JP5174022B2 - 膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物 - Google Patents
膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5174022B2 JP5174022B2 JP2009524322A JP2009524322A JP5174022B2 JP 5174022 B2 JP5174022 B2 JP 5174022B2 JP 2009524322 A JP2009524322 A JP 2009524322A JP 2009524322 A JP2009524322 A JP 2009524322A JP 5174022 B2 JP5174022 B2 JP 5174022B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- pancreatic
- amino acid
- acid sequence
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 title claims description 69
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 83
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 79
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 79
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 68
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 41
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 12
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 10
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 19
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 20
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 11
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 11
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 11
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 10
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- -1 inorganic acid salt Chemical class 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 3
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 3
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101800001586 Ghrelin Proteins 0.000 description 2
- 102400000442 Ghrelin-28 Human genes 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 2
- 239000003629 gastrointestinal hormone Substances 0.000 description 2
- GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N ghrelin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)COC(=O)CCCCCCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 GNKDKYIHGQKHHM-RJKLHVOGSA-N 0.000 description 2
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000788682 Homo sapiens GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000658577 Homo sapiens Transmembrane 4 L6 family member 20 Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 1
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000004634 feeding behavior Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000027119 gastric acid secretion Effects 0.000 description 1
- 108010036598 gastric inhibitory polypeptide receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000044190 human TM4SF20 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000001985 kidney epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004810 partition chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
- A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
Description
本発明は、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療に有効な膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物に関する。
近年、消化管は、食事中の栄養分を吸収するだけでなく消化管ホルモンを産生する内分泌器官として注目されており、胃で産生されるグレリンの他、小腸から分泌されるグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１：ＧＬＰ−１）や胃酸分泌抑制ポリペプチド（Ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：ＧＩＰ）などが既にクローニングされている。グレリンは摂食亢進作用を有し、エネルギー代謝と関連がある。ＧＬＰ−１やＧＩＰはインクレチンと称され、食事負荷により膵臓β細胞に働き、インスリン分泌を誘導する。また、ＧＩＰは脂肪組織でも発現しており、ＧＩＰレセプターのノックアウトマウスは高脂肪負荷食を与えても体重が増加しないことから、肥満との関連も示唆されている。
