CN1525818A - 用于治疗骨性关节炎及软骨修复的亚精胺合酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的方法，其包含给所述对象施用一定量的亚精胺生物合成抑制剂，所述的量足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制。本发明还提供了亚精胺生物合成抑制剂在治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象中的用途，其中所述的抑制剂的量足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制。本发明还进一步提供了制备用于治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的治疗组合物的方法，并进一步提供了鉴定亚精胺生物合成抑制剂的方法，其中所述的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。

Description

用于治疗骨性关节炎及软骨修复的亚精胺合酶抑制剂
本发明为2000年12月12日递交的美国临时申请No.60/254,850的部分继续申请并要求该申请的优先权，该申请的内容作为参考在此并入本申请。
技术领域
本发明与亚精胺合酶(spermidine synthase)在骨性关节炎发展及软骨修复中的作用有关。更具体地，本发明涉及治疗方法、亚精胺合酶抑制剂的组合物及其在骨性关节炎及其相关的软骨破坏的治疗中的用途。
背景技术
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种常见病，它能使人日趋衰弱，并且花费巨大，在目前阶段尚无法治愈。对于新治疗方法的需要十分迫切。该疾病的特点是软骨细胞的功能异常，以及因而导致的软骨细胞在关节软骨组织内终末分化和启动骨发生，并且破坏软骨基质。因此，起源于共同祖细胞且其产物与软骨发生和骨发生相关的基因、决定软骨细胞终末分化的基因、以及其产物启动软骨基质破坏的基因，显然都是可选用的治疗切入点。
OA的流行病学
OA又被错误地称为退行性关节病，是指以动关节(即可活动的、由滑膜包裹的关节)功能障碍为特点的疾病。其中以特发性(原发性)OA最为常见，其易感因素不明。
继发性OA与特发性OA在病理上无法区分，但其病因为另一基础疾病的存在。OA是人关节病变中最常见的形式，也是美国乃至全世界最普遍的关节状态。根据不同临床研究结果估计，在70岁以上的人群中，90％以上患有OA。本发明的目的在于用新的方法对该疾病进行治疗和预防。
OA的发病机理
OA包括一组异质性病理的改变，其共同结果是对关节软骨完整性的破坏，以及关节缘软骨下骨板的骨质改变，从而引起关节症状及体征。OA可以是特发性的(即原发性)，也可以继发于其他原因(如炎症、生化因素、内分泌因素、代谢因素、解剖或发育异常)。年龄是OA最大的危险因素，其他诸如大的创伤以及长期反复使用关节亦是OA的重要危险因素。OA累及的关节形式还受发病前职业性或非职业性关节超负荷的影响。
该疾病一般分为两个阶段(1)代偿期；(2)失代偿期。目前，大多数研究人员认为软骨细胞外基质的最初变化是由外源性因素导致的(如负荷、损伤等)。软骨胶原网状结构随之受到破坏，溶酶体酶和分泌蛋白酶(MMP，纤维蛋白酶，组织蛋白酶)可能是软骨基质能观察到的最初变化所产生的原因。这些酶的合成和分泌是由IL-1或其他因素(如机械刺激)所刺激发生的。在疾病的最初阶段，细胞代偿反应亦被激活。软骨细胞分泌的蛋白酶抑制因子如TIMP和PAI-1等通过拮抗蛋白酶活性以稳定软骨系统。生长因子如IGF-1和TGF-β等在损伤的修复中起到一定作用，该修复过程可能能使病变痊愈，或者在最低限度上能通过活化成软骨细胞系细胞使修复过程稳定。最后，则导致过度增殖的软骨细胞堆积。这种细胞具有显著的生物合成活性，其表达会导致蛋白多糖(PG)浓度的增加，从而使软骨增厚(OA代偿期)。这种代偿机制可以使关节在多年内维持一定的功能。
但是，修复组织并不能完全承重，而且PG合成的速度会随着软骨的全层丢失而下降，这标志着OA失代偿期的开始。随着关节软骨的破坏，祖细胞向组织损伤处进行迁移。祖细胞会进行增殖并分化成四种细胞：成骨细胞，成软骨细胞，破软骨细胞和成纤维细胞，这四种细胞一起形成被称之为骨赘(osteophyte)的骨组织，骨赘突入关节腔，从而抑制关节的活动。最后，软骨逐渐会被骨所代替。
上述现象的原因目前尚不清楚。一种可能性是在OA中，对关节软骨细胞或滑膜成纤维细胞生长的正常抑制性控制被替代了。这使得在正常关节软骨中不存在的两种细胞在关节内堆积，即(1)具有改良特性的不成熟间质细胞和骨髓细胞及(2)肥大的关节软骨细胞。现有研究结果显示肥大软骨细胞可能通过分泌成血管因子及成骨因子启动骨发生。(Horner，A.，Bishop，N.J.，Bord S.，Beeton，C.，Kelsall，A.W.，Coleman，N.and Compston，J.E.(1999).血管内皮生长因子(VEGF)在人新生生长板软骨中的免疫定位J.Anat.194：519-524)。
对OA的治疗手段可定位于三个主要的步骤：
—抑制最初的软骨破坏，这是一种已经被接受的治疗方法，即通过减少关节物理压力及使用金属蛋白酶抑制剂进行治疗；
—在疾病进程的稍后阶段抑制或减缓软骨的全部破坏，即用治疗手段活化软骨修复相关步骤，也就是说促进不成熟基质祖细胞向成熟软骨细胞进行分化，从而产生具有正常功能的关节软骨；
—在疾病进程的终末阶段抑制或减缓骨赘形成，即使用治疗手段抑制在关节软骨部位的异位骨发生。
因此，发明人开始着手确定编码刺激或抑制祖细胞向软骨细胞和/或成骨细胞分化的特异因子的靶基因。
由被称为成骨因子的IL-1、FGF-2和机械刺激引起的基因表达的变异，可能与OA的发病有关，因此对其进行干预会起到治疗OA的作用。令人惊讶的是，目前本发明人已经发现亚精胺合酶基因是FGF-2上调的基因之一。这就意味着亚精胺合酶基因在OA发病过程中可能起到了一定的作用。
亚精胺合酶
亚精胺是三种生物活性多胺(polyamine)中的其中之一，另两者分别为腐胺(putrescine)和精胺(spermine)。多胺是一组对于细胞增殖和分化极为重要的细胞成分。尽管多胺的确切功能尚不清楚，但有假说认为它在一些细胞进程如复制、转录和翻译中起非常重要的作用。
多胺的生物合成途径包含两种被精确调控的酶，即鸟氨酸脱梭酶和S-腺苷甲硫氨酸脱梭酶，以及两种结构表达酶，及亚精胺合酶和精胺合成酶。亚精胺合酶分子量大小为74kDa，它催化腐胺(1，4-二氨基丁烷(1，4-diaminobutane))发生3-氨丙基化以生成亚精胺。亚精胺的生物合成包含两个步骤，即S-腺苷甲硫氨酸(SAM)脱梭酶催化的SAM脱梭，生成S-腺苷-3-甲硫基丙胺(S-adenosyl-3-methylthiopropanamine，脱梭化SAM)，以及鸟氨酸脱梭酶催化的鸟氨酸脱梭生成腐胺。脱梭化SAM再与亚精胺合酶反应生成氨丙基酶，该酶将氨丙基转移至腐胺生成亚精胺和5′-甲基硫腺苷(5′methylthioadenosine，MTA)。该活性酶是两个相同亚基的二聚体，不需要协同因子，将氨丙基由dcAdoMet转移至腐胺。
在包括软骨在内的许多活体组织中都已经发现了腐胺、亚精胺和精胺。在骨骼内的软骨转化诱导过程中，也发现了它们的生成，其过程是由ODC催化的。刺激粘多糖合成的甲状旁腺激素能够诱导培养的兔分化肋软骨细胞中的ODC活性，并提高多胺水平。静止期软骨缺乏腐胺。根据组织重量和DNA含量，骨化软骨与静止期软骨相比，含有更多的多胺。骨化软骨中的亚精胺含量比静止期软骨高5倍，精胺含量则高2倍左右。骨化软骨内的亚精胺/精胺比值为1.7，而静止期软骨中该比值为0.69。只有亚精胺具有将蛋白多糖亚基从琼脂糖4B II型胶原柱上洗脱下来的能力(Franco Vittur等(1986).软骨内多胺在钙化机制中的可能作用Biochimica et Biophysica Acta 881：38-45)
通过分析由蛋白多糖亚基充填的琼脂糖4B胶原柱的蛋白多糖洗脱物可得知多胺在蛋白多糖基团与胶原相互作用过程中所起的作用。腐胺和精胺没有表现出任何作用，而亚精胺具有很强的取代蛋白多糖亚基的作用，约有90％的蛋白多糖亚基被从柱上洗脱。精胺和亚精胺提高了软骨产生的碱性磷酸酶的活性。在骨化前软骨的静止带发现了亚精胺。在接近增殖带和柱状细胞的地方，细胞染色消失了。仅仅在软骨细胞开始过度增殖的柱状细胞基质中，亚精胺染色才特别明显。在三种多胺中，亚精胺含量是最丰富的，亚精胺/精胺的高摩尔比值被认为是快速生长的一个指标。在骨化区内亚精胺含量是最高的。
多胺的代谢
亚精胺的前体，即腐胺和脱梭化S-腺苷甲硫氨酸(dcAdoMet)的合成是由两种脱梭酶，即鸟氨酸脱梭酶(ODC，EC4.1.1.17)和S-腺苷甲硫氨酸脱梭酶(AdoMetDC，SamDC，EC4.1.1.51)催化的。这些酶的活性是受到精确调控的：生长因子和其他刺激因素使其水平上升，而多胺本身则使其活性下降。这些因素共同作用，将多胺调整至细胞生长和发育所需要水平。在控制多胺水平的诸多因素中，ODC和AdoMetDC活性的变化是最主要的两个因素。包括腐胺氨丙基转移酶(PAPT，亚精胺合酶，EC2.5.1.6)和亚精胺氨丙基转移酶(SAPT，精胺合成酶，EC2.5.1.22)的氨丙基转移酶活性主要是通过其底物利用度进行调节的。除了在细胞内从头进行合成外，多胺还可通过被特异性转运系统所摄取而获得。细胞内多胺含量可对该转运系统进行负调节，而生长因子和致癌基因则可对其进行正调节。多胺缺失可使该转运系统出现及活性增加，这是一个改善多胺合成抑制作用的重要因素。外源性多胺的摄取可能是抗肿瘤因子等多胺合成抑制因子临床试验失败的决定性因素。最后，多胺水平还可通过互相转化、氧化及外流等过程进行调节。多胺末端氮原子的氧化是由含Cu+2的氧化酶催化的，尽管该酶是否完全不存在于细胞内尚不清楚，但它主要存在于细胞外。在亚精胺/精胺-N-乙酰转移酶(SSAT，EC2.3.1.57)的作用下，多胺之间的相互转化以及外流到胞外的过程得以完成，该酶将多胺的氨丙基末端乙酰化，生成N-乙酰精胺和N-乙酰亚精胺。上述这些乙酰衍生物与细胞多聚阴离子结合得不甚紧密，都会被排泌至胞外或被很快代谢。FAD依赖性多胺氧化酶(PAO)将N-乙酰精胺和N-乙酰亚精胺上的N-乙酰氨丙基去除，使其非末端氮原子得以氧化，分别生成亚精胺和腐胺。这条途径的限定性因素是SSAT的活性，在通常情况下，该酶的活性非常低，但是在细胞内多胺水平上升或毒素刺激的情况下，该酶活性被极大程度地诱导，使得多胺由细胞膜和细胞器释放。在生理条件下，PAO对非乙酰化多胺活性极低或根本无活性。
因此确定不同的亚精胺合酶抑制剂及评估其作为抑制或延缓OA进程药物的可能性是本发明的研究方向之一。
