido nucleico y el vector de expresión de la divulgación que se describen en el presente documento se pueden preparar y obtener mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia: Sambrook y Russell ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual"; tercera edición; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press); y Green y Sambrook ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual"; Cuarta Edición; 20 l2 Cold Spring Harbor Laboratory Press).
UNA PARTICULA VÍRICA DE LA DIVULGACIÓN DE LA TERAPIA GÉNICA
La expresión "partícula vírica" y el término "virión" se usan en el presente documento indistintamente, y se refieren a una partícula de virus infecciosa y normalmente defectuosa en la replicación que comprende el genoma vírico (es decir, la construcción de ácido nucleico del vector vírico de expresión) empaquetado dentro de una cápside y, según sea el caso, una envoltura lipídica que rodea la cápside.
En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el virión de la divulgación es un "virión de AAV recombinante" o "virión de rAAV" obtenido mediante el empaquetamiento de una construcción de ácido nucleico de un vector de AAV de acuerdo con la divulgación en una cubierta de proteína.
Las proteínas de la cápside vírica de un virus adenoasociado (proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3) se generan a partir de un solo gen vírico (gen cap). Las diferencias entre las secuencias de proteínas de cápside de los diferentes serotipos de AAV dan lugar al uso de diferentes receptores de superficie celular para la entrada celular. Junto con vías alternativas de procesamiento intracelular, esto da lugar a distintos tropismos tisulares para cada serotipo del AAV.
En una realización particular, se puede preparar un virión de AAV recombinante de acuerdo con la divulgación mediante la encapsulación de la construcción de ácido nucleico de un vector/genoma de AAV derivado de un determinado serotipo de AAV en una partícula vírica formada por proteínas Cap naturales que corresponden a un AAV de ese mismo serotipo en particular. No obstante, se han desarrollado varias técnicas para modificar y mejorar las propiedades estructurales y funcionales de las partículas víricas de AAV de origen natural (Bunning H. et al. J Gene Med 2008; 10: 717-733). Por tanto, en otra partícula vírica de AAV de acuerdo con la divulgación, se puede empaquetar la construcción de nucleótidos del vector vírico flanqueado por ITR/s de un serotipo de AAV dado, por ejemplo, en: a) una partícula vírica constituida por proteínas de cápside derivadas del mismo o diferente serotipo de AAV [por ejemplo, ITR de AAV2 y proteínas de cápside de AAV5; ITR de AAV2 y proteínas de la cápside de AAV8; etc.]; b) una partícula vírica de mosaico constituida por una mezcla de proteínas de la cápside de diferentes serotipos o mutantes de AAV [por ejemplo, ITR de AAV2 con proteínas de la cápside de AAV1 y AAV5]; c) una partícula vírica quimérica constituida por proteínas de cápside que se han truncado mediante el intercambio de dominios entre diferentes serotipos o variantes de AAV [por ejemplo, ITR de AAV2 con proteínas de cápside de AAV5 con dominios de AAV3]; o d) una partícula vírica dirigida diseñada para mostrar dominios de unión selectiva, permitiendo una interacción restrictiva con receptores específicos de células diana [por ejemplo, ITR de AAV4 con proteínas de la cápside de AAV2 truncadas genéticamente mediante la inserción de un ligando peptídico; o proteínas de la cápside de AAV2 no modificadas genéticamente mediante el acoplamiento de un ligando peptídico a la superficie de la cápside].
El experto apreciará que el virión de AAV de acuerdo con la divulgación puede comprender proteínas de la cápside de cualquier serotipo de AAV. En una realización, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la partícula vírica comprende proteínas de la cápside de un AAV. En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la partícula vírica de AAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en un AAV1, un AAV5, un AAV7, un a AV8 y un AAV9, que son más adecuados para la administración a las células hepáticas (Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414­ 1421; Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73). En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la partícula vírica comprende una construcción de ácido nucleico de la divulgación en donde las secuencias de ITR 5' y ITR 3' de la construcción de ácido nucleico son de un serotipo de AAV2 y las proteínas de la cápside son de un serotipo de AAV8.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la partícula vírica de AAV comprende proteínas de la cápside de Anc80, un ancestro predicho de los serotipos víricos de AAV 1, 2, 8 y 9, que se comporta como un vector de terapia génica altamente potente dirigido al hígado, el músculo y la retina (Zinn et al. Cell Reports 2015; 12:1-13). En una realización más particular, la partícula vírica comprende la proteína de la cápside VP3 Anc80L65 (número de registro del Genbank: KT235804).
Las interacciones entre el virus y el glicano son determinantes críticos de la invasión de la célula hospedadora. En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la partícula vírica de AAV comprende proteínas de la cápside que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos, en donde las sustituciones introducen un nuevo sitio de unión de glicano en la proteína de la cápside de AAV. En una realización más particular, las sustituciones de aminoácidos están en el aminoácido 266, aminoácidos 463-475 y aminoácidos 499-502 de AAV2 o las posiciones de aminoácidos correspondientes de AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV 8, AAV9, AAV10 o cualquier otro serotipo de AAV, Anc80 y Anc80L65 también incluidos.
El nuevo sitio de unión de glicano introducido puede ser un sitio de unión de hexoxa [por ejemplo, un sitio de unión de una galactosa (Gal), una manosa (Man), una glucosa (Glu) o una fucosa (fuc)]; un sitio de unión de ácido siálico (Sia) [por ejemplo, un resto Sia tal como ácido W-acetilneuramínico (NeuSAc) o ácido W-glicolilneuramínico (NeuSGc)]; o un sitio de unión de disacárido, en donde el disacárido es un ácido siálico unido a galactosa, por ejemplo, en forma de Sia(alfa2,3)Gal o Sia(alfa2,6)Gal. Se proporciona una guía detallada para introducir un nuevo sitio de unión de un serotipo de AAV en una proteína de la cápside de un AAV de otro serotipo en la publicación de patente internacional WO2014144229 y en Shen et al. (J. Biol. Chem. 2013; 288(40):28814-28823). En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, el sitio de unión de Gal de AAV9 se introduce en la cadena principal de VP3 de AAV2, produciendo una cepa de AAV de unión a glicano doble que puede usar receptores de HS y Gal para la entrada celular. Preferiblemente, dicha cepa de AAV de unión a glicano doble es AAV2G9. Shen et al. generaron AAV2G9 mediante la sustitución de restos de aminoácidos directamente implicados en y que flanquean inmediatamente el sitio de reconocimiento de Gal sobre la subunidad de la proteína de la cápside VP3 de AAV9 en los restos correspondientes de la región de codificación de la subunidad VP3 de AAV2 (numeración Q464V de VP3 de AAV2, A467P, D469N, I470M, R471A, D472V, S474G, Y500F e S501A).
