DE10156121A1

DE10156121A1 - Somatische Gentherapie mit Vektoren, die einen verkürzten metallsensitiven Promotor besitzen, zur Behandlung des Morbus Wilson sowie anderer Erkrankungen, die mit Veränderungen im Metallstoffwechsel einhergehen, wie z.B. Alzheimer-Erkrankung

Info

Publication number: DE10156121A1
Application number: DE2001156121
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Stremmel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2003-05-28

Description

Inhalt der Erfindung

Rekombinierte Adeno-assoziierte virale (AAV) Konstrukte für die somatische Gentherapie des Morbus Wilson unter Verwendung eines Kupfer-/Zink-induzierbaren, größenreduzierten Metallothionein-I-Promotors, einer funktionstüchtigen (größenreduzierten) Wilson Gen cDNA, eines SV40 Polyadenylierungsignals und terminaler "repeats" von AAV.

Stand der Technik

Der Morbus Wilson ist eine autosomal rezessive Störung mit einer Frequenz von 1 : 30.000 in der westlichen Bevölkerung. Ursache der Erkrankung ist ein Defekt der biliären Kupferausscheidung mit einhergehender Kupferüberladung des Organismus. Überschüssiges Kupfer akkumuliert in Leber, bestimmten Strukturen des Gehirns und einigen anderen Organen und führt zu Leberversagen, Leberzirrhose und neurologischen Störungen als hauptsächliche Symptome. Ohne Behandlung ist die Lebenserwartung deutlich reduziert. Gegenwärtig zielt die Therapie darauf ab, die Körperkupferspeicher zu reduzieren oder Kupfer in einem nicht toxischen Komplex zu binden unter Verwendung von D-Penicillamin, Trientine oder oralen Zinkpräparaten. Die Probleme dieser Therapien sind:

1. sie können schwere Nebenwirkungen zeigen,
2. sie können nicht immer die klinischen Symptome wie Zirrhose oder neurologische Schädigungen verbessern,
3. sie dürfen niemals unterbrochen werden, da sonst eine schwere Leberzellschädigung droht.

Die orthotope Lebertransplantation kann den Phänotyp der Erkrankung heilen. Diese Maßnahme ist jedoch teuer und gefährlich mit einer deutlichen Mortalitätsrate der Operation selbst, der Folgekomplikationen und der Notwendigkeit einer lebenslangen immunsuppressiven Therapie. Darüber hinaus kann aufgrund des bestehenden Spender-Organmangels nur eine kleine Gruppe der Patienten mit einer Lebertransplantation versorgt werden.
Der genetische Defekt ist auf dem Chromosom 13 q 14.3 lokalisiert. Das Wilson Gen kodiert den Kupfertransporter ATP7B, welcher wahrscheinlich im Trans-Golgi-Netzwerk lokalisiert ist. Es handelt sich um ein Mitglied der P-Typ ATPase Familie, enthält sechs mögliche Metallbindungsstellen und ist in der Leber deutlich exprimiert, während es in anderen Organen in niedrigerer Konzentration nachweisbar ist. Es gibt mehr als 100 bekannte Mutationen in diesem Gen (mit allelischen Unterschieden im mutierten Gen), die zum Morbus Wilson führen können. Die häufigste Mutation ist an Position 1069 des Gens (H1069Q). Ob spezifische Mutationen mit einem bestimmten Phänotyp des Morbus Wilson korrelieren, ist unsicher.
Eine andere sehr seltene genetische Störung des Kupferstoffwechsels ist die Menkes- Erkrankung, welche eine X-chromosomale, rezessiv vererbte Störung des Kupferstoffwechsels darsteltt mit meist fatalem Ausgang innerhalb der ersten drei Lebensjahre. Das verantwortliche Gen ist das ATP7A mit einer 60%igen Homologie zum Wilson Gen ATP7B. Das Menkes-Genprodukt kodiert auch für einen intrazellulären Kupfertransporter, der jedoch ein unterschiedliches Organverteilungsmuster zeigt.
Von Interesse ist die Beobachtung, dass Kupfer auch im Hirngewebe von Patienten mit Alzheimer-Erkrankung akkumuliert. Eine Verbindung zu einem pathologischen Kupferstoffwechsel wird diskutiert. Da diese Kupferablagerungen möglicherweise zur klinischen Manifestation beitragen, könnte eine somatische Gentherapie zur Entfernung von überschüssigem Kupfer von Bedeutung sein. Die hier vorgestellte Erfindung könnte deshalb für diese Patienten eine Bedeutung haben, insbesondere der Gebrauch eines kupfersensiblen Promotors, um die zellulären Ausschleusungswege für Kupfer bedarforientiert anzuregen.

Das Konzept der Gentherapie bei Wilsonerkrankung

Die somatische Gentherapie kann den genetischen Defekt korrigieren und so die metabolischen Veränderungen in der Kupferhomeostase beseitigen. Sie kann die konventionelle medikamentöse Therapie ersetzen, das Fortschreiten der Erkrankung verhindern und sogar Organkomplikationen, wie z. B. Leberschädigung und neurologische Störungen zur Rückbildung bringen.
Aufgrund von Erfahrungen mit Lebertransplantationen bei Morbus Wilson Patienten lernten wir, dass die Stoffwechselkorrektur in der Leber allein schon in der Lage ist, die Erkrankung phänotypisch zu heilen. Für eine erfolgreiche Gentherapie ist der permanente Austausch des defekten Gens erforderlich. Deshalb ist die Integration eines normalen ATP7B-Gens in das Genom der Patienten mit Morbus Wilson notwendig. Dies kann durch Einsatz von Adeno-assoziiertem Virus (AAV) erreicht werden. Zusätzlich zur Integration eines funktionierenden Wilson Gens (voll funktionstüchtige cDNA) ist der Einbau eines Promotors zum Wilson Gen notwendig, um die Transkription entsprechend den metabolischen Anforderungen zu steuern (Kupferüberladung erfordert Genaktivierung, um Kupfer auszuschleusen) oder nach Bedarf anzuschalten, z. B. nach Zugabe von Zink. Wenn einmal das Gen in das Wirtsgenom integriert ist und Transkription unter Kontrolle eines geeigneten Promotors abläuft, wird davon ausgegangen, dass der metabolische Defekt verschwindet. Selbst wenn nicht alle Hepatozyten mit dem korrigierten Gen stabil transduziert sind, haben die genkorrigierten Zellen einen Überlebensvorteil gegenüber den Wilson-betroffenen Hepatozyten mit ihrer toxischen Kupferakkumulation und der Induktion von apoptotischen Prozessen. Im Laufe der Zeit können die korrigierten Zellen sogar das geschädigte Lebergewebe wieder neu besiedeln.

Das Prinzip der Erfindung

Um die Zellen möglichst effektiv zu transduzieren - einhergehend mit geringst möglicher Invasilität, geringster Pathogenität und ohne Karzinogenität -, schlagen wir den Gebrauch von Adeno-assoziierten Viren als Vektoren vor. Ihr geringes Gesundheitsrisiko und die geringe Antigenität sowie die Infektionsbereitschaft auch gegenüber nicht proliferativen Zellen (hohe stabile Transduktionseffizienz) führt dazu, dass AAV sehr brauchbar für die somatische Gentherapie ist. Obwohl alle o. g. Eigenschaften optimal von dem AAV-Vektorsystem gewährleistet werden, ist die Größenbegrenzung zur Aufnahme fremder DNA ein großes Problem für den Gebrauch dieses Systems bei der Gentherapie des Morbus Wilson.
Aufgrund der Größe des AAV wird die annehmbare Größe der Fremd-DNA, die in das Genom des AAV integriert werden kann, mit 3,7-5,15 kb angegeben (= 80-110% des AAV-Genom mit 4,68 kb). Deshalb kann das Wilson Gen normalerweise nicht in den AAV-Vektor eingepasst werden, da die Gesamtlänge der Wilson Gen cDNA schon 4,4 kb beträgt. Um eine effektive Verpackung des Virus zu gewährleisten und um eine ausreichende funktionale Expression des transfizierten Wilson Gens zu erreichen, sind zusätzliche genetische Elemente notwendig, wie AAV "terminal repeats" (2 × 0,16 kb), ein Promotor (ca. 1,0 kb) und ein Polyadenylierungssignal (0,2 kb). Aus diesem Grund würde die zusammengesetzte Größe des Gesamtkonstrukts definitiv zu groß sein, um im AAV-Vektor eingesetzt zu werden.
Deshalb sind unsere Lösungsansätze:

1. Gebrauch eines größeren AAV-Vektors, der noch entwickelt werden muß, oder
2. Generierung eines funktionstüchtigen Wilson Genkonstrukts, welches noch in den Rahmen des AAV hineinpasst.

