JP4742345B2 - カルシウムチャネルを遮断するグラモストラ・スパチュラタ由来のポリペプチドおよびその遺伝子 - Google Patents
カルシウムチャネルを遮断するグラモストラ・スパチュラタ由来のポリペプチドおよびその遺伝子 Download PDFInfo
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Description
本発明は、電位依存性カルシウムチャネルを遮断するポリペプチド又は遺伝子、並びに該ポリペプチド又は遺伝子を含む医薬に関する。
電位依存性カルシウムチャネルは様々な細胞機能、特に神経伝達の調節に重要な役割を果たしている。哺乳類においては、現在少なくとも10種の分子種が知られており、薬理学的にＬ-, Ｎ-, P/Q-, Ｒ-, または Ｔ-型カルシウムチャネルとして分類されている（非特許文献１及び２を参照）。
Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルは、主に心臓、脳神経系に存在していることが知られている（非特許文献３を参照）。
南米産クモであるグラモストラ・スパチュラタの毒液（GsV）にはカリウムチャネルや機械受容チャネルを遮断するペプチド性毒が含まれていることが知られている。
Ｔ型カルシウムチャネルを遮断する化合物としては、ethosuximide, zonisamide, mibefradilなどが知られている。又、Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルに作用するペプチド性毒としては、サソリ（パラブツス・トランスバリクス）毒液から抽出されたKurtoxinだけが知られている（非特許文献４を参照）。
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16:521-555 (2000)
Jpn. J. Pharmacol. 72:83-109 (1996)
Drug Discovery Today, 11:245-253 (2006)
Nat Neurosci. 1(8):668-674 (1998)
上記従来の知見から明らかなように、Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルは、心臓、脳神経系において重要な役割を持っており、医薬品の標的として考えられている。本発明の課題は、Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルに対するペプチドを新たに提供することにある。
本発明者は鋭意研究の結果、南米産クモであるグラモストラ・スパチュラタの毒液中に新規なＴ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断するポリペプチドを見出した。さらに、その遺伝子配列を決定し、本ペプチド及び遺伝子がカルシウムチャネルの診断、治療薬、又は神経細胞や筋細胞のような細胞の生理学的研究に有効であることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）に関するものである。
[１] 以下の(a)から(d)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(c) 配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ポリペプチドであって、少なくとも配列番号６で表わされるアミノ酸配列の第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチド。
[１] 以下の(a)から(d)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(c) 配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ポリペプチドであって、少なくとも配列番号６で表わされるアミノ酸配列の第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチド。
[２] 以下の(e)から(g)のいずれかのポリヌクレオチド：
(e) 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(f) 配列番号５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの部分ポリヌクレオチドであって、少なくとも配列番号５で表わされる塩基配列の第139番目〜第246番目の塩基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
(g) 上記(e)若しくは(f)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(e) 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(f) 配列番号５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの部分ポリヌクレオチドであって、少なくとも配列番号５で表わされる塩基配列の第139番目〜第246番目の塩基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
(g) 上記(e)若しくは(f)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[３] 以下の(a)から(d)のいずれかのポリペプチド：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(c) 配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ポリペプチドであって、少なくとも配列番号６で表わされるアミノ酸配列の第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチド。