このように、消化管ホルモンはエネルギー代謝や摂食行動などに関わっており、その機能の解明により、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療方法が開発されるに至っている。しかしながら、消化管ホルモンの全容は未だ明らかにされておらず、不明な部分も多い。
そこで本発明は、これまでに知られていない消化管由来のポリペプチドをコードする遺伝子の探索を行い、見出された遺伝子をもとに新たな医薬用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ＳＳＴ法（Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｒａｐ法：Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９ Ｍａｙ；１７（５）：４８７−９０． Ａ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｐ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｋｏｊｉｍａ Ｔ， Ｋｉｔａｍｕｒａ Ｔ．）を採用してマウスの腸管から単離したｃＤＮＡ断片をもとに特定したクローンＣＦ２６６（ｍＣＦ２６６）が、腸管において特異的に発現していること、このｍＣＦ２６６をトランスフェクトした細胞の培養上清にはインスリン分泌誘導作用があること、アデノウイルスベクターを使用した強制発現系において、ｍＣＦ２６６がｉｎ ｖｉｖｏでインスリン分泌誘導作用を示すことなどを見出した。さらに、本発明者らは、ｍＣＦ２６６に対応するヒトＣＦ２６６（ｈＣＦ２６６）によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントである合成ポリペプチドについても、同様の作用を示すことを見出した。
また、本発明者らは、アデノウイルスベクターを使用した強制発現系において、ｈＣＦ２６６がｉｎ ｖｉｖｏで膵臓β細胞増加促進作用を示すこと、ｍＣＦ２６６のトランスジェニックマウスにおいて膵臓β細胞の増加が促進されることなどを見出した。さらに、本発明者らは、ｈＣＦ２６６によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントである合成ポリペプチドについても、同様の作用を示すことを見出した。なお、膵臓β細胞の増加が促進される要因としては、膵臓β細胞の増殖促進、膵臓β細胞の破壊抑制のいずれもが考えられるが、本明細書ではその両者を合わせて「膵臓β細胞増加促進」と称する。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
また、本発明者らは、アデノウイルスベクターを使用した強制発現系において、ｈＣＦ２６６がｉｎ ｖｉｖｏで膵臓β細胞増加促進作用を示すこと、ｍＣＦ２６６のトランスジェニックマウスにおいて膵臓β細胞の増加が促進されることなどを見出した。さらに、本発明者らは、ｈＣＦ２６６によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントである合成ポリペプチドについても、同様の作用を示すことを見出した。なお、膵臓β細胞の増加が促進される要因としては、膵臓β細胞の増殖促進、膵臓β細胞の破壊抑制のいずれもが考えられるが、本明細書ではその両者を合わせて「膵臓β細胞増加促進」と称する。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。
本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とする；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメント。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドのフラグメントが、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチドであることを特徴とする。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進組成物は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくとも１つを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明によれば、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療に有効な膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物を提供することができる。
本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、次の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを有効成分とすることを特徴とするものである；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｃ）膵臓β細胞増加促進作用を持つ（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドのフラグメント。
本発明者らがマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡであるが、このＤＮＡはマウスの筋肉に発現している膜タンパク質Ｔｍ４ｓｆ２０（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ４ Ｌ ｓｉｘ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ２０）をコードするＤＮＡとして公知の全長１５０５ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ ＮＭ ０２５４５３）。ｍＣＦ２６６のＣＤＳは４１．．７２１であり、配列番号３に記載の２２６個のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている（配列番号２参照）。しかしながら、このポリペプチドが膵臓β細胞増加促進作用を持つことについての報告は、これまでのところ存在しない。
また、本発明者らは、ｍＣＦ２６６に対応するヒトＣＦ２６６（ｈＣＦ２６６）についてもｍＣＦ２６６と同様の作用を有することを確認している。ｈＣＦ２６６は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡであり、ヒトＴＭ４ＳＦ２０をコードするＤＮＡとして公知の全長２３０８ｂｐのものである（ＮＣＢＩ：ＬＯＣＵＳ ＮＭ ０２４７９５）。ｈＣＦ２６６のＣＤＳは３８．．７２７であり、配列番号６に記載の２２９個のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしている（配列番号５参照）。しかしながら、このポリペプチドが膵臓β細胞増加促進作用を持つことについての報告もまた、これまでのところ存在しない。