En otro aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el virión de la divulgación es un virión adenovírico, tal como un virión de Ad5. Como es el caso de los viriones de AAV, las proteínas de la cápside de los viriones de Ad también pueden diseñarse para modificar su tropismo y sus propiedades de direccionamiento celular, también se pueden emplear serotipos adenovíricos adicionales.
Producción de partículas víricas
La producción de partículas víricas portadoras de la construcción de ácido nucleico del vector vírico de expresión de la divulgación puede realizarse mediante métodos y protocolos convencionales, que se seleccionan teniendo en cuenta las características estructurales escogidas para la realización real de la construcción de ácido nucleico y la partícula vírica del vector que se vaya a producir.
En resumen, se pueden producir partículas víricas en una célula específica productora de virus (célula de empaquetamiento) que se transfecta con la construcción de ácido nucleico del vector que se vaya a empaquetar, en la presencia de un vector auxiliar o virus u otra(s) construcción(ones) de ADN.
En consecuencia, en un aspecto, la divulgación se refiere al uso de la construcción de ácido nucleico o vector de expresión de la divulgación para la producción de partículas víricas.
En un aspecto relacionado, la divulgación se refiere a un proceso de producción de partículas víricas de la divulgación que comprende las etapas de:
a) cultivar una célula hospedadora que comprenda una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación en un medio de cultivo; y
b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.
Preferiblemente, dicha célula hospedadora es una célula de empaquetamiento, como se describe a continuación. Los medios de cultivo adecuados serán conocidos por un experto en la materia. Los ingredientes que componen dichos medios pueden variar según el tipo de célula que se vaya a cultivar. Además de la composición de nutrientes, la osmolaridad y el pH se consideran parámetros importantes de los medios de cultivo. El medio de crecimiento celular comprende diversos ingredientes bien conocidos por el experto en la materia, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, fuentes de carbohidratos, lípidos, oligoelementos (CuS04, FeS04, Fe(N03)3, ZnS04, etc.), estando cada ingrediente presente en una cantidad que mantiene el cultivo de una célula in vitro (es decir, la supervivencia y el crecimiento de las células). Los ingredientes también pueden incluir diferentes sustancias auxiliares, tales como sustancias tampón (como bicarbonato de sodio, Hepes, Tris, etc.), estabilizadores de la oxidación, estabilizadores para contrarrestar el estrés mecánico, inhibidores de proteasas, factores de crecimiento animales, hidrolizados vegetales, agentes antiaglomerantes, agentes antiespumantes. Las características y composiciones de los medios de crecimiento celular varían dependiendo de las necesidades celulares en particular. Son ejemplos de medios de crecimiento celular disponibles en el mercado: MEM (medio esencial mínimo), BME (Basal Médium Eagle, medio de Eagle basal), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Médium, Medio de Eagle modificado por Dulbecco), DMEM de Iscove (modificación de Iscove del medio de Dulbecco), GMEM, RPMI 1640, Leibovitz L-15, CHO, medio de McCoy, Medio 199, HEK293, Ham (medio de Ham), F10 y derivados, Ham F12, DMEM/F12, etc.
UNA CÉLULA HOSPEDADORA DE LA DIVULGACIÓN
En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación.
La expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier estirpe celular que es susceptible a la infección por un virus de interés y que se puede cultivar in vitro.
La célula hospedadora de la divulgación puede usarse para fines de terapia génica ex vivo. En dichos aspectos, las células se transfectan con la construcción de ácido nucleico o el vector vírico de la divulgación y, posteriormente, se trasplantan al paciente o sujeto. Las células trasplantadas pueden tener un origen autólogo, alogénico o heterólogo. Para uso clínico, el aislamiento celular generalmente se llevará a cabo según las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF). Antes del trasplante, normalmente se comprueba la calidad celular y la ausencia de microbios u otros contaminantes y se puede llevar a cabo un preacondicionamiento del hígado, tal como con radiación y/o un tratamiento inmunosupresor. Además, las células hospedadoras pueden ser trasplantadas junto con factores de crecimiento para estimular la proliferación y/o diferenciación celular, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, Hepatocyte Growth Factor).
En un aspecto particular, la célula hospedadora se usa para terapia génica ex vivo en el hígado. Preferiblemente, dichas células son células eucariotas tales como células de mamíferos, éstos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos tales como simios; chimpancés; monos y orangutanes, animales domésticos, incluyendo perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, ganado bovino, cerdos, ovejas y cabras u otras especies de mamíferos que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsteres y similares. Un experto en la materia escogerá las células más apropiadas según el paciente o sujeto en el que se vaya a realizar el trasplante.
Dicha célula hospedadora puede ser una célula con propiedades de autorrenovación y pluripotencia, tales como células madre o células madre pluripotentes inducidas. Las células madre son preferentemente células madre mesenquimales. Las células madre mesenquimales (MSC, Mesenchymal Stem Cell) son capaces de diferenciarse en al menos uno de entre un osteoblasto, un condrocito, un adipocito o un miocito, y pueden aislarse de cualquier tipo de tejido. En general, las MSC se aislarán de la médula ósea, tejido adiposo, del cordón umbilical o de la sangre periférica. Los métodos de obtención de las mismas son bien conocidos por un experto en la materia. Las células madre pluripotentes inducidas (también conocidas como células iPS o iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) son un tipo de célula madre pluripotente que puede generarse directamente a partir de células adultas. Yamanaka et al. indujeron células iPS mediante la transferencia de los genes Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc a fibroblastos de ratón y humanos, y forzando a las células a expresar los genes (documento WO 2007/069666). Thomson et al. produjeron posteriormente células iPS humanas usando Nanog y Lin28 en lugar de Klf4 y c-Myc (documento WO 2008/118820).
Dichas células hospedadoras también pueden ser hepatocitos. Los procedimientos de trasplante de hepatocitos, incluyendo el aislamiento de células y el posterior trasplante a un receptor humano o ratón se describe por ejemplo en Filippi y Dhawan, Ann NY Acad Sci. 2014, 131550-55; Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660; Irani et al. Molecular Therapy 2001, 3:3, 302-309; y Vogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176. Un método para la transducción ex vivo de un vector vírico en hepatocitos se describe por ejemplo en Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982.
En otro aspecto particular, la célula hospedadora es una célula de empaquetamiento. Dichas células pueden ser células adherentes o en suspensión. La célula de empaquetamiento y la construcción de vector auxiliar, o de ADN proporcionan juntas en trans todas las funciones que faltan que son necesarias para la replicación completa y el empaquetamiento del vector vírico.