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(c) 配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ポリペプチドであって、少なくとも配列番号６で表わされるアミノ酸配列の第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチド。
[４] [１]又は[２]のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[５] [４]の組換えベクターを含む形質転換体。
[６] カルシウムチャネルを遮断する量の[１]又は[２]のポリヌクレオチドをin vitroで細胞に投与することを含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断する方法。
[７] カルシウムチャネルを遮断する量の[３]のポリペプチドをin vitroで細胞に投与することを含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断する方法。
[８] [１]又は[２]のポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断するカルシウムチャネル遮断剤。
[９] [３]のポリペプチドを有効成分として含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断するカルシウムチャネル遮断剤。
[５] [４]の組換えベクターを含む形質転換体。
[６] カルシウムチャネルを遮断する量の[１]又は[２]のポリヌクレオチドをin vitroで細胞に投与することを含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断する方法。
[７] カルシウムチャネルを遮断する量の[３]のポリペプチドをin vitroで細胞に投与することを含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断する方法。
[８] [１]又は[２]のポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断するカルシウムチャネル遮断剤。
[９] [３]のポリペプチドを有効成分として含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断するカルシウムチャネル遮断剤。
グラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）クモの毒液から単離したポリペプチドは、Ｔ型カルシウムチャネルを遮断し、カルシウムチャネルを媒介とする疾病や病状の治療および無脊椎動物の抑制に際して、本質的に細胞中の前記カルシウムチャネルを遮断するのに有用である。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明はグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）の毒液から単離したポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNA）、そのDNAを挿入したベクター、そのDNAを発現可能に保持する形質転換体、その形質転換体を培養する工程を含む該ペプチドを製造する方法、および該ペプチドを有効成分とする医薬を提供するものである。
本発明はグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）の毒液から単離したポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNA）、そのDNAを挿入したベクター、そのDNAを発現可能に保持する形質転換体、その形質転換体を培養する工程を含む該ペプチドを製造する方法、および該ペプチドを有効成分とする医薬を提供するものである。
本発明のグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）の毒液（GsV)から単離したポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に表わされるアミノ酸配列はcDNA配列解析から推定したアミノ酸配列である。また、配列番号７にクモの毒液から単離したポリペプチドをペプチドシーケンサーまたはMSで配列決定した結果得られた配列を示す。配列番号７に表わされる配列は配列番号２に表わされる配列に対してC末端のアミノ酸が２個少ないが、これは翻訳後修飾によるものと考えられる。本発明のポリペプチドは、配列番号７に表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドをも包含する。
本発明のグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）の毒液から単離したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１に示す。また、配列番号５にシグナル配列及びプレプロ配列をコードする部分を含む塩基配列を、配列番号６にシグナル配列及びプレプロ配列を含むアミノ酸配列を示す。シグナル配列及びプレプロ配列の位置は図５に示す。シグナル配列の予測にはウェブサイト（1150784756765_0）を利用した。本発明は、プロプロ配列又はシグナル配列及びプレプロ配列を含むポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも包含する。さらに、本発明は配列番号６に表わされるアミノ酸配列の一部配列であって、少なくとも第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号５に表わされる塩基配列の一部配列であって、少なくとも第139番目〜第246番目の塩基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチドをも包含する。
ペプチドは、その活性に不可欠な部位以外に他のアミノ酸あるいは修飾型アミノ酸を欠失・付加あるいは置換を行っても活性を保っていることが多く、これを利用して医薬品として必要な他の性質（代謝プロファイル等）を改善することは、しばしば行われることである。従って、本配列をもとにして部分的にアミノ酸の欠失・付加・置換などを行って作成した変換型ペプチド、あるいは修飾型ペプチドのうちＴ型電位依存性カルシウムチャネル抑制活性を持っているペプチドは本発明の請求範囲に含まれるものである。
