ES2784264T3 - Construcciones de ácido nucleico y vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson y otras afecciones - Google Patents

Abstract

Una construcción de ácido nucleico que comprende: a) una secuencia de nucleótidos del promotor mínimo del gen de α1-antitripsina (AAT); b) una secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre humana (ATP7B); c) una secuencia de señal de poliadenilación; y d) secuencias de ITR 5' e ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV); en donde el promotor mínimo del gen de α1 antitripsina es la única secuencia de elementos reguladores de la transcripción eucariota de dicha construcción de ácido nucleico.

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de ácido nucleico y vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson y otras afecciones

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a construcciones de ácido nucleico y a vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson y de otras afecciones.

Estado de la técnica

Merle et al. revisaron el estado de la técnica relativo a la terapia génica de la enfermedad de Wilson (Current Gene Therapy 2007; 7: 217-220), y este se resume y se completa en el presente documento con las referencias divulgadas más adelante.

La enfermedad de Wilson (EW) es un trastorno autosómico recesivo heredado del metabolismo del cobre con una frecuencia media de 1:30.000. La EW está causada por mutaciones del gen ATP7B, codificante de una ATPasa transportadora del cobre de tipo P, que se encuentra en el cromosoma 13. ATP7B se expresa principalmente en los hepatocitos y funciona en el transporte transmembrana del cobre. La ausencia o la reducción de la función de la proteína ATP7B conduce a una reducción de la excreción hepatocelular del cobre en la bilis, y produce una acumulación del cobre principalmente en el hígado y, posteriormente, en el sistema neurológico y en otros tejidos. La incapacidad de incorporar el cobre en la ceruloplasmina es una consecuencia adicional de la pérdida de la proteína ATP7B funcional.

EW puede presentarse clínicamente como una enfermedad hepática, como un trastorno neurológico progresivo o como una enfermedad psiquiátrica. En general, los pacientes con EW hepática la presentan al final de la infancia o adolescencia, y presentan características de hepatitis aguda, insuficiencia hepática fulminante o enfermedad hepática crónica progresiva. Las manifestaciones neurológicas de la EW normalmente se presentan más tarde que la enfermedad hepática, con mayor frecuencia en la segunda o tercera década, e incluyen síntomas cerebelosos y cerebrales extrapiramidales.

El objetivo del tratamiento médico de la EW es eliminar el depósito tóxico del cobre del organismo y evitar su reacumulación. En la actualidad, hay tres fármacos contra el cobre aprobados para la EW: la D-penicilamina, la trientina y las sales de cinc. La terapia médica es eficaz en la mayoría, pero no en todos los pacientes con EW. El trasplante de hígado es una opción terapéutica en pacientes con EW que presentan insuficiencia hepática fulminante o insuficiencia hepática progresiva. Se ha demostrado que corrige el fenotipo de la EW y proporciona una excelente supervivencia a largo plazo.

Sin embargo, una interrupción de la terapia o un tratamiento inadecuado pueden provocar la muerte en pocos meses. Debido a que la medicación para la EW debe tomarse regularmente, la adherencia al tratamiento, en algunos pacientes, especialmente, en pacientes adolescentes con EW, es baja.

Bajo terapia, los síntomas neurológicos residuales son relativamente comunes e incluso pueden aparecer síntomas progresivos. Debido a que las opciones actuales de tratamiento médico no son eficaces en todos los pacientes con EW y la adherencia a la terapia es un problema, una solución más amplia podría implicar la terapia génica.

Teóricamente, la expresión de ATP7B de tipo silvestre en los hepatocitos revertiría todas las anomalías relacionadas con la enfermedad, y salvaría el hígado y evitaría los síntomas neurológicos. El objetivo final de una terapia génica ideal para la EW sería administrar ATP7B, en cantidad suficiente, específicamente a los hepatocitos durante toda la vida.

Todos los estudios publicados sobre la transferencia de genes adenovíricos para la EW han usado vectores adenovíricos de primera generación que solo producen la expresión transgénica transitoria. Terada et al. [Terada et al. J. Biol. Chem. 1998; 273:1815-1820; Terada et al. FEBS Lett. 1999; 448: 53-56] demostraron la transferencia exitosa de genes mediante la administración de genes mediada por adenovirus en el modelo de ratas LEC. Se observó el restablecimiento de la síntesis de holoceruloplasmina, de la actividad de la ceruloplasmina oxidasa en suero y de la excreción del cobre en la bilis, indicando un efecto terapéutico de la transferencia génica. Estos efectos fueron de una duración muy limitada, con un nivel máximo en el día tres y una disminución a partir de entonces. Ha-Hao et al. [Z. Gastroenterol. 2002; 40: 209-216] también demostraron un mayor contenido del cobre en las heces de ratas LEC tras la transferencia del gen ATP7B mediado por adenovirus, indicando una mayor excreción del cobre en la bilis. Además, se demostró el efecto terapéutico mediante el restablecimiento de la holoceruloplasmina y de su actividad ferroxidasa. Sin embargo, una vez más, la duración del efecto terapéutico en estos experimentos fue solo transitoria, con una duración limitada de unos cuantos días.

Hasta la fecha, todavía no se han probado los vectores adenovíricos "cobardes" para esta aplicación.

Otros sistemas de vectores víricos no integrantes comúnmente usados, el virus adenoasociado (AAV, Adeno-Associated Virus), no se ha probado para la EW hasta la fecha, principalmente, porque el gen ATP7B (de aproximadamente 4,4 kb de longitud) deja un espacio mínimo para asignar el resto de secuencias requeridas (por ejemplo, promotor, secuencia de señal de poli A, etc.) dentro del vector AAV, cuya capacidad de empaquetamiento es de 4,4-4,7 kb. La solicitud de patente alemana DE 100156121A1 (publicada en 2003) propuso un vector vírico recombinante adenoasociado para la terapia génica de la EW que posee un promotor acortado sensible al metal (promotor de la metalotioneína I) para producir expresión inducible por cobre o cinc del transgén ATP7B. No obstante, este documento no proporciona, ni se ha desvelado con posterioridad, información alguna sobre la eficacia terapéutica y el rendimiento del vector.

Por otro lado, se han probado varios vectores lentivíricos portadores de ATP7B de tipo silvestre en modelos animales de EW. Merle et al. [Sean. J. Gastroenterol. 2006; 41: 974-982] informaron de la terapia génica sistémica en ratas LEC con vectores lentivíricos con expresión de ATP7B bajo el control de un promotor de fosfogliceroquinasa. Veinticuatro semanas después de la transferencia génica, se redujo el contenido del cobre en el hígado significativamente, y la histología hepática mejoró en las ratas tratadas en comparación con los controles no tratados, pero el efecto fue solo parcial. La actividad de la ceruloplasmina oxidasa en suero aumentó dos semanas después de la transferencia de genes en comparación con los controles, sin embargo, disminuyó a niveles más bajos 24 semanas después del tratamiento. Más recientemente, Roybal et al. [Gene Therapy 2012; 19: 1085-1094] han informado sobre la transferencia temprana de genes gestacionales en ratones ATP7 '/_ con un lentivirus portador de ATP7B humano bajo el control de la transcripción de un promotor específico del hígado que contenía elementos de apolipoproteína E y alfa-1 antitripsina. La administración en el útero del vector proporcionó una reducción en los niveles del cobre en el hígado, la preservación de la histología hepática normal, el restablecimiento de la incorporación del cobre a la ceruloplasmina y la mejora de la biosíntesis del colesterol. Sin embargo, la eficacia del tratamiento fue muy variable de un ratón a otro, y disminuyó con el tiempo.

Objeto de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

Los inventores han diseñado por primera vez un vector vírico adenoasociado que administrado a ratones con desactivación de ATP7B (un modelo animal reconocido de la enfermedad de Wilson) corrigió las principales características patológicas de la enfermedad de Wilson durante al menos 24 semanas después del tratamiento. Este vector de AAV, denominado en el presente documento AAV2/8-AAT-wtATP7B, porta un gen codificante del ATP7B humano bajo el control de la transcripción de un promotor específico del hígado que simplemente contiene la secuencia promotora mínima del gen de a1-antitripsina (AAT). La excreción de Cu (contenido de Cu en la orina) y el contenido de Cu en el hígado se redujeron significativamente en los ratones con la enfermedad de Wilson tratados con el vector, mientras que la actividad ceruloplasmina se restableció significativamente. Además, dicho vector de AAV restableció la excreción fisiológica del cobre biliar. Por otro lado, la administración del vector produjo la normalización de los niveles de transaminasas en suero y de la histología hepática, junto con una notable reducción del infiltrado inflamatorio, de la proliferación de los conductos biliares y de la fibrosis. Estas observaciones indicaron que tanto la construcción de ácido nucleico (promotor de AAT unido a la secuencia codificante de ATP7B) como el vector de AAV de 5,1 kb de longitud que la porta permiten superar los efectos patológicos más relevantes de una acumulación del cobre vinculada a una deficiencia o disfunción de ATP7B y, por tanto, pueden ser muy adecuados para la terapia génica en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, tales como la enfermedad de Wilson o una enfermedad y/o afección asociada con una disminución de la exocitosis lisosómica dependiente de ATP7B y la acumulación del cobre.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la divulgación se refiere a una construcción de ácido nucleico (en adelante también denominada "construcción de ácido nucleico de la divulgación"), que comprende: a) una secuencia de nucleótidos del promotor del gen de a1-antitripsina (AAT); b) una secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B); y c) una secuencia de señal de poliadenilación.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vector de expresión (en adelante, también denominado "vector de expresión de la divulgación"), que comprende una construcción de ácido nucleico de la divulgación.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una partícula vírica (en adelante, también denominada "partícula vírica de la divulgación"), que comprende una construcción nucleica o un vector de expresión de la divulgación. Preferentemente, la construcción de ácido nucleico constituye la secuencia genómica del vector vírico.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un producto de la divulgación, es decir, un producto que comprende una construcción de ácido nucleico de la divulgación, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "producto de la divulgación", como se usa en el presente documento, se refiere a y cubre indistintamente cualquiera de entre: a) la construcción de ácido nucleico de la divulgación; b) el vector de expresión de la divulgación; c) la célula hospedadora de la divulgación; y d) la partícula vírica de la divulgación.