本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、このような配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分とすることができる。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、膵臓β細胞増加促進作用が維持されている限り、上述のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分とすることもできる。あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがその生物学的活性を維持することは既に知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
なお、１若しくは数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する場合には、置換前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが望ましい。アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。
具体的に、配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドとしては、例えば、ｈＣＦ２６６の一塩基多型（ＳＮＰｓ）に基づく配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされる配列番号９に記載の２２９個のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる（配列番号８参照）。配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相違は、前者は２７番目のアミノ酸がバリン（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））であるのに対して、後者はアラニン（ｈＣＦ２６６（２７Ａ））であることである。
また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、膵臓β細胞増加促進作用が維持されている限り、上述のポリペプチドのフラグメントを有効成分とすることもできる。
具体的に、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドのフラグメントとしては、例えば、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの９８〜１１６番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＡＬＹＣＭＬＩＳＩＱＡＬＬＫＧＰＬＭＣ（配列番号１０参照）を少なくとも含むポリペプチド、同７８〜９６番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＣＮＮＲＴＧＭＦＬＳＳＬＦＳＶＩＴＶＩ（配列番号１１参照）を少なくとも含むポリペプチド、同１６１〜１７９番目に相当する１９個のアミノ酸配列ＴＳＮＤＴＭＡＳＧＷＲＡＳＳＦＨＦＤＳ（配列番号１２参照）を少なくとも含むポリペプチドが挙げられる。
本発明の膵臓β細胞増加促進剤の有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントは、化学合成してもよいが、遺伝子工学的に取得することもできる。例えば、配列番号１や配列番号４や配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを外来遺伝子として培養可能な宿主細胞に組み込み、当該細胞を培養して遺伝子発現させることで、その培養上清から得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など、公知の細胞を適宜使用することができる。動物細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など、公知の細胞を適宜使用することができる。動物細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。
ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、対象とするＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを採用することにより取得できるＤＮＡを意味する。例えば、コロニーやプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルタを使用し、０．７〜１．０Ｍ塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を使用し、６５℃条件下でフィルタを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどが挙げられる（必要であればＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．， １９８９．などを参照のこと）。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列の、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列との相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
これらのポリペプチドやそのフラグメントの分離・精製は、例えば、イオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど、ペプチド化学において通常使用される方法によって行うことができる。
本発明の膵臓β細胞増加促進剤は、注射剤（皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内など）として、経皮、経粘膜、経鼻などの投与に適した剤型として、あるいは経口投与に適した剤型（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤など）として、投与することが可能である。また、本発明の膵臓β細胞増加促進剤には、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤などを適宜添加することができる。その用法用量は患者の性別、年齢、体重、病態などによって適宜決定すればよい。
例えば、その有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントを必要に応じて薬学的に許容される塩酸塩などの無機酸塩、酢酸塩などの有機酸塩、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩などに変換し、滅菌した上で、凍結乾燥品として製剤化しておくことができる。使用時には、生理食塩水などに溶解して注射剤の形態で静脈内投与することで、膵臓β細胞の増加促進が可能となる。
なお、本発明の膵臓β細胞増加促進剤の有効成分となるポリペプチドやそのフラグメントは、高度に精製された純品を単独で使用してもよいし、複数種類を混合して使用してもよく、種々の膵臓β細胞増加促進組成物の形態で使用することができる。
また、本発明の説明に供する、遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターは、外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを組み込んでなることを特徴とするものである。ウイルスベクターの具体例としては、配列番号１、配列番号４、配列番号７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡをＣＡＧプロモーターなどに連結して構築したアデノウイルスベクターなどが挙げられる。このようなウイルスベクターは、例えば静脈内投与することで、膵臓β細胞の増加促進が可能となる。