例えば、上記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断する活性を有するポリペプチドも本発明に包含される。ここで、１又は数個とは、１〜10個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個をいう。
このような上記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列として、前記アミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有しているものが挙げられる。
このような上記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは上記アミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一である。
また、上記塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド（DNA)とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドであってＴ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、DNAを固定したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、68℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。
さらに、上記DNAに対するRNA、又は該RNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるRNAであってＴ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断する活性を有するポリペプチドに対応するRNAも本発明に包含される。
なお、DNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて行うことができる。
本発明は、本発明のDNAを含む組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を包含する。
本発明にかかるペプチドは、後述実施例に示したMono-SカラムおよびバイダックC18等と同様、既知の方法でGsVから分離精製することができる。例えば、スルホン酸基あるいは四級アンモニウム基を有するイオン交換担体を使用したイオン交換クロマトグラフィーにより、溶出緩衝液のpHあるいは塩濃度を変化させ目的活性物質を単離精製することができる。この場合の溶出液としては、通常この分野で使用し得るあらゆるものが用いられるが、例としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ギ酸アンモニウム、重炭酸アンモニウムなどを挙げることができる。また、疎水性基修飾したシリカゲル担体を用いた逆相クロマトグラフィー法により、エタノール、プロピルアルコール、アセトニトリルなどの様々な親水性有機溶媒による濃度勾配溶出を行い、目的物質を得ることもできる。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを用いて純化することも可能である。このように本発明のペプチドは、GsVを原料として、分離、精製することによって製造することが可能である。また本発明にかかるポリペプチドは、従来用いられているポリペプチドの化学合成技術を用いて得ることができる。この場合、代謝的な安定化を図ることを目的として、修飾型のアミノ酸を挿入することも許される。更に本発明にかかるポリペプチドは、遺伝子組換え技術を用いて製造することも可能である。例えば、該ポリペプチドをコードするように設計したDNAを、該ペプチドを製造しようとする宿主細胞に適合した発現ベクターに挿入する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては、本発明のベクターに適合する細胞であれば特に制限はなく、種々の動物細胞、細菌、酵母、昆虫細胞などが挙げられる。この際、該ポリペプチドの製造を容易にするために融合タンパクとして発現する、或いは分泌のためのシグナルを付加する等、該ポリペプチドをコードする以外の配列を付け加えることも許される。また、発現ベクターには形質転換体の選択を容易にするため、或いは該ポリペプチドの産生を向上するために薬剤耐性等の遺伝子を挿入しても良い。その発現ベクターを微生物あるいは細胞に導入し、形質転換体を得る。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、文献（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning: A Laboratory,Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY）記載の方法に従って行うことが可能である。そして形質転換体を培養し、形質転換体又はその培養上清から上記の方法に準じて該ポリペプチドを精製することができる。また、本発明のポリペプチドをGSTやHisbとの融合ポリペプチドとして発現させた場合には、それぞれグルタチオンセファロースカラム、ニッケルセファロースカラムを用いて精製することも可能である。
分離・精製における目的画分の追跡は、ラットＴ型電位依存性カルシウムチャネルCav3.1を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を使用し、発現電流量の抑制活性を指標にして行えばよい。すなわち、後記の実施例に示される様に、精製画分を添加した際の発現電流量の抑制作用を電気的に記録し観察すればよい。本発明のポリペプチドの構造解析は、通常の方法で行うことができるが、例えば、アミノ酸配列自動分析装置（プロテインシークエンサー）を使用し、エドマン分解法によるＮ末端からの逐次分解、酵素消化ペプチドのアミノ酸配列分析並びにカルボキシペプチダーゼを用いたＣ末端アミノ酸分析などを組み合わせることにより行うことができる。