En otro aspecto, la divulgación se refiere además a un kit que comprende una construcción de ácido nucleico, un vector, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación en uno o más recipientes.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un producto de la divulgación para su uso en medicina (como medicamento o composición medicinal). Este uso en medicina incluye el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre. Dicho de otra manera, la divulgación se refiere: al uso de un producto de la divulgación en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre; y a un método de tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre en un sujeto o paciente, que comprende administrar al sujeto o paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un producto de la divulgación. En un aspecto más particular, el producto de la divulgación se usa para el tratamiento de la enfermedad de Wilson.

En otro aspecto, la divulgación se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un producto de la divulgación como se ha descrito anteriormente, para los usos propuestos en medicina y métodos terapéuticos descritos en el presente documento.

En un aspecto adicional más, la divulgación se refiere a un proceso de producción de partículas víricas de la divulgación que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula hospedadora que contenga una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación en un medio de cultivo; y

b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.

En un aspecto relacionado, la presente divulgación se refiere al uso de la construcción de ácido nucleico de la divulgación o del vector de expresión de la divulgación para la producción de partículas víricas.

Descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de la construcción de ácido nucleico del vector AAV2-AAT-wtATP7B que expresa ATP7B humano. Los elementos de la construcción son: a) el promotor del gen alfa-1-antitripsina (AAT); b) la secuencia de nucleótidos codificante de ATP7B humano; c) la secuencia de señal de poliadenilación (pA) y que flanquea el genoma del vector; y d) las secuencias de repetición terminales invertidas de AAV2 (ITR, Inverted Terminal Repeat).

Figura 2: Niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero en ratones de tipo silvestre (WT, Wild Type), Ratones deficientes en ATP7B (ratones con la enfermedad de Wilson, EW) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (1 x 1010 de AAV de EW) y con 3 x 1010 gv/ratón (3 x 1010 de AAV de EW) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B. El vector se administró cuando los animales tenían 6 semanas de vida. Los niveles de ALT se midieron 4, 9, 14 y 24 semanas después del tratamiento (semanas) y se expresan como UI/l (UI: Unidades Internacionales), ns: no significativo; *: p < 0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].

Figura 3: Contenido total del cobre en orina en ratones de tipo silvestre (WT), Ratones deficientes en ATP7B (ratones con la enfermedad de Wilson, EW) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (1 x 1010 de AAV de EW) y con 3 x 1010 gv/ratón (3 x 1010 de AAV de EW) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (n = 5 en cada grupo). El contenido del cobre se midió 4, 9, 14 y 24 semanas después del tratamiento (semanas) y se expresa como nanogramos de Cu (ng). ns: no significativo; *: p < 0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].

Figura 4: Actividad ceruloplasmina en suero en ratones de tipo silvestre (WT), Ratones deficientes en ATP7B (ratones con la enfermedad de Wilson, EW) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (1 x 1010 de AAV de EW) y con 3 x 1010 gv/ratón (3 x 1010 de AAV de EW) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (n = 5 en cada grupo). La actividad ceruloplasmina se midió 4 semanas después del tratamiento, y se expresa como la absorbancia medida a 570 nm de longitud de onda [Abs (570 nm)]. ns: no significativo; *: p < 0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].

Figura 5A: Contenido de cobre en el hígado en ratones de tipo silvestre (WT), Ratones deficientes en ATP7B (ratones con la enfermedad de Wilson, EW) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (1 x 1010 de AAV de EW) y con 3 x 1010 gv/ratón (3 x 1010 de AAV de EW) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (n = 5 en cada grupo). El contenido de cobre se determinó tras sacrificar a los animales 24 semanas después del tratamiento (30 semanas de vida) mediante espectroscopia de absorción atómica; y se expresa como jg/g (|jg de Cu/g de tejido hepático seco). ns: no significativo; *: p < 0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney]. Figura 5B. Contenido de Cu en el hígado en ratones WT (n = 15), Ratones con EW (n = 25) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (n = 5) y con 3 x 1010 gv/ratón (n = 5) del vector AAV2/8-AAT-WtATP7B como se describe para la Figura 5A, en donde el contenido de Cu en el hígado se presenta de forma individualizada y con la inclusión de más animales en los grupos de DW y WT.

Figura 6: Imágenes histológicas de hígados de animales de tipo silvestre (WT), Ratones deficientes en ATP7B (ratones con la enfermedad de Wilson, EW) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (1 x 1010 de AAV de EW) y con 3 x 1010 gv/ratón (3 x 1010 de A^a V de EW) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (n = 5 en cada grupo). Las imágenes se tomaron después de sacrificar a los animales (30 semanas de vida). A : Imágenes de cortes hepáticos teñidos con hematoxilina y eosina. B: Imágenes de muestras histológicas teñidas mediante la técnica de sulfuro de plata de Timm para la detección de depósitos del cobre.

Figura 7: Análisis de la inflamación del hígado, de la proliferación de los conductos biliares y de la fibrosis. Imágenes de hígados de animales de tipo silvestre (WT), Ratones deficientes en ATP7B (ratones con la enfermedad de Wilson, EW) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (1 x 1010 de AAV de EW) y con 3 x 1010 gv/ratón (3 x 1010 de Aa V de EW) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (n = 5 en cada grupo). El análisis se realizó tras sacrificar a los animales (30 semanas de vida). CD45: Imágenes de cortes hepáticos inmunoteñidos con anti-CD45 para detectar infiltrados inflamatorios del hígado. PANCK: Imágenes de cortes hepáticos inmunoteñidos con anti-PANCK para detectar la proliferación de los conductos biliares. RS: Imágenes de cortes hepáticos teñidos con Rojo Sirio para detectar la fibrosis.

Figura 8: Representación gráfica del análisis cuantitativo de la inflamación del hígado, de la proliferación de los conductos biliares y de la fibrosis realizada en imágenes digitales de cortes hepáticos inmunoteñidos con anti-CD45 (CD45; como marcador inflamatorio) o con anti-PanCk (PANCK; como marcador de la proliferación de los conductos biliares); o teñidos con Rojo Sirio (RS; como marcador de la fibrosis). Las mediciones se expresan como la proporción del área teñida inmunohistoquímicamente, área teñida de Rojo Sirio en el caso de la fibrosis, con respecto al área total (% de área tañida IHQ). ns: no significativo; *: p < 0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].

Figura 9: Concentración del cobre en heces (A) y concentración del cobre en orina (B) en ratones con EW (EW) (n = 5), Ratones con EW tratados con 3 x 1010 gv/ratón (AAV de EW) (n = 5) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B, y en un grupo de miembros de la misma camada heterocigotos (Control). 2 semanas después del tratamiento, la mitad de los ratones de cada grupo recibió una sobrecarga del cobre por vía intraperitoneal de 100 |jg (+CuSO4); y la otra mitad se dejó sin tratar (-CuSO4). Se analizó la concentración del cobre en las heces (A) y en la orina (B) extraídas durante las siguientes 24 horas.

Figura 10. Contenido de Cu en el hígado en ratones de tipo silvestre (WT) (n = 15), ratones con EW (n = 25), ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (n = 8) (dosis subóptima) del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (ATP7B) y ratones con EW tratados con 1 x 1010 gv/ratón (n = 8) del vector AAv2/8-AAT-coATP7B (coATP7B). El contenido de cobre se determinó tras sacrificar a los animales 24 semanas después del tratamiento mediante espectroscopia de absorción atómica; y se expresa como jg/g (jg de Cu/g de tejido hepático seco), ns: no significativo; *: p < 0,05, **: p < 0,01; ***: p < 0,001 [prueba no emparejada de Mann-Whitney].

Descripción detallada de la invención

Todos los términos y expresiones usados en la presente solicitud, a menos que se indique lo contrario, se entenderán en su significado habitual, como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos y expresiones usados en la presente solicitud son las que se establecen a continuación, y tienen por objeto aplicarse de manera uniforme a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, a menos que una definición expresamente establecida proporcione una definición más amplia.

Las expresiones "secuencia de ácido nucleico" y "secuencia de nucleótidos" se pueden usar indistintamente para referirse a cualquier molécula compuesta de o que comprenda nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico puede ser un oligonucleótido o un polinucleótido. Una secuencia de nucleótidos puede ser un ADN o ARN. Una secuencia de nucleótidos puede ser modificada químicamente o artificial. Las secuencias de nucleótidos incluyen ácidos nucleicos peptídicos (ANP), morfolinos y ácidos nucleicos bloqueados (ANB), así como ácidos nucleicos de glicol (ANG) y ácido nucleico de treosa (ANT). Cada una de estas secuencias se distingue del ADN o ARN natural por los cambios en la cadena principal de la molécula. Asimismo, se pueden usar nucleótidos de fosforotioato. Otros análogos de desoxinucleótidos incluyen metilfosfonatos, fosforoamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos, y fosforotioatos de oligorribonucleótidos y sus análogos de 2'-O-alilo y metilfosfonatos de 2-O-metil-ribonucleótido, que pueden usarse en un nucleótido de la divulgación.

La expresión "construcción de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico artificial producida a partir del uso de tecnología de ADN recombinante. Una construcción de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico, tanto monocatenaria como bicatenaria, que se ha modificado para contener segmentos de secuencias de ácido nucleico, que se combinan y se yuxtaponen de una manera, que, de otro modo, no existiría en la naturaleza. Normalmente, una construcción de ácido nucleico es un "vector", es decir, una molécula de ácido nucleico que se usa para administrar ADN creado de manera exógena a una célula hospedadora.