Preferiblemente, dichas células de empaquetamiento son células eucariotas tales como células de mamífero, incluyendo células de simio, humanos, de perro y de roedor. Son ejemplos de células humanas las células PER.C6 (documento WO01/38362), MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células HEK-293 (ATCC CRL-1573), células HeLa (ATCC CCL2) y células pulmonares fetales de macaco (ATCC CL-160). Son ejemplos de células de primate no humano las células Vero (a Tc C CCL81), células COS-1 (ATCC CRL-1650) o células COS-7 (ATCC CRL-1651). Son ejemplos de células de perro las células MDCK (ATCC CCL-34). Son ejemplos de células de roedor las células de hámster, tales como BHK21-F, células HKCC o células CHO.
Como alternativa a las fuentes de mamífero, las estirpes celulares para su uso en la divulgación pueden derivarse de fuentes aviares tales como el pollo, pato, ganso, codorniz o faisán. Los ejemplos de estirpes celulares aviares incluyen células madre embrionarias aviares (documentos WO01/85938 y WO03/076601), células de retina de pato inmortalizadas (documento WO2005/042728) y células derivadas de células madre embrionarias aviares, incluyendo células de pollo (documento WO2006/108846) o células de pato, tales como la estirpe celular EB66 (documentos WO2008/129058 y WO2008/142124).
En otro aspecto, dicha célula hospedadora son células de insecto, tales como las células SF9 (ATCC CRL-1711), células Sf21 (IPLB-Sf21), células MG1 (BTI-TN-MG1) o células High Five™ (BTI-TN-5B1-4).
En consecuencia, en un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la célula hospedadora comprende:
a) una construcción de ácido nucleico o vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante), en general, como un plásmido;
b) una construcción de ácido nucleico, en general, un plásmido, que codifica los genes rep y/o cap de AAV que no lleva(n) las secuencias de ITR; y/o
c) una construcción de ácido nucleico, en general, un plásmido o un virus, que comprende genes auxiliares víricos.
Los genes víricos necesarios para la replicación de AAV se denominan en el presente documento genes auxiliares víricos. Normalmente, dichos genes necesarios para la replicación de AAV son genes auxiliares adenovíricos, tales como E1A, E1B, E2a, E4 o ARN de VA. Preferiblemente, los genes auxiliares adenovíricos son del serotipo Ad5 o Ad2.
Se pueden usar métodos convencionales para producir partículas víricas del vector de AAV, que consisten en la transfección conjunta de células transitorias con una construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) portador del vector/genoma de AAV recombinante de la divulgación; una construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido auxiliar de AAV) que codifica genes rep y cap, pero no portadora de secuencias de ITR; y con una tercera construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) que proporciona las funciones adenovíricas necesarias para la replicación de AAV. Por tanto, en un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más de las características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, dicha célula hospedadora se caracteriza por comprender:
i) una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante);
ii) una construcción de ácido nucleico codificante de los genes rep y cap de AAV, no portadora de las secuencias de ITR; y
iii) una construcción de ácido nucleico que comprende genes auxiliares adenovíricos.
Como alternativa, los genes rep, cap y auxiliares adenovíricos se pueden combinar en un solo plásmido (Blouin V. et al. J Gene Med. 2004; 6 (supl): S223-S228; Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850). Por tanto, en otro aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más de las características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, dicha célula hospedadora se caracteriza por comprender:
i) una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante); y
ii) un plásmido codificante de los genes rep y cap de AAV no portador de las secuencias de ITR y que además comprende genes auxiliares adenovíricos.
En un aspecto particular adicional, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la célula hospedadora comprende:
a) una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante);
b) un plásmido codificante de los genes rep y cap de AAV no portador de las secuencias de ITR; y
c) un plásmido que comprende genes auxiliares adenovíricos E2a, E4 y ARN de AV,
en donde la transfección conjunta se realiza en células, preferentemente, células de mamífero, que expresan constitutivamente y transcomplementan el gen adenovírico e 1, como las células HEK-293 (ATCC CRL-1573).
La producción a gran escala de vectores de AAV de acuerdo con la divulgación también se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la infección de células de insecto con una combinación de baculovirus recombinantes (Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943). Las células SF9 se infectan conjuntamente con tres vectores de baculovirus que expresan respectivamente rep de AAV, cap de AAV y el vector de AAV que se va a empaquetar. Los vectores de baculovirus recombinantes proporcionarán las funciones del gen auxiliar vírico necesarias para la replicación y/o el empaquetamiento del virus.
Mediante el uso de plásmidos auxiliares que codifican el ORF de rep (Open Reading Frame, marco de lectura abierto) de un serotipo de a Av y el ORF de cap de un serotipo de AAV diferente, es factible empaquetar un vector flanqueado por ITR de un serotipo de AAV dado en viriones ensamblados a partir de proteínas estructurales de la cápside de un serotipo diferente. También es posible, mediante este mismo procedimiento empaquetar vectores de mosaico, quiméricos o dirigidos.
Por otro lado, la producción de vectores de HC-Ad de acuerdo con la divulgación puede llevarse a cabo por medio de células de mamífero que expresan constitutivamente y transcomplementan el gen adenovírico E1, y también la Cre recombinasa (por ejemplo, células 293Cre). Estas células se transfectan con el genoma del vector de HC-Ad y se infectan con un virus auxiliar adenovírico de primera generación (con E1 eliminado) en el que la señal de empaquetamiento está flanqueada por secuencias de loxP. [Parks R. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1996; 13565-13570; para células 293Cre, véase Palmer y Engel. Mol. Ther. 2003; 8:846-852]. Se han descrito varios sistemas de virus auxiliares basados en Cre/loxP que se pueden usar para empaquetar vectores de HC-Ad, tales como AdAdlC8cluc o el virus auxiliar AdTetCre auto-inactivador optimizado (documento EP2295591; Gonzalez-Aparicio et al. Gene Therapy 2011; 18: 1025-1033).
Se puede encontrar orientación adicional para la construcción y producción de vectores víricos para terapia génica de acuerdo con la divulgación en:
"Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols". Serie: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten y Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer).
Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag.
Heilbronn R. y Weger S. "Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics". En: "Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology", 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pág. 143-170.
"Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols". R. O. Snyder y P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer).
Bünning H. et al. "Recent developments in adeno-associated virus technology". J. Gene Med. 2008; 10:717-733.
"Adenovirus: Methods and Protocols". M. Chillon y A. Bosch (Eds.); Tercera edición. 2014 Humana Press (Springer).
