JPH10146191A - ウィルソン病治療用の組換えアデノウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウィルソン病の遺伝子治療に有用な、銅輸送
蛋白を発現するウイルスベクターを提供する。 【解決手段】 銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこ
の遺伝子の発現を制御するＣＡＧプロモーターを有す
る、ウィルソン病治療用組換えアデノウイルスベクタ
ー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はウィルソン病治療用
の組換えアデノウイルスベクターに関する。さらに詳し
くは、銅輸送蛋白発現用組換えアデノウイルスベクター
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウィルソン病発生頻度は出生人口３〜４
万人に一人と推定され、先天性代謝異常症の中では比較
的頻度が高い。銅輸送蛋白をコードする遺伝子の欠損に
より、肝に銅が異常蓄積することにより発症することが
最近明らかになった（Nature Genetics, Vol.5, 327-33
7(1993)）。現在Ｄ−ペニシラミンや塩酸トリエンチン
などのキレート薬投与による治療が実施されているが重
篤な副作用が報告され、満足な治療法とはいえない。ま
た、重篤な副作用が出ない場合も毎日大量のキレート剤
を一生飲み続けることは患者にとって大きな苦痛であ
る。

【０００３】近年、種々のベクターを用いた遺伝子導入
技術が開発されており、銅輸送蛋白をコードする遺伝子
を用いた遺伝子治療が確立されることが望ましい。現在
知られているベクターにはレトロウイルスベクター、ア
デノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターな
どのウイルスベクター、あるいはリポソームなどの非ウ
イルスベクターがあり、これらを用いて種々の遺伝性疾
患、癌およびウイルス性疾患に対する遺伝子治療の試み
が米国を中心に行われている。しかし、ウィルソン病に
関する有効な遺伝子治療は未だ報告例がない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、銅輸送蛋白を発現するウイルスベクターを構築し、
これをウィルソン病治療用に提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記の課題を解決するために鋭意検討し、ウイルスベクタ
ーとしてアデノウイルスベクターを用いることによっ
て、銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこの遺伝子の
発現を制御するプロモーターを有し、銅輸送蛋白を生体
内で発現させることができる組換えアデノウイルスベク
ターを作製することにより、このベクターを用いて動物
細胞内での所望の遺伝子の発現に成功した。これによ
り、本発明の組換えアデノウイルスベクターは、ウィル
ソン病の治療に有用であることを確認した。

【０００６】ウィルソン病は、銅輸送蛋白の欠損のた
め、肝臓に蓄積する銅により引き起こされる。一方、ア
デノウイルスは分裂期、休止期を問わず種々の細胞に感
染し、特に肝臓への感染効率は高いため、本発明の組換
えアデノウイルスベクターは効率的に肝細胞に導入され
る。例えば、患者の門脈から該組換えアデノウイルスベ
クターを投与することができる。肝細胞に導入された本
発明の組換えアデノウイルスベクターは、銅輸送蛋白を
発現し、発現した銅輸送蛋白によって銅が細胞外に排出
される。このように、本発明の組換えアデノウイルスベ
クターを用いることにより、ウィルソン病患者の細胞内
に蓄積した銅を排出することができる。

【０００７】即ち、本発明の要旨は次の通りである。 （１） 銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこの遺伝
子の発現を制御するプロモーターを有する組換えアデノ
ウイルスベクター。 （２） 銅輸送蛋白がヒト由来であることを特徴とする
前記１記載の組換えアデノウイルスベクター。 （３） プロモーターがＣＡＧプロモーターであること
を特徴とする前記１または２記載の組換えアデノウイル
スベクター。 （４） アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ遺伝子領域全部
またはその一部が欠失していることを特徴とする前記１
ないし３いずれか記載の組換えアデノウイルスベクタ
ー。 （５） アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領域全部
またはその一部が欠失していることを特徴とする前記１
ないし４いずれか記載の組換えアデノウイルスベクタ
ー。 （６） アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子領域全部ま
たはその一部が欠失していることを特徴とする前記１な
いし５いずれか記載の組換えアデノウイルスベクター。 （７） 銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこの遺伝
子の発現を制御するプロモーターを有する組換えアデノ
ウイルスベクターからなるウィルソン病治療剤。 （８） 銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこの遺伝
子の発現を制御するプロモーターを有する組換えアデノ
ウイルスベクターを大量に生産する方法であって、該組
換えアデノウイルスベクターをヒト胎児腎由来細胞株２
９３細胞に感染させ、感染した２９３細胞を２価の銅イ
オン濃度が約４０μＭ〜約８０μＭである培地中で培養
することを特徴とする方法。