本発明の膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物、あるいは本発明の説明に供する、遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターは、体内において優れた膵臓β細胞増加促進作用を示すため、膵臓β細胞の減少又は死滅を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療に有効である。換言すれば、これらの膵臓β細胞増加促進剤、膵臓β細胞増加促進組成物、あるいは遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターを用いることにより、膵臓β細胞の減少又は死滅を伴う疾患、特に１型糖尿病の治療方法を提供することができる。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
＜参考例１：ｍＣＦ２６６の部位別発現分布＞
参考例１では、ＳＳＴ法を採用してマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６のｍＲＮＡの部位別発現分布をノザンブロット法により検討した。
参考例１では、ＳＳＴ法を採用してマウスの腸管から取得したｍＣＦ２６６のｍＲＮＡの部位別発現分布をノザンブロット法により検討した。
先ず、マウスから各臓器・組織（大脳、心臓、肺、肝臓、膵臓、脾臓、腎臓、小腸、白色脂肪組織、褐色脂肪組織、筋肉）を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて添付の説明書に従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。次に、定法に従い１０μｇ／レーンとなるようにメンブレンを作製し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使用して標識したｍＣＦ２６６のｃＤＮＡ（ｍＲＮＡクローン）をプローブにしてハイブリダイズさせた。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ｍＣＦ２６６は小腸において特異的に発現している。
＜参考例２：ＣＦ２６６トランスフェクション細胞の培養上清によるマウス膵臓β細胞由来培養細胞株ＭＩＮ６細胞に対する作用＞
参考例２では、ＣＦ２６６をトランスフェクトした胎児腎臓上皮細胞由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清によるＭＩＮ６細胞に対する作用を確認した。
参考例２では、ＣＦ２６６をトランスフェクトした胎児腎臓上皮細胞由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清によるＭＩＮ６細胞に対する作用を確認した。
先ず、５％ＦＣＳ及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地で継代培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍディッシュに１×１０６個撒いた。その翌日、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｍＣＦ２６６の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣＦ２６６）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ｍＣＦ２６６を強制発現させた。その２４時間後に培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に交換し、さらにその２４時間後に培養上清を回収した。
次に、１５％ＦＣＳ、抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍＬ）、及び２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地（高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で継代培養したＭＩＮ６細胞を２４穴プレートに３×１０５個／ウェル撒いた。その翌日、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース）を０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間前培養した後、上記の培養上清とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を０．５ｍＬ／ウェル添加して１時間刺激を行い、ＭＩＮ６細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。測定は培養液中のインスリンをＥＬＩＳＡ法（シバヤギのレビスインスリンキットを使用：以下同じ）で測定することで行った。なお、インスリン値はＭＩＮ６細胞の総タンパク質量で正規化した。
同様に、ヒト腸管ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からクローニングした配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））、及びＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ｖ））に対して公知の方法で変異導入することで取得した配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｈＣＦ２６６（２７Ａ））のそれぞれの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、それぞれを強制発現させた。そして、その培養上清を用いて、上記と同様にしてＭＩＮ６細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。
その結果を図２に示す。図中、「Ｍｏｃｋ」は、上記と同様の方法で空ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして得た培養上清を添加した場合の結果を示す。図２から明らかなように、ＣＦ２６６を強制発現させた細胞の培養上清は、ＭＩＮ６細胞に対してグルコース応答性のインスリン分泌を誘導し、その作用はとりわけｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を強制発現させた場合が優れていた。
＜参考例３：２型糖尿病モデルＫＫ／Ａｙマウスに対するｍＣＦ２６６の作用＞
参考例３では、ｍＣＦ２６６を発現するアデノウイルスベクターを用いて、２型糖尿病モデルマウスであるＫＫ／Ａｙマウスに対するｍＣＦ２６６の作用を確認した。
参考例３では、ｍＣＦ２６６を発現するアデノウイルスベクターを用いて、２型糖尿病モデルマウスであるＫＫ／Ａｙマウスに対するｍＣＦ２６６の作用を確認した。