本发明的另一个研究方向是为OA治疗和软骨修复提供治疗手段。
上述及本发明的其他研究方向将在下文中进行详细论述。
发明内容
首先，本发明涉及治疗有OA治疗需求的对象的方法，该方法是通过给予上述对象有效量的亚精胺生物合成抑制剂，对亚精胺的生物合成起到实质性抑制作用，以达到治疗对象的目的。
在优选实施方案中，给予上述对象的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。
根据一个特定优选实施方案，亚精胺合酶抑制剂是指能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的抑制因子。
在另一优选实施方案中，给予对象的亚精胺合酶抑制剂可选自由腺苷亚精胺(adenosyl spermidine)、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺(trans-4-methylcyclohexylamine，4MCHA)、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巯基丙胺(2-mercaptopropylamine)、N-氯磺酰二环己胺(N-chlorosulfonyldicyclohexylamine)、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷(5′-((3-aminopropyl)amino)-5′deoxyadenosine)、1-氨基氧基(aminooxyl)-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷(5′-(isobutylthio)adenosine)、5′-(甲硫基)腺苷(5′-(methylthio)adenosine)及其功能同族物和类似物组成的组。
本发明还进一步涉及作用于多胺生物合成途径中的一个或多个步骤的抑制剂在治疗哺乳动物OA中的用途。在一个优选实施方案中，该抑制剂可以是亚精胺生物合成抑制剂。在更优选实施方案中，则可以是亚精胺合酶抑制剂，并能抑制亚精胺的聚积。
根据一个特定优选实施方案，亚精胺合酶抑制剂是指能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的抑制因子。
该酶抑制剂可以从上文所列举的已知亚精胺合酶抑制剂中进行选择。
本发明还进一步提供了通过使用多胺生物合成途径抑制剂治疗哺乳动物OA的方法。根据优选实施方案，该抑制剂可以为亚精胺合酶抑制剂。具体而言，是指能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的亚精胺合酶抑制剂。
其次，本发明涉及多胺生物合成途径抑制剂在制备用于治疗哺乳动物OA的药物组合物中的用途。优选抑制剂可为亚精胺生物合成抑制剂，更优选的可为亚精胺合酶抑制剂，最优选的可为能够抑制亚精胺聚积以及导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的抑制剂。
根据本发明，在治疗OA的药物组合物的制备过程中所使用的抑制剂可从上文所列举的亚精胺合酶抑制剂中进行选择。
本发明还进一步提供了一种治疗OA的治疗组合物，所述的组合物包含多胺生物合成途径中一个或多个步骤的抑制剂作为活性成分。优选抑制剂为亚精胺生物合成抑制剂，最优选的为亚精胺合酶抑制剂。
根据优选实施方案，本发明的组合物可选择性加入制药用或兽药用载体、赋形剂和/或稀释剂。
第三，本发明涉及用于治疗OA的治疗组合物的制备方法，该制备方法包含的步骤为(a)识别一种能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的亚精胺合酶抑制剂；和(b)将上述抑制剂与药用可接受载体、赋形剂和/或稀释剂混合。
在本项内容的优选实施方案中，识别适用于制备治疗OA的治疗组合物的亚精胺合酶抑制剂的过程通过以下步骤进行：
(a)获得可供选用的亚精胺合酶抑制剂；以及
(b)评估上述候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程的作用。
评估方法包含以下步骤：
i.准备一个包含编码亚精胺合酶的DNA的测试系统；
ii.将上述系统与候选亚精胺合酶抑制剂在正常情况下能够引起亚精胺表达的条件下进行接触；以及
iii.比较检测候选抑制剂与对照对终点指示的作用，上述作用是指对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程的抑制。
在一个特定实施方案中，本发明评估法所选用的测试系统可为体外细胞培养、离体细胞培养、离体器官培养及动物模型体内实验中的任何一种。在另一个特定实施方案中，上述测试系统所表达的亚精胺合酶可为内源性或外源性表达。该测试系统还可选择性加入内源性和/或外源性物质，使得实验条件适于亚精胺的表达，以及对为确定软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中的任一过程而设定的终点指示的检测。
对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质的抑制作用可通过许多不同的方法进行观察，包括染色法(包括免疫组化)和参数法，举例来说就是对一个生理性示值读数如细胞周期的变化进行观察。具体方法的选择取决于所选用的测试系统。
根据优选实施方案，本发明为了评估上述候选抑制剂所选用的测试系统为体外转染细胞培养。该细胞携带外源性表达的亚精胺合酶。
在可供选择的实施方案中，本发明所选用的评估用测试系统为离体骨培养，其包含内源性表达的亚精胺合酶。优选骨培养为胚胎骨培养。
另一种可供选择的测试系统可为体内系统，即动物模型测试系统。根据本发明，所选用的评估用动物模型可通过对实验动物脚爪厚度的测量，将关节炎的发生作为终点指示。实验动物脚爪大小的增加小于对照组动物的，就意味着所检测候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质或关节炎的发生起到了抑制作用。
优选测试系统所选用的动物模型可为转基因小鼠。
另一个优选体内测试系统可选用表达内源性亚精胺合酶的关节炎哺乳动物模型。该模型可将关节炎的发生作为终点指示。
根据特别优选实施方案，该模型可选用患关节炎的大鼠或小鼠。
本发明的一个特别优选的实施方案涉及治疗OA的治疗组合物的制备方法，该方法包含下列步骤：(a)确定一种能导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的亚精胺合酶抑制剂；(b)将上述抑制剂与药用可接受载体相混合。确定一种适合的抑制剂包括获取一个候选抑制剂及对其作用的评估。根据该实施方案，可从腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物中选择一种抑制剂，并对其作用进行进一步的评估。
一个替代方法为通过筛选可作为亚精胺合酶抑制剂的物质来获得候选抑制剂，并对其作用进行进一步的评估。
根据本发明，上述筛选方法包含下列步骤：
(a)准备包含亚精胺合酶的混合物；
(b)将上述混合物与被筛选物质在正常情况下能引起亚精胺生物合成的条件下进行接触；以及
(c)确定被筛选物质对终点指示作用，对上述终点的抑制即意味着亚精胺合酶受到被筛选物质的抑制。根据该替代方法的一个特异性实施方案，终点指示可为亚精胺合酶催化反应产物的生成。
本发明的上述所有及其他方面的特点和优点将在下文中加以进一步解释，并通过非限定性实施方案和附图举例说明。
附图说明
图1：经IGF-1处理6天后的融合HMSC细胞对不同分化标记物的表达。对照为未经处理的相同培养的细胞。标记物表达的水平用相对单位表示。
缩写：Cont.＝对照；trea.＝经处理的；Collagen t.II＝II型胶原；Alcian b1.＝阿尔新蓝。
图2：经IL-1β处理6天后的融合HMSC细胞对不同分化标记物的表达。对照为未经处理的相同培养的细胞。标记物表达的水平用相对单位表示。
缩写：Cont.＝对照；trea.＝经处理的；Collagen t.II＝II型胶原；Alcian b1.＝阿尔新蓝。
图3：经FGF-2处理6天后的融合HMSC细胞对不同分化标记物的表达。对照为未经处理的相同培养的细胞。标记物表达的水平用相对单位表示。
缩写：Cont.＝对照；trea.＝经处理的；Collagen t.II＝II型胶原；Alcian b1.＝阿尔新蓝。
图4A-4B：Northern印迹法分析亚精胺合酶。
4A：Northern印迹法分析组织亚精胺合酶：第一道：脑；第二道：结肠；第三道：心脏；第四道：肾脏；第五道：肝脏；第六道：肌肉；第七道：肺；第八道：胎盘；第九道：小肠；第十道：脾；第十一道：胃；第十二道：睾丸。
4B：：Northern印迹法分析U2OS成骨细胞亚精胺合酶。
图5：Western印迹法分析瞬时转染亚精胺合酶的293细胞。其探针为抗组蛋白抗体。第三道：转染细胞裂解物；第四道：转染细胞的培养基；第五道：对照293细胞裂解物；第六道：对照293细胞的培养基；第七道：阳性对照。
图6：PCR法分析稳定转染亚精胺合酶的RCJ3.1C5.18细胞。数字代表不同的克隆。
具体实施方式
下文将利用非限制性实施方案对本发明进一步举例说明。
OA是一种以软骨退行性改变及异位骨发生为特征的破坏性关节病。发明人同时利用体外细胞系(HMSC细胞)和离体器官培养(在关节模拟器内生长的胚胎骨骺)两种测试系统，以发现在该疾病发展过程中可能起重要作用的基因。实验采用人关节软骨祖细胞(HMSC细胞)表达一系列基因。这些细胞经各种处理以模拟软骨修复(IGF-1)或OA起病及发展(IL1-β、bFGF-2、机械刺激)。复杂组织内包含能相互作用的不同类型的细胞，而离体测试系统能更好地反映发生于其中的基因事件，因而发明人除了采用体外实验，还使用了离体实验。
发明人采用微阵列杂交法研究不同处理方法产生的基因表达轮廓，并用生物信息工具对其进行了分析。发明人在采取预期能引起OA的处理方法处理体外细胞系后，检测到许多已知为OA标记物的基因，因此所获基因表达方式表明所选用的体外细胞系能准确地反映体内OA关节的进程。
发明人已经确认，在亚精胺生物合成过程涉及到的亚精胺合酶受bFGF-2的上调。这个发现意味着多胺的生物合成，具体而言即亚精胺的生物合成，更确切地说应该是亚精胺合酶在OA发生发展中有所涉及，因而可被选择作为治疗哺乳动物OA新药的治疗靶点。
因此首先，本发明涉及对需要OA治疗的对象的治疗方法，该方法是通过给予上述对象有效量的亚精胺生物合成抑制剂，对亚精胺的生物合成起到实质性抑制作用，以达到治疗对象的目的。
在这里，“治疗”是指对疾病状态的改善，以及对疾病进程的延缓，包括部分或完全缓解特异性疾病相关症状。“治疗”也可能可以预防疾病发生或推迟其发作。
