KR20040018317A

KR20040018317A - 골관절염 치료 및 연골 재생을 위한 스페르미딘 신타제의억제제

Info

Publication number: KR20040018317A
Application number: KR10-2003-7007862A
Authority: KR
Inventors: 디재닛 바; 엘레나 페밍스테인; 오리트 세게브
Original assignee: 시오노기 앤드 컴파니, 리미티드
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2004-03-03
Also published as: IL156405A; AU2002246650A1; US6696454B2; JP2004517902A; EP1357881A4; US20040229886A1; US20020160978A1; WO2002058623A3; IL156405A0; CN1525818A; WO2002058623A2; EP1357881A2

Abstract

본 발명은 골관절염 치료가 필요한 대상에게 스페르미딘 생합성 억제제를 실질적으로 스페르미딘 생합성의 억제에 충분한 효과가 있는 양으로 투여하여 상기 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 골관절염 치료가 필요한 대상의 치료에 스페르미딘 생합성 억제제를 실질적으로 스페르미딘 생합성의 억제에 충분한 효과가 있는 양으로 사용하는 방법도 제공한다. 본 발명은 그 밖에도, 골관절염 치료가 필요한 대상에게 실질적으로 스페르미딘 생합성의 억제에 충분한 효과가 있는 양의 스페르미딘 생합성 억제제 및 담체를 포함하는 치료 조성물과 또한, 스페르미딘 생합성의 억제제를 확인하는 방법도 제공하며 이 때의 억제제는 스페르미딘 신타제 억제제이다.

Description

골관절염 치료 및 연골 재생을 위한 스페르미딘 신타제의 억제제 {INHIBITORS OF SPERMIDINE SYNTHASE FOR THE TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS AND CARTILAGE REHABILITATION}

골관절염(OA)는 통상적으로 현재 비용이 많이 들고 치료불가능한 쇠약성 질병이다. 이 질병의 치료에 관한 새로운 접근이 크게 요구되고 있다. 이 질병은 관절 연골조직 내에서의 연골세포의 이상기능, 이들의 말단 미분화 및 골 형성의 개시, 및 정상 연골조직 기질의 파괴 등을 특징으로 한다. 통상의 어버이 세포로부터시작되는 연골형성 및 골형성시 생성물이 수반되는 유전자, 연골세포의 말단 미분화를 결정하는 유전자, 또한 연골성 기질의 파괴를 트리거(trigger)할 생성물이 수반되는 유전자 등이 치료 조절을 위한 후보가 될 것이 명백하다.

OA 유행성

퇴행성 관절질병 이라고 잘못 알려지기도 한 OA는 관절형 (이동성, 활액분비선) 관절의 불량으로 나타난다. 가장 일반적인 형태의 질병인 특발성 (초기) OA에 있어서는, 소인적 변수가 나타나지 않는다. 2차적 OA는 병원학적으로 특발성 OA와 뚜렷이 구별되지 않으나 한가지 잠재적 원인에 기인한다. OA는 모든 인간의 관절질환에서 가장 공통적인 현상이며 또한 미국뿐만 아니라 전세계적으로 노화성 관절염 상태를 나타내는 가장 일반적인 것이다. 각종 연구에서의 임상적 평가에 근거한 OA 전개의 평가 결과 70세 이상의 인구중 90% 이상이 OA를 앓고 있다. 본 발명은 상기 질병의 치료 및 예방을 위한 새로운 방법을 목적으로 하는 것이다.

OA 병원론

OA는 관절연골의 결함 상태에 관련한 관절증세 및 징후, 또한 이에 관련하는 관절끝에 있는 기초골의 변화를 유도하는 이상 상태이다. OA는 다른 의학적 상태들 (염증성, 생화학적, 내분비관련성, 대사성 및 해부학적 혹은 진행성 이상상태)로 이행되는 특발성 (즉, 1차) 혹은 2차 질병일 수 있다. 노화는 OA에 대한 가장 강력한 위험 인자이나 심한 외상 및 반복적인 관절 사용 역시 OA에 있어서 중요한 위험 인자이다. OA에 관절이 연계될 수 밖에 없는 패턴 역시 본업이나 부차적인 과하중의 영향을 받게 된다.

상기 질병은 두가지 일반적인 단계를 갖는다; (1) 보정 및 (2) 보정 부전. 현재, 대부분의 연구자들은 외인성 요인 (예, 하중이나 부상 등)으로 인해 연골의 세포외 기질에서 1차 변화가 일어나는 것을 알고 있다. 이에, 연골의 콜라겐망 상의 결함이 나타나고 리소좀형 효소 및 분비된 단백질분해효소 (MMPs, 플라스민, 카텝신 등)가 관측된 연골 기질 상의 초기 변화를 설명해준다. 이들의 합성 및 분비는 IL-1 혹은 기타의 인자들 (예, 기계적 자극 등)에 의해 자극된다. 질병의 초기단계에서, 보정형 세포 반응이 활성화된다. 연골세포에서 분비된 TIMP 및 PAI-1 같은 프로테아제 억제제가 프로테아제 활성에 대항하여 계를 안정화하기 위한 작용을 한다. IGF-1 및 TGF-β 같은 성장인자들은 병변을 치유하거나 적어도 연골세포 계통의 세포 증식을 활성화시켜 안정화하는 회복 과정에서 제 역할을 한다. 결국, 이것은 비대한 연골세포의 축적을 유도하는 것이다. 후자인 연골세포는 연골의 밀집화에 연관되는 프로테오글리칸(PG) 농도의 증대시 발현되는 생합성적 활성도를 표시했다 ("보상" OA). 보상 기전은 관절을 수년간 적절한 기능적 상태로 유지한다. 그러나, 회복 조직은 유지되지 않으며 PG 합성 속도 역시 연골의 전체 밀집도 상실과 함께 저하된다. 이것이 OA의 부상불가 단계를 나타내는 것이다. 관절 연골의 파괴에 뒤이어 어버이 세포가 조직 손상 부위로 이동한다. 이 세포들은 증식하여 4개의 세포종류 즉; 조골세포, 연골모세포, 콘드로클라스트(chondroclast) 및 섬유아세포로 분화하며, 이들은 서로 조합하여 관절 공간 속에 돌출하는 골증식체 라고 하는 골조직을 형성하며 그 이동을 억제한다. 결국, 연골이 점진적으로 골로 대체되는 현상이 발생하는 것이다.

이러한 현상의 이유는 아직 밝혀진 바가 없다. 한가지 가능성은 OA 내에서 관절의 연골세포 혹은 활액분비막 섬유아세포의 정상적인 억제적 성장 제어가 변화한다는 것이다. 이는 정상적인 관절 연골에서는 발견되지 않는 2종류의 세포 축적을 가능하게 한다: 즉, (1) 변성력을 갖는 미성숙 중간엽(mesenchymal) 및 골수세포, 또한 (2) 비대성 관절 연골세포이다. 과거의 연구 결과에 따르면 비대성 연골세포는 다혈관 형성 및 골형성 인자들의 분비에 의해 골형성 작용을 트리거 할 수 있음이 입증되었다 (Horner, A., Bishop, N.J. Bord S., Beeton, C., Kelsall, A.W., Coleman, N. and Compston, J.E. (1999). 인간 신생아 성장판 연골 내의 세포내피성 성장인자(VEGF)의 면역국소화(immunolocalisation). J. Anat. 194:519-524 참조)

OA에서, 치료적 방해는 다음의 3가지 주요 과정을 타겟으로 한다:

*초기 연골 손상의 억제- 수용가능한 치료적 방안 중 하나로서, 관절에 가해지는 물리적 압력을 감소시키는 권고사항 및 금속성 단백질 분해효소의 억제제를 이용하여 치료하는 방법을 조합한다.

*이보다 후기일 때 전체 연골 파괴의 억제 혹은 약화- 연골 재생에 관련되는 과정의 치료활성화 즉, 중간엽 어버이 세포를 완전한 기능적 관절 연골조직을 생성할 수 있는 성숙 연골세포로 적절히 분화하는 것을 촉진하는 것이다.

*질병의 최종 단계에서 골증식체 형성의 억제 혹은 약화- 관절 연골의 부위에서의 이탈형 골형성을 치료학적으로 억제한다.

따라서, 본 발명자들은 어버이 세포가 연골세포로 분화하는 것을 자극 혹은억제하고 또한/또는 조골세포로 분화하는 것을 자극 혹은 억제하는 특이적 인자를 코드할 타겟 유전자를 확인하는 것을 목적으로 한다.

현재 골형성 인자로 알려진 IL-1, FGF-2 및 기계적 응력에 의해 야기된 유전자 발현의 변화는 OA 의 성장에 관계되며 따라서 치료적 방해로써 대항해야 한다. 놀랍게도 본 발명자들은 FGF-2에 의해 성장조절된 유전자 중 하나가 스페르미딘 신타제 유전자임을 발견하였다. 이것은 스페르미딘 신타제 유전자가 OA 경로에 수반한다는 예측을 가능하게 하는 것이다.

스페르미딘 신타제

스페르미딘은 3가지 생활성 폴리아민 중 하나로서 다른 두개는 푸트레신(putrescine) 및 스페르민(spermine)이다. 폴리아민류는 세포증식 및 세포분화의 조절에서 중요한 역할을 하는 세포성분 집단을 구성한다. 이들의 정확한 작용은 아직까지 명확히 밝혀진 바가 없으나, 폴리아민이 다수의 세포성 과정 예컨대, 복제, 전사 및 번역 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다.

폴리아민 생합성 경로는 2가지의 고도로 조절된 효소 즉, 오르니틴 디카르복실라제와 S-아데노실메티오닌 디카르복실라제로 구성되며 또한, 구성상에서 발현되는 2개의 효소 즉, 스페르미딘 신타제 및 스페르민 신타제를 포함한다. 스페르미딘 신타제는 74kDa 단백질로서 푸트레신(1,4-디아미노부탄)의 3-아미노프로필화 반응을 촉매화시켜 스페르미딘을 생성하는 것이다. 스페르미딘의 생합성 반응은 SAM 디카르복실라제에 의하여 S-아데노실메티오닌 (SAM)이 S-아데노실-3-메틸티오프로판아민으로 탈카르복실화 하는 반응과 또한, 오르니틴 디카르복실라제에 의하여 오르니틴이 푸트레신으로 탈카르복실화 하는 반응을 수반한다. 탈카르복실화한 SAM은 그 뒤 스페르미딘 신타제와 반응하여 아미노프로필화 형태의 효소를 생성하고 이것은 다시 아미노프로필기를 푸트레신으로 전환시켜 스페르미딘 및 5'-메틸티오아데노신(MTA)을 생성하게 된다. 활성 효소는 2개의 동일한 서브유닛의 다이머로서 공통인자(cofactor)를 필요로 하지 않으며 아미노프로필 공여체인 deAdoMet 및 수용체인 푸트레신을 사용한다.

푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민은 연골을 포함한 다수의 생조직에서 발견되었다. ODC에 의해 촉매화 된 이들의 형성은 뼈 속에서 연골 변형이 유도되는 과정에서 관측되었다. 부갑상성 호르몬은 배양조직 내에서 분화된 래빗 늑골 연골세포 내의 글리코사미노글리칸의 합성을 자극하고, ODC 활성을 유발하며 폴리아민 레벨을 증가시킨다. 휴지 상태의 연골은 푸트레신이 결여되어 있다. 골화 연골에는 나머지 영역보다 더 많은 폴리아민이 함유되어 있다 (조직의 무게 및 DNA 함량에 기초하여). 골화 영역의 스페르미딘의 양은 5배 더 많고 스페르민의 2배에 해당한다. 스페르미딘/스페르민의 비는 골화 연골에서 1.7 및 나머지 영역에서는 0.69로 나타났다. 스페르미딘은 세파로스 4B-II종 콜라겐 컬럼으로부터 나온 프로테오글리칸 서브유닛을 여과하는 능력을 보여주었다 (Franco Vittur et al. (1986), A possible role for polyamines in cartilage in the mechanism of cacification. Biochimica et Biophysica Acta 881:38-45 참조).

프로테오글리칸 유닛과 콜라겐의 상호작용에 대한 폴리아민의 영향은 프로테오글리칸 서브유닛을 채운 세파로스 4B-콜라겐 컬럼에서 얻은 프로테오글리칸 용출물을 통해 연구조사했다. 푸트레신 및 스페르민은 영향을 받지 않았으나 스페르미딘은 프로테오글리칸 서브유닛 여과에 큰 능력을 보여 주었다: 약 90%의 프로테오글리칸 서브유닛이 컬럼에서 제거되었다. 스페르민 및 스페르미딘은 연골에서 생성된 알칼리성 포스파타제의 활성을 증대시켰다. 스페르미딘은 예비골형성 연골의 나머지 영역에 있는 세포에서 관측되었다. 세포 염색성이 사라졌고 증식 및 컬럼 세포의 영역에 접근하였다. 스페르미딘 염색은 연골세포의 비대화가 시작되는 컬럼 세포의 말단에서만 기질 내에서 뚜렷하게 나타난다. 이들 3가지 폴리아민류 중에서, 스페르미딘이 가장 풍부하다; 고 몰비의 스페르미딘/스페르민이 급속성장의 지수로서 채택되었다. 최대량의 스페르미딘이 골화 영역 내에 존재한다.