La expresión "vector de expresión" o el término "vector", como se usan en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos recombinante que es capaz de efectuar la expresión de un gen (transgén) en células hospedadoras u organismos hospedadores compatibles con dichas secuencias. Junto con el transgén, los vectores de expresión normalmente incluyen al menos secuencias reguladoras de la transcripción adecuadas, y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción 3'. También puede haber factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, tales como elementos potenciadores de la expresión capaces de responder a una señal inductiva precisa (factores de transcripción endógenos o quiméricos) o específicos de determinadas células, órganos o tejidos.

El término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a los mamíferos. Las especies de mamíferos que pueden beneficiarse de los métodos de tratamiento desvelados incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos tales como simios; chimpancés; monos y orangutanes, animales domésticos, incluyendo perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, ganado bovino, cerdos, ovejas y cabras, u otras especies de mamíferos que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsters y similares.

La expresión "células de empaquetamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula o estirpe celular que puede transfectarse con un vector auxiliar o un virus o una construcción de ADN, y que proporciona en trans todas las funciones carentes que se requieren para la replicación completa y el empaquetamiento de un vector vírico. Por lo general, las células de empaquetamiento expresan de manera constitutiva o inducible una o más de dichas funciones víricas que faltan.

UNA CONSTRUCCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO DE LA DIVULGACIÓN

Secuencia de nucleótidos del promotor del gen al-antitripsina (AAT)

Como se usa en el presente documento, la expresión "promotor eucariota" se refiere a una región de secuencia de ADN que inicia la transcripción de un determinado gen, o una o más secuencias de codificación, en células eucariotas. Un promotor puede funcionar en concierto con otras regiones o elementos reguladores para dirigir el nivel de transcripción del gen o la/s secuencia/s de codificación. Estos elementos reguladores incluyen, sin limitación, sitios de unión de factor de transcripción, sitios de unión de proteínas represoras y activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la materia para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor, Incluyendo, por ejemplo, atenuadores, potenciadores y silenciadores. El promotor está ubicado cerca del sitio de inicio de la transcripción del gen o de la secuencia codificante a la que está unido operativamente, sobre la misma cadena y en dirección 5' de la secuencia de ADN (hacia la región 5' de la cadena codificante). Un promotor puede tener aproximadamente 100-1000 pares de bases de longitud. Las posiciones en un promotor se designan en relación con el sitio de inicio de la transcripción para un determinado gen (es decir, las posiciones en dirección 5' son números negativos que se cuentan desde -1, por ejemplo, -100 es una posición a 100 pares de bases en dirección 5').

La expresión "promotor central" o "promotor mínimo" se refiere a la parte mínima de una secuencia promotora requerida para iniciar adecuadamente la transcripción. Incluye el sitio de inicio de la transcripción (SIT) y elementos directamente en dirección 5'; un sitio de unión para la ARN polimerasa (ARN polimerasa II); y sitios de unión de factores de transcripción generales. Comúnmente, un promotor también comprende una secuencia de promotor proximal (en dirección 5' del promotor central), que contiene otros elementos reguladores primarios (tales como potenciadores, silenciadores, elementos límite/aislantes); y una secuencia promotora distal (en dirección 3' del promotor central), que puede contener elementos reguladores adicionales, normalmente, con una influencia más débil en el nivel de transcripción del gen.

La construcción de ácido nucleico de la divulgación comprende la secuencia de nucleótidos del promotor del gen de la a1-antitripsina (AAT), es decir, comprende la secuencia promotora mínima del gen. En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el ácido nucleico de la divulgación comprende la secuencia promotora mínima del gen AAT como la única secuencia de elementos reguladores eucariota.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia promotora de AAT es la secuencia parcial delimitada por las bases 156-460 de SEQ. ID. NO.1.

De acuerdo con la divulgación, la secuencia promotora de AAT está unida operativamente a la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre. Como se usa en el presente documento, la expresión "unido/a operativamente" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos (o polipéptidos) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se ubica en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia promotora o una secuencia reguladora de la transcripción está unida operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Unido/a operativamente significa que las secuencias de ADN que están unidas normalmente son contiguas; cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y en marco de lectura.

ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B)

La ATPasa 2 transportadora del cobre (ATP7B) es una ATPasa transportadora de cationes de tipo P que funciona exportando cobre de las células.

El gen que codifica la enzima humana se encuentra en el cromosoma 13 (ubicación del cromosoma 13q14.3; nombre del gen ATP7B). Hay información sobre el polipéptido ATP7B humano (secuencias de aminoácidos, estructura, dominios y otras características) disponible, por ejemplo, en Uniprot con número de registro: P35670 (http://www.uniprot.org/uniprot/P35670; Versión de entrada 168 (3 de septiembre de 2014), Versión de secuencia 4 (16 de junio de 2009)). La información sobre el gen ATP7B codificante de esta enzima está disponible en Entrez con el número de registro ID del gen: 540 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/540; actualizado el 19 de septiembre de 2014). Se han descrito 4 isoformas producidas por cortes y empalmes alternativos para ATP7B; se escoge la isoforma 1 (identificador P35670-1, 1.465 aminoácidos de longitud) como secuencia canónica.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleotídico de la divulgación comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un ATP7B humano, preferentemente, un ATP7B humano cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia canónica (SEQ. ID. NO. 3), también denominada en el presente documento wtATP7B.

Debido a la redundancia de los codones, existen numerosas secuencias de nucleótidos que pueden generarse codificando polipéptidos ATP7B con la misma secuencia de aminoácidos.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre es la secuencia codificante CDS de la SEQ. ID. NO. 1, bases 473-4.870.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre es la secuencia codificante CDS de la SEQ. ID. NO. 2, bases 473-4.870, una secuencia con un sesgo de uso de codones optimizado para las células humanas que codifica el mismo wtATP7B.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia de nucleótidos que codifica la ATPasa 2 transportadora de cobre es una secuencia en donde al menos 1.170, al menos 1.245, al menos 1.315 o al menos 1.390 de los codones codificantes de la ATPasa 2 transportadora del cobre son idénticos a la secuencia codificante CDS 473-4.870 de la SEQ. ID. NO. 2.

Secuencia de señal de poliadenilación

Como se usa en el presente documento, la expresión "señal de poliadenilación" o "señal de poli(A)" se refiere a una secuencia de reconocimiento específica dentro de la región 3' no traducida (UTR (UnTranslated Región) 3') del gen, que se transcribe en la molécula precursora de ARNm y guía la terminación de la transcripción del gen. La señal de poli(A) actúa como una señal para la escisión endonucleolítica del ARNm precursor recién formado en su extremo 3', y para la adición a este extremo 3' de un tramo de ARN que solo consiste en bases de adenina (proceso de poliadenilación; cola poli(A)). La cola poli(A) es importante para la exportación nuclear, la traducción y la estabilidad del ARNm. En el contexto de la divulgación, la señal de poliadenilación es una secuencia de reconocimiento que puede dirigir la poliadenilación de genes de mamíferos y/o genes víricos, en células de mamífero.

Las señales de poli(A) normalmente consisten en a) una secuencia de consenso AAUAAA, que se ha demostrado que es necesaria tanto para la escisión en el extremo 3' como para la poliadenilación del ARN pre-mensajero (pre-ARNm), así como para potenciar la terminación de la transcripción en dirección 3'; y b) elementos adicionales en dirección 5' y dirección 3' de AAUAAA que controlan la eficiencia de la utilización de AAUAAA como una señal de poli(A). Hay una considerable variabilidad en estos motivos en genes de mamíferos.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia de señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico de la divulgación es una secuencia de señal de poliadenilación de un gen de mamífero o un gen vírico. Las señales de poliadenilación adecuadas incluyen, entre otras, una señal de poliadenilación temprana de SV40, una señal de poliadenilación tardía de SV40, una señal de poliadenilación de timidina quinasa de HSV, una señal de poliadenilación del gen de protamina, una señal de poliadenilación del adenovirus 5 EIb, una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento, una señal de poliadenilación de PBGD y similares.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia de señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico es una secuencia de señal de poli(A) sintética que también es capaz de dirigir y efectuar la escisión endonucleolítica y la poliadenilación del ARNm precursor procedente de la transcripción de la secuencia de nucleótidos codificante de ATP7B.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la secuencia de señal de poliadenilación de la construcción de ácido nucleico es la secuencia de señal de poli(A) sintética delimitada por las bases 4.877-4.932 de la SEQ. ID. NO.

1.

Otros elementos nucleotídicos

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico de la divulgación constituye el genoma recombinante de un vector de expresión para terapia génica, el vector de expresión de la divulgación; y, más concretamente, de un vector vírico para terapia génica.

Por tanto, en un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico de la divulgación comprende además una ITR 5' y una ITR 3' de un virus.

Como se usa en el presente documento, la expresión "repetición terminal invertida (ITR)" se refiere a una secuencia de nucleótidos ubicada en el extremo 5' (ITR 5') y una secuencia de nucleótidos ubicada en el extremo 3' (ITR 3') de un virus, que contienen secuencias palindrómicas y que pueden plegarse para formar estructuras de horquilla en forma de T que funcionan como cebadores durante el inicio de la replicación del ADN. También son necesarias para la integración del genoma vírico en el genoma del hospedador; para el rescate del genoma del hospedador; y para la encapsidación de ácido nucleico vírico en viriones maduros. Las ITR se requieren en cis para la replicación del genoma del vector y su empaquetamiento en las partículas víricas.

En un aspecto, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5', una señal de empaquetamiento y y una ITR 3' de un virus. "La señal de empaquetamiento ^y " es una secuencia de nucleótidos de acción en cis del genoma del virus, que, en algunos virus (por ejemplo, adenovirus, lentivirus, etc.) es esencial para el proceso de empaquetamiento del genoma del virus en la cápside vírica durante la replicación.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5' y una ITR 3' de un virus seleccionado del grupo que consiste en parvovirus (en particular, virus adenoasociados), adenovirus, alfavirus, retrovirus (en particular, retrovirus gamma y lentivirus), virus del herpes y SV40; en un aspecto preferido, el virus es un virus adenoasociado (AAV), un adenovirus (Ad) o un lentivirus.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV.