正如在发明背景中所描述的，多胺生物合成途径涉及到两种被精确调控的酶，即鸟氨酸脱梭酶和S-腺苷甲硫氨酸，以及两种结构表达酶，及亚精胺合酶和精胺合成酶。
亚精胺的生物合成包含两个步骤，即S-腺苷甲硫氨酸(SAM)脱梭酶催化的SAM脱梭，生成S-腺苷-3-甲硫基丙胺(S-adenosyl-3-methylthiopropanamine，脱梭化SAM)，以及鸟氨酸脱梭酶催化的鸟氨酸脱梭生成腐胺。脱梭化SAM再与亚精胺合酶反应生成氨丙基酶，该酶将氨丙基转移至腐胺生成亚精胺和5′-甲基硫腺苷(MTA)。腐胺和脱梭化S-腺苷甲硫氨酸(dcAdoMet)这两种前体的合成在两种脱梭酶即鸟氨酸脱梭酶(ODC，EC4.1.1.17)和S-腺苷甲硫氨酸脱梭酶(AdoMetDC，SamDC，EC4.1.1.51)的作用下发生。
在优选实施方案中，给予对象的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。
在这里“抑制剂”所指的范畴包括同族物和类似物，它们都是原先已经确认的保留有抑制多胺生物合成活性的抑制性分子，确切地说是抑制亚精胺生物合成活性的，更确切地说是保留母代细胞对特异性亚精胺合酶活性的抑制。“抑制剂”既包括已知的各种多胺合成途径抑制剂，确切地说是亚精胺生物合成抑制剂，更确切地说是亚精胺合酶抑制剂，也包括在即将描述的筛选系统中发现的抑制剂，在下文的例4中将对其进行举例说明。
“实质性抑制”是指对亚精胺生物合成的抑制程度在10-90％之间，优选范围为25-75％，更优选范围为40-60％。
根据特定的优选实施方案，亚精胺合酶抑制剂是指能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中的任一过程产生抑制作用的物质。
在另一优选实施方案中，本发明使用的亚精胺合酶抑制剂可选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物组成的组。
在上面所列举的抑制剂中，最令人感兴趣的是AdoDATO、4MCHA和DCHA。文献中所包含的研究关注于这些抑制剂在细胞培养和体内的作用。例如AdoDATO是转移酶的一种过渡型类似物，能降低亚精胺水平并显著降低细胞增殖。将多种哺乳动物细胞暴露于AdoDATO能使细胞亚精胺含量大幅度降低，以及随之而来的腐胺水平上升，这与药物抑制亚精胺合酶活性的表现相一致。(Pegg AE，TangKC，Coward JK.(1982).S-腺苷-1，8-二氨基-3-硫辛烷对多胺代谢的作用Biochemistry 21(20)：5082-5089)。
在体内实验中，将大鼠迁延暴露于4MCHA达10天后，多种组织内的亚精胺含量减少了70-80％，但精胺水平代偿性上升，因而多胺总含量依然保持不变，对生长没有明显的作用。口服4MCHA10天或4个月都导致大鼠组织内亚精胺水平显著下降，以及精胺水平代偿性上升(Shirahata A，Takahashi N，Beppu T，Hosoda H，Samejima K.(1993)亚精胺合酶抑制剂及精胺合成酶抑制剂对大鼠组织内多胺合成的作用Biochem Pharmacol.45(9)：1897-1903)。
每天给予新生大鼠DCHA将导致脑内亚精胺水平剂量依赖性下降，以及腐胺和精胺水平的上升。尽管持续给予DCHA，所有三种多胺水平都在两周内恢复到正常水平。(Slotkin TA，Bartolome J，PersonsD，Whitmore WL.(1984).新生大鼠脑及心脏内多胺水平：鸟氨酸脱梭酶抑制剂和亚精胺合酶抑制剂的作用Life Sci.35(10)：1125-1131)。
在优选实施方案中，本发明的方法应意欲治疗哺乳动物对象，更优选的是以人为对象，因此“患者”、“哺乳动物对象”或“有需要的对象”指任何需要治疗的哺乳动物，包括人，牛，马，狗和猫，优选对象为人。
本发明的治疗方法包含给有需要的对象施用一有效量的上述抑制剂。“有效量”是指能够达到所选择效果的剂量。例如本发明所用抑制剂或组合物的有效量指能对骨性关节炎病理改变起治疗作用的剂量。
本发明还进一步涉及亚精胺生物合成途径中的一个或多个步骤的抑制剂在治疗哺乳动物对象的OA中的用途。根据优选实施方案，本治疗方法以及本实施方案中的抑制剂可以是亚精胺合酶抑制剂。优选亚精胺合酶抑制剂为能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中的任一过程产生抑制作用的物质。
具体而言，本发明所使用的亚精胺抑制剂可选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷(5′-((3-aminopropyl)amino)-5′deoxyadenosine)、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物组成的组。
本发明还进一步提供了一种能在治疗哺乳动物对象OA中使用的多胺生物合成途径抑制剂。根据本实施方案，优选的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂，确切地说是能够导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中的任一过程产生抑制作用的亚精胺合酶抑制剂。明确地说，本发明提供的可用于治疗OA的亚精胺合酶抑制剂可选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物组成的组。
此外，上述抑制剂能抑制多胺生物合成途径中至少一个步骤，确切地说是抑制亚精胺的生物合成，更确切地说是抑制亚精胺合酶，因而可以用于制备治疗哺乳动物对象OA的药物组合物。
本发明还提供了一种可用于治疗OA的治疗组合物。本发明的所述组合物包含多胺生物合成途径中一个或多个步骤的抑制剂作为活性成分。优选抑制剂为亚精胺生物合成抑制剂，最优选为亚精胺合酶抑制剂。上文所列举是可包含于本发明的组合物中的抑制剂。
本发明的组合物及方法特别是为治疗人OA而设计的，但其他哺乳动物也包括在内。这些成分可直接施用于对象以进行治疗，也可在施用前根据需要将其与载体蛋白如卵白蛋白或血清白蛋白结合。治疗配方可为任何一种传统剂量配方。典型配方包含上述至少一种活性成分及一种或多种载体。
根据优选实施方案，本发明的组合物可选择性加入制药用或兽药用载体、赋形剂和/或稀释剂。
每种载体都必须满足制药和生理要求，必须能与其他成分相互兼容，并且不能对受者有伤害作用。尽管有适用于经口、直肠和鼻腔给药的配方，优选配方为经胃肠外施用，包括肌肉内、静脉内、皮内、且特别是皮下施用。配方可用任何制药业已知的方法方便地制成单位剂量的形式。
本发明的成分有多种不同的给药方式。非限定性例子包括直接静脉内注射，或直接在受累关节内或临近部位注射。
适用于注射的药物形式包括灭菌水剂，或是悬液和灭菌粉剂的形式在使用前制备成供注射用的灭菌溶液或悬液。任何药物形式都必须是无菌的，且必须为易用于注射器内的液体。在生产和储藏条件下必须保持稳定，且必须在避免微生物如细菌和真菌污染的条件下保存。载体可为溶剂或悬液，其成分可为水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，液态聚乙二醇及其类似物)、及其适当的混合物和植物油等。可使用多种方法以保持其适当的流动性，如使用卵磷脂等包被，保持所需悬液微粒大小，以及使用表面活性剂等。
可通过使用多种抗菌剂和抗真菌剂以防止微生物的污染，如氯代丁醇，石炭酸，山梨酸，硫柳汞及其类似物等。在许多情况下，最好还包括等张液，如葡萄糖液或氯化钠溶液。为延长注射成分的吸收时间，还可加入能延缓吸收的成分，如单硬脂硫酸铝和凝胶。
注射用无菌溶液的制备方法为将所需剂量的活性成分与由上述成分组成的适当溶剂混合，再根据需要过滤灭菌。一般而言，悬液的制备方法为将各种无菌活性成分加入至盛有基础悬液和其他所需上述成分的无菌容器中，混合而成。
注射用无菌粉剂的优选制备方式为采取真空干燥或冻干技术，将活性成分和其他所需附加成分由经过滤灭菌的溶液形式制成粉剂。
“药用可接受载体”包括各种及所有溶剂、悬液、包被剂、抗菌剂和抗真菌剂及其类似物。上述用于药用活性成分的介质和药剂都是在制药业中常用的。除非某种传统介质或药剂与活性成分不相兼容，否则其在药物组合物中的使用都是可预期的。
补充活性成分也可加入至本发明组合物中去。
本发明成分的优选给药途径可为口服施用，例如与无活性稀释剂或载体同服，或制成硬凝胶胶囊或软胶囊，或是直接与餐同服。
组合物的剂量可为任何能改善患者OA症状的剂量。本领域人员都能够理解，优选剂量应经过一系列良好实验测定及标准临床实践后根据每个患者个体化制定。
本发明还涉及制备用于治疗OA的药物组合物的方法。该方法包含下列步骤：(a)确定一种能导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的亚精胺合酶抑制剂；以及(b)将上述抑制剂与药用可接受载体相混合。
在本项内容的优选实施方案中，确定适用于制备OA药物组合物的亚精胺合酶抑制剂的过程通过以下步骤进行：
(a)获得可供选用的亚精胺合酶抑制剂；以及
(b)评估上述候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程的作用。
根据本发明，评估方法包含以下步骤：
i.准备一个包含编码亚精胺合酶的DNA的测试系统；
ii.将上述系统与候选亚精胺合酶抑制剂在通常能够引起亚精胺表达的条件下进行接触；以及
iii.在到达终点指示时将实验候选抑制剂的作用与对照进行比较，上述作用是指对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程的抑制。
根据所选择的测试测试系统，对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质的抑制作用可通过许多不同的方法进行观察，包括细胞内染色法(包括免疫组化)和参数法，举例来说就是对一个生理性示值读数如细胞周期的变化进行观察。
在一个特定实施方案中，本发明评估法所选用的测试系统可为体外细胞培养、离体细胞培养、离体器官培养及动物模型体内实验中的任何一种。
在另一个特定实施方案中，本发明使用的测试系统所表达的亚精胺合酶可为内源性或外源性表达。该测试系统还可选择性加入内源性和/或外源性物质，使得实验条件适于亚精胺的表达，以及对为确定软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中的任一过程而设定的终点指示的检测。
在不同测试系统中，被评估候选抑制剂在终点指示的作用既可为上述终点指示的增加，也可为其减少。
