JP2024515720A - 筋ジストロフィーを治療するための製品及び方法 - Google Patents

Abstract

ＤＭＤ遺伝子におけるエクソン６、７、８、又は９のうちのいずれかに変異を有する患者における筋ジストロフィーを治療又は予防するための製品及び方法が提供される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子療法ベクター、並びにこれらのベクターを使用して、ＤＭＤ遺伝子の転写物及びジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現を調節又は回復する際にＤＭＤアンチセンス配列を含む核酸を送達する方法が提供される。製品及び方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを治療、改善、及び／又は予防するために使用される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された、米国仮特許出願第６３／１７８，６４８号の優先利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、筋ジストロフィーの治療及び／又は予防のための遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＤＭＤエクソン６、７、８、及び／又は９での変異から生じる患者における筋ジストロフィーを治療又は予防するための製品及び方法を提供する。本開示は、アンチセンス媒介性エクソンスキッピングのためのヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、フレーム破壊性エクソンをスキップし、リーディングフレームを回復することによって機能性ジストロフィンタンパク質の発現を可能にする。核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子療法ベクター、並びにジストロフィン遺伝子及びタンパク質を発現するためにこれらのベクターを使用する方法が提供される。本製品及び方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの治療及び／又は予防のために使用される。

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５６４９３＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０，４３９バイト、２０２２年４月２２日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

筋ジストロフィー（ＭＤ）は、主に随意筋に影響を与える遺伝性変性疾患群である。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期又は小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布及び程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、並びに遺伝形式の点で異なる。

ＭＤは、個人、家族、及びコミュニティに深刻な影響を与える、特定可能な治療のない疾患群である。コストは計り知れない。個人は、自尊心の喪失に関連する感情的な緊張及び低減した生活の質に苦しむ。手足の機能の喪失に起因する極度の身体的困難は、日常生活の動作において苦難をもたらす。家族関係は、経済的損失及び対人関係への課題によって苦しむ。影響を受けた兄弟は身動きがとれないと感じ、配偶者間の争いは、特に、筋ジストロフィーの責任が親パートナーの一方の足元に置かれ得る場合、しばしば離婚につながる。治療法を見つけるための探求の負荷は、多くの場合、人生のあらゆる側面を損ない、試す、生涯にわたる非常に集中した努力となる。家族を超えて、コミュニティは、特殊教育、特殊輸送、並びに再発性気道感染症及び心合併症を治療するための再入院のコストにおける筋ジストロフィー人口のハンディキャップに対応する追加施設の必要性による経済的負荷を負う。経済的責任は、州及び連邦政府機関によって共有され、納税者コミュニティに責任が拡大される。

ＭＤの１つの形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。Ｘ連鎖変性筋障害であるＤＭＤは、約１：５２００の男性出生に影響を及ぼす最も一般的な重度の小児筋ジストロフィーである（非特許文献１）。全身的な筋力低下の症状は、最初に３～５歳で現れ、１３歳までに歩行の不能に進行し、典型的には、心筋症又は呼吸不全による死亡が人生の３０代までに発生する（非特許文献２、３）。ジストロフィンは、筋線維の側筋膜下領域に局在する大きな（４２７ｋＤａ）多機能タンパク質であり、筋肉収縮によって引き起こされる機械的損傷から肉腫を保護する上で重要な役割を果たし（非特許文献４）、ＤＭＤ遺伝子によってコードされるが（非特許文献５）、ＤＭＤは、そのオープンリーディングフレームを破壊する変異によって引き起こされる。

ＭＤの別の形態は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。ＢＭＤは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を維持する変異から生じる部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の存在から生じる、軽度の対立遺伝子障害である（非特許文献６、７）。ＢＭＤは、ＤＭＤと同様に、体の筋肉を徐々に弱く、小さくする遺伝性疾患である。ＢＭＤは、臀部、骨盤、大腿部、及び肩、並びに心臓の筋肉に影響を及ぼすが、ＤＭＤほど深刻な問題を引き起こさないことが知られている。様々な部分的に機能するタンパク質をもたらす多様なフレーム内変異のために、ＢＭＤは、例えば、１０代後半から成人後期までの歩行の不能を伴う、広範な表現型スペクトルを有する。

ＤＭＤへの有望な治療アプローチは、ＤＭＤの機能的バージョンの置き換え、又はＤＮＡ又はプレｍＲＮＡレベルでのその修復に基づいている。いずれのアプローチも、部分的に機能するＢＭＤ様ジストロフィンの発現につながる、オープンリーディングフレームの回復を目的としている。修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた遺伝子置換試験が報告されているが（非特許文献８～１０）、ＡＡＶの導入遺伝子のパッケージングのキャパシティは約５ｋｂに制限される。ＤＭＤ ｃＤＮＡは１１．４ｋｂであるため、現在のウイルスベクターでは、いくつかの内部欠失を有するが、インフレームである、マイクロジストロフィンｃＤＮＡのうちの１つを利用する（非特許文献１１）。代替的なアプローチとして、プレｍＲＮＡ内の重要なエクソン定義エレメントに結合するアンチセンス配列を送達することによってｍＲＮＡリーディングフレームを復元し、スプライソソームによる特定のエクソンの認識を阻害し、成熟ＲＮＡからの標的エクソンの除外をもたらす、というものがある。かかるアンチセンス配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、又はエクソン５１のスキッピングを生じさせ得る変異に起因するＤＭＤの治療用にＦＤＡによって承認された最初のかかる治療剤であるエテプリセンなどのホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）からなることができる（非特許文献１２～１４）。

ＤＭＤ遺伝子の特定に続く多くの研究ラインにもかかわらず、治療選択肢は限定される。したがって、ＤＭＤ遺伝子の１つ以上の変異の治療を含む、ＤＭＤ及びＢＭＤなどのＭＤの治療に対するニーズが、当該技術分野に依然として存在する。

Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ７１，３０４－３１３（２０１２） Ｐａｓｓａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ ３１，１２１－１２５（２０１２） Ｄｕｃｈｅｎｎｅ，Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｐａｒａｌｙｓｉｅ Ｍｙｏｓｃｌｅｒｏｔｉｑｕｅ），ｏｒ Ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ａｐｐａｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ ２，５４１－５４２（１８６７） Ｐｅｔｒｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，３７１０－３７１４（１９９３） Ｊｕａｎ－Ｍａｔｅｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１３５１８９（２０１５） Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０，９９２－１０００（２０１４） Ｍｏｎａｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １４，４１２－４１５（１９８９） Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８，９７－１２９（１９９２） Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １０，９８１－９８９（２００４） Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ １，４２７－４５１（２０１４） Ｄｕａｎ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，２３３７－２３５６（２０１８） Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２８，８０３－８２４（２０１８） Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ６２，７２３－７４２（２０１５） Ａｌｆａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）９８，ｅ１５８５８（２０１９）

本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、８、及び／又は９の１つ以上の変異を有する患者における疾患を予防する、疾患の進行若しくは重症度を遅延する、かつ／又は疾患を治療するための製品及び方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、８、及び／又は９のスキッピングを誘導するＵ７ｓｎＲＮＡアプローチを使用する製品及び方法を提供する。

より具体的には、本開示は、ＤＭＤエクソン６、７、８、及び／又は９での変異から生じる患者における筋ジストロフィーを治療又は予防するための製品及び方法を提供する。本開示は、アンチセンス媒介性エクソンスキッピングのためのヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、フレーム破壊性エクソンをスキップし、リーディングフレームを回復することによって機能性ジストロフィンタンパク質の発現を可能にする。核酸を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子療法ベクター、及びこれらのベクターを使用してジストロフィン遺伝子及びタンパク質を発現する方法が提供される。本製品及び方法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーの治療及び／又は予防のために使用される。

本開示は、アンチセンス媒介性エクソンスキッピングをもたらし、ＤＭＤエクソン６、７、８、及び／又は９の変異に起因する患者における筋ジストロフィーを治療、改善、又は予防するために、ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、及び８のうちの１つ以上を標的とするように設計された、ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の組み合わせを含む核酸を提供する。

本開示は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する：
（ａ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、及び
（ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列。

いくつかの態様では、核酸は、少なくとも２つのヌクレオチド配列の組み合わせを含み、組み合わせは、
（ｉ）ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列、並びに
（ｉｉｉ）ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列、を含む。

いくつかの態様では、核酸は、少なくとも３つのヌクレオチド配列の組み合わせを含み、組み合わせは、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、核酸は、
（ａ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、及び
（ｄ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを含む随伴型組換えアデノウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶ－ａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、自己相補的である。

本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれか１つ以上と、担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントとを含む組成物を提供する。
本開示は、本明細書に記載の任意のベクターと、担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントとを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、ベクターは、ＡＡＶ又はｒＡＡＶである。

本開示は、筋ジストロフィーの治療、予防、又は改善を必要とする対象においてそれを行う方法を提供し、方法は、対象に、有効量の
（ａ）本明細書に記載の核酸のうちのいずれか１つ以上、
（ｂ）本明細書に記載の任意のベクター、又は
（ｃ）本明細書に記載の核酸若しくはベクターを含む任意の組成物、を投与するステップを含む。

いくつかの態様では、ベクターは、ＡＡＶ又はｒＡＡＶである。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶ－ａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、自己相補的である。いくつかの態様では、投与することは、全身経路を介する。いくつかの態様では、全身経路は、注射、注入又は移植によるものである。いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーである。

方法のいくつかの態様では、対象の細胞における機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルは、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルと比較して、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に増加する。

方法のいくつかの態様では、細胞における機能性ジストロフィンの発現は、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前及び後に生検した筋肉におけるウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学でジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

方法のいくつかの態様では、血清クレアチニンキナーゼのレベルは、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の血清クレアチニンキナーゼのレベルと比較して、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に低下する。

方法のいくつかの態様では、治療は、対象における改善した筋力、改善した筋機能、改善した可動性、改善したスタミナ、又はそれらの２つ以上の組み合わせをもたらす。
方法のいくつかの態様では、６分間歩行試験、立ち上がり時間試験、上り４歩（ａｓｃｅｎｄ ４ ｓｔｅｐｓ）試験、上り下り４歩（ａｓｃｅｎｄ ａｎｄ ｄｅｓｃｅｎｄ ４ ｓｔｅｐｓ）試験、ノーススター歩行評価（Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＮＳＡＡ）、努力肺活量（ＦＶＣ）試験、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ｈａｎｄ ｈｅｌｄ ｄｙｎａｍｏｍｅｔｒｙ）（ＨＨＤ）試験、計時アップアンドゴー（Ｕｐ ａｎｄ Ｇｏ）試験、粗大動作サブテスト換算（Ｇｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｓｕｂｔｅｓｔ Ｓｃａｌｅｄ）（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大等尺性随意収縮試験（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって測定されたとき、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に、対象における筋ジストロフィーの進行が遅延するか、又は対象における筋機能が改善される。

いくつかの態様では、本開示の治療方法は、第２の療法又は併用療法を投与することを更に含む。いくつかの態様では、方法は、グルココルチコイドを投与することを更に含む。

本開示はまた、
（ａ）本明細書に記載の核酸のうちのいずれか１つ以上、
（ｂ）本明細書に記載の任意のベクター、又は
（ｃ）本明細書に記載の核酸若しくはベクターを含む任意の組成物、の使用を、
筋ジストロフィーの治療のための医薬品の調製のため、又は筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療するために提供する。

