JP2024508324A - Ｄｍｄエクソンの重複を修正するためのｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ９を使用したジストロフィンベースのミオパチーの治療のための生成物及び方法 - Google Patents

Ｄｍｄエクソンの重複を修正するためのｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ９を使用したジストロフィンベースのミオパチーの治療のための生成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、限定するものではないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、又は中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）を含む筋ジストロフィーの治療のための遺伝子治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連タンパク質９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ－ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）（Ｃａｓ９）をコードする核酸とともに使用されるｇＲＮＡをコードする核酸を含む核酸、並びにＤＭＤ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９療法に適しているエクソン重複変異から生じる、ＤＭＤ、ＢＭＤ、又はＩＭＤを含むが、これらに限定されない、筋ジストロフィーの治療に使用するために、単一又は複数のＤＭＤエクソンの重複変異を修正するためのガイドＲＮＡ及びＣａｓ９をコードする核酸を送達するための核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、を提供する。【選択図】なし

Description

政府権益の声明
本発明は、米国国立衛生研究所からの認可番号ＡＲ０７０６０４の下で政府の支援とともに行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５５００９＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：５７，０９３バイト：作成日：２０２２年３月２日）を含み、その全体が本明細書に援用される。
本開示は、筋ジストロフィーの治療のための遺伝子治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＤＭＤエクソンの重複の修正のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を伴う筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための、新たな遺伝子治療のための生成物、方法、及び使用を提供する。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、主に随意筋に影響を及ぼす遺伝性変性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期又は小児期に発症するが、他は中年以降まで出現し得ない。障害は、筋力低下の分布及び程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、並びに遺伝形式の点で異なる。
ＭＤは、個人、家族、及びコミュニティに深刻な影響を与える、識別可能な治療法のない疾患のグループである。コストは計り知れない。個人は、自尊心の喪失に伴う感情的な緊張と生活の質の低下に苦しむ。四肢機能の喪失に起因する極端な身体的課題は、日常生活の活動に困難をもたらす。家族力動は、経済的損失と対人関係への挑戦に苦しむ。罹患した兄弟姉妹は疎遠に感じ、特に筋ジストロフィーの責任が親のパートナーの一方起因する可能性がある場合、配偶者間の紛争はしばしば離婚につながる。治癒を見つけるための探求の負担は、しばしば生涯にわたる、高度に焦点を当てた努力となり、人生のあらゆる側面を損なう挑戦となる。家族を超えて、コミュニティは、特殊教育における筋ジストロフィー集団のハンディキャップ、特別な交通機関、及び再発性呼吸器感染症及び心臓合併症を治療するための再発入院の費用に対応するための追加施設の必要性を通じて、財政的負担を負う。財政的責任は、州及び連邦政府機関によって分担され、納税者コミュニティの責任を拡大する。
ＭＤの１つの形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これは、５０００人に１人の新生児男性が罹患する、最も一般的な重度の小児期型の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、骨格筋及び心筋、並びに胃腸管及び網膜におけるジストロフィンタンパク質（４２７ＫＤａ）の欠如をもたらすＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、筋鞘を偏心性収縮から保護するだけでなく、筋鞘に近接する多くのシグナル伝達タンパク質を固定する。ＭＤの別の形態は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。ＢＭＤは、ＤＭＤと同様に、体の筋肉を徐々に弱く少なくしていく遺伝性疾患である。ＢＭＤは、腰、骨盤、太もも、肩、及び心臓の筋肉に影響を及ぼすが、ＤＭＤほど深刻ではない問題を引き起こすことが知られている。
ＤＭＤの多くの臨床症例は、ＤＭＤ遺伝子の欠失変異に関連している。欠失変異とは対照的に、ＤＭＤエクソンの重複は、ジストロフィン異常症患者の偏りのないサンプルにおける、疾患を引き起こす変異の約５％を占めるが［非特許文献１］、変異のいくつかのカタログでは、重複の数はより多く、（非特許文献２）では、１１％であった。
ＭＤの他の形態は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）及び中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）である。ＢＭＤは、主に随意筋に影響を及ぼす遺伝性変性疾患のグループである、９種類の筋ジストロフィーの１つである。ＢＭＤはまた、ジストロフィン遺伝子の変化によって引き起こされ、それによりタンパク質が短くなりすぎる。欠陥のあるジストロフィンは、通常の使用で、筋肉細胞を損傷の危険に晒す。また、２０１２年３月２９日に公開された特許文献１、２０１３年３月２１日に公開された特許文献２、及び２０１３年２月２１日に公開された特許文献３も参照されたい。ＩＭＤは、１２歳を過ぎて歩くが、１５歳までに歩くのをやめる患者の筋ジストロフィー表現型の分類である。患者のＩＭＤ分類の使用は、ＤＭＤに対して典型的であるよりも重症度が低いが、ＢＭＤに対して典型的であるよりも重症度が高い患者を記述するのに有用である。
ＤＭＤ遺伝子の同定に続く多くの研究のラインにもかかわらず、ＤＭＤ遺伝子が関係する様々な筋ジストロフィーの治療オプションは限られている。したがって、ＤＭＤ、ＢＭＤ、及びＩＭＤを含むが、これに限定されない筋ジストロフィーの治療に対する当該技術分野での必要性が存在する。
米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００７２５４１号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００４５５３８号明細書
Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，１３４（３）：２９５－２９８（２００５） Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，３０（１２）：１６５７－１６６６（２００９）
本開示は、ＤＭＤエクソン重複に起因する変異を伴う筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための、新たな遺伝子治療のための生成物、方法、及び使用を提供する。より具体的には、本開示は、ＤＭＤエクソンの重複の修正のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を伴う筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための、新たな遺伝子治療のための生成物、方法、及び使用を提供する。
本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を提供する。いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。
本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ．７４である。
本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームを提供する。いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。
本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸、及び薬学的に許容される担体を含む、組成物を提供する。いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。
本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸、及び薬学的に許容される担体を含む、ＡＡＶを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ．７４である。
本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸、及び薬学的に許容される担体を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームを含む組成物を提供する。
本開示は、細胞におけるジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子の変異を修正する方法であって、細胞を、
（ａ）（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び薬学的に許容される担体を含む核酸、を含む核酸、
（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ＡＡＶ、
（ｉｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソーム、又は
（ｉｖ）前述の核酸、前述のＡＡＶ、若しくは前述のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び薬学的に許容される担体を含む組成物、並びに
（ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ＡＡＶ、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含むＡＡＶ、若しくはＣａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームを含む組成物、と接触させることを含む。
いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。
いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ．７４である。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、又はその機能的断片は、配列番号２７７又は２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含む。
本開示は、ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子の変異を有する対象における筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防する方法であって、対象に、有効量の
（ａ）（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び薬学的に許容される担体を含む核酸、を含む核酸、
（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ＡＡＶ、
（ｉｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
（ｉｖ）前述の核酸、前述のＡＡＶ、若しくは前述のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び薬学的に許容される担体を含む組成物、並びに
（ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ＡＡＶ、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む組成物、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含むＡＡＶ、若しくはＣａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、を投与することを含む。
いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。
いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ．７４である。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、又はその機能的断片は、配列番号２７７又は２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含む。
いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、又は中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）である。
いくつかの態様では、変異は、ＤＭＤ遺伝子の単一又は複数のエクソンの重複である。いくつかの態様では、単一又は複数のエクソンの重複は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２又は３に関与する、それを取り囲む、又は影響を及ぼす。いくつかの態様では、重複は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複である。
本開示は、細胞内でジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子を発現させるための薬剤の調製のための、筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防するための、及び／又は筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防するための薬剤の調製のための、
（ａ）（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、及び薬学的に許容される担体を含む核酸、を含む核酸、
（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ＡＡＶ、
（ｉｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、若しくは配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む核酸を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
（ｉｖ）前述の核酸、前述のＡＡＶ、若しくは前述のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び薬学的に許容される担体を含む組成物、並びに
（ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ＡＡＶ、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
（ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む組成物、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含むＡＡＶ、又はＣａｓ９酵素をコードする核酸若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、
の使用を提供する。
いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。
いくつかの態様では、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様では、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ．７４である。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、又はその機能的断片は、配列番号２７７又は２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含む。
いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、又は中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）である。
いくつかの態様では、変異は、ＤＭＤ遺伝子の変異である。
いくつかの態様では、変異は、ＤＭＤ遺伝子の単一又は複数のエクソンの重複である。いくつかの態様では、単一又は複数のエクソンの重複は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２又は３に関与する、それを取り囲む、又は影響を及ぼす。いくつかの態様では、重複は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複である。
いくつかの態様では、本開示の方法又は使用は、細胞又は対象におけるジストロフィンタンパク質の発現の増加をもたらす。いくつかの態様では、本開示の方法又は使用は、対象におけるジストロフィー性病理の進行を阻害する。いくつかの態様では、本開示の方法又は使用は、対象における筋肉機能を改善する。いくつかの態様では、筋肉機能の改善は、筋力の改善である。いくつかの態様では、筋肉機能の改善は、立位及び歩行における安定性の改善である。
いくつかの態様では、核酸、ＡＡＶ、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又は組成物若しくは医薬品は、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射、又はエアロゾル投与のために製剤化される。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の図面の説明及び詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、図面、詳細な説明、及び特定の実施例は、開示される主題の実施形態を示すが、例示としてのみ与えられ、それは本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるためであることを理解されたい。