Der Inhalt der Erfindung

1. Um eine effektive und kontrollierte Expression des Morbus Wilson Genprodukts zu gewährleisten, schlagen wir ein Konstrukt mit Volllängen cDNA (4,68 kb) oder größenreduzierter, jedoch voll funktionstüchtiger (4,4 kb) ATP7B cDNA vor, welche an den Metallthionein-I-Promotor gekoppelt ist, z. B. den minimalen Mausmetallothionein-I-Promotor (MTp: 0,2 kb). Dieser Promotor hat den Vorteil durch Kupfer aktiviert zu werden (Kupferüberladung der Hepatozyten bei Morbus Wilson) oder durch Zink nach externer Applikation (induzierbare, nicht toxische Genexpressionsstrategie).
2. Von allen prinzipiell zur Verfügung stehenden Metallothionein-I-Promotoren schlagen wir als Beispiel den Mausmetallothionein-I-Promotor vor, welcher auf ein Fragment zwischen den Positionen 149-349 der Originallängen cDNA (Genbank Zugangsnummer J00605) gekürzt werden kann. Dieses Fragment (0,2 kb) enthält noch die auf Metall ansprechenden Elemente A-D, die TATA-Box und die Transkriptionsstartstelle. Bei Verwendung des menschlichen Metallothionein-I- Promotors müssen die entsprechenden Regionen aus der menschlichen cDNA selektioniert werden.
3.
- a) Das Gen, welches für die somatische Gentherapie des Morbus Wilson benutzt wird, ist die menschliche ATP7B Volllängen cDNA (Genbank Zugangsnummer HSU 03464).
- b) Eine Deletion der ersten beiden Kupferbindungsdomänen der menschlichen ATP7B cDNA könnte ungefähr 350 Basenpaare einsparen ohne Funktionsverlust des Genprodukts. Diese größenreduzierte cDNA (4,33 kb) erlaubt eine bessere Verpackung des Virions und erlaubt mehr Platz, um andere genetische Elemente wie Verstärker einzuführen, die zu einem höheren Expressionsspiegel des therapeutisch eingeführten ATP7B Gens führen.
4. Das SV 40 Polyadenylierungssignal (pA: 0,2 kb) kann aus den Basen 2533-2739 des SV 40 Virusgenoms zusammengesetzt sein (Genbank Zugangsnummer J02400).
5. Die "terminal repeats" (TR) des AAV (2 × 0,16 kb) sind notwendig zur Produktion der Viruspartikel und Integration in das Wirtsgenom.
6. Das induzierbare Wilson Gen-AAV Konstrukt kann kombiniert werden mit genetischen Komponenten des Wildtyp AAV durch chemische Reagenzien (z. B. liposomale Faktoren, Hirano et al. J. Hepatol. 29, 910-914; oder ASOR/poly-L-lysine, Wu et al. 1989, J. Biol. Chem. 264, 16985-16987) oder virale Boten (Baculovirus, Palombo et al. 1998, J. Virol. 72, 5025-5034). Diese Kombinationen erlauben bessere Transfektionen der Hepatozyten sowie effektivere und spezifischere Integration des induzierbaren Wilson Gen-AAV Konstruktes auf dem humanen Chromosom 19.

Schema des induzierbaren Wilsonerkrankung Genkonstrukts

Die Verwendung eines größenreduzierten Metallothionein-I-Promotors (s. 2.) und einer größenreduzierten humanen ATP7B cDNA (s. 3b) zusammen mit 0,2 kb MTp, 0,2 kb pA und 2 × 0,16 kb TR erlaubt eine Gesamtlänge des induzierbaren Genkonstrukts von 5,05 kb, welches die Verpackung in AAV zur somatischen Gentherapie des Morbus Wilson erlaubt. Der rekombinierte Vektor, der für die somatische Gentherapie verwendet werden soll, kann (neben der intravenösen Applikation) auch oral gegeben werden, um eine sichere und optimale Genkorrektur in Darm und Leber zu gewährleisten.
Das gleiche oben beschriebene Vorgehen ist auch anwendbar für das ATP7A Gen zur somatischen Gentherapie der Menkes-Erkrankung.
Das folgende Beispiel erklärt die Erfindung in repräsentativer Weise:

Konstruktion eines induzierbaren Wilson Gen-AAV

Die "terminal repeats" von AAV, das Maus-Metallothionein-I-Promotortragment und das SV40 Polyadenylierungssignal werden durch eine PCR-Subklonierungsstrategie mit üblichen molekularbiologischen Techniken gewonnen. Die Wilson Gen cDNA (ATP7B) wird aus menschlicher ATP7B mRNA revers-transkribiert. Alle genetischen Elemente werden in einem Plasmid rekombiniert in E. coli (z. B. JC 8111) propagiert und durch eine Plasmid-DNA-Isolationsmethode in großer Menge entsprechend dem GMP- Qualitätsstandard aufgereinigt.
Zur Produktion des induzierbaren Wilson Gen (iWD)- AAV-Partikels, wird das isolierte iWD-AAV Plasmid mit einem geeigneten AAV-Verpackungssystem in die menschliche Zelllinie 293T transfiziert.
Die Transfektion der "iWD-AAV" Plasmide in die menschlichen 293T Zellen basiert auf einem einfachen Calcium-Chlorid-Protokoll mit 2 × HBSS-Puffer (1,4 mM Na₂HPO₄2H₂O, 10 mM KCl, 280 mM NaCl, 112 mM D-Glukose, 50 mM Hepes, pH 7,5). Exponentiell wachsende Zellen werden ausgesät, um 60-80%ige Konfluenz am Tag der Transfektion zu erreichen. Dies wird ca. 24-48 Stunden nach der Aussäung erzielt. Die Plasmid DNA wird mit 2,5 M CaCl₂ Puffer gemischt, bis eine Endkonzentration von 0,25 M erreicht ist. Die Plasmid DNA/Calcium Chlorid Komplexformation wird eingeleitet durch Hinzufügen von 2 × HBSS Puffer (aufgewärmt auf 37°C), bis die Konzentration von einfachem HBSS erreicht ist. Die Transfektion wird in DMEM (Dulbecco's verändertes Igelmedium) durchgeführt mit 5% CO₂ und bei 37°C über eine Inkubationszeit von 3 Tagen.