폴리아민 대사성

선구물질, 푸트레신, 탈카르복실화 S-아데노실메티오닌 (dcAdoMet)의 합성은 2개의 디카르복실라제인 오르니틴 디카르복실라제(ODC, EC 4.1.1.17) 및 S-아데노실메티오닌 디카르복실라제 (AdoMetDC, SamDC, EC 4.1.1.51)의 작용으로 발생한다. 이들 효소는 양쪽 성장인자 및 이들의 레벨을 증가시키는 다른 자극에 의해, 또한 이들의 활성도를 감소시킬 폴리아민 자체에 의해 고도로 조절된다. 이들 작용제의 영향이 조합되어 세포성장 및 진행에 필요한 폴리아민 레벨을 조정한다. ODC 및 AdoMetDC 의 활성 변화는 폴리아민 레벨 조절에 큰 힘을 미친다. 아미노프로필 전달효소인 푸트레신 아미노프로필 전달효소 (PAPT, 스페르미딘 신타제, EC 2.5.1.6) 및 스페르미딘 아미노프로필 전달효소 (SAPT, 스페르민 신타제, EC 2.5.1.22)의 활성은 1차적으로 이들의 기질 활용도를 통해 조절된다. 세포내에서의이들의 반복 합성과 별개로, 폴리아민은 또한 특이적 이동계에 의한 흡수작용의 결과로서 수득될 수 있다. 상기 이동계는 세포내 폴리아민 함량에 의해 음성적으로 및 성장인자 및 온코겐에 의해 양성적으로 모두 조절된다. 이동계 및 폴리아민 감소의 결과로서 개선된 이것의 활성도는 폴리아민 합성 억제의 영향을 진정시키는데 중요한 인자이다. 외인성 폴리아민의 흡수는 이들 억제제를 항암제로서 임상실험하는 과정에서 성공률이 적은 것에 영향을 미치는 임계변수가 될 수 있다. 마지막으로, 폴리아민 레벨은 상호전환, 산화 및 유출작용의 결과로서 변할 수 있다. 말단 질소원자에서 일어나는 폴리아민 산화반응은 일차적으로 및 세포외에 위치하는 Cu⁺²-함유 산화효소에 의해 달성되나, 이들이 세포로부터 완전히 결여되지는 않는다. 폴리아민이 상호전환 및 용출은 N-아세틸스페르민 및 N-아세틸스페르미딘을 형성할 폴링민의 아미노프로필 말단을 아세틸화 하는 스페르미딘/스페르민-N-아세틸 전달효소 (SSAT, EC 2.3.1.57)의 작용에 의해 촉진된다. 이들 아세틸 유도체는 세포성 폴리음이온에 약하게 결합하며 분비 혹은 신속히 대사 처리된다. 이들은 N-아세틸아미노프로판알의 분할 및 스페르민을 스페르미딘으로 또한 스페르미딘을 푸트레신으로 전환시키는 FAD-의존형 산화효소로서 폴리아민 옥시다제(PAO)에 의해 내부 질소원자에서 산화된다. 이 경로의 제한인자는 SSAT의 활성도로서, 이것은 정상적으로는 매우 낮으나 폴리아민의 세포 함량 증가 혹은 독성 자극물의 공급이 있을 시에는 크게 유발되어 막 및 세포기관으로부터 폴리아민이 방출되는 것을 유도한다. 생리학적 조건에서, PAO는 비-아세틸화 폴리아민에 대하여 거의 혹은 전혀활성을 갖지 않는다.

따라서, 본 발명의 한가지 목적은 여러 종류의 스페르미딘 신타제 억제제를 확인하고 OA의 억제 혹은 지연을 위한 잠재적 약물로서의 이들의 효과를 평가하는 것이다.

또다른 본 발명의 목적은 OA 치료 및 연골 재생 용도로서 가능한 치료 작용제를 제공하는 것이다.

이들 목적 및 기타의 목적을 다음의 상세한 설명에서 더 구체적으로 기술한다.

본 발명은 2000년 12월 12일자 미국 가출원 60/254,850 의 연속출원으로서이 건 발명의 내용을 특허청구범위로 하며 본 출원 명세서에 그 내용을 참고로 수록하였다.

본 발명은 골관절염 진행 및 연골조직의 회복에 수반되는 스페르미딘 신타제에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 골관절염의 치료 및 이에 관련하여 손상된 연골의 치료에 있어서 치료 방법, 조성물 및 및 스페르미딘 신타제 억제제의 용도에 관한 것이다.

도 1은 IGF-1로 6일간 치료한 융합성 HMSC 세포에 의한 각종 분화 마커(marker)의 발현을 도시한다. 대조군 - 유사하게 배양된 무치료된 세포이다. 마커 발현의 레벨은 상대적 단위로 표시한다. 약어: Cont.=대조군; trea.=치료된 것; Collagen t. Il=콜라겐 II종; Alcian bl.=알시안 블루.

도 2는 IL-1β로 6일간 치료한 융합성 HMSC 세포에 의한 각종 분화 마커의 발현을 도시한다. 대조군 - 유사하게 배양된 무치료된 세포이다. 마커 발현의 레벨은 상대적 단위로 표시한다. 약어: Cont.=대조군; trea.=치료된 것; Collagen t. Il=콜라겐 II종; Alcian bl.=알시안 블루.

도 3은 FGF-2로 6일간 치료한 융합성 HMSC 세포에 의한 각종 분화 마커의 발현을 도시한다. 대조군 - 유사하게 배양된 무치료된 세포이다. 마커 발현의 레벨은상대적 단위로 표시한다. 약어: Cont.=대조군; trea.=치료된 것; Collagen t. Il=콜라겐 II종; Alcian bl.=알시안 블루.

도 4A-4B는 스페르미딘 신타제의 노던 블롯 분석 결과를 도시한다.

4A: 스페르미딘 신타제의 조직 노던 블롯 분석 결과로서; 1열-뇌; 2열-결장; 3열-심장; 4열-신장; 5열-간; 6열-근육; 7열-폐; 8열-태반; 9열-소장; 10열-비장; 11열-위; 12열-고환.

4B: U2OS 조골세포 내의 스페르미딘 신타제의 노던 블롯 분석 결과를 도시한다.

도 5는 스페르미딘 신타제에 의해 전이적 트랜스펙트된 293 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한다. 웨스턴 블롯을 항-히스 항체로 프로브하였다. 3열-트랜스펙트된 세포의 융해물; 4열-트랜스펙트된 세포의 배지; 5열-293 대조군 세포의 융해물; 6열-293 대조군 세포의 배지; 7열-양성 대조군.

도 6은 스페르미딘 신타제로 안정적으로 트랙스펙트된 RCJ3.1C5.18 세포의 PCR 분석 결과를 도시한다. 숫자들은 상이한 클론들을 표시한다.

첫 번째 측면에서, 본 발명은 OA 치료가 필요한 대상의 치료 방법에 관한 것이며 이 방법은 상기 대상에게 실질적으로 스페르미딘 생합성을 억제하는데 효과적인 양의 스페르미딘 생합성 억제제를 투여하여 상기 대상을 치료하는 것이다.

한 바람직한 구현예에서, 상기 대상에게 투여되는 억제제는 스페르미딘 신타제 억제제이다.

특별히 바람직한 구현예에 따르면, 상기 스페르미딘 신타제 억제제는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중의 어느 것을 유도하는 억제제이다.

또다른 바람직한 구현예에서, 상기 대상에게 투여된 스페르미딘 신타제 억제제는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA),시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스-(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 포유동물 대상의 OA 치료에 있어서 폴리아민 생합성 경로 내의 하나 이상의 단계에서 억제제를 사용하는 것에 관계한다. 이 억제제는 한 바람직한 구현예에 따르면 스페르미딘 생합성 억제제, 더 바람직한 구현예에 따르면 스페르미딘 신타제 억제제이고 또한 스페르미딘 축적을 억제해야 한다.

특별히 바람직한 한 구체예에 따르면, 여기에서 사용되는 스페르미딘 신타제 억제제는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포의 형성 중 어느 것을 억제 유도할 억제제이다.

여기에서 사용되는 스페르미딘 억제제는 상술한 바와 같은 공지의 스페르미딘 신타제 억제제로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 포유동물 대상의 OA 치료에 사용되는 폴리아민 생합성 경로의 억제제를 제공한다. 이 억제제는 바람직한 구현예에 따르면 스페르미딘 신타제 억제제일 수 있다. 좀 더 구체적으로, OA 치료에 사용되는 억제제는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성중 어느 것의 억제를 유도하는 스페르미딘 신타제 억제제이다.

그 밖의 또다른 측면에서, 본 발명은 포유동물 대상의 OA 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조시 폴리아민 생합성 경로의 억제제를 사용하는 것에 관계한다. 바람직하게, 여기서 사용되는 억제제는 스페르미딘 생합성 억제제, 더 바람직하게는 스페르미딘 신타제 억제제; 가장 바람직하게는, 스페르미딘 축적을 억제하고 또한 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제를 유도하는 억제제이다.

OA 치료용 약제학적 조성물의 제조에 사용되는 억제제는 본 발명에 따르면, 상술한 스페르미딘 신타제 억제제 중에서 선택된다.

본 발명은 또한, OA 치료를 위한 치료 조성물도 제공한다. 이 조성물은 활성성분으로서 폴리아민 생합성 경로 내의 적어도 하나 이상의 단계에서 사용하는 억제제를 포함한다. 더 바람직하게, 이 억제제는 스페르미딘 생합성 억제제이다. 가장 바람직하게, 이 억제제는 스페르미딘 신타제 억제제이다.

한 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 약제학적 혹은 가축에게 수용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 OA 치료용 치료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 제조방법은 (a) 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제를 유도할 스페르미딘 신타제의 억제제를 확인하고; 및 (b) 상기 억제제를 약제학적 수용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 측면에 관한 바람직한 구현예에서, OA 치료를 위한 치료 조성물의 제조에 적합한 스페르미딘 신타제 억제제의 확인은 다음의 단계에 따라 실행된다:

(a) 스페르미딘 신타제 억제제 후보를 수득하고; 및

(b) 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것에 대한 상기 억제제 후보의 영향을 한가지 평가 방법에 따라 평가하는 단계.

상기 평가 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

i) 스페르미딘 신타제를 엔코딩할 DNA를 포함하는 시험 시스템을 제공하고;

ii) 정상일 때 스페르미딘의 발현을 유도할 조건하에서 상기 시험 시스템을 상기의 스페르미딘 신타제 억제제 후보와 접촉시키고; 및

iii) 대조군과 비교하여 종말점 표시에 대한 시험된 억제제 후보의 영향을 결정하는 단계를 포함하고, 이 때 상기의 영향은 시험된 억제제 후보를 이용하여 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제작용을 가리키는 지표가 된다.

특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 평가 방법에 의해 사용된 시험 시스템은 시험관내(in vitro) 세포배양, 체외(ex vivo) 세포배양, 체외 유기 배양 및 체내 동물 모델 등 어느 것도 될 수 있다. 또 다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 이용된 상기 시험 시스템에 의해 발현되는 스페르미딘 신타제는 내인성 혹은 외인성으로 발현한다. 이 시험 시스템은 필요시 스페르미딘 발현 및 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것을 결정하기 위한 종말점 표시의 검출에 적절한 조건을 제공할 내인성 및/또는 외인성 작용제를더 포함하기도 한다.

선택된 시험 분석 체계에 따라서, 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성의 억제는 예를 들어, 세포내 염색 분석법 (면역조직화학적 염색법을 포함한) 및 관측가능한 변수들 예컨대, 세포주기의 변화 같은 생리학적 판독치에 영향을 미치는 분석법을 포함하는 다양한 방식으로 관측할 수 있다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기의 대상 억제제의 영향을 평가하는 본 발명의 방법에서 사용되는 시험 시스템은 시험관내에서 트랜스팩트된 세포 배양물이다. 이용된 세포는 외인성 발현된 스페르미딘 신타제를 운반한다.

별도의 또다른 구현예에서, 평가 목적의 본 발명의 방법에서 사용된 시험 시스템은 내인성 발현된 스페르미딘 신타제를 포함하는 체외 골 배양조직이다. 바람직하게, 골 배양조직은 태아 골 배양조직이다.

또다른 시험 시스템은 동물 모델계인 체내계일 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 평가목적의 동물 모델을 사용하면 종말점 표시로서 관절염의 발생을 활용할 수 있다. 종말점 표시로서 사용할 경우 관절염 발생은, 예컨대 상기 동물의 앞발 두께를 측정하면 확인 결정할 수 있다. 대조군에서 관찰된 증가분보다 앞발의 크기 증가가 적으면 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성의 억제를 가리키는 것이다.

한 바람직한 시험 시스템에서, 적절한 동물 모델은 형질전환 마우스이다.

또다른 바람직한 체내 시험 시스템에서, 내인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 관절염에 걸린 포유동물 모델을 본 발명의 평가방법을 이용하여 사용할 수 있다. 이 구현예에 따르면, 관절염에 걸린 동물은 종말점 표시로서 관절염 발생을 활용할 수 있다.

특히 바람직한 구현예에 따르면, 관절염에 걸린 포유동물은 관절염 걸린 래트 혹은 마우스이다.

특별히 바람직한 본 발명의 구현예는 OA 치료를 위한 치료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (a) 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제를 유도하는 스페르미딘 신타제의 억제제를 확인하는 단계; 및 (b) 상기 억제제를 약제학적 수용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 적절한 억제제의 확인은 대상 억제제를 수득하고 특정 대상의 효과를 평가하는 것을 수반한다. 이 구현예에 따르면, 대상 스페르미딘 신타제 억제제는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민 (4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스 (시클로펜틸아미디노히드라존) (MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아민)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)이데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능적인 상동체와 동족체로 구성된 군에서 억제제를 선택함으로써 후속의 평가를 위해 수득할 수 있다.

이와 별도로, 대상 억제제는 또한 후속의 평가를 위해 스페르미딘 신타제의 억제제인 대상물에 대한 스크린법을 이용하여 수득하기도 한다. 본 발명에 따르면, 이러한 스크린법은:

(a) 스페르미딘 신타제를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;

(b) 상기 혼합물을 정상일 경우 스페르미딘의 생합성을 유도하는 조건하에 실험 대상물과 접촉하는 단계; 및

(c) 종말점 표시에 대한 상기 실험 대상물의 영향을 결정하는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 종말점의 억제가 실험 대상물에 의한 스페르미딘 신타제의 억제를 표시하는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 특별한 구현예에 따르면, 상기 종말점 표시는 스페르미딘 신타제 촉매 반응의 생성물이 존재함을 나타낸다.

상술한 내용 및 그 밖의 본 발명의 특징과 장점은 다음의 상세한 설명에서 예시적이며 비제한적인 구현예와 첨부 도면을 참조하여 더욱 구체적으로 기술된다.

본 발명을 바람직한 구현예에 대한 예시적이나 비제한적인 설명을 통해 다음에서 더 구체적으로 설명한다.

OA는 연골의 퇴행 뿐만 아니라 정상위치 외의 골형성에 의해서도 발생하는 특징의 파괴적인 관절 질환이다. 본 발명은 시험관내 세포계 (HMSC 세포) 및 체외기관 배양조직 (태아의 관절 촉진자 내에서 성장한 골단부)를 모두 이용하여 상기 질병의 발생에 중요한 역할을 할 수도 있는 유전자를 발견하였다. 인간의 관절 연골 어버이 세포(HMSC)는 일련의 유전자 발현 증식 실험을 실행하는데 이용하였다. 이들 세포는 연골 재생(IGF-1) 혹은 OA 개시 및 진행(ILI-??, bFGF-2, 기계적 응력)을 모방하는 각종 치료에 응용했다. 시험관 연구 이외에도, 다양한 상호작용 세포류를 포함하는 복합 조직에 관련하여 일어나는 유전적 현상들을 더욱 양호하게 반영하는 체외 실험을 실행하였다. 각종 응용 치료에 상응하는 유전자 발현 프로파일은 미량분석 교잡법으로 연구 및 출원인이 소장한 생물학적 측정기구로 분석하였다. 수득된 유전자 발현 패턴은, 예상된 작용을 나타내어 발명자들이 OA 마커로 공지된 다수의 유전자가 존재함을 확인할 수 있었으므로, 상기 선택된 in vitro 세포계가 체내의 OA 관절에서 발생하는 과정들을 정확하게 반영하고 있음을 증명했다.