先ず、高脂肪高ショ糖負荷食を与えた１８週齢のＫＫ／Ａｙマウス（体重約４７〜５１ｇ）に対して、ＣＡＧプロモーターにｍＣＦ２６６を連結して構築したアデノウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの商品名ＶｉｒａＰｏｗｅｒを使用して作製）を５×１０９ＰＦＵの濃度で尾静脈から静脈内投与した。その４日後、静脈内糖負荷試験（ｉ．ｖ．ＧＴＴ）を行い、経時的に採血し、血清中の血糖値、インスリン値を測定した。
その結果を図３に示す。図中、「Ａｄ ＧＦＰ」は、ｍＣＦ２６６の代わりにＧＦＰをコードするＤＮＡを連結して構築したアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。図３から明らかなように、２型糖尿病モデルマウスの体内でｍＣＦ２６６を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合と比較して、血糖値はやや低い傾向が見られるに過ぎなかったが（図中（ａ））、インスリン値は有意に高くなっていた（図中（ｂ））。したがって、ｍＣＦ２６６の発現はインスリンの分泌を誘導することが分かった。
＜参考例４：ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）トランスフェクション細胞の培養上清に含まれるポリペプチドによるマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対する作用＞
参考例４では、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清に含まれるポリペプチドを化学合成し、合成したポリペプチドによるマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対する作用を確認した。
参考例４では、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清に含まれるポリペプチドを化学合成し、合成したポリペプチドによるマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対する作用を確認した。
先ず、参考例２と同様の方法により、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を強制発現させ、培養上清を回収した。そして、陰イオン交換カラム（ＰＯＲＯＳ ＨＱカラム；ＡＢＩ）を使用して、回収した培養上清を分画した。
次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した膵臓ランゲルハンス氏島細胞を２４穴プレートに１０ｉｓｌｅｔｓ／ウェル撒き、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２時間培養した後、ＫＲＢＨ緩衝液（２．８ｍＭグルコース又は２０ｍＭグルコース）を０．５ｍＬ／ウェルとなるように添加して３０分間前培養した。そして、上記の培養上清画分とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を０．５ｍＬ／ウェル添加して１時間刺激を行い、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞のグルコース応答性のインスリン分泌（ＧＳＩＳ）を測定した。測定は培養液中のインスリンをＥＬＩＳＡ法で測定することで行った。さらに、インスリン分泌誘導活性が認められた画分を質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＡＳ）で解析し、特異的に見られたピークの質量から予測された１９個のアミノ酸配列からなる３種類のポリペプチド、すなわち、ＡＬＹＣＭＬＩＳＩＱＡＬＬＫＧＰＬＭＣ（ポリペプチドＡ：配列番号１０）、ＣＮＮＲＴＧＭＦＬＳＳＬＦＳＶＩＴＶＩ（ポリペプチドＢ：配列番号１１）、ＴＳＮＤＴＭＡＳＧＷＲＡＳＳＦＨＦＤＳ（ポリペプチドＣ：配列番号１２）を化学合成した。
続いて、これら３種類のポリペプチドＡ〜ＣのそれぞれをＫＲＢＨ緩衝液に１０ｎＭの濃度で溶解した溶液を、上記と同様の方法で３０分間前培養したマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に０．５ｍＬ／ウェル添加して３０分間刺激を行い、上記と同様の方法でマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞のグルコース応答性のインスリン分泌を測定した。なお、インスリン値はマウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞の総ＤＮＡ量で正規化した。
その結果を図４に示す。図中、「Ｃｏｎｔ．」は、ＫＲＢＨ緩衝液のみを添加して刺激を行ったこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。また、「ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）」は、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養上清とＫＲＢＨ緩衝液との混合液（１：１（ｖ／ｖ））を添加して刺激を行ったこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。また、「ＧＬＰ−１」は、ヒトＧＬＰ−１（ペプチド研究所）をＫＲＢＨ緩衝液に１０ｎＭの濃度で溶解した溶液を添加して刺激を行ったこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。図４から明らかなように、３種類のポリペプチドＡ〜Ｃは、マウス膵臓ランゲルハンス氏島細胞に対してグルコース応答性のインスリン分泌を誘導することが分かった。
＜実施例１：１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対するｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の作用＞
実施例１では、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現するアデノウイルスベクターを用いて、１型糖尿病モデルマウスであるＳＴＺマウスに対するｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の作用を確認した。
実施例１では、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現するアデノウイルスベクターを用いて、１型糖尿病モデルマウスであるＳＴＺマウスに対するｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の作用を確認した。
先ず、７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（体重約１８〜２０ｇ）を０日目から１８時間絶食させた後、生理食塩水に溶解したストレプトゾシン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、すぐに自由摂食とした。さらに、翌日から１８時間絶食し、２日目に再度同量のストレプトゾシンを腹腔内投与して、すぐに自由摂食とした。７日目に血清中の血糖値を測定し、空腹時血糖値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上であるものを糖尿病と判定し、以後の実験に用いた。その同日に、糖尿病と判定されたＳＴＺマウスに対して、ＣＡＧプロモーターにｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を連結して構築したアデノウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの商品名ＶｉｒａＰｏｗｅｒを使用して作製）を、１×１０９ＰＦＵの濃度で尾静脈から静脈内投与した。そして１２日目に、経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行い、経時的に採血し、血清中の血糖値を測定した。