El genoma de AAV se compone de una molécula de ADN monocatenaria, lineal, que contiene 4.681 bases (Berns y Bohenzky, (1987) "Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32:243-307). El genoma incluye repeticiones terminales invertidas (ITR) en cada extremo que funcionan en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR tienen aproximadamente 145 pb de longitud. La parte interna no repetida del genoma incluye dos grandes marcos abiertos de lectura, conocidos como los genes rep y cap de AAV, respectivamente. Estos genes codifican las proteínas víricas que participan en la replicación y en el empaquetamiento del virión. En particular, se sintetizan al menos cuatro proteínas víricas a partir del gen rep de AAV, Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, nombradas de acuerdo con su peso molecular evidente. El gen cap de AAV codifica al menos tres proteínas, VP1, VP2 y VP3. Para una descripción detallada del genoma de AAV, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbio!. and Immunol. 158:97-129.

La construcción de viriones de AAV recombinantes se conoce en general en la técnica, y se ha descrito, por ejemplo, en los documentos US 5.173.414 y US 5.139.941; WO 92/01070, WO 93/03769, (Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) "Vaccines 90" (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) "Current Opinion in Biotechnology" 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol.

158:97-129; y Kotin, R. M. (1994) "Human Gene Therapy" 5:793-801.

En un aspecto preferido, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico o el vector de expresión de la divulgación comprende o consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos del promotor del gen de a1-antitripsina (AAT);

b) una secuencia de nucleótidos codificante de una ATPasa 2 transportadora del cobre;

c) una secuencia de señal de poliadenilación; y

d) secuencias de ITR 5' e ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV).

La divulgación puede llevarse a cabo usando ITR de cualquier serotipo de AAV, incluyendo AAV1, AAV2, AAV3 (incluyendo los tipos 3A y 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino y cualquier otro serotipo de AAV conocido en la actualidad o que se descubra más adelante.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5' y una ITR 3' de un AAV de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en un AAV1, un AAV2 y un AAV4. En un aspecto preferido, la construcción de ácido nucleico comprende las secuencias de ITR delimitadas por las bases 1-141 y las bases 4.968-5.107 de SEQ. ID. NO. 1, que son las secuencias de ITR de un AAV2.

Las ITR son los únicos elementos víricos del AAV que se requieren en cis para la replicación del genoma de AAV y su empaquetamiento en las partículas víricas.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la construcción de ácido nucleico comprende una ITR 5', una señal de empaquetamiento ^ y una ITR 3' de un adenovirus de cualquiera de los serotipos dentro de cualquiera de los subgrupos de clasificación (A-F). En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, estas secuencias de ITR 5', de la señal ^ e ITR 3' proceden de un adenovirus del subgrupo C, más preferentemente, de un adenovirus de serotipo 2 (Ad2) o serotipo 5 (Ad5).

Por otro lado, en otros aspectos, la divulgación puede llevarse a cabo usando ITR 5' y/o ITR 3' sintéticas; y también mediante el uso de una ITR 5' y un ITR 3' procedente de virus de diferentes serotipos.

Todos los demás genes víricos necesarios para la replicación del vector vírico pueden proporcionarse en trans dentro de las células productoras de virus (células de empaquetamiento) como se describe a continuación. Por lo tanto, su inclusión en la construcción de ácido nucleico de un genoma de vector vírico de acuerdo con la divulgación es opcional. En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el vector de expresión es un vector de AAV. En un aspecto particular, la construcción de ácido nucleico de la divulgación constituye un vector de AAV cuya secuencia de nucleótidos es la SEQ. ID. NO. 1 o la SEQ. ID. NO. 2.

En otro aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el vector de expresión es un vector adenovírico. Este vector adenovírico de acuerdo con la divulgación puede ser, en particular, un adenovirus de primera, segunda o tercera generación [véase "Adenovirus. Methods and Protocols". Chillon M. y Bosch A. (Eds); Tercera Edición; 2014 Springer] o cualquier otro sistema de vectores adenovíricos ya conocido o descrito más adelante.

En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el vector vírico de la divulgación es un "adenovirus de tercera generación", que también puede denominarse "adenovirus cobardes", "adenovirus dependiente de auxiliar (HD-Ad)" o "adenovirus de alta capacidad (HC-Ad)". Un adenovirus de tercera generación tiene todas las regiones codificantes víricas eliminadas ("cobarde"); depende de un adenovirus auxiliar para replicarse (dependiente del auxiliar); y puede transportar y administrar a la célula hospedadora inserciones de hasta 36 Kpb de material genético foráneo (alta capacidad). Un adenovirus "cobarde" mantiene las repeticiones terminales invertidas ITR (5' y 3') y la señal de empaquetamiento(^).

La construcción de ácido nucleico y el vector de expresión de la divulgación que se describen en el presente documento se pueden preparar y obtener mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia: Sambrook y Russell ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual"; Tercera Edición; 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press); y Green y Sambrook ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual"; Cuarta Edición; 2012 Cold Spring Harbor Laboratory Press).

UNA PARTICULA VÍRICA DE LA DIVULGACIÓN DE LA TERAPIA GÉNICA

La expresión "partícula vírica" y el término "virión" se usan en el presente documento indistintamente, y se refieren a una partícula de virus infecciosa y normalmente defectuosa en la replicación que comprende el genoma vírico (es decir, la construcción de ácido nucleico del vector vírico de expresión) empaquetado dentro de una cápside y, según sea el caso, una envoltura lipídica que rodea la cápside.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el virión de la divulgación es un "virión de AAV recombinante" o "virión de rAAV" obtenido mediante el empaquetamiento de una construcción de ácido nucleico de un vector de AAV de acuerdo con la divulgación en una cubierta de proteína.

Las proteínas de la cápside vírica de un virus adenoasociado (proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3) se generan a partir de un solo gen vírico (gen cap). Las diferencias entre las secuencias de proteínas de la cápside de los diferentes serotipos de AAV dan lugar al uso de diferentes receptores de la superficie celular para la entrada celular. En combinación con vías alternativas de procesamiento intracelular, esto da lugar a distintos tropismos tisulares para cada serotipo del AAV.

En un aspecto particular, se puede preparar un virión de AAV recombinante de acuerdo con la divulgación mediante la encapsulación de la construcción de ácido nucleico de un genoma de AAV derivado de un determinado serotipo de AAV en una partícula vírica formada por proteínas Cap naturales que corresponden a un AAV de ese mismo serotipo en particular. No obstante, se han desarrollado varias técnicas para modificar y mejorar las propiedades estructurales y funcionales de las partículas víricas de AAV naturales (Bunning H. et al. J Gene Med 2008; 10: 717­ 733). Por tanto, en otra partícula vírica de AAV de acuerdo con la divulgación, se puede empaquetar la construcción de nucleótidos del vector vírico flanqueado por ITR/s de un serotipo de AAV dado, por ejemplo, en: a) una partícula vírica constituida por proteínas de la cápside derivadas de un mismo o diferente serotipo de AAV [por ejemplo, ITR de AAV2 y proteínas de la cápside de AAV5; ITR de AAV2 y proteínas de la cápside de AAV8; etc.]; b) una partícula vírica de mosaico constituida por una mezcla de proteínas de la cápside de diferentes serotipos o mutantes de AAV [por ejemplo, ITR de AAV2 con proteínas de la cápside de AAV1 y AAV5]; c) una partícula vírica quimérica constituida por proteínas de la cápside que se han truncado mediante el intercambio de dominios entre diferentes serotipos o variantes de AAV [por ejemplo, ITR de AAV2 con proteínas de la cápside de AAV5 con dominios de AAV3]; o d) una partícula vírica dirigida diseñada para mostrar dominios de unión selectiva, permitiendo una interacción restrictiva con receptores específicos de células diana [por ejemplo, ITR de AAV4 con proteínas de la cápside de AAV2 truncadas genéticamente mediante la inserción de un ligando peptídico; o proteínas de la cápside de AAV2 no modificadas genéticamente mediante el acoplamiento de un ligando peptídico a la superficie de la cápside].

El experto apreciará que el virión de AAV de acuerdo con la divulgación puede comprender proteínas de la cápside de cualquier serotipo de AAV. En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la partícula vírica comprende proteínas de la cápside de un AAV. En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la partícula vírica de AAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en un AAV1, un AAV5, un AAV7, un a AV8 y un AAV9, que son más adecuados para la administración a las células hepáticas (Nathwani et al. Blood 2007; 109: 1414-1421; Kitajima et al. Atherosclerosis 2006; 186:65-73). En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la partícula vírica comprende una construcción de ácido nucleico de la divulgación en donde las secuencias de ITR 5' y ITR 3' de la construcción de ácido nucleico son de un serotipo de AAV2 y las proteínas de la cápside son de un serotipo de AAV8. En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la partícula vírica de AAV comprende al menos una proteína de la cápside de Anc80, un ancestro predicho de los serotipos víricos de AAV 1, 2, 8 y 9, que se comporta como un vector de terapia génica altamente potente para atacar el hígado, el músculo y la retina (Zinn et al. Cell Reports 2015; 12:1-13). En un aspecto más particular, la partícula vírica comprende la proteína de la cápside VP3 Anc80L65 (número de registro del Genbank: KT235804).

Las interacciones entre el virus y el glicano son determinantes críticos de la invasión de la célula hospedadora. En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la partícula vírica de AAV comprende proteínas de la cápside que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos, en donde las sustituciones introducen un nuevo sitio de unión a glicano o un nuevo sitio de unión a sulfato de heparán (HS) en la proteína de la cápside de AAV. En un aspecto más particular, las sustituciones de aminoácidos están en el aminoácido 266, aminoácidos 463-475 y aminoácidos 499-502 de AAV2 o las posiciones de aminoácidos correspondientes de AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 o cualquier otro serotipo de AAV, Anc80 y Anc80L65 también incluidos.