USOS TERAPÉUTICOS
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al producto de la divulgación como se define en el Sumario para su uso como un medicamento.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al producto de la divulgación como se define en el Sumario para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o una disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, y de cualquier otra afección y enfermedad en la que una regulación positiva de la expresión y de la actividad de la ATPasa 2 transportadora del cobre pueda producir un beneficio terapéutico o una mejora terapéutica, en particular, una enfermedad o afección asociadas con una disminución de la exocitosis lisosómica dependiente de ATP7B y la acumulación del cobre en los lisosomas, tales como trastornos coleostáticos, enfermedad de Alzheimer y/o cáncer (Polishchuck et al. Dev Cell. 2014, 29(6), 686-700; Gupta y Lutsenko, Future Med. Chem. 2009, 1, 11251142).
El sujeto que se va a tratar puede ser un mamífero, y en particular, un paciente humano.
En una realización particular, opcionalmente en combinación con una o más características de las diversas realizaciones descritas anteriormente o a continuación, la afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa transportadora del cobre es la enfermedad de Wilson (EW, número de registro del catálogo en línea "Mendelian Inheritance in Man catalog" OMIN 277900; http://www.omim.org/entry/277900).
En un aspecto relacionado, la divulgación se refiere al uso del producto de la divulgación, como se define en el Sumario, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, y de cualquier otra afección y enfermedad en la que una regulación positiva de la expresión y actividad de la ATPasa 2 transportadora del cobre pueda producir un beneficio terapéutico o mejora, preferentemente, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, y de cualquier otra afección y enfermedad en la que una regulación positiva de la expresión y actividad de la ATPasa 2 transportadora del cobre pueda producir un beneficio terapéutico o una mejora terapéutica, preferentemente, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson, en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción de ácido nucleico, un vector de expresión, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación.
El tratamiento con un producto de la divulgación puede aliviar, mejorar o reducir la gravedad de uno o más síntomas de la EW. Por ejemplo, el tratamiento puede aumentar y/o restablecer la síntesis de holoceruplasmina, la actividad de ceruloplasmina oxidasa y/o la excreción del cobre en la bilis (reduciendo así la acumulación del cobre en suero, hígado, cerebro y orina); y, por consiguiente, puede aliviar, mejorar o reducir la gravedad del dolor abdominal, cansancio, ictericia, frecuencia de movimientos incontrolados, rigidez muscular, problemas con el habla, deglución o coordinación física.
El producto de la divulgación normalmente se incluirá en una composición farmacéutica o un medicamento, opcionalmente en combinación con un vehículo, diluyente y/o adyuvante farmacéutico. Dicha composición o dicho producto medicinal comprende el producto de la divulgación en una cantidad eficaz, suficiente para proporcionar un efecto terapéutico deseado, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En consecuencia, en un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico, un vector de expresión, una célula hospedadora o una partícula vírica de la divulgación, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se puede usar cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado en la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación (véase, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, abril de 1997). Las composiciones farmacéuticas normalmente son estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma de soluciones (por ejemplo, solución salina, solución de dextrosa o solución tamponada, u otros fluidos estériles farmacéuticamente aceptables), microemulsiones, liposomas u otra estructura ordenada adecuada para aceptar una alta concentración de producto (por ejemplo, micropartículas o nanopartículas). El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina. El producto de la divulgación puede administrarse en una formulación de liberación controlada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta u otros vehículos que protejan al producto contra la liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar, por ejemplo, polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos/poliglicólicos (PLG). Preferiblemente, dicha composición farmacéutica se formula como una solución, más preferentemente, como una solución salina opcionalmente tamponada.
Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas de la divulgación. En el Compendio de Productos Farmacéuticos y Especialidades (CPS; del inglés, Compendium of Pharmaceutical and Specialties) de la Asociación Canadiense de Farmacéuticos, por ejemplo, se puede encontrar orientación sobre la administración conjunta de terapias adicionales.
En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica de la divulgación es una composición farmacéutica parenteral, incluyendo una composición adecuada para administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Estas composiciones farmacéuticas son solo ilustrativas y no limitan las composiciones farmacéuticas adecuadas para otras vías de administración parenterales y no parenterales.
En el contexto de la divulgación, una "cantidad eficaz" significa una cantidad terapéuticamente eficaz.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado, tal como una elevación de la actividad de translocación del cobre, aumentando así el cobre en la bilis y reduciendo el cobre en el suero, el hígado, el cerebro y la orina. La cantidad terapéuticamente eficaz del producto de la divulgación, o la composición farmacéutica que lo comprende, puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del producto o de la composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es normalmente aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del producto o de la composición farmacéutica se ve compensado por los efectos beneficiosos terapéuticamente.
En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica que lleva el producto de la divulgación se administra al sujeto o paciente por vía parenteral.
En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular.
En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica que comprende un producto de la divulgación se administra por vía intersticial, es decir, por inyección a o en los intersticios de un tejido. La diana tisular puede ser específica, por ejemplo, tejido del hígado, o puede ser una combinación de varios tejidos, por ejemplo, los tejidos musculares y hepáticos. Las dianas tisulares ilustrativas pueden incluir hígado, músculo esquelético, músculo del corazón, depósitos adiposos, riñón, pulmón, endotelio vascular, células epiteliales y/o hematopoyéticas. En un aspecto preferido, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, se administra por inyección intrahepática, es decir, inyección en el espacio intersticial del tejido hepático.
La cantidad de producto de la divulgación que se administra al sujeto o paciente puede variar dependiendo de las circunstancias particulares de cada sujeto/paciente, incluyendo, la edad, el sexo y el peso del individuo; la naturaleza y el estadio de la enfermedad, la agresividad de la enfermedad; la vía de administración; y/o la medicación concomitante que se haya recetado al sujeto o paciente. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima.
Para cualquier sujeto en particular, las pautas posológicas específicas pueden ajustarse con el tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son solo ilustrativos y no limitan los intervalos de dosificación que puedan seleccionar los médicos.
En una realización, se puede administrar un vector de AAV de acuerdo con la divulgación al sujeto o paciente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson en una cantidad o dosis comprendida dentro de un intervalo de 5 x 1011 a 1 x 1014 gv/kg (gv: genomas víricos; kg: peso corporal del sujeto o del paciente). En una realización más particular, el vector de AAV se administra en una cantidad comprendida dentro de un intervalo de 1 x 1012 a 1 x 1013 gv/kg.
En otro aspecto, se puede administrar un vector de HC-Ad de acuerdo con la divulgación al sujeto o paciente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson en una cantidad o dosis comprendida dentro de un intervalo de 1 x 109 a 1 x 1011 UI/kg (UI: unidades infecciosas del vector).