その結果を図５に示す。図中、「Ａｄ（−）」は、外来遺伝子を組み込んでいないアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。また、「Ａｄ ＧＦＰ」は、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の代わりにＧＦＰをコードするＤＮＡを連結して構築したアデノウイルスベクターを用いた場合の結果を示す。図５から明らかなように、１型糖尿病モデルマウスの体内でｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合、あるいは何も発現させていない場合と比較して、血糖値は有意に低くなっていた。したがって、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現は血糖値の上昇を抑えることが分かった。
次に、これらのＳＴＺマウスの膵臓を摘出し、組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、筑波大学組織標本作製室に依頼してパラフィン包埋切片を作製した。その切片を脱パラフィンした後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間、抗原賦活化を行い、５％スキムミルクを用いて室温で１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ポリクローナル抗インスリン・モルモット抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナル抗グルカゴン・ウサギ抗体（Ｄａｃｏ）を用いて４℃で一晩、１次抗体反応を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で切片を洗浄した。さらに、ポリクローナルヒツジ抗モルモットＩｇＧ結合ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３抗体（Ｄａｃｏ）を用いて室温で１時間、暗室で２次抗体反応を行い、ＴＢＳＴで切片を洗浄した。その後、蛍光退色防止剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントし、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察して、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）を測定した。
その結果を図６に示す。図６から明らかなように、１型糖尿病モデルマウスの体内でｈＣＦ２６６（２７Ｖ）を発現させると、対照としてＧＦＰを発現させた場合、あるいは何も発現させていない場合と比較して、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）は有意に上昇していた。したがって、ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）の発現はβ細胞の増加を促進することが分かった。
＜実施例２：トランスジェニックマウスにおけるｍＣＦ２６６の作用＞
実施例２では、トランスジェニックマウスにおけるｍＣＦ２６６の作用を確認した。
実施例２では、トランスジェニックマウスにおけるｍＣＦ２６６の作用を確認した。
先ず、ＣＡＧプロモーターにｍＣＦ２６６を連結して構築したｍＣＦ２６６の発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＣＦ２６６）を直鎖化し、筑波大学生命科学動物資源センターに依頼してトランスジェニックマウスを作製した。なお、導入遺伝子はＰＣＲ法及びサザンブロット法で確認し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと５世代交配を行った。
次に、これらのトランスジェニックマウスの膵臓を摘出し、組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、筑波大学組織標本作製室に依頼してパラフィン包埋切片を作製した。その切片を脱パラフィンした後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間、抗原賦活化を行い、５％スキムミルクを用いて室温で１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ポリクローナル抗インスリン・モルモット抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナル抗グルカゴン・ウサギ抗体（Ｄａｃｏ）を用いて４℃で一晩、１次抗体反応を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で切片を洗浄した。さらに、ポリクローナルヒツジ抗モルモットＩｇＧ結合ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３抗体（Ｄａｃｏ）を用いて室温で１時間、暗室で２次抗体反応を行い、ＴＢＳＴで切片を洗浄した。その後、蛍光退色防止剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントし、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察して、切片上の膵臓面積あたりのインスリンが染まるランゲルハンス氏島細胞の面積及び数を測定した。なお、ランゲルハンス氏島細胞の数は、野生型のマウスの場合が１となるように正規化した。
その結果を図７に示す。図中、「ＷＴ」は、野生型のマウスを用いた場合の結果を示す。図７から明らかなように、ヘテロ型（＋／−）、ホモ型（＋／＋）となるに従い、野生型と比べてβ細胞の面積（図中（ａ））、数（図中（ｂ））が顕著に増えていた。したがって、ｍＣＦ２６６の発現はβ細胞の増加を促進することが分かった。
＜実施例３：ｈＣＦ２６６（２７Ｖ）トランスフェクション細胞の培養上清に含まれるポリペプチドによる１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対する作用＞
実施例３では、参考例４と同様にして化学合成したポリペプチドＡ〜Ｃによる１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対する作用を確認した。
実施例３では、参考例４と同様にして化学合成したポリペプチドＡ〜Ｃによる１型糖尿病モデルＳＴＺマウスに対する作用を確認した。