【０００８】以下に本発明について詳細に説明する。本
発明に用いられるアデノウイルスは動物を宿主とするも
のであり、特にヒトを宿主とするヒトアデノウイルスが
好適に用いられる。ヒトアデノウイルスのゲノムは、約
３６ｋｂの２本鎖状ＤＮＡであって、ＤＮＡ鎖両端には
およそ１００ｂｐからなる逆方向反復塩基配列があり、
そのＤＮＡ鎖両端の５’末端にはＥ２Ｂ遺伝子産物が切
断加工された５５ｋの蛋白質が共有結合しているという
特異な構造をしている。本発明に用いられるヒトアデノ
ウイルスとしては、特に、２型または５型のアデノウイ
ルスが好ましい。

【０００９】本発明に用いられるアデノウイルスのゲノ
ムは、Ｅ１遺伝子領域、特にＥ１Ａ遺伝子領域を欠失し
ていることが好ましい。これは、アデノウイルスの細胞
ガン化活性に関与するＥ１Ａ遺伝子領域を欠失させるこ
とにより、アデノウイルスを無毒化し、ゲノム中に組み
込んだ外来の遺伝子配列のみを発現させるためである。
必ずしもＥ１Ａ遺伝子領域のすべてを欠失させる必要は
ない。例えば、１．３〜９．３％（ｍａｐ ｕｎｉｔ）
の断片を除去すれば目的は達成される。該アデノウイル
スは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子を持続的に発現している細
胞（例えば、ヒト胎児腎由来細胞株２９３細胞）を除く
宿主細胞内で増殖することができないという特徴を有す
る。銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこの遺伝子の
発現を制御するプロモーターは、例えば、Ｅ１Ａ遺伝子
領域の欠失部位に挿入することができる。

【００１０】また、本発明に用いられるアデノウイルス
のゲノムは、Ｅ３遺伝子領域全部またはその一部も欠失
させても良い。Ｅ３遺伝子領域は、アデノウイルスの複
製には不要であるからである。特に、Ｅ３遺伝子領域の
一部である７９．６〜８４．８％（ｍａｐ ｕｎｉｔ）
を欠失させたものが好ましい。銅輸送蛋白をコードする
遺伝子およびこの遺伝子の発現を制御するプロモーター
は、例えば、Ｅ３遺伝子領域の欠失部位に挿入すること
ができる。

【００１１】さらに、本発明に用いられるアデノウイル
スのゲノムは、Ｅ２Ａ遺伝子の機能を完全に欠失させる
ために、Ｅ２Ａ遺伝子領域全部またはその一部を欠失さ
せても良い。Ｅ２Ａ遺伝子領域の存在がアデノウイルス
ベクターの細胞内での長期安定性に悪影響を及ぼすから
である。Ｅ２Ａ遺伝子領域欠損型のアデノウイルスベク
ターは、ＥＰ−７３２４０５−Ａに記載した方法に従っ
て構築することができる。この技術は任意の目的遺伝子
に対して応用可能であり、本発明の目的遺伝子にも応用
できる。このベクターを用いることにより長期間の発現
が可能となり、ウィルソン病等、長期間の遺伝子発現を
要する疾患には特に有効であると考えられる。

【００１２】銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこの
遺伝子の発現を制御するプロモーターを導入するアデノ
ウイルスゲノムの部位は、実施例に示したＥ１遺伝子領
域欠失部位（１．３〜９．３ ｍａｐ ｕｎｉｔ）の他
に、Ｅ３遺伝子領域欠失部位（７９．６〜８４．８ ｍ
ａｐ ｕｎｉｔ）(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,46
26-4630(1987)）、あるいはＥ４プロモーター上流域で
右端（１００ｍａｐｕｎｉｔ）から１９８塩基の部位(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320-1324(1996)）な
どが挙げられる。

【００１３】ウィルソン病患者の細胞内に蓄積した銅を
排出するためには大量の銅輸送蛋白の発現が必要であ
る。このために種々のプロモーターが用いられる。本発
明に用いられるプロモーターとしては、動物ウイルス遺
伝子プロモーターおよび動物細胞遺伝子プロモーターが
挙げられる。前者の例としてはＳＶ４０遺伝子プロモー
ター、アデノウイルス主要後期遺伝子プロモーター等が
あり、また、後者の例としてはチミジンキナーゼ遺伝子
プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、
免疫グロブリン遺伝子プロモーター等がある。しかし、
本発明には、ＣＡＧプロモーターが特に有利に用いられ
る。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルスエン
ハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギ
βグロビンのスプライシングアクセプターおよびウサギ
βグロビン由来のポリＡ付加シグナルからなるハイブリ
ッドプロモーターであり、高発現ベクターとして特開平
３−１６８０８７号公報に開示されている。その調製は
同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−１６
８０８７号、１３頁２０行〜２０頁１４行および２２頁
１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩで切り出すことにより行うことができ、本発明に利
用することができる。