En otro aspecto, la divulgación se refiere adicionalmente a un kit que comprende una construcción de ácido nucleico, vector, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación en uno o más recipientes. Un kit de la divulgación puede incluir instrucciones o materiales de empaquetamiento que describen cómo administrar una construcción de ácido nucleico, vector, una célula hospedadora o una partícula vírica de la divulgación contenida dentro del kit a un paciente. Los recipientes del kit pueden ser de cualquier material adecuado, por ejemplo, vidrio, plástico, metal, etc., y de cualquier tamaño, forma o configuración adecuados. En ciertas realizaciones, los kits pueden incluir una o más ampollas o jeringas que contengan una construcción de ácido nucleico, vector, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación en una forma líquida o en solución adecuada.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones, el término "comprende" y sus variaciones, no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra "comprende" abarca el caso de "consiste en". Objetos adicionales, ventajas y características de la divulgación serán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la divulgación. Además, todas las combinaciones posibles de realizaciones particulares y preferidas se describen en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1. Construcción de vectores de expresión recombinantes
Se diseñaron y produjeron cinco vectores AAV diferentes que portan y expresan el ATP7B humano o una forma truncada de ATP7B humano para realizar la terapia génica de la enfermedad de Wilson (WD): AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-coATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366), AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) y AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486).
1.1 Vector AAV2/8-AAT-wtATP7B [denominado también en el presente documento como AAV-wtATP7B1
La secuencia genómica de este vector se identifica como SEQ.ID.NO.1.
En primer lugar, se ensambló el plásmido pUC-ATP7B a petición (GenScript) mediante la clonación de la construcción de ácido nucleico en un plásmido pUC57. La construcción de ácido nucleico contenía una secuencia de ADNc codificante de ATP7B humano (transgén) junto con una secuencia de señal de poliadenilación sintética (Levitt N. et al. Genes & Development 1989; 3 (7): 1019-1025) en dirección 3' del transgén.
Después, se introdujo el promotor mínimo del gen alfa 1 anti-tripsina (AAT) en el plásmido pUC-ATP7B, en dirección 5' del gen ATP7B. El promotor mínimo consiste en la secuencia del nucleótido -261 al nucleótido 44 en relación con el sitio de cap del promotor de AAT (Kramer M. G. et al. Mol. Therapy 2003; 7(3): 375-385) y contiene el elemento específico del tejido (EET), necesario para la función hepática, y la región distal (RD) necesaria para toda la actividad del promotor. El promotor de AAT se obtuvo mediante amplificación por PCR usando como plantilla el plásmido pEnhAlbAAT-luciferasa (proporcionado por M. G. Kramer) y los siguientes cebadores
Cebador de AAT directo
5' CTGGTCTAGAACGCGTCGCCACCCCCTCCACCTTGG 3' (SEQ.ID.NO.10); y
Cebador de AAT inverso
5' ATCATGATGCGGCCGCTTCACTGTCCCAGGTCAGTG 3' (SEQ.ID.NO.11).
El cebador de AAT directo tiene un sitio de restricción para Xbal y Mlul, y el cebador de 3' AAT inverso tiene un sitio de restricción para NotI.
Por lo tanto, para obtenerse el plásmido pUC-AAT-ATP7B, se digirió el plásmido pUC-ATP7B con Xbal y NotI, y se ligó al promotor de AAT previamente digerido con las mismas enzimas.
Seguidamente, se subclonó el casete de expresión en el plásmido de transferencia de AAV pAAV-MCS (Agilent technologies) mediante digestión con las enzimas de restricción PmlI y Mlul, produciendo así el plásmido pAAV2-AAT-wtATP7B.
Una vez construido el plásmido, se preparó el vector de AAV por doble transfección en 293 células del plásmido pAAV2-AAT-ATP7B y del plásmido pDP8 (obtenido de PlasmidFactory, Bielefeld, Alemania; el plásmido pDP8 expresa la proteína de la cápside de AAV8, la proteína rep de AAV2 y las moléculas adenovíricas necesarias para la producción y el empaquetamiento de AAV).
El vector finalmente se purificó mediante gradiente de yodixanol y se tituló mediante PCR cuantitativa.
1.2 Vector AAV2/8-AAT-coATP7B [denominado también en el presente documento como AAV-coATP7B1
La secuencia genómica de este vector se identifica como SEQ.ID.NO.3.
Para obtener el vector de AAV que expresa una versión con optimización de codones del gen ATP7B (coATP7B), primero, se ensambló el plásmido pUC-coATP7B a petición (GenScript) mediante la clonación de la construcción de ácido nucleico en un plásmido pUC57. A continuación, se escindió el coATP7B del pUC-coATP7B mediante la digestión con las enzimas de restricción NotI y Kpnl y se subclonó en el plásmido pAAV2-AAT-wtATP7B previamente digerido con las mismas enzimas, NotI y Kpnl, obteniéndose el plásmido pAAV2-AAT-coATP7B.
Una vez construido el plásmido, se realizó la producción del genoma del vector y el empaquetamiento de partículas víricas como se ha descrito anteriormente para el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B: transfección doble del plásmido pAAV2-AAT-coATP7B obtenido previamente con el plásmido pDP8, purificación (gradiente de yodixanol) y titulación.
1.3 Vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d223-366) [denominado también en el presente documento como AAV-T11
Este vector porta como el transgén una secuencia de un ácido nucleico (SEQ.ID.NO.12) que codifica ATP7B(d223-366), una forma truncada del ATP7B humano en el cual se han eliminado los aminoácidos 223 a 366. La secuencia eliminada incluye el dominio HMA 3 y siete aminoácidos del dominio HMA 4.
Para obtener el vector, el plásmido pUC57-wtATP7B se digirió con las enzimas de restricción Mfel y Nae I, obteniéndose el plásmido pUC57-ATP7B-T1. De esta forma, el tamaño de la región codificante se redujo en 432 nucleótidos y el tamaño de la proteína en 144 aminoácidos.
Una vez construido el plásmido pUC57-ATP7B-T1, se realizó la producción del genoma del vector y el empaquetamiento de partículas víricas como se describe anteriormente para el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B: ligamiento al promotor AAT, subclonación en el plásmido pAAV-MCS, transfección doble del plásmido pAAV2-AAT-T1 obtenido previamente con el plásmido pDP8, purificación del virus (gradiente de yodixanol) y titulación.
1.4 Vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) [denominado también en el presente documento como AAV-T211
La secuencia genómica de este vector se identifica como SEQ.ID.NO.6.