いくつかの態様では、ベクターは、ＡＡＶ又はｒＡＡＶである。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶ－ａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ９である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、自己相補的である。いくつかの態様では、医薬品は、全身経路を介した使用のために設計される。いくつかの態様では、全身経路は、注射、注入又は移植によるものである。いくつかの態様では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーである。

使用のいくつかの態様では、対象の細胞における機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルは、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルと比較して、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に増加する。

使用のいくつかの態様では、細胞における機能性ジストロフィンの発現レベルは、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物の投与前及び投与後に生検した筋肉におけるウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学でジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される。

使用のいくつかの態様では、血清クレアチニンキナーゼのレベルは、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の血清クレアチニンキナーゼのレベルと比較して、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に低下する。

使用のいくつかの態様では、治療は、対象における改善した筋力、改善した筋機能、改善した可動性、改善したスタミナ、又はそれらの２つ以上の組み合わせをもたらす。
使用のいくつかの態様では、６分間歩行試験、立ち上がり時間試験、上り４歩試験、上り下り４歩試験、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、努力肺活量（ＦＶＣ）試験、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）試験、計時アップアンドゴー計時試験、粗大動作サブテスト換算（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大等尺性随意収縮試験（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって測定されたとき、核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に、対象における筋ジストロフィーの進行が遅延するか、又は対象における筋機能が改善される。

いくつかの態様では、本開示の使用は、第２の療法又は併用療法を更に含む。いくつかの態様では、使用は、グルココルチコイドを投与することを更に含む。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の図面及び詳細な説明の説明から明らかになる。しかしながら、図面、詳細な説明及び実施例は、開示される主題の態様を例示するものの、本開示の趣旨及び範囲内にある様々な変更及び修正がこの図面、詳細な説明及び実施例から当業者にとり明らかとなるため、単なる例示としてのみ与えられることを理解されたい。

ヒト、マウス、及びイヌにおけるＤＭＤエクソン６、７、及び８のヌクレオチド配列の比較を示す。図１はまた、これらのエクソンを標的とするアンチセンス配列及び標的化配列の位置も示す。標的化配列は、下線が引かれている。強調及び太字の塩基は、ヒト配列と比較したマウス及びイヌ配列における違いを示す（小文字＝イントロン配列、大文字＝エクソン配列）。図１Ａは、ヒト、マウス、及びイヌのエクソン６配列を示す。図１Ｂは、エクソン６について標的配列及びアンチセンス配列を示す。図１Ｃは、ヒト、マウス、及びイヌのエクソン７配列を示す。図１Ｄは、エクソン７について標的配列及びアンチセンス配列を示す。図１Ｅは、ヒトマウス、及びイヌのエクソン８配列を示す。図１Ｆは、エクソン８について標的配列及びアンチセンス配列を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 エクソン６、７、及び／又は８を標的とするアンチセンス配列の組み合わせが、ＷＴ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤにおけるエクソン６～８のスキッピングをいかに媒介することができるかを示す。図２Ａは、ＡＡＶ１（２．５Ｅ１１ｖｇ／^６ｃｍウェル）におけるアンチセンス配列（右側のパネルに示される）の組み合わせを使用したＷＴ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの形質導入からのＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。ＷＴ及びスキップした転写物を増幅するプライマーは、エクソン５及び１０に位置した。全ての異なる構築物は、マルチエクソンスキッピングにつながった。エクソン９は、多くの場合、未処置の対照細胞株に示されるように、自然にスキップされる。いくつかのバンドが処置後に得られ、２つの転写物：（１）エクソン５、９、１０を含む転写物（赤色で囲った２つの転写物を含む上の枠、ＥＳＥ８＿２、ＥＳＥ７及び公開されているエクソン６に対するアンチセンスから（すなわち、ＥＳＥ６、Ｖｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｎｏｖ；２０（１１）：２１２０－３３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１２．１８１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｓｅｐ １１．ＰＭＩＤ：２２９６８４７９、Ｂｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｍａｒ；２０（３）：５８０－９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１．２６４．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｄｅｃ ６．ＰＭＩＤ：２２１４６３４２によって公開されている）、又はＥＳＥ８＿２、ＥＳＥ７、及びＳＤ６による処置）、並びに（２）エクソン５及び１０を含む転写物（緑色で囲った８つの転写物を含む下の枠、パネルに右側に示されているアンチセンスの様々な組み合わせによる処置）における２つのバンドを含んだ。エクソン５、９、及び１０、並びにエクソン５及び１０を含む両方の転写物は、それらがＤＭＤのリーディングフレームを回復させるため、治療的である。図２Ｂは、エクソン５、１０転写物に対応する緑色の下の枠からの転写物のサンガー配列決定を示す。図２Ｃは、エクソン５、９、１０転写物に対応する赤色の上の枠からの転写物のサンガー配列決定を示す。 同上。 同上。 同上。 エクソンスキッピングに対するＵ７ｓｎＲＮＡベクターアプローチを示す。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡを標的とするために担体として使用される。それは、核細胞質輸出に使用されるループと、Ｕ７ｓｎＲＮＡと標的プレｍＲＮＡとの間の効率的なアセンブリに使用されるＳｍタンパク質に結合する認識配列と、プレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス配列と、からなる。それは、それ独自のプロモーター及び３’下流配列を有する。次いで、Ｕ７カセットをＡＡＶプラスミドにクローニングして、ベクターを産生する。２つの方向：エクソン６、７、及び８を標的とするＵ７－アンチセンス配列を含むフォワード構築物（図３Ａ及び３Ｃ、Ｕ７ ＥＳＥ８＿２＿ＥＳＥ７＿ＳＤ６＿フォワード）、及び同様の構築物のリバース方向（図３Ｂ及び３Ｄ、Ｕ７ ＥＳＥ８＿２＿ＥＳＥ７＿ＳＤ６＿リバース）が例として示される。配列番号２６及び２８を含む核酸は、図３Ａ～Ｄに示される。エクソン及びイントロンの長さは、青色矢印で示され、加えて、赤色の数は、アミノ酸に対応する。エクソン５～１０及び５～９からのＰＣＲアンプリコンは、１２９ｂｐで異なる。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ｈＤＭＤ遺伝子のエクソン７におけるナンセンス変異を有する、新規マウスモデル、ｈＤＭＤｍ７モデルの生成及び特性評価を示す。図４Ａは、ヒトＤＭＤエクソン６、７、及び８の概略図を示す。稲妻記号は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体がヒトＤＭＤエクソン７を切断する位置を表す。図４Ｂは、ゲノム編集後の導入されたナンセンス変異のサンガー配列確認を示す。図４Ｃは、ｈＤＭＤｍ７マウスモデルからのＲＴ－ＰＣＲ結果を示し、４週間及び３ヶ月での両方のナンセンス変異にもかかわらず、ｈＤＭＤ転写物の存在が確証される。予想されたように、エクソン９を伴わない転写物も検出された（下のバンド）。図４Ｄは、対照（Ｂｌ６マウス）及びｈＤＭＤｍ７マウスからのウェスタンブロット結果を示す。ジストロフィンは、ＷＴマウスに存在するが、ｈＤＭＤｍ７マウスには存在しない（Ｃ末端抗体：ＰＡ１－２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。全長ジストロフィン（上矢印）、ロード対照（下矢印）。 同上。 同上。 同上。 対照マウス（ｈＤＭＤ）と比較した、ＤＭＤのトランスジェニックマウスモデル（ｈＤＭＤｍ７又はｄｅｌＣＨ２）の脛骨前筋（ＴＡ）筋肉の組織病理学及び力生成を示す。図５Ａは、３ヶ月齢及び６ヶ月齢のＷＴ ｈＤＭＤ及びｈＤＭＤｍ７（ｄｅｌＣＨ２）マウスからの脛骨前筋（ＴＡ）、腓腹筋（Ｇａｓ）、上腕三頭筋（Ｔｒｉ）、及び横隔膜（Ｄｉａ）筋肉で行われたＨ＆Ｅ染色を示す（ｎ＝５）。３ヶ月齢及び６ヶ月齢の両方の動物において、中心核形成は、ｈＤＭＤｍ７マウスで観察されたが、ＷＴ ｈＤＭＤマウスでは観察されなかった。加えて、線維症も、６ヶ月齢のｈＤＭＤｍ７マウスで横隔膜に観察された（アスタリスク）。図５Ｂは、強縮性収縮後の正規化された比筋力によって測定されたＴＡ筋力評価を示す。図５Ｂは、３ヶ月齢及び６ヶ月齢のｈＤＭＤｍ７（ｄｅｌＣＨ２）マウスからの筋力が、３ヶ月齢及び６ヶ月齢の野生型マウス（ｈＤＭＤ）と比較して、経時的に減少することを示す。図５Ｃは、反復伸張性収縮後のＴＡ筋肉における力の喪失を示す。ｈＤＭＤｍ７（ｄｅｌＣＨ２）マウスは、このアッセイによって測定されたとき、３ヶ月齢で約５５％のＴＡ強度、６ヶ月齢で約６５％のＴＡ強度を失った。 同上。 同上。 Ｕ７＿Ｕ７ ＥＳＥ８＿２ ＳＤ７ ＳＤ６フォワード又はリバースＳＣ ｒＡＡＶ（４Ｅ１１ｖｇ）が、ｈＤＭＤｍ７マウスにおいて筋肉内注射によって送達されたインビボでのエクソンスキッピング実験に関する結果を示す。４Ｅ１１ｖｇは、ｈＤＭＤｍ７マウスのＴＡに注射した。注射の１ヶ月後、ＲＮＡを単離し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。図６Ａは、未処置の野生型マウス（ｈＤＭＤ、レーン１及び２）及びＤＭＤのマウスモデルのマウス（ｈＤＭＤｍ７、レーン３及び４）の両方が、上の２つの矢印に示されるように、エクソン５、６、７、８、９、及び１０、並びにエクソン５、６、７、８、及び１０について転写物を発現したことを示す。ＡＡＶ１．Ｕ７ ＥＳＥ８＿２ ＳＤ７ ＳＤ６フォワード（レーン５～１０）を注射したマウスは、エクソン５、６、及び１０、並びにエクソン５及び１０の転写物によって実証されるように、エクソン７～９（緑色で囲われている上の枠、エクソン６のより効率が低いスキッピングを有する）及びエクソン６～９（赤色で囲われている下の枠、エクソン６のより効率の高いスキッピングを有する）の様々な量のエクソンスキッピングを示した。これらの結果は、エクソン６が除外されたが、エクソン９がエクソンスキッピング後に転写物の１つに存在した図２Ａに示されるインビトロデータとわずかに異なる。エクソン６を含むが、エクソン７、８、及び／又は９を欠く転写物は、リーディングフレームを回復させないが、（１）エクソン５、９、及び１０、又は（２）エクソン５及び１０を含む転写物は、リーディングフレームを回復させる。図６Ｂ～Ｃは、アンチセンス構築物による処置後のエクソン５、６、及び１０（図６Ｂ）並びにエクソン５及び１０（図６Ｃ）の転写物の発現を確証する転写物のサンガー配列決定を示す。 同上。 同上。 本開示のアンチセンス、Ｕ７、及びＤＭＤ標的配列を示す。プロモーター（黄色）、ｓｍＯＰＴ（緑色）、ループ（青色）、及び３’ＵＴＲ領域（ピンク色）は、異なる色で強調されている。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 本開示の複数のアンチセンス配列を含むＵ７アンチセンス構築物配列のいくつかの例を示す。プロモーター（黄色）、ｓｍＯＰＴ（緑色）、ループ（青色）、及び３’ＵＴＲ領域（ピンク色）は、異なる色で強調されている。各構築物には、３つのアンチセンス配列が存在し、各々がそれら独自のプロモーター、ｓｍＯＰＴ、ループ、及び３’ＵＴＲ配列を有する。 同上。 同上。 左脛骨前筋（ＬＴＡ）及び右脛骨前筋（ＲＴＡ）への３匹のｈＤＭＤｍ７マウスの筋肉内注射後のエクソンスキッピングの有効性を示す。マウスに、エクソン６、７、及び８をスキップするように設計されたｓｃＡＡＶ１．ｎＥＳＥ８＿ＳＤ７＿ＳＤ６（ＴＴ７４５－３）を注射した。結果は、処置した筋肉から抽出されたＲＮＡで行われたＲＴ－ＰＣＲからのものである。バンド配列は、サンガー配列決定によって確証された。エクソン５、６、１０及びエクソン５、１０を有する転写物は、インフレームであり、したがって、治療的である。結論として、ｓｃＡＡＶ１．ｎＥＳＥ８＿ＳＤ７＿ＳＤ６（ＴＴ７４５－３）は、エクソン７、８、及び９をスキップし、エクソン６を部分的にスキップすることができる。エクソン６、７、８、及び９を省略又は欠く転写物は、ｄｍｄのリーディングフレームを回復するため、治療的である。 ＡＡＶ．Ｕ７ｓｎＲＮＡ（構築物ＴＴ７４４－３）の筋肉内注射を７週齢で両方のＴＡ筋肉に受けているｈＤＭＤｍ７マウスからの結果を示す。生理学的実験を３ヶ月後に行い、ＴＡ筋力を測定した。図１０Ａは、それぞれ（左から右に）、健康な対照マウス（ｈＤＭＤ－生理食塩水）、ｄｅｌＣＨ２／ｈＤＭＤｍ７処置マウス（ｄｅｌＣＨ２－ＴＴ７４４－３）、及びｄｅｌＣＨ２／ｈＤＭＤｍ７未処置マウス（ｄｅｌＣＨ２－生理食塩水）における比筋力の測定からの結果を示す。図１０Ｂは、同じマウス群から、連続した伸張性収縮からの力の測定からの結果を示す。ＴＴ７４５－３は、脛骨前筋の比筋力を改善することができ、脛骨前筋の伸張力に対する抵抗を改善することができ、このベクターの治療的利益を支持する。 同上。 処置した３ヶ月齢のｈＤＭＤｍ７（画像ではＤｅｌＣＨ２として参照される）マウス、（ＡＡＶ．Ｕ７ｓｎＲＮＡ（構築物ＴＴ７４４－３）「ＤｅｌＣＨ２＋ＴＴ７４４－３－２００１－ＬＴＡ－２０ｘ」と表示された右端パネルを参照）、及び未処置（生理食塩水、「ＤｅｌＣＨ２＋Ｓａｌ－２３０６－ＬＴＡ－２０ｘ」と表示された中央パネルを参照）の代表的な画像を示す。健康な対照マウス（ｈＤＭＤ１０４４）を、比較のために左端パネルに示す。ジストロフィンは、免疫蛍光染色によって赤色で染色される。画像は、ＬＴＡの２０×倍率である。これらの結果は、ＴＴ７４４－３構築物による処置が、注射の３ヶ月後に脛骨前筋にジストロフィン発現を導入したことを示す。 マウスＬＴＡ及びＲＴＡの治療的注射について生理食塩水の２０×拡大画像から、ジストロフィンの免疫蛍光染色の定量を示す。図１２Ａは、未処置マウス（ＤｅｌＣＨ２）と比較して、処置マウスで５０％多いジストロフィンを有する線維について自動線維定量を示す。ＷＴと比較して、処置したマウスは、５０％高いジストロフィン強度を有する約１５本のジストロフィン陽性線維を有する。図１２Ｂは、ジストロフィン強度の自動定量を示す。処置したマウスの強度は、未治療のマウスが全体で約４８０であるのに対して全体で約５５０であり、この構築物が処置後により多くのジストロフィン発現を可能にするという事実を裏付ける。まとめると、これらの結果は、ＴＴ７４４－３構築物による処置が、注射の３ヶ月後に脛骨前筋にジストロフィン発現を導入したことを示す。 同上。 生理食塩水（左バー）又は構築物ＴＴ７４４－３（右バー）を筋肉内に注射したｈＤＭＤｍ７／ＤｅｌＣＨ２マウスからの転写物のパーセンテージの定量を示す。処置は、２５％のスキッピング（Δ６～９に対応する青色、治療的転写物）及び７５％のスキッピングされていない転写物（休止に対応するオレンジ色、スキップされていない転写物）を示す。まとめると、これはまた、ジストロフィン発現を可能にするｄｍｄのリーディングフレームを回復する、エクソン６、７、８、及び９のスキッピングを媒介するＴＴ７４４－３の有効性を支持するデータである。 ジストロフィンに対して免疫蛍光によって染色された３匹のマウスからの総ＬＴＡ画像（１０×）を示す。ｈＤＭＤ ＬＴＡジストロフィン（左端パネル）は、５ヶ月齢マウスでジストロフィン染色を示し、陽性対照として機能する。注射（ＤｅｌＣＨ２＋生理食塩水、中央パネル）の５ヶ月後のジストロフィンに対するＬＴＡの染色は、ジストロフィン発現をほとんど示さない。注射（ＤｅｌＣＨ２＋ＴＴ７４４－３、右パネル）の５ヶ月後のジストロフィンに対するＬＴＡの染色は、約４０％のジストロフィン陽性線維を示す。これらの結果は、ＴＴ７４４－３による処置が、その治療可能性を支持する４０％の線維においてジストロフィン発現を回復させたことを示す。

本明細書に記載の製品及び方法は、ＤＭＤ遺伝子の１つ以上の変異を有する患者における、疾患を予防するため、疾患の進行を遅延させるため、及び／又は筋ジストロフィーを治療するために使用される。より具体的には、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、８、及び／又は９のスキッピングを誘導するＵ７ｓｎＲＮＡアプローチを使用する製品及び方法を提供する。

いくつかの態様では、本明細書に記載の製品及び方法は、アクチン結合ドメイン１（ＡＢＤ１）の第２の部分を欠くジストロフィンの発現を誘導し、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、８、及び／又は９に変異を有する患者を治療する。かかる製品及び方法は、より短いジストロフィンタンパク質アイソフォームの発現を強いる。

Ｇａｒｃｉａ及び共同研究者らは、エクソン６及び８の両方を同時にスキッピングすることを可能にするベクターの使用を調査した（ＵＳ２０１２／００７７８６０（Ｇａｒｃｉａ）、Ｂｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（３）：５８０－９，２０１２、Ｖｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（１１）：２１２０－３３，２０１２、Ｂａｒｂａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：２７４－８２，２０１３、及びＬｅ Ｇｕｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（１１）：１９２３－３５；２０１４）。かかるベクターは、ＧＲＭＤイヌモデルにおけるより短いジストロフィン（おそらくデルタＣＨ２タンパク質）の発現を可能にし、骨格筋及び心臓の改善をもたらす。

本開示は、ジストロフィンをコードするＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、８、及び／又は９に変異を有する患者を治療するために、ヒトＤＭＤ遺伝子におけるエクソン６、７、及び８の各々を標的とするように設計された新規アンチセンス配列を提供する。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも２つのアンチセンス配列を含む核酸を含み、各アンチセンス配列は、Ｕ７プロモーターが先行する。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも３つのアンチセンス配列を含む核酸を含み、各アンチセンス配列は、Ｕ７プロモーターが先行する。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも３つのアンチセンス配列を含み、各アンチセンス配列は、Ｕ７プロモーターが先行し、各アンチセンス配列は、異なるエクソン、例えば、１つの標的化エクソン６、１つの標的化エクソン７、及び１つの標的化エクソン８を標的とする。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも２つ又は少なくとも３つ以上のアンチセンス配列を含む構築物の複数コピーを含む。いくつかの態様では、本開示は、かかる構築物の複数のコピーを含むベクターを含み、各構築物は、少なくとも２つ又は少なくとも３つのアンチセンス配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、ＭＤの治療、改善、若しくは予防、又はＭＤの治療での使用のための薬剤の製造における、これらの核酸（及びかかる核酸を含むベクター及び組成物）の方法及び使用を含む。

本開示は、修飾Ｕ７小核ＲＮＡ（Ｕ７ｓｎＲＮＡ）に埋め込まれたアンチセンス標的化配列（以下の表１に示される）及び／又はアンチセンス標的化配列の組み合わせを提供する（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，４９２９－４９３４（１９９８））。いくつかの態様では、各アンチセンス配列は、Ｕ７プロモーター配列が先行する。これは、アンチセンス配列を分解から保護し、スプライシングが発生する核内に蓄積することを可能にする小核リボソームタンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）の一部となる（Ｓｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ８，２４１５－２４２３（１９９９））。いくつかの態様では、下流アンチセンス配列の連続転写を可能にする内部プロモーターを含有するＵ７ｓｎＲＮＡは、広範囲の組織送達のためにＡＡＶに封入される。このアプローチは、インビトロ並びにＤＭＤのマウス及びイヌモデルにおいて有用であることが示されている（Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０，９９２－１０００（２０１４）、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２１，２５５９－２５７１（２０１２）、Ｂａｒｂａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０，２７４－２８２（２０１３）、Ｂｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０，５８０－５８９（２０１２）、Ｖｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０，２１２０－２１３３（２０１２））。したがって、いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＤ遺伝子の変異に起因する疾患又は障害の予防、治療、又は改善のためのかかるＵ７ｓｎＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、ＤＭＤ遺伝子は、ヒトＤＭＤ遺伝子である。

Ｕ７は、２つの方向：フォワード及びリバースにクローニングすることができる。Ｕ７がフォワード方向にあるとき、フォワードアンチセンス配列が使用される。Ｕ７がリバース方向にあるとき、リバースアンチセンス配列が使用される。配列中の小文字は、イントロン領域の塩基を表す。配列中の大文字は、エクソン領域の塩基を表す。

本開示は、ＤＭＤ遺伝子のアンチセンス、Ｕ７、及び標的配列を提供する（以下の表２に示される）。

本開示は、アンチセンス標的化配列（以下の表３に示される）の組み合わせを含む核酸を提供する。いくつかの態様では、配列は、修飾Ｕ７小核ＲＮＡ（Ｕ７ｓｎＲＮＡ）に埋め込まれる。以下の表３に示されるかかる構築物は、限定的ではなく、核酸は、配列番号１～２０のうちのいずれかに示されるアンチセンス配列、若しくはそれらのバリアント、又は配列番号２１～２５のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列のうちのいずれかを標的とするアンチセンス配列の他の可能な組み合わせを含む。

したがって、本開示は、表１～３に示される配列のうちのいずれかを含む核酸を提供する。より具体的には、本開示は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％又は８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％又は８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、以下の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０以上のヌクレオチド配列の組み合わせを含む核酸を提供する：（ａ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％又は８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％又は８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は（ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列。

いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

したがって、本開示は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列を含む、核酸を提供する。

いくつかの態様では、核酸は、少なくとも２つのヌクレオチド配列の組み合わせを含み、組み合わせは、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列と、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列と、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様では、核酸は、少なくとも３つのヌクレオチド配列の組み合わせを含み、組み合わせは、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、及びヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列を含む。いくつかの更なる態様では、核酸は、ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６、７、及び／又は８で標的とする少なくとも４つのヌクレオチド配列、少なくとも５つのヌクレオチド配列、少なくとも６つのヌクレオチド配列、少なくとも７つのヌクレオチド配列、少なくとも８つのヌクレオチド配列、少なくとも９つのヌクレオチド配列、又は少なくとも１０以上のヌクレオチド配列の組み合わせを含む。

いくつかの態様では、かかるヌクレオチド配列は、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含む配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％又は８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、及び配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列のうちの１つ以上の任意に組み合わせを含む。

いくつかの態様では、ヌクレオチド配列のかかる組み合わせは、配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％又は８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、Ｕ７プロモーターの制御下にあるかかる核酸を含む。いくつかの態様では、本開示は、Ｕ７小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）中のかかる核酸の送達を含む。いくつかの態様では、Ｕ７プロモーターは、配列番号３０又は３４に示される配列と少なくとも７０％、８０％、又は９０％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＤ発現に影響を与える、Ｕ－ＲＮＡとも一般に称される小核リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）を提供する。ｓｎＲＮＡは、真核生物細胞内の細胞核のスプライシング斑点及びカジャール体内に見出される小ＲＮＡ分子のクラスである。小核ＲＮＡは一連の特定のタンパク質に関連しており、複合体は小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ、しばしば「ｓｎｕｒｐｓ」と発音される）と称される。各ｓｎＲＮＰ粒子は、ｓｎＲＮＡ成分といくつかのｓｎＲＮＰ特異的タンパク質（核タンパク質のファミリーであるＳｍタンパク質を含む）で構成されている。ｓｎＲＮＡは、それらの関連タンパク質とともに、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ基質上の特定の配列に結合するリボ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）を形成する。これらは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのいずれかによって転写される。ｓｎＲＮＡは、共通の配列特徴及びＲＮＡ結合ＬＳｍタンパク質などの関連するタンパク質因子の両方に基づいて、しばしば２つのクラスに分類される。ＳｍクラスのｓｎＲＮＡとして知られる第１のクラスは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ４ａｔａｃ、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２で構成されている。ＳｍクラスのｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。ＬｓｍクラスのｓｎＲＮＡとして知られる第２のクラスは、Ｕ６及びＵ６ａｔａｃで構成されている。ＬｓｍクラスのｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、ＳｍクラスのｓｎＲＮＡとは対照的に、核から決して離れることはない。

いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＤ遺伝子発現を妨げるＵ７ｓｎＲＮＡ分子を提供する。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与するが、いくつかの態様では、スプライシング調節のための汎用ツールに、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして、変換される［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６［５７０２）：１７９６－９（２００４）］。更に、遺伝子治療ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注射後に標的細胞内で恒久的に発現することができる［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２，（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。ＡＡＶアプローチを使用した神経筋障害におけるＵ７ｓｎＲＮＡシステムの可能性は、インビボ（ＡＡＶ．Ｕ７）で調査されている［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルの欠陥ＲＮＡを標的とするこのＡＡＶ９．Ｕ７の単回注射は、心臓及び横隔膜を含む全ての筋肉における疾患の長期的な矯正をもたらす。心臓を標的化する能力は、ＤＭ１患者が心臓の異常を示すため、重要である。

いくつかの態様では、ＤＭＤ阻害性核酸を含むＵ７ｓｎＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡは、ベクター中で送達される。しかしながら、いくつかの他の態様では、かかるＤＮＡは、ＡＡＶ又は他のベクター中で送達されない。したがって、本開示は、本明細書に記載のアンチセンス構築物をコードするＤＮＡを送達する他の手段を含む。いくつかの態様では、かかる送達には、リポソーム、ナノ粒子、又は化学的トランスフェクションを介した送達が含まれるが、これらに限定されない。化学的トランスフェクションは、リン酸カルシウム、脂質、又はタンパク質複合体によってＤＮＡを導入する。

したがって、本開示のアンチセンス配列は、いくつかの態様では、ｓｎＲＮＡによって運ばれ、いくつかの態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）などのウイルスベクターを使用して送達される。このアプローチの利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体内に埋め込まれており、それによって、それを分解から保護し、スプライシングが生じる核内への蓄積を引き起こすことである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注入後に標的細胞内で恒久的に発現することができる。ＡＡＶは、いかなる既知の疾患も引き起こすことなく自然にヒトに感染する小さなウイルスである。そのウイルスは、非常に軽度の免疫応答を誘導し、分裂細胞及び静止細胞の両方に感染することができる。遺伝子治療に使用される改変型は、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、エピソーム状態で持続する。したがって、ＡＡＶベクターは、優れた安全性プロファイルを有し、それらを遺伝子療法にとって非常に魅力的にしている。

本開示は、いくつかの態様では、ＡＡＶを利用して阻害性Ｕ７ｓｎＲＮＡを送達して、ＤＭＤアンチセンス配列を送達するが、これは、前ｍＲＮＡ内の重要なエクソン定義エレメントに結合し、スプライソソームによる特異的エクソンの認識を阻害し、成熟ＲＮＡから標的エクソンを除外し、ジストロフィンの発現をもたらす。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与するが、いくつかの態様では、スプライシング調節のための汎用ツールに、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして、変換される［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６［５７０２）：１７９６－９（２００４）］。更に、遺伝子治療ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注射後に標的細胞内で恒久的に発現することができる［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２，（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。ＡＡＶアプローチを使用した神経筋障害におけるＵ７ｓｎＲＮＡシステムの可能性は、インビボ（ＡＡＶ．Ｕ７）で調査されている［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルの欠陥ＲＮＡを標的とするこのＡＡＶ９．Ｕ７の単回注射は、心臓及び横隔膜を含む全ての筋肉における疾患の長期的な矯正をもたらす。心臓を標的化する能力は、ＤＭ１患者が心臓の異常を示すため、非常に重要である。

したがって、本開示は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列又は少なくとも２つのヌクレオチド配列の組み合わせなどのＤＭＤアンチセンス配列の送達のためのＵ７ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶベクターの産生及び投与を含む：
（ａ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに
（ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列。

本開示はまた、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列又は少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、若しくは少なくとも１０以上のヌクレオチド配列の組み合わせなどのＤＭＤアンチセンス配列の送達のためのＵ７ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶベクターの産生及び投与を含む：
（ａ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに
（ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列。

いくつかの態様では、本開示は、単一ベクターに組み合わされた本明細書に記載の様々なアンチセンス配列の１つ以上のコピーを提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の様々なアンチセンス配列の１つ以上のコピー、又は単一ベクターに組み合わされた様々なアンチセンス配列の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、及び１０以上の組み合わせを提供する。したがって、本開示は、本開示の核酸又は本開示の核酸の組み合わせを含むベクターを含む。かかるベクターとして、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、又は偽型ウイルス、及び／又は本明細書に開示される１つ以上の核酸を送達するための外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、又は小分子を含むウイルスなどのウイルスベクターが挙げられる。いくつかの態様では、ベクターは、ＡＡＶである。したがって、本開示のいくつかの態様では、Ｕ７ｓｎＲＮＡは、ＡＡＶなどのウイルスベクターを介して送達される。

いくつかの態様では、ＡＡＶは、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠く。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆位末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ ＩＴＲ及びＡＡＶ３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ ＩＴＲ及びＡＡＶ４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ ＩＴＲ及びＡＡＶ７カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ及びＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ及びＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含み長さが約４．７ｋｂである。例えば、本明細書で上記したように、ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全なゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９にそれぞれ提供されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に概説されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。

ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染はサイレント及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。更に、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにおいてクローニングされたＤＮＡとして感染性であり、組換えゲノムの構築を実現可能にする。更に、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド形成及び組み込みを指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるために、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てが、外来ＤＮＡで置き換えられてもよい。いくつかの態様では、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供される。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定かつ頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重感染に対して耐性がない。

いくつかの態様では、本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移行される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８及びＡＡＶｒｈ．１０が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノム内のＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０及びＡＡＶ－Ｂ１が挙げられるが、これらに限定されない。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）に概説されている。上に示される、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が、特に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。

いくつかの態様では、本開示の組換えＡＡＶゲノムは、ポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、プレｍＲＮＡのキーエクソン定義エレメントに結合し、スプライソソームによる特定のエクソンの認識を阻害し、成熟ＲＮＡからのＤＭＤの標的エクソンの排除をもたらす１つ以上のアンチセンス配列を含む。したがって、いくつかの態様では、本開示のｒＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のＤＭＤアンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）などの業者は、カスタムで阻害ＲＮＡ分子を製造する。加えて、市販のキットとして、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）又はｐｓｉＲＮＡシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などを利用してカスタムでｓｉＲＮＡ分子を製造することが可能である。

したがって、いくつかの態様では、ＤＭＤ阻害性核酸を含むＵ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子は、ｒＡＡＶベクターにクローニングされる。したがって、本開示の態様は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列又は少なくとも２つのヌクレオチド配列の組み合わせを含む核酸を含むｒＡＡＶゲノムを含む：
（ａ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、並びに
（ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列。

いくつかの態様では、ｒＡＡＶゲノムは、以下からなる群から選択される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０以上のヌクレオチド配列の組み合わせを含む核酸を含む：
（ａ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号１～２０及び２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は
（ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列。

いくつかの態様では、ウイルスベクターは、偽型ＡＡＶであり、１つのＡＡＶ血清型からのＩＴＲと、異なるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質とを含む。いくつかの態様では、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）である。いくつかの態様では、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）である。いくつかの態様では、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）である。

いくつかの態様では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８、又はＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、又はＡＡＶ－Ｂ１からの１つ以上のカプシドタンパク質のキメラを含むカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含む。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）に概説されている。本明細書において上に示されるこれらの様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。

いくつかの態様では、本明細書に記載のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドが提供される。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移行される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－Ｂ１及びＡＡＶｒｈ７４が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。

いくつかの態様では、パッケージング細胞が提供される。パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全てのコンポーネントを安定して発現する細胞株を作製することである。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子の除去によって作製される。これらは治療的遺伝子に置き換えられる。ベクター粒子を生成するためには、パッケージング細胞が不可欠である。パッケージング細胞株は、カプシド産生及びベクターのビリオン成熟に必要な全てのウイルスタンパク質を提供する。したがって、パッケージング細胞株は、それらがｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含有するよう作製される。所望の遺伝子をレトロウイルスＤＮＡベクターに挿入し、適切なパッケージング細胞株を維持した後、レトロウイルスベクターを調製することは今や単純な事項である。

例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

したがって、いくつかの態様では、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞が更に提供される。パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定に形質転換されたがん細胞であり得る。別の態様では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

いくつかの態様では、パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全てのコンポーネントを安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、並びに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）に概説されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。様々なタイプのｒＡＡＶの製造及び使用が具体的に企図され、例示される。したがって、組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプセル化ｒＡＡＶ粒子）が本明細書に提供される。いくつかの態様では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を欠き、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶｒｅｐ又はｃａｐＤＮＡが存在しない。いくつかの態様では、ＡＡＶは、組換え直鎖ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一態様では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定に形質転換されたがん細胞である。別の態様では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。

ｒＡＡＶは、いくつかの態様では、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸又はウイルスベクターなどのベクターを含む組成物を提供する。したがって、本明細書に記載の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物が提供される。様々な態様では、かかる組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。様々な態様では、かかる組成物はまた、他の成分、例えば、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントを含む。許容される担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度では不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、若しくは他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴｗｅｅｎ、プルロニック、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、及び細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍＬ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、約１×１０^１５、約１×１０^１６、又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）［又はウイルスゲノム（ｖｇ）］の範囲であり得る。

いくつかの態様では、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１６ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、１．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇはまた、１．０Ｅ１０ｖｇ／ｋｇと指定され、これは単に、科学的表記を示す代替方法である。同様に、１０^１１はＥ１１と同等である。いくつかの態様では、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、ｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１０約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０^１６ｖｇ／ｋｇである。

いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、初回用量の後に第２のより大きい用量が続く。いくつかの態様では、初回用量の後に第２の同じ用量が続く。いくつかの態様では、初回用量の後に、１回以上のより少ない用量が続く。いくつかの態様では、初回用量の後に、同じ用量又はそれ以上の用量の複数の用量が続く。

インビボ又はインビトロで、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を用いて標的細胞を形質導入する方法が企図される。本開示のｒＡＡＶを用いた細胞の形質導入は、ＤＭＤ遺伝子のプレｍＲＮＡにおけるキーとなるエクソン定義エレメントに結合するアンチセンス配列の持続的な発現をもたらし、スプライソソームによる特定のエクソンの認識を阻害し、成熟ＤＭＤ ＲＮＡから標的エクソンを除去する。したがって、本開示は、スプライソソームによる特定のエクソンの認識を阻害し、成熟ＲＮＡから対象に標的エクソンを除外する、プレｍＲＮＡのキーとなるエクソン定義エレメントに結合するアンチセンス配列を発現するｒＡＡＶ及びｒＡＡＶを投与／送達する方法を提供する。いくつかの態様では、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。これらの方法は、本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶで細胞及び組織（筋肉などの組織を含むがこれらに限定されない）を形質導入することを含む。形質導入は、細胞特異的な制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて実施することができる。「形質導入」という用語は、例として、標的細胞によるジストロフィンタンパク質の機能的形態の発現をもたらす本明細書に記載の複製欠損ｒＡＡＶを介して、インビボ又はインビトロのいずれかでアンチセンス配列を含むｕ７ｓｎＲＮＡの標的細胞への投与／送達を指すために使用される。

インビボ方法は、有効用量又は有効複数用量の、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物を、それを必要とする対象（ヒト対象を含む）に投与するステップを含む。したがって、本明細書に記載のｒＡＡＶの有効用量（又は本質的に同時に投与される用量、又は間隔を置いて投与される用量）の投与を必要とする対象にそれを行う方法が提供される。用量（複数可）が障害／症状の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量（複数可）が障害／症状の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量とは、治療される障害／症状に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する、障害／症状の状態の進行を遅延若しくは予防する、障害／症状の状態の進行を遅延若しくは予防する、疾病の程度を軽減する、障害／症状の寛解（部分又は完全）をもたらす、及び／又は生存を延長する用量のことである。

いくつかの態様では、本開示の組成物及び方法は、筋ジストロフィー（ＭＤ）などの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。様々な態様では、かかるＭＤは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。Ｘ連鎖変性筋障害であるＤＭＤは、約１：５２００の男性出生に影響を及ぼす最も一般的な重度の小児筋ジストロフィーである（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ７１，３０４－３１３（２０１２））。全身的な筋力低下の症状は、最初に３～５歳で現れ、１３歳までに歩行の不能に進行し、典型的には、心筋症又は呼吸不全による死亡が人生の３０代までに発生する（Ｐａｓｓａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ ３１，１２１－１２５（２０１２）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ，Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｐａｒａｌｙｓｉｅ Ｍｙｏｓｃｌｅｒｏｔｉｑｕｅ），ｏｒ Ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ａｐｐａｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ ２，５４１－５４２（１８６７））。ジストロフィンは、筋線維の側筋膜下領域に局在する大きな（４２７ｋＤａ）多機能タンパク質であり、筋肉収縮によって引き起こされる機械的損傷から肉腫を保護する上で重要な役割を果たし（Ｐｅｔｒｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，３７１０－３７１４（１９９３））、ＤＭＤ遺伝子によってコードされるが（Ｊｕａｎ－Ｍａｔｅｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０，ｅ０１３５１８９（２０１５））、ＤＭＤは、そのオープンリーディングフレームを破壊する変異によって引き起こされる。他の様々な態様では、かかるＭＤは、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。部分的に機能的なジストロフィンタンパク質の存在は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を維持する変異とともに生じ、より軽度の対立遺伝子障害ＢＭＤをもたらす（Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０，９９２－１０００（２０１４）；Ｍｏｎａｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １４，４１２－４１５（１９８９））。ＢＭＤは、ＤＭＤと同様に、体の筋肉を徐々に弱く、小さくする遺伝性疾患である。ＢＭＤは、臀部、骨盤、大腿部、及び肩、並びに心臓の筋肉に影響を及ぼすが、ＤＭＤほど深刻な問題を引き起こさないことが知られている。様々な部分的に機能するタンパク質をもたらす多様なフレーム内変異のために、ＢＭＤは、例えば、１０代後半から成人後期までの歩行の不能を伴う、広範な表現型スペクトルを有する。

病理学的ＤＭＤ又はＢＭＤ変異を有することが知られている家族において、本開示の方法は、様々な態様では、疾患を予防する方法であり、それらは疾患の発症前に実施される。他の様々な態様では、本開示の方法は、診断後に実施され、したがって、疾患の治療又は改善方法である。

分子的、生化学的、組織学的、及び機能的転帰尺度は、方法の治療的有効性を実証する。転帰尺度は、例えば、Ｄｙｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １（２００５）のチャプター３２、３５、及び４３、並びにＢｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６０２：３４７－３９３（２０１０）に概説されている。転帰尺度としては、成熟ＲＮＡからの標的エクソンの排除、影響を受ける組織における変異体ＤＭＤ ｍＲＮＡ又はタンパク質の減少又は除去、並びにジストロフィンの機能的形態の発現のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内の機能性ジストロフィンの発現は、ｒＡＡＶの投与前及び投与後に生検した筋肉中のウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法によってジストロフィンタンパク質レベルを測定して、改善を判定することによって検出される。

いくつかの態様では、対象の細胞における機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルは、ｒＡＡＶの投与前の機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルと比較してｒＡＡＶの投与後に増加する。いくつかの態様では、ジストロフィンの機能的形態の発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は少なくとも約１００％超増加する。様々な態様では、改善した筋力、改善した筋機能、及び／又は改善した可動性及びスタミナは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は少なくとも約１００％超の改善を示す。

他の転帰尺度としては、治療前後の対象の血清クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）のレベルを測定することが挙げられる。ＣＫレベルの上昇は、筋肉損傷の顕著な特徴である。デュシェンヌ型患者では、ＣＫレベルは正常範囲（出生以来の正常レベルの１０～１００倍）を超えて顕著に増加する。血液サンプル中のＣＫレベルが上昇している場合、通常は筋肉が筋ジストロフィー又は炎症などの異常なプロセスによって崩壊していることを意味する。したがって、本開示の方法による治療のための陽性の治療的転帰は、ｒＡＡＶの投与前の血清クレアチニンキナーゼのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後の血清クレアチニンキナーゼのレベルが低下することである。

他の転帰尺度は、治療後の対象において、改善した筋力、改善した筋機能、改善した可動性、改善したスタミナ、又はそれらの２つ以上の組み合わせがあるか否かを判定することを含む。かかる転帰尺度は、対象の筋ジストロフィーの進行を判定する上で重要であり、当該技術分野で既知の様々な試験によって測定される。これらの試験のいくつかとして、６分間歩行試験、立ち上がり時間試験、上り４歩試験、上り下り４歩試験、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）試験、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）試験、計時アップアンドゴー試験、粗大動作サブテスト換算（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大等尺性随意収縮試験（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用する組み合わせは、同時治療又は連続治療を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医療的処置及びサポーティブケアとの組み合わせ、並びにグルココルチコイドなどの治療法との組み合わせが具体的に企図される。全てのタイプのグルココルチコイドは、本明細書に開示される併用療法での使用のために含まれる。かかるグルココルチコイドとしては、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、デフラザコート、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、及びトリアムシノロンが挙げられるが、これらに限定されない。

有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、直腸又は膣を含むが、これらに限定されない、当該技術分野における標準的な経路により行い得る。いくつかの態様では、有効用量は、全身的な投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるように循環器系に投与する経路である。かかる全身投与は、様々な態様では、経腸投与（胃腸管を介した薬物の吸収）を介して、又は非経口投与（一般に、注射、注入、又は移植）を介して行われる。様々な態様では、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様では、有効用量は、静脈内及び／又は筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様では、有効用量は、順に、又は連続して送達される。いくつかの態様では、有効用量は、同時に送達される。様々な態様では、本開示のｒＡＡＶのＡＡＶコンポーネント（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される疾患又は障害の状態又は状態、対象の状態、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又はマッチングされる。

特に、本開示の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を動物の標的組織に輸送するであろう任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び／又は神経系若しくは肝臓に直接注射することが含まれるが、これらに限定されない。単純にリン酸塩緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁させることは、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するために十分であることが実証されており、担体又はｒＡＡＶと共投与することができる他の成分に既知の制限はない（しかしながら、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避されるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾され得る。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は、全て当該技術分野における標準的な技法によって容易に入手可能である。

注射可能な使用に好適な薬学的形態は、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。全ての場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）である程度に流動的でなければならない。製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散媒体とすることができる。適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

本開示はまた、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を含む、又は本開示のプロセスに従って製造されるキットを提供する。本開示の文脈において、「キット」という用語は、２つ以上のコンポーネントを意味し、そのうちの１つが本開示の核酸、ベクター、又は組成物に対応し、他方が容器、レシピ、説明書などに対応する。したがって、キットは、様々な態様で、特定の目標を達成するのに十分な一連の製品であり、単一のユニットとして販売され得る。

キットは、核酸、ベクター、又は本開示の組成物を含有する任意の適切な形状、サイズ、及び材料の１つ以上のレシピエント（バイアル、アンプル、容器、注射器、ボトル、バッグなど）を、投与のための適切な投与量で含み得る（上記参照）。キットは、更に、使用のための指示又は説明書（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態）、核酸、ベクター若しくは組成物を投与するための手段（例えば、注射器、ポンプ、注入器など）、核酸、ベクター若しくは組成物を再構成するための手段、及び／又は核酸、ベクター若しくは組成物を希釈するための手段を含み得る。

一実施形態では、そのようなキットは、密封されたボトルなどの容器又は容器にパッケージングされた希釈剤中の核酸又はベクターを含み、ラベルが容器に貼られているか、又は核酸又はベクターの使用を説明するパッケージに含まれる。一実施形態では、希釈剤は、容器内のヘッドスペースの量（例えば、液体製剤と容器の上部との間の空気の量）が非常に少なくなるように、容器内にある。好ましくは、ヘッドスペースの量は無視できる（すなわち、ほとんどない）。

いくつかの態様では、製剤は、安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護する、及び／又は安定状態で製剤の安定性又は保存期間を延長する物質又は賦形剤を指す。安定剤の例としては、限定されないが、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられる。

いくつかの態様では、製剤は、抗微生物防腐剤を含む。「抗菌保存剤」という用語は、組成物に加えられて、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する任意の物質を指す。抗微生物防腐剤の例としては、限定されないが、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられる。

いくつかの態様では、キットは、キット中に提供される試薬の使用を説明するラベル及び／又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つ以上を送達するためのカテーテル、シリンジ、又は他の送達デバイスを任意選択で含む。

本開示はまた、投与単位の単回用量又は複数回用量のキットを提供する。いくつかの態様では、本開示は、シングルチャンバー型及びマルチチャンバー型の充填済み注射器を含むキットを提供する。

この文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせがこの文書と同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に見られない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「ａ」又は「ａｎ」とともに記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。本開示の態様が特徴を「含む」と記載される場合、実施形態もまた、特徴「からなる」又は「本質的になる」と企図される。

別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素の全てを指すと理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載の本開示の特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、又は単なる日常的な実験を使用して確認することができる。かかる均等物は、本開示によって包含されることが意図される。

本明細書で使用される「及び／又は」という用語は、「及び」、「又は」及び「当該用語によって接続された要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、及びより好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、本発明は、具体的な数も含み、例えば、約１０は１０を含む。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内及び各エンドポイントに該当する各別個の値を個別に参照するための簡略標記方法として機能することを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書で個別に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。

本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈が別段必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形例は、記載された整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で置換され得るか、又は本明細書で「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語とともに用いられる。

本明細書で使用される場合、「～からなる」は、特許請求の範囲の要素において特定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用される場合、「～から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的特性及び新規特性に実質的に影響を与えない材料又はステップを除外しない。

本明細書の各例では、「含む」、「本質的にからなる」、及び「からなる」の用語のうちのいずれかは、他の２つの用語のいずれかで置き換えられ得る。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、及び物質などに限定されず、そのように変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、特許請求の範囲によってのみ定義される本開示の主題の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われる。本明細書に提供されるいずれか及び全ての例、又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、別段特許請求の範囲にない限り、本発明の範囲に限定を述べるものではない。本明細書における文言は、本発明の実施に不可欠ないずれかの特許請求の範囲にない要素を示すものと解釈されるべきではない。

上記又は下記に関わらず、本明細書の本文全体で引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む）は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と矛盾するか、又は矛盾する範囲では、本明細書が、そのような材料に優先する。

本開示及びその利点のより良い理解は、例示のみを目的として提供される以下の実施例から得られる。実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。

態様及び本開示の態様は、以下の実施例によって例示される。
実施例１
材料及び方法
構築物
表２及び３に示されるような、プロモーター、アンチセンス、ｓｍＯＰＴ、ループ、及び３’ＵＴＲ配列を含むＵ７ｓｎＲＮＡ遺伝子構築物をコードするＤＮＡを、ＡＡＶベクターにクローニングした。全てのプラスミド構築物について配列を検証した。

Ｕ７ｓｎＲＮＡ ＡＡＶベクターの設計及び製造
ベクターは、Ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅで作製された。血清型１及び９組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ９）ベクターを、ヒトの胚芽腎臓２９３細胞において、アデノウイルスフリーの三重プラスミドＤＮＡトランスフェクション（ＣａＰＯ４沈殿）方法を使用した改良クロスパッケージングアプローチによって作製した（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：７９１－８０１）。

不死化及び条件的に誘導可能な線維ＭｙｏＤ細胞株
哺乳動物線維芽細胞におけるＭｙｏＤ遺伝子の発現は、細胞の筋原性系統への分化転換をもたらす。かかる細胞は、更に筋管に分化することができ、それらは、ＤＭＤ遺伝子を含む、筋肉遺伝子を発現する。テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＭｙｏＤを条件的に発現する不死化細胞株を作製した。これは、レンチウイルスｔｅｔ誘導性ＭｙｏＤの一次線維芽細胞株の安定したトランスフェクションによって達成され、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲ）を含む。得られた安定した株は、ドキシサイクリンによる処理によってＭｙｏＤ発現を開始することが可能である。かかる細胞株は、エクソン６、７、及び８内に変異を有するＤＭＤ患者から作製した。

ドキシサイクリンの制御下で筋肉系統細胞に分化転換することができたＷＴ不死化ヒト線維芽細胞は、テロメラーゼ発現ベクター及びｔｅｔ誘導性ＭｙｏＤ発現ベクターの両方を用いた形質導入によって産生された［Ｃｈａｏｕｃｈ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０，７８４－７９０（２００９）］。次いで、変換したヒト線維筋芽細胞（ＦＭ）を、エクソン６、７、及び８に対するアンチセンス配列を組み込んだ異なるＵ７構築物を担持するｓｃＡＡＶ１ベクターで形質導入した。

ｈｄｍｄ７（ｄｅｌＣＨ２）マウスモデル
ｈｄｍｄ遺伝子座内のｈＤＭＤエクソン７にナンセンス変異を有するマウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集ツールを使用して開発した。変異を示す概略図を図４Ａに示す。その中で、数字は各エクソン及びイントロンの長さを示す（各エクソン（赤色で示される）の番号はアミノ酸に対応している）。エクソン５～１０及び５～９からのＰＣＲアンプリコンは、１２９ｂｐ（すなわち、エクソン９の長さ）で異なる。

このｈｄｍｄ７（ｄｅｌＣＨ２）マウスモデルは、ジストロフィンの不存在をタンパク質レベルで示し、中心核形成及び筋力低下を示す（図５Ａ～Ｃ）。エクソン６、７、及び８のマルチエクソンスキッピングは、このｈＤＭＤｍ７マウスのリーディングフレームを回復するように設計された。ゴールデンリトリバーイヌモデル（ＧＲＤＭ）で証明されているように（Ｌｅｇｕｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎｏｖ；２２（１１）：１９２３－３５、Ｖｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｎｏｖ；２０（１１）：２１２０－３３））、エクソン６～８のスキッピングは、切断されたが高い機能性ジストロフィンの発現をもたらした。これらの試験におけるイヌは、エクソン６～８を欠く転写物を発現することができ、歩行又は走行することができた（Ｌｅｇｕｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４（上記）、Ｖｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２（上記）。

雄Ｃ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ツール及び鋳型でトランスフェクトして、エクソン７にナンセンス変異を導入した（図４Ａ～Ｂを参照）。挿入は、ＰＣＲによって確認した。１つの優れたクローンが見出され、増幅させ、数十のアルビノＢＬ／６胚盤胞に注射した。注射した胚盤胞をレシピエントマウスに移植した。キメラ雄からのジストロフィン遺伝子をＰＣＲによって、次いでＲＴ－ＰＣＲによって確認した。コロニーを拡大させ、ヘテロ接合体として維持した。図４Ｃは、４週齢及び３ヶ月齢のヘミ接合型ｈＤＭＤｍ７マウスの両方からの筋肉においてジストロフィン発現の存在しないこと示す。

実験動物の使用及び動物実験
本試験の動物を含む全ての実験手順は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの研究機関によってレビューされ、承認された。

筋肉内及び尾静脈注射
いくつかの態様では、筋肉内注射が使用された。筋肉内注射試験のために、マウスは、ベクターＤＮＡ用量を４．１１Ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ）で用いて脛骨前筋（ＴＡ）に注射し、１ヶ月後に屠殺した。屠殺時、ＴＡ、腓腹筋、上腕三頭筋、横隔膜、及び心臓を取り出し、液体窒素冷却イソペンタン中で凍結させた。

いくつかの態様では、注射は尾静脈装置を使用して行われる。尾部を、電球を介して温めて静脈を拡大させる。目に見えるようになると、ＡＡＶベクター又は対照（生理食塩水又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））を、３３Ｇ気密ハミルトンシリンジを使用して、合計３００μｌの生理食塩水若しくはＰＢＳで、又は生理食塩水若しくはＰＢＳのみを注射した。注射後、滅菌コットンパッドを注射部位に配置し、出血が止まるまで圧力をかけて保持した。

筋肉の調製
マウスの切除では、標準的な技法を使用した。筋肉を回収し、凍結切片調製のために急速凍結又はマウントし、免疫蛍光及びＨ＆Ｅ染色のために１０μＭで切断した。全ての処置群の右側の脛骨前筋（ｔａ）、腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃ）、大腿四頭筋（ｑｕａｄ）及び上腕三頭筋を解析した。組織病理学試験のための組織／器官を回収し、１０％中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ）中で固定した。

エクソンスキッピング解析
組織試料から全ＲＮＡを単離し、逆転写（ＲＴ）、続いてＰＣＲによって解析した。全ＲＮＡを、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１５５９６０１８）に従って、Ｔｒｉｚｏｌを使用して凍結筋肉切片（１５×４０μＭ切片）から単離した。各試料について、１μｇの全ＲＮＡを使用して、製造業者のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｅｒｋ１６７２）に従ってランダム六量体プライマーを使用してＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡを生成し、次いで、各ＲＴ反応について１μｇのＲＮＡ及びランダム六量体とオリゴ（ｄＴ）との混合物を使用して、３５サイクルのシングルＰＣＲに使用した。次いで、ｍＲＮＡを、分析した領域に特異的なプライマーを介して増幅させた。２×マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ０１７２）及び鋳型として１５０ｎｇのＲＴ産物を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。電気泳動後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動によって分離し、Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００イメージングシステム（Ｋｏｄａｋ）を使用してイメージングした。

サンガー配列決定
点変異及びエクソンスキッピング産物の存在を確証するために、増幅ＰＣＲを産生させ、２％アガロースゲルでランした。バンドは、標準プロトコルに従って、ＺｙｍｏｇｅｎゲルＤＮＡ回収キット（Ｄ４００１／Ｄ４００２，Ｚｙｍｏｇｅｎ）を使用して抽出した。次いで、ＤＮＡをサンガー配列決定のためにＯｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓに送り、そこで配列決定が実行された。

イムノブロット解析
２５切片（４０μＭ）、並びにベース緩衝液、ホスファターゼ阻害剤（ＰｈｏｓＳｔｏｐ，Ｒｏｃｈｅ，４９０６８４５００１）及びプロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ，Ｆｉｓｈｅｒ，７８４３０）を含有する１００μＬの溶解緩衝液からタンパク質抽出を開始した。スチールビーズを組織に添加し、これをＴｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して３０／秒の速度で２分間ホモジナイズした。次いで、溶解物を氷上でインキュベートし、スピンダウンし、上清を除去し、イムノブロットするまで－８０℃で保管し、細胞破片を廃棄した。イムノブロットのために、５０～１５０μｇの筋肉組織タンパク質を、３～８％のトリス酢酸ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＡ０３７８ＢＯＸ）上にローディング色素（１×ｌａｅｍｍｌｉ）とともにロードした。ゲルを８０Ｖで３０分間泳動させ、次いで１２０Ｖで４時間泳動させた。タンパク質を、５０Ｖで、トランスファー緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＰ０００６１）中、４℃でニトロセルロース膜（Ｆｉｓｈｅｒ、０９－３０１－１０８）に一晩トランスファーさせた。次いで、膜を、ラットモノクローナル抗ジストロフィン一次抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２７７）及びマウスモノクローナルβ－アクチニン一次抗体（１：５０００、Ｆｉｓｈｅｒ、ＭＡ１２２８６３）、続いて、ＩＲＤｙｅα－ウサギ６８０及びαマウス８００（Ｌｉｃｏｒ、９２６－６８０７１及び９２６－３２２１０）二次抗体を用いて曝露させた。膜をＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ上でスキャンし、Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ １４を使用してイメージングした。

力の生成及び伸張性収縮からの保護
生理学的試験を、３ヶ月齢及び６ヶ月齢マウスのＴＡ筋肉で行った。力試験手順は、Ｈａｋｉｍの手順の修正版を使用して行った（Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９８５）２０１１；１１０：１６５６－１６６３、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１４；２０：９９２－１０００）。マウスの初期麻酔は、それらの重量（すなわち、マウスの重量）の５倍の２５ｍｇ／ｍＬのケタミン、及びそれらの重量の２倍の２．５ｍｇ／ｍＬのキシラジンを含有するカクテルを腹腔内注射することによって実施した。皮膚筋膜及び結合組織を、脛骨前筋（ＴＡ）周辺から除去した。術中、ＴＡ筋肉は常に０．９％の生理食塩水で湿らせていた。結び目を４－０縫合で遠位ＴＡ腱に結び付け、腱を切断した。次いで、余分な縫合糸を再び結び付け、腱を力トランスデューサに取り付けるためのループを残した。次いで、マウスを、実験期間中、３７℃で維持されたプラットフォーム上に配置した。足の四肢は、膝キャップにピンを通し、足をテーピングしてプラットフォームに固定した。次に、ＴＡ腱に取り付けられた縫合糸のループを、２０５Ｂデュアルモードサーボモータトランスデューサ（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に取り付けた。最後に、２つの電気プローブを、刺激のために坐骨神経の近くの二頭筋大腿筋に配置した。

静止力を１０分間の平衡期間にわたって３～４ｇの間に設定した。次に、ＴＡ筋を最適な長さ（Ｌｏ、ｍｍ）で刺激し、活性強縮性筋力を記録して、ＬａｂＶｉｅｗベースのＤＭＣプログラム（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して絶対力測定を行った。次に、筋肉を１０段階のパッシブ・ストレッチ・プロトコルを介して動作させ、その間に刺激を適用して、反復した伸長性収縮後の力低下を決定した。各ステップで、ＴＡ筋肉は受動的にＬｏの１０％緊張した。プロトコルが完了すると、マウスに致死量のケタミン／キシラジンを投与し、ＴＡ筋肉を除去して体重を測定した。質量（ｇ）／（筋肉密度×線維長の比×Ｌｏ）として断面積を測定し、その際、筋肉密度が１．０６ｍｇ／ｍｍ３であり、ＴＡにおける線維長の比が０．６であった（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｒｐｈｏｌ １９９４；２２１：１７７－１９０）。筋重量とＬｏを使用した断面積を絶対力測定に適用して、比筋力測定値を得た。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用のバージョン６．０３，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）における非パラメトリックデータを仮定したＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌａｃｅ検定を使用して評価した。全てのデータについて、各測定値の平均偏差及び標準偏差を決定し、その後±１標準偏差を超える測定値を外れ値として除外した。１０番目の伸長性収縮の記録を使用して外れ値を決定した。

統計分析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して実施した。サンプルサイズが十分であった場合、又はＳｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定を使用して、Ｄ’ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎを使用してデータ正規性を試験した。データがガウス分布を有する場合、一方向ＡＮＯＶＡ検定を使用した。そうでない場合は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓアッセイを実施した。この方法は、伸長性収縮誘発性損傷（ＥＣＣ）を除く全ての実験に適用され、ここでは、双方向ＡＮＯＶＡ分析、続いてボンフェローニ事後試験を実施した。

実施例２
アンチセンス配列及びベクター
エクソン６、７、及び８のウイルス媒介性スキッピングを実行するための製品及び方法を開発した。製品及び方法は、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６（５７０２）：１７９６－１７９９（２００４）又はＧｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（６）：１７９６０１７９９（２００４）で報告されているＵ７ｓｎＲＮＡシステムと比べて変更した。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、エクソン６、７、及び８でのスプライシングに干渉するように、いくつかの標的アンチセンス配列を含むように変更した。具体的には、エクソン６、７、及び８を標的とするアンチセンス配列を、図１Ａ～Ｆに示され、以下の表４に示されるように設計した。

エクソン６、７、及び８を標的とするアンチセンス配列を含むＵ７ｓｎＲＮＡ構築物を作製した。各Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物は、標的配列のうちの１つを含んだ。次いで、Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物のうちの１つ以上を含むゲノムを有する自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターを作製した。

組換えｓｃＡＡＶは、ＨＥＫ２９３細胞において、アデノウイルスフリーの三重プラスミドＤＮＡトランスフェクション（ＣａＰＯ４沈殿）方法によって所望のベクターゲノムを含むプラスミドを使用した改良クロスパッケージングアプローチによって作製した［Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：７９１－８０１（２００２）］。ベクターは、既に報告されているものと同様の方式で、ＡＡＶヘルパープラスミド及びアデノウイルスヘルパープラスミドで共トランスフェクトすることによって生成した［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，１０：１５２８－１５３４（２００３）］。アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ）は、高力価ｒＡＡＶ生成に必要なアデノウイルス５型Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡ Ｉ／ＩＩ ＲＮＡ遺伝子を発現する。

ベクターは、連続イオジキサノール勾配精製及び既に報告されている直線ＮａＣｌ塩勾配を使用したアニオン交換カラムクロマトグラフィーによって、澄明化した２９３細胞溶解液から精製した［Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１０：１０３１－１０３９（１９９９）］。ベクターゲノム（ｖｇ）力価は、既に報告されているようにＰｒｉｓｍ ７５００ Ｔａｑｍａｎ検出器システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して、特異的プライマー／プローブセットを用いたＱＰＣＲベースの検出を使用して測定した（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（上記））。ベクターストック力価は、１～１０×１０^１２ｖｇ／ｍＬの範囲だった。

実施例３
ＷＴ細胞株及びｈＤＭＤマウスモデルにおけるＵ７ｓｎＲＮＡ媒介性スキッピングの有効性
最初のエクソンスキッピング分析は、ＷＴ不死化ヒト線維筋芽細胞を形質導入する自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃｒＡＡＶ）ベクターを使用してＲＴ－ＰＣＲによって実行した。ドキシサイクリンの制御下で筋肉系統細胞に分化転換することができるＷＴ不死化ヒト線維芽細胞が、テロメラーゼ発現ベクター及びｔｅｔ誘導性ＭｙｏＤ発現ベクターの両方を用いた形質導入によって産生された［Ｃｈａｏｕｃｈ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０，７８４－７９０（２００９）］。次いで、変換したヒト線維筋芽細胞（ＦＭ）を、エクソン６、７、及び８に対するアンチセンス配列を組み込んだ異なるＵ７構築物を担持するｓｃｒＡＡＶベクターで形質導入した。

ＲＴ－ＰＣＲの結果は、３つの異なるアンチセンス配列を有するｓｃ ｒＡＡＶ－Ｕ７構築物について図２Ａに示される（例えば、ＥＳＥ８＿２、ＥＳＥ７、ＳＤ６（「１３６」として示される組み合わせ）又はＥＳＥ８、ＳＤ７、及びＳＤ６（「２５６」として示される組み合わせ）。Ｕ７ ｅｓｅ８＿２ ｅｓｅ７ ｓｄ６構築物は、フォワード又はリバース方向のいずれかで、ベクターゲノムに含まれた（図３Ａ～Ｄ）。各Ｕ７構築物は、配列に３つのエクソン６、７、及び８標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物：Ｕ７ ＥＳＥ８＿２／ＥＳＥ８構築物、Ｕ７ ＥＳＥ７／ＳＤ７構築物、及びＵ７ ＳＤ６構築物を含む、エクソン６、７、又は８に対して指向されるアンチセンス（図３Ａ～Ｄに示されるようにプラスミドマップに示される）を有した。Ｕ７＿Ｕ７ ＥＳＥ８＿２／ＥＳＥ８、ＳＤ７／ＥＳＥ７、ＳＤ６フォワード又はリバースＳＣｒＡＡＶ（本明細書の他の箇所ではＵ７＿Ｕ７ ＥＳＥ８＿２ ＳＤ７ ＳＤ６フォワード又はリバースＳＣ ｒＡＡＶと略される）は、エクソン６、７、及び８スキッピングのより高いパーセンテージを達成した。

その後の実験で、エクソンスキッピング効率を、本明細書で上記のｈｄｍｄ７マウスモデルにおいてインビボで分析した。エクソン６、７、及び８の各々を標的とするアンチセンス配列を含む最も効率的なＡＡＶ－Ｕ７ベクターであるｒＡＡＶ１．Ｕ７＿Ｕ７ ＥＳＥ８＿２ ＳＤ７ ＳＤ６フォワード又はリバースを、ｈＤＭＤｍ７マウスにおける最初の筋肉内注射のために選択した。

結果を図６Ａ～Ｃに示す。図６Ａは、エクソン７、８、及び９（緑色の枠（図６Ａの上の枠））又はエクソン６、７、８、及び９（赤色の枠（図６Ａの下の枠））のエクソンスキッピングのＲＴ－ＰＣＲ結果を示す。レーン１～２は、エクソン５、６、７、８、９、及び１０、又はエクソン５、６、７、８、及び１０のいずれかを有する転写物を伴うＷＴｈＤＭＤマウスにおける自然増幅を示す。レーン３～４は、同じ転写物を伴うｈＤＭＤｍ７マウスにおける自然増幅を示す。レーン５～１０は、Ｕ７ ＥＳＥ８＿２ＳＤ７ ＳＤ６フォワードを用いた処置後のスキッピングの結果を示す。エクソン５、６、及び１０（緑色の枠（図６Ａの上の枠））、エクソン５及び１０（赤色の枠（図６Ａの下の枠））が存在し、スキッピングの効率を確証している。図６Ｂは、両方の転写物において、エクソン７、８、及び９（緑色の枠（図６Ａの上の枠））及びエクソン６、７、８、及び９（赤色の枠（図６Ａの下の枠））のスキッピングを確証するサンガー配列決定を示す。図６Ｂで配列決定された転写物は、エクソン７、８、及び９を欠いており、図６Ｃで配列決定された転写物は、エクソン６、７、８、及び９を欠いている。これらの結果は、アンチセンス配列を含むベクターが、エクソン６、７、８、及び９のエクソンスキッピングを媒介することができたことを確証した。これらの結果は、エクソン６が除外されたが、エクソン９がエクソンスキッピング後に転写物の１つに存在した図２Ａから得られたインビトロデータとわずかに異なる。エクソン６を含むが、エクソン７、８、及び／又は９を欠損している転写物は、リーディングフレームを回復させないが、エクソン５、９及び１０を含む転写物、並びにエクソン５及び１０を含む転写物は、両方ともＤＭＤのリーディングフレームを回復させる。