先ず、７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（体重約１８〜２０ｇ）を０日目から１８時間絶食させた後、生理食塩水に溶解したストレプトゾシン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内投与し、すぐに自由摂食とした。さらに、翌日から１８時間絶食し、２日目に再度同量のストレプトゾシンを腹腔内投与して、すぐに自由摂食とした。７日目に血清中の血糖値を測定し、空腹時血糖値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上であるものを糖尿病と判定し、以後の実験に用いた。糖尿病と判定されたＳＴＺマウスに対して、７日目から８週間に亘って、生理食塩水に溶解したポリペプチドＡ〜Ｃ（２５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）を１日２回、腹腔内投与し続けた。
次に、これらのＳＴＺマウスの膵臓を摘出し、組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、筑波大学組織標本作製室に依頼してパラフィン包埋切片を作製した。その切片を脱パラフィンした後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて室温で３０分間、抗原賦活化を行い、５％スキムミルクを用いて室温で１時間、ブロッキングを行った。ブロッキング後、ポリクローナル抗インスリン・モルモット抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナル抗グルカゴン・ウサギ抗体（Ｄａｃｏ）を用いて４℃で一晩、１次抗体反応を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で切片を洗浄した。さらに、ポリクローナルヒツジ抗モルモットＩｇＧ結合ＦＩＴＣ抗体（Ｄａｃｏ）及びポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ結合Ｃｙ３抗体（Ｄａｃｏ）を用いて室温で１時間、暗室で２次抗体反応を行い、ＴＢＳＴで切片を洗浄した。その後、蛍光退色防止剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｖｅｃｔｏｒ）でマウントし、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００；ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察して、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）を測定した。
その結果を図８に示す。図中、「Ｃｏｎｔ．」は、ポリペプチドＡ〜Ｃを含まない生理食塩水を用いたこと以外は上記と同様の方法で実験を行った場合の結果を示す。図８から明らかなように、ポリペプチドＡ〜Ｃを投与したマウスでは、α細胞とβ細胞との面積比（β細胞／α細胞）は有意に上昇しており、その効果はとりわけポリペプチドＡを投与した場合が優れていた。
本発明は、糖尿病をはじめとする種々の疾患の治療に有効な膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
Claims (7)
- 次の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つを有効成分とする膵臓β細胞増加促進剤；
（ａ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１又は配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド。 - 配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１記載の膵臓β細胞増加促進剤。
- 次の（ｄ）〜（ｆ）の少なくとも１つを有効成分とする膵臓β細胞増加促進剤；
（ｄ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号３又は配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチド、
（ｆ）前記（ｄ）のポリペプチドのフラグメント又は前記（ｅ）のポリペプチドのフラグメントであって、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つフラグメント。 - 配列番号６に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項３記載の膵臓β細胞増加促進剤。
- 配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、の少なくとも１つを有効成分として含有する膵臓β細胞増加促進組成物。
- 遺伝子治療により膵臓β細胞の増加を促進するためのウイルスベクターを含む膵臓β細胞増加促進剤であって、
前記ウイルスベクターが、外来遺伝子の発現が可能なウイルスベクターに外来遺伝子として配列番号１、配列番号４、配列番号７の少なくとも１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらのＤＮＡと９０％以上の相同性を有し、かつ、膵臓β細胞増加促進作用を持つポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んでなるものである膵臓β細胞増加促進剤。 - 前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求項６記載の膵臓β細胞増加促進剤。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2007/064357 WO2009013794A1 (ja) | 2007-07-20 | 2007-07-20 | インスリン分泌誘導剤及び膵臓β細胞増加促進剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2009013794A1 JPWO2009013794A1 (ja) | 2010-09-24 |
| JP5174022B2 true JP5174022B2 (ja) | 2013-04-03 |
Family
ID=40281058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009524322A Active JP5174022B2 (ja) | 2007-07-20 | 2007-07-20 | 膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8236758B2 (ja) |
| EP (1) | EP2168589B1 (ja) |
| JP (1) | JP5174022B2 (ja) |
| CA (1) | CA2694222C (ja) |
| DK (1) | DK2168589T3 (ja) |
| WO (1) | WO2009013794A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2857500B1 (en) * | 2012-05-25 | 2018-01-31 | Saitama Medical University | Method for producing pancreatic hormone-producing cell, pancreatic hormone-producing cell, and differentiation/induction promoter |