本発明は本発明のグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）クモの毒液由来のＴ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断する活性を有するポリペプチドに対する抗体を包含する。該方法は公知の抗体作製方法により得ることができる。
本発明は、さらに本発明のグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）クモの毒液由来のＴ型電位依存性カルシウムチャネルを遮断する活性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドをin vitro又はin vivoで細胞に投与することを含む細胞中のカルシウムチャネルを遮断する方法を包含する。該方法に用いる細胞の種類は限定されず、入手可能な培養細胞、生体から単離した細胞が含まれる。該方法は、細胞を細胞培養用培地、生理食塩水、緩衝液等に入れ、その中に本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを添加すればよい。用いる細胞の密度及びポリペプチド又はポリヌクレオチドの添加量は適宜決定することができる。
細胞中のカルシウムチャネルが遮断されたか否かは、細胞中の発現電流を測定すればよい。細胞中の発現電流の測定は、例えば後記の実施例に記載の方法で行うことができる。
このように、本発明のＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞中のカルシウムチャネル遮断剤として用いることができ、本発明は本発明のＴ型電位依存性カルシウムチャネル遮断活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含むカルシウムチャネル遮断剤を含む。
該カルシウムチャネル遮断剤は、様々な細胞機能の調節、特に神経伝達の調節に用いることができ、研究試薬、さらにはカルシウムチャネルが関与する疾患の治療等にも用いることができる。
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、例えば以下のように疾患の治療に用いることができる。
１：心臓（洞房結節細胞（心臓のペースメーカー活性に関与））のＴ型カルシウムチャネルを遮断することにより、心筋収縮性を抑制せずに血圧・心拍数を減少させ、高血圧症及び狭心症を治療することができる。
２：収縮力に影響を及ぼさない徐脈薬又は反射性頻脈をきたしにくい降圧薬となる。
３：不整脈発生に関与する電気的心筋リモデリングに対してはＴ型カルシウムチャネルの遮断が抗不整脈的に作用することから抗不整脈薬となる。
４：Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬の投与により心房筋の不応期を延長させ、心房細動の発症が抑制されるという結果から抗心房細動薬となる。
５：Ｔ型カルシウムチャネルは冠動脈平滑筋を含め血管平滑筋に広く分布し、平滑筋のtonusに重要な役割を演じていることからＴ型カルシウムチャネル遮断薬は、この作用により降圧薬となる。
６：上記作用による心筋保護作用薬剤となる。
７：Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬は、血管平滑筋の増殖を抑制することが報告されていることから血管内膜肥厚や増殖による血管閉塞などの予防等に用いることができる。
８：Ｔ型カルシウムチャネルは、シナプス入力が多い樹状突起部のシナプス下膜において、閾値下の微小なEPSPなどで自発性発火を起こして、興奮のトリガーとなっていることから、神経細胞に存在するＴ型カルシウムチャネルを遮断することにより、抗痙攣薬、抗てんかん薬等として用いることができる。
９：isofluramine, thiopental, propofol, octanolなどの麻酔薬ならびにpentobarbitalの臨床濃度においてＴ型カルシウムチャネルを抑制することが知られていることから、Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬は麻酔薬として利用できる。
１：心臓（洞房結節細胞（心臓のペースメーカー活性に関与））のＴ型カルシウムチャネルを遮断することにより、心筋収縮性を抑制せずに血圧・心拍数を減少させ、高血圧症及び狭心症を治療することができる。
２：収縮力に影響を及ぼさない徐脈薬又は反射性頻脈をきたしにくい降圧薬となる。
３：不整脈発生に関与する電気的心筋リモデリングに対してはＴ型カルシウムチャネルの遮断が抗不整脈的に作用することから抗不整脈薬となる。
４：Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬の投与により心房筋の不応期を延長させ、心房細動の発症が抑制されるという結果から抗心房細動薬となる。
５：Ｔ型カルシウムチャネルは冠動脈平滑筋を含め血管平滑筋に広く分布し、平滑筋のtonusに重要な役割を演じていることからＴ型カルシウムチャネル遮断薬は、この作用により降圧薬となる。
６：上記作用による心筋保護作用薬剤となる。
７：Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬は、血管平滑筋の増殖を抑制することが報告されていることから血管内膜肥厚や増殖による血管閉塞などの予防等に用いることができる。
８：Ｔ型カルシウムチャネルは、シナプス入力が多い樹状突起部のシナプス下膜において、閾値下の微小なEPSPなどで自発性発火を起こして、興奮のトリガーとなっていることから、神経細胞に存在するＴ型カルシウムチャネルを遮断することにより、抗痙攣薬、抗てんかん薬等として用いることができる。
９：isofluramine, thiopental, propofol, octanolなどの麻酔薬ならびにpentobarbitalの臨床濃度においてＴ型カルシウムチャネルを抑制することが知られていることから、Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬は麻酔薬として利用できる。
すなわち、本発明は本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを有効成分として含む高血圧症又は狭心症治療薬、降圧薬、抗不整脈薬、抗心房細動薬、心筋保護作用薬、血管閉塞予防薬、抗痙攣薬、抗てんかん薬等を包含する。
ポリペプチドを含むカルシウムチャネル遮断剤は、そのまま細胞に適用してもよいし、ポリペプチドにHIV-1・TATペプチド等の公知の細胞膜通過ペプチドを連結させることにより細胞内に適用することができる。また、ポリヌクレオチドを含むカルシウムチャネル遮断剤は、ヌクレオチドを細胞に導入すればよい、このような、ポリヌクレオチドの細胞への導入は公知の方法により行うことができる。例えば、ウイルスベクターを用いる方法又は非ウイルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が知られている(別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；別冊実験医学、遺伝子導入&発現解析実験法、羊土社、1997；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999)。
本発明のカルシウムチャネル遮断剤を含む医薬組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、ポリペプチドの場合、経口投与では、1日約0.001mg〜100mgであり、１回または数回に分けて投与すればよい。また、非経口投与では、１回あたり、0.001mg〜100mgを皮下注射、筋肉注射、または静脈注射によって投与すればよい。また、発現ベクター等に挿入されたヌクレオチドは、数日または数週間または数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg〜100mgを皮下注射、筋肉注射、または静脈注射等によって投与すればよい。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に特に限定されるものではない。また、特に記載の無い限りにおいて、遺伝子工学的手法の詳細は、"Molecular Cloning 2nd ed."（Sambrook,J., Fritsch,E.F., Maniatis,T. 著 Cold Spring Harvor Laboratory Press 1989年発刊）に記載の方法に従った。
１． アフリカツメガエル卵母細胞発現系の構築
（１） ラット電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニットCav3.1（DDBJ accession No. AF027984）cDNAをクローニングするためにラット脳ファーストストランドcDNAをテンプレートとしてPCRを行い全長を得た。Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット(Cav3.1）は、ラットよりクローニングされたポリペプチドであり、その製法の概略および詳細は、Nature 391 (6670), 896-900 (1998))に記載されている。このポリペプチドのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を配列番号３及び４に示す。
（２） （１）の工程で得られたPCR産物をpSD64TRベクター(pSP64T (Nucleic Acids Res. 12: 7057 (1984))にマルチクローニングサイトとカエルβグロビン遺伝子の5'及び3'非翻訳領域を加え、アフリカツメガエル卵母細胞での発現効率が上がるように改変されたベクターは、T. Snutch博士より供給される。図１のKpn IサイトとSpe IサイトにLigation High（東洋紡社）を用いて接続し、pSD64TR-Cav3.1を得た（図２）。形質転換した大腸菌XL1Blue(Stratagene社)よりプラスミドを調製した(Wizard, Promega社)。Cav3.1を含むプラスミドはXbaIにより消化し線状化した。線状化したプラスミドをテンプレートとし、キャップアナログ（アンビオン社）を添加した反応液を用い、SP6 RNAポリメラーゼ（MEGA Script SP6 Kit; アンビオン社）によりキャップ構造を持つcRNAを合成し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入するサンプルとした。
（１） ラット電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニットCav3.1（DDBJ accession No. AF027984）cDNAをクローニングするためにラット脳ファーストストランドcDNAをテンプレートとしてPCRを行い全長を得た。Ｔ型電位依存性カルシウムチャネルα1サブユニット(Cav3.1）は、ラットよりクローニングされたポリペプチドであり、その製法の概略および詳細は、Nature 391 (6670), 896-900 (1998))に記載されている。このポリペプチドのアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列を配列番号３及び４に示す。
（２） （１）の工程で得られたPCR産物をpSD64TRベクター(pSP64T (Nucleic Acids Res. 12: 7057 (1984))にマルチクローニングサイトとカエルβグロビン遺伝子の5'及び3'非翻訳領域を加え、アフリカツメガエル卵母細胞での発現効率が上がるように改変されたベクターは、T. Snutch博士より供給される。図１のKpn IサイトとSpe IサイトにLigation High（東洋紡社）を用いて接続し、pSD64TR-Cav3.1を得た（図２）。形質転換した大腸菌XL1Blue(Stratagene社)よりプラスミドを調製した(Wizard, Promega社)。Cav3.1を含むプラスミドはXbaIにより消化し線状化した。線状化したプラスミドをテンプレートとし、キャップアナログ（アンビオン社）を添加した反応液を用い、SP6 RNAポリメラーゼ（MEGA Script SP6 Kit; アンビオン社）によりキャップ構造を持つcRNAを合成し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入するサンプルとした。
アフリカツメガエルは業者より購入した。成熟したメスのアフリカツメガエルをTricaine(0.5g/l)を用いて麻酔し、腹腔より外科的にステージＶ−ＶＩの卵母細胞を採取した。採取した卵母細胞を、１mg/mlのコラゲネース(S-1型、新田ゼラチン社)を含むMBS(-Ca2+)液中で30分間処理し、濾胞細胞を除去した。濾胞細胞を除去した卵母細胞をMBS(-Ca2+)で10分間６回洗浄し、コラゲネースを完全に洗い流した。翌日、ガラス針を用いて卵母細胞にcRNAを注入した。注入したcRNAの濃度は100ng/μlである。cRNAを注入した卵母細胞は５％ウマ血清を含むMBS(+Ca2+)液中で培養し、３から５日の間に阻害実験を行った。
２． 発現電流の測定
発現した電流は、２本電極電位固定法にて測定した。電極はガラス電極を引き伸ばして作製し、電極内部を３M KClで満たした。電極抵抗が0.4〜２MWである電極を使用した。テストプロトコールはソフトウェアpClamp8 (Axon Instruments社)を用いて作製した。発現した電流はOC-725C増幅器(Warner Instruments社)を用いて増幅し、DIGIDATA 1321 A/D変換機(Axon Instruments社)によりデジタル化しコンピュータに取り込んだ。測定においては膜電位を-80mVに固定し100msecの-20mVへのパルスを与えて刺激した。リーク電流はP/4 protocolによりオンラインで差し引いた。ペプチド毒の活性を阻害しないため、５mM Ba(OH)2, 90mM NaOH, １mM KOH, 0.5mM Niflumic acid, 0.1mM EDTA, ５mM HEPES, pHをmethanesulfonic acidで7.4に合わせてあり、毒の非特異的吸着を防ぐために0.1mg/ml cytochrome c (Sigma社)を含む溶液を測定溶液として用いた。
発現した電流は、２本電極電位固定法にて測定した。電極はガラス電極を引き伸ばして作製し、電極内部を３M KClで満たした。電極抵抗が0.4〜２MWである電極を使用した。テストプロトコールはソフトウェアpClamp8 (Axon Instruments社)を用いて作製した。発現した電流はOC-725C増幅器(Warner Instruments社)を用いて増幅し、DIGIDATA 1321 A/D変換機(Axon Instruments社)によりデジタル化しコンピュータに取り込んだ。測定においては膜電位を-80mVに固定し100msecの-20mVへのパルスを与えて刺激した。リーク電流はP/4 protocolによりオンラインで差し引いた。ペプチド毒の活性を阻害しないため、５mM Ba(OH)2, 90mM NaOH, １mM KOH, 0.5mM Niflumic acid, 0.1mM EDTA, ５mM HEPES, pHをmethanesulfonic acidで7.4に合わせてあり、毒の非特異的吸着を防ぐために0.1mg/ml cytochrome c (Sigma社)を含む溶液を測定溶液として用いた。
３． 毒液の精製
電位依存性カルシウムチャネル阻害ペプチドの単離グラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）の毒液(100μｌ)を１Ｍ酢酸で溶解した後、Sep-Pak（登録商標）C18カートリッジにより0.05％TFAを含有する70％アセトニトリルで溶出してくる画分を得た。得られた画分を逆相分取C18カラム（10×250mm）を用い、流速４ml/min.で0.05％TFA-70％アセトニトリル液を用いた60分間でアセトニトリルの直線濃度勾配で、220nmの紫外吸収をモニターしながら、溶出を行った。
電位依存性カルシウムチャネル阻害ペプチドの単離グラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）の毒液(100μｌ)を１Ｍ酢酸で溶解した後、Sep-Pak（登録商標）C18カートリッジにより0.05％TFAを含有する70％アセトニトリルで溶出してくる画分を得た。得られた画分を逆相分取C18カラム（10×250mm）を用い、流速４ml/min.で0.05％TFA-70％アセトニトリル液を用いた60分間でアセトニトリルの直線濃度勾配で、220nmの紫外吸収をモニターしながら、溶出を行った。
クロマトグラムからピークが見られた１５個の溶出画分から興起する試験法により、これらの電位依存性カルシウムチャネルの阻害活性を検討した。その結果、20〜30％のアセトニトリル濃度で溶出した画分に、電位依存性カルシウムチャネル（Ｔタイプ）のイオンの流入を抑制する作用が認められた（図３）。
この阻害活性を示した画分をさらに、Superiodex ODS（4.6×250mm、資生堂社製）を用い、１ml/minで20％から25％のアセトニトリルの直線濃度勾配で、220nmの紫外吸収をモニターしながら溶出を行った。電位依存性カルシウムチャネル阻害活性を示す画分は、最終的に、Superiodex ODS（4.6×250mm、資生堂製）により前の条件と同様に行い、精製を行った。その結果、電位依存性カルシウムチャネルを阻害するペプチドが得られた（図４）。
４． アミノ酸配列の決定
得られたペプチドをジチオスレイトールで還元後、４−ビニルピリジンによってアルキル化を行い、未反応試薬を除去した。得られたペプチドのアミノ酸配列を、エドマン分解により決定した。得られた電位依存性カルシウムチャネル阻害ペプチドは、ABIprocise491HT（アプライドバイオサイエンス社製）を用いてそのアミノ酸配列を決定した。ペプチドを50％メタノール溶液100μｌに溶解し、TFA処理したガラス繊維フィルターにより濾過し、濾液にポリブレンを添加した。配列番号７にグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）クモの毒液から単離したポリペプチドのアミノ酸配列解析から明らかになったアミノ配列を示す。