Este vector porta como el transgén una secuencia de ácido nucleico que codifica ATP7B(d57-486) [también denominado como ATP7B-T2], una forma truncada del ATP7B humano en el cual se han eliminado los aminoácidos 57 a 486. De esta forma, se han eliminado los primeros 4 dominios HMA manteniendo la secuencia de señal que comprende los 56 aminoácidos de la región terminal amino, reduciendo el tamaño de la región codificante en 1,29 Kb y la proteína en 430 aminoácidos.
La secuencia de nucleótidos de ATP7B(d57-486) se obtuvo mediante amplificación por PCR usando el pUC57-wtATP7B como molde y dos conjuntos de cebadores;
un primer conjunto de cebadores que amplifican la secuencia amino terminal:
Cebador F1:
5' CTAGATGCGGCCGCCACCATGCCTG 3' (SEQ.ID.NO.14), y
Cebador R1:
5' CTGAGAAGAAGGGCCCAGGCC 3' (SEQ.ID.NO.15); y
un segundo conjunto de cebadores que amplifican la región carboxi terminal:
Cebador F2:
5' GGCCCTTCTTCTCAGCCGCAGAAGTGCTTCTTACAG 3' (SEQ.ID.NO.16), y
Cebador R2:
5' ACCAAAATCGATAAAACCGATTACAATCC 3' (SEQ.ID.NO.17).
Las secuencias 5' terminal de los cebadores R1 y F2 son complementarias. Usando cantidades equimoleculares de los dos fragmentos purificados por PCR como molde, y los cebadores F1 y R2, se realizó la PCR obteniéndose la secuencia de nucleótidos codificante de ATP7B(d57-486). El producto de la PCR se digirió a continuación con Notl y Clal y se clonó en el plásmido pUC57-AAT-wtATP7B previamente digerido con ambas enzimas obteniendo el plásmido pUC57-ATP7B-T2.
Una vez construido el plásmido pUC57-ATP7B-T2, se realizó la producción del genoma del vector y el empaquetamiento de partículas víricas como se describe anteriormente para el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B: ligamiento al promotor AAT, subclonación en el plásmido pAAV-MCS, transfección doble del plásmido pAAV2-AAT-T2 obtenido previamente con el plásmido pDP8, purificación (gradiente de yodixanol) y titulación.
1.5 Vector AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) [denominado también en el presente documento como AAV-AAT-coT21
Este vector porta como transgén una secuencia de ácido nucleico con optimización de codones [SEQ.ID.NO.8; coATP7B(d57-486) o coATP7B-T21 que también codifica ATP7B(d57-486).
La secuencia de nucleótidos de coATP7B(d57-486) se obtuvo mediante amplificación por PCR usando el pUC57-coATP7B como molde y dos conjuntos de cebadores;
un primer conjunto de cebadores que amplifican la secuencia amino terminal:
Cebador F3:
5' ACGCGTGCGGCCGCCACCATGCCAG 3' (SEQ.ID.NO.18), y
Cebador R3:
5' CTGGGAGCTAGGTCCCAGTCC 3' (SEQ.ID.NO.19); y
Un segundo conjunto de cebadores que amplifican la región carboxi terminal:
Cebador F4:
5' GGACCTAGCTCCCAGCCTCAGAAGTGTTTTCTGCAG 3' (SEQ.ID.NO.20), y
Cebador R4:
5' TGTTCCTCGCGAATGATCAGGTTGTCCTC 3' (SEQ.ID.NO.21).
Las secuencias 5' terminal de los cebadores R3 y F4 son complementarias. Usando cantidades equimoleculares de los dos fragmentos purificados por PCR como molde, y los cebadores F3 y R4, se realizó la PCR obteniéndose la secuencia de nucleótidos con optimización de codones que codifica ATP7B(d57-486). El producto de la PCR se digirió a continuación con NotI y Nrul y se clonó en el plásmido pUC57-AAT-wtATP7B previamente digerido con ambas enzimas obteniendo el plásmido pUC57-coATP7B-T2.
Una vez construido el plásmido pUC57-coATP7B-T2, se realizó la producción del genoma del vector y el empaquetamiento de partículas víricas como se describe anteriormente para el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B: ligamiento al promotor AAT, subclonación en el plásmido pAAV-MCS, transfección doble del plásmido pAAV2-AAT-coT2 obtenido previamente con el plásmido pDP8, purificación del virus (gradiente de yodixanol) y titulación.
Ejemplo 2. Modelo de la enfermedad de Wilson en animales: ATP7B KO
Se ensayó el rendimiento terapéutico de los vectores AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 y AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 en ratones con desactivación de ATP7B (ratones ATP7B KO, ATP7B-/- o WD), que son un modelo animal representativo de la EW. Este modelo animal fue desarrollado por Buiakova et al., mediante la introducción de un codón de terminación temprana en el ARNm de ATP7B de ratón diseñando la sustitución de una parte del exón 2 de ATP7B con un casete de neomicina orientado en el marco de transcripción opuesto (Buikova O. I. et al. "Human Molecular Genetics" 1999; 8(9): 1665-1671). Los ratones con desactivación de ATP7B no muestran expresión de ATP7B en el hígado y una alta excreción de Cu en la orina, bajos niveles de holoceruloplasmina en suero, altos niveles de transaminasas, alta concentración de Cu en el hígado y una histología hepática patológica. Estos ratones presentan las características bioquímicas típicas de la enfermedad de Wilson humana, excepto por la afectación neurológica (Lutsenko S. "Biochemical Society Transactions" 2008; 36(Pt 6): 1233-1238).
Ejemplo 3. Determinación del efecto terapéutico de los vectores víricos AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 y AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 en ratones con la enfermedad de Wilson
Se dividieron ratones macho ATP7B-/- de seis semanas (6 s) en 4 grupos de 5 ratones cada uno: 1 de los grupos fue tratado por vía intravenosa con el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B a una dosis de 3 x 1010 gv/ratón (gv: genomas víricos); un segundo grupo con la misma dosis del vector AAV2/8-AAT-ATP7B-T1; un tercer grupo con la misma dosis del vector AAV2/8-AAT-ATP7B-T2; y un cuarto grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control (control). Los animales fueron sacrificados veinticuatro semanas después de la administración del vector (semana 30).
Cuatro semanas después de la administración del vector y después cada cinco semanas hasta la semana 30; se determinaron los niveles de transaminasas en suero (ALT) y el contenido de Cu en orina en todos los grupos. Se midió la actividad de ceruloplasmina en suero 4 semanas después del tratamiento.
Se determinaron los niveles de transaminasas en suero (ALT) mediante el método DGKC (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) usando un analizador clínico Hitachi 747 (Hitachi, Tokio, Japón).