| US9856304B2 (en) | 2013-05-24 | 2018-01-02 | Saitama Medical University | Peptide and application thereof |
-
2007
- 2007-07-20 JP JP2009524322A patent/JP5174022B2/ja active Active
- 2007-07-20 DK DK07791094.1T patent/DK2168589T3/da active
- 2007-07-20 EP EP07791094A patent/EP2168589B1/en not_active Not-in-force
- 2007-07-20 CA CA2694222A patent/CA2694222C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-07-20 WO PCT/JP2007/064357 patent/WO2009013794A1/ja active Application Filing
- 2007-07-20 US US12/669,324 patent/US8236758B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN7012002822; 長寿科学総合研究推進事業研究報告集， ２００６， ｐ．３６１-３６４ * |
| JPN7012002823; 日本内分泌学会雑誌， ２００７．４．２０， Ｖｏｌ． ８３， Ｎｏ． １， ｐ． １０３， Ｏ-１-６-１９ * |
| JPN7012002824; 糖尿病， ２００７．４．２５， Ｖｏｌ． ５０， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １， ｐ． Ｓ-２８４， ＩＩＩ-１０-１６ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2168589A4 (en) | 2010-08-11 |
| EP2168589A1 (en) | 2010-03-31 |
| CA2694222A1 (en) | 2009-01-29 |
| US20100168026A1 (en) | 2010-07-01 |
| DK2168589T3 (da) | 2013-06-10 |
| US8236758B2 (en) | 2012-08-07 |
| JPWO2009013794A1 (ja) | 2010-09-24 |
| CA2694222C (en) | 2018-07-17 |
| WO2009013794A1 (ja) | 2009-01-29 |
| EP2168589B1 (en) | 2013-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2002502589A (ja) | ４５個のヒト分泌タンパク質 | |
| JP7427208B2 (ja) | 視覚機能再生剤又は視覚機能低下予防剤 | |
| CS91791A3 (en) | Epithelium or epithelium precursors | |
| JP2002539773A (ja) | 分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸 | |
| SK38998A3 (en) | Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor | |
| JP4742345B2 (ja) | カルシウムチャネルを遮断するグラモストラ・スパチュラタ由来のポリペプチドおよびその遺伝子 | |
| JP2002501738A (ja) | ６７個のヒト分泌タンパク質 | |
| JP2002506625A (ja) | サイトカインレセプター共通γ鎖様 | |
| WO2016179861A1 (zh) | Slit2D2-HSA融合蛋白及其在抗肿瘤中的应用 | |
| JP5174022B2 (ja) | 膵臓β細胞増加促進剤及び膵臓β細胞増加促進組成物 | |
| US20060154331A1 (en) | Erythrocyte differentiation factor, gene encoding same, and methods of use thereof | |
| JP2002505871A (ja) | ３１個のヒト分泌タンパク質 | |
| JPWO2007072980A1 (ja) | アペリンの新規用途 | |
| JP5881065B2 (ja) | 新たに同定したインスリン分泌制御因子を用いた抗糖尿病薬剤のスクリーニング法 | |
| JP4520951B2 (ja) | インスリン分泌誘導剤及びインスリン分泌誘導組成物 | |
| CN104955836B (zh) | Bpifb4蛋白的变体 | |
| KR20070007894A (ko) | 항비만약 | |
| CN110904046B (zh) | Islr基因在制备治疗肥胖及改善胰岛素抵抗的药物中的应用 | |
| JP5099856B2 (ja) | 代謝症候群の治療もしくは予防剤、検査方法、検査薬、及び代謝症候群の治療薬の候補化合物のスクリーニング方法 | |
| CN113186225B (zh) | Pd1/pdl1单抗致免疫性心肌炎模型及制备方法 | |
| JP2002502601A (ja) | 樹状富化分泌リンパ球活性化分子 | |
| US20240287508A1 (en) | Modified filamins and their uses | |
| JP2022171486A (ja) | 筋線維芽細胞を脱活性化するためのＴｃｆ２１タンパク質の部分ペプチド | |
| EP4013890A2 (en) | Compositions and methods utilizing a novel human foxo3 isoform | |
| CN115666624A (zh) | 作为抗癌治疗的emid2蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100707 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100707 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20120302 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120302 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120724 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120905 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121002 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121030 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121204 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121227 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5174022 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |