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Diese
Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die Gadfly Zugangsnummer
CG8327 kodieren, homologe Proteine und die dadurch kodierten Polypeptide
und deren Verwendung bei der Herstellung eines Medikamentes für die Vorbeugung
und Behandlung von Fettleibigkeit und verwandten Störungen,
wie beispielsweise Essstörung,
Kachexie, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzerkrankung,
Hypercholesterinämie
und Dyslipidämie.
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Es
gibt mehrere Stoffwechselkrankheiten des menschlichen und tierischen
Stoffwechsels, z. B. Fettleibigkeit und schwerer Gewichtsverlust,
die in Zusammenhang mit einem Energieungleichgewicht stehen, bei
dem die Kalorienzufuhr im Ungleichgewicht zum Energieverbrauch steht.
Fettleibigkeit ist eine der häufigsten
Stoffwechselstörungen
weltweit. Es handelt sich dabei um eine noch immer kaum verstandene
menschliche Erkrankung, die für
die westliche Gesellschaft immer relevanter wird. Fettleibigkeit ist
definiert als überschüssiges Körperfett,
was häufig zu
einer signifikanten Verschlechterung der Gesundheit führt. Mit
Fettleibigkeit verknüpft
sind häufig
kardiovaskuläre
Risikofaktoren wie Hypertonie, hoher Blutspiegel an Triglyzeriden
und Nüchternglukose sowie
niedrige Blutspiegel von HDL-Cholesterin. Diese typische Ballung
von Symptomen wird üblicherweise
als „metabolisches
Syndrom" bezeichnet (Reaven,
2002, Circulation 106(3): 286–8, Übersichtsarbeit).
Hyperlipidämie
und eine Erhöhung
der freien Fettsäuren
korrelieren eindeutig mit dem metabolischen Syndrom, das als die
Verknüpfung
zwischen mehreren Krankheiten, einschließlich Fettleibigkeit und Insulinresistenz,
definiert ist. Diese findet häufig
in denselben Patienten statt und ist ein Hauptrisikofaktor für die Entwicklung
von Typ-2-Diabetes und kardiovaskuläre Erkrankung. Es wurde vorgeschlagen,
dass die Kontrolle des Lipidspiegels und des Glukosespiegels erforderlich
ist, um Typ-2-Diabetes, Herzkrankheit und andere Fälle eines metabolischen
Syndroms zu behandeln (siehe beispielsweise Santomauro A. T. et
al., (1999) Diabetes, 48(9): 1836–1841 und McCook, 2002, JAMA
288: 2709–2716).
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Fettleibigkeit
des Menschen wird stark von umweltbedingten und genetischen Faktoren
beeinflusst, wobei der Umwelteinfluss häufig eine Hürde für die Identifizierung (humaner)
Gene für
Fettleibigkeit ist. Fettleibigkeit wird von genetischen, metabolischen,
biochemischen, psychologischen und verhaltensbedingten Faktoren
beeinflusst. Es handelt sich dabei um eine an sich komplexe Störung, gegen
die an mehreren Fronten angegangen werden muss, um ein dauerhaftes
positives klinisches Ergebnis zu erhalten.
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Fettleibigkeit
gilt nicht als einzelne Störung, sondern
als eine heterogene Gruppe von Zuständen mit (potenziellen) mehreren
Ursachen. Fettleibigkeit ist außerdem
gekennzeichnet von einem erhöhten Nüchternplasmainsulin
und einer übertriebenen
Insulinantwort auf orale Glukosezufuhr (Kopelmann, J. Clin. Invest
65, 1980, 1272–1284),
und es kann eine deutliche Beteiligung von Fettleibigkeit an Typ-2-Diabetes-mellitus
bestätigt
werden (Kopelman, Nature 404, 2000, 635–643).
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Neben
anderen Hormonen spielt Insulin eine Schlüsselrolle bei der Regulierung
des Energiestoffwechsels. Ein hoher Blutglukosespiegel stimuliert
die Sekretion von Insulin durch Betazellen in der Bauchspeicheldrüse. Insulin
führt zur
Speicherung von Glykogen und Triglyzeriden und zur Synthese von
Proteinen. Der Eintritt von Glukose in Muskeln und Fettzellen wird
von Insulin stimuliert. Bei Patienten, die an Diabetes mellitus
leiden, ist entweder die Menge an Insulin, das von den Inselzellen
in der Bauchspeicheldrüse
produziert wird, zu niedrig (Typ-1-Diabetes oder insulinabhängiger Diabetes
mellitus, IDDM) oder Leber- und Muskelzellen verlieren ihre Fähigkeit,
auf normale Insulinspiegel im Blut zu reagieren (Insulinresistenz).
Im nächsten
Stadium verlieren Bauchspeicheldrüsenzellen ihre Fähigkeit
zur Produktion ausreichender Insulinmengen (Typ-2-Diabetes oder nicht-insulinabhängiger Diabetes
mellitus NIDDM).
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Obgleich
mehrere Kandidatengene beschrieben worden sind, welche das homöostatische System
bzw. die homöostatischen
Systeme, die Körpermasse/-gewicht
regulieren, beeinflussen sollen, wie beispielsweise Leptin, VCPI,
VCPL oder der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor-Gamma-Coaktivator, sind
die speziellen molekularen Mechanismen und/oder Moleküle, die
Fettleibigkeit oder die Regulierung von Körpergewicht/Körpermasse
beeinflussen, nicht bekannt.
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Das
technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt,
war daher, Mittel und Verfahren bereitzustellen, um (pathologische)
metabolische Zustände
zu modulieren, die die Körpergewichtregulierung
und/oder homöostatische
Energieschaltkreise beeinflussen. Die Lösung des technischen Problems
wird erreicht, indem die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen
bereitgestellt werden.
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Entsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung Gene mit neuartigen Funktionen
bei der Körpergewichtregulierung,
der Energiehomöostase,
des Stoffwechsels und von Fettleibigkeit. Die vorliegende Erfindung
beschreibt ein spezifisches Gen, das an der Regulierung von Körpergewicht,
Energiehomöostase,
Stoffwechsel und Fettleibigkeit beteiligt ist und daher an damit
zusammenhängenden
Störungen
wie dem metabolischen Syndrom, Essstörungen, Kachexie, Diabetes
mellitus, Hypertonie, koronarer Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis
und Gallensteinen. Die vorliegende Erfindung beschreibt die humanen
Homologe des Gens von Drosophila, Gadfly Zugangsnummer CG8327, als
an solchen oben erwähnten
Zuständen
beteiligt.
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Polyamine
(Putrescin, Spermidin und Spermin) können die Funktionen von RNA,
DNA, Nucleotidtriphosphaten, Proteinen und anderen sauren Substanzen
modulieren (Tgarashi K. and Kashiwagi K., 2000, Biochem Biophys
Res Commun 271(3): 559–564).
Polyamine stimulieren die Aktivität von Glykogensynthase (Casein)-Kinase-1
aus Rindernieren- und verschiedenen Rattengeweben (Singh T. J., 1988,
Arch Biochem Biophys 267(1): 167–175). Die Biosynthese von
Polyaminen, die universell für
zelluläre
Funktionen essenziell sind, findet ausgehend von Arginin und Methionin
statt und umfasst 4 verschiedene Enzyme: Spermidinsynthase, Ornithindecarboxylase,
S-Adenosyl-L-methionindecarboxylase und Sperminsynthase (Janne J.
et al., 1991, Ann Med 23(3): 241–259). Wahlfors et al. (1990,
DNA Cell Biol. 9: 103–110)
klonierten eine cDNA, die für
die Volllängen-Untereinheit
der humanen Spermidinsynthase kodiert. Myohanen et al. (1991, DNA
Cell Biol. 10(6): 467–474)
isolierten das humane Gen aus einer genomischen Bibliothek und kartierten
es auf Chromosom 1. Eine transgene Mauslinie weist eine Überexpression
des humanen Spermidinsynthasegens auf. Die erhöhte Spermidinsynthaseaktivität hat keinen
Effekt auf den Putrescin-, Spermidin- oder Spermingehalt in Gewebe
(Kauppinen L. et al., 1993, Biochem J 293 (Pt 2): 513–516).
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WO02/12338
beschreibt die Verwendung humaner Spermidinsynthase für die Untersuchung schmerzregulierender
Substanzen.
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WO02/058623,
Stand der Technik nur unter Artikel 54(3) und (4) EPC, beschreibt
die Verwendung eines Inhibitors der Spermidinsynthase zur Behandlung
von Osteoarthritis.
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Ito
H. et al., 1982, Cancer letters, Band 15, Nr. 3, 229–236, beschreibt
die Verwendung eines Inhibitors von Spermidinsynthase bei der Behandlung von
Krebs.
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Bislang
wurde nicht beschrieben, dass von Gadfly Zugangsnummer CG8327 kodierte
Proteine und eng verwandte Proteine, insbesondere humane Proteinspermidinsynthase
(SRM) an der Regulierung der Energiehomöostase und der Regulierung
des Körpergewichtes
und verwandten Störungen
beteiligt sind, und daher wurden keine Funktionen bei Stoffwechselkrankheiten
und andere Krankheiten, wie oben aufgeführt, erläutert.
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In
dieser Erfindung zeigen wir, dass die korrekte Gendosis von Gadfly
Zugangsnummer CG8327 für
die Aufrechterhaltung der Energiehomöostase essenziell ist. Eine
genetische Untersuchung wurde verwendet, um zu identifizieren, dass
eine Mutation von homologen Genen von Gadfly Zugangsnummer CG8327
Fettleibigkeit verursacht, was durch eine signifikante Erhöhung des
Triglyzeridgehalts, der wichtigsten Energiespeichersubstanz, widergespiegelt
wird.
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Polynukleotide,
die Proteine mit Homologien zu Gadfly Zugangsnummer CG8327 kodieren,
sind geeignet, um Krankheiten und Störungen, wie oben beschrieben,
zu untersuchen. Des Weiteren sind neue Zusammensetzungen bereitgestellt,
die für
die Diagnose, Behandlung und Prognose von Krankheiten und Störungen,
wie oben beschrieben, geeignet sind.
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Bevor
die vorliegenden Proteine, Nukleotidsequenzen und Verfahren beschrieben
werden, versteht sich, dass diese Erfindung nicht auf die jeweils beschriebenen
Verfahrensweisen, Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien
beschränkt
ist, da diese variieren können.
Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur
für den
Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen bestimmt ist und
nicht dafür,
den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken, die nur von den beiliegenden
Ansprüchen
beschränkt
wird. Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von
einem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise
verstanden wird. Es können zwar
alle Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent
sind wie die hierin beschriebenen, bei der Ausübung oder Testung der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, aber es werden nun die bevorzugten Verfahren,
Vorrichtungen und Materialien beschrieben. Aller hierin erwähnten Veröffentlichungen sind
hierin durch Bezugnahme enthalten, um die Zelllinien, Vektoren und
Verfahrensweisen zu beschreiben und zu offenbaren, die in den Veröffentlichungen berichtet
sind, welche in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können. Hierin
ist nichts als Zugeständnis
zu verstehen, dass die Erfindung nicht berechtigt wäre, solche
Beschreibungen vorwegzunehmen.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt, dass Proteine, die zu Gadfly Zugangsnummer
CG8327 homolog sind, die Energiehomöostase und den Fettstoffwechsel
regulieren, vor allem den Stoffwechsel und die Speicherung von Triglyzeriden
und Polynukleotiden, welche die in dieser Erfindung beschriebenen
Proteine identifizieren und kodieren. Die Erfindung betrifft ferner
Vektoren, Wirtszellen, Antikörper und
Rekombinationsverfahren zum Herstellen der Polypeptide und Polynukleotide
der Erfindung. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung dieser Sequenzen
bei der Diagnose, Untersuchung, Prävention und Behandlung von
Krankheiten und Störungen,
beispielsweise, aber nicht ausschließlich, Stoffwechselkrankheiten
wie Fettleibigkeit sowie verwandte Störungen wie das metabolische
Syndrom, Essstörung,
Kachexie, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzkrankheit,
Hypercholesterinämie,
Dyslipidämie,
Osteoarthritis und Gallensteine.
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Der
Begriff „Polynukleotid,
umfassend die Nukleotidsequenz wie gezeigt in GenBank Zugangsnummer" bezieht sich auf
das exprimierbare Gen der Nukleotidsequenz, die unter der entsprechenden GenBank
Zugangsnummer abgelegt ist. Der Begriff „GenBank Zugangsnummer" bezieht sich auf
NCBI-GenBank-Datenbankeinträge (Bezugsquelle: Benson
et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28: 15–18).
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Proteine,
die zu Gadfly Zugangsnummer CG8327 homolog sind, und Nukleinsäuremoleküle, die
diese kodieren, können
aus Insekten- oder Wirbeltierarten erhalten werden, z. B. Säugern oder
Vögeln.
Besonders bevorzugt sind homologe Nukleinsäuren, insbesondere Nukleinsäuren, die
eine humane Spermidinsynthase (SRM) kodieren.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert,
welches zur Regulierung der Energiehomöostase und dem Stoffwechsel
von Triglyzeriden beiträgt,
wobei das Nukleinsäuremolekül Folgendes
umfasst:
- (a) Die Nukleotidsequenz von oder
eine Nukleotidsequenz kodierend (i) Gadfly Zugangsnummer CG8327,
humane Spermidinsynthase (SEQ ID Nr. 1; GenBank Zugangsnummer NM_003132).
- (b) Eine Nukleotidsequenz, die bei 50°C in einer Lösung, die 1 × SSC und
0,1% SDS enthält,
an eine Sequenz von (a) hybridisiert,
- (c) eine Sequenz, die mit den Sequenzen von (a) oder (b) innerhalb
der Degeneration des genetischen Kodes korrespondiert, Bezug auf
das Nukleinsäuremolekül von (a)
degeneriert ist,
- (d) eine Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens
85%, vorzugsweise zu mindestens 90%, mehr bevorzugt zu mindestens
95%, mehr bevorzugt zu mindestens 98% und bis zu 99,6% identisch
ist zu den Aminosäuresequenzen
von Gadfly Zugangsnummer CG8327,
- (e) eine Sequenz, die eine Gadfly Zugangsnummer CG8327 und/oder
ein homologes Protein kodiert, insbesondere humane Spermidinsynthase (SEQ
ID Nr. 2; GenBank Zugangsnummer NP_003123),
- (f) eine Sequenz, die sich von dem Nukleinsäuremolekül von (a) bis (d) durch Mutation
unterscheidet und wobei die Mutation eine Veränderung, Deletion, Duplikation
und/oder einen vorzeitigen Abbruch des kodierten Polypeptids verursacht,
oder
- (g) eine partielle Sequenz einer beliebigen der Nukleotidsequenzen
von (a) bis (e) mit einer Länge
von mindestens 15 Basen, vorzugsweise mindestens 20 Basen, mehr
bevorzugt mindestens 25 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 50
Basen.
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Die
Erfindung beruht auf dem Befund, dass ein Protein, das zu Gadfly
Zugangsnummer CG8327 homolog ist (hierin als SRM bezeichnet), und
die Polynukleotide, die es kodieren, an der Regulierung der Triglyzeridspeicherung
und daher der Energiehomöostase
beteiligt sind. Die Erfindung beschreibt die Verwendung dieser Polypeptide,
Polynukleotide und deren Effektoren für die Diagnose, Untersuchung, Prävention
oder Behandlung von damit in Zusammenhang stehenden Krankheiten
und Störungen, einschließlich Stoffwechselkrankheiten
wie beispielsweise Fettleibigkeit sowie verwandte Störungen wie das
metabolische Syndrom, Essstörung,
Kachexie, Diabetes mellitus, Hypertonie, koronare Herzkrankheit,
Hypercholesterinämie,
Dyslipidämie,
Osteoarthritis oder Gallensteine.
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Entsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung Gene mit neuartigen Funktionen
bei der Körpergewichtsregulierung,
Energiehomöostase,
Metabolismus und Fettleibigkeit, Fragmente der Gene, Polypeptide,
die von den Genen kodiert werden, oder Fragmente davon, und Antikörper, biologisch aktive Nukleinsäuren, wie
beispielsweise Antisense-Moleküle, RNAi-Moleküle oder
Ribozyme oder Aptamere.
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Die
Möglichkeit
zur Manipulation und Untersuchung der Genome von Modellorganismen
wie beispielsweise der Fliege Drosophila melanogaster bietet ein
leistungsstarkes Werkzeug zur Analyse biologischer und biochemischer
Prozesse, die aufgrund einer signifikanten evolutionären Konservierung
von Genen, zellulären
Prozessen und Signalwegen für
komplexere Wirbeltierorganismen direkte Relevanz haben (siehe beispielsweise
Adams M. D. et al., (2000) Science 287: 2185–2195). Die Identifikation
neuartiger Genfunktionen in Modellorganismen kann direkt zur Aufklärung korrelativer
Signalwege bei Säugern
(Menschen) und von Verfahren zu deren Modulierung beitragen. Eine
Korrelation zwischen einem pathologischen Modell (beispielsweise
Veränderungen
der Triglyzeridspiegel als Anzeichen für ein metabolisches Syndrom,
einschließlich
Fettleibigkeit) und der modifizierten Expression eines Fliegengens kann
die Assoziation des menschlichen Orthologs mit der jeweiligen humanen
Krankheit identifizieren.
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Bei
Fliegen, die aufgrund einer Fehlexpression eines bekannten Gens
einen mutanten Phänotyo aufweisen,
kann eine genetische Vorwärtsuntersuchung
durchgeführt
werden (siehe Johnston Nat Rev Genet 3: 176–188 (2002); Rorth P., (1996)
Proc Natl Acad Sci USA 93: 12418–12422). Triglyzeride sind die
wirksamsten Energiespeicher in Zellen. Fettleibige Menschen zeigen
meist einen signifikanten Anstieg des Triglyzeridgehalts. In dieser
Erfindung haben wir eine genetische Untersuchung angewandt, um Mutationen
von Genen zu identifizieren, die die Proteine der Erfindung kodieren,
und homologe Gene, die Veränderungen
des Körpergewichtes
verursachen, was sich an einer wesentlichen Änderung des Triglyzeridspiegels
zeigt. Zur Isolierung von Genen mit einer Funktion bei der Energiehomöostase wurden
mehrere Tausend proprietäre
und öffentlich verfügbare EP-Linien nach
einem längeren
Fütterungszeitraum
auf ihren Triglyzeridgehalt getestet (siehe Beispiele für ausführlichere
Angaben). Linien mit signifikant erhöhtem Triglyzeridgehalt wurden
als positive Kandidaten für
zukünftige
Analysen ausgewählt.
Die Veränderung
des Triglyzeridgehalts aufgrund des Verlustes einer Genfunktion
deutet auf Genaktivitäten
bei der Energiehomöostase
in dosisabhängiger
Weise hin, welche die als Triglyzeride gespeicherte Energiemenge
kontrollieren.
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In
einer Ausführungsform
wurden Fliegen, die für
die Integration von Vektoren für
Drosophila-Linien EP(3)3054, HD-EP(3)31 068, HD-EP(3)31149, EP(3)3322,
EP(2)2162, EP(3)0650, HD-EP(3)31393 und HD-EP(3)32007 homozygot
waren, in einem Assay analysiert, welcher den Triglyzeridgehalt
dieser Fliegen misst, was im Abschnitt BEISPIELE der Erfindung ausführlicher
veranschaulicht ist. Die Ergebnisse der Analyse des Triglyzeridgehalts
sind in 1, 5, 9, 13, 17, 21 und 15 gezeigt.
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Der
Anstieg des Triglyzeridgehalts aufgrund des Verlustes einer Genfunktion
deutet auf Genaktivitäten
bei der Energiehomöostase
in dosisabhängiger
Weise hin, welche die als Triglyzeride gespeicherte Energiemenge
kontrollieren.
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Nukleinsäuren, welche
die Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren, wurden mit einer
Plasmid-Rescue-Technik identifiziert. Es wurden genomische DNA-Sequenzen
isoliert, die sich neben der Integrationsstelle des EP-Vektors (hierin
EP(3)3054, HD-EP(3)31068, HD-EP(3)31149, EP(3)3322, EP(2)2162, EP(3)0650,
HD-EP(3)31393 und HD-EP(3)32007) befinden. Mit diesen isolierten
genomischen Sequenzen wurden öffentliche
Datenbanken wie die des Berkeley Drosophila Genome Project (GadFly;
siehe auch FlyBase (1999) Nucleic Acids Research 27: 85–88) durchsucht,
wodurch die Integrationsstellen der Vektoren und die korrespondierenden
Gene identifiziert wurden, ausführlicher beschrieben
im Abschnitt „BEISPIELE". Die molekulare Organisation
der Gene ist in 2, 6, 10, 14, 18, 22 und 26 gezeigt. Die Drosophila-Gene und die
davon kodierten Proteine mit Funktionen bei der Regulierung des
Triglyzeridstoffwechsels wurden weiter in öffentlich verfügbaren Sequenzdatenbanken
analysiert (siehe BEISPIELE für
mehr Details), und es wurden Säugerhomologe
identifiziert (siehe 3, 7, 11, 15, 19, 23 und 27). Es wurden Vergleiche (Clustal-Analyse)
zwischen den Proteinen verschiedener Arten (Mensch, Maus und Drosophila)
durchgeführt (siehe 3, 7, 11, 15, 19, 23 und 27).
Ausgehend von der Homologie dürften
die Drosophila-Proteine der Erfindung und jedes homologe Protein
oder Peptid mindestens gewisse Aktivität teilen. Aus dem Stand der
Technik sind für
die erfindungsgemäßen Gene
keine funktionellen Daten verfügbar,
welche die Regulierung der Körpergewichtskontrolle
und verwandter Stoffwechselkrankheiten wie Fettleibigkeit und Diabetes
beschreiben.
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Die
Funktion der Säugerhomologe
bei der Energiehomöostase
wurde in dieser Erfindung weiter validiert, indem die Expression
der Transkripte in verschiedenen Geweben analysiert und indem die
Rolle bei der Adipozytendifferenzierung analysiert wurde (siehe 4, 8, 12, 16, 20, und 24). Expressionsprofilstudien (siehe BEISPIELE
für mehr
Details) bestätigen
die besondere Relevanz der erfindungsgemäßen Proteine als Regulatoren
des Energiestoffwechsels bei Säugern.
Darüber
hinaus zeigen wir, dass die erfindungsgemäßen Proteine durch Fasten oder durch
genetisch induzierte Fettleibigkeit reguliert werden. In dieser
Erfindung haben wir Mausmodelle für Insulinresistenz und/oder
Diabetes verwendet, wie beispielsweise Mäuse, die Gen-Knockouts im Leptin-Signalweg
(beispielsweise ob(Leptin)- oder db(Leptinrezeptor)-Mäuse) tragen,
um die Expression der erfindungsgemäßen Proteine zu untersuchen. Solche
Mäuse entwickeln
typische Symptome eines Diabetes, zeigen hepatische Lipidansammlung
und haben häufig
einen erhöhten
Plasmalipidspiegel (siehe Bruning et al., 1998, Mol. Cell. 2: 449–569). Darüber hinaus
zeigen wir in dieser Erfindung, dass die mRNAS der erfindungsgemäßen Proteine
während der
Adipozytendifferenzierung in vitro reguliert werden (siehe BEISPIELE
für mehr
Details), was auf eine Rolle als Modulator der Lipidakkumulierung
in Adipozyten hindeutet. Wir folgern deshalb, dass die erfindungsgemäßen Proteine
(oder Varianten davon) eine Funktion im Stoffwechsel reifer Säugeradipozyten
haben.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt weiter Polypeptide, welche die
Aminosäuresequenzen
von SRM umfassen, und homologe Proteine. Ausgehend von der Homologie,
dürften
die erfindungsgemäßen Proteine
und jedes homologe Protein oder Peptid mindestens gewisse Aktivität teilen.
Aus dem Stand der Technik sind für
die erfindungsgemäßen Gene keine
funktionellen Daten verfügbar,
welche die Regulierung der Körpergewichtskontrolle
und verwandter Stoffwechselkrankheiten wie Fettleibigkeit und Diabetes
beschreiben.
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Die
Erfindung umfasst auch Polynukleotide, welche ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren. Entsprechend kann jede Nukleinsäuresequenz,
welche die Aminosäuresequenzen
eines erfindungsgemäßen Proteins
oder homologe Proteine kodiert, verwendet werden, um rekombinante
Moleküle
zu erzeugen, die ein erfindungsgemäßes Protein oder homologe Proteine
exprimieren. Von einem Fachmann wird anerkannt, dass als ein Ergebnis
der Degeneration des genetischen Codes viele Nukleotidsequenzen
hergestellt werden können,
welche die erfindungsgemäßen Proteine
oder homologe Proteine kodieren, wobei einige minimale Homologie
zu den Nukleotidsequenzen beliebiger bekannter und natürlich vorkommender
Gene aufweisen. Die Erfindung zieht darin jede und alle möglichen
Variationen von Nukleotidsequenzen in Betracht, die hergestellt
werden können,
indem Kombinationen ausgehend von der möglichen Codonauswahl ausgewählt werden.
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Die
Erfindung umfasst außerdem
Polynukleotidsequenzen, die unter verschiedenen Stringenzbedingungen
an die beanspruchten Nukleotidsequenzen hybridisieren können, und
insbesondere solche Polynukleotide, die ein erfindungsgemäßes Protein
kodieren. Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur
(Tm) des Nukleinsäurebindungskomplexes
bzw. der Sonde, wie gelehrt von Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987:
Methods Enzymol. 152: 399–407)
und Kimmel, A. R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507–511), und
können
bei einer definierten Stringenz verwendet werden. Eine Hybridisierung
unter stringenten Bedingungen bedeutet vorzugsweise, dass nach Waschen
für 1 Std.
mit 1 × SSC
und 0,1% SDS bei 50°C,
vorzugsweise bei 55°C,
mehr bevorzugt bei 62°C
und am meisten bevorzugt bei 68°C,
insbesondere für
1 Std. in 0,2 × SSC
und 0,1% SDS bei 50°C,
vorzugsweise bei 55°C,
mehr bevorzugt bei 62°C
und am meisten bevorzugt bei 68°C,
ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Veränderte Nukleinsäuresequenzen,
die ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren, die in der Erfindung enthalten
sind, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener
Nukleotide, was zu einem Polynukleotid führt, welches dasselbe oder
ein funktionell gleichwertiges Protein kodiert.
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Die
kodierten Proteine können
auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäurereste
enthalten, welche eine stumme Veränderung herstellen und zu funktionell
gleichwertigen Proteinen führen.
Auf der Basis einer Ähnlichkeit
der Polarität,
Ladung, Löslichkeit,
Hydrophobizität,
Hydrophilie und/oder der amphipathischen Art der Reste können absichtliche
Aminosäuresubstitutionen
vorgenommen werden, so lange die biologische Aktivität des Proteins
erhalten bleibt. Darüber
hinaus betrifft die Erfindung Peptidfragmente der Proteine oder
Derivate solcher Peptide, wie beispielsweise zyklische Peptide,
Retro-Inverso-Peptide oder Peptidmimetika mit einer Länge von
mindestens 4, vorzugsweise mindestens 6 und bis zu 50 Aminosäuren.
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Auch
enthalten im Umfang der vorliegenden Erfindung sind Allele der Gene,
die ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren. Wie hierin verwendet handelt es
sich bei einem „Allel" oder „Allelsequenzen" um eine alternative
Form des Gens, die aus mindestens einer Mutation der Nukleinsäuresequenz
resultieren kann. Allele können
zu veränderten
mRNAs oder Polypeptiden führen,
deren Struktur oder Funktion verändert
sein können oder
nicht. Häufige
Mutationsveränderungen,
aus denen Allele entstehen, werden im Allgemeinen natürlichen
Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nukleotiden zugeschrieben.
Jeder dieser Veränderungstypen
kann alleine oder in Kombination mit den anderen einmal oder mehrmals
in einer bestimmten Sequenz stattfinden.
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Die
Nukleinsäuresequenzen,
die ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren, können verlängert werden, indem eine besondere
Nukleotidsequenz verwendet wird und verschiedene aus dem Stand der
Technik bekannte Verfahren angewandt werden, um stromaufwärts gelegene
(Upstream)-Sequenzen wie beispielsweise Promotoren und regulatorische
Elemente festzustellen. Beispielsweise verwendet ein Verfahren,
das angewandt werden kann, die „Restriktionsstellen-PCR", universelle Primer,
um unbekannte Sequenzen neben einem bekannten Lokus zu erhalten
(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2: 318–322). Es kann auch eine inverse
PCR verwendet werden, um Sequenzen unter Anwendung divergenter Primer
ausgehend von einer bekannten Region zu amplifizieren oder zu verlängern (Triglia,
T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 8186). Ein anderes Verfahren,
das verwendet werden kann, ist Capture-PCR, welche die PCR-Amplifikation von
DNA-Fragmenten neben einer bekannten Sequenz in humaner DNA und Yeast-Artificial-Chromosome-DNA
umfasst (Lagerstrom, M. et al. (PCR Methods Applic. 1: 111–119)). Ein
anderes Verfahren, das verwendet werden kann, um unbekannte Sequenzen
zu erhalten, ist das von Parker, J. D. et al. (1991; Nucleic Acids
Res. 19: 3055–3060).
Darüber
hinaus können
PCR, Nested-Primer und PROMOTERFINDER-Bibliotheken verwendet werden,
um genomische DNA abzuwandern (Clontech, Palo Alto, Kalif., USA).
Dieser Prozess vermeidet die Notwendigkeit zur Untersuchung von
Bibliotheken und ist nützlich,
um Intron/Exon-Kontaktstellen zu finden.
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Zur
Expression eines biologisch aktiven Proteins können die Nukleotidsequenzen,
die das Protein oder funktionelle Äquivalente kodieren, in geeignete
Expressionsvektoren eingefügt
werden, d. h. in einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription
und Translation der eingefügten
Kodierungssequenz enthält.
Es können
Verfahren verwendet werden, die einem Fachmann gut bekannt sind, um
Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen enthalten, welche
die Proteine und geeignete Transkriptions- und Translationskontrollelemente kodieren.
Solche Verfahren umfassen DNA-Rekombinationstechniken in vitro,
synthetische Techniken und genetische Rekombination in vivo. Solche
Techniken sind beschrieben in Sambrook, J. et al. (1989) Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview,
N.Y., und Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons,
New York, N.Y., USA.
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Es
können
verschiedene Expressionsvektor-/Wirtsysteme verwendet werden, um
Sequenzen zu enthalten und zu exprimieren, die ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren. Dazu gehören, aber nicht ausschließlich, Mikroorganismen
wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder
Cosmid-DNA-Expressionsvektoren
transformiert sind, Hefen, die mit Hefeexpressionsvektoren transformiert
sind, Insektenzellsysteme, die mit Virusexpressionsvektoren (z.
B. Bakulovirus) transformiert sind, Pflanzenzellsysteme, die mit
Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaik-Virus, CaMV; Tabakmosaikvirus,
TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z. B. Ti oder PBR322-Plasmiden)
transformiert sind, oder tierische Zellsysteme. Die „Kontrollelemente" oder „regulatorischen
Sequenzen" sind
diejenigen untranslatierten Regionen der Vektor-Enhancer, Promotoren, 5'- und 3'-untranslatierte
Regionen, die mit zellulären Wirtsproteinen
wechselwirken, um Transkription und Translation durchzuführen. Solche
Elemente können in
Stärke
und Spezifität
variieren. Je nach dem verwendeten Vektorsystem und Wirt kann jede
beliebige Zahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente,
einschließlich
konstitutive und induzierbare Promotoren, verwendet werden.
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Das
Vorhandensein von Polynukleotidsequenzen, die ein erfindungsgemäßen Protein
oder homologe Protein kodieren, lässt sich durch DNA-DNA- oder
DNA-RNA-Hybridisierung und/oder Amplifizierung anhand von Sonden
oder Anteilen oder Fragmenten von Polynukleotiden feststellen, die das
Protein kodieren. Assays auf der Basis von Nukleinsäureamplifizierung
umfassen die Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligomeren auf
der Basis der für
ein erfindungsgemäßes Protein
spezifischen Sequenzen und Nukleinsäuren, um Transformanden zu
erkennen, die DNA oder RNA enthalten, welche die Proteine kodieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Oligonukleotide" oder „Oligomere" auf eine Nukleinsäuresequenz
von mindestens etwa 10 Nukleotiden und bis zu etwa 60 Nukleotiden,
vorzugsweise etwa 15 bis 30 Nukleotiden und mehr bevorzugt etwa 20–25 Nukleotiden,
die als Sonde oder Amplimer verwendet werden kann.
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Aus
dem Stand der Technik sind verschiedene Protokolle für die Feststellung
und Messung der Expression der erfindungsgemäßen Proteine oder homologen
Proteine unter Verwendung von für
das Protein spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern bekannt.
Beispiele umfassen ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay), RIA
(Radioimmunoassay) und FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).
Ein zweiseitiger Immunassay auf der Basis monoklonaler Antikörper, die
gegen zwei nicht wechselwirkende Epitope auf dem Protein reaktiv sind,
ist bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungsassay
verwendet werden. Diese und andere Assays sind unter Anderem beschrieben
in Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual,
APS Press, St Paul, Minn.) und Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp.
Med. 158: 1211–1216).
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Einem
Fachmann ist eine breite Vielzahl von Markern und Konjugationstechniken
bekannt, die in verschiedenen Nukleinsäure- und Aminosäureassays
verwendet werden können.
Mittel zum Herstellen markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zur Erkennung
von Sequenzen, die mit Polynukleotiden verwandt sind, welche ein
erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren, umfassen Oligo-Labeling, Nick-Translation, End-Labeling
oder PCR-Amplifizierung mit einem markierten Nukleotid.
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Alternativ
können
die Sequenzen, die ein erfindungsgemäßes Protein oder homologe Proteine kodieren,
oder beliebige Anteile davon in einen Vektor kloniert werden, um
eine mRNA-Sonde herzustellen. Solche Vektoren sind aus dem Stand
der Technik bekannt, im Handel erhältlich und können verwendet werden,
um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase
wie beispielsweise T7, T3 oder SP6 und markierter Nukleotide zu
synthetisieren. Diese Verfahren können mit vielen verschiedenen
im Handel erhältlichen
Kits durchgeführt
werden (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo,
Mich., USA); Promega (Madison Wis., USA); und U.S. Biochemical Corp.,
(Cleveland, Ohio, USA).
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Geeignete
Reportermoleküle
oder Marker, die verwendet werden können, umfassen Radionuklide,
Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszente oder chromogene Stoffe
sowie Substrate, Cofaktoren, Hemmstoffe, Magnetteilchen und dergleichen.
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Wirtszellen,
die mit Nukleotidsequenzen transformiert sind, die ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren, können unter Bedingungen kultiviert
werden, die für
die Expression und Wiedergewinnung des Proteins aus der Zellkultur
geeignet sind. Das von einer rekombinanten Zelle hergestellte Protein
kann sezerniert werden oder intrazellulär vorliegen, je nach der Sequenz
und/oder dem verwendeten Vektor. Wie einem Fachmann bekannt ist,
können
Expressionsvektoren entwickelt werden, die das Protein kodierende
Polynukleotide und Signalsequenzen enthalten, welche die Sekretion
des Proteins durch eine prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran
veranlassen. Andere rekombinante Konstruktionen können verwendet
werden, um Sequenzen, welche das gewünschte Protein kodieren, mit
einer Nukleotidsequenz zu verbinden, die eine Polypeptiddomäne kodiert,
welche die Reinigung löslicher
Proteine ermöglicht.
Solche Domänen, welche
die Reinigung ermöglichen,
umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Metallchelat-bildende
Peptide wie Histidin-Tryptophan-Module,
die eine Reinigung auf immobilisierten Metallen zulassen, Protein-A-Domänen, die
eine Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin zulassen, und die
im FLAG-Extensions/Affinitätsreinigungssystem
(Immunex Corp., Seattle, Wash., USA) verwendete Domäne.
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Diagnostika und Therapeutika
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Die
in dieser Erfindung beschriebenen Daten zeigen, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und
Proteine und deren Effektormoleküle
für implizierte
therapeutische Anwendungen geeignet sind, beispielsweise, aber nicht
ausschließlich,
bei Stoffwechselstörungen
wie beispielsweise Fettleibigkeit sowie bei verwandten Störungen wie
beispielsweise dem metabolischen Syndrom, Essstörung, Kachexie, Diabetes mellitus,
Hypertonie, koronarer Herzerkrankung, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthritis
und Gallensteine. Therapeutische Anwendungsgebiete für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und
Proteine und homologe erfindungsgemäße Nukleinsäuren und Proteine sind daher
beispielsweise, aber nicht ausschließlich: (i) Proteintherapeutika,
(ii) Zielantikörper
(therapeutische Antikörper,
diagnostische Antikörper,
Antikörper,
die gegen einen Wirkstoff gerichtet sind/zytotoxische Antikörper), (iii) Gentherapie
(Genverabreichung/Genablation) und (iv) Geweberegeneration in vitro
und in vivo (Regeneration all solcher Gewebe und Zelltypen, aus
denen diese Gewebe zusammengesetzt sind, und aus diesen Geweben
gewonnener Zelltypen).
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Proteine
sind für
therapeutische Anwendungen geeignet, die bei verschiedenen Anwendungsgebieten, wie
unten beschrieben, impliziert sind. Beispielsweise können cDNAs,
welche die erfindungsgemäßen Proteine
kodieren, und insbesondere ihre humanen Homologe, bei der Gentherapie
eingesetzt werden, und die erfindungsgemäßen Proteine und insbesondere
ihre humanen Homologe können
nützlich
sein, wenn sie einem Individuum verabreicht werden, das einen diesbezüglichen
Bedarf aufweist. Als nicht-einschränkendes Beispiel sind die Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung für
die Behandlung von Patienten wirksam, die beispielsweise, jedoch nicht
ausschließlich,
an Stoffwechselstörungen
wie oben beschrieben leiden.
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In
einem Aspekt können
beispielsweise Antikörper,
die für
ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine spezifisch sind, direkt als Antagonist oder
indirekt als Targeting- oder Abgabemechanismus verwendet werden,
um einen pharmazeutischen Stoff zu Zellen oder Gewebe zu bringen,
welche das Protein exprimieren. Die Antikörper können unter Anwendung von aus
dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren erzeugt werden. Solche
Antikörper
umfassen, jedoch nicht ausschließlich, polyklonale, monoklonale,
chimäre,
einzelkettige Antikörper,
Fab-Fragmente oder
Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek
produziert werden. Neutralisierende Antikörper (d. h. solche, die die
Bildung von Dimeren hemmen) sind für den therapeutischen Gebrauch
besonders bevorzugt.
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Für die Produktion
von Antikörpern
können verschiedene
Wirte, einschließlich
Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse,
Menschen und Andere durch Injektion mit einem erfindungsgemäßen Protein
oder einem beliebigen Fragment oder Oligopeptid davon, das immunogene
Eigenschaften hat, immunisiert werden. Je nach Art des Wirts können verschiedene Adjuvanzien
verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken. Es ist bevorzugt, dass
die zur Induktion von Antikörpern
verwendeten Peptide, Fragmente oder Oligopeptide eine Aminosäuresequenz aufweisen,
die aus mindestens fünf
Aminosäuren und
mehr bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren besteht.
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Monoklonale
Antikörper
können
mit jeder Technik erzeugt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch
kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht. Dazu gehören, jedoch
nicht ausschließlich,
die Hybridomatechnik, die humane B-Zell-Hybridoma-Technik und die
EBV-Hybridoma-Technik
(Köhler,
G. et al. (1975) Nature 256: 495–497; Kozbor, D. et al. (1985)
J. Immunol. Methods 81: 31–42; Cote,
R. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026–2030; Cole, S. P. et al. (1984)
Mol. Cell Biol. 62: 109–120).
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Darüber hinaus
können
Techniken verwendet werden, die für die Produktion von „chimären Antikörpern" entwickelt wurden,
das Splicing von Mausantikörpergenen
zu humanen Antikörpergenen zum
Erhalt eines Moleküls
mit geeigneter Antigenspezifität
und biologischer Aktivität
verwendet werden (Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
81: 6851–6855;
Neuberger, M. S. et al. (1984) Nature 312: 604–608; Takeda, S. et al. (1985)
Nature 314: 452–454).
Alternativ können
unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren Techniken
angepasst werden, die für
die Produktion einzelkettiger Antikörper beschrieben worden sind, um
spezifische einzelkettige Antikörper
zu produzieren. Antikörper
mit verwandter Spezifität,
aber von distinkter idiotypischer Zusammensetzung, können erzeugt
werden, indem eine Mischung von Ketten (Chain-Shuffling) aus zufälligen kombinatorischen Immunglobulinbibliotheken
durchgeführt
wird (Burton, D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120–3). Antikörper können auch
hergestellt werden, indem in vivo eine Produktion in der Lymphozytenpopulation induziert
wird oder indem rekombinante Immunglobulinbibliotheken oder Panels
hoch spezifischer Bindungsreagenzien, wie in der Literatur Orlandi,
R. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833–3837; Winter, G. et al. (1991)
Nature 349: 293–299)
beschrieben, durchsucht werden.
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Es
können
auch Antikörperfragmente
erzeugt werden, die spezifische Bindungsstellen für die Proteine
enthalten. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, jedoch nicht
ausschließlich
die F(ab')2-Fragmente, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls erzeugt
werden können,
und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken von
F(ab')2-Fragmenten
erzeugt werden können.
Alternativ können
Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden, um eine schnelle
und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten
Spezifität
zu ermöglichen
(Huse, W. D. et al. (1989) Science 254: 1275–1281).
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Es
können
verschiedene Immunassays für ein
Screening verwendet werden, um Antikörper mit der gewünschten
Spezifität
zu identifizieren. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Protokolle
für kompetitive
Bindungsassays und immunradiometrische Assays unter Verwendung von
polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit festgelegten Spezifitäten bekannt.
Solche Immunassays umfassen typischerweise die Messung der Komplexbildung zwischen
einem erfindungsgemäßen Protein
oder homologen Proteinen und deren spezifischem Antikörper. Ein
zweiseitiger Immunassay auf der Basis monoklonaler Antikörper, die
gegen zwei nicht wechselwirkende Proteinepitope reaktiv sind, ist
bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet
werden (Maddox, oben).
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung können
die Polynukleotide oder Fragmente davon oder Nukleinsäureeffektormoleküle wie beispielsweise
Antisense-Moleküle, Aptamere, RNAi-Moleküle oder
Ribozyme für
therapeutische Zwecke verwendet werden. In einem Aspekt können Aptamere,
d. h. Nukleinsäuremoleküle, die
an ein erfindungsgemäßes Protein
binden und dessen Aktivität
modulieren können,
mit einem Screening- und Auswahlverfahren erzeugt werden, das die
Verwendung kombinatorischer Nukleinsäurebibliotheken umfasst.
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In
einem weiteren Aspekt können
in Situationen, in denen es wünschenswert
wäre, die
Transkription der mRNA zu blockieren, Antisense-Moleküle der Polynukleotide
verwendet werden. Insbesondere können
Zellen mit Sequenzen transformiert werden, die zu Polynukleotiden
komplementär
sind, welche die Proteine kodieren. Antisense-Moleküle können daher
verwendet werden, um Proteinaktivität zu modulieren oder eine Regulierung
der Genfunktion zu erreichen. Eine solche Technologie ist nun aus
dem Stand der Technik gut bekannt, und Sense- oder Antisense-Oligomere oder größere Fragmente
können von
verschiedenen Stellen aus entlang den Kodierungs- oder Kontrollregionen
von Sequenzen, welche die Proteine kodieren, entworfen werden. Für die Abgabe
von Nukleotidsequenzen an das Zielorgan, Zielgewebe oder die Zielzellpopulation
können
Expressionsvektoren, die von Retroviren, Adenoviren, Herpes- oder
Vakziniaviren oder von verschiedenen bakteriellen Plasmiden abgeleitet
sind, verwendet werden. Zur Konstruktion von rekombinanten Vektoren,
die Antisense-Moleküle exprimieren,
welche zu den Polynukleotiden der Gene, welche die Proteine kodieren,
komplementär
sind, können
Verfahren verwendet werden, die einem Fachmann gut bekannt sind.
Diese Techniken sind sowohl in Sambrook et al. (oben) als auch in
Ausubel et al. (oben) beschrieben. Gene, welche ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine kodieren, können abgeschaltet werden, indem
eine Zelle oder ein Gewebe mit Expressionsvektoren transformiert
wird, welche hohe Mengen an Polynukleotid oder ein Fragment davon exprimieren,
das das Protein kodiert. Solche Konstrukte können verwendet werden, um nicht
translatierbare Sense- oder Antisense-Sequenzen in eine Zelle einzuführen. Selbst
ohne Integration in die DNA können
solche Vektoren fortfahren, RNA-Moleküle zu transkribieren, bis sie
von endogenen Nukleasen deaktiviert werden. Transiente Expression
kann bei einem nicht replizierenden Vektor einen Monat oder länger andauern,
und noch länger,
wenn geeignete Replikationselemente Teil des Vektorsystems sind.
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Wie
oben erwähnt,
lassen sich Modifikationen der Genexpression erhalten, indem Antisense-Moleküle, z. B.
DNA, RNA oder PNA, Nukleinsäureanaloga,
wie beispielsweise zu den Kontrollregionen der Gene, d. h. den Promotoren, Enhancern
und Introns, konzipiert werden. Oligonukleotide, die von der Transkriptionsinitiationsstelle
abgeleitet sind, z. B. zwischen Position –10 und +10 ausgehend von der
Startstelle, sind bevorzugt. Entsprechend lässt sich mit „Dreifach-Helix"-Basenpaarungsverfahren eine
Hemmung erreichen. Dreifach-Helix-Paarung ist geeignet, da sie eine
Hemmung der Fähigkeit
der Doppelhelix verursacht, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen,
Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen. Kürzliche
therapeutische Fortschritte unter Verwendung von Triplex-DNA sind
in der Literatur beschrieben (Gee, J. E. et al. (1994) in; Huber,
B. E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., USA). Die Antisense-Moleküle können auch
entworfen werden, um die Translation von mRNA zu blockieren, indem
sie verhindern, dass das Transkript an Ribosome bindet.
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Ribozyme,
enzymatische RNA-Moleküle, können auch
verwendet werden, um die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren.
Die Mechanismen der Ribozymwirkung umfassen sequenzspezifische Hybridisierung
des Ribozymmoleküls
an komplementäre
Ziel-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele, die
verwendet werden können,
umfassen gentechnisch hergestellte Ribozymmoleküle mit Hammerhead-Motiv, welche die
endonukleolytische Spaltung von Sequenzen, welche die Proteine kodieren,
spezifisch und effizient katalysieren. Spezifische Ribozymspaltungsstellen
in einem beliebigen potenziellen RNA-Zielmolekül werden zunächst identifiziert,
indem das Zielmolekül
auf Ribozymspaltungsstellen gescannt wird, die folgende Sequenzen
umfassen: GUA, GUU und GUC. Nach der Identifizierung können kurze
RNA-Sequenzen mit 15 bis 20 Ribonukleotiden, die der Region des Zielgens
mit der Spaltungsstelle entsprechen, auf sekundäre Strukturmerkmale untersucht
werden, welche das Oligonukleotid inoperabel machen. Die Eignung
von Kandidatenzielmolekülen
kann auch geprüft
werden, indem die Zugänglichkeit
für eine
Hybridisierung mit komplementären
Oligonukleotiden unter Verwendung von Ribonukleaseschutzassays getestet
wird.
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Nukleinsäureeffektormoleküle, z. B.
Antisense-Moleküle
und Ribozyme der Erfindung können
mit jedem aus dem Stand der Technik für die Synthese von Nukleinsäuremolekülen bekannten
Verfahren hergestellt werden. Dazu gehören Techniken für die chemische
Synthese von Oligonukleotiden, wie beispielsweise chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese. Alternativ
können
RNA-Moleküle
durch In-vitro- und
In-vivo-Transkription von DNA-Sequenzen hergestellt werden, welche
die Proteine kodieren. Solche DNA-Sequenzen können in verschiedene Vektoren
mit geeigneten RNA-Polymerasepromoteren,
wie beispielsweise T7 oder SP6, eingebaut werden. Alternativ können diese
cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar
synthetisieren, in Zelllinien oder Gewebe eingeführt werden. RNA-Moleküle können modifiziert
werden, um intrazelluläre
Stabilität
und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen
umfassen, jedoch nicht ausschließlich die Addition flankierender
Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder
die Verwendung von Phosphorothioat- oder 2'-O-Methyl- anstelle von Phosphodiesterase-Verknüpfungen
im Molekülgerüst. Dieses
Konzept der Produktion von PNAs inhärent und lässt sich bei all diesen Molekülen durch den
Einbau nicht klassischer Basen wie beispielsweise Inosin, Queosin
und Wybutosin sowie acetyl-, methyl-, thio- und ähnlich modifizierter Formen
von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die von endogenen
Endonukleasen nicht einfach erkannt werden, erweitern.
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Es
sind viele Verfahren zum Einführen
von Vektoren in Zellen oder Gewebe verfügbar und gleichermaßen zur
Anwendung in vivo, in vitro und ex vivo geeignet. Für eine Therapie
ex vivo können
Vektoren in Stammzellen eingeführt werden,
die dem Patienten entnommen und klonal für eine autologe Transplantation
zurück
in denselben Patienten propagiert worden sind. Die Verabreichung
durch Transfektion und durch Liposomeninjektion kann anhand von
Verfahren erreicht werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt
sind. Es kann jedes beliebige der oben beschriebenen therapeutischen
Verfahren bei jedem beliebigen geeigneten Individuum angewandt werden,
einschließlich
beispielsweise bei Säugern
wie Hunden, Katzen, Kühen,
Pferden, Kaninchen, Affen und am meisten bevorzugt beim Menschen.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für einen
beliebigen der oben erläuterten
therapeutischen Effekte. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen
können
ein erfindungsgemäßes Protein
oder homologe Proteine, Antikörper
gegen ein erfindungsgemäßes Protein oder
homologe Proteine, Mimetika, Agonisten, Antagonisten oder Hemmstoffe
eines erfindungsgemäßen Proteins
oder homologer Proteine, aufweisen. Die Zusammensetzungen können alleine
oder in Kombination mit mindestens einem anderen Mittel, wie beispielsweise
einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden, welche in
jedem sterilen, biologisch verträglichen
pharmazeutischen Trägerstoff
verabreicht werden kann, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Salzlösung, gepufferte
Salzlösung,
Dextrose und Wasser. Die Zusammensetzungen können dem Patienten alleine
oder in Kombination mit anderen Mitteln, Wirkstoffen oder Hormonen gegeben
werden. Die in dieser Erfindung verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen
können auf
beliebige Weise verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, auf
oralem, intravenösem,
intramuskulärem,
intra-arteriellem, intramedullärem,
intrathekalem, intraventrikulärem,
transdermalem, subkutanem, intraperitonealem, intranasalem, enteralem,
topilalem, sublingualem oder rektalem Weg.
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Außer den
aktiven Inhaltsstoffen können
diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch
annehmbare Trägerstoffe
enthalten, welche Exzipienten und Hilfsstoffe aufweisen, welche
die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungen, die
pharmazeutisch verwendbar sind, ermöglichen. Darüber hinaus
sind Einzelheiten über
Techniken zu Formulierungen und Verabreichung in der jüngsten Ausgabe
von Remington's Pharmaceutical
Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA, USA) zu finden.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf
eine Weise hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt
ist, z. B. durch herkömmliche
Misch-, Auflösungs-,
Granulations-, Drageeherstellungs-, Verreibungs-, Emulgierungs-,
Verkapselungs-, Einschluss- oder
Lyophilisierungsprozesse. Nach dem Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen
können
sie in einen geeigneten Behälter
platziert und für
die Behandlung eines indizierten Zustands gekennzeichnet werden.
Zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Proteins oder homologer
Proteine würde
eine solche Kennzeichnung Menge, Häufigkeit und Verabreichungsweg
enthalten.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die für
den erfindungsgemäßen Gebrauch
geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven
Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den beabsichtigten
Zweck zu erreichen. Die Festlegung einer wirksamen Dosis liegt im
Kompetenzbereich eines Fachmanns. Die therapeutisch wirksame Dosis
kann für
jede Verbindung zunächst entweder
in Zellkulturassays, z. B. an Präadipozytenzelllinien,
oder in Tiermodellen, in der Regel an Mäusen, Kaninchen, Hunden oder
Schweinen, eingeschätzt werden.
Das Tiermodell kann auch verwendet werden, um den geeigneten Konzentrationsbereich
und den Verabreichungsweg festzulegen. Solche Informationen können dann
verwendet werden, um geeignete Dosen und Verabreichungswege für Menschen
zu bestimmen. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf
die Menge eines aktiven Inhaltsstoffes, beispielsweise eines erfindungsgemäßen Proteins
oder homologer Proteine, von Fragmenten davon, von Antikörpern eines
erfindungsgemäßen Proteins
oder homologer Proteine, etc., die zur Behandlung eines bestimmten
Zustandes wirksam ist. Therapeutische Wirksamkeit und Toxizität können durch
pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren
ermittelt werden, z. B. ED50 (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch
wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die für 50% der Population letal
ist). Das Dosisverhältnis zwischen
therapeutischen und toxischen Wirkungen ist der therapeutische Index,
der als Verhältnis LD50/ED50
ausgedrückt
werden kann. Pharmazeutische Zusammensetzungen mit hohen therapeutischen
Indizes sind bevorzugt. Die aus den Zellkulturassays und Tierstudien
erhaltenen Daten werden zur Formulierung eines Dosisbereichs für den Gebrauch
beim Menschen verwendet. Die in solchen Zusammensetzungen enthaltene
Dosis liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs zirkulierender Konzentrationen,
der den ED50-Wert mit wenig oder keiner Toxizität einschließt. Die Dosierung variiert
innerhalb dieses Bereichs je nach der angewandten Dosisform, der
Empfindlichkeit des Patienten und der Verabreichungsart. Die exakte
Dosis wird vom Praktiker unter Berücksichtigung von Faktoren in
Verbindung mit dem Individuum, das eine Behandlung benötigt, festgelegt.
Dosis und Verabreichung werden angepasst, um ausreichende Mengen
der aktiven Einheit bereitzustellen oder um den gewünschten
Effekt aufrechtzuerhalten.
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Zu
berücksichtigende
Faktoren umfassen den Schweregrad des Krankheitszustandes, die allgemeine
Gesundheit des Individuums, Alter, Gewicht und Geschlecht des Individuums,
Ernährung,
Zeit und Häufigkeit
der Verabreichung, Wirkstoffkombination(en), Reaktionsempfindlichkeiten
und Verträglichkeit/Ansprechen
auf die Therapie. Langwirkende pharmazeutische Zusammensetzungen
können
je nach Halbwertszeit und Clearancerate der jeweiligen Formulierung
alle 3 bis 4 Tage, jede Woche oder einmal alle zwei Wochen verabreicht
werden. Normale Dosismengen können,
je nach Verabreichungsweg, von 0,1 bis 100.000 Mikrogramm bis zu
einer Gesamtdosis von etwa 1 g variieren. Leitlinien in Bezug auf
bestimmte Dosierungen und Verabreichungsverfahren sind in der Literatur
angegeben und einem praktizierenden Fachmann verfügbar. Ein
Fachmann verwendet für
Nukleotide andere Formulierungen als für Proteine oder deren Hemmstoffe.
Entsprechend ist die Verabreichung von Polynukleotiden oder Polypeptiden
spezifisch für
die jeweiligen Zellen, Bedingungen, Orte, etc.
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Die
Nukleinsäuren,
welche die erfindungsgemäßen Proteine
kodieren, können
verwendet werden, um transgene Zelllinien und Tiere zu erzeugen. Diese
transgenen nicht humanen Tiere sind bei der Untersuchung der Funktion
und Regulierung der erfindungsgemäßen Proteine in vivo nützlich.
Transgene Tiere, insbesondere transgene Säuger, können als Modellsystem für die Untersuchung
vieler entwicklungsbedingter und zellulärer Prozesse, die dem Menschen
eigen sind, dienen. Es können
viele verschiedene nicht humane Modelle für Stoffwechselstörungen verwendet
werden, um Modulatoren des erfindungsgemäßen Proteins zu testen. Fehlexpression
(beispielsweise Überexpression
oder Mangel an Expression) des erfindungsgemäßen Proteins, insbesondere
Fütterungsbedingungen
und/oder Verabreichung biologisch aktiver Verbindungen können Modelle
für Stoffwechselstörungen erzeugen.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung verwenden solche Assays Mausmodelle für Insulinresistenz
und/oder Diabetes, wie beispielsweise Mäuse mit Gen-Knockouts im Leptin-Signalweg (beispielsweise
ob(Leptin)- oder db(Leptinrezeptor)-Mäuse). Solche Mäuse entwickeln
typische Symptome eines Diabetes, weisen eine Lipidansammlung in
der Leber auf und häufig
erhöhte
Plasmalipidspiegel (siehe Bruning et al., 1998, Mol. Cell. 2: 449–569). Anfällige Wildtypmäuse (beispielsweise
C57Bl/6) zeigen ähnliche
Symptome, wenn sie eine fetthaltige Nahrung erhalten. Außer zur
Testung der Expression der erfindungsgemäßen Proteine in solchen Mausstämmen (siehe
Abschnitt BEISPIELE) können
diese Mäuse auch
verwendet werden um zu testen, ob die Verabreichung eines Kandidatenmodulators
beispielsweise die Lipidansammlung in der Leber, im Plasma oder
im Fettgewebe ändert,
indem aus dem Stand der Technik bekannte Standardassays verwendet werden,
wie beispielsweise FPLC, kolorimetrische Assays, Tests des Blutglukosespiegels,
Insulintoleranztests und andere.
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Transgene
Tiere können
durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen hergestellt
werden, in denen der normale Lokus des Gens, welches das erfindungsgemäße Protein
kodiert, mutiert ist. Alternativ wird ein Nukleinsäurekonstrukt, welches
das Protein kodiert, in Ooozyten injiziert und wird zufällig in
das Genom integriert. Man kann die erfindungsgemäßen Gene oder Varianten davon auch
in Geweben exprimieren, in denen sie normalerweise nicht exprimiert
werden, oder zu anomalen Zeiten während der Entwicklung. Darüber hinaus können Varianten
der erfindungsgemäßen Gene, beispielsweise
spezifische Konstrukte, die Antisense-Moleküle oder dominant negative Mutationen
exprimieren, welche die Expression der erfindungsgemäßen Proteine
blockieren oder verändern,
zufällig in
das Genom integriert werden. Ein feststellbarer Marker, wie beispielsweise
Lac Z oder Luziferase, kann in den Lokus der erfindungsgemäßen Gene
eingeführt
werden, wobei die Hochregulierung der Expression der erfindungsgemäßen Gene
zu einer leicht feststellbaren Veränderung des Phänotyps führt. Vektoren
für eine
stabile Integration umfassen Plasmide, Retroviren und andere Tierviren,
YACs (Yeast Artifical Chromosomes) und dergleichen. DNA-Konstrukte
für eine
homologe Rekombination enthalten mindestens Anteile der erfindungsgemäßen Gene
mit der gewünschten
genetischen Modifikation und enthalten Regionen der Homologie mit dem
Ziellokus. Praktischerweise sind Marker für positive und negative Selektion
enthalten. DNA-Konstrukte für
eine zufällige
Integration brauchen keine Homologieregionen zu enthalten, um eine
Rekombination zu vermitteln. DNA-Konstrukte für eine zufällige Integration bestehen
aus den Nukleinsäuren,
welche die erfindungsgemäßen Proteine
kodieren, einem regulatorischen Element (Promotor), einem Intron
und einem Polyadenylierungssignal. Verfahren zum Erzeugen von Zellen
mit Modifikationen des Zielgens durch homologe Rekombination sind
aus dem Stand der Technik bekannt.
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Für embryonale
Stammzellen (ES-Zellen) kann eine ES-Zelllinie verwendet werden, oder es können embryonale
Zellen frisch aus einem Wirt, z. B. einer Maus, Ratte, Meerschwein,
etc. erhalten werden. Solche Zellen werden auf einer geeigneten Fibroblasten-Feeder-Schicht
in Gegenwart von LIF (Leukemia Inhibiting Factor) gezüchtet. ES
bzw. embryonale Zellen können
transfiziert und anschließend verwendet
werden, um transgene Tiere herzustellen. Nach der Transfektion werden
die ES-Zellen auf einer Feederschicht in einem geeigneten Medium
ausgestrichen. Zellen, die das Konstrukt enthalten, können durch
Verwendung eines Selektionsmediums ausgewählt werden. Nachdem die Kolonien
ausreichend lange Zeit wachsen konnten, werden sie gepickt und hinsichtlich
des Stattgefundenhabens einer homologen Rekombination analysiert.
Positive Kolonien können
dann zur Manipulierung von Embryonen und Morula-Aggregation verwendet
werden. In Kürze werden
Morulae aus 4 bis 6 Wochen alten superovulierten weiblichen Tieren
entnommen, die Zona pellucida entfernt und die Morulae in kleine Vertiefungen einer
Gewebekulturschale gegeben. Die ES-Zellen werden trypsiniert, und die modifizierten
Zellen werden in die Vertiefungen dicht neben die Morulae gegeben.
Am folgenden Tag werden die Aggregate in das Uterushorn scheinschwangerer
Weibchen übertragen.
Die Weibchen können
anschließend
normal austragen. Chimäre
Nachkommen können
einfach an einer Veränderung
der Fellfarbe erkannt werden und werden anschließend hinsichtlich einer Weitergabe
der Mutation auf die nächste
Generation (F1-Generation) untersucht. Die Nachkommen der F1-Generation
werden auf Vorhandensein des modifizierten Gens untersucht, und
männliche
und weibliche Tiere, welche die Modifikationen aufweisen, werden
gekreuzt, um homozygote Nachkommen zu erhalten. Wenn die Genveränderungen
an einem bestimmten Punkt während
der Entwicklung Letalität verursachen,
können
Gewebe oder Organe als allogene oder kongene Grafts bzw. Transplantate
oder als In-vitro-Kultur behalten werden. Bei den transgenen Tieren
kann es sich um beliebige nicht humane Säuger handeln, beispielsweise
um ein Labortier, Haustiere, etc., beispielsweise Mäuse, Ratten,
Meerschweine, Schafe, Kühe,
Schweine und andere. Die transgenen Tiere können bei Funktionsuntersuchungen,
Wirkstoffuntersuchungen und anderen Anwendungen verwendet werden
und sind bei der Untersuchung der Funktion und Regulation der erfindungsgemäßen Proteine
in vivo nützlich.
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Die
Figuren zeigen:
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1 zeigt
den Triglyzeridgehalt einer Spermidinsynthase (GadFly Zugangsnummer CG8327)-Mutante.
Gezeigt ist der Anstieg des Triglyzeridgehalts von EP(3)3054-Fliegen
(bezeichnet als „EP(3)3054"), verursacht durch
homozygote lebensfähige
Integration des P-Vektors im Vergleich zu Kontrollen mit Integration
dieses Vektortyps an anderer Stelle im Genom (bezeichnet als „EP-Kontrolle").
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2 zeigt
die molekulare Organisation des mutierten Spermidinsynthase (Gadfly
Zugangsnummer CG8327)-Genlokus.
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3 zeigt
die Säugerhomologe
von GadFly Zugangsnummer CG8327.
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3A zeigt
das BLASTP-Suchergebnis für das
CG8327-Genprodukt
(Query) mit dem besten humanen Homologtreffer (Sbject).
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3B zeigt
die Nukleinsäuresequenz
der humanen Spermidinsynthase (SEQ ID Nr: 1; GenBank Zugangsnummer
NM_003132).
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3C zeigt
die Aminosäuresequenz
(Einbuchstabencode) der humanen Spermidinsynthase (SEQ ID Nr: 2;
GenBank Zugangsnummer NP 003123).
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3D zeigt
das Clustal X (1.81)-Proteinsequenzalignment für die humane Spermidinsynthase (bezeichnet
als „Hs
NP_003123"), die
murine Spermidinsynthase (bezeichnet als „Mm NP_033298") und die Drosophila-Spermidinsynthase
(bezeichnet als „Dm
CG8327"). Lücken im
Alignment sind als „–" dargestellt.
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4 zeigt
die Expression der Spermidinsynthase in Säugergeweben. Die relative RNA-Expression
ist auf der Y-Achse
gezeigt. In 4A und B sind die getesteten
Gewebe auf der X-Achse dargestellt. „WAT" bezieht sich auf weißes Fettgewebe, „BAT" bezieht sich auf
braunes Fettgewebe. In 4C und D gibt die X-Achse die
Zeitachse an. „d0" bezieht sich auf
Tag 0 (Versuchsbeginn), „d2" bis „d10" bezieht sich auf
Tag 2 bis Tag 10 der Adipozytendifferenzierung.
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4A:
Echtzeit-PCR-Analyse der Expression von Spermidinsynthase in Wildtyp-Mausgeweben.
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4B:
Echtzeit-PCR-vermittelte Analyse der Expression von Spermidinsynthase
in verschiedenen Mausmodellen.
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4C:
Echtzeit-PCR-vermittelte Analyse der Expression von Spermidinsynthase
während
der Differenzierung von 3T3-L1-Zellen
von Präadipozyten
zu reifen Adipozyten
-
4D:
Echtzeit-PCR-vermittelte Analyse der Expression von Spermidinsynthase
während
der Differenzierung von 3T3-F442A-Zellen
von Präadipozyten
zu reifen Adipozyten.
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Die
Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
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Beispiel 1: Messung des
Triglyzeridgehalts
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Mutante
Fliegen werden aus einer proprietären Fliegenmutations-Stammsammlung
und einer öffentlich
verfügbaren
Stammsammlung erhalten. Die Fliegen können unter einem Fachmann bekannten Standardbedingungen
wachsen. Im Verlauf des Experimentes werden zusätzliche Fütterungen mit Bäckerhefe
(Saccharomyces cerevisiae) bereitgestellt. Die durchschnittliche
Erhöhung
des Triglyzeridgehalts von Drosophila, enthaltend die EP-Vektoren
in homozygoter oder hemizygoter lebensfähiger Integration, wurde im
Vergleich zu Kontrollfliegen untersucht (siehe 1).
Zur Bestimmung von Triglyzeriden wurden die Fliegen unter Verwendung
eines Wasserbads 5 Min. bei 90°C
in einem wässrigen
Puffer inkubiert, gefolgt von Heißextraktion. Nach weiteren
5 Min. Inkubation bei 90°C
und schwacher Zentrifugation wurde der Triglyzeridgehalt des Fliegenextraktes
mit dem Triglyzeridtest von Sigma (INT 336-10 oder -20) durch Messung
von Änderungen der
optischen Dichte nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Als
Bezugswert wurde der Proteingehalt desselben Extraktes mit dem DC-Proteinassay von
BIO-RAD nach dem Protokoll des Herstellers gemessen. Der Assay wurde
dreimal wiederholt.
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Der
durchschnittliche Triglyzeridgehalt aller Fliegen der EP-Sammlungen
(bezeichnet als „EP-Kontrolle") ist als 100% im
ersten Balken von 1 einschließlich Standardabweichung gezeigt.
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EP(3)3054-homozygote
Fliegen zeigen konstant einen höheren
Triglyzeridgehalt als die getesteten Kontrollfliegen (Balken 2 in 1).
Der Verlust an Genaktivität
auf dem Lokus 85E4 auf Chromosom 3R, auf dem der EP-Vektor von EP(3)3054-Fliegen homozygot
lebensfähig
integriert ist, ist daher für
Veränderungen
des Stoffwechsels der Energiespeichertriglyzeride verantwortlich.
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Beispiel 2: Identifikation
von Drosophila-Genen, die mit Stoffwechselkontrolle assoziiert sind.
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Die
Nukleinsäure,
welche das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, wurde mit
einer Plasmid-Rescue-Technik identifiziert. Es wurde eine genomische
DNA-Sequenz isoliert, die neben der Integrationsstelle des EP-Vektor
lokalisiert ist (hierin EP(3)3054). Mit dieser isolierten genomischen
Sequenz wurden öffentliche
Datenbanken wie beispielsweise das Berkeley Drosophila Genome Project (GadFly)
durchsucht, wodurch die Integrationsstellen des Vektors und das
entsprechende Gen identifiziert wurden. Die molekulare Organisation
dieses Lokus ist in 2 gezeigt.