Se determinó la actividad de ceruloplasmina en suero con diclorhidrato de O-dianisidina (4,4'-diamino-3,3'-dimetoxibifenilo) como sustrato (Sigma-Aldrich, San Louis, MO, Estados Unidos) según lo descrito por Schosinsky et al. (Clinical Chemistry 1974; 20(12): 1556-1563). Se midió la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro.
Se determinó el contenido del cobre en orina mediante espectroscopía de absorción atómica (SIMAA 6000, de Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk).
Después del sacrificio se extirpó el hígado para el análisis histológico.
Se determinó el contenido del cobre hepático en tejido de hígado seco mediante espectroscopía de absorción atómica (SIMAA 6000, de Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk), y mediante tinción con sulfuro de plata de Timm (Danscher G. y Zimmer J. Histochemistry 1978; 55(1): 27-40).
Se evaluó la estructura del hígado en cortes teñidos con hematoxilina y eosina.
Se realizó un análisis de inmunohistoquímica con anticuerpo anti-CD45 de ratón (BioLegend, San Diego, EE.UU; número de catálogo 103102) para detectar la infiltración inflamatoria en el hígado.
También se realizó un análisis de inmunohistoquímica con anticuerpo anti-PanCk de ratón (Invitrogen/Life Technologies, 18-0132, clon AE1/AE3) para detectar células biliares.
Para determinar la fibrosis, se usó la tinción con Rojo Sirio convencional como método para la determinación del colágeno.
Como se muestra en la Figura 2, los niveles de transaminasas se habían normalizado en los ratones que recibieron AAV2/8-AAT-wtATP7B o AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 pero no en los animales tratados con AAV2/8-AAT-ATP7B-T1. Además, la concentración de Cu en orina fue significativamente inferior en los animales que recibieron AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B-T1, o AAV2/8-AAT-ATP7B-T2; sin embargo AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 fue menos eficiente en reducir la concentración de Cu en orina (Figura 3). La actividad de ceruloplasmina se restableció después del tratamiento en los animales que recibieron AAV2/8-AAT-wtATP7B o AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 pero no en los animales tratados con AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 (Figura 4). Este resultado fue corroborado mediante análisis de transferencia Western. Se detectó holoceruloplasmina en ratones tratados con AAV2/8-AAT-wtATP7B o AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 pero no en animales tratados con AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 donde como en los ratones WD no tratados solo se pudo detectar apoceruloplasmina.
Por otro lado, la administración del AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 o AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 redujo significativamente el contenido de Cu en el hígado; sin embargo, AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 fue menos eficaz en reducir la concentración de Cu en el hígado (Figura 5). Los resultados se confirmaron en la imagen obtenida tras la tinción de Timm (Figura 6B). En cuanto a la histología hepática, los animales no tratados mostraron una arquitectura hepática anormal con enormes hepatocitos que contenían enormes núcleos. La administración de los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B o AAV2/8-AAT-ATP7B-T2 pero no AAV2/8-AAT-ATP7B-T1 dio como resultado la normalización de la histología hepática (Figura 6A). Además, los animales con EW presentaron un fuerte infiltrado hepático compuesto principalmente por células positivas en CD45; la infiltración desapareció tras el tratamiento con los vectores víricos recombinantes (Figura 7). Por tanto, la administración del vector de AAV dio como resultado una reducción notable del infiltrado inflamatorio. Además, la proliferación de conductos biliares y fibrosis hepática también se redujo significativamente en los ratones WD tratados con AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B-T2, y V2/8-AAT-ATP7B-T1 (Figura 7).
Ejemplo 4. Efecto terapéutico del vector vírico AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) en ratones hembra con la enfermedad de Wilson.
Se dividieron ratones hembra ATP7B-/- de seis semanas (6 s) en 4 grupos de 5 ratones cada uno: los animales de los grupos 1 - 3 se trataron por vía intravenosa con el vector vírico AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), recibiendo cada grupo una dosis diferente (respectivamente 1 x 1010, 3 x 1010, y 1 x 1011 gv/ratón); un cuarto grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control (WT).
Cuatro semanas después de la administración del vector y después cada cinco semanas hasta 24 semanas después del tratamiento (cuando los ratones tenían 30 semanas de edad), se determinaron los niveles de transaminasas en suero (ALT) y la concentración de Cu en orina en todos los grupos, mediante los mismos métodos descritos en el Ejemplo 3.
Como se muestra en la Figura 8, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) normalizó los niveles de transaminasas en ratones hembra WD en las dos dosis más altas (3 x 1010, y 1 x 1011 gv/ratón); la dosis más baja 1 x 1010 gv/ratón) redujo significativamente los niveles de transaminasas pero no consiguió eliminar el daño hepático. Sin embargo, el tratamiento con las tres dosis diferentes redujo significativamente la excreción urinaria de Cu alcanzando los niveles observados en los ratones WT (Figura 9).
Ejemplo 5. Comparación del efecto terapéutico de los vectores víricos AAV2/8-AAT-wtATP7B y AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) en ratones hembra con enfermedad de Wilson.
Se establecieron dos grupos experimentales. Para cada grupo experimental, se dividieron ratones hembra ATP7B-/-de seis semanas (6 s) en 4 grupos de 5 ratones cada uno: 3 de los grupos se trataron por vía intravenosa con un vector vírico de ensayo, recibiendo cada grupo una dosis diferente (respectivamente 1 x 1010, 3 x 1010, y 1 x 1011 gv/ratón; un cuarto grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control (WT).
En el primer grupo experimental (grupo experimental 1), a los ratones WD que reciben tratamiento se les administró el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B; en el segundo grupo experimental (grupo experimental 2) se administró el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486).
La actividad de ceruloplasmina en suero se determinó 4 semanas después del tratamiento y el contenido de Cu hepático determinado 24 semanas después del tratamiento, se midió mediante los mismos métodos descritos en el Ejemplo 3.
Actividad de ceruloplasmina en suero
La actividad de ceruloplasmina en suero se corrigió solo por la administración de la dosis más alta del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (Figura 10A grupo experimental 1); no observándose ningún efecto después de la administración de las dosis más bajas.
En cambio, el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) aumentó significativamente los niveles de ceruloplasmina con la dosis más baja de 1 x 1010 gv/ratón); la administración de la dosis media del vector normalizó los niveles de ceruloplasmina y la dosis más alta aumentó la actividad de ceruloplasmina respecto a los niveles normales (Figura 10B grupo experimental 2).
Concentración de Cu en el hígado
Además, la concentración de Cu en el hígado se redujo pero no se normalizó con la administración de las dos dosis más altas de AAV2/8-AAT-wtATP7B; y no se observó ningún efecto con la dosis más baja (Figura 11A grupo experimental 1). Por el contrario, se observó que la concentración de Cu se redujo tras la administración del vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) en todas las dosis ensayadas y con la dosis más alta los niveles eran cercanos a los normales (Figura 11B grupo experimental 2).