単一のｇＲＮＡを使用して重複した部位を標的とする、エクソンの重複の修正の表現を示す。図１Ａは、代表的な単一エクソン重複及び潜在的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介修復療法を示す。標的化された重複領域内の単一のｇＲＮＡ（オレンジ色の三角形）は、重複領域の両方のコピーを切断し、通常のコード配列への復帰を触媒する。 単一のｇＲＮＡを使用して重複した部位を標的とする、エクソンの重複の修正の表現を示す。図１Ｂは、代表的な複数エクソンの重複及び潜在的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介修正療法を示す。重複領域（灰色の陰影領域）内の標的化された単一のｇＲＮＡ（オレンジ色の三角形）は、重複領域の両方のコピーを切断し、通常のコード配列への復帰を触媒する。 同上。 イントロン１（白色）エクソン２（黒色）及びイントロン２（シアン色）内のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（緑色）及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（青色）のｇＲＮＡ標的部位と重なるヒトＤＭＤ部分遺伝子マップを示す。スケールバーのティックマークは、１００塩基対（ｂｐ）を表す。 各レーンの上に示されるように、ＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードするプラスミドの一過性発現に続く、ＨＥＫ２９３細胞から抽出されたｇＤＮＡを使用して生成されたＰＣＲアンプリコン上でのＴ７Ｅ１変異検出アッセイを示す。入力アンプリコン（「－」）は、１０％ＰＡ－ＴＢＥゲル上でＴ７Ｅ１酵素（「＋」）で処置したアンプリコンと並行してランし、臭化エチジウムで染色した後に撮像した。断片Ｃ～Ｅは、ｇＲＮＡ標的部位のうちの１つ以上にまたがる、ＤＭＤ遺伝子の異なる領域からの任意に命名されたアンプリコンである。アンプリコンは、Ｔ７Ｅ１変異検出アッセイの長さ及び位置の制限内で機能するように設計された。標的部位は、遺伝子の周りに散在し、したがって、Ｔ７Ｅ１アッセイのために、約６００ｂｐのアンプリコンはいずれも、それらの全てをカバーしなかった。したがって、変異検出アッセイのために、アンプリコンを追跡するために、任意にアンプリコンに名前を付けた。各々の異なるアンプリコンについて、未処置のＨＥＫ２９３由来のｇＤＮＡを陰性対照（「未処置」）として使用した。各反応について、予想される切断断片の位置は、アスタリスク（「＊」）でマークされる。「１０ｂｐのｉｎｓ対照」は、１０ｂｐの挿入によって異なる２つのＤＮＡの等モル量を含む陽性対照を表す。ｈＤＳＡ－００１、ｈＤＳＡ－００２、ｈＤＳＡ－０２７、及びｈＤＳＡ－０３０のｇＲＮＡを使用した編集の強力な証拠に留意されたい。 各レーンの上に示されるように、ＣｊＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードするプラスミドの一過性発現に続く、ＨＥＫ２９３細胞から抽出されたｇＤＮＡを使用して生成されたＰＣＲアンプリコン上でのＴ７Ｅ１変異検出アッセイを示す。入力アンプリコン（「－」）は、１０％ＰＡ－ＴＢＥゲル上でＴ７Ｅ１酵素（「＋」）で処置したアンプリコンと並行してランし、臭化エチジウムで染色した後に撮像した。断片Ｂ～Ｅは、１つ以上のｇＲＮＡ標的部位にまたがる、ＤＭＤ遺伝子の異なる領域からの任意に命名されたアンプリコンである。各々の異なるアンプリコンについて、未処置のＨＥＫ２９３由来のｇＤＮＡを陰性対照（「未処置」）として使用した。各反応について、予想される切断断片の位置は、アスタリスク（「＊」）でマークされる。ｈＤＣＪ－００３、ｈＤＣＪ－００８、ｈＤＣＪ－０２７、及びｈＤＣＪ－０３１のｇＲＮＡを使用した編集の強力な証拠に留意されたい。 イントロン３内のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのｇＲＮＡ標的部位と重ねたＤＭＤ部分遺伝子マップを示す。スケールバーのティックマークは１００ｂｐを表す。標的配列が重複される変異（例えば、エクソン２～６の重複）について、両方の部位でのＣａｓ９による同時切断は、介在する重複配列の欠失をもたらし、したがって、図１Ｂのような正常なエクソン配置の回復をもたらす。 各レーンの上に示されるように、ＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡをコードするプラスミドの一過性発現に続く、ＨＥＫ２９３細胞から抽出されたｇＤＮＡを使用して生成されたＰＣＲアンプリコン上でのＴ７Ｅ１変異検出アッセイを示す。入力アンプリコン（「－」）は、１０％ＰＡ－ＴＢＥゲル上でＴ７Ｅ１酵素（「＋」）で処置したアンプリコンと並行してランし、臭化エチジウムで染色した後に撮像した。断片α～γは、１つ以上のｇＲＮＡ標的部位にまたがる、ＤＭＤ遺伝子の異なる領域からの任意に命名されたアンプリコンである。各々の異なるアンプリコンについて、未処置のＨＥＫ２９３由来のｇＤＮＡを陰性対照（「未処置」）として使用した。各反応について、予想される切断断片の位置は、アスタリスク（「＊」）でマークされる。「１０ｂｐのｉｎｓ対照」は、１０ｂｐの挿入によって異なる２つのＤＮＡの等モル量を含む陽性対照を表す。ＪＨＩ３ＳＡ００３、ＪＨＩ３ＳＡ００７、ＪＨＩ３ＳＡ００８、ＪＨＩ３ＳＡ０１３、ＪＨＩ３ＳＡ０１５、ＪＨＩ３ＳＡ０１６、及びＪＨＩ３ＳＡ０１７ ｇＲＮＡを使用した編集の強力な証拠に留意されたい。 表３に示されるように、高（Ｈ）、中（Ｍ）、及び低（Ｌ）の３つの用量の、ＭＨＣＫ７プロモーターによって駆動されるＣａｓ９をコードするｒＡＡＶと、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ ｈＤＳＡ０３０の３つのコピーをコードするｓｃＡＡＶとの１：１の混合物で処置された、Ｄｕｐ２患者細胞におけるＤＭＤエクソン１～３のＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。次いで、全ＲＮＡを抽出する前に、細胞を２週間、筋管に分化転換した。全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成後、ＤＭＤ５’ＵＴＲ及びエクソン３内のプライマーを使用してＰＣＲを実施し、未処置の試料（Ｕ）によって示されるように、Ｄｕｐ２については約３５０ｂｐのバンドを得、健康な対照のＲＮＡによって示されるように、野生型配列については約３００ｂｐのバンドを得た。エクソン２（ｄｅｌ２）の完全な欠失に対応するマイナーなバンドも、約２６０ｂｐで観察される。ＲＴ ｎｅｇは、ＲＮＡなしのＲＴ－ＰＣＲ反応を表し、ＮＴＣは、鋳型ｃＤＮＡなしのＰＣＲ反応を表す。ｎ＝２であるＨ群を除いて、ｎ＝３個の生物学的複製物。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して密度測定によってバンドを定量化し、総アンプリコン密度のパーセント（総転写産物のパーセント）としてプロットした。バーは平均を表し、誤差バーは標準偏差である。 表３に示されるように、高（Ｈ）、中（Ｍ）、及び低（Ｌ）の３つの用量の、ＭＨＣＫ７プロモーターによって駆動されるＣａｓ９をコードするｒＡＡＶと、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ ｈＤＳＡ０３０の３つのコピーをコードするｓｃＡＡＶとの１：１の混合物を有する、Ｄｕｐ２－６患者細胞におけるＤＭＤエクソン１～８のＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。次いで、全ＲＮＡを抽出する前に、細胞を２週間、筋管に分化転換した。全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成後、ＤＭＤ５’ＵＴＲ及びエクソン８内のプライマーを使用してＰＣＲを実施し、未処置の試料（Ｕ）によって示されるように、Ｄｕｐ２－６については約１３００ｂｐのバンドを得、健康な対照のＲＮＡによって示されるように、野生型配列については約７００ｂｐのバンドを得た。ＲＴ ｎｅｇは、ＲＮＡなしのＲＴ－ＰＣＲ反応を表し、ＮＴＣは、鋳型ｃＤＮＡなしのＰＣＲ反応を表す。ｎ＝２であるＭ群を除いて、ｎ＝３個の生物学的複製物。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して密度測定によってバンドを定量化し、総アンプリコン密度のパーセント（総転写産物のパーセント）としてプロットした。バーは平均を表し、誤差バーは標準偏差である。 Ｄｕｐ２ ＤＭＤ患者の筋線維におけるＣａｓ９及びｇＲＮＡを発現するためのＡＡＶベクター化アプローチの漫画表現を示す。発現すると、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡは、ｃａｓ９がｇＲＮＡによってプログラムされたゲノムＤＮＡ標的部位に誘導される核に結合及び転位する。重複領域内で標的化する場合、Ｃａｓ９切断部位が重複し、両方の部位でＣａｓ９による同時結合及び切断がもたらされ、介在する重複したＤＮＡ配列が除去される。ＤＮＡを修復して壊れたＤＮＡ骨格を固定した後、重複変異が除去され、正常なエクソン配置が回復し、ジストロフィンの発現と正常な筋線維の生理学の回復につながる。 表４に示されるように、高（Ｈ）、中（Ｍ）、及び低（Ｌ）の３つの用量の、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ ｍＤＳＡ０１０の３つのコピーをコードするＭＨＣＫ７プロモーター駆動Ｃａｓ９及びｓｃＡＡＶをコードするｒＡＡＶを筋肉内注射した（各々ｎ＝４個の生物学的複製物）４週間後のマウスからの前脛骨筋断面の代表的な領域の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。断面を、ジストロフィン抗体（上部パネル、赤色チャネル）及びラミニン抗体（緑色チャネル、図示せず）と共染色した。筋鞘ジストロフィンの蓄積は、筋鞘マスク座標を決定するために役立つラミニンチャネルを用いたマスク下強度法を使用して、個々の筋断面全体の個々の繊維ごとに定量化した。ジストロフィン染色を含む筋鞘の少なくとも３０％を有する線維は、陽性としてカウントされた。次いで、マスクを生成し、分析した各繊維上に重ね、繊維のジストロフィン陽性周囲のパーセントに基づいて連続的な虹色の勾配で着色し、０～０．９９％が紫色、１００％が赤色であった。次いで、３０％を超えるジストロフィン陽性筋鞘周囲を有する繊維のパーセントを、各処置群のジストロフィン陽性繊維の平均パーセントを表すバー、及び標準偏差を表す誤差バーでグラフ化した。 ＭＨＣＫ７プロモーター駆動されるＣａｓ９をコードするｒＡＡＶと、４Ｅ６ ｖｇ／細胞のＭＯＩでＵ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ ｈＤＳＡ０３０の３つのコピーをコードするｓｃＡＡＶとの１：１の混合物で細胞を処置した後の、Ｄｕｐ２変異を有する２人の患者（図１１Ａ）及びＤｕｐ２－６変異を有する１人の患者（図１１Ｂ）からの細胞におけるＤＭＤ転写産物のＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。次いで、全ＲＮＡを抽出する前に、細胞を２週間、筋管に分化転換した。全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成後、ＤＭＤ５’ＵＴＲ及びエクソン８内のプライマーを使用してＰＣＲを実施し、未処置の試料（未処置）によって示されるように、Ｄｕｐ２－６については約１３００ｂｐ、野生型配列（ＷＴ）については約７００ｂｐのバンドを得た。ｎ＝３個の生物学的複製物。ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して密度測定によってバンドを定量化し、総アンプリコン密度のパーセント（総転写産物のパーセント）としてプロットした（図１１Ｃ）。バーは平均を表し、誤差バーは標準偏差である。 同上。 同上。
本開示は、ＤＭＤ遺伝子が関与するジストロフィン異常症又は筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための、生成物、方法、及び使用を提供する。ジストロフィン異常症は稀であるが（男性出産５，０００人に１人）、ほとんどの場合、重要な筋肉特異的構造タンパク質であるジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子の変異によって引き起こされる致命的な疾患である。疾患の重症度は、最も軽度の形態のＢＭＤの場合の、人生の後半の筋力低下から、最も重度の形態のＤＭＤの場合の、青年期の歩行の完全な喪失、及び１０代から２０代前半の心臓及び呼吸器の合併症による死亡までにわたる。患者への壊滅的な影響に加えて、家族への社会経済的及び心理的負担は膨大である。ほとんどの患者は、非常に効果的な治療選択肢を持たず、典型的には、ごくわずかな利益しかもたらさず、重篤な副作用を引き起こす支持療法及びコルチコステロイドで治療される。
より具体的には、本開示は、１つ以上のＤＭＤエクソンにおける重複変異を伴う筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための生成物、方法、及び使用を提供する。
本明細書に提供される生成物及び方法は、ＤＭＤ遺伝子の様々な領域に影響を及ぼすかかる重複変異に起因する筋ジストロフィーを治療、改善、又は予防する際に使用するための、完全長ジストロフィンタンパク質、又はジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現を提供する。既知の最大のヒト遺伝子であるＤＭＤは、ジストロフィンと呼ばれるタンパク質を作製するための指示を提供する。ジストロフィンは、主に運動に使用される筋肉（骨格筋）及び心（ｈｅａｒｔ）（心（ｃａｒｄｉａｃ））筋に位置する。いくつかの態様では、変異は、ジストロフィンをコードする最大の既知のヒト遺伝子である、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９）の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２若しくは３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、単一又は複数のエクソンの重複である。ジストロフィンは、主に運動に使用される筋肉（骨格筋）及び心（ｈｅａｒｔ）（心（ｃａｒｄｉａｃ））筋に位置する。
より具体的には、本開示は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のヌクレオチド配列を含む核酸、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、及び／又はＤＭＤ遺伝子の単一又は複数のエクソンの重複を修正するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの戦略で使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９酵素、様々なＤＭＤ領域においてエクソンの重複を実施するための核酸を含むベクター、並びに１つ以上のＤＭＤエクソンにおける重複変異を伴う筋ジストロフィーの治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防のための方法を提供する。したがって、本開示は、ＤＭＤ遺伝子の多様な変異を有する筋ジストロフィー患者の膨大なコホートに、完全長ジストロフィン、又はジストロフィンの機能的形態を復元するための生成物、方法、及び使用を提供する。
ガイドＲＮＡ及び標的部位
本開示は、ガイドＲＮＡ標的化のために、Ｃａｓ９をユーザが選択したＤＮＡ部位及びＤＭＤ遺伝子上の標的部位に誘導するｇＲＮＡと、ＤＭＤ遺伝子上のユーザが選択した部位又は標的部位でＤＮＡ二本鎖切断を生成するＣａｓ９とを含む。本明細書で使用される場合、「標的」、「標的部位」、「標的配列」又は「標的核酸」は、標的配列として本明細書で提供される配列のｆｏｒｗａｒｄ鎖又はｒｅｖｅｒｓｅ鎖のいずれかである。したがって、標的は、コード鎖又はその相補鎖である。
Ｃａｓ９は、結合及び切断するために二本鎖ＤＮＡを必要とするが、ｇＲＮＡは、２本鎖のうちの１本のみにアニールする。これにもかかわらず、Ｃａｓ９は、所与の配列の両方の鎖に結合し、切断する。天然のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９系は、２つのＲＮＡを含有し、１つは、ｃｒＲＮＡと呼ばれ、スペーサー（その標的特異性を割り当てる）直接反復（それがｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣａｓ９と結合するのを助ける）と呼ばれる配列と、ｃｒＲＮＡ直接反復に相補的な領域を含有し、ｃｒＲＮＡ直接反復配列にアニールして、それらがＣａｓ９に結合するｄｓＲＮＡを形成するようにするｔｒａｃｒＲＮＡとを含有する。ガイドＲＮＡは、コード鎖又は非コード鎖のいずれかを標的化することができる。ｇＲＮＡが結合するように設計されるべき鎖は、ＰＡＭ配列がどちらの鎖上にあるかに依存する。ＰＡＭ（例えば、ＳａＣａｓ９の場合は５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（配列番号２７９）、ＣｊＣａｓ９の場合は５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’（配列番号２８０））を含む鎖は、非標的鎖と呼ばれ、ｇＲＮＡの対応するスペーサー領域の配列と一致するプロトスペーサー配列を含む。したがって、ｇＲＮＡのスペーサー領域は、非ＰＡＭ含有鎖（標的鎖）に結合する。表１に示される標的配列は、ＤＭＤ遺伝子のコード配列であり、したがって、標的鎖又は非標的鎖のいずれかであり得る（すなわち、センス又はアンチセンス）。Ｃａｓ９は、一方の鎖がＰＡＭを含有し、他方の鎖が標的配列（すなわち、標的鎖）を含有する二本鎖ＤＮＡを必要とする。
本明細書に提供される表１は、ｇＲＮＡの完全な配列及びｇＲＮＡのスペーサー配列、並びにｇＲＮＡの各々の標的配列を含む、ヒト及び／又はマウスＤＭＤ遺伝子の様々な領域を標的とするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのｇＲＮＡ配列を提供する。
以下に提供される表２は、本開示の方法で使用される例示的なＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９のコード配列を提供する。本明細書におけるこれらの配列の提供は、例示的な目的のためのものであり、本開示の方法をこれらの特定のＣａｓ９配列に限定することを意図するものではない。本明細書で上に示されるように、本開示の方法は、機能的断片を含む、任意のＣａｓ９種、ホモログ、オルソログ、又はバリアントで実施されることを意味する。
より具体的には、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える変異に起因する筋ジストロフィーの治療に使用するための、様々なＤＭＤエクソン又はイントロン配列に結合して完全長ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンの機能的形態を提供するように設計されている配列を含む、核酸を提供する。本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、変異に起因する筋ジストロフィーの治療に使用するための、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９をコードして完全長ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンの機能的形態を提供する核酸を送達するための核酸を含む、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、又は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）及び自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）などのベクターを提供する。本開示はまた、ＤＭＤ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これらの配列は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、変異に起因する筋ジストロフィーの治療に使用するための、様々なＤＭＤエクソン又はイントロン配列に結合して完全長ジストロフィンタンパク質又はジストロフィンの機能的形態を提供するように設計されている。
本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様では、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、核酸は、ヌクレオチド配列から本質的になる。いくつかの態様では、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。
いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、又は７０％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む、核酸を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、又は７０％の同一性を含むｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む。本開示の例示的なヌクレオチド配列には、以下の表１に特定されるものが含まれるが、これらに限定されない。
表１は、ヒト及びマウスＤＭＤエクソン、並びにＤＭＤ遺伝子の隣接するイントロン配列を標的化するように設計された、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのｇＲＮＡヌクレオチド配列を提供する。列１のｇＲＮＡ ＩＤの後のアスタリスクは、ｇＲＮＡがマウス及びヒト配列の両方を標的とすることを示す。表１の第３のカラムは、固有のスペーサー配列（すなわち、カラム３及び５において太字で示される配列番号９３～１８４）及び共通リピート：アンチリピートｇＲＮＡ配列（カラム３において下線付きフォント）の両方を含むｇＲＮＡ配列（すなわち、太字及び下線付きフォントの両方を含む配列番号１～９２）を提供する。表１は、ＤＭＤ遺伝子の標的ヌクレオチド配列も提供する。
したがって、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、変異に起因するＤＭＤ遺伝子の単一及び複数のエクソンの重複を補正するための核酸を提供する。ＤＭＤ遺伝子は、ヒトにおいて最大の既知の遺伝子である。それは、２４０万塩基対のサイズであり、７９個のエクソンを含み、転写され、共転写的にスプライシングされるのに１６時間以上かかる。このＣａｓ９遺伝子編集プロセスの結果は、身体がジストロフィンを可能にする。いくつかの態様では、ジストロフィンは、完全長ジストロフィン、又はＤＭＤ遺伝子の変異に起因するであろう、又はそれに起因する筋ジストロフィーを予防、改善、又は治療するジストロフィンの機能形態である。いくつかの態様では、ジストロフィンは、より短い、使用可能なジストロフィンであり、いくつかの態様では、そのようなＤＭＤ変異の影響をより軽度にする。
ジストロフィン及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー
本開示は、ＤＭＤ遺伝子の変異に起因する筋ジストロフィーを治療するための生成物、方法、及び使用を提供する。そのような筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、及び中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＭＤは、ジストロフィンタンパク質の４２７ｋＤａの筋アイソフォームの合計７９個のエクソン及びコードを含む、ＤＭＤ遺伝子内の無数の変異によって引き起こされるＸ連鎖遺伝子障害である（Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｎｅｕｒｏｌ Ｃｌｉｎ３２，６７１－６８８，ｖｉｉｉ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｎｃｌ．２０１４．０５．００２（２０１４））。ＤＭＤ遺伝子は、知られている最長のヒト遺伝子の１つであるジストロフィンタンパク質をコードする。ジストロフィンは、細胞骨格アクチンフィラメントとジストログリカン複合体（ＤＧＣ）との間の結合を介して形質膜を強化するのに役立つ構造タンパク質である（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ５，１２２３－１２３９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｐｈｙ．ｃ１４００４８（２０１５））。したがって、ジストロフィンは、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、第２のアクチン結合ドメインとのスペクトリン様リピートからなる中央ロッドドメイン、及びＤＧＣと直接相互作用するＣ末端ドメインを含むいくつかの重要なドメインを有する（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．、上記）。ジストロフィンは、正常な筋肉収縮中にショックアブソーバーとして機能し、正常な活動中に筋肉の損傷や変性を防ぐために必要とされる。ジストロフィンがないと、筋肉の変性が衰弱を引き起こし、最終的には１０代前半に歩行不能になる。一旦車椅子に乗ると、患者は（それぞれ心臓及び横隔膜の関与による）心臓及び呼吸機能の急激な低下を有し、これがＤＭＤの早期死亡特性の主な原因である。
ジストロフィンタンパク質をコードする遺伝子であるＤＭＤ遺伝子は、部分的には遺伝子のサイズに起因して、多様な変異プロファイルを有する（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ３６，３９５－４０２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｕｍｕ．２２７５８（２０１５））。エクソン重複は、遺伝子の一部が重複し、元の遺伝子断片に直接隣接して配置されるときに生じる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。エクソン欠失は、１つ以上のエクソンを含有する遺伝子の一部が遺伝子から完全に切除されるときである（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。エクソン欠失及び重複の両方は、通常、機能的なジストロフィンタンパク質の喪失をもたらすフレームシフト変異をもたらす。他のＤＭＤ変異は、一般的にフレームシフト変異をもたらすサブエクソン挿入及び欠失（インデル）からなる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。他のＤＭＤ変異は、特定のエクソンのスプライス部位に影響を与える変異からなる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。更に他のＤＭＤ変異は、ＤＭＤ遺伝子のイントロン領域全体にわたる可変かつ高度に特異的な変異からなる（Ｂｌａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．上記）。この広範な変異プロファイルにもかかわらず、遺伝子編集は、上述の変異の多くのタイプを修正する上で大きな可能性を示している。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート及び関連タンパク質９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）（「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９」又は「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９」）は、ＲＮＡプログラム可能なエンドヌクレアーゼを利用して、ウイルス侵入者から細菌を保護する細菌に見出される適応免疫系である。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質からなるこの系は、ｇＲＮＡに相補的な部位及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位として知られる短い認識配列の近くで正確な二本鎖切断（ＤＳＢ）を行うために再利用されている。Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９、以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、又はＣｓｘ１２と呼ばれていた）は、ＤＮＡウイルス及びプラスミドに対する特定の細菌の免疫学的防御に重要な役割を果たす１６０キロのダルトンのタンパク質であり、遺伝子工学の応用において多用されている。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ配列に相補的なＤＮＡの特定の鎖を認識及び切断するためのガイドとしてＣＲＩＳＰＲ配列を使用する酵素である。Ｃａｓ９酵素は、ＣＲＩＳＰＲ配列とともに、生物内の遺伝子を編集するために使用され得るＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９として知られる技術の基礎を形成する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２３（Ｒ１）：Ｒ４０－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｕ１２５．ＰＭＩＤ２４６５１０６７）。この編集プロセスは、基礎的な生物学的研究、バイオテクノロジー製品の開発、及び疾患の治療を含む幅広い用途を有する。
本開示は、本明細書に開示される遺伝子編集複合体、方法及び使用においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を利用する。本開示には、その機能的断片を含む、Ｃａｓ９の全ての種、ホモログ、オルソログ、及びバリアントの使用が含まれていた。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、別途明記されない限り、操作されたＣａｓ９バリアント（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ１１，３５７６（２０２０）、ＷＯ２０１４／１９１５２１）、及びｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９（例えば、ＷＯ２０１６／１１２２４２、ＷＯ２０１７／１９７２３８）、並びにそれらの機能的断片を含む、全てのＣａｓ９種、ホモログ、オルソログ、バリアントを含む。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、別途明記されない限り、任意のＣａｓ９種、ホモログ、オルソログ、バリアント、ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９を含む操作されたバリアント、哺乳動物コドン最適化Ｃａｓ９、又はその機能的断片である。
サイズ及びＰＡＭ認識配列が異なる、異なる細菌由来のＣａｓ９タンパク質のいくつかの異なる種及びホモログが存在する。最もよく特性評価されている変異体は、１，３７１個のアミノ酸によってコードされ、５’－ＮＧＧ－３’のＰＡＭ認識配列を有する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）由来のＣａｓ９である（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９（２０１２）、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ８，２２８１－２３０８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１３．１４３（２０１３）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ９８，１２０５－１２４０，ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００４６．２０１７（２０１８））。あまり一般的に使用されないＣａｓタンパク質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）由来であり、ＳｐＣａｓ９とは対照的に、１０５３個のアミノ酸によってコードされ、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（配列番号２７９）のＰＡＭ認識配列を有する（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５２０，１８６－１９１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４２９９（２０１５））。より小さいＳａＣａｓ９タンパク質の使用は、いくつかの態様では、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターに関連する限られたカーゴスペース（約５ｋｂ）を考慮して、ウイルスによって送達される遺伝子療法において好ましい（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ７９，９９３３－９９４４，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．１５．９９３３－９９４４．２００５（２００５））。それにもかかわらず、本開示には、Ｃａｓ９の全ての様々な種、ホモログ、オルソログ、及び変異体、並びにそれらの機能的断片の使用が含まれ、本明細書に例示される特定のＣａｓ９に限定されない。本開示の様々な例示的な態様では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａＣａｓ９）及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）が提供される。本開示は、Ｃａｓ９のこれらの特定の種に限定されない。いくつかの態様では、Ｃａｓ９は、哺乳動物にコドン最適化されている。いくつかの態様では、例えば、ＳａＣａｓ９は、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ Ｏｃｔｏｂｅｒ １５，２０１９ １１６（４２）２０９６９－２０９７６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９０６８４３１１６）により記載されている。いくつかの態様では、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９は、市販されており、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（カタログ番号６８３３８、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／６８３３８／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／）からのＰＸ４０４である。いくつかの態様では、ＳｐＣａｓ９は、文献（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１ＪＨ４３（Ｑ１ＪＨ４３＿ＳＴＲＰＤ）に記載されている。
例示的な態様では、本開示は、Ｃａｓ９コード配列を提供する。例示的な態様では、Ｃａｓ９は、配列番号２７７若しくは２７８（表２）に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号２７７若しくは２７８に示される配列と少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアント、又はその機能的断片によってコードされる。例示的な態様では、本開示は、表２に記載されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（配列番号２７７）及びＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（配列番号２７８）をコードするヌクレオチド配列を提供する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９体細胞遺伝子編集は、ＤＭＤ変異を修正し、患者に有意義な利益を提供する莫大な可能性を有する。ジストロフィン異常症は、ＤＭＤ遺伝子の無数の変異によって引き起こされ得るが、エクソンの重複は、多くのジストロフィン異常症患者に影響を及ぼす最も一般的なものの１つである。本開示は、単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をＣａｓ９とともに使用して、ＤＮＡの重複領域を切除し、正常なコード配列への復帰をもたらす２つの切断を生成する、エクソン重複を修正するためのアプローチを提供する（図１Ａ～Ｂ）。ほとんどの現代的なエクソン欠失及びスキップアプローチ、ＤＭＤ遺伝子の正常なコード配列（ＣＤＳ）への復帰、及び完全長ジストロフィン発現の回復で達成されるように機能的変異型アイソフォームを生成するためにリフレームするのではなく、本明細書に記載の生成物、方法、及び使用で実施されるように、１つ以上のＤＭＤ遺伝子変異に起因するジストロフィン異常症又は筋ジストロフィーを有する対象に最も堅牢で長期的な利益を提供する。
いくつかの態様では、Ｃａｓ９をコードする核酸は、細胞において発現するためのウイルスベクターを含む、哺乳動物発現ベクターに挿入される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９のための哺乳動物ｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞内での発現のためのウイルスベクターを含む、哺乳動物発現ベクターにクローニングされる。
いくつかの態様では、ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９をコードするＤＮＡは、プロモーターの発現下にある。いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ８ｅプロモーター、ＳＰＣ５－１２プロモーター、又はデスミンプロモーターである。
いくつかの態様では、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。内因性Ｕ６プロモーターは、通常、Ｕ６ ＲＮＡの発現を制御する。Ｕ６ ＲＮＡは、スプライシングに関与する核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であり、これらは十分に特性評価されている［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様では、Ｕ６プロモーターは、哺乳動物細胞におけるｓｈＲＮＡ分子のベクターベースの発現を制御するために使用され［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９（３）：１４４３－８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）］、それは、（１）プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌｙＩＩＩ）によって認識され、ｓｈＲＮＡの高レベルな構成的発現を制御し、（２）プロモーターがほとんどの哺乳動物細胞型において活性であるためである。いくつかの態様では、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するのに必要な全ての要素が転写開始部位の上流に位置する、ＩＩＩ型ＰｏｌＩＩＩプロモーターである（Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００））。本開示は、マウス及びヒトの両方のＵ６プロモーターを含む。ループによって接続された標的遺伝子からのセンス及びアンチセンス配列を含有するｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、そこでダイサー（Ｄｉｃｅｒ）は、それを小さな／短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に処理する。いくつかの態様では、Ｃａｓ９についての哺乳動物ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｕ６プロモーターの制御下にある。いくつかの態様では、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、ＭＨＣＫ７プロモーターの制御下にある。
本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、及びワクシニアウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示の核酸、例えば、本明細書に開示のＤＭＤ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を送達する。いくつかの態様では、ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、個別のベクターに個別にクローニングされる。いくつかの態様では、ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及びＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を、同じベクターにクローニングする。したがって、いくつかの態様では、本開示は、本開示において上記に記載されるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むベクターを含む。いくつかの態様では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。本開示を通して様々な態様では、ＡＡＶは、ｒＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ、又はｓｓＡＡＶである。