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In 2 ist
die genomische DNA-Sequenz in der Anordnung als eine gestaffelte
schwarze Linie in der Mitte dargestellt (die Zahlen geben die Länge der genomischen
DNA in Basenpaaren wieder), welche die Integrationsstelle des Vektors
für Linie
EP(3)3054 aufweist. Eine transkribierte DNA-Sequenz (EST) und prognostizierte
Gene sind als Balken darüber
gezeigt (Sense-Strang). Prognostizierte Exons der cDNA mit GadFly
Zugangsnummer CG8327 sind als dunkelgraue Balken und Introns als
hellgraue Linien gezeigt. Die Sequenz kodiert ein Gen, das von GadFly-Sequenzanalyseprogrammen
als Zugangsnummer CG8327 vorhergesagt wird. Es wurden öffentliche
DNA-Sequenzdatenbanken
(beispielsweise NCBI GenBank) durchsucht, wodurch die Integrationsstelle
von Linie EP(3)3054 identifiziert wurde, die einen Anstieg des Triglyzeridgehalts
verursacht. EP(3)3054 ist in die erste cDNA in Antisense-Ausrichtung
der cDNA mit Zugangsnummer CG8327 integriert (die Integrationsstelle
ist in der unteren Hälfte der
Figur als Dreieck gezeigt). Die Expression der cDNA, die Zugangsnummer
CG8327 kodiert, könnte daher
durch homozygote lebensfähige
Integration von Vektoren von Linie EP(3)3054 beeinflusst werden,
was zu einem Anstieg der Energiespeichertriglyzeride führt.
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Beispiel 3: Identifizierung
humaner homologer Gene und Proteine
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Die
Drosophila-Gene und die von ihnen kodierten Proteine mit Funktionen
bei der Regulierung des Triglyzeridstoffwechsels wurden durch Anwendung
des BLAST-Algorithmus
bei der Suche in öffentlich
verfügbaren
Sequenzdatenbanken weiter analysiert, und es wurden Säugerhomologe
identifiziert (siehe 3).
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Wie
in 3A gezeigt, ist das Genprodukt von Drosophila
CG8327 über
283 Aminosäuren
(von 302 Aminosäuren)
zu 76% homolog zu einer humanen Spermidinsynthase-l; SRM; GenBank
Zugangsnummer NM_003132 für
die cDNA, NP_003123 für das
Protein). Darüber
hinaus ist das Genprodukt von Drosophila CG8327 über 283 Aminosäuren (von
302 Aminosäuren)
zu 76% homolog zur murinen Spermidinsynthase (GenBank Zugangsnummer NM_009272
für die
cDNA, NP_033298 für
das Protein). In 3B und 3C sind
die Nukleinsäure-
und Aminosäuresequenzen
der humanen Spermidinsynthase gezeigt. 3D zeigt
ein Clustal X (1.81) Proteinalignment von Spermidinsynthase-Homologen von
Mensch, Maus und Drosophila.
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Beispiel 4: Experimente
zur Erstellung eines Expressionsprofils
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Zur
Analyse der Expression der in dieser Erfindung beschriebenen Polypeptid
in Säugergeweben
wurden mehrere Mausstämme
(vorzugsweise die Mausstämme
C57Bl/6J, C57Bl/6 ob/ob und C57Bl/KS db/db, bei denen es sich um
Standardmodellsysteme in der Adipositas- und Diabetesforschung handelt)
von Harlan Winkelmann (33178 Borchen, Deutschland) erworben und
unter konstanter Temperatur (vorzugsweise 22°C), 40 Prozent Luftfeuchtigkeit und
einem Licht/Dunkel-Zyklus von vorzugsweise 14/10-Stunden gehalten. Die Mäuse erhielten
ein Standardfutter (beispielsweise von ssniff Spezialitäten GmbH,
Bestellnummer ssniff M-Z V1126-000). Für das Nüchtern-Experiment („Mäuse nach Fastenperiode") wurde Wildtypmäusen für 48 Std.
das Futter entzogen, und die Tiere erhielten nur Wasser ad libitum
(siehe beispielsweise Schnetzler et al. J Clin Invest 1993 Jul;
92(1): 272–80,
Mizuno et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996 Apr 16; 93(8): 3434–8). Die
Tiere wurden in einem Alter von 6 bis 8 Wochen getötet. Die
Gewebe der Tiere wurden nach Standardverfahren, die einem Fachmann
bekannt sind, entnommen, in Flüssigstickstoff
schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80°C aufbewahrt.
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Zur
Analyse der Rolle der in dieser Erfindung beschriebenen Proteine
bei der In-Vitro-Differenzierung verschiedener Säugerzellkulturzellen zur Verwandlung
von Präadipozyten
zu Adipozyten wurden Säugerfibroblastenzellen
(3T3-L1-Zellen) (z. B. Green & Kehinde,
Cell 1: 113–116,
1974) von der American Tissue Culture Collection (ATCC, Hanassas,
VA, USA; ATCC-CL 173) erhalten. 3T3-L1-Zellen wurden als Fibroblasten
gehalten und differenzierten zu Adipozyten wie im Stand der Technik
beschrieben (z. B. Qiu. et al., J. Biol. Chem. 276: 11988–95, 2001;
Slieker et al., BBRC 251: 225-9, 1998). Zu verschiedenen Zeitpunkten
des Differenzierungsvorgangs, beginnend an Tag 0 (Tag der Konfluenz)
und Tag 2 (Hormonzugabe, beispielsweise Dexamethason und 3-Isobutyl-1-methylxanthin)
bis zu Tag 10 der Differenzierung, wurden alle zwei Tage geeignete
Teilmengen an Zellen entnommen. Alternativ wurden 3T3-F442A-Säugerfibroblastenzellen (z.
B. Green & Kehinde,
Cell 7: 105–113,
1976) von der Harvard Medical School, Department of Cell Biology
(Boston, MA, USA) erhalten. 3T3-F442A-Zellen wurden
als Fibroblasten gehalten und differenzierten zu Adipozyten wie
zuvor beschrieben (Djian, P. et al., J. Cell. Physiol., 124: 554–556, 1985).
Zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsvorgangs, beginnend
an Tag 0 (Tag der Konfluenz und Hormonzugabe, beispielsweise Insulin)
bis zu Tag 10 der Differenzierung, wurden alle zwei Tage geeignete
Teilmengen an Zellen entnommen. 3T3-F442A-Zellen differenzieren
in vitro bereits im konfluenten Stadium nach der Zugabe von Hormon
(Insulin).
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RNA
wurde aus Mausgeweben oder Zellkulturzellen mit Trizol Reagens (beispielsweise
von Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) isoliert und mit dem RNeasy-Kit
(beispielsweise von Qiagen, Deutschland) in Kombination mit einer
DNase-Behandlung nach den Anleitungen des Herstellers und wie einem Fachmann
bekannt weiter gereinigt. Gesamt-RNA wurde revers transkribiert
(vorzugsweise mit der Superscript II RNaseH – Reversen Transkriptase von
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) und einer Taqman-Analyse unterzogen,
vorzugsweise unter Verwendung des Taqman 2 × PCR Master Mix (von Applied
Biosystems, Weiterstadt, Deutschland; die Mischung enthält herstellergemäß beispielsweise
AmpliTaq Gold DNA Polymerase, AmpErase UNG, dNTPS mit dUTP, Passivreferenz
Rox und optimierte Pufferbestandteile) auf einem GeneAmp 5700 Sequenznachweissystem
(von Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland).
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Taqman-Analyse
von Spermidinsynthase (Srm) wurde vorzugsweise unter Verwendung
folgender Primer/Sondenpaare durchgeführt: Maus-Srm-Vorwärtsprimer
(Seq ID Nr.: 28) 5'- CCG TGC CGC CTT
CGT AC -3'; Maus-Srm-Rückwärtsprimer
(Seq ID Nr.: 29) 5'-
ACC TGG ATT CAG CTT ATG TCA TTG -3'; Maus-Srm-Taqman-Sonde (Seq ID Nr.: 30) (5/6-FAM)
CCT GAG TTC ACC CGG AAG GCC C (5/6-TAMRA).
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Echtzeit-PCR
(Taqman)-Analyse der Expression von Spermidinsynthase in Säugergeweben (Mausgeweben)vergab,
dass Spermidinsynthase in vielen adulten Mausgeweben exprimiert
wird, einschließlich
WAT und BAT (4A). Das hohe Expressionsniveau
von Spermidinsynthase in diesen Geweben deutet darauf hin, dass
die Spermidinsynthase am Stoffwechsel von Geweben beteiligt ist,
die für
das metabolische Syndrom relevant sind. Die Expression von Spermidinsynthase
in braunem Fettgewebe wird vom Stoffwechsel reguliert; In genetisch adipösen (ob/ob)-Mäusen ist die Expression im
Vergleich zum Wildtyp-Niveau moderat induziert (4B).
Darüber
hinaus wird die Expression von Spermidinsynthase während der
In-Vitro-Differenzierung
von 3T3-L1-Zellen sowie bei einem weiteren Modellsystem für die In-Vitro-Differenzierung
von Präadipozyten
zu Adipozyten, der 3T3-F442A-Zelllinie, reguliert (4C und 4D).
Während
die Spermidinsynthase in 3T3-L1-Zellen eine transiente Hochregulierung
ihrer Expression zeigt, wird in 3T3-F442A-Zellen eine stabile Hochregulierung
ihrer Expression beobachtet. Die Spermidinsynthase wird am Ende
der klonalen Expansionsphase der Präadipozytendifferenzierung hochreguliert.
Dies lässt
den Schluss zu, dass die Spermidinsynthase beim Einsetzen der endgültigen Adipozytenreifung
benötigt wird
(siehe 4C und 4D).