En consecuencia, una dosis de 1 x 1010 gv/ratón del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B demostró ser una "dosis subóptima" para la construcción wt tanto para la obtención de una normalización de la actividad de ceruloplasmina en suero como para la reducción de la acumulación de Cu en el hígado; mientras que el vector portador de la forma truncada proporciona inesperadamente efectos terapéuticos estadísticamente significativos a dicha dosis subóptima.
Ejemplo 6. Comparación del efecto terapéutico de los vectores víricos AAV2/8-AAT-wtATP7B y AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) en ratones con EW.
Se dividieron ratones macho ATP7B-/- de seis semanas (6 s) en 3 grupos de ratones: 2 grupos de animales se trataron respectivamente con una dosis intravenosa subóptima (1 x 1010 gv/ratón) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B o el vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486); un tercer grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control (WT).
Se midió el contenido de Cu hepático mediante el mismo método descrito en el Ejemplo 3.
Como se muestra en la Figura 12, aunque ambos vectores, AAV2/8-AAT-wtATP7B y AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486), administrados a una dosis subóptima redujeron la acumulación de cobre en el hígado de ratones con EW, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) proporcionó una reducción del contenido de cobre hepático que fue significativamente mayor que la reducción proporcionada por AAV2/8-AAT-wtATP7B.
Ejemplo 7. Comparación del efecto terapéutico de los vectores víricos AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) y AAV-AAT-coATP7B(d57-486) en ratones con EW.
Se dividieron ratones macho ATP7B-/- de seis semanas (6 s) en 3 grupos de ratones: 2 grupos de animales se trataron respectivamente con una dosis intravenosa subóptima (1 x 1010 gv/ratón) del vector AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) y AAV-AAT-coATP7B(d57-486); un tercer grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control (WT).
Se midió el contenido de Cu hepático mediante el mismo método descrito en el Ejemplo 3.
Como se muestra en la Figura 13, aunque ambos vectores, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) y AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486), administrados a una dosis subóptima redujeron la acumulación de cobre en el hígado de ratones con EW, AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) proporcionó una reducción del contenido de cobre hepático que fue significativamente mayor que la reducción proporcionada por AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486).
Ejemplo 8. Efecto terapéutico del vector vírico optimizado por codón AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486) en ratones con EW.
Se dividieron ratones macho ATP7B-/- de seis semanas (6 s) en 5 grupos de ratones: 4 grupos de animales se trataron respectivamente con una dosis intravenosa subóptima (1 x 1010 gv/ratón) de los vectores AAV2/8-AAT-wtATP7B, AAV2/8-AAT-coATP7B, AAV2/8-AAT-ATP7B(d57-486) o AAV2/8-AAT-coATP7B(d57-486); un quinto grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control (WT).
Se midió la actividad de ceruloplasmina en suero mediante el mismo método descrito en el Ejemplo 3.
Como se muestra en la Figura 14, los dos vectores portadores de la secuencia de nucleótidos de ATP7B-T2 truncado

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ácido nucleico que comprende
a) una secuencia de nucleótidos de un promotor eucariota;
b) una secuencia de nucleótidos codificante de una ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B) truncada en la cual los sitios asociados a metales pesados N-terminal HMA 1, HMA 2, HMA 3 y HMA 4 están totalmente eliminados y HMA 5 y HMA 6 permanecen sin eliminar; y
c) una secuencia de señal de poliadenilación,
d) flanqueada por una repetición terminal invertida (ITR) 5' y una ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV).
2. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la deleción en el ATP7B truncado comprende los aminoácidos 57 a 486 de la secuencia SEQ.ID.NO.2.
3. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos del ATP7B truncado es la SEQ.ID.NO.7.
4. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótidos codificante del ATP7B truncado se selecciona del grupo que consiste en
a) la secuencia codificante CDS de la SEQ.ID.NO.6, bases 473..3580;
b) la secuencia SEQ.ID.NO.8; y
c) una secuencia en donde al menos 827, al menos 879, al menos 931 o al menos 983 de los codones codificantes del ATP7B truncado son idénticos a los codones de la secuencia codificante de la SEQ.ID.NO.8.
5. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia de nucleótidos del promotor eucariota es una secuencia de nucleótidos del promotor del gen a1-antitripsina, o una secuencia promotora quimérica que comprende una secuencia promotora del gen a1-antitripsina combinada con un elemento potenciador del gen de la albúmina.
6. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la secuencia de nucleótidos del promotor eucariota es la secuencia delimitada por las bases 156..460 de SEQ.ID.NO.1 (AAT) o SEQ.ID.NO.5 (EalbPa1AT).
7. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las secuencias de ITR 5' e ITR 3' de un AAV son de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2 y AAV4, preferiblemente son del serotipo AAV2.
8. Un vector de expresión que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vector es un vector AAV.
10. Una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9.
11. Una partícula vírica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9.
12. La partícula vírica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la partícula vírica comprende proteínas de la cápside de un AAV.
13. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10 o una partícula vírica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Una construcción de ácido nucleico que comprende
a) una secuencia de nucleótidos de un promotor eucariota;
b) una secuencia de nucleótidos codificante de un ATP7B truncado en el cual los sitios asociados a metales pesados N-terminal HMA 1, HMA 2, HMA 3 y HMA 4 están totalmente eliminados y HMA 5 y HMA 6 permanecen sin eliminar; y
c) una secuencia de señal de poliadenilación;
d) flanqueada por una repetición terminal invertida (ITR) 5' y una ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV); un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10 o una partícula vírica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, para su uso como un medicamento.
15. Una construcción de ácido nucleico que comprende
a) una secuencia de nucleótidos de un promotor eucariota;
b) una secuencia de nucleótidos codificante de un ATP7B truncado en el cual los sitios asociados a metales pesados N-terminal HMA 1, HMA 2, HMA 3 y HMA 4 están totalmente eliminados y HMA 5 y HMA 6 permanecen sin eliminar; y
c) una secuencia de señal de poliadenilación;
d) flanqueada por una repetición terminal invertida (ITR) 5' y una ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV); un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-9, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10 o una partícula vírica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de ATP7B en el ser humano, seleccionada entre las siguientes afecciones: trastornos coleostáticos, enfermedad de Alzheimer, cáncer y enfermedad de Wilson.
16. Un proceso de producción de partículas víricas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, que comprende las etapas de:
a) cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 10 en un medio de cultivo; y
b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.
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