본 발명자들은 bFGF-2 치료시 성장조절되는 유전자로서 스페르미딘 생합성시 수반되는 스페르미딘 신타제 유전자를 확인했다. 이 발견은 폴리아민 생합성 경로 특히 스페르미딘, 더 구체적으로는 스페르미딘 신타제의 생합성이 잠재적으로 OA에 수반되고 따라서, 포유동물의 OA 치료를 위한 약물의 개발을 위한 약물 타겟으로 선택되었다는 것을 가리킨다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 측면은 OA 치료가 필요한 대상의 치료방법에 관한 것으로서 이 방법은 상기 대상에게 실질적으로 스페르디민 생합성을 억제하기에 유효한 양의 스페르미딘 억제제를 투여하여 상기 대상을 치료하는 것을 포함한다.

"치료"란 특정 질병에 관련된 증세의 부분적 혹은 완전 제거를 포함하여, 지병 상태의 완화 및 그 진행의 완화를 의미한다. "치료"는 또한 질병을 예방 및 발병의 지연도 포함한다.

본 발명의 배경설명에서 언급하였듯이, 폴리아민 생합성 경로는 2가지의 고조절된 효소, 오르니틴 디카르복실라제와 S-아데노실메티오닌 디카르복실라제 또한, 2가지의 구성적 발현 효소인 스페르미딘 신타제와 스페르민 신타제를 동반한다. 스페르미딘 생합성은 S-아데노실메티오닌(SAM)을 SAM 디카르복실라제에 의해 S-아데노실-3-메틸티오프로파나민 (디카르복실화된 SAM)으로 바꾸는 탈카르복실화 반응, 또한 오르니틴을 오르니틴 디카르복실라제에 의해 푸트레신으로 바꾸는 탈카르복실화 반응을 수반한다. 디카르복실화 SAM은 그 뒤 스페르미딘 신타제와 반응하여 아미노프로필레이트형 효소를 생성하고 다시 이것은 아미노프로필기를 푸트레신으로 전환하여 스페르미딘과 5'-메틸티오아데노신(MTA)으로 전환시킨다. 선구물질, 푸트레신과 디카르복실화 S-아데노실메티오닌 (deAdoMet)의 합성은 2가지 디카르복실라제인 오르니틴 디카르복실라제(ODC, EC 4.1.1.17) 및 S-아데노실메티오닌 디카르복실라제(AdoMetDC, SamDC, EC 4.1.1.51)의 작용에 의해 개시된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 대상에게 투여되는 억제제는 스페르미딘 신타제 억제제이다.

"억제제"란 폴리아민 생합성 억제 활성을 보유하는, 더 구체적으로는 스페르미딘 생합성 억제 활성을 보유하는, 더욱더 구체적으로는 모계 분자에서 관측된 스페르미딘 신타제 억제 활성을 보유하는 최초에 확인된 억제 분자로부터 유래된 상동체와 동종체를 포함한다. "억제제"는 폴리아민 경로의 공지된 억제제 특히 스페르미딘 생합성의 억제제, 좀더 구체적으로 스페르미딘 신타제 활성의 억제제와 또한 실시예 4와 같은 하기에서 기술될 스크리닝 시스템에서 발견된 기타의 억제제를 포함한다.

"실질적인 억제" 란 10-90%, 더 바람직하게는 25-75%, 더욱더 바람직하게는 40-60% 범위의 레벨로 스페르미딘 생합성을 억제하는 것을 말한다.

특별히 바람직한 구현예에 따르면, 스페르미딘 신타제 억제제는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 생성 중 어느 것의 억제를 유도하는 억제제이다.

그 외의 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 투여되는 스페르미딘 신타제 억제제는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스(시클로펜틸아미디노히드라존) (MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

이들 중 특히 관심을 끄는 것은 AdoDATO, 4MCHA 및 DCHA이다. 문헌에는 이들 억제제가 세포 배양시 및체내에서작용하는 효과를 관측한 연구결과가 포함되어 있다. 예를 들어, AdoDATO는 전달효소 반응의 전이상태 동족체로서 스페르미딘 레벨을 감소시키고 세포 증식의 현저한 감소를 가져왔다. 각종 포유류의 세포가 라세미형 AdoDATA 에 노출되면 세포성 스페르미딘 함량이 급격히 감소했으며 동시에약물에 의한 스페르미딘 신타제의 억제에 관련된 푸트레신의 증가를 가져왔다. (Pegg AE, Tang KC, Coward JK.(1982). Effects of S-adenosyl-1,8-diamino-3-thiooctance on polyamin metabolism. Biochemistry 21(20):5082-5089)

래트를체내에서4MCHA에 10일 정도로 오랜시간 동안 노출하는 경우 각종 조직에서 스페르미딘 함량이 70-80% 감소되었으나 스페르민의 증가 이를 보충하였으므로 전체 폴리아민 함량은 일정 수준을 유지하였고 성장에 대한 뚜렷한 영향은 보이지 않았다. 래트의 조직에 대해 10일 혹은 4개월 정도 4MCHA를 구강투여하면 특이적인 및 현저한 스페르미딘 감소를 야기하였고 이를 스페르민 증가가 보상하였다 (Shirahata A, Takahashi N, Beppu T, Hosoda H, Samejima K. (1993). Effects of inhibitors of spermidine synthase and spermine synthase on polyamine synthesis in rat tissues. Bichem. Pharmaco, 45(9):1897-1903)

갓 태어난 래트에게 DCHA를 일일 투여하면 뇌 스페르미딘의 약량 의존성 결실이 일어났으며 동시에 푸트레신 및 스페르민의 증가가 동반되었다. 계속되는 DCHA 치료에도 불구하고 3가지 폴리아민의 레벨은 2주 내에 정상으로 복귀했다 (Slotkin TA, Bartolome J, Persons D, Whitmore WL. (1984). Polyamines in brain and heart of the neonatal rat: effects of inhibitors of ornithine decarboxylase and spermidine synthase. Life Sci. 35(10):1125-1131).

한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 포유류 대상 특히 바람직하게는 인간의 치료하기 위한 것이다. 여기서 "환자", "포유류 대상" 혹은 "치료 대상자" 등은 인간, 소, 말, 개 및 고양이류 바람직하게는 인간 환자를 포함한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 의미한다.

본 발명의 치료방법은 치료 대상자에게 상기 억제제를 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 여기서 "유효량"이란 선택된 결과를 달성하기 위해 필요한 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량의 억제제 혹은 본 발명의 조성물이란 골관절염의 치료에 유효한 양이다.

본 발명은 따라서 포유류 대상에 대한 OA 치료의 스페르미딘 생합성의 하나 이상의 단계에서 억제제를 사용하는 것에 관계한다. 치료방법에서 또한 이 구현예에서의 억제제는 스페르미딘 신타제 억제제이다. 바람직하게, 본 발명에서 사용되는 스페르미딘 신타제 억제제는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 생성 중 어느 것의 억제를 유도하는 억제제이다.

특히 본 발명에서 사용되는 스페르미딘 억제제는, 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 포유류 대상에 대한 OA 치료에 사용할 폴리아민 생합성 경로의 억제제를 제공한다. 또한, 이 구현예에서 상기 억제제는 바람직하게는 스페르미딘 신타제 억제제, 더 구체적으로 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 생성 중 어느 것의 억제를 유도하는 스페르미딘 신타제 억제제이다.특히 본 발명에서 OA 치료에 사용하기 위해 제공되는 스페르미딘 신타제 억제제는, 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

또다른 측면에서, 상술한 폴리아민 생합성 경로의 적어도 하나의 단계에서의 억제제 특히 스페르미딘 생합성의 억제제 및 더욱 구체적으로는 스페르미딘 신타제의 억제제는 포유류 대상의 OA 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, OA 치료를 위한 치료 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 활성성분으로서 폴리아민 생합성 경로의 하나 이상의 단계에서의 억제제를 포함한다. 바람직하게, 이 억제제는 스페르미딘 생합성의 억제제이다. 더욱 구체적으로 상기 억제제는 스페르미딘 신타제 억제제이다. 본 발명의 조성물에 함유되는 특별한 억제제는 상기에서 열거한 바와 같다.

본 발명의 조성물 및 방법은 특히 인간의 OA 치료를 위한 것이나 다른 포유동물들도 포함한다. 이들 조성물은 직접 치료 대상에게 투여할 수도 있으며 혹은 오발부민 혹은 혈청 알부민 같은 담체 단백질에 콘쥬게이트(conjugate)한 뒤 투여하는 것도 바람직하다. 치료 제형물은 종래의 투약 제형 형태로 투여되기도 한다.통상의 제형은 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 활성성분을 하나 이상의 수용가능한 담체와 함께 포함한다.

한 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 선택적으로, 약제학적 혹은 가축학적 수용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함한다.

각 담체는 다른 성분들과의 조화성 측면에서 약제학적 및 생리학적 수용가능한 형태이며 수용자에게 해를 입히지 않는 것이어야 한다. 제형은 구강, 직장 및 비강내로 투여하기 적절하여야 하며 비경구형 투여용도의 제형은 근육내, 정맥내, 피내 및 특별히 피하투여를 위한 것이다. 이 제형은 편리하게 단위약량 형태로 되며 또한 제약분야에서 공지된 방법들로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 투여한다. 비제한적인 예를 들면, 이 조성물은 정맥주사 혹은 염증 관절에 직접 혹은 근접하여 주사할 수 있다.

주사용도로 적절한 약제학적 형태는 수용액 혹은 분산액 및 멸균 주사액이나 분산액으로 즉석제조 가능한 멸균 분말 등을 포함한다. 어떤 경우에서나, 제형은 멸균상태이어야 하며 쉽게 주사할 수 있을 정도의 유체 상태이어야 한다. 또한 생산 및 보관 조건하에서 안정하고 박테리아나 세균류 등의 미생물에 의한 오염으로부터 보호되어야 한다. 담체는 용매 혹은 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 등을 함유하는 분산매질, 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다. 적절한 유동성은 예컨대, 레시틴 같은 코팅물을 이용하고, 분산시 필요한 입자크기를 유지하고 또한 계면활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다.

미생물 작용의 방지는 각종 항균성 및 항진균성 작용제 예컨대, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 실행할 수 있다. 다수의 경우에서, 등장성 작용제 예컨대, 설탕이나 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 흡수력을 연장하는 것은 조성물에 흡수지연 작용제로서 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하면 달성할 수 있다.

멸균 주사액은 활성 화합물을 상기에서 열거한 바와 같은 기타의 성분들과 함께, 필요량만큼 적절한 용매에 함유시켜 제조하며 필요하다면 여과멸균처리를 한다. 일반적으로 분산물은 기본 분산 매질 및 필요시 상기에서 열거된 기타의 성분들을 함유하는 멸균 매개물 속에 각종 멸균된 활성 성분들을 포함시켜 제조한다.

멸균 주사액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제법은 활성 성분 분말과 미리 멸균 여과해둔 용액으로부터 나온 또다른 바람직한 성분을 수득하기 위한 감압-건조 및 동결건조 기술이다.

여기에서 "약제학적 수용가능한 담체"란 임의의 모든 종류의 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균성 및 항진균성 작용제 등을 포함한다. 상기의 매질 및 작용제를 약제학적 활성 물질로서 사용하는 것은 널리 공지되어 있다. 종래의 매질 혹은 작용제에서 제외되는 것은 활성 성분과 조화될 수 없는 것들로 치료조성물에 사용시 심사숙고 해야 한다.

보조 활성 성분도 상기 조성물에 함유시킬 수 있다.

본 발명 조성물의 바람직한 경로는, 예컨대, 불활성 희석제나 담체와 함께 경구투여하거나, 딱딱한 혹은 부드러운 껍질의 젤라틴 캡슐에 함유되거나 또는 태블릿 형태로 압착 혹은 직접 식이조절용 식품에 함유시켜서 투여하는 것이다.

조성물의 투약량은 환자의 OA 증세를 완화시키기 위한 정도이다. 당해 분야의 지식을 가진 경우라면 바람직한 투약량은 환자에 따라 차별화되며 충실한 실험연구 및 표준 의약 시행규칙에 따라야 한다.

본 발명의 또다른 측면은 OA 치료를 위한 치료 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법은 (a) 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제를 유도하는 스페르미딘 신타제의 억제제를 확인하고, (b) 상기 억제제를 약제학적 수용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.

상기 측면의 한 바람직한 구현예에서, OA 치료를 위한 치료조성물의 제조에 적합한 스페르미딘 신타제 억제제의 확인은:

(a) 스페르미딘 신타제 억제제 후보를 수득하고; 및

(b) 한가지 평가 방법에 의해 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것에 대한 상기 억제제 후보의 효과를 평가하는 단계에 의해 수행된다.

본 발명에 따르면, 상기 평가방법은;

(i) 스페르미딘 신타제를 엔코딩할 DNA를 포함하는 시험 시스템을 제공하고;

(ii) 상기 시스템을 정상적으로는 스페르미딘의 발현을 유도할 조건에서 상기 시험대상인 스페르미딘 신타제 억제제 후보에게 접촉시키고; 및

(iii) 대조군과 비교하여 종말점 표시에 대한 시험된 억제제 후보의 영향을결정하는 단계를 포함하고, 이 때 상기의 영향은 시험된 억제제 후보를 이용하여 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제작용을 가리키는 지표가 된다.

선택된 분석 시험 시스템에 따라서, 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성의 억제는 예를 들어, 세포내 염색 분석법 (면역조직화학적 염색법을 포함한) 및 관측가능한 변수들 예컨대, 세포주기의 변화 같은 생리학적 판독치에 영향을 미치는 분석법을 포함하는 다양한 방식으로 관측할 수 있다.

특별한 구현예에서, 본 발명에 따른 평가 방법에 의해 사용되는 시험 시스템은시험관내세포 배양물,체외세포 배양물,체외기관 배양물 및체내동물 모델 중 어느 것이 될 수 있다.

또다른 특별한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 시험 시스템에 의해 발현되는 스페르미딘 신타제는 내인성 혹은 외인성 발현된다. 이 시험 시스템은 필요시 스페르미딘 발현에 적절하고 또한, 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것을 결정하기 위한 종말점 표시의 검출을 위한 적절한 조건을 제공할 내인성 및/또는 외인성 작용제를 포함하기도 한다.