根据特定优选实施方案，本发明采用实验方法的终点指示可以通过能产生视觉可观察信号的分化标记物的表达进行确定。这些视觉可观察信号可以但不限定为阿尔新蓝染色和茜素红染色。阿尔新蓝染色增加反映软骨蛋白多糖的增加，即意味着软骨形成，而茜素红染色的增加则反映钙化，即意味着软骨细胞终末分化。因此，一种理想的候选亚精胺合酶抑制剂是一种会导致阿尔新蓝染色增加及茜素红染色减少的物质。
在另一个特定优选实施方案中，终点指示可为能产生视觉可观察信号的过度增殖标记物的表达。一个非限定性例子为可通过X型胶原的免疫组化染色检测过度增殖的存在。
可供选择的终点指示还可为细胞增殖，用合适的方法也可对其进行检测。一种可能性为通过细胞周期FACS分析检测细胞增殖。其他可供选择的方法包括通过增殖标记物免疫组化染色检测细胞增殖。优选增殖标记物可为PCNA。
根据优选实施方案，本发明采用的评估上述候选抑制剂作用的测试系统为体外转染细胞培养。这些细胞携带外源性表达亚精胺合酶。
在另一个特定优选实施方案中，用于本发明评估方法采用测试系统的细胞或转染细胞既可以是原核也可以是真核细胞，确切地说是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞，优选为哺乳动物细胞。最优选为RCJ3.IC5.18细胞，这是由胎鼠颅骨获得的细胞克隆，仅限于软骨分化途径(Grigoriadis，A.E，Heersche，.IN.，Aubin，J.E(1996).成软骨大鼠细胞系新家族中软骨祖细胞频率及软骨分化的分析Differentiation 60：299-307)。这些细胞用pCMVneo表达载体稳定转染，因而包含编码亚精胺合酶蛋白的核酸序列。
“表达载体”是指能将DNA片段整合至宿主基因组的载体，如质粒、病毒、噬菌体、可整合DNA片段及其他运载工具等。表达载体通常为包含所需基因或其片段，且具有自我复制能力的DNA或RNA构建体，而且还包含可操纵地连接的基因控制元件，在合适的宿主细胞内能被识别，并影响所需基因的表达。这些控制因素能在合适的宿主细胞内影响基因的表达。一般而言，基因控制因素可包含一个原核细胞增强子系统或真核细胞增强子表达控制系统。这些系统通常包含一个可转录增强子，一个控制转录开始的选择性存在的操纵子，提高RNA表达水平的转录增强子，一段编码合适的核糖体结合位点的序列，RNA剪切位点，终止转录和翻译的序列等等。表达载体通常包含一个复制起点，使得载体能独立于宿主细胞进行复制。
“可操纵地连接的”是指若将第一个核酸序列与第二个核酸序列建立功能关系后，第一个核酸序列能与第二个相连接。举例来说，如果一个增强子能影响编码序列的转录或表达，则该增强子与该编码序列可操纵地连接。一般而言，可操纵地连接的DNA序列处于相邻位置，如果两个序列都是蛋白质编码区，则都位于同一读码框内。
一般而言，此类载体还另外含有能在转化细胞中提供表型选择的特异性基因。可供选择的各种标记物可与任何构建体结合。举例来说，可以使用能赋予转化细胞耐药性、营养缺陷、耐细胞毒素性或表达表面蛋白等特性的供选择标记物。本发明测试系统所使用的表达载体还可包含一个标签序列。该序列使得重组蛋白能够被检测和分离，其非限定性例子可为HA、c-myc、GST、GFP及His-6中的任意一个，优选序列为His-6。
根据本发明，还可使用原核及真核病毒载体表达人亚精胺合酶。
将载体导入宿主细胞的方法早已为本领域人员所熟知。载体对宿主细胞的导入可通过任何能将该构建体导入细胞的方法完成，例如磷酸钙沉淀法，微注射法，电穿孔法或转化法。详请参阅《现代分子生物学实验技术》(Ausubel，F.M.ed.(1989)，John Wiley & Sons，NewYork)。
“细胞”或“转染细胞”是两个在本申请书中常用的术语。其指代对象不仅是特定对象细胞，还包括其子代细胞或潜在子代细胞。尽管由于突变或环境影响，某些修饰在子代细胞中也可能出现，事实上子代细胞与母代细胞可能并不完全相同，但仍属于该术语在此所指代的范畴。
“转染细胞”是指通过重组DNA技术稳定或瞬时转染载体的细胞。耐药性或其他供选择标记物可部分用于转化株的筛选。此外，供选择标记物的存在，如耐药性在避免培养被微生物污染方面也可能起一定作用。上述转染细胞的纯培养可通过在所需诱导表型能够存活的条件下进行细胞培养而获得。
术语“转染”是指核酸的导入，如通过核酸介导的基因转移将病毒载体导入受体细胞。
本发明体外测试系统所使用的细胞或转染细胞还可包含内源性或外源性表达的核酸，其编码的分子可能对亚精胺生物合成以及引起软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成和破骨细胞破坏骨质的途径有重要作用。
候选亚精胺合酶抑制剂对以转染细胞为基础的测试系统的作用可通过下列方法进行评估，例如用细胞周期FACS分析或PCNA检测软骨细胞增殖，用阿尔新蓝及茜素红染色检测软骨细胞终末分化，用X型胶原免疫组化染色检测软骨细胞过度增殖。
在另一个可供选择的实施方案中，本发明所采用的评估测试系统为包含内源性表达亚精胺合酶的离体骨培养。优选为胚胎骨培养。最优选为由鼠胚胎后腿获得的骨培养。
本测试系统中，不同候选抑制剂对软骨细胞终末分化的作用将通过对实验骨和对照骨进行染色来检测，染色法采用茜素红染色及能使正常关节软骨着色的阿尔新蓝染色。骨的径向生长将通过增殖区域及钙化骨长度的增加来计算。本测试系统将使用X型胶原免疫组化染色对过度增殖进行评估，候选抑制剂对软骨细胞增殖的作用将用PCNA进行检测。
另一个可供选择的测试系统为动物模型体内系统。根据本发明的实验方法，使用动物模型进行评估能把关节炎的发生作为终点指示。将关节炎的发生作为终点指示可通过测量实验动物脚爪厚度进行检测。实验动物脚爪大小的增加小于对照组动物的，就意味着所测试候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质或关节炎的发生起到了抑制作用。
在优选测试系统中，适用的动物模型可为表达外源性亚精胺合酶的转基因小鼠。确切地说，该转基因鼠在II型胶原增强子的作用下表达亚精胺合酶。
根据此特定实施方案，该体内测试系统对候选亚精胺合酶抑制剂作用的评估方法为，将候选抑制剂在通常情况下能导致亚精胺生物合成的条件下给予上述转基因小鼠。这些特定的适宜条件可为在使用候选抑制剂前先给予对象转基因鼠亚精胺合酶底物如SAM等。
“转基因动物”可为任何动物，优选为非人类哺乳动物，鸟类或两栖类动物也可，该动物的一个或多个细胞包含转基因成分，即用人为手段如转基因技术导入的异源性核酸。该核酸可通过精细的基因操作如微注射或重组病毒感染等方法直接或间接导入前体细胞。基因操作并不包括传统的杂种或体外受精法，而是直接指代重组DNA分子的导入。该分子可整合于染色体内，或可为染色体外复制DNA。在本文描述的标准转基因生物体内，转基因成分使细胞表达人亚精胺合酶基因。
转基因动物还包括组成性(constitutive)及条件性(conditional)“敲除”动物。本发明所指代的“非人类动物”包括脊椎动物，如啮齿类动物，非人类灵长类动物，羊，狗，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。优选非人类动物为啮齿类，包括大鼠和小鼠，最优选为小鼠。“转基因动物”是指在其体内发现重组基因，或其某些细胞但并非全部细胞内表达重组基因的动物。
“转基因成分”是指一段核酸序列(如编码亚精胺合酶的序列)，其为部分或全部异源性或外源性，即对于其导入转基因动物或细胞而言是外来的；或者其与导入转基因动物或细胞的内源性基因同源，但其插入动物基因组的位点与天然基因的位点不同，或者其插入将导致基因敲除或其他失功能性突变。转基因成分可包括一个或多个转录调节序列及其他核酸如内含子，这对于所选择核酸的最佳表达可能是必需的。
除了检测关节炎的发生以外，最好还能用上文所述离体测试系统所采用的终点指示对候选抑制剂对于转基因鼠的作用进行评估。
另一个优选体内测试系统可选用表达内源性亚精胺合酶的关节炎哺乳动物模型。该模型可将关节炎的发生作为终点指示。
可通过测量实验动物脚爪厚度对于关节炎的发生进行检测。只要实验动物脚爪大小的增加小于对照组动物的，就意味着所测试候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质或关节炎的发生起到了抑制作用。如前所述，该候选抑制剂的作用还将通过分化和增殖终点指示进行进一步检测。
“动物“是指任何适用于实验的、在分类学上属哺乳动物的，如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、家兔、狗、猫等。优选哺乳动物为小鼠或大鼠，但本发明的实验方法和系统最好也能适用于非哺乳类动物。
根据特定优选实施方案，关节炎哺乳动物模型可以为外源性诱导的关节炎大鼠或小鼠。确切地说，优选大鼠为II型胶原诱导性关节炎(CIA)雌性Lewis鼠。
本发明的一个特定优选实施方案与骨性关节炎(OA)药物组合物的制备方法相关。该方法由确定一种能导致对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程产生抑制作用的亚精胺合酶抑制剂，以及将上述抑制剂与药用可接受载体相混合两步骤组成。确定一种适合的抑制剂包括获取一个候选抑制剂及对其作用的评估。根据该实施方案，候选的亚精胺合酶抑制剂可选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物组成的组，并对其作用进行进一步的评估。
一个替代方法为通过筛选可作为亚精胺合酶抑制剂的物质来获得候选抑制剂，并对其作用进行进一步的评估。根据本发明，上述筛选方法包含下列步骤：
(a)准备包含亚精胺合酶的混合物；
(b)将上述混合物与被筛选物质在通常能引起亚精胺生物合成的条件下进行接触；以及
(c)确定被筛选物质对终点指示的作用，对上述终点的抑制即意味着亚精胺合酶受到被筛选物质的抑制。
根据该替代方法的一个特异性实施方案，终点指示可为亚精胺合酶催化反应产物的生成。上述产物可为亚精胺和甲基腺苷(MTA)中的任意一种。可通过荧光法或放射标记法对其进行检测，具体方法在下文实施例4中将加以描述。
本发明筛选及评估的实验药物可为基于蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸、自然有机物、合成衍生有机物及抗体的物质中任意一种。明确地说，上述基于核酸、蛋白质或抗体的物质可为组合文库的产物。
术语“核酸”是指多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)，在适当的时候为核糖核酸(RNA)。
该术语还应包括由核苷酸类似物生成的RNA或DNA等价物及类似物，以及用于上述实施方案的双链多核苷酸及单链多核苷酸如有意义(sense)或反义(antisense)单链多核苷酸。
在当选药物或物质中，有模拟亚精胺合酶活性区域的肽类，以及非肽类小分子。就其识别的难易程度而言，肽类在替代检测亚精胺合成抑制作用的筛选实验中尤为有用。尽管上述筛选实验在对大型化学物质库的直接筛库中未必全部适用，但可与其他技术合用在所选方向上对候选物质进行精细筛选。
本发明并不仅限于所公开及描述的实施例、方法步骤及材料，这些方法步骤及材料可在一定程度上改变。同样由于本发明的范围仅由所附权利要求书及其等价物所限定，因此本说明书中所用术语并非限定性，而是仅用于描述特定实施方案。
必须指出的是，除非在内容中明确说明，否则本说明书及附录权利要求书中单数意义的“一个”、“一种”、“该(所述)”等冠词亦包括复数范围。
在本说明书及下文权利要求书中，除非在上下文中明确指出，否则“包含”一词应理解为包括一个或一组规定的整数或步骤，而并非意味着除外其他任何一个或一组规定的整数或步骤。
下文所列举的实施例代表发明人在本发明的各个方面中所使用的技术。在仿效本发明优选实施方案使用这些技术时，本领域人员在本说明书所公开的基础上，可在不破坏本发明整体领域的前提下对其进行各种修改。
实施例
实验步骤
细胞培养
1.细胞系
1.1.HMSC-由人软骨获得的正常成年人关节软骨祖细胞。软骨在切割后于新鲜DMEM培养基中培养，在培养基中还加入了10％FCS，L-谷酰胺和抗生素。两周后去除残余碎片，并获得贴壁细胞。
1.2.U2OS-由美国典型培养物保藏中心(HTB-96)获得的人成骨细胞样骨肉瘤细胞系。
1.3.RCJ3.1C5.18-由加拿大多伦多大学Jane Aubin教授捐赠的细胞系。对该细胞系的描述请参阅《成软骨大鼠细胞系新家族中软骨祖细胞频率及软骨分化的分析》(Grigoriadis A.E，Heersche J.N，AubinJE(1996)Differentiation，60：299-307)。
1.4.293人肾细胞得自美国典型培养物保藏中心(CRL-1573)。
2.机械牵拉(mechanical stress)
HMSC细胞在培养瓶中生长以使其融合。第二代次代培养为将细胞以1×105/cm2的密度接种于聚氨基甲酸乙酯软膜上，并将其用夹子固定于机械装置上。为使细胞更好地贴附和生长，该膜事先用完全血清在室温下预处理了60分钟。在24小时内，细胞贴附于膜上。将该膜用夹子牵拉伸长33％以对其进行张力处理。该张力保持稳定达1小时。用机械刮除法收集细胞以用于分离RNA。压缩步骤如下所述：在接种细胞前将软膜用夹子固定于机械装置上，并将其牵拉伸长25％，再接种细胞并孵化24小时使其贴附于膜上。然后将拉紧的软膜放松使其恢复原先长度，使细胞压缩。压缩细胞在进行RNA提取前先静置1小时。
3.转染
稳定转染：根据制造者的说明，用Lipofectamine 2000试剂(GibcoBRL)将人亚精胺合酶基因克隆入pCMVNSVneo表达载体，转染RCJ3.1C5.18细胞。在每毫升培养基中加入0.3mg G418后筛选出稳定克隆。
RT-PCR
根据产品说明书，用EZ-RNA分离试剂盒(Biological Industries)提取稳定RCJ3.1C5.18克隆的全部RNA。根据产品说明书，用Superscript II试剂盒(GibcoBRL)进行第一条cDNA链的合成及PCR反应。
Northern印迹
用U2OS细胞提取的RNA与人亚精胺合酶进行Northern印迹。每个印迹包含2μg多聚腺苷酸+RNA，并用亚精胺合酶完全开放读码框作为探针。具体方法参见《现代分子生物学实验技术》(Ausubel FM等(ed)，(1987)，Vol.1，Section 4.9.1.)。
分化标记物染色
1.阿尔新蓝染色：用Bouin固定剂将胚胎骨固定10分钟，再用阿尔新蓝(用3％的醋酸制成1％溶液)染色30分钟，用蒸馏水洗涤。
2.茜素红染色：用70％乙醇溶液将胚胎骨固定，在冰上孵化60分钟后再用40mM的茜素红溶液(Sigma)染色10分钟。
检测增殖
1.PCNA法：根据产品说明书，用抗PCNA抗体(DAKO)对胚胎骨切片进行免疫组化染色。
检测过度增殖
X型胶原法：根据产品说明书，用抗X型胶原抗体(quartett)对胚胎骨切片进行免疫组化染色。
动物模型：
胶原诱导性关节炎(CIA)动物模型
小鼠CIA详请参阅《对II型胶原的自身免疫：关节炎实验动物模型》(Trentham D.E，Townes A.S，Kang A.H(1977).J.Exp.Med.146：857-868)。
佐剂诱导性关节炎(AA)
AA详请参阅《活化T细胞通过osteoprotegerin配体在佐剂诱导性关节炎中调节骨丢失和关节破坏》(Kong Y.Y等，(1999).Nature，402：304-308)。
半月板切除术模型
半月板切除术详请参阅《透明质酸钠在实验性关节中对家兔膝关节的作用》(Hah F，Ishiguro N，Ito T，Sakai T，Iwata H.(1999).NagoyaJ Med Sci Nov，62(3-4)：115-26)。
实施例1：
确定骨性关节炎发生和软骨修复所涉及基因的实验模型
1.实验设计：实验模型
为了理解OA发病机制的分子机制，发明人使用了一系列体外和离体模型。同时使用数个互相补充的模型促进了对几个相互关联但又相互独立生理状况的分类，从而也促进了对某特定生理或病理步骤决定性基因的选择。
所采取的实验策略是基于以下已知事实上的：
1.保存于组织培养物内的正常成人关节软骨祖细胞(HMSC细胞)及新鲜分离的人胎儿骨骺能准确地模拟关节软骨的正常基因表达模式。
2.关节模拟器内生长的经IGF-1处理的HMSC细胞和分离的人胎儿骨骺能模拟软骨修复相关步骤：正常软骨细胞成熟，为HMSC细胞过度合成高质基质，以及为骨骺保留正常软骨结构。请注意，为了模拟损伤后软骨修复过程，发明人在关节模拟器内生长的部分骨骺内刻意制造了软骨缺陷。
3.FGF-2及IL-1β，该两者都为成骨因子，都促进HMSC细胞启动成骨过程。
4.牵拉或压缩等机械刺激可能会引起软骨缺陷，导致周围软骨退化和超氧阴离子及一氧化氮(NO)合成增加，因而能模拟OA的表现。
因此，由IGF-1及关节模拟器内软骨生长引起的基因表达的改变对正常软骨的功能是有益的，可通过对其模拟起到治疗作用。与此相反的是，由IL-1、FGF-2及机械刺激引起的基因表达的改变可能与OA发生有关，因此应通过治疗手段对其进行拮抗。
1.1.体外测试系统
所选用细胞为人间叶干细胞(HMSC细胞)。骨性关节炎的发病机制提示，在患病关节软骨内，间叶干细胞不仅分化成软骨细胞系(正常修复过程所需)，还分化为成骨细胞及成纤维系细胞，因而使得损伤修复过程同时也成为致病过程。此外，通常静止于II型胶原期的关节软骨细胞进一步分化为肥大软骨细胞。如此周而复始，由于成骨因子的分泌(见上文)使得祖细胞向成骨细胞和破骨细胞的分化增多(这两种前体细胞并非常驻细胞，而是在骨髓内产生的)。根据已知事实，数种刺激可能对间叶干细胞产生作用并使其发生异常分化。这些刺激包括广泛的细胞外基质成分及结构变化，生长因子、细胞因子、化学因子的分泌，以及持续的机械强制作用。由不同刺激因素激活的间叶干细胞细胞内信号传导途径为强制性步骤。正是由于这个原因，体外研究采用了源于关节软骨的正常成人间叶干细胞培养。这些细胞是由University of Tel Aviv医学院的Zvi Nevo教授向申请人提供的。
发明人选用了下列处理方法：
IGF-1：使用对正常软骨功能和恢复有益的生长因子。抑制将最终导致软骨骨替代的软骨细胞终末分化及软骨血管化。
白介素-1：已知该炎症细胞因子在OA关节内过度产生。其诱导软骨退化酶、骨重吸收细胞因子和生物活性分子如TNF-a、IL-6、可溶性IL-6受体(slL-6R)和NO的表达。
FGF-2：该成纤维生长因子已被应用于OA发病机制及该疾病动物模型中。重症OA患者的FGF-2浓度显著高于轻症患者的。
在协同培养系统内，用重症RA患者滑液刺激产生的破骨细胞形成过程在使用FGF-2抗体中和后被实质性抑制，且该抑制作用强于其他细胞因子抗体的抑制作用。发明人由此得出结论，OA患者滑液内源性FGF-2水平的上升可能通过诱导成骨细胞(其作用可能直接进行观察)及破骨细胞系(靶细胞内某些基因的表达可能是破骨反应的间接介质，可对其进行观察)在关节破坏中起一定作用。
机械刺激：持续性机械负荷是OA发病的主要原因之一。
1.2.离体测试系统
所选用系统为关节模拟器内生长的完整分离骨骺*。
除体外实验外，发明人还使用了关节模拟器内生长的分离胎儿骨骺离体实验模型，该模型是由Zvi Nevo教授和Dr.Dror Robinson建立的，生长中的分离骨骺在该特殊装置中引起人间叶干细胞的显著增殖及其向成熟功能性软骨细胞的分化，以及大量高质基质的合成。与此相反的是，在常规组织培养条件下得到的骨骺关节组织大量凋亡和坏死。该模型的优越性体现在其能更好地反映在复杂组织内发生的基因事件(用关节模拟装置储存移植用活胚胎及成人软骨移植物Cohen，I.，Robinson，D.，Cohen，N.，Nevo，Z.(2000)，Biomaterials，21：2117-2123)。
*该关节模拟器由一个无菌生长槽组成，通过一个封闭的管道系统由大培养基储存器补充培养基。因此关节模拟器内的软骨能不断获得富含CO2的新鲜培养基。
在体内，关节软骨是由滑液滋养的，关节活动及负荷所产生的静水压不断地将滑液泵入关节腔。深层软骨，确切地说是钙化带上方的生长层软骨是由血管滋养的。因此在正常关节软骨内存在两种搏动模式，即关节运动和血液循环模式。在关节模拟器内，培养基以事先确定的最佳速度即570ml/h持续作用于组织。蠕动移液泵则产生类似于收缩压范围(150mmHg，100次/分)的正弦式压力。总而言之，关节模拟器的优点在于：
—持续灌注系统为组织提供了充分的营养，并避免了废弃产物的堆积；
—灌注系统模拟了作用于关节软骨的静水压和重力作用以刺激软骨生长。
实施例2
实验模型系统的确立
1.体外实验
发明人用HMSC细胞进行了一系列体外实验。通过各种处理方法引起成软骨反应(如IGF-1)或成骨及血管形成反应(如IL-1和FGF-2)。体外实验共进行了两轮。最初进行的是校准实验，以确定各种刺激引起的细胞反应的时间/剂量动力学。在此基础上进行了制备RNA的大规模实验，并将RNA用于基因表达轮廓实验。
1.1体外细胞系统的校准
为了验证HMSC细胞对不同刺激的分化反应，发明人将细胞用不同方法处理(见表1)，并用免疫组化染色检测其成骨细胞和成软骨细胞系细胞特异性标记物的表达。为完善HMSC细胞对分化处理的反应，发明人用不同的细胞密度(稀疏和融合)研究其生长。
表1.先导研究中对HMSC细胞的处理方案
                                         处理时间
处理方式   0  1小时  12小时  24小时  48小时   3天   6天
不处理   +     +     +     +   +   +
IL-1β 0.5ng/ml和1ng/ml     +     +     +   +   +
IGF-1 10ng/ml和20ng/m     +     +     +   +   +
FGF-2 10ng/ml和100ng/ml     +     +     +   +   +
机械刺激*(压缩和牵拉)    +
“机械刺激”如实验步骤中所述。
在实验中对下列分化标记物进行了检测：
软骨细胞终末分化及骨发生标记物：
—骨钙蛋白(骨细胞)；
—VEGF(肥大软骨细胞，血管形成)；
—成纤维生长因子受体3(FGFR 3)(软骨祖细胞及上级肥大软骨细胞)。
软骨形成标记物：
—II型胶原(软骨细胞成熟)；
—阿尔新蓝(软骨细胞成熟)。
经校正的最佳处理方法的结果如图1-3所示。
所获结果说明下列问题：
1.HMSC细胞能在高密度(融合细胞)生长及成熟，并表现出分化为成软骨细胞系和成骨细胞系迹象，但是没有肥大软骨细胞和骨细胞特异性标记物的显著表达(见图1-3，对照细胞)。
2.阿尔新蓝染色证实，IGF-1通过增加II型胶原表达及减少FGFR3表达加速软骨细胞成熟及软骨基质产生(见图1)。
3.IL-1β或FGF-2对HMSC细胞似乎都有复合作用，该处理
i)诱导祖细胞增殖，如FGFR-3表达增加所示(可能还同时反映对软骨细胞终末分化的诱导，见下文)；
ii)VEGF表达增加提示对软骨细胞终末分化及血管形成的促进；
iii)骨钙蛋白表达增加提示对骨发生的刺激；
iv)阿尔新蓝染色减少提示对正常软骨基质产生的抑制。
结论：
—IGF-1仅能刺激HMSC细胞向成软骨细胞系分化，并对其向成骨细胞系分化有一定抑制作用。因此可将其作为意图发现其产物促进正常软骨形成或抑制OA骨赘形成的基因的实验模型。
—IL-Iβ或FGF-2会使HMSC细胞发生OA中的大多数变化。
因此，其表达受该两者影响的基因可作为抗OA药物的潜作用靶点。
1.2.基因表达轮廓全尺寸体外实验
在先导研究的基础上，发明人对实验进行了如下调整：
1.由于没有观察到HMSC细胞发生任何剂量依赖性反应，因此在每种处理方案中仅使用一种剂量的细胞因子/生长因子(起初设计使用两种剂量)。这是由于在本研究中所使用的细胞因子/生长因子剂量都超出了生理范围之外。因此任何预定剂量都可能足以引起细胞的最大反应，增大剂量不会增加细胞反应。此外，大剂量的IL-1β处理显示出细胞毒作用。
2.增加了收获细胞以制备RNA的时间点(由预定的2个增加到了5个)，以增加各种处理方案引起的基因反应产物的溶解。
全尺寸实验中使用的处理方案总结见表2。
表2.全尺寸实验中对HMSC细胞的处理方案
                                                             处理时间
处理方式   0  1小时  12小时  24小时  48小时   3天   6天
不处理   +     +     +     +    +    +
IL-1β0.5ng/ml     +     +     +    +    +
IGF-1 10ng/ml     +     +     +    +    +
FGF-2 10ng/ml   +
机械刺激(压缩)   +
机械刺激(牵拉)   +
在每个时间点都进行了碱性磷酸酶染色。每个实验都进行了两次，总共进行了44次实验(22种处理方案×2次重复)。所获RNA用于制备专用OA芯片(见下文)以及用于杂交“OA”芯和“纤维变性”芯片的探针。
2.OA研究离体实验模型
除HMSC体外测试系统外，发明人还分别于切除同时及在关节模拟器内生长3天后提取(胎龄22周)人胎儿骨骺RNA。由于在原定的第一天时间点上没有观察到任何生物效应，因而将该点取消。为了启动基质恢复，在将其置于关节模拟器内之前先对部分骨骺进行了损伤。由于先导研究已经证实，骨骺在常规组织培养条件下无法存活，因而用该损伤后培养的方案取代了原定在常规组织培养条件下对骨骺进行离体培养的方案。每个离体实验皆进行了两次，总共进行了6次实验(3种条件×2次重复＝6次实验)(见表3)。离体实验所提取的RNA也同样用于制备专用“OA”芯片。由此产生的探针用于杂交“OA”芯片和“纤维变性”芯片。
表3关节模拟器内人胎儿骨骺的处理方案
处理方式     骨骺数目
新鲜分离     6(3个/杂交)
关节模拟器内生长3天     6(3个/杂交)
损伤后再于关节模拟器内生长3天     6(3个/杂交)
*每个探针都是从由3个经类似方法处理的骨骺提取的RNA池中制备的。
实施例3
确定在骨性关节炎发生和软骨修复中涉及的基因
1.制备“OA”和“纤维变性”芯片
发明人用其SDGI法由经上述方法处理的HMSC细胞提取的RNA及由离体实验所获的RNA池制备“OA”芯片，其具体方法的描述见于出版号为No.WO01/75180的美国专利申请，其全文在此并入以作参考。其共包含10,000个cDNA克隆。“纤维变性”芯片也通过发明人的上述SDGI法制备。
2.与cDNA微阵列杂交。
2.1.标记探针并与DNA微阵列杂交
用1克polyA RNA合成探针，RNA由经逆转录酶(Superscript，Gibco-BRL)及18-mer oligo-dT引物处理的样本获得。在逆转录过程中还使用了Cy3-dCTP(Amersham)或Cy5-dCTP(Amersham)标记cDNA。杂交、以及接下来的扫描和显影方法参见：Schena，M.等(1996)Proc Natl Acacl，Sci ilSA 93，10614-10619。杂交质控用发明人自身的方法进行。
2.2.杂交设计
根据表4，用cDNA探针去杂交OA及人纤维变性cDNA微阵列。
在所有的杂交中，探针2都是同样的，其成分为0时间点RNA提取物(见表4，共用对照)。其作为标准化探针使得我们可将不同杂交的结果用统计分析方法进行比较。每种杂交的探针1都是由经各种方法处理的细胞或离体培养器官提取的RNA制备的。全套杂交重复2次，总次数为26种杂交×2个cDNA微阵列×2次重复＝104次杂交。
表4：杂交方案
探针编号 探针名称     染色 人关节软骨RNA处理方法
    1 SOA1     cy5 对照12小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    2 SOA2     cy5 对照24小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    3 SOA3     cy5 对照48小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    4 SOA4     cy5 对照3天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    5 SOA5*     cy5 对照6天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    6 SOA6     cy5 IL-1b处理12小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    7 SOA7     cy5 IL-1b处理24小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    8 SOA8     cy5 IL-1b处理48小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    9 SOA9     cy5 IL-1b处理3天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    10 SOA10     cy5 IL-1b处理6天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    11 SOA11     cy5 IGF-1处理12小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    12 SOA12     cy5 IGF-1处理24小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    13 SOA13     cy5 IGF-1处理48小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
 探针编号 探针名称     染色 人关节软骨RNA处理方法
    14 SOA14     cy5 IGF-1处理3天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    15 SOA15     cy5 IGF-1处理6天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    16 SOA16     cy5 FGF-2处理12小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    17 SOA17     cy5 FGF-2处理24小时
NML21(共用对照)     cy3 正常
    18 SOA18     cy5 FGF-2处理48h
NML21(共用对照)     cy3 正常
    19 SOA19     cy5 FGF-2处理3天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    20 SOA20     cy5 FGF-2处理6天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    21 OA23     cy5 损伤后于关节模拟器内生长3天
NML21(共用对照)     cy3 正常
    22 OA24     cy5 关节模拟器生长3天对照
NML21(共用对照)     cy3 正常
    23 OA27     cy5 新鲜分离骨骺
NML21(共用对照)     cy3 正常
    24 SOA30     cy5 HMSC
NML21(共用对照)     cy3 正常
    25 SOA31     cy5 17周AC压缩1小时(MF)
NML21(共用对照)     cy3 正常
    26 SOA32’     cy5 17周AC牵拉1小时(MF)
NML21(共用对照)     cy3 正常
*探针SOA5表现出伪象，因而在进一步分析中将其舍去。
2.3.杂交结果分析
发明人用运算法则分析杂交数据以进行质量控制，并用两种不同的算法分析基因群集。
2.3.1质量控制
质量控制的目的在于准确平衡Cy3和Cy5信号，以检测出在某给定杂交中推定为鉴别价值很差的“可疑”信号，并将原始数据转化为合适的形式以共进一步分析。用于检测在某给定杂交中推定为鉴别价值很差的“可疑”像素的算法，是建立在一套实验中不同杂交的共用对照信号对数在二维平面上稳定分布的基础上的。