【００１４】本発明で用いる銅輸送蛋白をコードする遺
伝子ＷＤ（Nature Genetics, Vol.5, 338-343(1993)）
は、遺伝子治療を目的とするため、ヒト由来であること
が望ましい。ＷＤ遺伝子の転写産物は臓器により異なる
ことが知られており（肝臓：Nature Genetics, Vol.5,
327-337(1993)、脳：Nature Genetics, Vol.5, 344-350
(1993)）、脳から得られたｃＤＮＡと肝臓から得られた
ｃＤＮＡは明らかに構造が異なっているが、その構造の
比較から、正常な機能を有しているのは肝臓から得られ
たｃＤＮＡと考えられる。従ってウィルソン病遺伝子治
療のためには肝臓由来のｃＤＮＡを用いることが望まし
い。ただし、翻訳産物が銅輸送機能を有していることが
本質的であるため、塩基配列中に挿入・置換・欠失が存
在する変異ｃＤＮＡも、その翻訳産物が銅輸送機能を有
していれば用いることができる。また、種々の臓器から
得られたｃＤＮＡ断片を連結して目的のｃＤＮＡを得る
こともできる。

【００１５】次に、本発明の組換えアデノウイルスベク
ターの製造方法について説明する。 銅輸送蛋白ｃＤＮＡを含むｐＷＤ４７２９を制限酵
素ＳｍａＩ(宝酒造製)およびＫｐｎＩ（宝酒造製）で同
時消化し、銅輸送蛋白の全コーディング領域を含むＤＮ
Ａ断片を得る。 公知の方法（細胞工学 １３、７６０−７６３（１
９９４））により調製したＣＡＧプロモーターを含むカ
セットコスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡｗｔを制限酵素Ｓｗａ
Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）で処理したものと、
で得たＤＮＡ断片を平滑化したものとを混合する。次い
で、カセットコスミドを沈殿させ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させ、銅輸送蛋白遺伝子を組み込んだカセットコ
スミドを得る。ＣＡＧプロモーター以外のプロモーター
を使用する場合には、まずアデノウイルスゲノム（３６
ｋｂ）の全長のうち、複製に不要なＥ３遺伝子領域
（１．９ｋｂ）とＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ遺伝子領域（２．９ｋ
ｂ）を欠失させた約３１ｋｂのゲノムＤＮＡを持つカセ
ットコスミドを作製し、他方、使用しようとするプロモ
ーター、銅輸送蛋白遺伝子およびポリＡ配列を含むプラ
スミドを作製し、適当な制限酵素で処理し、アデノウイ
ルスゲノムのＥ１Ａ・Ｅ１Ｂ欠失部位に銅輸送蛋白遺伝
子発現ユニットが組み込まれたカセットコスミドを得
る。

【００１６】 次に、得られたカセットコスミドを、
ラムダ・インビトロ・パッケージングキットであるギガ
パックＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、イン
ビトロ・パッケージングを行う。 一方、アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複合体（Ａｄ５
ｄ１Ｘ ＤＮＡ−ＴＰＣ）を調製する。アデノウイルス
ＤＮＡとしては、Ａｄ５ｄ１Ｘ（Ｉ．Ｓａｉｔｏｅｔ
ａｌ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５４，７１
１−７１９（１９８５））を用い、Ａｄ５ｄ１ＸをＨｅ
Ｌａ細胞（Ｒｏｕｘ １０本分）に感染させ、培養を行
う。ウイルス粒子を回収し、塩酸グアニジン処理・超遠
心によりＤＮＡ−ＴＰＣを分離・回収する。こうして得
られたＡｄ５ｄ１Ｘ ＤＮＡ−ＴＰＣを次のステップの
組換えアデノウイルス作製のため充分量のＥｃｏＴ２２
Ｉで処理する。 最後のステップとして、銅輸送蛋白遺伝子を組み込
んだカセットコスミドとＥｃｏＴ２２Ｉで処理したＡｄ
５ｄ１Ｘ ＤＮＡ−ＴＰＣを混合し、セルファクト（フ
ァルマシア社製）キットを用いてリン酸カルシウム法で
トランスフェクションを行う。ウイルスの増殖のため細
胞が死滅したものからウイルス液を回収し、銅輸送蛋白
をコードする遺伝子およびこの遺伝子の発現を制御する
プロモーターを有する組換えアデノウイルスベクターを
得る。