いくつかの態様では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用して、ｇＲＮＡをコードする核酸及び／又はＣａｓ９をコードする核酸を送達する。ＡＡＶは、複製欠乏パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、約４．７ｋｂ長であり、１４５ヌクレオチドの逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されており（ＡＡＶ８に関連する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照されたい）、ＡＡＶ９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＭｙｏＡＡＶ１Ａに関する情報は、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ１８４（１９）：４９１９－３８（２０２１））に提供されている。ＡＡＶＭＹＯに関する情報は、Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１：５４３２（２０２０）；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２０－１９２３０）によって提供されている。ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１のゲノムも、当該技術分野で既知である。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体への組み込みを指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）とカップリングした、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力のある固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド化、及び組み込みを誘導するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てを、外来ＤＮＡで置き換えることができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性ではない。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＤＭＤ標的化ポリヌクレオチド構築物に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、ＤＭＤを標的とする他のポリヌクレオチド構築物とともに投与される。そのため、いくつかの態様では、ＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＤＭＤドナー配列をコードするポリヌクレオチドとともに投与される。様々な態様では、ｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ＣＫ８ｅプロモーター、ＳＰＣ５－１２プロモーター、又はデスミンプロモーター等のプロモーターを含むが、これらに限定されない様々なプロモーター下で発現される。具体的には、この戦略は、単一のバックボーン内の複数のコピーにおける同じｇＲＮＡのより効率的な発現を達成するために様々な態様で使用される。ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。本明細書において上に示されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示又は記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを含むゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、本開示は、ｒＡＡＶを提供し、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐＤＮＡを欠いている。いくつかの態様では、本開示は、ｒＡＡＶを提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ４カプシド、ＡＡＶ５カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ７カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶ１０カプシド、ＡＡＶ１１カプシド、ＡＡＶ１２カプシド、ＡＡＶ１３カプシド、ｒＡＡＶａｎｃ８０カプシド、ＡＡＶｒｈ．７４カプシド、ｒＡＡＶｒｈ．８カプシド、ｒＡＡＶｒｈ．１０カプシド、ＭｙｏＡＡＶ１Ａカプシド、ＡＡＶＭＹＯカプシド、又はｒＡＡＶ－Ｂ１カプシドを更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示又は記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを含むゲノムを含む、ｓｃＡＡＶを提供する。いくつかの態様では、ｓｃＡＡＶは、ｓｃＡＡＶ１、ｓｃＡＡＶ２、ｓｃＡＡＶ３、ｓｃＡＡＶ４、ｓｃＡＡＶ５、ｓｃＡＡＶ６、ｓｃＡＡＶ７、ｓｃＡＡＶ８、ｓｃＡＡＶ９、ｓｃＡＡＶ１０、ｓｃＡＡＶ１１、ｓｃＡＡＶ１２、ｓｃＡＡＶ１３、ｓｃＡＡＶａｎｃ８０、ｓｃＡＡＶｒｈ．７４、ｓｃＡＡＶｒｈ．８、ｓｃＡＡＶｒｈ．１０、ｓｃＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ｓｃＡＡＶＭＹＯ、又はｓｃＡＡＶ－Ｂ１である。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染が許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１を含むがこれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスが由来することができる任意のＡＡＶ血清型に由来する。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、本開示に含まれる。例えばＭａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が特に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のガイドＲＮＡ又はＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。したがって、本開示の実施形態は、配列番号１～１８６のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列を含む核酸、又は配列番号１～１８６のうちのいずれかに示される配列と少なくとも、又は約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶゲノムを含む。
パッケージング細胞を産生する方法は、ＡＡＶ粒子の作成に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
ｒＡＡＶ産生の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９（１９９２）、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２））に概説されている。様々なアプローチが以下：Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４－５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３：１１２４－３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、特に、ｒＡＡＶ産生に関する文書のセクションに重点を置く。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを生成するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定的に形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
上記及び以下に記載される本開示の方法の細胞形質導入効率は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の効率であり得る。
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、具体的には、ｒＡＡＶ産生に関する文書のセクションに重点を置く。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの、安定して形質転換されたがん細胞である。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製される。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法を含む。
別の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを含むｒＡＡＶを含む組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡを送達するためのｒＡＡＶを含む、組成物を含む。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列のうちの１つ以上と、Ｃａｓ９をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列と、を含む、組成物ｒＡＡＶを含む。本開示の組成物は、ｒＡＡＶ及び１つ以上の薬学的又は生理学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含む。許容される担体及び希釈剤は、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、若しくは他の有機酸）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジン）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）、塩形成カウンターイオン、及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる。
いくつかの態様では、本開示は、ｇＲＮＡをコードする、又はｇＲＮＡを含む１つ以上の配列を含む１つのプラスミドと、ｇＲＮＡスペーサー配列によって決定されるＤＮＡ遺伝子座において二本鎖ＤＮＡ切断を生成することができるＣａｓ９をコードする配列を含む第２のプラスミドと、を含む、二重プラスミド系を含む。いくつかの態様では、プラスミドは、送達のためにＡＡＶに導入される。いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒＡＡＶ、ｓｃＡＡＶ、又はｓｓＡＡＶである。いくつかの態様では、プラスミドは、非ベクター化送達を介して細胞に導入される。
いくつかの他の態様では、核酸は、非ベクター化送達を介して細胞に導入される。そのため、実施形態において、本開示は、ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡ又はＣａｓ９をコードする核酸の非ベクター化送達を含む。いくつかの態様では、この文脈では、核酸と複合体を形成し、細胞外及び細胞内ヌクレアーゼからそれらを保護することができる合成担体は、ウイルスベクターの代替物である。いくつかの態様では、そのような非ベクター化送達は、本開示の核酸を含むナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームの使用を含む。本開示はまた、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを単独又は組み合わせで含む組成物を含む。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のＡＡＶを、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに適切な溶液に取り込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本的な分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分に加えて予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示の方法で投与されるＡＡＶの力価は、例えば、特定のＡＡＶ、投与の様式、治療目標、個体、及び標的にされる細胞型に応じて異なり、当該技術分野で標準の方法によって決定され得る。ＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（例えば、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、及び１×１０１４ｖｇ）。
実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡをコードする核酸及び／又はＣａｓ９をコードする核酸の非ベクター化送達を含む。いくつかの態様では、この文脈では、核酸と複合体を形成し、細胞外及び細胞内ヌクレアーゼからそれらを保護することができる合成担体は、ウイルスベクターの代替物である。本開示は、かかる非ベクター化送達を含む。本開示はまた、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを単独又は組み合わせで含む組成物を含む。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡを含むポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、を含む任意の１つ以上の核酸、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９をコードする核酸を、それを必要とする細胞又は対象に送達する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、対象に、（ｉ）ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡ（例えば、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２若しくは３に影響を与える単一又は複数のエクソンの重複に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、変異を標的とするｇＲＮＡ）、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素、をコードする、１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶを投与することを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列、若しくは配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様では、方法は、対象に、（ｉ）ｇＲＮＡであって、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に影響を及ぼす単一又は複数のエクソンの重複を標的とする、ｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を投与することを含む。いくつかの態様では、方法は、１つ以上のＡＡＶベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様では、方法は、非ベクター化送達を介して核酸を送達することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡを含むポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、を含む任意の１つ以上の核酸、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９をコードする核酸を、それを必要とする細胞又は対象に送達する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、対象に、（ｉ）ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡ（例えば、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２若しくは３に影響を与える単一又は複数のエクソンの重複に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、変異を標的とするｇＲＮＡ）、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素、をコードする、１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶを投与することを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列、若しくは配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様では、方法は、対象に、（ｉ）ｇＲＮＡであって、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に影響を及ぼす単一又は複数のエクソンの重複を標的とする、ｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を投与することを含む。いくつかの態様では、方法は、１つ以上のＡＡＶベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様では、方法は、非ベクター化送達を介して核酸を送達することを含む。
更に別の態様では、本開示は、細胞内でＤＭＤ遺伝子の発現を増加させる、又は完全長ジストロフィン若しくは機能的ジストロフィンの発現を増加させる方法を提供し、方法は、（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアントを含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡを含むポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的化するＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、を含む核酸を有する細胞、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９をコードする核酸を、それを必要とする細胞又は対象と接触させることを含む。いくつかの態様では、方法は、対象に、（ｉ）ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡ（例えば、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２若しくは３に影響を与える単一又は複数のエクソンの重複に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、変異を標的とするｇＲＮＡ）、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素、をコードする、１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶを投与することを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列、若しくは配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様では、方法は、細胞を、（ｉ）ｇＲＮＡであって、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に影響を及ぼす単一若しくは複数のエクソンの重複を標的とする、ｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片、をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と接触させることを含む。いくつかの態様では、方法は、１つ以上のＡＡＶベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様では、方法は、核酸を非ベクター化送達を介して細胞に送達することを含む。
更に別の態様では、本開示は、細胞内で、ＤＭＤ遺伝子の発現を増加させる、又は完全長ジストロフィン若しくは機能的ジストロフィンの発現を増加させる方法を提供し、方法は、（ｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアントを含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡを含むポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的化するＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９をコードする核酸を、それを必要とする細胞又は対象と接触させることを含む。いくつかの態様では、方法は、対象に、（ｉ）ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡ（例えば、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、重複変異を標的とするｇＲＮＡ）、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素、をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶを投与することを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸は、配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列、若しくは配列番号２７７若しくは２７８に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又はその機能的断片を含む。いくつかの態様では、方法は、細胞を、（ｉ）ｇＲＮＡであって、少なくとも１つのｇＲＮＡが、ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複を含むがこれらに限定されない、エクソン２又は３に影響を及ぼす単一若しくは多重のエクソンの重複を標的とする、ｇＲＮＡ）、及び（ｉｉ）Ｃａｓ９酵素又はその機能的断片をコードする、ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させることを含む。いくつかの態様では、方法は、１つ以上のＡＡＶベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様では、方法は、非ベクター化送達を介して核酸を送達することを含む。
いくつかの態様では、ＤＭＤの発現又は全長ジストロフィン若しくは機能的ジストロフィンの発現は、本明細書に提供される方法によって、細胞又は対象において、少なくとも又は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％増加する。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１～１８４のいずれか１つに示される核酸配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡを含むヌポリクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９をコードする核酸、を含み、それらは細胞若しくは対象に送達され、ＤＭＤ遺伝子を編集し、単一のエクソンの重複若しくは複数のエクソンの重複を修正し、細胞又は対象における完全長ジストロフィン発現又は機能的ジストロフィン発現を回復又は増加させる、組換え遺伝子編集複合体を提供する。そのような遺伝子編集複合体は、ＤＭＤの発現を操作し、完全長又は機能的ジストロフィンの発現を増加させ、特に、ＤＭＤ遺伝子のものなどの疾患関連配列が不適切に発現されるＲＮＡレベルで、筋ジストロフィーなどの異常なＤＭＤ発現に関連する遺伝子疾患を治療するために使用される。
いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号１～１８４のいずれか１つに示される核酸配列を含むＤＭＤ ｇＲＮＡを含むヌポリクレオチド、若しくは配列番号１～１８４のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも若しくは約７０％の同一性を含むそのバリアント、又は配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を標的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸、及び（ｉｉｉ）Ｃａｓ９をコードする核酸、を含み、それらは細胞若しくは対象に送達され、ＤＭＤ遺伝子を編集し、単一のエクソンの重複若しくは複数のエクソンの重複を修正し、細胞又は対象における完全長ジストロフィン発現又は機能的ジストロフィン発現を回復又は増加させる、組換え遺伝子編集複合体を提供する。そのような遺伝子編集複合体は、ＤＭＤの発現を操作し、完全長ジストロフィンの発現、又は機能的ジストロフィンの発現を増加させ、特に、ＤＭＤ遺伝子のものなどの疾患関連配列が不適切に発現されるＲＮＡレベルで、筋ジストロフィーなどの異常なＤＭＤ発現に関連する遺伝子疾患を治療するために使用される。
いくつかの態様では、本開示は、ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓ９酵素若しくはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の送達のためのＡＡＶ形質導入細胞を提供する。インビボ又はインビトロで、標的細胞をＡＡＶで形質導入する方法が、本開示に含まれる。方法は、有効用量又は有効複数用量の本開示のＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒトなど）を含む対象に投与する工程を含む。用量が筋ジストロフィーの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態において、有効用量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除又は低減）し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、筋ジストロフィーの寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、ＤＭＤである。いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、ＩＭＤである。いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、ＢＭＤである。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書に使用される併用は、同時治療又は連続治療を含む。本開示の方法と、標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド及び／又は免疫抑制薬）との組み合わせは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１３／０１６３５２号に開示されるものなどの他の療法との組み合わせと同様に、特に企図される。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶ及びｓｃＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される疾患状態、及びＤＭＤを発現する細胞などの標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。いくつかの実施形態において、投与経路は、筋肉内である。いくつかの実施形態において、投与経路は、静脈内である。
特に、本開示のＡＡＶの実際の投与は、ＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉、血流、中枢神経系、及び／又は脳若しくは他の器官への直接注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ＡＡＶを用いる通常の方法では避けるべきである）。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に援用される）。薬学的組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。ＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射の目的のために、セサミ油若しくはピーナッツ油などのアジュバント中の溶液、又は水性プロピレングリコール、並びに滅菌水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容される塩としてのＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に入手可能である。
注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器での使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。いくつかの態様では、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＤＭＤ ｇＲＮＡ及びＣａｓ９の発現をもたらす本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介したインビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ｇＲＮＡを含むヌクレオチド配列、及び１つ以上のＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載のＤＭＤ又はＣａｓ９構築物のうちの１つ以上の投与／送達を指すために使用される。
一態様では、ＡＡＶによる形質導入は、インビトロで実行される。一実施形態において、所望の標的細胞は、対象から取り出され、ＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。代替的に、同系又は異種の細胞が、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じない場合に使用することができる。
対象への形質導入及び形質導入した細胞の再導入のために好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態において、細胞は、例えば適切な培地中で、ＡＡＶを細胞と組み合わせることによってインビトロで形質導入され、サザンブロット及び／若しくはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、又は選択可能なマーカーを使用して、目的のＤＮＡを有するこれらの細胞についてスクリーニングする。次いで、形質導入された細胞を薬学的組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射による、又は例えばカテーテルを使用した平滑筋及び心筋への注射によるなど、様々な技術によって対象に導入することができる。
本開示は、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくはある間隔で与えられる用量）の、ＤＭＤ発現を回復させることを目的とするＤＭＤ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡと、Ｃａｓ９をコードして、ＤＭＤ配列の切断をそれを必要とする細胞又は対象にもたらすＤＮＡと、を含むＡＡＶを投与する方法を提供する。
本開示のＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＤＭＤ発現及びＣａｓ９酵素を標的とするガイドＲＮＡの持続発現をもたらす。したがって、本開示は、完全長及び／又は機能的ジストロフィン発現を細胞又は対象に回復させるＡＡＶを投与／送達する方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、対象中にある。いくつかの態様では、細胞は、動物対象である。いくつかの態様では、動物対象は、ヒト対象である。
これらの方法には、本開示の１つ以上のＡＡＶで、血液及び血管系、中枢神経系、並びに組織（筋細胞及びニューロン、骨格筋を含む筋肉などの組織、心臓、脳、皮膚、眼、並びに内分泌系などの臓器、並びに内分泌腺及び唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）に形質導入することが含まれる。いくつかの態様では、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットを用いて形質導入が行われる。例えば、本開示の一実施形態は、筋肉特異的制御要素によって指向される筋肉細胞及び筋肉組織を形質導入する方法を提供し、これには、限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するものが含まれる［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）］、ミオサイト特異性エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心臓アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］及び、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速攣縮トロポニンＣ遺伝子、遅攣縮心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅攣縮トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘導核内因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１）］、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘発性要素及びプロモーター［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい］、ｔＭＣＫプロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：１４８９－１４９９（２００８）を参照されたい］、ＣＫ６プロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、上記］、及び他の制御要素。
ＡＡＶは、ＤＭＤを発現する全ての罹患した臓器を標的とするため、本開示は、本明細書に記載されるようなＤＮＡの、対象の全ての細胞、組織、及び臓器への送達を含む。いくつかの態様では、骨格筋組織を含む筋肉組織は、インビボＤＮＡ送達のための魅力的な標的である。本開示は、形質導入細胞由来のジストロフィンを発現するためのＤＭＤ遺伝子の持続的発現を含む。いくつかの態様では、本開示は、形質導入筋線維由来のジストロフィンの持続発現を含む。「筋肉細胞」又は「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、又は心臓組織に由来する骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞又は細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、いくつかの態様では、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞など、分化又は未分化である。
いくつかの態様では、対象又は患者の筋ジストロフィーを治療する方法が提供される。いくつかの態様では、「治療すること」は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーの１つ以上の症状（筋肉消耗、筋肉の脱力、筋緊張症、骨格筋の問題、心臓機能の異常、呼吸困難、発話及び嚥下の問題（構音障害及び嚥下障害）又は認知障害を含むが、これらに限定されない）、網膜の異常、腰の脱力、顔の脱力、腹部筋の脱力、関節及び脊髄の異常、下肢の脱力、肩の脱力、聴力喪失、筋肉の炎症、及び非対称的な衰弱を含む）を改善、阻害、又は更には予防することを含む。
いくつかの態様では、治療方法は、ジストロフィンタンパク質の発現の増加、又は対象において生理学的又は機能的に活性であるジストロフィンタンパク質の変化した形態又は断片の発現の増加をもたらす。いくつかの態様では、ジストロフィンは、完全長ジストロフィン、又はＤＭＤ遺伝子の変異に起因するであろうであろう、又はそれに起因する筋ジストロフィーを予防、改善、又は治療するジストロフィンの機能形態である。いくつかの態様では、ジストロフィンは、より短い、使用可能なジストロフィンであり、いくつかの態様では、そのようなＤＭＤ変異の影響をより軽度にする。特定の態様では、治療方法は、対象におけるジストロフィー病理の進行を阻害する。いくつかの態様では、治療方法は、対象における筋肉機能を改善する。いくつかの態様では、筋肉機能の改善は、筋力の改善である。いくつかの態様では、筋肉機能の改善は、立位及び歩行における安定性の改善である。筋力の改善は、最大自発的等角収縮試験（ｍａｘｉｍａｌ ｖｏｌｕｎｔａｒｙ ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＭＶＩＣＴ）などの当該技術分野で知られている技術によって決定される。いくつかの例では、筋肉機能の改善は、立位及び歩行の安定性の改善である。いくつかの態様では、安定性又は強度の改善は、６分歩行試験（６－ｍｉｎｕｔｅ ｗａｌｋ ｔｅｓｔ）（６ＭＷＴ）、１００メートル走行／歩行試験（１００ｍｅｔｅｒ ｒｕｎ／ｗａｌｋ ｔｅｓｔ）、又は時間計測階段上り（ｔｉｍｅｄ ｓｔａｉｒ ｃｌｉｍｂ）などの当該技術分野で知られている技術によって決定される。
分子的、生化学的、組織学的、及び機能的なエンドポイントは、ＤＭＤ遺伝子の発現を増加させるための、本明細書に開示される生成物及び方法の治療有効性を実証する。本開示によって企図されるエンドポイントには、ＤＭＤ（ジストロフィン）タンパク質発現の増加が含まれ、これは、ＤＭＤ、ＩＭＤ、及びＢＭＤ、並びにＤＭＤ発現の欠如又は減少に関連する他の障害を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィーの治療に適用される。
本発明はまた、本明細書に記載の障害の治療に使用するためのキットを提供する。かかるキットは、薬学的に許容される担体中に、上述の本明細書に記載の核酸のうちのいずれか、又は上記の本明細書で記載のウイルスベクターのうちのいずれかを含む、少なくとも第１の無菌組成物を含む。別の構成要素は、任意選択により、治療組成物の投与のための好適な容器及びビヒクルとともに、障害の治療のための第２の治療剤である。キットは、第１及び第２の組成物の送達を懸濁し、希釈し、又は影響を及ぼすための溶液又は緩衝液を任意選択的に含む。
一実施形態において、そのようなキットは、密封されたボトル又は容器等の容器にパッケージングされた希釈剤中の核酸又はベクターを含み、核酸又はベクターの使用を説明する標識が容器に貼付される、又はパッケージに含まれる。一実施形態において、希釈剤は、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気の量）が非常に少なくなるように、容器内にある。好ましくは、ヘッドスペースの量は無視できる（すなわち、ほとんどない）。
いくつかの態様では、製剤は、安定化剤を含む。「安定化剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護し、かつ／又は安定状態で製剤の安定性若しくは保存期間を延長させる物質又は賦形剤を指す。安定化剤の例としては、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、製剤は、抗微生物保存剤を含む。「抗微生物保存剤」という用語は、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する組成物に添加される任意の物質を指す。抗微生物保存剤の例としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、キットは、キットに提供される試薬の使用を説明するラベル及び／又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つ以上を送達するためのカテーテル、シリンジ、又は他の送達デバイスを任意選択的に含む。
本文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に認められない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「ａ」又は「ａｎ」で記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。本開示の態様が特徴を「含む」として記載される場合、実施形態はまた、特徴から「なる」又は「本質的になる」ことが企図される。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で他に示されない限り、範囲及び各エンドポイントに入る各々の別個の値を個別に参照するための略記方法として機能することを単に意図しており、各々の別個の値及びエンドポイントは、本明細書で個別に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施される。本明細書に提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく照らすことを意図しており、別段の主張がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
本明細書の本文全体で引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた題材が本明細書と一致しないか、又は矛盾する範囲では、本明細書は、いかなるかかる題材にも優先する。
本開示及びその利点のより良い理解は、例示的な目的のためのみに提供される以下の実施例から得られるであろう。実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、それらの観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆されるが、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
本開示の追加の態様及び詳細は、限定するのではなく例示的であることが意図されている以下の実施例から明らかであろう。
実施例１
ＤＭＤを標的とするｇＲＮＡ配列の設計及び生成
ＤＭＤエクソンの重複を修正する能力を試験するために、様々なｇＲＮＡ配列を、ＤＭＤ遺伝子を標的とするために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９と併せて使用するように設計した（図２及び図５を参照）。表１は、ヒト及びマウスＤＭＤエクソン、並びにＤＭＤ遺伝子の隣接するイントロン配列を標的化するように設計された、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのｇＲＮＡヌクレオチド配列を提供する。
表１の配列は、エクソン２にまたがる２０００塩基対ウインドウ内（イントロン１、イントロン２、及びエクソン２内）及びエクソン３の下流の１０００ｂｐウインドウ内（イントロン３内）のＳａＣａｓ９（５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’）（配列番号２７９）及びＣｊＣａｓ９（５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’）（配列番号２８０）ＰＡＭ配列に対する最新のヒト（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２）及びマウス（ＧＲＣｍ３８．ｐ６）ゲノムＤＮＡ参照構築物を検索することによって設計した。次に、ＰＡＭ部位に対応する潜在的なｇＲＮＡスペーサー配列を、同じ鎖上のＰＡＭ配列の２２塩基上流を収集し、次いでそれらをＲＮＡ配列に変換することによって生成した。５’グアニン残基で始まらなかったものについては、追加の５’グアニンを添加して、効率的なＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写開始を駆動した。最高の潜在的な遺伝子編集効率及び部位特異性を有するｇＲＮＡを選択しながら、ライブラリサイズを低減するために、３段階のインシリコ除外パイプラインを適用した。第一に、スペーサー配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結シグナル（５’－ＵＵＵＵＵ－３’）（配列番号２８１）についてスクリーニングし、それらが５つ以上のウラシル残基の１つ以上のホモポリマー配列を含有する場合、更なる試験から除外した。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースの制約は、発現に使用されるＵ６小核ＲＮＡプロモーターからの効率的なｇＲＮＡ転写を駆動するために必要であった。第二に、ｇＲＮＡが、マイナーな対立遺伝子を保有する患者のｇＲＮＡ活性を阻害し得る１つ以上の共通の（＞１％マイナーな対立遺伝子頻度）単一ヌクレオチド多型を含有するゲノムＤＮＡ領域を標的とした場合、ｇＲＮＡを更なる解析から除外した。最後に、ｇＲＮＡが、ＣＣＴｏｐオンラインウェブツールを使用し、適切なゲノムＤＮＡ参照構築物（ヒト又はマウスのいずれか）内で検索して予測されるように、３０を超える予測されたオフターゲット部位、又はエクソン内の１つ以上のオフターゲット部位を有する場合、ｇＲＮＡを除外した。