得られたペプチドをジチオスレイトールで還元後、４−ビニルピリジンによってアルキル化を行い、未反応試薬を除去した。得られたペプチドのアミノ酸配列を、エドマン分解により決定した。得られた電位依存性カルシウムチャネル阻害ペプチドは、ABIprocise491HT（アプライドバイオサイエンス社製）を用いてそのアミノ酸配列を決定した。ペプチドを50％メタノール溶液100μｌに溶解し、TFA処理したガラス繊維フィルターにより濾過し、濾液にポリブレンを添加した。配列番号７にグラモストラ・スパチュラタ（Grammostola spatulata）クモの毒液から単離したポリペプチドのアミノ酸配列解析から明らかになったアミノ配列を示す。
５． 質量スペクトル解析
MALDI-TOF質量スペクトルを測定した。データは陽性線形様式にて読み取った。
決定されたアミノ酸配列のデータベース検索を行ったところ、同一の配列を持つものは登録されておらず、新規のペプチドであることが明らかとなった。配列番号７にMSをかけて決定したC末端アミノ酸配列（GTx1-15）を示す。
MALDI-TOF質量スペクトルを測定した。データは陽性線形様式にて読み取った。
決定されたアミノ酸配列のデータベース検索を行ったところ、同一の配列を持つものは登録されておらず、新規のペプチドであることが明らかとなった。配列番号７にMSをかけて決定したC末端アミノ酸配列（GTx1-15）を示す。
６． 新規ペプチド性毒の遺伝子解析
グラモストラ・スパチュラタの毒腺から総RNAを抽出、mRNAを精製し、定法に従いpSD64TFベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築した。インサートの塩基配列の解析を進めたところ、今回発見した新規ペプチド性毒をコードしている遺伝子を発見した。配列番号５に遺伝子解析から明らかになった本発明のポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。また、配列番号６に該DNA配列からの推定アミノ酸配列を示す。図５に示すように、シグナル配列及びプレプロ配列が存在する。
グラモストラ・スパチュラタの毒腺から総RNAを抽出、mRNAを精製し、定法に従いpSD64TFベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築した。インサートの塩基配列の解析を進めたところ、今回発見した新規ペプチド性毒をコードしている遺伝子を発見した。配列番号５に遺伝子解析から明らかになった本発明のポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を示す。また、配列番号６に該DNA配列からの推定アミノ酸配列を示す。図５に示すように、シグナル配列及びプレプロ配列が存在する。
Claims (9)
- 以下の(a)から(d)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(c) 配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ポリペプチドであって、少なくとも配列番号６で表わされるアミノ酸配列の第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制する活性を有するポリペプチド。 - 以下の(e)から(g)のいずれかのポリヌクレオチド：
(e) 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
(f) 配列番号５で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの部分ポリヌクレオチドであって、少なくとも配列番号５で表わされる塩基配列の第139番目〜第246番目の塩基からなる塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
(g) 上記(e)若しくは(f)のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 - 以下の(a)から(d)のいずれかのポリペプチド：
(a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(b) 配列番号７で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
(c) 配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの部分ポリペプチドであって、少なくとも配列番号６で表わされるアミノ酸配列の第47番目〜第82番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
(d) 上記(a)〜(c)のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制する活性を有するポリペプチド。 - 請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- カルシウムチャネルを遮断する量の請求項４に記載の組換えベクターをin vitroで細胞に投与することを含む細胞中のＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制する方法。
- カルシウムチャネルを遮断する量の請求項３に記載のポリペプチドをin vitroで細胞に投与することを含む細胞中のＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制する方法。
- 請求項４に記載の組換えベクターを有効成分として含む細胞中のＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制するＴ型電位依存性カルシウムチャネルイオン流入抑制剤。
- 請求項３に記載のポリペプチドを有効成分として含む細胞中のＴ型電位依存性カルシウムチャネルのイオン流入を抑制するＴ型電位依存性カルシウムチャネルイオン流入抑制剤。
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