【００１７】本発明の組換えアデノウイルスベクターの
大量調製においては、ベクター感染細胞の培地の添加量
を調整し、通常用いる２０ｍｌ／２２５ｃｍ²フラスコ
よりも多くすることが望ましく、好ましくは約４０ｍｌ
／２２５ｃｍ²フラスコに相当する培地量にすれば、高
力価のベクターが調製できる。また、銅輸送蛋白発現組
換えアデノウイルスベクターを調製する際、通常の方法
（特開平７−２９８８７７号公報）では最終力価が低
い。この原因は、ベクター調製に用いるヒト胎児腎由来
細胞株２９３細胞に感染した銅輸送蛋白発現組換えアデ
ノウイルスベクターによって、銅輸送蛋白が大量に産生
された結果、２９３細胞内の銅イオンが欠乏し２９３細
胞にダメージを与えるためウイルス力価が上昇しないと
考えられた。そこで、本発明者らは、培地への銅イオン
の添加、細胞あたりの培地量等を検討した。その結果、
塩化銅（II）（ＣｕＣｌ₂）を培地に約４０μＭ〜約８
０μＭになるように添加することによって、ベクター力
価は塩化銅（II）（ＣｕＣｌ₂）未添加培地を使用した
場合に比べて飛躍的に上昇することに成功した。

【００１８】本発明はまた、銅輸送蛋白をコードする遺
伝子およびこの遺伝子の発現を制御するプロモーターを
有する組換えアデノウイルスベクターからなるウィルソ
ン病治療剤に関する。本発明のウィルソン病治療剤に
は、患者において選択されるべき投与経路に適した薬学
的担体が含まれる。本発明のウィルソン病治療剤は非経
口的に投与することができる。ウィルソン病患者の肝臓
の全細胞に効率よく導入することが望ましく、そのため
には門脈からの局所投与が好ましい。本発明のウィルソ
ン病治療剤の投与量、投与回数は、患者の症状、年齢、
体重などによって異なるが、通常は成人に対し、１回当
たり、１０¹²〜１０¹³ｐｆｕ投与することができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定さ
れるものではない。

【００２０】実施例１ ＷＤ遺伝子の取得：ＷＤ ｃＤＮＡの作製法 まず、以下に示したＷＤの２つのクローン（米国コロン
ビア大、Dr. T. C. Gilliam から入手）およびＲＴ−Ｐ
ＣＲにより得た２断片から全長をコードするクローンを
得た。 1)pCUN-C1 (塩基番号 223-2031) 2)pWD02 (塩基番号 1489-5581)(Nature Genetics, Vo
l.5, 344-350(1993)、ベクターはpUC) ＲＴ−ＰＣＲは、ヒト肝臓のｍＲＮＡを鋳型にして以下
のプライマーを使って行った。

【００２１】翻訳開始コドンをカバーするプライマー
(set 1) 5プライマー 5'-CCG ACC AGG TGA CCT TTT GC-3' (塩
基番号 101-120) 3プライマー 5'-CTG ACT GTG CTG GTG GCC AC-3' (塩
基番号 350-331) exon6,7,8,12を含むプライマー (set 2) 5プライマー 5'-TCA AGT ATG ACC CAG AGG TC-3' (塩
基番号 1751-1770) 3プライマー 5'-CAT CAC AGT CTT TAT CTT GT-3' (塩
基番号 3237-3218)

【００２２】まず、翻訳開始コドン付近を含んだプラス
ミドpEAXを作製した（図１）。すなわち、のプライマ
ーセットでできた249bpの断片をEcoRIとApaIで切断し、
これを、pCUN-C1をApaIとXhoIで切断して得られた1461b
pの断片とライゲーションしてpBlueScript(pBS)のEcoRI
/XhoI部位に挿入し、pEAXを得た。次に、exon6,7,8,12
を含むプラスミドpWD02compを作製した（図２）。すな
わち、のプライマーセットでできた1486bpの断片をXh
oI,BclIで切り、これをpWD02のXhoI-BclI間の断片と入
れ換えた。次に、pEAXのEcoRI/XhoI 断片(1640bp)とpWD
02compのXhoI/EcoRI 断片(3800bp)を同時にpBlueScript
のEcoRI部位に挿入して、完全長のWD cDNAを持ったプラ
スミド(pWDcomp)を作り、最後に、PvuII(nt 4729)より
3'側の部分を除いて、pWD4729を構築した（図３）。

【００２３】実施例２ ＷＤカセットコスミドの作製 作製されたｐＷＤ４７２９から、翻訳開始コドンから終
止コドンを含む領域約４．７ｋｂの断片をＳｍａＩおよ
びＫｐｎＩによって切り出し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素（宝酒
造製）によって両端を平滑化した。この断片と、ＣＡＧ
プロモーターを含むコスミドベクターｐＡｄｅｘ１ＣＡ
ｗｔをＳｗａＩで切断したものとを１６℃で一晩連結反
応後、ＳｗａＩで切断し、常法(Molecular Cloning Vol
3 E34)に従いカセットコスミドのフェノール抽出、遠心
分離ついでゲル濾過を行った。再度ＳｗａＩ切断をおこ
ない、得られたコスミドをギガパックＸＬ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社製）を用いてラムダ・イン・ビトロ・パッ
ケージングし、大腸菌ＤＨ５αに感染させて一部をアン
ピシリン添加寒天プレートに接種した。得られたアンピ
シリン耐性のコロニーを１．５ｍｌのアンピシリン添加
ＬＢ培地で一晩培養し、コスミドＤＮＡを調製した。こ
のコスミドＤＮＡの制限酵素切断断片解析により、ＷＤ
ｃＤＮＡ断片が予定通りに挿入されているクローンを選
択し、ｐＡｄｅｘ１ＣＡＷＤとした。なお、ＷＤｃＤＮ
Ａ断片が予定通り挿入されているクローンのＤＮＡをＮ
ｒｕＩで切断後リガーゼを用いて自己連結することによ
り、大部分のアデノウイルス遺伝子を取り除いたプラス
ミドＰｅｘ１ＣＡＷＤも調製し、制限酵素切断断片の解
析により、発現ユニットの向きと構造を確認した。

【００２４】実施例３ アデノウイルスＤＮＡ−蛋白複合体（Ａｄ５ ｄｌＸ
ＤＮＡ−ＴＰＣ）の調製ＷＤカセットコスミドｐＡｄｅ
ｘ１ＣＡＷＤから銅輸送蛋白質発現組換えアデノイルス
ベクターＡｄｅｘ１ＣＡＷＤを調製するために使用す
る、アデノウイルスＤＮＡ―蛋白複合体（Ａｄ５ ｄｌ
Ｘ ＤＮＡ−ＴＰＣ）は、実験医学別冊バイオマニュア
ルシリーズ４「動物細胞への遺伝子導入と発現・解析」
（１９９３年、羊土社）４３頁〜５８頁に記載された方
法に従って調製した。得られたＡｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ
−ＴＰＣのＥｃｏＴ２２Ｉ切断も、同文献に記載された
方法に準じて実施した。得られたＡｄ５ ｄｌＸ ＤＮ
Ａ−ＴＰＣ ＥｃｏＴ２２Ｉ切断断片は、分注後−８０
℃で保存した。

【００２５】実施例４ 組換えアデノウイルスの分離と高力価ウイルス液の調製 １０％ＦＣＳ添加ＤＭＥで培養した２９３細胞の６ｃ
ｍ、９ｃｍシャーレ、各１枚を用意した。ＷＤカセット
コスミドｐＡｄｅｘ１ＣＡＷＤ８μｇおよびとＥｃｏＴ
２２Ｉ切断Ａｄ５ ｄｌＸ ＤＮＡ−ＴＰＣ１μｇを混
合し、セルフェクトキット（ファルマシア社製）を用い
て６ｃｍシャーレ２９３細胞にリン酸カルシウム法によ
りトランスフェクションを行った。６ｃｍシャーレのメ
ディウムの上から混合液を滴下し、培養を続けた。一晩
培養後（約１６時間）し、午前中に培養液を交換し、夕
方、遺伝子導入２９３細胞をシャーレから剥がしてコラ
ーゲンコート９６穴プレート（住友ベークライト社製）
３枚に、原液・１０倍希釈・１００倍希釈して播き直し
た。細胞数が各プレートで大きく異ならないように、１
０倍希釈、１００倍希釈２９３細胞には、それぞれ１０
ｃｍシャーレ２９３細胞を１／３ずつ添加して９６穴プ
レートに播いた。

【００２６】９６穴プレート播き込み５日後、１０日
後、１７日後、２１日後に５０μｌの５％ＦＣＳ添加Ｄ
ＭＥを加えた。ウイルスが増殖した結果、２９３細胞が
死滅したウエルが７日後ころから出現し、ウエル中の細
胞が完全に死滅するごとに滅菌パスツールピペットで細
胞懸濁液を採取した。採取した細胞懸濁液は、ドライア
イス上で急速凍結後−８０℃で保存した。９６穴プレー
ト播き込み１０日後以降２９３細胞が死滅した１２クロ
ーンを選択し、これらのクローン感染細胞懸濁液を超音
波処理３０秒３回行い、５０００回転５分間遠心し、上
清を１次ウイルス液（first seed）として−８０℃で保
存した。

【００２７】コラーゲンコート２４穴プレート上の２９
３細胞を用意し、各クローンの１次ウイルス液１０μｌ
を接種後５％ＦＣＳ−ＤＭＥ０．４ｍｌを添加し培養し
た。各クローンとも２ウエルずつ接種した。１次ウイル
ス液接種３日〜４日後、ウイルス複製による細胞障害が
完結したウエルから細胞懸濁液を採取し、１ウエルの細
胞懸濁液は超音波処理３０秒×３回後５０００回転５分
間遠心を行い、上清を２次ウイルス液として−８０℃で
凍結保存した。他の１ウエルは５０００回転５分で上清
と細胞（セルパック）を分離し、上清はサンプルに混入
する可能性のある増殖可能なアデノウイルスＲＣＡ（Ｒ
ｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ａｄｅｎ
ｏｖｉｒｕｓ）由来のＥ１Ａ遺伝子検出用サンプルとし
て凍結保存した。セルパックは、実験医学別冊バイオマ
ニュアルシリーズ４「動物細胞のへの遺伝子導入と発現
・解析」（１９９３年、羊土社）４３頁〜５８頁に記載
された方法に従って染色体ＤＮＡを調製し、これに含ま
れるウイルスＤＮＡの構造をＸｈｏＩなどの制限酵素を
用いて切断し、断片長を解析して目的の遺伝子構造をも
つクローンを選択した。

【００２８】目的の遺伝子構造を持つことが確認された
クローンに対応する培養上清から、Zhang,W.W.らの文献
（Biotechniques, 1995.18(3):p.444−447.）に準じた
方法を用いてウイルスＤＮＡを調製し、これを鋳型とし
てアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を検出するＰＣＲを行な
った。Ｅ１Ａ遺伝子の検出用ＰＣＲ反応に用いるプライ
マーは、文献に記載されたものとは異なる新たに設定し
たものを使用した。具体的には、ヒトアデノウイルス５
型遺伝子全塩基配列（Genbank Accession No.M73260 ）
中のＥ１Ａ遺伝子塩基配列に由来する以下のオリゴヌク
レオチド（１）、（２）を用いてＰＣＲ反応を行い、９
０６ｂｐのＥ１Ａ由来ＰＣＲ遺伝子増幅産物が検出され
ないクローンを選択し、Ａｄｅｘ１ＣＡＷＤとした。 オリゴヌクレオチド（１）５’―AAA TGG CCG CCA GTC
TTT TG―３’(塩基番号600-619) オリゴヌクレオチド（２）５’―CCA GGC TCG TTA AGC
AAG TC―３’(塩基番号1505-1486)

【００２９】得られたＡｄｅｘ１ＣＡＷＤは２９３細胞
を用いて順次継代し、最終的には２２５ｃｍ²フラスコ
６本のスケールで大量調製を行った。力価測定は実験医
学別冊バイオマニュアルシリーズ４「動物細胞への遺伝
子導入と発現・解析」（１９９３年、羊土社）４３頁〜
５８頁に記載された方法に従って実施した。Ａｄｅｘ１
ＣＡＷＤ精製検討は、次のように実施した。すなわち、
２２５ｃｍ２フラスコ６本からＡｄｅｘ１ＣＡＷＤ感染
２９３細胞を培地懸濁液として回収し、密閉型超音波破
砕機により細胞を破砕後１０、０００回転１０分間遠心
し、Ａｄｅｘ１ＣＡＷＤを含んだ上清を得た。４Ｍおよ
び２．２Ｍ塩化セシウム溶液を重層したベックマン社製
ＳＷ２８チューブ上にこの上清をさらに重層し、ベック
マン社製ＳＷ２８スイングローターで２５、０００回転
２時間４℃で遠心し、遠心チューブ内でＡｄｅｘ１ＣＡ
ＷＤのバンドを形成させた。このバンドを回収し、塩化
セシウム飽和溶液で２倍希釈したのち、ベックマン社製
ＳＷ４１チューブに添加し、この上に４Ｍおよび２．２
Ｍ塩化セシウムを重層後、ベックマン社製ＳＷ４１ロー
ターで３５、０００回転３時間４℃で遠心した。チュー
ブ内で形成されたＡｄｅｘ１ＣＡＷＤベクターのバンド
を回収後、１０％グリセロールを含んだＰＢＳに対して
充分に透析して塩化セシウムを除去した後、Ａｄｅｘ１
ＣＡＷＤ精製ベクターとして−８０℃で凍結保存した。

【００３０】動物接種検討のためのＡｄｅｘ１ＣＡＷＤ
大量調製は、最初はアデノウイルスベクター感染後２２
５ｃｍ²フラスコあたり２０ｍｌの５％ＦＣＳ添加ＤＭ
Ｅ培地を添加して実施した。しかし、この方法ではベク
ター複製による２９３細胞障害完結に著しく長い期間を
要し、得られた精製ベクターの力価も通常の場合の１０
分の１以下であるおよそ３×１０⁹ｐｆｕ／ｍｌでしか
なかった。この程度の力価しかないサンプルでは動物投
与検討が困難なため、高力価のサンプルを得るための検
討を実施した。検討の結果、ベクター感染細胞の培地の
添加量を４０ｍｌ／２２５ｃｍ²フラスコに増加させれ
ば、高力価のベクターが調製できることが明らかになっ
た。この場合、精製ベクターの力価は先に述べた検討の
およそ１０倍である２．５×１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌであ
り、２２５ｃｍ²フラスコ６本から合計２．２×１０¹¹
ｐｆｕ／ｍｌのベクターが得られた。

【００３１】また、Ａｄｅｘ１ＣＡＷＤが発現する銅輸
送蛋白質の機能により、ベクターが複製する２９３細胞
の機能が阻害されている可能性を考慮し、塩化銅（II）
（ＣｕＣｌ₂）をベクター感染細胞培養液に添加する検
討を行った。検討の結果、２９３細胞に対して障害を示
さない４０μＭＣｕＣｌ₂を培地に添加した場合、ベク
ター感染細胞培地懸濁液超音波処理上清のベクター力価
はＣｕＣｌ₂未添加培地を使用した場合の２倍程度上昇
することが明らかになった。８０μＭＣｕＣｌ₂添加の
場合、若干の細胞傷害が見られたものの力価はやはり２
倍程度上昇した。

【００３２】実施例５ ＬＥＣラット肝初代培養細胞への感染 （ウェスタンブ
ロッティングによる発現確認） ＬＥＣラット（８週令、雄）から、コラゲナーゼ潅流法
にて肝細胞を分離し、コラーゲンコートしたプレートに
１×１０⁶個の細胞を播種し、無血清培地にて一晩培養
した。次に銅輸送蛋白発現組換えアデノウイルスＡｄｅ
ｘ１ＣＡＷＤあるいはコントロールアデノウイルスＡｄ
ｅｘ１ＣＡｗｔ（細胞工学 １３、７６０−７６３（１
９９４））をそれぞれ３×１０⁷pfuを１時間、細胞に感
染させ、感染後２日目に細胞を集め、細胞溶解用緩衝液
(50 mMトリス-塩酸, pH 8/ 150 mMNaCl, 1% NP-40/ 0.5
% デオキシコール酸/ 0.1% SDS) に溶かし、氷上で３０
分静置した。15,000 g ２０分遠心して上清を取り、そ
のうち１０μｌを7% SDS-PAGE にて電気泳動した後、Ｐ
ＶＤＦメンブレンフィルター上に電気泳動的にブロット
した。さらに以下の方法で銅輸送蛋白を検出した。

【００３３】（方法） フィルター ↓ブロッキング：10% スキムミルクを含むPBS-T（0.2%
Tween-20を含むPBS）中、室温で１時間インキュベート
した。 ↓洗浄：室温で１時間インキュベートした。 ↓フィルターを2% スキムミルク/ PBS-Tに浸し 抗−銅
輸送蛋白抗体 (100倍希釈液)を添加した後、室温で１時
間インキュベートした。 ↓洗浄： PBS−T中 5分間を３回 ↓フィルターを2% スキムミルク/ PBS−Tに浸しホース
ラディッシュペルオキシダーゼ結合抗-マウス IgG (100
0倍希釈液)を添加した後、室温で30分間インキュベート
した。 ↓洗浄： PBS−T中 5分間を５回 ↓ECL 反応液（アマーシャム）中 1分間 室温放置 Ｘ線フィルムに露光 （結果）Ａｄｅｘ１ＣＡＷＤ で処理した初代培養肝細
胞中に、分子量約１７０ｋＤの銅輸送蛋白が検出され
た。

【００３４】実施例６ ＬＥＣラットへの投与 (1)蛍光免疫染色による発現確認および細胞内局在性 ＬＥＣラット（３週令、性別不明）に銅輸送蛋白発現組
換えアデノイルスＡｄｅｘ１ＣＡＷＤ あるいはコント
ロールアデノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡｗｔをそれぞれ
１．２５×１０¹⁰pfu尾静脈より投与した。ウィルス投
与後、３日目の肝臓をコンパウンドとともに液体窒素で
凍結し、クライオスタットで５μｍで細切（以下は、全
て室温） ＃４％パラフォルムアルデヒドで２分間固定 ＃ＰＢＳで３回洗浄 ＃１％ＮＰ４０に５分侵漬 ＃ＰＢＳで３回洗浄 ＃抗−銅輸送蛋白抗体を３％ＢＳＡに２０００倍、８０
００倍に希釈し、２時間反応 ＃ＰＢＳで３回洗浄 ＃３％ＢＳＡで４０倍に希釈したローダミン標識抗マウ
スＩｇＧを２０分反応 ＃ＰＢＳで３回洗浄 ＃共焦点レーザー顕微鏡で観察 結果：Ａｄｅｘ１ＣＡＷＤを投与したＬＥＣラットの肝
細胞にのみ銅輸送蛋白が染色された。銅輸送蛋白は、細
胞質中、特にゴルジ装置に局在していると思われる。