El nuevo sitio de unión a glicano introducido puede ser un sitio de unión de hexosa [por ejemplo, un sitio de unión de galactosa (Gal), manosa (Man), glucosa (Glu) o fucosa (fuc)]; un sitio de unión de ácido siálico (Sia) [por ejemplo, un resto Sia tal como ácido W-acetil-neuramínico (NeuSAc) o ácido W-glicolilneuramínico (NeuSGc)]; o un sitio de unión de disacárido, en donde el disacárido es un ácido siálico unido a galactosa, por ejemplo, en forma de Sia(alfa2,3) Gal o Sia(alfa2,6)Gal. En la publicación de patente internacional WO2014144229 y en Shen et al. (J. Biol Chem.

2013; 288(40):28814-28823), se proporciona una guía detallada para introducir un nuevo sitio de unión de un serotipo de AAV en una proteína de la cápside de un AAV de otro serotipo. En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el sitio de unión de Gal de AAV9 se introduce en la cadena principal de VP3 de AAV2, produciendo una cepa de AAV de unión a glicano doble que puede usar receptores de HS y Gal para la entrada celular. Preferentemente, dicha cepa de AAV de unión a glicano doble es AAV2G9. Shen et al. generaron AAV2G9 mediante la sustitución de restos de aminoácidos directamente implicados en y que flanquean inmediatamente el sitio de reconocimiento de Gal sobre la subunidad de la proteína de la cápside VP3 de AAV9 en los restos correspondientes de la región de codificación de la subunidad VP3 de AAV2 (numeración Q464V de VP3 de AAV2, A467P, D469N, I470M, R471A, D472V, S474G, Y500F y S501A).

En otro aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, el virión de la divulgación es un virión adenovírico, tal como un virión de Ad5. Como es el caso de los viriones de AAV, las proteínas de la cápside de los viriones Ad también pueden diseñarse para modificar su tropismo y sus propiedades de dirección celular.

Producción de partículas víricas

La producción de partículas víricas portadoras de la construcción de ácido nucleico del vector vírico de expresión de la divulgación puede realizarse mediante métodos y protocolos convencionales, que se seleccionan teniendo en cuenta las características estructurales escogidas para la construcción de ácido nucleico real y la partícula vírica del vector que se vaya a producir. En resumen, se pueden producir partículas víricas en una célula específica productora de virus (célula de empaquetamiento) que se transfecta con la construcción de ácido nucleico del vector que se vaya a empaquetar, en presencia de un vector auxiliar o virus u otra/s construcción/es de ADN.

Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación se refiere al uso de la construcción de ácido nucleico o vector de expresión de la divulgación para la producción de partículas víricas.

En un aspecto relacionado, la divulgación se refiere a un proceso de producción de partículas víricas de la divulgación que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula hospedadora que comprenda una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación en un medio de cultivo; y

b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células.

Preferentemente, dicha célula hospedadora es una célula empaquetadora como se describe a continuación. Los medios de cultivo adecuados serán conocidos por un experto en la materia. Los ingredientes que componen dichos medios pueden variar según el tipo de célula que se vaya a cultivar. Además de la composición de nutrientes, la osmolaridad y el pH se consideran parámetros importantes de los medios de cultivo. El medio de crecimiento celular comprende diversos ingredientes bien conocidos por el experto en la materia, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, fuentes de carbohidratos, lípidos, oligoelementos (CuSO4, FeSO4, Fe(NO3)3, ZnSO4, etc.), estando cada ingrediente presente en una cantidad que mantiene el cultivo de una célula in vitro (es decir, la supervivencia y el crecimiento de las células). Los ingredientes también pueden incluir diferentes sustancias auxiliares, tales como sustancias tampón (como bicarbonato de sodio, Hepes, Tris, etc.), estabilizadores de la oxidación, estabilizadores para contrarrestar el estrés mecánico, inhibidores de proteasas, factores de crecimiento animales, hidrolizados vegetales, agentes anti-vertido, agentes antiespumantes. Las características y composiciones de los medios de crecimiento celular varían dependiendo de las necesidades celulares en particular. Son ejemplos de medios de crecimiento celular disponibles en el mercado: MEM (Minimum Essential Médium, Medio Esencial Mínimo), BME (Basal Médium Eagle, medio de Eagle basal), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Médium, Medio de Eagle modificado por Dulbecco), DMEM de Iscove (modificación de Iscove del medio de Dulbecco), GMEM, RPMI 1640, Leibovitz L-15, CHO, medio de McCoy, Medio 199, HEK293, Ham (medio de Ham), F10 y derivados, Ham F12, DMEM/F12, etc.

UNA CÉLULA HOSPEDADORA DE LA DIVULGACIÓN

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación.

La expresión "célula hospedadora", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier estirpe celular que es susceptible a la infección por un virus de interés y que se puede cultivar in vitro.

La célula hospedadora de la divulgación puede usarse para fines de terapia génica ex vivo. En dichos aspectos, las células se transfectan con la construcción de ácido nucleico o el vector vírico de la divulgación y, posteriormente, se trasplantan al paciente o sujeto. Las células trasplantadas pueden tener un origen autólogo, alogénico o heterólogo. Para uso clínico, el aislamiento celular generalmente se llevará a cabo según las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF). Antes del trasplante, normalmente se verifica la calidad celular y la ausencia de contaminantes microbianos u otros contaminantes, y se puede llevar a cabo el acondicionamiento previo del hígado, tal como con radiación y/o un tratamiento inmunosupresor. Además, las células hospedadoras pueden ser trasplantadas junto con factores de crecimiento para estimular la proliferación y/o diferenciación celular, tal como el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, Hepatocyte Growth Factor).

En un aspecto particular, la célula hospedadora se usa para terapia génica ex vivo en el hígado. Preferentemente, dichas células son células eucariotas tales como células de mamíferos, y éstos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos tales como simios; chimpancés; monos y orangutanes, animales domésticos, incluyendo perros y gatos, así como ganado, tal como caballos, ganado bovino, cerdos, ovejas y cabras, u otras especies de mamíferos que incluyen, sin limitación, ratones, ratas, cobayas, conejos, hámsters y similares. Un experto en la materia escogerá las células más apropiadas según el paciente o sujeto en el que se vaya a realizar el trasplante.

Dicha célula hospedadora puede ser una célula con propiedades de autorrenovación y pluripotencia, tales como células madre o células madre pluripotentes inducidas, en donde las células no son células embrionarias humanas. Las células madre son preferentemente células madre mesenquimales. Las células madre mesenquimales (MSC, Mesenchymal Stem Cell) son capaces de diferenciarse en al menos uno de entre un osteoblasto, un condrocito, un adipocito o un miocito, y pueden aislarse de cualquier tipo de tejido. En general, las MSC se aislarán de la médula ósea, del tejido adiposo, del cordón umbilical o de la sangre periférica. Los métodos de obtención de las mismas son bien conocidos por un experto en la materia. Las células madre pluripotentes inducidas (también conocidas como células iPS o iPSC, induced Pluripotent Stem Cell) son un tipo de célula madre pluripotente que puede generarse directamente a partir de células adultas. Yamanaka et al. indujeron células iPS mediante la transferencia de los genes Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc a fibroblastos humanos y de ratón, y obligando a las células a expresar los genes (documento WO 2007/069666). Thomson et al. produjeron posteriormente células iPS humanas usando Nanog y Lin28 en lugar de Klf4 y c-Myc (documento WO 2008/118820).

Dichas células hospedadoras también pueden ser hepatocitos. Por ejemplo, en Filippi y Dhawan, Ann NY Acad Sci.

2014, 1315 50-55; Yoshida et al., Gastroenterology 1996, 111: 1654-1660; Irani et al. Molecular Therapy 2001,3:3, 302-309; y Vogel et al. J Inherit Metab Dis 2014, 37:165-176, se describen procedimientos de trasplante de hepatocitos, incluyendo el aislamiento celular y el posterior trasplante, en un receptor humano o murino. Por ejemplo, en Merle et al., Scandinavian Journal of Gastroenterology 2006, 41:8, 974-982, se describe un método de transducción ex vivo de un vector vírico en hepatocitos.

En otro aspecto particular, la célula hospedadora es una célula de empaquetamiento. Dichas células pueden ser células adherentes o en suspensión. La célula de empaquetamiento y la/s construcción/es de vector auxiliar, de virus o de ADN proporcionan juntas en trans todas las funciones que faltan que son necesarias para la replicación completa y el empaquetamiento del vector vírico.

Preferentemente, dichas células de empaquetamiento son células eucariotas tales como células de mamífero, incluyendo células de simio, humanas, de perro y de roedor. Son ejemplos de células humanas las células PER.C6 (documento WO01/38362), MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células HEK-293 (ATCC CRL-1573), células HeLa (ATCC CCL2) y células pulmonares fetales de macaco (ATCC CL-160). Son ejemplos de células de primate no humano las células Vero (ATCC CCL81), células COS-1 (ATCC CRL-1650) o células COS-7 (ATCC CRL-1651). Son ejemplos de células de perro las células MDCK (ATCC CCL-34). Son ejemplos de células de roedor las células de hámster, tales como BHK21-F, células HKCC o células CHO.

Como alternativa a las fuentes de mamífero, las estirpes celulares para su uso en la divulgación pueden derivarse de fuentes aviares tales como el pollo, pato, ganso, codorniz o faisán. Los ejemplos de estirpes celulares aviares incluyen células madre embrionarias aviares (documentos WO01/85938 y WO03/076601), células de retina de pato inmortalizadas (documento WO2005/042728) y células derivadas de células madre embrionarias aviares, incluyendo células de pollo (documento WO2006/108846) o células de pato, tales como la estirpe celular EB66 (documentos WO2008/129058 y WO2008/142124).