在正常情况下，该分布集中于对角线，数据变异有其合理的稳定性。根据该变异，可对任一像素是否“可疑”进行评分，这些“可疑”像素即被自动标记。如果某杂交中仅有部分像素为“可疑”，则该杂交可用于进一步的分析，但必须事先了解的是那些数据是可信的，而那些不是。
2.3.2群集算法
算法1.该步骤为“盲算”，并不需要事先了解生物条件之间的关系。
在多维空间中，待分析基因都是分布于其中的点，群集的基础找出其中最密集的区域。密度的计算是通过相关性或欧几里德距离得到的。具体算法大致如下所述。选择待分析基因最密集的区域，将其定为第一群，将密集其次且与第一个区域无交集的区域定为第二群，依此类推。对区域范围的限定所依据的原则是该区域内的随机化的基因的平均表观为1。根据其在空间中的接近程度，这些窄群可进一步合并为宽群。根据其在全部基因表达轮廓的共变矩阵中分布的程度将经确定的群进行排位。
算法2.待分析组内不同杂交的生物学分类的假说一经确立，即可检测其行为与该假说密切相关的基因。用Fisher标准计算每个基因的差别表现。那些差别基因是最显著的基因。
根据下列方案对结果进行分析：
1.对每个微阵列分别进行质量控制。
2.对每个微阵列按算法1分别进行群集。
3.对每个微阵列按算法2分别进行群集。
4.对每个微阵列分别进行群集数据比较。
5.单独按算法1、单独按算法2及同时按两种算法对每个微阵列进行选择，将所获数据建立一个统一的群集基因表达数据组
6.确定最突出的基因表达模式(群集)并据其选择用于测序和注解的基因。
7.(用上述算法识别后)将由两个微阵列选择出来的基因组进行测序基础上的比较，并确证同一基因的表达模式是一致的。
8.建立由两个微阵列所获群集基因的无冗余目录。
9.进一步解释那些与EST’s(识别及同族搜索)一致的无注解克隆。
10.进一步解释未知基因和推定蛋白(同族搜索和结构域分析)。
11.对已知基因进行文献分析。
2.4.实验结果
在完成了对杂交结果的全部分析之后，发明人得到一个基因目录，其中57个基因是由“纤维变性”芯片获得的，197个是由“OA”芯片获得的。
根据已有生物医学文献和公共数据库的资料，发明人对部分已知基因进行了分析。
其中最令人感兴趣的是IL-1和FGF调节基因，这是由于其作为骨性关节炎表现的潜在意义(见上文)，即软骨基质的退化和对异位骨发生的刺激。
因此，其表达受FGF-2的基因影响的基因是本发明的终点关注对象。
该范畴内的基因是指在经FGF处理细胞内其表达不同于未经处理对照细胞内的基因。
在已经确认的基因中，已经发现亚精胺合酶(也表示为SEQ IDNo.1)的表达受FGF-2上调，但其在关节炎性疾病中的作用仍然未知。
亚精胺是三种生物活性多胺的其中之一。在小牛肩胛骨骨骺软骨中，多胺在骨化区即钙化发生的部位的浓度比静止区的要大。其中亚精胺含量大于精胺和腐胺含量。由于只能在静止区组织内检测到鸟氨酸脱梭酶，因此多胺的生物合成发生于静止区，随后在骨化区浓聚。免疫组化证据亦显示仅在骨化区有细胞外亚精胺的存在。因此，多胺可能与骨化前软骨的钙化有关(Vittur F等1986)。亚精胺依赖性蛋白在由1α，25-(OH)2D3及白介素4诱导的小鼠齿槽巨噬细胞融合中有一定作用。多胺，尤其是亚精胺，可能是1α，25-(OH)2D3诱导蛋白质合成并最终导致巨噬细胞融合的重要细胞内介质。当加入甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(丙咪腙)(MGBG)抑制亚精胺合成后，1α，25-(OH)2D3诱导合成增加的14种蛋白质中，其中9种合成增加效应显著减小，同时巨噬细胞的融合也随之受到抑制。再次加入亚精胺则使该9种蛋白质的合成及巨噬细胞的融合得到恢复。由于破骨细胞也必须经由融合才能获得活性，因此多胺可能在破骨细胞活化过程中有一定作用。维生素D在骨骼形成过程中的已知作用也支持该假说(Hayashi T等，1986)。
在此本发明人第一个证实了FGF-2对HMSC细胞亚精胺合酶的上调作用可能有骨发生作用。因此亚精胺合酶可作为筛选OA候选药物的优选靶点。
实施例4
对亚精胺合酶抑制剂作为OA药物可能性的评估
将亚精胺合酶作为筛选可用于抑制或延缓OA药物的候选抑制剂的靶点是基于其受bFGF-2(3ng/ml bFGF，50mg/ml维生素C和10-8M地塞米松)上调的事实上的。此外，对人胚胎骨的原位杂交研究显示，在滑膜内、骨小梁附近成骨细胞内以及骨内膜内有亚精胺合酶的表达。在新发生骨的软骨细胞内也观察到了同样的信号。
以下发现支持亚精胺合酶在OA中可能起一定作用：
1.骨化软骨的多胺含量比静止区的高。骨化区的亚精胺含量比静止区高5倍，精胺含量高2倍。骨化区的亚精胺/精胺比值为1.7，而静止区的比值为0.69(Vittur F等，1986)。
2.关节炎患者滑液中的多胺水平增高(Nesher G等，1997)。
3.ODC生物合成抑制剂在降低亚精胺水平及血清抗II型胶原抗体的同时，能预防胶原诱导性关节炎(CIA)的发生(Wolos J.A等，1990)。
4.抑制亚精胺的生物合成能抑制巨噬细胞融合。加入亚精胺能使该活性恢复(Hayashi T等，1986)。
5.体外研究显示，三种多胺中仅亚精胺具有将蛋白多糖亚基从II型胶原柱上置换下来的能力(Vittur F等，1986)。
6.亚精胺能增加碱性磷酸酶的活性(过度增殖及钙化的标记物)(Vittur F等，1986)。
在第一次大体分析中，发明人使用Northern印迹分析亚精胺合酶在不同组织内的基因表达形式。如图4所示，在所有检测组织内都发现了所预期的1.3Kb mRNA条带。
1.潜在的亚精胺合酶抑制剂
发明人对下列现有已知的不同亚精胺合酶抑制剂作为OA药物的可能性进行了评估：
腺苷亚精胺
AdoDATO
DCHA
反式-4-甲基环己胺
环己胺
甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(methylglyoxal bis(cyclopentylamidinohydrazone)，(MGBP))
2-巯基丙胺
N-氯磺酰二环己胺
5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷
1-氨基氧基-3-氨基丙烷
5′-(异丁硫基)腺苷
5′-(甲硫基)腺苷
还对用下列筛选方法所获的新亚精胺合酶抑制剂进行了评估：
1.1.放射性法
用放射性酶标法检测亚精胺合酶的方法详见《快速法检测腐胺氨丙基转移酶(亚精胺合酶)和亚精胺氨丙基转移酶(精胺合成酶)》(Raina，A.，Eloranta，T.，Pajula，R.L.(1983)，酶学方法94：257260.)。这些方法中要使用3H-，14C-或35S-标记的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(用E.coli SAM合成酶制备标记甲硫氨酸)。对甲硫氨酸中最初标记原子的选择决定何种产物(亚精胺或甲基腺苷(MTA))被最终标记。在最初的使用方法中使用DL-(2-14C)甲硫氨酸，得到标记的亚精胺产物。该方法需将标记亚精胺与标记反应物脱梭SAM分开，不能满足高产量筛选(HTS)的要求。因而产生了改良法，即使用L-(甲基-14C)甲硫氨酸，最后产生标记产物为甲基腺苷，使得实验方法大大简化，从而成为HTS生物方法发展的候选方向之一。简而言之，该方法需将标记脱梭SAM与标记MTA分开，用磷纤维素阳离子交换器即可做到。该交换器在酸性条件下结合MTA，而不结合脱梭SAM。
1.2.荧光法
现有多种不同的荧光法可用于识别一级胺和二级胺。在该方法中，一级胺先与水杨醛反应以获得希夫碱。亚精胺和腐胺之间的差异在于前者有一个二级胺，因而该二级胺可与丹磺酰氯或NBD氯化物反应以产生荧光产物。
2.对亚精胺合酶抑制剂作为OA药物可能性的评估
为了评估不同亚精胺合酶抑制剂作为OA药物的可能性，发明人对其导致的对软骨细胞增殖及终末分化的抑制，以及对关节炎发生的抑制作用进行了检验。发明人用下列评估测试系统对不同的亚精胺合酶抑制剂进行了检验：
2.1.体外测试系统
2.1.1.人亚精胺合酶全长cDNA的亚克隆
发明人用U2OS细胞提取的RNA通过RT-PCR克隆了人亚精胺合酶的全部开放读码框(接入号为BC000309和NM-003132)。用AvrII和KpnI双分解RT-PCR产物，并将其亚克隆为pCMVNSV-neo和pBScKS以用于TNT反应。此外，发明人还用RT-PCR法克隆了在N端用组蛋白标记的全部开放读码框。用AvrII消化RT-PCR产物，并将其亚克隆为pBSc以用于TNT反应。用NotI和HindIII消化该构建体，并将嵌入段亚克隆入pCMVNSV-neo NotI-HindIII。将上述四种构建体完全测序，其结果证实克隆序列于公布序列完全匹配。此外，还将该基因亚克隆为pIRES-puro表达载体(Clontech)。
2.1.2.用瞬时转染的293细胞检验亚精胺合酶构建体
为了检验上述构建体，发明人使用了用人亚精胺合酶cDNA(包含组蛋白标记并克隆为pIRES puro)瞬时转染的293细胞。细胞在无血清培养基中生长2天后收集培养液及溶解产物。用10％SDS凝胶分离蛋白质，再进行杂交。用抗组蛋白抗体与膜进行反应。结果观察到了所预期的35kDa条带(代表亚精胺合酶的一个亚基)(见图5)。
2.1.3.转染细胞中增殖或分化速率的增加
用过度表达外源性人亚精胺合酶基因的不同转染细胞系(如软骨细胞，内皮细胞)检验一个亚精胺合酶抑制剂，可获得不同的终点指示参数，其结果意味着对软骨细胞增殖及其终末分化的抑制。增殖或分化速率增大则意味着上述基因可能在诱导关节炎发生的途径中起一定作用。
2.1.4.建立稳定转染细胞系
将缺乏组蛋白标记的人亚精胺合酶cDNA克隆为pCMVneo表达载体，用于稳定转染RCJ3.1.C5.18细胞系。用RT-PCT法共分离了30个以上的克隆并对其进行了筛选(见图6)。选择最高表达克隆用于药物评估实验。
用提示软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质的终点指示检验亚精胺合酶的过度表达效应。这些参数在过去已经被证实与OA相关。本发明的体外测试系统也被用于评估不同亚精胺合酶抑制剂抑制及减弱这些效应的能力。
用阿尔新蓝染色(将软骨蛋白多糖着色)、碱性磷酸酶活性及X型胶原免疫组化染色可评估软骨细胞的分化。碱性磷酸酶活性或X型胶原免疫组化染色的增加意味着软骨细胞的终末分化。
软骨细胞增殖可通过测定细胞数量和胸腺嘧啶掺入率进行评估。
2.2.离体测试系统