Sammlung der "iWD-AAV"-Virionen

Am Tag 3 werden das Medium und die 293T Zellen durch Abkratzen von der Kulturplatte gesammelt und einer Einfrier-/Auftau-Prozedur unterzogen (-80°C, 5 ×). Schließlich werden leere und volle Virionen mit Hilfe eines CsCI Gradientens getrennt, gefolgt von einer Reinigung über eine Affinitätschromatographie (Matrex® Cellufine™ Sulfate, Millipore). Der Titer des induzierbaren Wilson Gen-AAV Konstrukts wird mit Hilfe eines ELISA Kit (Progen, Deutschland) bestimmt.

Claims

1. Somatische Gentherapie mit Hilfe eines Metall-sensitiven Promotors z. B. Metallothionein-I-Promotor, um Erkrankungen zu behandeln, die mit einer Metallanreicherung einhergehen, insbesondere von Kupfer bei Morbus Wilson oder Alzheimer-Erkrankung.

2. Ein Kupfer-/Zink-induzierbares Wilson Gen (ATP7B)-Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Konstrukt zur somatischen Gentherapie von Patienten mit Morbus Wilson.

3. Verwendung eines Metallothionein-I-Promotors zur Gewährleistung einer Kupfer- und/oder Zinkinduzierbarkeit der ATP7B Expression im ATP7B-AAV Genkonstukt.

4. Erfindung eines spezifischen größenreduzierten Metallothionein-I-Promotors (Verkürzung des Maus-Metallothionein-I-Promotors auf das Fragment zwischen den Positionen 149-349 des Originallängenpromotors (Genbank Zugangsnummer J00605) oder entsprechende Verkürzung im Metallothionein-I-Promotor anderer Spezies. Solche Verkürzungen können die Bereitstellung eines voll funktionierenden Metall-sensitiven Promotors in einem größenlimitierten Vektor gewährleisten.

5. Erfindung einer spezifischen Größenreduktion der menschlichen ATP7B cDNA (Deletion der ersten beiden Kupferbindungsdomänen) ohne einhergehenden Funktionsverlust.

6. Zusammensetzung des größenreduzierten Metallothionein-I-Promotors (s. 4.) und der größenreduzierten humanen ATP7B cDNA (s. 5.) zusammen mit einem Polyadenylisierungssignal und zwei "terminal repeats" des AAV, um eine 5,1 kb große, induzierbare ATP7B Genkonstruktion herzustellen, welche die Verpackung im AAV-System für die somatischen Gentherapie des Morbus Wilson erlaubt.

7. Somatische Gentherapie mit Hilfe des gleichen größenreduzierten (oder Vollängen-) Metallothionein-I-Promotors (s. 4.), um eine Genexpression nach Zufügen von Zink zu ermöglichen, z. B. nach oraler oder intravenöser Zinksubstitution.

8. Neben der intravenösen Applikation des Vektorkonstrukts wird die orale Gabe des Vektorkonstrukts vorgeschlagen (z. B. für Genkorrekturen bei Wilson- und Menkes- Erkrankung). Dies erlaubt eine spezifischere Genkorrektur in Darm und Leber.

9. Die somatische Gentherapie der Menkes-Erkrankung folgt der gleichen Vorschrift wie in den Patentansprüchen 1-8 beschrieben unter Nutzung des ATP7A Gens (mit Deletionen der ersten zwei Kupferbindungsdomänen).

10. Diagnostische Tests zum Nachweis der Wilson- und Menkes-Erkrankung aus Blut (Vollblut oder weiße Blutzellen) oder Biopsiematerial:

1. Spezifische ATP7B oder ATP7A PCR-Reaktionen zum Nachweis der jeweiligen RNA

2. Immunpräzipitation, Western-Blot oder verwandte Verfahren zum Nachweis eines Verlustes oder einer Mutation (isoelektrische Fokussierung) des jeweiligen Genprodukts