【００３５】(2)ホロセルロプラスミンの検出 セルロプラスミンは、分泌の過程において、ゴルジ体で
銅輸送蛋白から銅を受け取り、アポセルロプラスミンか
らホロセルロプラスミンへと変換される。ＷＤ遺伝子を
欠損するＬＥＣラットにおいては、血中にホロセルロプ
ラスミンは検出されずアポセルロプラスミンのみが検出
される（小児医学，25(2), 315-333(1991)）。ＬＥＣラ
ット（３週令、性別不明）に銅輸送蛋白発現組換えアデ
ノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡＷＤあるいはコントロールア
デノウイルスＡｄｅｘ１ＣＡｗｔをそれぞれ１．２５×
１０¹⁰pfu尾静脈より投与した。投与前および投与後３
日目のＬＥＣラットから採血し、血清を分離した。血清
をＰＢＳにて１００倍希釈したもののうち、１０μｌを
7% Native−PAGE にて、電気泳動後、 ＰＶＤＦメンブ
レンフィルター上に電気泳動的にブロットした。さらに
以下の方法で銅輸送蛋白を検出した。

【００３６】（方法） フィルター ↓ブロッキング：10% スキムミルクを含むPBS−T（0.2%
Tween−20を含むPBS）中、室温で１時間インキュベー
トした。 ↓洗浄： PBS−T中 5分間を２回 ↓フィルターを2% スキムミルク/ PBS−Tに浸し 抗−セ
ルロプラスミン抗体(500倍希釈液)を添加した後, 室温
で１時間インキュベートした。 ↓洗浄： PBS−T中 5分間を３回 ↓フィルターを2% スキムミルク/ PBS−Tに浸しホース
ラディッシュペルオキシダーゼ結合抗−マウスIgG(2500
倍希釈液)を添加した後、室温で30分間インキュベート
した。 ↓洗浄： PBS−T中 5分間を５回 ↓ECL 反応液（アマーシャム）中 1分間 室温放置 Ｘ線フィルムに露光 結果：Ａｄｅｘ１ＣＡＷＤ投与後のＬＥＣラット血中に
のみ、ホロセルロプラスミンが検出された。

【００３７】

【発明の効果】本発明により、ウィルソン病治療に有用
な組換えアデノウイルスベクターを提供することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、翻訳開始コドン付近を含んだプラスミ
ドｐＥＡＸ作製の概念図である。

【図２】図２は、ｅｘｏｎ6,7,8,12を含むプラスミドｐ
ＷＤ０２ｃｏｍｐ作製の概念図である。

【図３】図３は、ＰｖｕＩＩ(ｎｔ ４７２９)より３’
側の部分が除かれたプラスミドｐＷＤ４７２９作製の概
念図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 中井 通雄 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 (72)発明者 榊 利之 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこ
   の遺伝子の発現を制御するプロモーターを有する組換え
   アデノウイルスベクター。
2. 【請求項２】 銅輸送蛋白がヒト由来であることを特徴
   とする請求項１記載の組換えアデノウイルスベクター。
3. 【請求項３】 プロモーターがＣＡＧプロモーターであ
   ることを特徴とする請求項１または請求項２記載の組換
   えアデノウイルスベクター。
4. 【請求項４】 アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ遺伝子領
   域全部またはその一部が欠失していることを特徴とする
   請求項１ないし請求項３いずれか記載の組換えアデノウ
   イルスベクター。
5. 【請求項５】 アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ遺伝子領
   域全部またはその一部が欠失していることを特徴とする
   請求項１ないし請求項４いずれか記載の組換えアデノウ
   イルスベクター。
6. 【請求項６】 アデノウイルスゲノムのＥ３遺伝子領域
   全部またはその一部が欠失していることを特徴とする請
   求項１ないし請求項５いずれか記載の組換えアデノウイ
   ルスベクター。
7. 【請求項７】 請求項１ないし請求項６いずれか記載の
   組換えアデノウイルスベクターからなるウィルソン病治
   療剤。
8. 【請求項８】 銅輸送蛋白をコードする遺伝子およびこ
   の遺伝子の発現を制御するプロモーターを有する組換え
   アデノウイルスベクターを大量に生産する方法であっ
   て、該組換えアデノウイルスベクターをヒト胎児腎由来
   細胞株２９３細胞に感染させ、感染した２９３細胞を２
   価の銅イオン濃度が約４０μＭ〜約８０μＭである培地
   中で培養することを特徴とする方法。