En otro aspecto, dicha célula hospedadora son células de insecto, tales como las células SF9 (ATCC CRL-1711), células Sf21 (IPLB-Sf21), células MG1 (BTI-TN-MG1) o células High Five™ (BTI-TN-5B1-4).

Por consiguiente, en un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la célula hospedadora comprende: a) una construcción de ácido nucleico o vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante), en general, como un plásmido;

b) una construcción de ácido nucleico, en general, un plásmido, codificante de los genes rep y/o cap de AAV, no portador de las secuencias de ITR; y/o

c) un ácido nucleico, en general, un plásmido o un virus, una construcción que comprende genes auxiliares víricos.

Los genes víricos necesarios para la replicación de AAV se denominan en el presente documento genes auxiliares víricos. Por lo general, dichos genes necesarios para la replicación de AAV son genes auxiliares adenovíricos, tales como ARN de E1A, E1B, E2a, E4 o VA. Preferentemente, los genes auxiliares adenovíricos son del serotipo Ad5 o Ad2.

Se pueden usar métodos convencionales para producir partículas víricas del vector de AAV, que consisten en la transfección conjunta de células transitorias con una construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) portador del vector/genoma de AAV recombinante de la divulgación; una construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido auxiliar de AAV) codificante de genes rep y cap, pero no portadora de secuencias de ITR; y con una tercera construcción de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido) que proporciona las funciones adenovíricas necesarias para la replicación de AAV. Por tanto, en un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más de las características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, dicha célula hospedadora se caracteriza por comprender:

i) una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante);

ii) una construcción de ácido nucleico codificante de los genes rep y cap de AAV, no portadora de las secuencias de ITR; e

iii) una construcción de ácido nucleico que comprende genes auxiliares adenovíricos.

Como alternativa, los genes rep, cap y auxiliares adenovíricos se pueden combinar en un solo plásmido (Blouin V. et al. J Gene Med. 2004; 6 (supl): S223-S228; Grimm D. et al. Hum. Gene Ther. 2003; 7: 839-850). Por tanto, en otro aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más de las características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, dicha célula hospedadora se caracteriza por comprender: i) una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante); e

ii) un plásmido codificante de los genes rep y cap de AAV no portador de las secuencias de ITR y que además comprende genes auxiliares adenovíricos.

En un aspecto particular adicional, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la célula hospedadora comprende:

a) una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión de la divulgación (es decir, el genoma de AAV recombinante);

b) un plásmido codificante de los genes rep y cap de AAV no portador de las secuencias de ITR; y

c) un plásmido que comprende genes auxiliares adenovíricos E2a, E4 y ARN de VA;

en donde la transfección conjunta se realiza en células, preferentemente, células de mamífero, que expresan constitutivamente y transcomplementan el gen adenovírico ^e 1, como las células HEK-293 (ATCC CRL-1573).

La producción a gran escala de vectores de AAV de acuerdo con la divulgación también se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la infección de células de insecto con una combinación de baculovirus recombinantes (Urabe et al. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 1935-1943). Las células SF9 se infectan conjuntamente con tres vectores de baculovirus que expresan respectivamente rep de AAV, cap de AAV y el vector de AAV que se va a empaquetar. Los vectores de baculovirus recombinantes proporcionarán las funciones del gen auxiliar vírico necesarias para la replicación y/o el empaquetamiento del virus.

Mediante el uso de plásmidos auxiliares que codifican el ORF de rep (Open Reading Frame, marco de lectura abierto) de un serotipo de AAV y el ORF de cap de un serotipo de AAV diferente, es factible empaquetar un vector flanqueado por ITR de un serotipo de AAV dado en viriones ensamblados a partir de proteínas estructurales de la cápside de un serotipo diferente. También es posible, mediante este mismo procedimiento, empaquetar vectores de mosaico, quiméricos o dirigidos.

Por otro lado, la producción de vectores de HC-Ad de acuerdo con la divulgación puede llevarse a cabo por medio de células de mamífero que expresan constitutivamente y transcomplementan el gen adenovírico E1, y también la Cre recombinasa (por ejemplo, células 293Cre). Estas células se transfectan con el genoma del vector de HC-Ad y se infectan con un virus auxiliar adenovírico de primera generación (con E1 eliminado) en el que la señal de empaquetamiento está flanqueada por secuencias de loxP. [Parks R. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1996; 13565-13570; para células 293Cre, véase Palmer y Engel. Mol. Ther. 2003; 8:846-852]. Se han descrito varios sistemas de virus auxiliares basados en Cre/loxP que se pueden usar para empaquetar vectores de HC-Ad, tales como AdAdLC8cluc o el virus auxiliar AdTetCre auto-inactivador optimizado (documento EP2295591; Gonzalez-Aparicio et al. Gene Therapy 2011; 18: 1025-1033).

Se puede encontrar orientación adicional para la construcción y producción de vectores víricos para terapia génica de acuerdo con la divulgación en:

"Viral Vectors for Gene Therapy, Methods and Protocols". Series: Methods in Molecular Biology, Vol. 737. Merten y Al-Rubeai (Eds.); 2011 Humana Press (Springer).

Gene Therapy. M. Giacca. 2010 Springer-Verlag.

Heilbronn R. y Weger S. "Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics". En: "Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology", 197; M. Schafer-Korting (Ed.). 2010 Springer-Verlag; pág. 143-170.

"Adeno-Associated Virus: Methods and Protocols". R. O. Snyder y P. Moulllier (Eds). 2011 Humana Press (Springer). Bunning H. et al. "Recent developments in adeno-associated virus technology". J. Gene Med. 2008; 10:717-733. "Adenovirus: Methods and Protocols". M. Chillon y A. Bosch (Eds.); Tercera edición. 2014 Humana Press (Springer). USOS TERAPÉUTICOS

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al producto de la divulgación como se define en el Resumen para su uso como un medicamento.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al producto de la divulgación como se define en el Resumen para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o una disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, y de cualquier otra afección y enfermedad en la que una regulación positiva de la expresión y de la actividad de la ATPasa 2 transportadora del cobre pueda producir un beneficio terapéutico o una mejora terapéutica, en particular, una enfermedad o afección asociadas con una disminución de la exocitosis lisosómica dependiente de ATP7B y la acumulación del cobre en los lisosomas, tales como trastornos coleostáticos, enfermedad de Alzheimer y/o cáncer (Polishchuck et al. Dev Cell. 2014, 29(6), 686-700; Gupta y Lutsenko, Future Med. Chem. 2009, 1, 1125-1142).

El sujeto que se va a tratar puede ser un mamífero, y en particular, un paciente humano.

En un aspecto particular, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa transportadora del cobre es la enfermedad de Wilson (EW, número de registro del catálogo en línea "Mendelian Inheritance in Man catalog" OMIN 277900; http://www.omim.org/entry/277900).

En un aspecto relacionado, la divulgación se refiere al uso del producto de la divulgación, como se define en el Resumen, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, y de cualquier otra afección y enfermedad en la que una regulación positiva de la expresión y actividad de la ATPasa 2 transportadora del cobre pueda producir un beneficio terapéutico o mejora, preferentemente, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de la ATPasa 2 transportadora del cobre, y de cualquier otra afección y enfermedad en la que una regulación positiva de la expresión y actividad de la ATPasa 2 transportadora del cobre pueda producir un beneficio terapéutico o una mejora terapéutica, preferentemente, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson, en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción de ácido nucleico, un vector de expresión, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación. El tratamiento con un producto de la divulgación puede aliviar, mejorar o reducir la gravedad de uno o más síntomas de la EW. Por ejemplo, el tratamiento puede aumentar y/o restablecer la síntesis de holoceruplasmina, la actividad de ceruloplasmina oxidasa y/o la excreción del cobre en la bilis (reduciendo así la acumulación del cobre en suero, hígado, cerebro y orina); y, por consiguiente, puede aliviar, mejorar o reducir la gravedad del dolor abdominal, fatiga, ictericia, frecuencia de movimientos incontrolados, rigidez muscular, problemas con el habla, deglución o coordinación física.

El producto de la divulgación normalmente se incluirá en una composición farmacéutica o un medicamento, opcionalmente, en combinación con un vehículo, diluyente y/o adyuvante farmacéutico. Dicha composición o dicho producto medicinal comprende el producto de la divulgación en una cantidad eficaz, suficiente para proporcionar un efecto terapéutico deseado, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico, un vector de expresión, una célula hospedadora o una partícula vírica de la divulgación, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Se puede usar cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado en la preparación de una composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación (véase, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, abril de 1997). Las composiciones farmacéuticas normalmente son estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en forma de soluciones (por ejemplo, solución salina, solución de dextrosa o solución tamponada, u otros fluidos estériles farmacéuticamente aceptables), microemulsiones, liposomas u otra estructura ordenada adecuada para aceptar una alta concentración de producto (por ejemplo, micropartículas o nanopartículas). El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. El producto de la divulgación puede administrarse en una formulación de liberación controlada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta u otros vehículos que protejan al producto contra la liberación rápida, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar, por ejemplo, polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos/poliglicólicos (PLG). Preferentemente, dicha composición farmacéutica se formula como una solución, más preferentemente, como una solución salina opcionalmente tamponada.

Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar a las composiciones farmacéuticas de la divulgación. En el Compendio de Productos Farmacéuticos y Especialidades (CPS) de la Asociación Canadiense de Farmacéuticos, por ejemplo, se puede encontrar orientación sobre la administración conjunta de terapias adicionales.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica de la divulgación es una composición farmacéutica parenteral, incluyendo una composición adecuada para la administración intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Estas composiciones farmacéuticas son solo ilustrativas, y no limitan las composiciones farmacéuticas adecuadas para otras vías de administración parenteral y no parenteral.

En el contexto de la divulgación, una "cantidad eficaz" significa una cantidad terapéuticamente eficaz.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios para lograr el resultado deseado, dicha elevación de la actividad de translocación del cobre, aumentando, por tanto, el cobre en la bilis, y reduciendo el cobre en el suero, el hígado, el cerebro y la orina. La cantidad terapéuticamente eficaz del producto de la divulgación, o la composición farmacéutica que lo comprende, puede variar según factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del producto o de la composición farmacéutica para generar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es normalmente aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del producto o de la composición farmacéutica se vea compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica que lleva el producto de la divulgación se administra al sujeto o paciente por vía parenteral.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular.

En un aspecto, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, la composición farmacéutica que comprende un producto de la divulgación se administra por vía intersticial, es decir, por inyección a o en los intersticios de un tejido. La diana tisular puede ser específica, por ejemplo, tejido del hígado, o puede ser una combinación de varios tejidos, por ejemplo, los tejidos musculares y hepáticos. Las dianas tisulares ilustrativas pueden incluir hígado, músculo esquelético, músculo del corazón, depósitos adiposos, riñón, pulmón, endotelio vascular, células epiteliales y/o hematopoyéticas. En un aspecto preferido, opcionalmente, en combinación con una o más características de los diferentes aspectos descritos anteriormente o que se describen a continuación, se administra por inyección intrahepática, es decir, inyección en el espacio intersticial del tejido hepático.

La cantidad de producto de la divulgación que se administra al sujeto o paciente puede variar dependiendo de las circunstancias particulares de cada sujeto/paciente, incluyendo, la edad, el sexo y el peso del individuo; la naturaleza y el estadio de la enfermedad, la agresividad de la enfermedad; la vía de administración; y/o la medicación concomitante que se haya recetado al sujeto o paciente. Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta terapéutica óptima.

Para cualquier sujeto en particular, las pautas posológicas específicas pueden ajustarse con el tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Los intervalos de dosificación establecidos en el presente documento son solo ilustrativos, y no limitan los intervalos de dosificación que pueden seleccionar los médicos.

En un aspecto, se puede administrar un vector de AAV de acuerdo con la divulgación al paciente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson en una cantidad o dosis comprendida dentro de un intervalo de 5 x 1011 a 1 x 1014 gv/kg (gv: genomas víricos; kg: peso corporal del sujeto o del paciente). En un aspecto más particular, el vector de AAV se administra en una cantidad comprendida dentro de un intervalo de 1 x 1012 a 1 x 1013 gv/kg.

En otro aspecto, se puede administrar un vector de HC-Ad de acuerdo con la divulgación al paciente para el tratamiento de la enfermedad de Wilson en una cantidad o dosis comprendida dentro de un intervalo de 1 x 109 a 1 x 1011 UI/kg (UI: unidades infecciosas del vector).

En otro aspecto, la divulgación se refiere además a un kit que comprende una construcción de ácido nucleico, un vector, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación en uno o más recipientes. Un kit de la divulgación puede incluir instrucciones o materiales de empaquetamiento que describen cómo administrar una construcción de ácido nucleico, un vector, una célula hospedadora o una partícula vírica de la divulgación contenida dentro del kit a un paciente. Los recipientes del kit pueden ser de cualquier material adecuado, por ejemplo, vidrio, plástico, metal, etc., y de cualquier tamaño, forma o configuración adecuados. En determinados aspectos, los kits pueden incluir una o más ampollas o jeringas que contengan una construcción de ácido nucleico, un vector, una célula hospedadora, una partícula vírica o una composición farmacéutica de la divulgación en una forma líquida o en solución adecuada.

A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones, el término "comprende" y sus variaciones, no tienen por objeto excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Además, la palabra "comprende" engloba el caso de "que consiste en". Otros objetos, ventajas y características adicionales de la divulgación serán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la puesta en práctica de la divulgación. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo ilustrativo, y no tienen por objeto ser limitantes de la presente divulgación. Además, la presente divulgación cubre todas las combinaciones posibles de aspectos particulares y preferidos descritos en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción de vectores de expresión recombinantes

Se diseñaron y produjeron dos vectores de AAV diferentes que portaban y expresaban ATP7B humano para la terapia génica de la enfermedad de Wilson (EW): AAV2/8-AAT-wtATP7B y AAV2/8-AAT-coATP7B.

1.1 Vector AAV2/8-AAT-wtATP7B

En primer lugar, se ensambló el plásmido pUC-ATP7B a petición (GenScript) mediante la clonación de la construcción de ácido nucleico en un plásmido pUC57. La construcción de ácido nucleico contenía una secuencia de ADNc codificante de ATP7B humano (transgén) junto con una secuencia de señal de poliadenilación sintética (Levitt N. et al. Genes & Development 1989; 3 (7): 1019-1025) en dirección 3' del transgén.

A continuación, se introdujo el promotor mínimo del gen alfa1 anti-tripsina (AAT) en el plásmido pUC-ATP7B, en dirección 5' del gen ATP7B. El promotor mínimo consiste en la secuencia del nucleótido -261 al nucleótido 44 en relación con el sitio de cap del promotor de AAT (Kramer M. G. et al. Mol. Therapy 2003; 7(3): 375-385) y contiene el elemento específico del tejido (EET), necesario para la función hepática, y la región distal (RD) necesaria para toda la actividad del promotor. El promotor de AAT se obtuvo mediante amplificación por PCR usando como plantilla el plásmido pEnhAlbAAT-luciferasa (proporcionado por M. G. Kramer) y los siguientes cebadores:

Cebador de AAT directo

5' CTGGTCTAGAACGCGTCGCCACCCCCTCCACCTTGG 3' (SEQ. ID. NO. 5); y

Cebador de AAT inverso

5' ATCATGATGCGGCCGCTTCACTGTCCCAGGTCAGTG 3' (SEQ. ID. NO. 6).

El cebador de AAT directo tiene un sitio de restricción para Xbal y Mlul, y el cebador de AAT inverso tiene un sitio de restricción para NotI.

Por lo tanto, para obtenerse el plásmido pUC-AAT-ATP7B, se digirió el plásmido pUC-ATP7B con Xbal y NotI, y se ligó al promotor de AAT previamente digerido con las mismas enzimas.

Seguidamente, se subclonó el casete de expresión en el plásmido de transferencia de AAV pAAV-MCS (Agilent technologies) mediante digestión con las enzimas de restricción PmlI y Mlul, produciendo así el plásmido pAAV2-AAT-wtATP7B (Figura 1; SEQ. ID. NO. 1).

Una vez construido el plásmido, se creó el vector de AAV mediante doble transfección en 293 células de, el plásmido pAAV2-AAT-ATP7B y el plásmido pDP8 (obtenido de PlasmidFactory, Bielefeld, Alemania; el plásmido pDP8 expresa la proteína de la cápside de AAV8, la proteína rep de AAV2 y las moléculas adenovíricas necesarias para la producción y el empaquetamiento de AAV).

El vector finalmente se purificó mediante gradiente de yodixanol y se tituló mediante PCR cuantitativa.

1.2 Vector AAV2/8-AAT-coATP7B

Para obtener el vector de AAV que expresa una versión con optimización de codones del gen ATP7B (coATP7B), primero, se ensambló el plásmido pUC-coATP7B a petición (GenScript) mediante la clonación de la construcción de ácido nucleico en un plásmido pUC57. A continuación, se escindió el coATP7B del pUC-coATP7B mediante la digestión con las enzimas de restricción NotI y Kpnl y se subclonó en el plásmido pAAV2-AAT-wtATP7B previamente digerido con las mismas enzimas, NotI y KpnI, obteniéndose el plásmido pAAV2-AAT-coATP7B (SEQ. ID. NO. 2). Una vez construido el plásmido, se realizaron su producción y el empaquetamiento de partículas víricas como se ha descrito anteriormente para el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B: transfección doble del plásmido pAAV2-AAT-coATP7B obtenido previamente con el plásmido pDP8, purificación (gradiente de yodixanol) y titulación.

Ejemplo 2. Modelo de la enfermedad de Wilson en animales: Desactivación de ATP7B

Se probó el rendimiento terapéutico del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B en ratones con desactivación de ATP7B (ratones ATP7B KO, ATP7B'/' o EW), que son un modelo animal representativo de la EW. Este modelo animal fue desarrollado por Buiakova et al., mediante la introducción de un codón de terminación temprana en el ARNm de ATP7B de ratón diseñando la sustitución de una parte del exón 2 de ATP7B con un casete de neomicina orientado en el marco de transcripción opuesto (Buikova O. I. et al. "Human Molecular Genetics" 1999; 8(9): 1665-1671). Los ratones con desactivación de ATP7B no muestran expresión de ATP7B en el hígado y una alta excreción de Cu en la orina, bajos niveles de holoceruloplasmina en suero, altos niveles de transaminasas, alta concentración de Cu en el hígado y una histología hepática patológica. Estos ratones presentan las características bioquímicas típicas de la enfermedad de Wilson humana, excepto por la afectación neurológica (Lutsenko S. "Biochemical Society Transactions" 2008; 36(Pt 6): 1233-1238).

Ejemplo 3. Efecto terapéutico del vector vírico AAV2/8-AAT-wtATP7B en ratones con enfermedad de Wilson Se dividieron ratones macho ATP7B'/_ de seis semanas (6 s) en 3 grupos de 5 ratones cada uno: 2 de los grupos fueron tratados por vía intravenosa con el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B a dos dosis diferentes, 1 x 1010 gv/ratón (gv: genomas víricos) y 3 x 1010 gv/ratón diluidos respectivamente en solución salina; el tercer grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control. Los animales fueron sacrificados veinticuatro semanas después de la administración del vector (semana 30).

Cuatro semanas después de la administración del vector (semana 10) y cada cinco semanas hasta la semana 30 (semana 15, semana 20, semana 25 y semana 30), niveles de transaminasas en suero (ALT), Se determinaron la actividad de ceruloplasmina en suero y el contenido de Cu en orina en todos los grupos.

Se determinaron los niveles de transaminasas en suero (ALT) mediante el método DGKC (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) usando un analizador clínico Hitachi 747 (Hitachi, Tokio, Japón).