더욱더, 평가된 억제제 후보가 각종 시험 시스템의 종말점 표시에 대해 미치는 영향은 상기 종말점을 높이거나 감소시키는 것이라는 사실에 주목한다.

특별히 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 결정된 종말점 표시는 미분화 마커의 발현으로서, 이는 가시적인 검출 신호를 유도한다. 가시적 검출가능한 신호는 특별히 한정되는 것은 아니나, 알시안 블루 염색 및 알리자린 레드 염색이 될 수 있다. 알시안 블루 염색이 상승하면 이는 연골조직의 프로테오글리칸 증가를 반영하고 연골세포 생성을 표시하는 반면, 알리자린 레드 염색의 증가는 석회침착 현상을 반영하고 연골세포 최종 분화 현상을 표시한다. 따라서, 바람직한 스페르미딘 신타제 억제제 후보는 알시안 블루 염색의 증가 및 알리자린 레드 염색의 감소를 유도하는 물질일 것이다.

또다른 특별한 바람직한 구현예에서, 종말점 표시는 적절한 수단에 의해 검출된 가시적 검출가능한 신호를 유도하는 비대 마커의 발현이다. 비제한적인 예로서, 비대 현상의 검출수단은 콜라겐 X종의 존재에 관한 면역조직화학적 염색이 있다.

이와 별도로, 종말점 표시는 적절한 수단에 의해 검출되는 세포 증식일 수도 있다. 한가지 가능성에 따르면, 세포 증식은 세포 주기 FACS 분석에 의해 검출되기도 한다. 이와 별도로, 증식 마커의 존재에 관한 면역조직화학적 염색에 의해 세포 증식을 결정하는 것도 적절하다. 바람직한 증식 마커는 PCNA 이다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 억제제 후보의 영향을 평가하기 위한 본 발명의 방법에서 사용되는 시험 시스템은시험관내트랜스펙트된 세포 배양물이다. 이들 세포는 외인성 발현된 스페르미딘 신타제를 운반한다.

또다른 특별히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 평가방법에서 시험 시스템으로 사용되는 세포 혹은 트랜스펙트된 세포는 원핵생물 혹은 진핵생물 세포, 특히 박테리아 세포, 이스트 세포, 곤충 세포, 식물 세포 혹은 바람직하게는 포유류 세포일 수 있다. 가장 바람직한 것은 RCJ3.IC5.18 세포, 연골조직 분화 경로에 한정되는 태아 래트 두개에서 취한 클로날 세포 군집 등이다 (Grigoriadis, A.E., Heersche, JN. Aubin, J.E.(1996). Analysis of chondroprogenitor frequency and cartilage differentiation in novel family of clonal chondrogenic rat cell line. Differentiation 60:299-307). 이들 세포는 스페르미딘 신타제 단백질 용도의 핵산 서열 코딩을 포함하는 pCMVneo 발현 벡터에 의해 안정적으로 트랜스펙트된다.

"발현 벡터" 란 여기서 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합성 DNA 절편 및 그외에 DNA 절편을 숙주의 게놈 속에 통합시킬 수 있는 매개물 등의 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 원하는 유전자 혹은 그의 절편, 또한 적절한 숙주 세포 내에서 인지되고 또한 원하는 유전자 발현에 영향을 미칠 실제적 결합의 유전형 제어성분을 함유하는 자가-복제 DNA 혹은 RNA 구조물이다. 이들 제어성분은 적절한 숙주 내에서 발현에 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 유전형 제어성분은 원핵생물 프로모터 시스템 혹은 진핵생물 프로모터 발현 제어 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 통상 전사 프로모터, 전사 개시를 제어하는 선택적 조절자, RNA 발현의 레벨을 증가시키는 전사 인핸서, 적절한 리보솜 결합 부위를 엔코드하는 서열, RNA 스플라이스(splice) 접점, 전사 및 번역을 종료시키는 서열 등을 포함한다. 발현 벡터는 대개 벡터가 숙주 세포에 관계없지 복제되게 하는 복제 기원(origin)을 포함한다.

"실제적 결합"이란 제1 핵산 서열이 제1 핵산 서열과 관능성 관계에 있을 경우 제2 핵산 서열과 실제로 결합되는 것을 가리키는 문장이다. 예컨대, 프로모터는이것이 코딩 서열의 전사 혹은 발현에 영향을 미칠 경우 코딩 서열에 실제적으로 결합한다. 일반적으로, 실제적 결합의 DNA 서열은 연속성이 있고 따라서, 2개의 단백질-코딩 영역을 결합시켜야 할 경우 동일한 판독 프레임 내에 있다.

일반적으로 상기의 벡터는 별도로, 변형된 세포 내에 표현형 선택을 가능하게 할 수 있는 특이적 유전을 포함한다. 각종 선별적 마커가 임의의 구조물 속에 포함될 수 있다. 예를 들여, 내약물성, 영양 요구성, 세포독성에 대한 내성 혹은 표면 단백질의 발현 같은 선택적 표현형을 제공할 선별적 마커를 사용할 수 있다. 본 발명의 시험 시스템에서 사용되는 발현 벡터는 추후에 태그(tag) 서열을 포함하기도 한다. 이러한 서열은 재조합 단백질의 검출 및 분리를 가능하게 한다. 비제한적인 실시예로서, 상기 태그 서열은 HA, c-myc, GST, GFP 및 바람직하게는 His-6 일 수 있다.

원핵생물 및 진핵생물 바이러스 발현 벡터는, 본 발명에 따른 인간 스페르미딘 신타제를 코딩할 유전자를 발현하기 위하여 사용한다.

벡터는 당해 분야의 공지 방법에 따라, 구조물을 세포, 예컨대 인산칼슘 침전물, 미세주입, 전기영동 혹은 변형방법 등을 포함하여 숙주 세포 속으로 벡터를 도입하는 방법에 의해 달성될 수 있다. (예, 본 명세서에서 참고로 인용한 Ausubel, F.M. ed. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 참조).

"세포" 혹은 "트랜스펙트된 세포" 라는 용어가 이 명세서에서 사용되고 있다. 상기 용어는 특정의 대상 세포 뿐만 아니라 상기 세포의 번식 혹은 번식가능성에 대해서도 언급함을 이해할 수 있다. 임의의 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 탓으로 자손 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 번식력은 실제로 모계 세포와 동일하지 않아도 않고 그럼에도 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.

여기서의 "트랜스펙트된 세포"란 재조합 DNA 기법을 이용하여 구성된 벡터로 안정하게 혹은 전이적으로 트랜스펙트되는 세포들을 말한다. 내약품성 혹은 다른 선택성 마커는 부분적으로 변형체의 선택성을 촉진한다. 별도로, 선택성 마커 예컨대, 내약품성 마커는 오염성 미생물이 배양 배지내에서 증폭하지 않도록 할 때 사용할 수 있다. 트랜스펙트된 세포의 순수 배양물은 세포를 유래된 표현형의 생존을 위해 요구되는 조건하에서 배양함으로써 수득한다.

여기에서, "트랜스펙션(transfection)" 이란 핵산 즉, 발현벡터를 핵산-매개 유전자 전달에 의해 수용자 세포 속으로 도입시키는 것을 말한다.

본 발명의시험관내시험 시스템에서 사용되는 세포 혹은 트랜스펙트된 세포는 또한 스페르미딘의 생합성에 필수불가결한, 또한 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 등을 유도할 경로에 필수불가결한 분자들을 엔코딩하는 내인성 혹은 외인성 발현 핵산 구조물을 더 포함할 수 있다.

트랜스펙트된 세포계 시험 시스템 상에 미치는 스페르미딘 신타제 억제제 후보의 영향은 예컨대, 세포주기 FACS 분석법 혹은 PCNA를 이용하는 연골세포 증식, 알시안 블루 및 알리자린 레드 염색에 의한 연골세포 최종 분화, 또한 콜라겐 X종의 존재를 확인하기 위한 면역조직화학적 염색을 이용한 연골세포 비대증상 등을 검사함으로써 평가할 수 있다.

또다른 구현예에서, 평가 목적을 위해 본 발명의 방법에서 사용되는 시험 시스템은체외뼈 배양으로서, 내인성 발현된 스페르미딘 신타제를 포함한다. 바람직하게, 이용된 뼈 배양은 태아 미성숙 뼈의 배양이다. 더욱 바람직하게, 상기 뼈 배양물은 생쥐 태아로부터 얻은 뒷발이다.

연골세포 최종 분화에 대한 다양한 대상체의 영향은, 정상 관절 연골조직을 염색할 알시안 블루 및 알리자린 레드를 이용하여, 치료 및 미치료된 대조군 뼈로부터 제조된 영역들의 시험 시스템 염색법에서 검사하였다. 뼈의 길이방향 성장은 비대영역 및 석회화된 뼈의 길이 증가로서 계산될 것이다. 비대증은 이 시스템에서 콜라겐 X종의 존재를 확인하기 위한 면역조직화학적 염색법을 이용하여 평가할 것이며, 연골세포 증식에 관련한 억제제 후보의 영향은 PCNA로 결정한다.

또다른 별도의 시험 시스템은 동물 모델인체내시스템이다. 본 발명의 방법에 따르면, 평가 목적으로 동물 모델을 이용하면 종말점 표시로서 관절염 발생을 활용할 수 있다. 종말점 표시로서 사용되는 경우, 관절염 발생은 시험 동물의 앞발 두께를 측정함으로써 결정할 수 있다. 앞발 두께의 증가는 대조군 보다 적었으며 이는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성, 또는 관절염 발병 등을 시험 억제제 후보에 의해 억제할 수 있음을 가리킨다.

한 바람직한 시험 시스템에서, 적절한 동물 모델은 외인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 형질전환 생쥐일 수도 있다. 더 구체적으로, 형질전환 생쥐는 콜라겐 II종 프로모터 하에서 스페르미딘 신타제를 발현한다.

이 특정한 구현예에 따르면, 상기체내시험 시스템을 사용하는 스페르미딘신타제 억제제 후보의 영향을 평가하는 것은, 스페르미딘 생합성을 정상 유도할 조건 하에서 상기 시험 억제제 후보를 상기 형질전환 생쥐에게 가하는 것을 수반한다. 이들의 특히 적절한 조건은 예컨대, SAM 같은 스페르미딘 신타제 기질을 시험된 형질전환 생쥐에게 제공한 후 억제제 후보를 가하는 것이다.

여기에서, "형질전환 동물" 이란 비-인간 포유류 바람직하게는 새나 양서류를 포함하고, 하나 이상의 동물 세포가 현재 널리 공지된 형질전환 기술 같은 본 발명의 방법에 따라 도입된 헤테로성 핵산인 형진전환 유전자를 포함하는 것이다. 핵산은 신중한 유전자 조작 방식 즉, 미세주입 혹은 재조합 바이러스를 이용한 감염화 등을 통하여 세포의 선구물질 속으로 도입함으로써 직접 혹은 간접적으로 도입된다. 여기서의 "유전자 조작" 이란 전통적인 교배번식 혹은시험관수정 등을 포함하는 것이 아닌, 재조합 DNA 분자의 도입을 말한다. 이 분자는 염색체 내에 통합되거나 혹은 염색체외에서 복제되는 DNA 이다. 여기서 기술되는 전형적인 형질전환 유기물에서, 형질전환 유전자는 세포가 인간 스페르미딘 신타제 유전자를 발현하도록 야기시킨다.

형질전환 동물은 또한 구성측면 및 조건적 측면의 "녹아웃" 동물도 포함한다. 본 발명의 "인간외 동물"이란 설치류. 인간외의 영장류, 양, 개, 젖소, 닭, 양서류, 파충류 등의 가축을 포함한다. 바람직한 인간외 동물은 래트와 마우스, 더 바람직하게는 마우스를 포함한 설치류 중에서 선택된다. 여기서의 "형질전환 동물"이란 재조합 유전자가 발견되거나 혹은, 재조합물이 동물의 세포 전체가 아니라 일부에서 발현되는 것을 특징으로 하는 동물에 관련하여 사용된다.

여기에서 "형질전환 유전자" 란 부분 혹은 전체가 헤테로성 혹은 외인성 즉, 이것이 도입되는 형질전환 동물이나 세포에 대해 외래의 것이고, 또는 이것이 도입되는 형질전환 동물이나 세포의 내인성 유전자에 대해 상동성을 가지는 (단 이것이 삽입되는 즉, 자연 유전자의 것과 상이한 위치에 삽입되는 세포의 게놈을 변형시키는 방식으로 동물의 게놈 속에 삽입되거나 삽입되도록 설계되고 혹은, 이러한 삽입에 의해 녹아웃이나 다른 기능상실 돌연변이가 되는) 핵산 서열 (예컨대, 스페르미딘 신타제를 엔코딩하는)을 말한다. 형질전환 유전자는 하나 이상의 전사형 조절 서열 및 기타 다른 핵산으로서 예컨대, 선택된 핵산의 최적 발현에 필요할 수도 있는 인트론(개재배열)을 포함할 수 있다.

관절염 발병을 측정하는 것 이외에도, 형질전환 생주 시험 시스템에 대한 억제제 후보의 영향은 상술한체외시험 시스템에 대해 기술된 바와 같이 종말점 표시를 사용하여 평가할 수 있다.

또다른 바람직한체내시험 시스템에서, 내인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 관절염 포유류 모델을 본 발명의 평가 방법에서 이용할 수 있다. 이 구현예에 따르면, 관절염 동물은 관절염의 발명을 종말점 표시로 활용할 수 있다. 관절염 발명은 시험 대상인 관절염 동물의 앞발 두께를 측정하여 확인한다. 대조군보다 앞발 크기의 증가가 약하면 이것은 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성, 또한 상기 시험 억제제 후보에 의한 관절염의 발병 등이 억제됨을 증명하는 것이다. 따라서 관절염 동물 시험 시스템에 대한 억제제 후보의 영향은 상기에서 검토한 바와 같이 분화 및 증식 종말점을 이용하여 검사한다.

시험 동물에서 "동물" 이란 실험모델 예컨대, 래트, 마우스, 기니아픽, 햄스터, 래빗, 개, 고양이 등 사용하기 적합한 포유동물로서 구분된다. 바람직하게는, 포유동물이 마우스 및 래트인 것이다. 그러나, 본 발명의 방법 및 시스템은 포유류가 아닌 동물 등에서도 역시 채택할 수 있다.

특별히 구현예에 따르면, 관절염 동물은 관절염 래트 혹은 관절염 마우스로서 외인성 수단에 의해 유래되었다. 더욱 구체적으로, 관절염 래트를 사용할 때 콜라겐 II종-유래의 관절염(CIA)을 가진 암컷 루이스 래트가 바람직할 것이다.

특히 바람직한 구현예는 골관절염(OA) 치료를 위한 본 발명의 치료조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제를 유도하는 스페르미딘 신타제의 억제제를 확인하고, 상기 억제제를 약제학적 수용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 적합한 억제제의 확인은 억제제 후보를 수득하고; 이 특정 후보의 효과를 평가하는 것을 수반한다. 특별한 구현예에 따르면, 스페르미딘 신타제 억제제 후보는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 억제제를 선별하여 후속의 평가를 위해 수득할 수 있다.

이와 별도로, 억제제 후보는 스페르미딘 신타제의 억제제인 어떤 물질에 대한 스크리닝 처리법에 의해 추후 평가를 위해 수득되기도 한다. 본 발명에 따르면 이러한 스크리닝 법은;

(a) 스페르미딘 신타제를 포함하는 혼합물을 제공하고;

(b) 정상적으로 스페르미딘의 발현을 유도할 조건에서 상기 혼합물을 시험대상과 접촉시키고; 및

(c) 종말점 표시에 대한 시험대상의 영향을 결정하는 단계들을 포함하고, 이에 의해 상기 종말점의 억제가 시험대상에 의한 스페르미딘 신타제의 억제를 가리키는 것을 특징으로 한다.

상기 예의 특별한 구현예에 따르면, 종말점 표시는 스페르미딘 신타제 촉매 반응의 존재를 말한다. 이러한 제품은 스페르미딘 및 메틸아데노신(MTA) 중 어느 것일 수 있다. 결과로 나온 생성물 중 어느 쪽의 검출도 하기의 실시예 4에서 기술되는 형광성 혹은 방사선 라벨링 처리에 의해 수행된다.

본 발명의 스크리닝 및 평가방법을 위한 시험 약물은 단백질계, 탄수화물계, 지질계, 핵산계, 천연 유기물계, 합성유기물계, 및 항체계 물질로 구성된 군에서 선택되는 물질이다. 더 구체적으로, 상기 핵산계, 단백질계, 혹은 항체계 물질은 조합 라이브러리의 생성물이다.

여기서의 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA) 및 적절하게는 리보핵산(RNA) 같은 다핵산을 말한다. 이 용어는 또한 이의 등가물로서 누클레오티드 동족체로부터 나온 RNA 혹은 DNA 의 동족체 및 상술한 구현예에 응용되는 것으로서 2중 스트랜드의 폴리누클레오티드 및 센스 혹은 안티센스 같은 단일 스트랜드의 폴리누클레오티드를 포함한다.

성공적인 후보 약물 혹은 물질 중에는 스페르미딘 신타제의 활성영역 상에 모사 영역을 갖는 펩티드류 및 펩티드 소분자류가 포함된다. 이들은 확인하기가 쉽기 때문에 특히 스페르미딘 합성의 억제를 검출하는 교차형 스크리닝 분석법에서 유용하다. 여기에 개시된 TM크리닝 분석법은 대형의 화학 라이브러리를 직접 스크리닝 하기에는 적절치 않지만 기타의 선별기법과 조합할 수 있는 정교한 후보 스크리닝 처리는 가능하다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 특정의 실시예나 공정단계 및 여기에서 설명한 물질 등에 제한되지 않으며 이러한 공정단계 및 물질은 다소 달라질 수 있다. 또한 여기서 사용된 용어들은 특정 구현예를 설명하기 위한 것이나 이에 한정되지는 않으며 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구 범위 및 이의 등가물에 의해서만 한정된다.

본 명세서 및 특허청구범위에서 단수형 및 복수형 관사들 (a, an 및 the) 는 내용을 좀더 명확하게 표현하기 위한 목적으로 다수 사용되었다.

또한 본 명세서 및 특허청구범위에서 "포함하는" 등은 명시된 단계들을 수반하는 것으로 이해하며 기타의 단계들을 배제하기 위한 것은 아니다.

다음의 실시예는 본 발명의 다수 측면을 실행함에 있어서 본 발명자들이 이용한 방법들을 대표적으로 나타내고 있다. 이들 방법 및 기술은 본 발명을 실시하는 바람직한 구현예로서 예시되는 것이며 당해 분야의 지식을 가진 경우라면 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 한도에서 다수의 변형이 가능할 것임을 알수 있다.

실시예

실험 절차

세포 배양물

1. 세포주

1.1. HMSC - 정상 성인의 관절 연골조직 어버이 세포를 인간 연골조직에서 수득했다. 연골조직은 절제 및 10% FCS, L-글루타민 및 항생제를 보충한 신선한 DMEM 배지에서 배양했다. 절제된 연골조직을 배양하고 2주후, 잔여 조각물을 제거하고 부착된 세포를 사용했다.

1.2. U20S - 인간 조골세포-유사 골육종 세포주를 미국 미생물 배양 기탁협회(ATCC)에서 수득했다 (HTB-96).

1.3. RCJ3.1C5.18 - RCJ3.1C5.18 세포주는 제인 어빈 박사(터론토 대학, 캐나다)로부터 기증받았다. 이 세포주는 다음의 문헌에 나와 있다: Grigoriadis A.E. Heersche J.N, Aubin JE (1996). Analysis of chondroprogenitor frequency and cartilage differentiation in novel family of clonal chondrogenic rat cell lines. Differentiation, 60:299-307.

1.4. 293개의 인간 신장 세포를 미국 미생물 배양 기탁협회에서 수특했다 (CRL-1573).

2. 기계적 응력

HMSC는 배양 플라스크에서 증식하여 군집화 하였다. 2차 서브배양물을 1x10⁵세포/cm²의 밀도로 연성 폴리우레탄막 상에 시드하고, 이 막은 클램프로 기계적 장치에 부착했다. 세포 부착 및 증식을 보다 양호하게 하기 위해서, 막을 완전 혈청으로 60분간 실온에서 전처리했다. 세포가 24시간 동안 막에 부착되게 하였다. 텐션처리(=스트레칭)할 배양물은 클램프를 33%까지 이동시켜 신장했다. 텐션은 1시간 동안 지속했다. 세포를 기계적으로 긁어 수집하고 RNA 분리에 이용했다. 압축처리는 다음과 같이 행하였다:

연성막을 기계적 장치에 클램프를 이용하여 부착하고 신장시킨 후 본래 길이의 25%까지 세포를 시드했고, 그 뒤 세포를 다시 시드 및 배양하여 24시간 동안 부착되게 하였다. 24시간 후, 균주가 방출하고 막이 본래의 길이로 돌아가려는 수축 현상이 생기며 압축물을 형성했다. 이 압축 상태를 RNA 추출 전 1시간 동안 지속 유지했으며 이것은 상술한 설명에서와 마찬가지로 시행했다.

3. 트랜스펙션

안정한 트랜스펙션 - RCJ3.1C5.18는, 생산자 지침에 따라 리포펙타민 2000 시약(GibcoBRL)을 사용하여, pCMVNSVneo 발현 벡터 속에 클론화된 인간 스페르미딘 신타제 유전자와 함께 트랜스펙트되었다. 안정한 클론은 0.3mg G418/ml 배지를 첨가한 후에 선택했다.

RT-PCR

생산자의 방침에 따라, EZ-RNA 분리 키트 (바이오로지칼 인더스트리즈)를 사용하여 RNA 전체를 안정한 RCJ3.1C5.18 로부터 추출했다. 1차 스트랜드 cDNA 합성 및 PCR 반응은 생산자의 지침에 따라 수퍼스크립트 II종 키트 (Gibco BRL)를 사용하여 제조하였다.

노던 블롯 분석

인간 스페르미딘 신타제의 노던 블롯 분석은 U2OS 세포로부터 추출된 RNA를 이용하여 실행했다. 2㎍ 폴리(A)+RNA 함유 블롯을 스파르디민 신타제의 전체 ORF로 프로브 처리했다. 해당 규약집은 "Current protocols in molecular biology", Ausubel FM et al., (ed), (1987), Vol. 1. Section 4.9.1 참조.

분화 마커 염색

1.알시안 블루 -태아 뼈을 보우인(Bouin) 고정액으로 10분간 고정시키고, 알시안 블루(3% 아세트산 내 1%)로 30분간 염색한 후 증류수로 세척했다.

2.알리자린 레드 -태아 뼈을 70% 에탄올 용액으로 고정하고, 60분간 얼음 위에서 배양하고 40mM 알리자린 레드 용액(Sigma)으로 10분간 염색했다.

증식 실험

1. PCNA - 항-PCN 항체(DAKO)의 면역조직화학적 처리는 생산자의 지침에 따라 태아 뼈의 영역 내에서 실행한다.

비대분석

콜라겐 X종 - 항-콜라겐 X종(quartett)의 면역조직화학적 처리는 생산자의 지침에 따라 태아 뼈의 영역 내에서 실행한다.

동물 문석

콜라겐 유발 관절염(CIA)

생쥐의 CIA는 다음의 문헌상에서 소개되었다: Trentham D.E. Townes A.S. Kang A.H.(1977). Autoimmunity to type II collagen: an experimental model of arthritis J. Exp. Med. 146:857-868 참조.

조제 유발 관절염 (AA)

AA는 다음의 문헌 상에 소개되었다: Kong Y.Y et al., (1999). Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. Nature, 402:304-308. 참조.

메니섹토미(menisectomy) 모델

메니섹토미는 다음의 문헌 상에 소개되었다: Han F, Ishiguro N, Ito T, Sakai T, Iwata H. (1999). Effects of sodium hyaluronate on experimental osteoarthritis in rabbit knee joints. Nagoya J Med Sci Nov, 62(3-4):115-26

실시예 1

골관절염의 발병시 수반되는 유전자의 확인 및 연골조직 재생을 위한 실험 모델

1. 실험 설계 - 모델 시스템

OA의 병원성을 수반하는 분자형 메카니즘을 이해하기 위하여, 본 발명자들은시험관내및체외모델의 패널을 이용했다. 다수개의 보완 모델을 편집하여 수개의 관계된 단, 이들의 유전자 발현 패턴에 따라 서로 구별되는 생리학적 조건의 분류 및, 이에 따라, 특이 생리학적 혹은 병원학적 과정에서 중요한 유전자의 선별을 수월하게 할 수 있다.

채택된 실험 방법은 다음의 사전 지식에 근거하였다;

1. 정상 성인 관절의 연골조직 어버이 세포(HMSC)은 조직 배양했고 관절의 연골조직의 정상적인 유전자 발현과 극히 유사한 태아 인간 골단부를 새롭게 분리하였다.

2. 관절 자극기에서 증직한 상기 분리된 인간 골단부와 함께 IGF-1로 처리된 HMSCs는 연골조직 재생에 관련되는 과정을 모사한다: 정상의 연골세포 성장 및 고품질 기질 (HMSC를 위한)의 과잉합성과 또한 정상 연골조직 아키택춰(architecture) (골단부를 위한)의 보존. 유의: 손상 후의 연골조직 재생을 모사하기 위하여, 관절 자극기에서 성장한 골단부 일부에 연골조직 손상을 만들었다.

3. FGF-2 및 IL-1β는 모두 HMSC의 골형성 개시를 증대하는 골형성 인자들이다.

4. 신장 혹은 압축형태의 기계적 자극은 주변 연골조직 및 과산화물 음이온 및 산화질소(NO)의 합성을 열화시키며 따라서 OA 표현형을 모사하게 된다.

따라서, IGF-1에 의해 및 관절 자극기의 연골조직 성장에 의해 야기된 유전자 발현의 변화는 치료 조정시 모사된다. 대조적으로, IL 1, FGF2 및 기계적 응력에 의해 일어난 유전자 발현의 변화는 OA 발병과 연계될 수 있으며 따라서 치료 조정시 이에 대항한다.

1.1.시험관내모델 시스템

인간 장간막 줄기 세포 (HMSC)골관절염의 병원성은 관절염 연골조직에 있어서, 회복과정이 장간막 줄기 세포가 분화되기 시작하여 연골세포 (즉, 정상의) 계통 뿐만 아니라 골형성 및 섬유조직 성장 계통으로도 나뉘어 진다는 측면에서 혼란이 있다. 또한, 대개는 콜라겐 II종 분화 단계에서 억제되는 관절 연골세포가 비대 연골세포 단계로 진행한다. 계속해서, 골형성 인자의 분비에 따라 조골세포 및 파골세포 (이들 선구물질은 체류하는 것이 아니며 골수 내에서 생성됨)의 어버이 세포의 분화가 증대한다 (상기 참조). 사전 지식에 따르면, 여러곳의 손상이 장간막 줄기 세포의 자극 및 비정상 분화 현상을 야기할 것이다. 이것은 조성의 변화 및 ECM의 조직화, 성장인자, 사이토킨, 케모킨 등의 분비 및 지속적인 기계적 억제 등을 포함한다. 이들 세포주에 있어서, 장간막 줄기세포 내의 다양한 자극에 의해 활성화된 세포내 신호발생 경로의 확인 및 특징화는 지배 단계를 표시한다. 이 때문에,시험관내연구는 관절 연골조직으로부터 직접 유래된 인간 성인 장간막 줄기 세포 배양 모델에서 행하였다. 이들 세포는 즈비 네보 박사(텔아비브 의과대학)가 본 출원인에게 기증한 것이었다.

다음의 치료를 선택했다:

*IGF-1: 정상 연골조직 기능 및 재생에 유리한 성장인자. 연골세포의 최종분화 및 최종적으로 뼈에 의해 대체되는 연골조직 혈관생성을 억제한다.

*인터류킨-1: OA 관절에서 과량 생성되는 것으로 알려진 염증성 사이토킨. 연골조직-퇴행성 효소 및 뼈-재흡수 사이토킨 및 생활성 분자들 예컨대, TNF-α, IL-6, 가용성 IL-6 수용체(sIL-6R) 및 NO 등의 발현을 유도한다.

*FGF-2: 섬유아세포 인자는 OA의 병원론 및 이 질병의 동물모델에 관려했다. 심각한 OA 환자는 경미한 OA 환자보다 FGF-2 농도가 현저히 높았다. 심각한 OA 환자의 활액에 의해 자극된 공동배지 시스템 내에서의 파골세포 형성은 FGF-2 에 대항하여 항체를 중화함으로써 크게 억제할 수 있었으며, 이 억제작용은 다른 사이토킨에 대한 항체보다 훨씬 강력했다. 본 발명자들은 OA 환자의 활액 내의 내인성 FGF-2 레벨 증가가 조골세포(이것의 영향은 직접 관측이 가능함) 및 파골세포 계통 (파골세포 반응의 간접적 중재 역할을 하는 타겟 세포 내의 일부 유전자 발현을 관측할 수 있음)을 유발하여 관절 파괴 작용을 할 수도 있을 것으로 판단한다.