図９は、左脛骨前筋（ＬＴＡ）及び右脛骨前筋（ＲＴＡ）への３匹のｈＤＭＤｍ７マウスの筋肉内注射後のエクソンスキッピングの有効性を示す。マウスに、エクソン６、７、及び８をスキップするように設計されたｓｃＡＡＶ１．ｎＥＳＥ８＿ＳＤ７＿ＳＤ６（ＴＴ７４５－３）を注射した。結果は、処置した筋肉から抽出されたＲＮＡで行われたＲＴ－ＰＣＲからのものである。バンド配列は、サンガー配列決定によって確証された。エクソン５、６、１０及びエクソン５、１０を有する転写物は、インフレームであり、したがって、治療的である。結論として、ｓｃＡＡＶ１．ｎＥＳＥ８＿ＳＤ７＿ＳＤ６（ＴＴ７４５－３）は、エクソン７、８、及び９をスキップし、エクソン６を部分的にスキップすることができる。エクソン６、７、８、及び９を省略又は欠く転写物は、それがｄｍｄのリーディングフレームを回復するため、治療的である。

生理学的実験を行って、マウスへの注射の３ヶ月後にＴＡ筋力を測定した。図１０Ａ～Ｂは、ＡＡＶ．Ｕ７ｓｎＲＮＡ（構築物ＴＴ７４４－３）の筋肉内注射を７週齢で両方のＴＡ筋肉に受けているｈＤＭＤｍ７マウスからの結果を示す。図１０Ａは、それぞれ（左から右に）、健康な対照マウス（ｈＤＭＤ－生理食塩水）、ｄｅｌＣＨ２／ｈＤＭＤｍ７処置マウス（ｄｅｌＣＨ２－ＴＴ７４４－３）、及びｄｅｌＣＨ２／ｈＤＭＤｍ７未処置マウス（ｄｅｌＣＨ２－生理食塩水）における比筋力の測定からの結果を示す。図１０Ｂは、同じマウス群からの連続した伸張性収縮から、力の測定からの結果を示す。ＴＴ７４５－３は、脛骨前筋の比筋力を改善することができ、脛骨前筋の伸張力に対する抵抗を改善することができ、このベクターの治療的利益を支持した。

マウス筋肉におけるジストロフィン発現を処置後に調べた。図１１は、３ヶ月齢のｈＤＭＤｍ７（画像ではＤｅｌＣＨ２として参照される）マウスの処置されたもの（ＡＡＶ．Ｕ７ｓｎＲＮＡ（構築物ＴＴ７４４－３）、「ＤｅｌＣＨ２＋ＴＴ７４４－３－２００１－ＬＴＡ－２０ｘ」と表示された右端パネルを参照）及び未処置（生理食塩水、「ＤｅｌＣＨ２＋Ｓａｌ－２３０６－ＬＴＡ－２０ｘ」と表示された中央パネルを参照）の代表的な画像を示す。健康な対照マウス（ｈＤＭＤ１０４４）を、比較のために左端パネルに示す。ジストロフィンは、免疫蛍光染色によって赤色で染色される。画像は、ＬＴＡの２０×倍率である。これらの結果は、ＴＴ７４４－３構築物による処置が、注射の３ヶ月後に脛骨前筋にジストロフィン発現を導入したことを示す。

処置後のマウスにおけるジストロフィン発現の定量も実行した。１２Ａ～Ｂは、マウスＬＴＡ及びＲＴＡの治療的注射における生理食塩水の２０×拡大画像から、ジストロフィンの免疫蛍光染色の定量を示す。図１２Ａは、未処置マウス（ＤｅｌＣＨ２）と比較して、処置したマウスで５０％多いジストロフィンを有する線維について自動線維定量を示す。ＷＴと比較して、処置したマウスは、５０％高いジストロフィン強度を有する約１５本のジストロフィン陽性線維を有する。図１２Ｂは、ジストロフィン強度の自動定量を示す。処置したマウスの強度は、未治療のマウスが全体で約４８０であるのに対して全体で約５５０であり、この構築物が処置後により多くのジストロフィン発現を可能にするという事実を裏付ける。まとめると、これらの結果は、ＴＴ７４４－３構築物による処置が、注射の３ヶ月後に脛骨前筋にジストロフィン発現を導入したことを示す。

生理食塩水（左バー）又は構築物ＴＴ７４４－３（右バー）を筋肉内に注射したｈＤＭＤｍ７／ＤｅｌＣＨ２マウスからの転写物のパーセンテージの定量も実行した（図１３）。処置は、２５％のスキッピング（６～９に対応する青色、治療的転写物）及び７５％のスキッピングされていない転写物（休止に対応するオレンジ色、スキップされていない転写物）を示した。まとめると、このデータは、ジストロフィン発現を可能にするｄｍｄのリーディングフレームを回復させる、エクソン６、７、８、及び９のスキッピングを媒介するＴＴ７４４－３の有効性を示す。

ジストロフィン発現を、注射の５ヶ月後に測定した。図１４は、ジストロフィンに対して免疫蛍光によって染色された３匹のマウスからの総ＬＴＡ画像（１０×）を示す。ｈＤＭＤ ＬＴＡジストロフィン（左端パネル）は、５ヶ月齢マウスでジストロフィン染色を示し、陽性対照として機能する。注射（ＤｅｌＣＨ２＋生理食塩水、中央パネル）の５ヶ月後のジストロフィンに対するＬＴＡの染色は、ジストロフィン発現をほとんど示さない。注射（ＤｅｌＣＨ２＋ＴＴ７４４－３、右パネル）の５ヶ月後のジストロフィンに対するＬＴＡの染色は、約４０％のジストロフィン陽性線維を示す。これらの結果は、ＴＴ７４４－３による処置が、その治療可能性を支持する４０％の線維においてジストロフィン発現を回復させることを示す。

実施例４
ヒト患者の治療後のジストロフィンの発現
上記のように、ＤＭＤ遺伝子のエクソン６、７、及び８を標的とするアンチセンス配列を含む３つのＵ７ｓｎＲＮＡを含む治療的エクソンスキッピングウイルスベクターを作製した。マウスにおける用量探索試験に続いて、非ヒト霊長類における無毒性を実証した後、最初のヒト臨床を開始した。上記で考察されるように、標的化エクソンがスキッピングされる場合、ジストロフィンの機能的形態が、この療法によって発現される。

本開示を、特定の態様の観点から説明したが、当業者であればその変形及び修飾をし得ることが理解される。したがって、本開示における限定事項は、特許請求の範囲にのみ記載されている理解すべきである。

本出願で参照される全ての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (32)

1. 核酸であって、
   （ａ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも８０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
   （ｂ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される前記配列と少なくとも８０％の同一性を含む前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
   （ｃ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される前記配列を含むヌクレオチド配列、
   （ｄ）配列番号１～２０のうちのいずれか１つに示される前記配列を含む前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、及び
   （ｅ）配列番号２１～２５のうちのいずれか１つに示される配列に結合するヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
2. 少なくとも２つのヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
   （ｉ）ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、及び前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、
   （ｉｉ）前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、及び前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列、並びに
   （ｉｉｉ）前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、及び前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
3. 少なくとも３つのヌクレオチド配列の組み合わせを含み、前記組み合わせが、前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン６で標的とするヌクレオチド配列、前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン７で標的とするヌクレオチド配列、及び前記ヒトＤＭＤ遺伝子をエクソン８で標的とするヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の核酸。
4. （ａ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも７０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
   （ｂ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される前記配列と少なくとも７０％の同一性を含む前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
   （ｃ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される前記配列を含むヌクレオチド配列、及び
   （ｄ）配列番号２６～２９のうちのいずれか１つに示される前記配列を含む前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸を含む、随伴型組換えアデノウイルス（ｒＡＡＶ）。
6. 前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶ－ａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ９である、請求項５又は６に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ｒＡＡＶが、自己相補的である、請求項５～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
9. 請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸と、担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントとを含む、組成物。
10. 請求項５～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶと、担体、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントとを含む、組成物。
11. 筋ジストロフィーの治療、予防、又は改善を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、有効量の
    （ａ）請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項５～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は
    （ｃ）請求項９若しくは１０に記載の組成物、を投与するステップを含む、方法。
12. 前記投与が、全身経路を介する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記全身経路が、注射、注入、又は埋め込みによるものである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーである、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記対象の細胞における機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルが、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現の前記レベルと比較して、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に増加する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記細胞における機能性ジストロフィンの発現が、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前及び後に生検した筋肉においてウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学でジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項１５に記載の方法。
17. 血清クレアチニンキナーゼのレベルが、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の血清クレアチニンキナーゼの前記レベルと比較して、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に低下する、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記対象における、改善した筋力、改善した筋機能、改善した可動性、改善したスタミナ、又はそれらの２つ以上の組み合わせをもたらす、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
19. ６分間歩行試験、立ち上がり時間試験、上り４歩（ａｓｃｅｎｄ ４ ｓｔｅｐｓ）試験、上り下り４歩（ａｓｃｅｎｄ ａｎｄ ｄｅｓｃｅｎｄ ４ ｓｔｅｐｓ）試験、ノーススター歩行評価（Ｎｏｒｔｈ Ｓｔａｒ Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＮＳＡＡ）、努力肺活量（ＦＶＣ）試験、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ｈａｎｄ ｈｅｌｄ ｄｙｎａｍｏｍｅｔｒｙ）（ＨＨＤ）試験、計時アップアンドゴー（Ｕｐ ａｎｄ Ｇｏ）試験、粗大動作サブテスト換算（Ｇｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｓｕｂｔｅｓｔ Ｓｃａｌｅｄ）（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大等尺性随意収縮試験（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって測定されたとき、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に、前記対象における筋ジストロフィーの進行が遅延するか、又は前記対象における筋機能が改善される、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
20. 第２の療法又は併用療法を投与することを更に含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
21. グルココルチコイドを投与することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
22. 筋ジストロフィーの治療のための医薬品の調製のため、又は筋ジストロフィーの治療を必要とするヒト対象において筋ジストロフィーを治療するための、
    （ａ）請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項５～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は
    （ｃ）請求項９若しくは１０に記載の組成物、
    の使用。
23. 治療することが、全身経路を介する、請求項２２に記載の使用。
24. 前記全身経路が、注射、注入、又は埋め込みによるものである、請求項２３に記載の使用。
25. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー又はベッカー型筋ジストロフィーである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の使用。
26. 前記対象の細胞における機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルが、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物の使用前の機能性ジストロフィン遺伝子発現又はタンパク質発現の前記レベルと比較して、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物の使用後に増加する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の使用。
27. 前記細胞における機能性ジストロフィンの発現が、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前及び後に生検した筋肉においてウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学で前記ジストロフィンタンパク質レベルを測定することによって検出される、請求項２６に記載の使用。
28. 血清クレアチニンキナーゼのレベルが、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与する前の血清クレアチニンキナーゼの前記レベルと比較して、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に低下する、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の使用。
29. 前記対象における、改善した筋力、改善した筋機能、改善した可動性、改善したスタミナ、又はそれらの２つ以上の組み合わせをもたらす、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の使用。
30. ６分間歩行試験、立ち上がり時間試験、上り４歩試験、上り下り４歩試験、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）、努力肺活量（ＦＶＣ）試験、１０メートル計時試験、１００メートル計時試験、ハンドヘルドダイナモメトリー（ＨＨＤ）試験、計時アップアンドゴー試験、粗大動作サブテスト換算（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大等尺性随意収縮試験（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって測定されたとき、前記核酸、ｒＡＡＶ、又は組成物を投与した後に、前記対象における筋ジストロフィーの進行が遅延するか、又は前記対象における筋機能が改善される、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の使用。
31. 第２の療法又は併用療法の使用を更に含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の使用。
32. グルココルチコイドの使用を含む、請求項２１に記載の使用。