実施例２
実験材料及び方法
分子クローニング
ＳａＣａｓ９及びＣｊＣａｓ９ ｇＲＮＡ配列は、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位に隣接するＵ６プロモーター駆動発現カセット内の二本鎖ＤＮＡ断片としてＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成された。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位が隣接するサイトメガロウイルスプロモーター駆動ＳａＣａｓ９配列及びＵ６プロモーター駆動ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ発現カセットを含有するカスタムプラスミドを、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ Ｉｎｃ．によって作製した。ＣｊＣａｓ９配列を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって３つの断片として合成し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ Ｉｎｃカスタムプラスミド中のＳａＣａｓ９の代わりにＳｎａＢＩ部位とＰｓｉＩ部位との間に組み立てた。各ＳａＣａｓ９又はＣｊＣａｓ９ ｇＲＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位を有するＲｏｃｈｅ ｒＡＰｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｐｈｏｓ＆Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、対応するＳａＣａｓ９又はＣｊＣａｓ９プラスミドにサブクローニングした。全てのプラスミドは、サンガー配列決定法によって確認された。
ＡＡＶプラスミドクローニングのために、ＡＡＶ血清型２ＩＴＲ、複数クローニング部位、及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｈＧＨｐＡ）をコードするプラスミドを、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ（ｐＡＡＶ－ＭＣＳ）から購入した。ＭＨＣＫ７プロモーター駆動のＳａＣａｓ９発現カセットを調製するために、ＰＣＲを使用してＣＭＶプロモーターを除去し、ＳａＣａｓ９ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ Ｉｎｃカスタムプラスミドを線形化した。次いで、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）を使用して、ＭＨＣＫ７プロモーター配列をＣＭＶプロモーターの代わりにサブクローニングした。次いで、ＰＣＲを使用して、プラスミドからＭＨＣＫ７プロモーター及びＳａＣａｓ９コード配列を増幅し、末端にＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ部位を追加した。次いで、Ｒｏｃｈｅ ｒＡＰｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｐｈｏｓ＆Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔをＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限部位とともに使用して、ｈＧＨｐＡの上流のＩＴＲ間のｐＡＡＶ－ＭＣＳプラスミドにアンプリコンをサブクローニングした。３つのＵ６駆動ｇＲＮＡ発現カセットを含有するｓｃＡＡＶを生成するために、ＰＣＲを使用して、Ｕ６駆動ｇＲＮＡ発現カセットを増幅し、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位を末端に追加した。Ｒｏｃｈｅ ｒＡＰｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｐｈｏｓ ＆Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、自己相補的ＡＡＶ骨格内のＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位間の単一カセットをサブクローニングした後、追加のＰＣＲを使用して、両端にＮｈｅＩ部位、及び両端にＮｏｔＩ部位を有するＵ６－ｍＤＳ０１０アンプリコンを生成した。次いで、これらのアンプリコンを、Ｒｏｃｈｅ ｒＡＰｉｄ ＤＮＡ Ｄｅｐｈｏｓ＆ライゲーションキットを用いて、それぞれの制限部位で個別にサブクローニングして、Ｕ６－ｇＲＮＡ ｓｃＡＡＶプラスミドの３つのコピーを生成した。
いくつかの態様では、オールインワンＡＡＶプラスミドが構築される。ＣＭＶ駆動のＳａ Ｃａｓ９を含有するオールインワンＡＡＶプラスミドについて、ＮｏｔＩ制限部位に隣接するＣＭＶ駆動のＳａ Ｃａｓ９及びＵ６駆動のｈＤＳＡ－０１８ｇＲＮＡをコードするカスタムプラスミドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって生成した。ｐＡＡＶ－ＭＣＳプラスミドにＩＴＲ間でサブクローニングされたＮｏｔＩ及びＣＭＶ－ＳａＣａｓ９－Ｕ６－ｈＤＳＡ－０１８断片でプラスミドを消化し、ｐＡＡＶ－ＡＩＯ－ｈＤＳＡ０１８を生成するためのプラスミドを生成した。Ｕ６－ｈＤＳＡ－０１８配列に隣接するＢａｍＨＩ部位及びＸｈｏＩ部位を使用して、Ｕ６－ｈＤＳＡ－０１８をＵ６－ｍＤＳＡ－００４及びＵ６－ｈＤＳＡ－０１７に置き換え、それぞれ、ｐＡＡＶ－ＡＩＯ－ｍＤＳＡ００４及びｐＡＡＶ－ＡＩＯ－ｈＤＳＡ０１７を生成するためのプラスミドを生成した。
全てのプラスミド配列を、制限断片長及びサンガー配列決定によって確認した。
細胞培養及び処置
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｏｓｍｉｃウシ血清、１％Ｇｉｂｃｏ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）、及び１％Ｇｉｂｃｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００×）を補充したＬ－グルタミン、４．５ｇ／Ｌグルコース及びピルビン酸ナトリウムを含むＣｏｒｎｉｎｇ ＤＭＥＭを含むプラスチック性の１０ｃｍのペトリ皿で培養した。細胞を、Ｇｉｂｃｏ０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を使用して、８０％コンフルエンシーに達すると、通常通り継代させた。トランスフェクションのために、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを含むＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを、ＨＥＫ２９３細胞のための製造業者の提案されたプロトコルに従って使用した。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素で不死化され、レンチウイルス（ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞）を使用して、ドキシサイクリン誘導性筋芽細胞決定タンパク質１で修飾された患者皮膚線維芽細胞を、Ｌ－グルタミン、２０％ＨｙＣｌｏｎｅ胎児ウシ血清、及び１％Ｇｉｂｃｏ抗生物質－抗真菌（１００×）を補充した４．５ｇ／Ｌグルコース及びピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、Ｇｉｂｃｏ０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液を使用して、８０％コンフルエンシーに達すると、通常通り継代させた。筋管への形質転換のために、ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞が６０％コンフルエンスに達すると、培養培地を、８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを３日間補充したＰｒｏｍｏＣｅｌｌ骨格筋細胞増殖培地に切り替えた。次いで培地を、８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充した骨格筋細胞分化培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に１４日間切り替えた。
ｇＲＮＡのインビトロスクリーニング
ＨＥＫ２９３細胞を１２ウェルのプラスチック組織培養皿（細胞２００，０００個／ウェル）に播種し、一晩培養した。細胞を、製造業者が提案したＨＥＫ２９３細胞のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸをＰｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに使用して、サイトメガロウイルスプロモーター駆動のＳａ又はＣｊＣａｓ９をコードするプラスミド、及びＵ６プロモーター駆動のＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡ又はＣｊＣａｓ９ ｇＲＮＡ発現カセットでトランスフェクトした。６時間後、培地を置き換え、細胞を更に７２時間培養した。０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を収集し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲを使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘導挿入及び欠失を検出するためにＥｎＧｅｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）とともに使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的位置にまたがるアンプリコンを生成した。切断生成物を、１０％ポリアクリルアミドトリスボレート－ＥＤＴＡゲルを使用して電気泳動で分離し、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムの溶液で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でＵＶ透過照射で撮像した。遺伝子編集は、予測される変異部位におけるアンプリコンの切断として検出可能であった（図３、図４、及び図６を参照されたい）。検出可能な遺伝子編集をもたらしたこれらのｇＲＮＡは、ヒットとみなされた。
免疫蛍光染色
マウス前脛骨筋を解剖し、トラガカントガム中にマウントした後、液体窒素で冷却されたイソペンタン中で瞬間凍結した。－２０℃のミクロトームを使用して、断面（１０ミクロン）を収集した。切片を、１０％の正常なヤギ血清及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間透過させた後、３体積のＰＢＳでそれぞれ５分間洗浄した。切片を、１０％の正常ヤギ血清及び０．１％のＴｗｅｅｎ２を補充したＰＢＳでブロックした。切片を、１０％の正常なヤギ血清及び０．１％のＴｗｅｅｎ２を補充したリン酸緩衝生理食塩水中の１：４００希釈のウサギ抗ジストロフィン抗体（ＡＢ１５２７７；Ａｂｃａｍ）及び１：４００希釈のラット抗ラミニン抗体（ＭＡＢ４６５６；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で２時間染色した。ＰＢＳ中の４体積の０．１％のＴｗｅｅｎ－２０でそれぞれ５分間洗浄した後、切片を１０％の正常なヤギ血清及び０．１％のＴｗｅｅｎ２を補充したリン酸緩衝生理食塩水中の１：５００希釈のＡｌｅｘａ５６８標識ロバ抗ラット抗体（７１２－５４６－１５３）及び１：５００希釈のＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ａ－２１０６９）で１時間染色した。次いで切片を、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０の３体積でそれぞれ５分間洗浄した。セクションをＤＡＰＩでＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔに取り付けた。
免疫蛍光イメージング及び解析
全筋断面画像を、青（ＤＡＰＩ）、緑（Ａｌｅｘａ４８８；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び赤（Ａｌｅｘａ５６８；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）蛍光チャネルのＮｉｋｏｎ Ｔｉ２Ｅ蛍光顕微鏡で、１０倍の対物レンズを通して収集した。一般解析３ソフトウェアモジュールとマウス組織用に開発されたカスタム解析ワークフローを使用して、Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアで解析を行った。骨格筋を、未処置のｄｕｐ２（エクソン２重複のマウスモデル）マウス組織切片における両方のシグナルの強度プロファイルから経験的に導き出されたジストロフィン陽性及びラミニン陽性画素の閾値を使用して、全組織切片として分析した。ジストロフィン陽性線維は、ラミニン陽性境界を使用して全ての個々の筋線維を特定し、各筋線維の周りのジストロフィン陽性セグメントの全長を測定し、筋線維周囲のラミニン陽性セグメントの全長に正規化することによって定量化した。ジストロフィンを全体的な陽性として筋線維を同定するための基準は、周囲の７０％以上に設定された。
ｇＲＮＡのインビボスクリーニング
マウス標的化ｇＲＮＡは、ＣＭＶ又はＭＨＣＫ７プロモーター駆動のＳａ又はＣｊ Ｃａｓ９をコードするＡＡＶ１及びＵ６プロモーター駆動のｇＲＮＡを、エクソン２重複のマウスモデル（ｄｕｐ２マウス）のＴＡ筋肉に筋肉内注射することによって、インビボでの活性についてスクリーニングする。４週間後、上記のように、ＴＡを収集し、マウントし、染色し、イメージングする。活性マウス標的化ｇＲＮＡは、注射された筋肉においてジストロフィン（＞２％ジストロフィン陽性線維）の発現をもたらすが、不活性ｇＲＮＡは、ジストロフィン発現をもたらさない（＜２％陽性線維）。ジストロフィン発現のレベルは、個々のｇＲＮＡの遺伝子編集活性に直接比例する。
実施例３
患者細胞におけるＤＭＤエクソン２重複及び複数のエクソンの重複の修正
これらの実験の目的は、ＡＡＶベクター化Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ送達系が、患者由来細胞におけるエクソン２及び複数のエクソンの重複の崩壊を誘導することができるかどうかを試験することであった。この目的のために、ミオシン重鎖エンハンサー及びクレアチニンキナーゼコアプロモーター（ＭＨＣＫ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３０００２７）及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルからなる合成プロモーターによって駆動されるＳａＣａｓ９のための筋特異的発現カセットをコードする組換えＡＡＶを構築した。第２のＡＡＶを構築し、ヒトＵ６プロモーター駆動のｈＤＳＡ０３０ ｇＲＮＡ発現カセットの３つのコピーをコードするために使用した。ｇＲＮＡ ＡＡＶは、インビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を増強することが示されているＡＡＶに典型的な一本鎖ゲノムの代わりに二本鎖ゲノムのパッケージングをもたらす末端分解部位を欠く変異逆位末端配列（ＩＴＲ）を有するという点で自己相補的なＡＡＶゲノムである（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０２１３４）。エクソン２重複（Ｄｕｐ２）を有する患者及びエクソン２～６重複（Ｄｕｐ２～６）を有する患者からのＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞を、表３に示されるように（ｎ＝３個の生物学的複製物）、２つのＡＡＶウイルス（表３に示される高（Ｈ）、中（Ｍ）、及び低（Ｌ）用量群）の混合物を使用して処置、又はＡＡＶウイルスなしでモック処置した（未処置）。
簡潔には、細胞を播種し、約６０％コンフルエンシーに達してから、培地を８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充したＭｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に切り替えた。３日後、培地を、表３に示すように、８μｇ／ｍＬのドキシサイクリン、Ｃａｓ９ ＡＡＶ（ｒＡＡＶ１．ＭＨＣＫ７．ＳａＣａｓ９．ｈＧＨｐＡ）、及びｇＲＮＡ ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ１．３ｘＵ６．ｈＤＳＡ０３０）を補充した Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に置き換えた。７２時間後（及びその後２～３日ごとに）、培地を、８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充した新鮮なＭｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に置き換えた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－２５キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、全ＲＮＡを収集する前に、２週間、細胞を分化転換した。ＲＮＡ（１μｇ）を使用して、２０μＬの反応において、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲは、ＤＭＤ５’非翻訳領域にアニールするフォワードプライマー、及び（Ｄｕｐ２細胞の）エクソン３又は（Ｄｕｐ２－６細胞の）エクソン８にアニールするリバースプライマーを使用して実施した（図７及び８）。重要なことに、Ｄｕｐ２患者由来のＤｕｐ２ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞株は、有意な量の天然エクソン２スキップ（ＤＭＤ転写産物の約１５％）を示した。
１細胞当たり２．０×１０５総ＡＡＶ（１：１のＣａｓ９：ｇＲＮＡ ＡＡＶ比）の感染多重度（ＭＯＩ）での低用量のＤｕｐ２細胞の処置は、エクソン２の余分なコピー及び介在するイントロン配列の欠失に起因する約３８％の野生型転写産物に対する約２．５倍の増加を誘導した（＞１５０ｋｂ）。１細胞当たり１×１０６合計ＡＡＶの中用量へのＭＯＩの増加による用量応答が観察され、野生型エクソン配置に対応する転写産物の＞６５％が得られた。しかしながら、細胞当たり３×１０６総ＡＡＶの高ＭＯＩ用量への更なる増加は、ＡＡＶ結合の飽和、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡの発現、又はＤＭＤ標的部位に起因する可能性があるため、増加した編集をもたらさなかった。Ｄｕｐ２－６細胞では、２１０ｋｂを超えるＤｕｐ２－６遺伝子座の欠失について同様の傾向が観察され、野生型エクソン配置が、未処置細胞の１０％未満から最も高いＡＡＶ用量で約５０％に増加した。編集の潜在的な飽和も観察され、中用量と高用量との間で改善は有意ではなかった。
実施例４
ＳａＣａｓ９及びｍＤＳＡ０１０ ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶ及びｓｃＡＡＶの筋肉内送達は、用量依存的な完全長ジストロフィンの発現の増加をもたらす。
設計されたＡＡＶベクター化Ｃａｓ９及びｇＲＮＡ送達系が、Ｄｕｐ２マウスモデルにおけるエクソン２重複変異の修正を誘導できるかどうかを試験するために、４週齢のＤｕｐ２マウスの前脛骨（ＴＡ）筋肉の両方に、表４に示されるように、様々な用量（表４に示されるように、高（Ｈ）、中（Ｍ）、及び低（Ｌ）の用量、の２つのＡＡＶの１：１の混合物を注射した（ｎ＝４個の生物学的複製物）。ＡＡＶ混合物は、ＭＨＣＫ７プロモーター駆動型ＳａＣａｓ９をコードする組換えＡＡＶ血清型９（ｒＡＡＶ９．ＭＨＣＫ７．ＳａＣａｓ９．ｈＧＨｐＡ）及びＵ６プロモーター駆動型ｍＤＳＡ０１０ ｇＲＮＡの３つのコピーをコードする自己相補的ＡＡＶ血清型９（ｓｃＡＡＶ９．３ｘＵ６．ｍＤＳＡ０１０）を含む。未処置の対照として、ｄｕｐ２マウスにも緩衝液製剤（群Ｖ）を注射した。４週間後、注入されたＴＡを収集し、赤色チャネルにおけるジストロフィンに対する抗体（図１０）及び、緑色チャネルにおけるラミニン（図示せず）（図１０）で共染色された全筋断面のイメージング後に免疫蛍光顕微法によってジストロフィン発現を分析した。