*기계적 자극: 일정한 기계적 하중을 관절에 가하는 것이 OA 발생의 주된 요인 중 하나이다.

1.2.체외모델 시스템

관절 자극기 내에서 성장한 전체 분리된 골단부 ^*

체내실험에 더하여, 본 발명자들은 또한 관절 자극기 내에서 성장한 분리된, 인간 태아 골단부의체외모델도 사용하였으며 이것은 즈비 네보 교수 및 로빈슨 박사에게서 기증받은 것으로, 이 특수 장치 내에서 성장 분리된 골단부는 인간 장간막 줄기 세포의 현저한 증식, 성숙 기능성 연골세포로의 분화 및 현저한 상등급 기질의 합성 등을 야기한다. 대조적으로, 정상 조직 배양 조건 하의 골단부는 관절 조직의 대량의 세포사멸(apoptosis) 및 괴사(necrosis)를 보여준다. 이 모델은 복합 조직에 관련하여 일어나는 유전적 현상을 더욱 잘 반영하므로 유리하다(Cohen, I., Robinson, D., Cohen, N., Nevo, Z.(2000) Strong live embryonic and adult human cartilage grafts for trasplantation using a joint simulating device. Biomaterials, 21:2117-2123).

* 관절 자극기는 대형 배지 저장기로부터 밀폐관 시스템에 의해 공급되는 멸균 성장 챔버로 구성된다. 따라서, 이 관절 자극기 내에 들어있는 연골조직은 항상 CO₂가 농축된 신선한 배지에 의해 계속해서 자극된다.

체내정상 관절 연골조직은 관절운동 및 하중에 의해 발생하는 유체역학력에 의해 활액을 펌핑공급 받는다. 연골조직의 깊은 층은 특히 물결무늬의 석회화 현상 이전의 성장층이 혈관에 의해 공급된다. 따라서, 2가지 펄스형성 패턴 즉 관절운동과 혈액순환이 정상의 관절 연골조직에 존재한다. 관절 자극기에서, 조직은 최적 속도 (사전 정의된) 570m/h로서 공급되는 연속흐름에 노출된다. 연동식 펌프가 심장 수축시의 혈압(150mmHg, 100맥박/분) 범위와 유사한 연동 패턴의 압력을 발생한다. 요약하면; 관절 자극기는 다음과 같은 장점을 갖는다:

* 진행 관류(perfusion)는 영양소를 충분히 공급하고 노폐물의 축적을 막는다;

* 관류 유동은 관절 연골조직에 미치는 유체역학력 및 자유낙하력을 모사함으로써 연골조직의 성장을 자극한다.

실시예 2

실험 모델 시스템의 제조

1. 체내 실험

HMSC를 이용하는 일련의체내실험을 시행하였다. 세포들은 연골세포 형성 (예, IGF-1) 혹은 골세포 형성 및 혈관생성 (예, IL1 및 FGF-2) 반응을 야기하는 처리 패널 상에 노출되었다. 2회의시험관내실험을 실시하였다. 최초에, 보상 실험을 실시하여 자극에 대한 세포성 반응의 시간/약량 반응속도를 결정하였다. 이 연구에 근거하여, RNA 가 제조되어 유전자 발현 프로파일 실험 과정에서 사용된 큰 규모의 실험을 실시했다.

1.1. 시험관내 세포 시스템의 보상

다양한 자극에 대한 HMSC 의 분화 반응을 평가하기 위하여, 각종 처리(표 1)에 노출된 세포에 대하여 면역조직화학법 및 염색 절차를 통해 조골세포 및 연골아세포 계통에 대한 특이성을 가진 마커의 발현에 대해 시험했다. 분화 처리에 대한 HMSC의 반응을 최적화 하기 위하여, 다양한 밀도 (산포 및 융합된) 에서 성장한 세포에 대해 연구조사했다.

표 1. 파일럿 연구에 응용된 HMSC의 처리방식

	처리 기간
처리종류	0	1시간	12시간	24시간	48시간	3일	6일
처리없음	+		+	+	+	+	+
IL-1β 0.5ng/ml 및10ng/ml			+	+	+	+	+
IGF-1 10ng/ml 및20ng/ml			+	+	+	+	+
FGF-2 10ng/ml 및100ng/ml			+	+	+	+	+
기계적 응력^*(압축 및 신장)		+

* 기계적 응력 - 실험 절차에서 설명한 바와 같음

다음의 분화 마커를 시험하였다:

연골세포 말단 분화 및 골세포 생성의 마커:

* 오스테오칼신(osteocalcin) (골세포);

* VEGF (비대 연골세포, 혈관생성)

* 섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR 3) (연골세포 어버이 및 고 비대형 연골세포)

연골세포 생성의 마커:

* 콜라겐 II종 (연골세포 성숙분열);

* 알시엔 블루 (연골세포 성숙분열)

보상된 최적 처리조건을 나타내는 결과는 도 1-3과 같다.

수득된 결과를 다음과 같이 설명한다:

1. HMSC 는 연골세포 생성 및 골세포 생성 계통 양측에서 분화의 징후를 다소 표시하는 고밀도 (융합) 조건 하에서 성장 및 분열할 수 있으나, 비대형 연골세포 및 골세포에 대한 특이성을 가진 마커는 현저히 발현하지 않는다 (도 1-3 참조, 대조용 세포).

2. IGF-1 을 이용한 처리는 알시안 블루 염색, 콜라겐 II종 발현의 증가 및 FGFR3 발현의 감소에 의해 증명되는 바와 같이, 연골세포 성숙분열 및 연골조직의 기질 생성을 가속화 한다 (도 1).

3. IL-1β 혹은 FGF-2 를 이용한 처리는 HMSC 에 대하여 복합적인 영향을 갖는 것으로 보인다; 이 처리는,

i) FGFR-3 발현 증가가 나타내는 바와 같이 어버이 세포의 증식을 유발하고 (또한, 하기에서 나타내었듯이 말단 연골세포 분화의 유발을 반영한다);

ii) VEGF 발현 증가가 나타내는 바와 같이 말단의 연골세포 분화 및 혈관생성을 촉진하고;

iii) 오스테오칼신 발현의 증가가 나타내는 바와 같이 골세포 형성을 자극하고;

iv) 알시엔 블루 염색 감소가 나타내는 바와 같이 정상 연골조직 기질을 억제한다.

결론:

* IGF-1 를 이용한 HMSC 처리는 연골세포 생성 계통만 자극하고 조골세포 분화는 다소 억제한다. 따라서, 정상 연골세포 생성을 촉진하거나 OA에서 골증식체 발생을 억제하는 생성물을 제공하는 유전자의 발견을 위한 모델 시스템 역할을 할 수 있다.

* IL-1β 혹은 FGF-2를 이용한 HMSC 처리는 OA의 관련 측면을 대부분 재현한다. 따라서, 유전자 발현은 양쪽 처리에 의한 영향을 받는 것으로 밝혀지며 항-OA 약물의 개발을 위한 잠재적인 타겟 역할을 하기도 한다.

1.2.유전자 발현 프로파일 제공을 위한 실제 규모의 시험관내 실험

파일롯 연구의 결과에 기초하여 다음과 같이 조정하였다:

1. 각 실험에 단일 사이토킨/성장 인자 약량만 사용하였고 (최초 계획시의 2가지 약량 대신), 이는 HMSC 반응에서 전혀 약량 의존성이 관찰되지 않았기 때문이다. 이 관찰결과는 본 연구에서 사용된 사이토킨/성장 인자의 농도가 생리학적 범위를 넘기기 때문인 것으로 설명할 수 있다. 따라서, 최대 반응은 제안된 약량으로 처리함으로써 이미 달성할 수 있었고 또한 이들의 증가는 세포반응을 증대시키는 효과를 가져오지 않았다. 덧붙여서, 고약량 IL-1β으로 처리시 세포독성이 나타났다.

2. RNA 제조시 세포가 수득된 시점의 수치가 현저히 증가함으로써 (제안된 2개 시점이 아닌 5개 시점)처리에 대한 유전적 반응의 전개를 선명하게 보여준다.

실제규모 실험에서 사용된 처리방식을 다음의 표 2에서 요약하였다.

표 2. 실제 규모의 연구에 응용된 HMSC의 처리방식

	처리 기간
처리종류	0	1시간	12시간	24시간	48시간	3일	6일
처리없음	+		+	+	+	+	+
IL-1β 0.5ng/ml			+	+	+	+	+
IGF-1 10ng/ml			+	+	+	+	+
FGF-2 10ng/ml			+	+	+	+	+
기계적 응력(압축)		+
기계적 응력 (신장)		+

각 시점에서, 알칼리성 포스파타제 염색을 실행하였다. 각 실험은 2회씩 실시하여 44개의 실험결과 (22개 실험 방식 x 2회 반복)를 얻었다. 이들 실험에서 얻은 RNA는 공급된 OA 칩 (하기 참조)의 제조와 또한 "OA" 칩 및 "섬유증" 칩에 대해 교배용 프로브의 발생을 위해 이용하였다.

2. 체외 OA 연구 모델

HMSF를 사용한시험관내실험 이외에도, 직접 제거시 및 관절 자극기 내에서 3일간 증식한 후에 인간 태아(생후 22주) 골단부로부터 RNA를 추출했다. 사전의 1일 시점은 생물학적 영향이 관측되지 않으므로 분석되지 않았다. 기질 재생 과정을 트리거하기 위해, 골단부 일부에 상처를 낸 뒤 관절 자극기 속에 위치시켰다. 이 처리는, 골단부가 정상 조직 배양 조건 하에서체외증식하는 경우, 파일롯 실험에서 조직이 이러한 조건하에서 생존하지 못했음이 입증되었으므로, 사전 제안된 처리 대신 적용하였다.체외실험 각각은 2회씩 실행하여 총 6회의 실험 (예, 3가지 조건 x 2회 반복 = 총6회) 결과를 얻었다. (표 3 참조)체외실험으로부터 얻은 RNA는 또한 공급된 "OA" 칩의 제조에도 사용하였다. 생성된 프로브를 "OA" 칩 및 "섬유증" 칩에 교배시켰다.

표 3. 관절 자극기 내의 인간 태아 골단부의 처리방식

처리	골단부 갯수
분리 직후	6 (교배당 3개)^*
관절 자극기 내에서 3일간 성장	6 (교배당 3개)
손상시킨 후 관절 자극기 내에서 3일간 성장	6 (교배당 3개)

* 각 프로브는 3개의 유사 처리된 골단부로부터 추출된 RNA 풀로 제조함.

실시예 3

골관절염의 발생에 수반된 유전자의 확인 및 연골조직 재생

1."OA" 및 "섬유증" 칩의 제조

"OA" 칩은 상술한 바와 같이 처리된 HMSC 및체외실험으로부터 수득된 RNA 으로부터 추출된 RNA 풀을 이용하여 미국특허 출원 WO 01/75180 에서 설명한바와 같은 본 출원인의 SDGI 법에 따라 제조하였다. 여기에는 총 10,000 cDNA 클론이 함유된다. 또한 "섬유증" 칩도 본 출원인의 상기 SDGI 법으로 제조하였다.

2.cDNA 마이크로어레이에 대한 교배

2.1.프로브 라벨링 및 DNA 마이크로어레이에 대한 교배

cDNA 프로브는 역전사효소 (Superscript, Gibco-BRL) 및 18-mer oligO-dT 프라이머를 사용하여 모든 샘플로부터 유래된 1㎍ 폴리A RNA로부터 합성되었다. Cy3-dCTP (Amersham) 혹은 Cy5-dCTP (Amersham) 은 RT 반응 과정에서 함입되어 cDNA를 라벨화 하였다. 교배 및 후속의 스캐닝 처리, 계속해서 가시화 작업을 상술한 바와 같이 실시하였다 (Schena, M. et al.(1996)Proc Natl Acad Sci USA93, 10614-10619). 교배처리의 품질관리는 출원인의 방법에 따라 수행하였다.

2.2.교배 도표

cDNA 프로브는 표 3에 나타낸 도표에 따라 OA 및 섬유증 인간 cDNA 마이크로어레이에 교배하였다.

모든 교배에 있어서 프로브 (2)는 0 시점의 RNA 추출물로 된 풀을 포함하는 동일 프로브이다 (표 4, 통상의 대조군). 이것은 통용의 표준화 프로브 역할을 하며 규정 통계분석법에서의 다양한 교배방식에서 얻은 결과들을 비교할 수 있게 해준다. 각 교배에서의 프로브(1)는 세포 혹은 일정 처리 조건 하에서 배양된체외기관 배양물로부터 추출된 RNA 로 제조했다. 전체 교배 처리는 2회씩 반복하여; 26가지 교배처리 x 2개의 cDNA 마이크로어레이 x 2회 반복 = 104회의 교배처리를 행하였다.

표 4. 교배 도표

프로브 번호	프로브 명	염료	인간 관절 연골조직 RNA, 처리
1	SOA1	cy5	대조군 12시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
2	SOA2	cy5	대조군 24시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
3	SOA3	cy5	대조군 48시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
4	SOA4	cy5	대조군 3일
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
5	SOA5^*	cy5	대조군 6일
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
6	SOA6	cy5	IL-1b 12시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
7	SOA7	cy5	IL-1b 24시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
8	SOA8	cy5	IL-1b 48시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
9	SOA9	cy5	IL-1b 3일
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
10	SOA10	cy5	IL-1b 6일
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
11	SOA11	cy5	IGF-1 12시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
12	SOA12	cy5	IGF-1 24시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상

13	SOA13	cy5	IGF-1 48시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
14	SOA14	cy5	IGF-1 3일간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
15	SOA15	cy5	IGF-1 6일간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
16	SOA16	cy5	FGF-2 12시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
17	SOA17	cy5	FGF-2 24시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
18	SOA18	cy5	FGF-2 48시간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
19	SOA19	cy5	FGF-2 3일간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
20	SOA20	cy5	FGF-2 6일간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
21	SOA23	cy5	손상후 관절 자극기에서 3일간
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
22	SOA24	cy5	관절 자극기 3딜간 조절
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
23	SOA27	cy5	분리 직후의 골단부
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
24	SOA30	cy5	HMSC
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
25	SOA31	cy5	17주 AC 1시간 압축 (MF)

	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상
26	SOA32	cy5	17주 AC 1시간 신장 (MF)
	NML21 (통상의 대조부)	cy3	정상

* 프로브 SOA5 는 인공 반응이며 따라서 추후의 분석에서는 제외했다.

2.3교배 결과의 분석

교배 데이타를 품질관리 알고리즘 및 유전자 클러스터링에 관련한 2가지 알고리즘을 이용하여 분석했다.

2.3.1. 품질관리

품질관리는 Cy3 및 Cy5 신호의 정확한 평형을 달성하기 위한 것으로서 해당 교배시 낮은 분화를 가질 것으로 추정되는 "의심" 신호를 검출하고 또한 후속의 분석을 위해 적절한 형태로 원래의 데이타를 변형시킨다. 해당 교배에 대한 분화가 열등할 것으로 추정되는 "의심" 픽셀의 검출 알고리즘은 하나의 실험군 내의 다양한 교배로 수득한 통상의 대조군 신호들의 2차원 로그분포의 안정성에 기초한다. 정상적으로, 이 분포는 대각선을 따라 밀집되며 합당한 편차 안정성을 갖는다. 이 편차에 따르면, "의심"되는 픽셀의 스코어를 계산하고 이 픽셀을 자동적으로 표시한다. 픽셀의 일부만 "의심" 대상이 되는 경우, 교배는 추후의 분석용도로 실행된다: 그러나, 어떤 데이타가 신뢰성이 있는지 의 여부는 알고 있다.

2.3.2. 클러스터링 알고리즘

알고리즘 1.이 절차는 "블라인드" 형이며 생물학적 조건간의 상호연계성에 대한 사전지식을 필요로 하지 않는다. 클러스터링 처리는 분석된 유전자가 공간 내에 위치하는 경우 다차원적 공간 내에서의 밀집 면적을 확인하는 것에 기초한다.밀도는 상호관계 혹은 유클리드 거리에 의해 측정된다. 이 절차는 대체로 다음과 같다. 대부분 분석된 유전자가 밀집된 공간내의 면적을 선택한다; 이 집단을 제1 클러스터 라고 한다. 제2 클러스터는 제1 클러스터와 교차하지 않는 다음의 밀집면적이 되며 그 다음도 마찬가지이다. 이 면적의 반경은 면적내의 임의 배열된 유전자의 평균 외관을 1이라고 하는 기준에 따라 한정된다. 이들 협소한 클러스터를 공간상으로 근접성에 따라 더 넓은 것에 합칠 수 있다. 확인된 클러스터는 전체 유전자 발현 프로파일의 공변(covariation) 기질에 대한 기여도에 따라 순위를 매긴다.

알고리즘 2.분석된 세트 내의 상이한 교배의 생물학적 분류를 가정할 수 있다면 이 가설에 크게 연계되는 작용을 하는 유전자들을 검출할 수 있다. 모든 유전자에 있어서, 특이적 작용의 중요도에 관한 피셔 기준을 계산한다. 가장 중요한 유전자는 특이적인 것이다.

결과 분석을 다음의 순서에 따라 실행했다:

1. 품질관리 - 각 마이크로어레이에 대해 개별적으로

2. 알고리즘 1에 의한 클러스터링 - 각 마이크로어레이에 대해 개별적으로

3. 알고리즘 2에 의한 클러스터링 - 각 마이크로어레이에 대해 개별적으로

4. 클러스터링 데이타의 비교 - 각 마이크로어레이에 대해 개별적으로

5. 알고리즘 1에 의해서만 선택된 유전자, 알고리즘 2에 의해서만 선택된 유전자 및 양쪽 알고리즘에 의해서 선택되는 유전자를 함유하는 통합된 클러스터 유전자 발현 데이타의 생성 - 각 마이크로어레이에 대해 개별적으로

6. 각별한 유전자 발현 패턴 (클러스터)의 확인 및 이들에 의한 서열화 및 주석에 따른 유전자 선별.

7. 양측 마이크로어레이로부터 선별된 유전자군의 서열-기초 (상기 알고리즘에 의해 접근후) 비교 및 확인된 유전자의 발현 패턴이 동일한지 확인.

8. 양측 마이크로어레이로부터 수득된 클러스터 유전자의 비-중복 리스트의 생성.

9. EST (접근 및 상동성 조사)에 대한 동일성을 갖는 무-주석 클론의 주석달기.

10. 불명의 유전자 및 추정 단백질 (상동성 조서 및 도메인 분석)의 주석달기.

11. 공지 유전자의 문헌 분석.

2.4결과

교배 결과의 완전 분석후, 본 발명자들은 57개의 유전자를 "섬유증" 칩에서 또한 197개의 유전자를 "OA" 칩으로부터 유래한 유전자 리스트를 얻었다.

공지 유전자 일부를 생물의학 문헌 및 공개된 데이타베이스로부터 얻은 정보에 근거하여 분석했다.

IL-1 및 FGF-조절 유전자는 예컨대, 연골조직의 기질 퇴행 및 이탈 뼈 형성의 자극 등 골관절염 표현형 (상기 참조) 에서 잠재적인 역할을 하므로 중요한 관심 대상이 되었다.

따라서, FGF-2로 처리시 발현에 영향을 받았던 유전자들은 특히 본 발명의목적에 중요했다.

이 범주에 속하는 유전자는, FGF-처리 세포에서 이것으로 처리되지 않은 생물학적 대조군과 비교시, 발현 변화를 겪은 것들이다.

bFGF-2에 의해 상향 조절된 유전자들 중 하나는 관절염에 수반되는 것으로 알려진 적이 없었던 스페르미딘 신타제로 밝혀졌다 (서열 SEQ ID No.1로 정의됨).

스페르미딘은 3가지 생활성 폴리아민 중 하나이다. 소의 어깨뼈에서 얻은 골단부의 연골조직에서, 다른 영역보다 경화 영역에서 더 많이 농축되고 석회화가 일어난다. 스페르미딘은 스페르민 및 푸트레신보다 더 많은 양으로 존재한다. 오르니틴 디카르복실라제는 조직의 나머지 영역에서만 측정 가능하므로, 폴리아민 생합성이 일어나는 상기 영역에서 이들은 경화 영역 내에 축적된다. 스페르미딘이 경화영역 내에서만 세포외 특성을 갖는다는 것을 면역조직화학적 증거를 통해 알게되었다. 따라서, 폴리아민은 연골조직의 석회화에 관련될 수 있다 (Vittur F., et al. 1986). 스페르미딘 의전성 단백질은 1-α-2,5- 디히드록시비타민 D3 및 인터류킨 4에 의해 유래된 마우스의 치조 마크로파지의 융해에 수반되는 것으로 나타났다. 폴리아민, 대부분은 단백질 합성을 유발함에 있어서 스페르미딘은 1-α-2,5- 디히드록시비타민 D3 작용의 세포간 중재 역할을 하는데에 일조한다. 또한 마크로파지의 융해를 유도한다. 스페르미딘 합성은 메틸글리옥살 비스(구아닐히드라존) (MGMB)을 첨가하여 억제하였고, 1-α-2,5-(OH)₂D3 에서 유도된 14개 단백질 중의 9개에서의 합성 개선율은 융해의 공존 저해 현상에 의해 크게 감소했다. 또한 스페르미딘 외에도 상기 9개의 단백질의 합성 및 융해가 보존되었다. 파골세포는 융해과정을 반드시 거쳐야 하며 폴리아민류는 파골세포 활성화에서 일역을 담당할 수도 있다. 이 가설은 또한 골격 형성시 공지의 비타민 D 의 역할도 지원한다 (Hayashi T., et al., 1986)

제일 먼저 본 발명자들은 HMSC 세포와 골세포 형성 효과를 가지기도 하는 FGF-2의 처리에 의해 스페르미딘 신타제의 상향 조정을 증명한다. 따라서, 스페르미딘 신타제는 OA 치료용 약물 후보를 스크리닝하기 위한 바람직한 타겟이다.

실시예 4

OA 용 잠재 약물로서의 스페르미딘 신타제 억제제의 평가

OA를 억제 혹은 지연할 잠재 약물로서의 억제제 후보를 스크리닝할 타겟으로서 스페르미딘 신타제의 선별은 상술한 바와 같이 bFGF-2 치료시 (3ng/ml bFGF, 500mg/ml 아스코르빈산 및 10^-8M 덱스아메타존) 상향-조정성에 근거했다. 더욱더, 인간 태아 뼈에서 실행한 교배 연구는 활막, 조혈세포 상의 골형성 세포 및 내공생시에 활막내 스페르미딘 신타제의 발현을 입증하였다. 신호를 통해 뼈의 생성을 연골세포 내에서 관측하였다.

OA 스페르미딘 신타제에서 수반되는 잠재능력은 다음의 발견에 의해 뒷받침되었다;

1. 나머지 영역보다 더 많은 폴리아민을 함유하는 경화 연골조직. 경화 영역 내의 스페르민 양은 5배가 크고 스페르민 보다는 2배가 크다. 스페르미딘/스페르민비는 경화 연골조직에서 1.7이고 나머지 영역에서는 0.69이다 (Vittur F., et al. 1986).

2. 폴리아민 상승 레벨은 관절염 환자로부터 얻은 활액에서 검출하였다. (Nesher G., et al. 1997).

3. ODC 생합성 억제제는 콜라겐 유래의 관절염 (CIA)의 발병을 방지하고 또한 스페르미딘 레벨의 감소 및 혈청 항-CII 항체 레벨의 감소를 가져온다 (Wolos J.A., et al., 1990).

4. 스페르미딘 합성의 억제는 마크로파지의 융해를 억제한다. 스페르미딘을 첨가시 활성도가 지속유지된다. (Hayashi T., et al., 1986)

5.시험관내연구에서 3가지 폴리아민 중 스페르미딘이 유일하게 콜라겐 II종 컬럼으로부터 프로테오글리칸 서브유닛을 변위시키는 능력을 갖는다 (Vittur F., et al. 1986).

6. 알칼리성 포스파타제 활성 (비대화 및 석회화의 마커)는 스페르미딘에 의해 개선된다(Vittur F., et al. 1986).

첫번째 일반 분석에서, 여러 조직내의 스페르미딘 신타제의 발현 패턴은 노던 블롯 분석으로 검사했다. 도 4에서 보는 바와 같이, 예상된 1.3Kb mRNA가 모든 검사 조직에서 검출되었다.

1. 잠재적 스페르미딘 신타제 억제제

OA 치료를 위한 약물 후보로서 상이한 스페르미딘 신타제 억제제의 평가를 다음의 시판 스페르미딘 신타제 억제제을 이용하여 수행한다:

아데노실 스페르미딘

AdoDATO,

DCHA,

트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA),

시클로헥실아민,

메틸글리옥살 비스-(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP),

2-메르캅토프로필아민,

N-클로로술포닐디시클로헥실아민,

5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신,

1-아미노옥실-3-아미노프로판,

5'-(이소부틸티오)아데노신,

5'-(메틸티오)아데노신

또한, 다음의 스크리닝 법에 의해 수득되는 새로운 스페르미딘 신타제 억제제를 이용하여 평가 분석을 수행한다.

1.1 방사성계 분석:

스페르미딘 신타제의 방사성 효소 분석은 공지와 같다 (Raina, A., Eloranta, T., Pajula, R.L. (1983) 참조). 푸트레신 아미노프로필 트랜스페라제 (스페르미딘 신타제) 및 스페르미딘 아미노프로필 트랜스페라제 (스페르민 신타제)의 고속 분석법도 공지이다. (Methods in Enzymology, 94:257-260). 이들 분석법은³H-,¹⁴C- 혹은³⁵S-라벨 S-아데노실 메티오닌(SAM) (대장균으로부터 SAM 신테타제를 이용하여 라벨화된 메티오닌으로부터 제조)의 사용을 동반한다. 메티오닌 내에서 초기 라벨화되는 원자의 선택은 생성물, 스페르미딘 혹은 메틸아데노신(MTA) 중 어느 것이 라벨화 되는지를 결정한다. 초기에는, 분석 프로토콜에서 DL-(2-¹⁴C) 메티오닌의 사용을 수반했고 그 결과로 라벨화된 생성물은 스페르미딘으로 나타났다. 이 프로토콜은 라벨화된 반응성-탈카르복실화된 SAM으로부터 라벨화된 스페르미딘을 분리하기가 번거롭고, 고처리 스크리닝(HTS)와는 조화되지 않는다. 이 분석법의 변형은 L-(메틸-¹⁴C) 메티오닌을 수반하며 다른 생성물 즉, 메틸아데노신의 라벨화를 유도한다. 이것은 현재 HTS-조화성 생체분석 개발을 위한 후보가 될 정도로 이 분석법을 크게 단순화한다. 간단히 말하여, 이 분석법은 MTA로부터 라벨화된 디카르복실화 SAM의 분리를 동반한다는 것이다. 이는 산성 조건 하에서 MTA를 결합하나 디카르복실화 SAM은 결합하지 않는 포스포셀룰로오스 양이온 교반기에 의해 달성된다.

1.2 형광성계 분석:

1차 미 2차 아민의 확인을 위해 형광성계 분석법을 개발했다. 이 분석법에서 1차 아민은 먼저 살리실알데히드와 반응하여 쉬프(Schiff) 베이스를 제공함으로써 보호된다. 스페르미딘 및 푸트레신은 2차 아민을 갖는 전자와는 구별되며 이 아민은 단실 클로라이드 혹은 NBD 클로라이드와 반응하여 형광성 물질을 생성한다.

2. OA용 잠재 약물로서의 스페르미딘 신타제 억제제의 평가

다른 스페르미딘 신타제 억제제의 OA 용도의 잠재 약물로서의 적용성을 평가하기 위해, 다른 억제제를 연골세포 증식 및 말단 분화의 억제 혹은 약화와 또한, 관절염 발병의 억제를 유도한다. 다른 억제제들은 다음의 평가 시험 시스템에 따라 검사했다;

2.1. 시험관내 시험 시스템

2.1.1. 인간 스페르미딘 신타제 전길이 cDNA의 서브클로닝

인간 스페르미딘 신타제 (수탁번호 - BC 000309 및 NM_003132)의 전체 ORF는 U2OS 세포로부터 추출된 RNA 를 이용하는 RT-PCR 에 의해 클론화 되었다. RT-PCR 생성물은 AvrII 및 KpnI으로 2중 소화되었고 또한 TNT 반응을 위한 bCMVNSV-neo 및 pBScKS 로 서브클로닝 되었다. 덧붙여서, N-말단에 His-Tag 을 가진 전체 ORF 역시 RT-PCR에 의해 클로닝 되었다. RT-PCR 생성물은 AvrII로 소화했고 TNT 반응을 위해 bBSc로 서브클로닝 되었다. 이 구조물은 NotI 및 HindIII 으로 소화시키고 불활성 물질은 pCMVNSV-neo NotI-HindIII 로 서브클로닝 되었다. 4개의 구조물 모두가 완전 서열화되고 서열 분석시 공지의 서열과 함께 클론화된 서열을 완벽하게 조합할 수 있는 것으로 나타났다. 또다른 발현 벡터는 이 유전자를 pIRES-puro 발현 벡터속으로 서브클로닝 하면 제조될 수 있었다 (Clontech).

2.1.2. 293개 세포의 전이 트랜스펙션에 의한 스페르미딘 신타제의 검사

구조물을 검사하기 위해, 293개의 세포를 인간 스페르미딘 신타제 cDNA (His-tag 함유 및 pIRES-puro로 클론화 된)로 전이 트랜스펙션 하였다. 세포는 무혈청 배지에서 2일간 성장했고 배지 및 용혈물을 수거했다. 단백질은 10% SDS 겔상에서 분리한 뒤 블롯팅 했다. 막은 항히스 항체와 반응했다. 예상된 35kDa 폭의 밴드 (1개의 스페르미딘 신타제 서브유닛을 표현하는)를 관찰하였다 (도 5).

2.1.3. 트랜스펙트된 세포에서의 증식 혹은 분화율 개선

외인성 인간 스페르미딘 신타제 유전자를 과잉 발현하는 각종 트랜스펙트된 세포주 (예, 연골세포, 상피세포)를 이용하여 연골세포 증식 및 말단 분화의 억제를 가리키는 상이한 종말점 파라미터를 검사한다. 증식 혹은 분화율이 높을 수록 상기 유전자가 관절염 유발 경로에 수반될 가능성이 높다.

2.1.4. 안정한 트랜스펙트된 세포주의 형성

Hig-Tag 가 부족하고 pCMVneo 발현 벡터 속으로 클론화된 인간 스페르미딘 신타제 cDNA는 RCJ3.1C5.18 세포주의 안정한 트랜스펙션에 사용되었다. 30개 이상의 클론이 분리되고 RT-PCT (도 6 참조)에 의하여 스크리닝 되었다. 최고 발현 클론을 약물 평가 실험용으로 선별했다.

스페르민 신타제 과잉 발현의 효과를 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 생성을 표시하는 상이한 종말점 파마리터를 사용하여 검사했다. 이들 파라미터는 이미 OA와 관계가 있는 것으로 공지되었다. 본 발명의시험괸내시험 시스템은 이들 효과를 억제 및 약화시키기 위해 각종 스페르미딘 신타제 억제제의 능력을 평가하기 위해서도 사용한다.

연골세포 분화는 알시안 블루 염색 (염색 연골조직 프로테오글리칸), 알칼리성 포스파타제 활성도 및 콜라겐 X종 면역조직화학적 염색에 의해 평가된다. 알칼리성 포스파타제 활성 혹은 콜라겐 X종 면역조직화학적 염색의 증가는 연골세포의최종 분화를 표시한다.

연골세포의 증식은 세포수 및 티미딘 함유 여부를 측정하여 평가한다.

2.2. 체외 시험 시스템

상이한 억제제 후보에 의한 연골조직 및 뼈 형성에 대한 스페르미딘 신타제 억제의 효과를 내인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 태아 소 기관 배양물을 사용하여체외적으로검사한다. 생쥐 태아(E16)로부터 뒷발을 얻는다. 뼈 배양물은 - 10% 태아소 혈청(FCS), 0.05mg/ml 아스코르빈산 및 1mM 글리세롤포스페이트로 보충한 변형된 이글 배지에서 수행한다. 각 웰 당 1개의 뼈이 37℃ 온도 및 98% 습도에서 5% CO₂배양기 내에 넣은 24-웰 조직 배양판 안에 담은 300리터의 완전 배지 내에서 배양된다. AdoDATO 억제제-(5-50M) 같은 상이한 스페르미딘 산타제 억제제의 농도를 높여서 배양 배지에 첨가하고 뼈을 6일간 배양한다. 억제제 후보로 처리한 뼈 및 대조군 뼈을 각각 배양 뒤 0일 및 7일째에 평가한다.

대조군으로 제조 및 뼈로 처리된 부분을 알리자린 레드 (석회화된 조직을 염색하기 위한) 및 알시안 블루 (연골조직 프로테오글리칸을 염색하기 위한)으로 염색하여 연골세포 최종 분화를 평가한다. 뼈의 종방향 성장은 비대 영역 및 석회화 뼈의 길이 증가로서 계산된다. 비대성은 콜라겐 X종 염색을 이용해 평가한다. 증식은 PCNA로 평가한다.

2.3. 체내 시험 시스템

연골세포 증식, 말단 분화 및 관절염 발병 같은 OA 관련 변수들에 대한 스페르미딘 신타제 억제제의 영향을 두가지의체내시스템을 이용하여 평가한다: 하나는 과잉 발현 외인성 스페르미딘 신타제이고 다른 하나는 내인성 스페르미딘 신타제의 발현이다. 양측 시험 시스템은 본 발명에서 OA의 한 모델로서 사용된다.

2.3.1. 외인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 형질전환 생쥐

스페르미딘 신타제의 과잉 발현의 영향을 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성, 골파괴세포 형성, 또한 관절염의 발병 등을 표시하는 다양한 종말점 변수를 이용하여 검사한다.

인간 스페르미딘 신타제 cDNA를 콜라겐 II종 프로모터/인핸서 하에서 발현하는 형질전환 FVBN 생쥐를 준비했다. 연골조직의 발달은 형질전환 생쥐 태아(E17) 혹은 생후 1주일의 생쥐로부터 얻은 부위에서 검사한다. 최종 분화의 평가는 알시안 블루 및 알리자린 레드로 헤당 부위를 염색하여 수행한다. 증식 평가는 PCNA를 이용한다.

관절염의 발병은 앞발의 두께를 측정하여 성인 스페르미딘 신타제 형질전환 생쥐에게서 검사한다. 이들 형질전환 동물에서 스페르미딘 합성을 촉진하려면, 생쥐에게 디카르복실화 SAM (스페르미딘 신타제의 기질)로 처리하면 된다. 디카르복실화 SAM은 음용수에 용해하여 구강 투여하면 된다.

2.3.2. 내인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 관절염 래트

내인성 스페르미딘 신타제를 발현하는체내평가 시스템으로서, 관절염 래트의 모델을 사용한다. 콜라겐 관절염은 공지 방법에 따라 암컷 루이스 래트에게서 유발된 것이다 (Trentham D.E., Townes A.S., Kang A.H. (1977) 콜라겐 II종에 대한 자가면역성: 관절염 실험 모델. J.Exp.Med. 146:857-868 참조). 1.6mg/ml의 보빈 콜라겐 II종 및 0.4mg/ml 의 조제 펩티드 용액을 동일 부피의 Freund 불완전 조제 (DIFCO, MI)에 첨가하고 이것을 균질화기로 4℃ 및 10,000rpm 에서 15분간 교반하였다. 0일째에 각 동물에게 1ml의 에멀젼에 녹인 0.8mg의 콜라겐을 피내 주사로 투여한다.

다른 억제제 후보에 의한 스페르미딘 신타제 억제제의 효과는 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성, 또한 관절염의 발병 등을 표시하는 다양한 종말점 변수를 사용하여 이 시스템에서 평가한다.

상이한 스페름미딘 신타제 억제제를 관절염 래트에 투여할 수 있다 (콜라겐 II종 유발 관절염 (CIA)). 이 억제제를 물에 용해하고 경구투여 혹은 관절염 래트의 관절 부위에 직접 투여한다. 관절염 발명은 앞발의 두께를 측정하여 관측한다. 또한, 치료된 동물 및 대조군 동물로부터 얻은 해당 부위에 조직검사를 시행한다.

최종 분화의 평가는 해당 부위를 알시안 블루 및 알리자린 레드로 염색하여 시행한다. 증식 평가는 PCNA를 이용한다.

참고문헌

상술한 바와 같이, 본 발명은 골관절염 치료가 필요한 대상에게 스페르미딘 생합성 억제제를 투여하는 치료방법 및 이러한 치료에 충분한 효과적인 양으로서 스페르미딘 생성 억제제 및 담체를 포함하는 치료 조성물을 제공할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 골관절염의 치료 및 이에 관련하여 손상된 연골의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

골관절염 치료가 필요한 대상에게 스페르미딘 생합성 억제제를 실질적으로 스페르미딘 생합성의 억제에 충분한 효과가 있는 양으로 투여하여 상기 대상을 치료하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 억제제가 스페르미딘 신타제 억제제인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 스페르미딘 신타제 억제제는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스-(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체 및 동족체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
골관절염 치료가 필요한 대상의 치료에 스페르미딘 생합성 억제제를 실질적으로 스페르미딘 생합성의 억제에 충분한 효과가 있는 양으로 사용하여 상기 대상을 치료하는 것을 특징으로 하는 사용방법.
제 4 항에 있어서,

상기 스페르미딘 생합성 억제제가 스페르미딘 신타제 억제제인 것을 특징으로 하는 사용방법.
제 5 항에 있어서,

상기 억제제는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스-(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사용방법.
골관절염 치료가 필요한 대상의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 스페르미딘 생합성 억제제를 사용하는 방법.
제 7 항에 있어서,

상기 스페르미딘 생합성 억제제가 스페르미딘 신타제 억제제인 것을 특징으로 하는 사용방법.
제 8 항에 있어서,

상기 억제제는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스-(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체와 동족체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 사용방법.
실질적으로 스페르미딘 생합성의 억제에 충분한 효과가 있는 양의 스페르미딘 생합성 억제제 및 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 골관절염 치료가 필요한 대상의 치료를 위한 치료 조성물.
제 10 항에 있어서,

상기 스페르미딘 생합성 억제제가 스페르미딘 신타제 억제제인 것을 특징으로 하는 치료 조성물.
제 10 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 담체는 약제학적 혹은 가축학적으로 수용가능한 담체 인 것을 특징으로 하는 치료 조성물.
골관절염 치료가 필요한 대상의 치료를 위한 치료 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 제조방법은

(a) 실질적으로 스페르미딘 생합성에 충분히 효과적인 양의 스페르미딘 생합성 억제제를 수득하는 단계; 및

(b) 상기 억제제를 약제학적으로 수용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
스페르미딘 합성 억제제의 확인 방법으로서, 상기 억제제는 스페르미딘 산타제 억제제이고 또한 상기 확인 방법은;

(a) 스페르미딘 신타제 억제제 후보를 수득하는 단계;

(b) 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것에 대한 상기 억제제 후보의 영향을 대조군과 비교하여 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 14 항에 있어서,

상기 평가 방법은:

i) 스페르미딘 신타제를 엔코딩할 DNA를 포함하는 시험 시스템을 제공하는 단계;

ii) 정상일 때 스페르미딘의 발현을 유도할 조건하에서 상기 시험 시스템을 상기의 스페르미딘 신타제 억제제 후보와 접촉시키는 단계; 및

iii) 대조군과 비교하여 종말점 표시에 대한 시험된 억제제 후보의 영향을 결정하는 단계를 포함하고, 이 때 상기의 영향은 시험된 억제제 후보를 이용하여 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성 및 골파괴세포 형성 중 어느 것의 억제작용을 가리키는 지표가 되는 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 15 항에 있어서,

상기 시험 시스템은 외인성 발현된 스페르미딘 신타제를 포함하는시험관내트랜스펙트된 세포 배양물인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 16 항에 있어서,

상기 트랜스펙트된 세포 배양물은 스페르미딘 신타제 단백질을 코딩할 핵산 서열을 포함하는 pCMVneo 발현 벡터에 의해 안정하게 트랜스펙트된 RCJ3.1C5.18 세포의 배양물인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 15 항에 있어서,

상기 시험 시스템은 내인성 발현된 스페르미딘 신타제를 포함하는체외뼈 배양물인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 18 항에 있어서,

상기 뼈 배양물은 태아 뼈 배양물인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 15 항에 있어서,

상기 시험 시스템은 동물 모델을 포함하는체내시험 시스템인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 20 항에 있어서,

상기 종말점 표시는 관절염의 발병인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 21 항에 있어서,

상기 관절염 발병은 상기 동물의 앞발 두께에 의해 결정되고, 상기 앞발의 크기 증가가 대조군과 비교하여 적을 경우 이것은 상기 시험 억제제 후보에 의한 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성, 골파괴세포 형성 및 관절염 발병 중 어느 것의 억제작용을 가리키는 지표가 되는 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동물 모델은 형질전환 생쥐인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 20 항에 있어서,

상기체내시험 시스템은 내인성 스페르미딘 신타제를 발현하는 관절염에 걸린 포유류 모델인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 24 항에 있어서,

상기 종말점 표시는 관절염의 발병인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 25 항에 있어서,

상기 관절염 발병은 상기 관절염에 걸린 포유동물의 앞발 두께에 의해 결정되고, 상기 앞발의 크기 증가가 대조군과 비교하여 적을 경우 이것은 상기 시험 억제제 후보에 의한 연골세포 증식, 연골세포 최종 분화, 혈관생성, 골파괴세포 형성 및 관절염 발병 중 어느 것의 억제작용을 가리키는 지표가 되는 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 관절염에 걸린 포유동물은 관절염 래트인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 14 항에 있어서,

스페르미딘 신타제 억제제 후보를 수득하는 단계는 아데노실 스페르미딘, AdoDATO, DCHA, 트랜스-4-메틸시클로헥실아민(4MCHA), 시클로헥실아민, 메틸글리옥살 비스-(시클로펜틸아미디노히드라존)(MGBP), 2-메르캅토프로필아민, N-클로로술포닐디시클로헥실아민, 5'-((3-아미노프로필)아미노)-5'-데옥시아데노신, 1-아미노옥실-3-아미노프로판, 5'-(이소부틸티오)아데노신, 5'-(메틸티오)아데노신 및 이들의 기능성 상동체 및 동족체로 구성된 군에서 억제제를 선택함으로써 진행되는 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 14 항에 있어서,

스페르미딘 신타제 억제제 후보를 수득하는 단계는 스페르미딘 신타제의 억제제인 대상 물질에 대한 스크리닝법에 의해 진행되고, 상기 스크리닝법은;

(a) 스페르미딘 신타제를 포함하는 혼합물을 제공하는 단계;

(b) 정상적으로 스페르미딘의 생합성을 유도할 조건에서 상기 혼합물을 시험 대상 물질과 접촉시키는 단계; 및

(c) 종말점 표시에 대한 시험 대상 물질의 영향을 결정하는 단계를 포함하고, 이에 의해 상기 종말점의 억제가 시험 대상 물질에 의한 스페르미딘 신타제의 억제를 가리키는 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 29 항에 있어서,

종말점 표시는 스페르미딘 신타제 촉매반응의 생성물의 존재인 것을 특징으로 하는 확인방법.
제 30 항에 있어서,

스페르미딘 신타제 촉매반응의 생성물의 존재는 형광성 혹은 방사성 검출신호 중 어느 하나를 유도하는 것을 특징으로 하는 확인방법.