Se determinó la actividad de ceruloplasmina en suero con diclorhidrato de O-dianisidina (4,4'-diamino-3,3'-dimetoxibifenilo) como sustrato (Sigma-Aldrich, San Louis, MO, Estados Unidos) según lo descrito por Schosinsky et al. (Clinical Chemistry 1974; 20(12): 1556-1563). Se midió la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro.

Se determinó el contenido del cobre en orina mediante espectroscopía de absorción atómica (SIMAA 6000, de Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk).

Después del sacrificio, se extirpó el hígado para la determinación histológica y el análisis del contenido de Cu, de la inflamación, de la proliferación de los conductos biliares y de la fibrosis.

Se determinó el contenido del cobre hepático en tejido de hígado seco mediante espectroscopía de absorción atómica (SIMAA 6000, de Perkin-Elmer GmbH, Bodenseewerk), y mediante tinción con sulfuro de plata de Timm (Danscher G. y Zimmer J. Histochemistry 1978; 55(1): 27-40).

Se evaluó la estructura del hígado en cortes teñidos con hematoxilina y eosina.

Se realizó la inmunohistoquímica con anticuerpo anti-CD45 de ratón (BioLegend, San Diego, EE.UU.; Número de catálogo 103102) para detectar la infiltración inflamatoria en el hígado.

También se realizó la inmunohistoquímica con anticuerpo anti-PanCk de ratón (Invitrogen/Life Technologies, 18­ 0132, clon AE1/AE3) para detectar las células de los conductos biliares.

Para determinar la fibrosis, se usó la tinción con Rojo Sirio convencional como método para la determinación del colágeno.

Para analizar cuantitativamente la inflamación del hígado, la proliferación de los conductos biliares y la fibrosis, se obtuvieron imágenes digitales con un microscopio AxioImager.MI (Zeiss, Alemania) usando una macro Metamorph interna (Molecular Devices, EE. UU.). Este equipo permitió capturar imágenes ubicadas al azar a 20 aumentos (objetivo Plan-Neofluar con 0,50 NA), con enfoque automático, balance de blancos y corrección de sombras, en cada imagen obtenida. Todas las imágenes se almacenaron en formato TIFF a color de 24 bits sin comprimir. Las imágenes se analizaron automáticamente usando un complemento desarrollado para Fiji, ImageJ.41.

Como se muestra en la Figura 2, los niveles de transaminasas se normalizaron en los ratones que recibieron AAV2/8-AAT-wtATP7B, independientemente de la dosis. Tan pronto como 4 semanas después del tratamiento, los niveles de transaminasas en suero disminuyeron significativamente (Figura 2). Además, la concentración de Cu en orina fue significativamente inferior en los animales que recibieron el vector de terapia génica (Figura 3). La actividad de ceruloplasmina se restableció cuatro semanas después del tratamiento en los animales que recibieron la dosis más alta del vector (3 x 1010 gv/ratón), pero no en los animales que recibieron la dosis más baja (Figura 4).

Por otro lado, la administración del vector redujo significativamente el contenido de Cu en el hígado (Figura 5A); el resultado se confirmó en las imágenes obtenidas tras la tinción de Timm (Figura 6A). Cabe señalar que el contenido de cobre hepático se normalizó por completo en todos los animales que recibieron la dosis más alta del vector AAV2/8-AAT-wtATP7B (Figura 5B). En cuanto a la histología hepática, los animales no tratados mostraron una arquitectura hepática anormal con enormes hepatocitos que contenían enormes núcleos. La administración del vector produjo la normalización de la histología hepática (Figura 6B). Además, los animales con enfermedad de Wilson presentaron un fuerte infiltrado hepático compuesto principalmente por células positivas en CD45; la infiltración desapareció tras el tratamiento con el vector vírico recombinante (Figura 7A). La proliferación de los conductos biliares (Figura 7B) y la fibrosis hepática (Figura 7C) también se redujeron significativamente. El análisis de datos cuantitativo indicó que la dosis alta y baja del virus terapéutico redujo significativamente la proliferación y la fibrosis de los conductos biliares, sin embargo, solo la alta dosis del virus normalizó la inflamación del hígado (Figura 8).

Ejemplo 4. Efecto del tratamiento con el vector vírico AAV2/8-AAT-wtATP7B sobre el metabolismo del cobre en ratones con la enfermedad de Wilson

Para investigar si el vector de la divulgación era capaz de restablecer la excreción fisiológica del cobre biliar, se trataron ratones con EW de 6 semanas de vida (n = 5 por grupo) con AAV2/8-AAT-wtATP7B (3 x 1010 gv/ratón por vía intravenosa) o se dejaron sin tratamiento, y se usó un grupo de camadas heterocigóticas como control. Dos semanas después del tratamiento, la mitad de los animales recibió una sobrecarga de cobre mediante la administración por vía intraperitoneal de 100 |jg de CuSO4, (+ CuSO4); y la otra mitad, solución salina como control (-CuSO4); y se colocaron en una jaula metabólica para la recogida de orina y heces durante 24 horas.

Después, se determinó el contenido de cobre en orina y heces mediante espectrofotometría de absorción atómica con llama (Perkin Elmer AAnalyst 800, Norwalk, CT, EE.Uu .).

Los presentes inventores descubrieron que los animales de control WT y los ratones con EW tratados con AAV2/8-AAT-wtATP7B fueron capaces de excretar de manera similar el exceso del cobre en las heces (Figura 9A). Por el contrario, la sobrecarga de cobre no cambió la excreción fecal del cobre en ratones con EW no tratados, y como resultado de ello, el cobre urinario fue significativamente mayor en este grupo en comparación con los ratones con EW tratados con AAV2/8-AAT-wtATP7B (Figura 9B).

Estos datos demuestran claramente que AAV2/8-AAT-wtATP7B restablece el metabolismo normal del cobre en ratones con EW.

Ejemplo 5. Efecto terapéutico del vector vírico AAV2/8-AAT-coATP7B en ratones con enfermedad de Wilson Se dividieron ratones macho ATP7B'/_ de seis semanas (6 s) en 3 grupos de ratones: el primer grupo se trató por vía intravenosa con el vector AAV2/8-AAT-wtATP7B a una dosis subóptima de 1x1010 gv/ratón diluido en solución salina; el segundo grupo se trató de la misma manera con AAV2/8-AAT-coATP7B; y el tercer grupo se dejó sin tratamiento. Un grupo adicional de ratones de tipo silvestre se mantuvo sin tratamiento como grupo de control. Los animales fueron sacrificados veinticuatro semanas después de la administración del vector (semana 30).

Cuatro semanas después de la administración del vector y cada cinco semanas hasta la semana 30, se determinaron los niveles de transaminasas en suero (ALT), la actividad de ceruloplasmina en suero y el contenido de Cu en orina en todos los grupos. Tras el sacrificio de los animales, se extirpó el hígado para la determinación histológica y el análisis del contenido de Cu.

Como se muestra en la Figura 10, tanto AAV2/8-AAT-wtATP7B como AAV2/8-AAT-coATP7B administrados a una dosis subóptima redujeron la acumulación del cobre en el hígado de ratones con EW.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ácido nucleico que comprende:

a) una secuencia de nucleótidos del promotor mínimo del gen de a1-antitripsina (AAT);

b) una secuencia de nucleótidos codificante de la ATPasa 2 transportadora del cobre humana (ATP7B);

c) una secuencia de señal de poliadenilación; y

d) secuencias de ITR 5' e ITR 3' de un virus adenoasociado (AAV);

en donde el promotor mínimo del gen de a l antitripsina es la única secuencia de elementos reguladores de la transcripción eucariota de dicha construcción de ácido nucleico.

2. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos del promotor del gen de a1-antitripsina (AAT) es la secuencia delimitada por las bases 156-460 de SEQ. ID. NO. 1. 3. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos de ATP7B es SEQ. ID. NO.

3.

4. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótidos codificante de ATP7B se selecciona del grupo que consiste en

a) la secuencia codificante delimitada por las bases 473-4.870 de SEQ. ID. NO. 1;

b) la secuencia codificante delimitada por las bases 473-4.870 de SEQ. ID. NO. 2; y

c) una secuencia en donde al menos 1.170 de los codones codificantes de la ATPasa 2 transportadora del cobre son idénticos a los codones de la secuencia codificante delimitada por las bases 473-4.870 de SEQ. ID. NO. 2.

5. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las secuencias de ITR 5' e ITR 3' de un AAV son de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en un AAV1, un AAV2 y un AAV4, preferentemente del serotipo AAV2.

6. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la secuencia de nucleótidos de la construcción es SEQ. ID. NO. 1 o SEQ. ID. NO. 2.

7. Un vector de expresión que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vector es un vector de AAV.

9. Una célula hospedadora que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8.

10. Una partícula vírica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8.

11. La partícula vírica de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la partícula vírica comprende proteínas de la cápside de un AAV.

12. La partícula vírica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la partícula vírica comprende proteínas de la cápside de un AAV de un serotipo seleccionado de uno o más del grupo que consiste en AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAV10.

13. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9, una partícula vírica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9 o una partícula vírica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, para su uso como un medicamento.

15. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-8, una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9 o una partícula vírica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de una afección causada por una deficiencia o disfunción de ATP7B en el ser humano, seleccionada entre las siguientes afecciones: trastornos coleostáticos, enfermedad de Alzheimer, cáncer y enfermedad de Wilson, preferentemente, en el tratamiento de la enfermedad de Wilson.

16. Un proceso de producción de partículas víricas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende las etapas de:

a) cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9 en un medio de cultivo; y

b) recoger las partículas víricas del sobrenadante del cultivo celular y/o del interior de las células, en donde la célula hospedadora comprende además:

i) una construcción de ácido nucleico codificante de los genes rep y/o cap de AAV no portadora de las secuencias de ITR;

e/o

ii) una construcción de ácido nucleico que comprende genes auxiliares víricos.