まず、閾値を、それぞれ９９番目及び６６番目のパーセンタイル画素強度値を使用して、赤（ジストロフィン）及び緑（ラミニン）チャネルについて、ニコンエレメンツＡＲソフトウェアのカスタム分析スクリプトを使用して決定した。これらの閾値は、ビヒクル注入されたｄｕｐ２筋肉の全てのＩＦ画像から平均化され、次いで、ジストロフィン陽性線維を測定するために別のカスタム分析スクリプトで使用された。簡潔には、それが筋鞘様ジストロフィンに局在するとき、ラミニンを使用して、座標マスクを使用して、全筋肉切片画像上の個々の筋線維の筋鞘をマークした。次に、線維筋鞘座標マスクを使用して、各画像内の全ての個々の筋線維について、適切に局在化されたジストロフィンを測定した。次に、赤いチャネルの閾値を超える赤いチャネルのピクセル強度を含む筋肉膜周囲の少なくとも３０％の筋線維をジストロフィン陽性としてカウントした。緩衝液注射又は低用量（筋肉当たり総ＡＡＶ６×１０１０）注射されたマウスＴＡは、約２％のジストロフィン陽性繊維のみを含み、一方、１：１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＡＡＶ混合物の中用量（筋肉当たり総ＡＡＶ２×１０１１）又は高用量（筋肉当たり総ＡＡＶ６×１０１１）の注射は、それぞれ、約１０％及び約１５％のジストロフィン陽性繊維をもたらした（図１０）。
結論として、ＡＡＶベクター化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９配列の送達は、生きたジストロフィー性マウス骨格筋組織におけるｄｕｐ２変異を修正し、有意なジストロフィン発現を復元するために、大きな欠失（約３０ｋｂ）を誘導することができた。
実施例５
ｇＲＮＡのインビボスクリーニング
表１のｇＲＮＡを、ＭＨＣＫ７プロモーター駆動型Ｓａ又はＣｊ Ｃａｓ９をコードするＡＡＶ１及びＵ６プロモーター駆動型ｇＲＮＡを、エクソン２重複のマウスモデル（ｄｕｐ２マウス）のＴＡ筋肉に筋肉内注射することによって、インビボでの活性についてスクリーニングする。４週間後、上記のように、ＴＡを収集し、マウントし、染色し、イメージングする。表１の活性ＤＭＤ標的化ｇＲＮＡは、注射された筋肉においてジストロフィン（＞２％ジストロフィン陽性線維）の発現をもたらすが、不活性ｇＲＮＡは、ジストロフィン発現をもたらさない（＜２％陽性線維）。ジストロフィン発現のレベルは、個々のｇＲＮＡの遺伝子編集活性に直接比例する。
実施例６
患者由来細胞におけるエクソン２重複及びエクソン２－６複数エクソンの重複の修正
これらの実験の目的は、ＡＡＶベクター化Ｃａｓ９及びｇＲＮＡが、患者由来細胞におけるエクソン２の重複コピー及びエクソン２～６の複数エクソンの重複の除去を誘導することができるかどうかを更に試験することであった。この目的のために、ミオシン重鎖エンハンサー及びクレアチニンキナーゼコアプロモーター（ＭＨＣＫ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３０００２７）及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルからなる合成プロモーターによって駆動されるＳａＣａｓ９のための筋特異的発現カセットをコードする組換えＡＡＶを構築した。第２のＡＡＶを構築し、ヒトＵ６プロモーター駆動ｈＤＳＡ－０３０ ｇＲＮＡ（配列番号３０）発現カセットの３つのコピーをコードするために使用した。ｇＲＮＡ ＡＡＶは、インビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を増強することが示されているＡＡＶに典型的な一本鎖ゲノムの代わりに二本鎖ゲノムのパッケージングをもたらす末端分解部位を欠く変異逆位末端配列（ＩＴＲ）を有するという点で自己相補的なＡＡＶゲノムである（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０２１３４）。エクソン２重複を有する２人の患者（Ｄｕｐ２）及びエクソン２～６重複を有する１人の患者（Ｄｕｐ２～６）由来のＦｉｂｒｏＭｙｏＤ細胞を、２つのＡＡＶウイルスの混合物を１：１の比率で４Ｅ６ｖｇ／細胞の合計ＭＯＩを使用して処置し（処置済み）、又はＡＡＶウイルスなしでモック処置した（未処置）。
簡潔には、細胞を播種し、約６０％コンフルエンシーに達してから、培地を８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充したＭｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に切り替えた。３日後、培地を、Ｃａｓ９ ＡＡＶ（ｒＡＡＶ１．ＭＨＣＫ７．ＳａＣａｓ９．ｈＧＨｐＡ）、及びｇＲＮＡ ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ１．３ｘＵ６．ｈＤＳＡ０３０）を含有する８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充したＭｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に置き換えた。７２時間後（及びその後２～３日ごとに）、培地を、８μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを補充した新鮮なＭｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に置き換えた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）－２５キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、全ＲＮＡを収集する前に、２週間、細胞を分化転換した。ＲＮＡ（１μｇ）を使用して、２０μＬの反応において、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲは、ＤＭＤ５’非翻訳領域にアニールするフォワードプライマー、及び（Ｄｕｐ２細胞の）エクソン３又は（Ｄｕｐ２－６細胞の）エクソン８にアニールするリバースプライマーを使用して実施した（図１１Ａ～Ｃ）。
記載の技術及びｈＤＳＡ０３０（配列番号３０）を含むｇＲＮＡを用いたＤｕｐ２細胞の処置により、エクソン２の余分なコピーなしの治療用エクソン配置に対応する３１～４６％のＤＭＤ転写産物が得られた。重要なことに、エクソン２（ｄｅｌ２）の欠失は、処置後に患者＃１の細胞で検出され（全転写物の約１０％）、筋ジストロフィーのないいくつかの個体でのｄｅｌ２の偶然の発見によって正常な機能を付与することが示されているＩＲＥＳ駆動のジストロフィンタンパク質アイソフォームに起因して、治療転写物とみなされる。ｈＤＳＡ－０３０ ｇＲＮＡがＤＭＤイントロン２を標的とするため、ｄｅｌ２は、細胞のサブセットにおけるＤＮＡ修復中にｇＲＮＡ標的部位の周りで追加の塩基が欠失したときに生じ得る。Ｄｕｐ２－６細胞では、野生型エクソン配置の増加を伴う＞２１０ｋｂのＤｕｐ２－６遺伝子座の欠失が、未処置細胞での＜１０％から処置後の＞５０％まで増加するという同様の傾向が観察された。
本開示は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更及び修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本開示に課せられるべきである。
本出願で参照される全ての文書又は参照は、それらが参照されるコンテンツに特に注意を払って、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
参考文献
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Ｐ．Ｚｈｕ，Ｆ．Ｗｕ，Ｊ．Ｍｏｓｅｎｓｏｎ，Ｈ．Ｚｈａｎｇ，Ｔ．Ｃ．Ｈｅ，Ｗ．Ｓ．Ｗｕ，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｓｃｌｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ７，３１－４１（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊｕｎ １６（１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｎ．２０１７．０２．００７）．
Ｈ．Ｍｏｕ，Ｊ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｐｅｎｇ，Ｈ．Ｙｉｎ，Ｊ．Ｍｏｏｒｅ，Ｘ．Ｏ．Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｑ．Ｓｏｎｇ，Ａ．Ｓｈｅｅｌ，Ｑ．Ｗｕ，Ｄ．Ｍ．Ｏｚａｔａ，Ｙ．Ｌｉ，Ｄ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｏｒｅ，Ｚ．Ｗｅｎｇ，Ｗ．Ｘｕｅ，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｒ ｅｘｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ１８，１０８（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊｕｎ １４（１０．１１８６／ｓ１３０５９－０１７－１２３７－８）．
Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｃ．Ｌｏｎｇ，Ｈ．Ｌｉ，Ｊ．Ｒ．ＭｃＡｎａｌｌｙ，Ｋ．Ｋ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｄｖａｎｃｅｓ３，ｅ１６０２８１４（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ａｐｒ（１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．１６０２８１４）．
Ｂ．Ｌ．Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｋ．Ｃｈｅｒｉｆ，Ｊ．Ｐ．Ｉｙｏｍｂｅ－Ｅｎｇｅｍｂｅ，Ａ．Ｇｕｙｏｎ，Ｊ．Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｄ．Ｌ．Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｘ．Ｂａｒｂｅａｕ，Ｐ．Ｌａｇｕｅ，Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ＣＲＩＳＰＲ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳａＣａｓ９ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｍｏｄｅｌｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２６，２６０４－２６１６（２０１８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｎｏｖ ７（１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．０８．０１０）．
Ｌ．Ｘｕ，Ｋ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｌ．Ｚｈａｏ，Ｊ．Ｘｕ，Ｍ．Ｅｌ Ｒｅｆａｅｙ，Ｙ．Ｇａｏ，Ｈ．Ｚｈｕ，Ｊ．Ｍａ，Ｒ．Ｈａｎ，ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｄｘ Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２４，５６４－５６９（２０１６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｍａｒ（１０．１０３８／ｍｔ．２０１５．１９２）．
Ｄ．Ｊ．Ｔｒｕｏｎｇ，Ｋ．Ｋｕｈｎｅｒ，Ｒ．Ｋｕｈｎ，Ｓ．Ｗｅｒｆｅｌ，Ｓ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｗ．Ｗｕｒｓｔ，Ｏ．Ｏｒｔｉｚ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ４３，６４５０－６４５８（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊｕｌ ２７（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ６０１）．
Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｂｅｌｌ，Ｄ．ＭｃＭｅｎａｍｉｎ，Ｚ．Ｈｅ，Ｊ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈ．Ｙｕ，Ｃ．Ｘｕ，Ｈ．Ｍｏｒｉｚｏｎｏ，Ｋ．Ｍｕｓｕｎｕｒｕ，Ｍ．Ｌ．Ｂａｔｓｈａｗ，Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ａ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３４，３３４－３３８（２０１６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｍａｒ（１０．１０３８／ｎｂｔ．３４６９）．
Ｍ．Ｈａｇａｎ，Ｍ．Ａｓｈｒａｆ，Ｉ．Ｍ．Ｋｉｍ，Ｎ．Ｌ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｙ．Ｔａｎｇ，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅ ｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｄｉｃａｌ ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ１１０，９７－１００（２０１８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊａｎ（１０．１０１６／ｊ．ｍｅｈｙ．２０１７．１１．００９）．
Ｊ．Ｐ．Ｉｙｏｍｂｅ－Ｅｎｇｅｍｂｅ，Ｄ．Ｌ．Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｘ．Ｂａｒｂｅａｕ，Ｊ．Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｐ．Ｃｈａｐｄｅｌａｉｎｅ，Ｐ．Ｌａｇｕｅ，Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ＤＭＤ Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣｉｎＤｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ５，ｅ２８３（２０１６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ＥｐｕｂＪａｎ ２６（１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１５．５８）．
Ｂ．Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｊ．Ｐ．Ｉｙｏｍｂｅ－Ｅｎｇｅｍｂｅ，Ｊ．Ｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｄ．Ｌ．Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｆｒｏｍ ｇＲＮＡ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １６８７，２６７－２８３（２０１８）１０．１００７／９７８－１－４９３９－７３７４－３＿１９）．
Ｖ．Ｋｙｒｙｃｈｅｎｋｏ，Ｓ．Ｋｙｒｙｃｈｅｎｋｏ，Ｍ．Ｔｉｂｕｒｃｙ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｃ．Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｗ．Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｃｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．ＪＣＩ ｉｎｓｉｇｈｔ２，（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ ２１（１０．１１７２／ｊｃｉ．ｉｎｓｉｇｈｔ．９５９１８）．
Ｔ．Ｋｏｏ，Ｎ．Ｂ．Ｌｕ－Ｎｇｕｙｅｎ，Ａ．Ｍａｌｅｒｂａ，Ｅ．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｋｉｍ，Ｏ．Ｃａｐｐｅｌｌａｒｉ，Ｈ．Ｙ．Ｃｈｏ，Ｇ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ２６，１５２９－１５３８（２０１８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊｕｎ ６（１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．０３．０１８）．
Ｌ．Ａｍｏａｓｉｉ，Ｊ．Ｃ．Ｗ．Ｈｉｌｄｙａｒｄ，Ｈ．Ｌｉ，Ｅ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ａ．Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ｄ．Ｃａｂａｌｌｅｒｏ，Ｒ．Ｈａｒｒｏｎ，Ｔ．Ｒ．Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｕ，Ｃ．Ｍａｓｓｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｒ．Ｊ．Ｐｉｅｒｃｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３６２，８６－９１（２０１８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｏｃｔ ５（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｕ１５４９）．
Ｍ．Ｅｌ Ｒｅｆａｅｙ，Ｌ．Ｘｕ，Ｙ．Ｇａｏ，Ｂ．Ｄ．Ｃａｎａｎ，Ｔ．Ｍ．Ａ．Ａｄｅｓａｎｙａ，Ｓ．Ｃ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ａｋａｇｉ，Ｄ．Ｅ．Ｓｙｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｍｏｈｌｅｒ，Ｊ．Ｍａ，Ｐ．Ｍ．Ｌ．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｒ．Ｈａｎ，Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｍｉｃｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ１２１，９２３－９２９（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ ２９（１０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１７．３１０９９６）．
Ｄ．Ｇ．Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ａ．Ｍ．Ｋａｂａｄｉ，Ｐ．Ｉ．Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｗ．Ｈ．Ｍａｊｏｒｏｓ，Ｔ．Ｅ．Ｒｅｄｄｙ，Ｃ．Ａ．Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ６，６２４４（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｆｅｂ １８（１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７２４４）．
Ｎ．Ｅ．Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｈａｌｌ，Ｇ．Ｌ．Ｏｄｏｍ，Ｍ．Ｐ．Ｐｈｅｌｐｓ，Ｃ．Ｒ．Ａｎｄｒｕｓ，Ｒ．Ｄ．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｓ．Ｄ．Ｈａｕｓｃｈｋａ，Ｊ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｊ．Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ８，１４４５４（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｆｅｂ １４（１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４４５４）．
Ｃ．Ｌｏｎｇ，Ｌ．Ａｍｏａｓｉｉ，Ａ．Ａ．Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ｊ．Ｒ．ＭｃＡｎａｌｌｙ，Ｈ．Ｌｉ，Ｅ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３５１，４００－４０３（２０１６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊａｎ ２２（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５７２５）．
Ｈ．Ｌ．Ｌｉ，Ｎ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｎ．Ｓａｓａｋａｗａ，Ｓ．Ｓｈｉｒａｉ，Ｔ．Ｏｈｋａｍｅ，Ｔ．Ｓａｋｕｍａ，Ｍ．Ｔａｎａｋａ，Ｎ．Ａｍａｎｏ，Ａ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ａ．Ｈｏｔｔａ，Ｐｒｅｃｉｓｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＴＡＬＥＮ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ４，１４３－１５４（２０１５）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｊａｎ １３（１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１４．１０．０１３）．
Ｃ．Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｒ．ＭｃＡｎａｌｌｙ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ａ．Ａ．Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＤＮＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３４５，１１８４－１１８８（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｓｅｐ ５（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５４４４５）．
Ｍ．Ｉｆｕｋｕ，Ｋ．Ａ．Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｍ．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．Ｓ．Ｙ．Ｌｕｎｇ，Ａ．Ｈｏｔｔａ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｉｎ Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＤＭＤ Ｐａｔｉｅｎｔ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ１８２８，１９１－２１７（２０１８）１０．１００７／９７８－１－４９３９－８６５１－４＿１２）．
Ｃ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｒ．Ｈｉｃｋｓ，Ｎ．Ｖ．Ｅｒｍｏｌｏｖａ，Ｈ．Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．Ｊａｎ，Ｓ．Ｙｏｕｎｅｓｉ，Ｓ．Ｋａｒｕｍｂａｙａｒａｍ，Ｃ．Ｋｕｍａｇａｉ－Ｃｒｅｓｓｅ，Ｄ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｚａｃｋ，Ｄ．Ｂ．Ｋｏｈｎ，Ａ．Ｎａｋａｎｏ，Ｓ．Ｆ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｃ．Ｍｉｃｅｌｉ，Ｍ．Ｊ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｐｙｌｅ，Ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔｓ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒｉｔｙ ｏｆ ＤＭＤ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ１８，５３３－５４０（２０１６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ａｐｒ ７（１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０１．０２１）．
Ｌ．Ａｍｏａｓｉｉ，Ｃ．Ｌｏｎｇ，Ｈ．Ｌｉ，Ａ．Ａ．Ｍｉｒｅａｕｌｔ，Ｊ．Ｍ．Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｅ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｏｒｔｉｚ，Ｊ．Ｒ．ＭｃＡｎａｌｌｙ，Ｓ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，Ｆ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｇｒｉｍｍ，Ｓ．Ｄ．Ｈａｕｓｃｈｋａ，Ｒ．Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ，Ｅ．Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，（２０１７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｅｐｕｂ Ｎｏｖ ２９（１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｎ８０８１）．
ＷＯ２０１７／１０３６２４Ａ１＝Ｄｕａｌ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ（発明者：Ｊａｍｅｓ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌｉｌｉ Ｗａｎｇ，Ｙａｎｇ Ｙａｎｇ）．
Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｄｕａｌ ＡＡＶ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３４，３３４－３３８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３４６９（２０１６）．
ＷＯ２０１６／０９７２１８及びＷＯ２０１６／０９７２１９Ａ１＝ＡＤＥＮＯ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＶＩＲＵＳ－ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ ＯＦ ＯＣＵＬＡＲ ＤＩＳＥＡＳＥ（発明者：Ｇｅｏｒｇｅ Ｂｕｃｈｌｉｓ，Ｘａｖｉｅｒ Ａｎｇｕｅｌａ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ａ．Ｈｉｇｈ）．
ＷＯ２０１７／１９７２３８Ａ１＝ＡＡＶ ｓｐｌｉｔ ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．（発明者：Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｗｅｉ Ｌｅｏｎｇ Ｃｈｅｗ．）
Ｔｒｕｏｎｇ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３，６４５０－６４５８，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ６０１（２０１５）．
Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ１１２，２９８４－２９８９，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５０１６９８１１２（２０１５）．
ＷＯ２０１６／０２５４６９Ａ１＝Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．（発明者：Ｅｒｉｃ Ｎ．Ｏｌｓｏｎ，Ｃｈｅｎｇｚｕ ＬＯＮＧ，Ｊｏｈｎ Ｒ．ＭＣＡＮＡＬＬＹ，Ｊｏｈｎ Ｍ．ＳＨＥＬＴＯＮ，Ｒｈｏｎｄａ Ｂａｓｓｅｌ－Ｄｕｂｙ．）
ＷＯ２０１７／１９３０２９Ａ２＝Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．（発明者：Ｄａｖｉｄ Ａ．Ｂｕｍｃｒｏｔ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｃ．Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊｏｓｈｕａ Ｃ．Ｔｙｃｋｏ，Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ－Ｈａｍｍ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ．Ｇｅｒｓｂａｃｈ）．
Ｉｙｏｍｂｅ－Ｅｎｇｅｍｂｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ＤＭＤ Ｍｙｏｂｌａｓｔｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣｉｎＤｅｌ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ５，ｅ２８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１５．５８（２０１６）．
ＷＯ２０１９／０３６５９９．
米国特許出願第２０１８／０２６５８５９号．

Claims (32)

  1. （ａ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号１～１８４のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列、又は
    （ｅ）配列番号１８５～２７６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む、ＤＭＤ遺伝子の標的核酸に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、核酸。
  2. プロモーター配列を更に含む、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記プロモーターが、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである、請求項２に記載の核酸。
  4. 前記プロモーターが、Ｕ６又はＨ１である、請求項２又は３に記載の核酸。
  5. 前記筋肉特異的プロモーターが、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８ｅ、ＳＰＣ５－１２、又はＣＫ１である、請求項３に記載の核酸。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸を含む、アデノ随伴ウイルス。
  7. 前記ウイルスが、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く、請求項６に記載のアデノ随伴ウイルス。
  8. 前記ウイルスが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項６又は７に記載のアデノ随伴ウイルス。
  9. 前記ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＭｙｏＡＡＶ１Ａ、ＡＡＶＭＹＯ、又はＡＡＶ－Ｂ１である、請求項６～８のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  10. 前記ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、又はＡＡＶｒｈ．７４である、請求項６～９のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  11. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソーム。
  12. （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、又は
    （ｃ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び
    薬学的に許容される担体、を含む、組成物。
  13. 細胞におけるジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子の変異を修正する方法であって、前記細胞を、
    （ａ）（ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｉｉ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）請求項１２に記載の組成物、及び
    （ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
    （ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、アデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む組成物、と接触させることを含む、方法。
  14. ジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子に変異を有する対象における筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防する方法であって、前記対象に、有効量の
    （ａ）（ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｉｉ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）請求項１２に記載の組成物、及び
    （ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
    （ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、アデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、組成物、を投与することを含む、方法。
  15. 筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、又は中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記変異が、前記ＤＭＤ遺伝子の単一又は複数のエクソンの重複である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  17. 前記単一又は複数のエクソンの重複が、前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、請求項１６に記載の方法。
  18. 重複が、前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複である、請求項１７に記載の方法。
  19. 細胞内でジストロフィン（ＤＭＤ）遺伝子を発現させるための薬剤の調製のための、
    （ａ）（ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｉｉ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）請求項１２に記載の組成物、及び
    （ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
    （ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、アデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、又はその機能的断片を含む組成物、
    の使用。
  20. 筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防するための、
    （ａ）（ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｉｉ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）請求項１２に記載の組成物、及び
    （ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
    （ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、アデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、又はその機能的断片を含む組成物、
    の使用。
  21. 筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防するための薬剤の調製のための、
    （ａ）（ｉ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｉｉ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）請求項１２に記載の組成物、及び
    （ｂ）（ｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片、
    （ｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、アデノ随伴ウイルス、
    （ｉｉｉ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、若しくはその機能的断片を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は
    （ｉｖ）Ｃａｓ９酵素をコードする核酸、又はその機能的断片を含む組成物、
    の使用。
  22. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、又は中間型筋ジストロフィー（ＩＭＤ）である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の使用。
  23. 前記筋ジストロフィーが、ＤＭＤ遺伝子の変異の結果である、請求項２０又は２１に記載の使用。
  24. 前記変異が、前記ＤＭＤ遺伝子の単一又は複数のエクソンの重複である、請求項２３に記載の使用。
  25. 前記単一又は複数のエクソンの重複が、前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２又は３に関与する、その周囲を取り囲む、又は影響を与える、請求項２４に記載の使用。
  26. 重複が、前記ＤＭＤ遺伝子のエクソン２、２－３、２－４、２－５、２－６、２－７、２－８、２－９、２－１０、２－１１、２－１２、２－１３、２－１４、２－１５、２－１６、２－１７、２－１８、２－１９、２－２０、２－２１、２－２２、２－２３、２－２４、２－２５、２－２６、２－２７、２－２８、２－２９、２－３０、２－３１、２－３２、２－３３、２－３４、２－３５、２－３６、２－３７、２－３８、２－３９、２－４０、２－４１、２－４２、２－４３、２－４４、２－４５、２－４６、２－４７、２－４８、２－４９、２－５０、２－５１、２－５２、２－５３、２－５４、２－５５、２－５６、２－５７、２－５８、２－５９、２－６０、２－６１、２－６２、２－６３、２－６４、２－６５、２－６６、２－６７、２－６８、２－６９、２－７０、２－７１、２－７２、２－７３、２－７４、２－７５、２－７６、２－７７、２－７８、２－７９、３、３－４、３－５、３－６、３－７、３－８、３－９、３－１０、３－１１、３－１２、３－１３、３－１４、３－１５、３－１６、３－１７、３－１８、３－１９、３－２０、３－２１、３－２２、３－２３、３－２４、３－２５、３－２６、３－２７、３－２８、３－２９、３－３０、３－３１、３－３２、３－３３、３－３４、３－３５、３－３６、３－３７、３－３８、３－３９、３－４０、３－４１、３－４２、３－４３、３－４４、３－４５、３－４６、３－４７、３－４８、３－４９、３－５０、３－５１、３－５２、３－５３、３－５４、３－５５、３－５６、３－５７、３－５８、３－５９、３－６０、３－６１、３－６２、３－６３、３－６４、３－６５、３－６６、３－６７、３－６８、３－６９、３－７０、３－７１、３－７２、３－７３、３－７４、３－７５、３－７６、３－７７、３－７８、又は３－７９の重複である、請求項２５に記載の使用。
  27. 前記細胞又は前記対象におけるジストロフィンタンパク質の発現の増加をもたらす、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１９～２６のいずれか一項に記載の使用。
  28. 前記対象におけるジストロフィー病理の進行を阻害する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１９～２６のいずれか一項に記載の使用。
  29. 前記対象の筋肉機能を改善する、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１９～２６のいずれか一項に記載の使用。
  30. 前記筋肉機能の改善が、筋力の改善である、請求項２９に記載の方法又は使用。
  31. 前記筋肉機能の改善が、立位及び歩行の安定性の改善である、請求項２９に記載の方法又は使用。
  32. 前記核酸、ＡＡＶ、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又は組成物若しくは薬剤が、筋肉内注入、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射、又はエアロゾル投与のために製剤化される、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｃ）請求項１１に記載のナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソーム、
    （ｄ）請求項１２に記載の組成物、
    （ｅ）請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法、又は
    （ｆ）請求項１９～２６のいずれか一項に記載の使用。
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