发明人用表达内源性亚精胺合酶的离体胚胎骨器官培养检验不同的候选抑制剂对软骨及骨形成中亚精胺合酶的抑制作用。实验材料为小鼠胚胎(E16)后腿。用加入10％胎牛血清(FCS)、0.05mg/ml维生素C及1mM磷酸甘油的改良Eagle′s培养基培养骨。在300l完全培养基内用24孔组织培养板上以每孔一骨的密度，将培养板置于5％CO2孵箱中，在37℃及98％湿度的条件下进行培养。将浓度渐增的不同亚精胺合酶抑制剂如AdoDATO抑制剂(5-50M)加入培养基，骨培养共持续7天。在0时间点和培养7天后，对经候选抑制剂处理的骨及对照骨进行评估。
用茜素红(使钙化组织着色)和阿尔新蓝(使软骨蛋白多糖着色)将对照组和实验组骨切片染色，以评估软骨细胞终末分化。同时也测量了骨的径向生长以计算过度增殖区及钙化骨长度的增加。还通过X型胶原染色进一步评估过度增殖的程度。软骨细胞增殖的程度由PCNA法检测。
2.3.体内测试系统
发明人用两个体内测试系统评估不同亚精胺合酶抑制剂对不同OA相关参数如软骨细胞增殖、终末分化及关节炎的发生等的作用：其一过度表达外源性亚精胺合酶，另一个表达内源性亚精胺合酶。两者都作为本发明的OA模型。
2.3.1.表达外源性亚精胺合酶的转基因小鼠
在本系统中，用提示软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成、破骨细胞破坏骨质及关节炎发生的不同终点指示检验亚精胺合酶过度表达的作用。
在II型胶原增强子作用下表达人亚精胺合酶cDNA的转基因FVBN小鼠模型已经建立成功。在转基因小鼠胚胎(E17)或一周龄小鼠切片中检测软骨的形成。用阿尔新蓝和茜素红染色切片评估终末分化的程度。用PCNA法评估增殖的程度。
通过测量成年亚精胺合酶转基因小鼠脚爪的厚度来检测关节炎的发生。为促进这些转基因小鼠体内发生亚精胺合成，小鼠都经脱梭SAM(亚精胺合酶底物之一)处理。脱梭SAM是溶解于饮用水中，经口施用给小鼠的。
2.3.2.表达内源性亚精胺合酶的关节炎大鼠
关节炎大鼠作为表达内源性亚精胺合酶的评估系统在本实验中使用。根据Trentham的方法在雌性Lewis鼠中诱导胶原性关节炎(对II型胶原的自身免疫：一个关节炎实验模型Trentham D.E，TownesA.S，Kang A.H(1977)，J.Exp.Med.146：857-868)。将1.6mg/ml小牛II型胶原及0.4mg/ml佐剂肽溶液加入等体积弗氏不完全佐剂(DIFCO，MI)，用匀浆器在4℃下以10,000转/分的速度搅拌15分钟制成乳剂。在实验的第0天，每个动物都皮内给予1ml乳剂，内含0.8mg胶原。
用提示软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成、破骨细胞破坏骨质及关节炎发生的不同终点指示参数检验不同候选抑制剂对亚精胺合酶的抑制作用。
将不同亚精胺合酶抑制剂施用于关节炎大鼠(II型胶原诱导性关节炎(CIA))。将抑制剂溶解于水中，可经口使用给大鼠或直接进行关节腔内注射施用。通过测量脚爪厚度监测关节炎的发生。此外，还用组织学方法检测实验组及对照组动物的切片。
用阿尔新蓝及茜素红染色切片评估终末分化的程度。用PCNA法评估增殖的程度。
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aaaaaaaa                                                            1268

Claims (31)

1、一种治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的方法，其包含给所述的对象施用足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制的量的亚精胺生物合成抑制剂以由此达到治疗所述对象的目的。
2、权利要求1的方法，其中所述的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。
3、权利要求2的方法，其中所述的亚精胺合酶抑制剂选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺(4MCHA)、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(MGBP)、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其任何功能同族物和类似物组成的组。
4、亚精胺生物合成抑制剂在治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象中的用途，其中所述的抑制剂的量足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制而由此达到治疗所述对象的目的。
5、权利要求4的用途，其中所述的亚精胺生物合成抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。
6、权利要求5的用途，其中所述的抑制剂选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(MGBP)、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其任何功能同族物和类似物组成的组。
7、亚精胺生物合成抑制剂在制备用于治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的药物组合物中的用途。
8、权利要求7的用途，其中所述的亚精胺生物合成抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。
9、权利要求8的用途，其中所述的抑制剂选自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)(MGBP)、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物组成的组。
10、一种用于治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的治疗组合物，其包含一种亚精胺生物合成抑制剂以及一种载体，所述的抑制剂的量足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制。
11、权利要求10的治疗组合物，其中所述的亚精胺生物合成抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。
12、权利要求10或11的治疗组合物，其中所述的载体为药用或兽用可接受的载体。
13、一种制备用于治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的治疗组合物的方法，所述方法包含的步骤为：
a.获得足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制的量的亚精胺生物合成抑制剂，以及
b.将所述的抑制剂与药用可接受的载体混合。
14、一种鉴定亚精胺生物合成抑制剂的方法，其中所述的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂而所述的鉴定通过以下步骤进行：
a.获得候选亚精胺合酶抑制剂；
b.用一种评估方法通过与对照比较而评估所述候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成以及破骨细胞破坏骨质中任一过程的作用。
15、权利要求14的方法，其中所述的评估方法包含的步骤为：
i.提供包含编码亚精胺合酶的DNA的测试系统；
ii.将所述系统与所述候选亚精胺合酶抑制剂在正常情况下能导致亚精胺表达的条件下进行接触；以及
iii.与对照比较而确定检测候选抑制剂对终点指示的作用，其中所述作用意味着所述检测候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程有抑制作用。
16、权利要求15的方法，其中所述测试系统为包含外源性表达的亚精胺合酶的体外转染细胞培养物。
17、权利要求16的方法，其中所述的转染细胞培养物为以pCMVneo表达载体稳定转染的RCJ3.1C5.18细胞培养物，所述的载体包含编码亚精胺合酶蛋白的核酸序列。
18、权利要求15的方法，其中所述的测试系统为包含内源性表达亚精胺合酶的离体骨培养物。
19、权利要求18的方法，其中所述的骨培养物为胚胎骨培养物。
20、权利要求15的方法，其中所述的测试系统为包含动物模型的体内测试系统。
21、权利要求20的方法，其中所述的终点指示为关节炎的发生。
22、权利要求21的方法，其中所述关节炎的发生是通过测量所述动物的脚爪的厚度而确定的，其中与对照比较脚爪尺寸的增加较小意味着所述检测候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程以及对关节炎的发生有抑制作用。
23、权利要求20至22中任一项的方法，其中所述动物模型为转基因小鼠。
24、权利要求20的方法，其中所述的体内测试系统为表达内源性亚精胺合酶的关节炎哺乳动物模型。
25、权利要求24的方法，其中所述终点指示为关节炎的发生。
26、权利要求25的方法，其中所述关节炎的发生是通过测量所述动物的脚爪的厚度而确定的，其中与对照比较脚爪尺寸的增加较小意味着所述检测候选抑制剂对软骨细胞增殖、软骨细胞终末分化、血管形成及破骨细胞破坏骨质中任一过程以及对关节炎的发生有抑制作用。
27、权利要求24至26中任一项的方法，其中所述的关节炎哺乳动物为关节炎大鼠。
28、权利要求14的方法，其中通过自由腺苷亚精胺、AdoDATO、DCHA、反式-4-甲基环己胺、环己胺、甲基乙二醛双(环戊基脒腙)，(MGBP))、2-巯基丙胺、N-氯磺酰二环己胺、5′-((3-氨丙基)氨基)-5′脱氧腺苷、1-氨基氧基-3-氨基丙烷、5′-(异丁硫基)腺苷、5′-(甲硫基)腺苷及其功能同族物和类似物组成的组中选出一种抑制剂而获得一种候选亚精胺合酶抑制剂。
29、权利要求14的方法，其中通过进行一种物质筛选方法而获得一种候选亚精胺合酶抑制剂，所述物质为亚精胺合酶抑制剂，所述的筛选方法包含的步骤为：
a.提供包含亚精胺合酶的混合物；
b.将所述混合物与检测物质在正常情况下能导致亚精胺生物合成的条件下进行接触；以及
c.确定所述检测物质对终点指示的作用，其中对所述终点指示的抑制意味着亚精胺合酶被所述检测物质抑制。
30、权利要求29的方法，其中所述的终点指示为亚精胺合酶催化反应产物的出现。
31、权利要求30的方法，其中所述的亚精胺合酶催化反应产物的出现导致产生可检测的荧光信号或放射性信号。
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