CN1308684A - 鉴定药物作用途径的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了几种方法,用于通过如下步骤鉴定和表现药物对细胞作用的生物途径:(ⅰ)测定对于细胞分级暴露于所研究药物细胞成分的应答;(ⅱ)测定对于该细胞一种或几种生物途径中扰动的细胞成分的应答,以及(ⅲ)定标一组所测定的途径应答,以便根据客观的测定最佳地拟合所测定的药物应答。在另一些实施方案中,本发明还对所鉴定的表现提供显著性检验,并证实所鉴定的途径是真实的药物作用途径。在不同的实施方案中,可通过测定基因表达,蛋白质丰度,蛋白质活性,或者这些测定量的组合来确定对细胞的作用。在另一些不同的实施方案中,通过使用可滴定的表达系统,使用转染系统,改变途径RNAs的丰度,改变途径蛋白质的丰度,或者改变途径蛋白质的活性,可以形成对细胞内生物途径的扰动。本发明还提供了根据鉴定药物作用生物途径的方法用于药物开发的方法,并且提供了一些方法,用于表现参与环境改变对细胞作用的生物途径。

Description

鉴定药物作用途径的方法

1.发明的领域

本发明的领域涉及用于鉴定药物在细胞内作用的方法，特别是用于寻找受药物作用影响的细胞内生物途径的方法，以及应用这些方法发现药物。

2.背景

鉴别药物或候选药物作用的生物途径是一个具有巨大经济价值的课题，并对人类有重大意义。虽然常常可知道或推测一种药物影响的主要靶分子和细胞途径，因为最初是通过特定的药物筛选方法选择了这种药物，但是重要的是要证明它对这种主要途径的作用，并定量它常常以未预料的方式沿着其它可能是有害的或者有利的次要途径的作用。在另一些情况下，药物作用的主要途径是未知的，必须对确定这些途径。

对于许多应用研究领域，例如药物的发现，这种信息是重要的，药物的发现是一个借助它对生物活性化合物进行鉴定和初步描述特征的过程。在对人类疾病治疗的进程中药物的发现是一个关键性步骤。目前，二种途径支配着新药寻找过程。首先是以特定的生物检测法进行测定，开始筛选对细胞或机体具有所需作用的化合物(例如，诱发细胞凋亡或抑制血管形成)。然后可对具有所需活性的化合物进行修饰，以便增强其效力，增加稳定性或其它特性，并以此生物测定法再次测试这种经修饰的化合物。这样，当以小鼠肿瘤模型进行测试时，就可能鉴定具有血管形成抑制剂作用的化合物，然后合成结构相关的化合物，并用同样的测定法再次测试。这种方法的一个局限性是，通过筛选常常不知道也不能测定其作用机制，例如受此化合物影响的靶分子的细胞途径。此外，这种测定方法仅能提供很少有关药物作用特性的信息，不论是有关作用的靶标或作用途径。最后，所需要花费的实验努力限制了通过测试对细胞或动物生物作用可筛选的化合物数量。

相比之下，药物筛选的第二种途径包括测试大批化合物对已知靶分子的特异性作用，典型的靶分子是克隆的基因序列或者分离出的酶或蛋白质。例如，可用于测试大批化合物改变来自特定启动子转录水平的能力，或者改变对已鉴定蛋白质结合能力的方法，可以发展成为高通量的测定方法。虽然使用高通量的筛选是鉴定候选药物的强有力的方法，但也具有局限性。主要的缺点是这种测定方法仅能提供很少，或者不能提供有关化合物在细胞或机体水平作用的信息，特别是涉及受影响的真正细胞途径的信息。为了测定在体内的毒性或副作用，必须通过将药物用于一系列生物细胞和整体动物试验来测试这些作用。实际上，对候选药物特性和毒性研究的分析可能耗费药物开发过程的大部分时间(参见例如Oliff等1997，“药物开发的靶分子”，in Devite等，癌：肿瘤学的原理与实践，第五版，1997 Lippincott-Raven出版公司，Philadelphia)。

几种基因表达的测定方法现在已可实际应用于在细胞培养中定量测定药物对大部分基因和蛋白质的作用(参见例如Schena等，1995，对具有互补DNA微阵列的基因表达模型的定量监测，科学270：467-470；Lockhort等，1996，通过对高浓度寡核苷酸序列的杂交进行表达监测，自然生物技术学14：1675-1680；Blanchqrd等，1996，排列顺序：探测基因组的奥密，自然生物技术学14，1649；1996，US专利5,569,588，Ashby等1996.10.29公开，标题为“药物筛选的方法”)。来自这些基因表达测定法的原始数据常常难以协调一致地加以解释。这种测定技术一般可报告在应答药物时具有改变表达的许多基因，典型地是50-100，可能达到1000，或者少至10。在一般情况下，不作进一步分析，仅根据这些数据不可能辨别其原因和作用。在一对相关的生物状态下许多基因中的一个或几个也具有改变表达的事实，导致几乎不能理解是什么引起了这种改变以及这种改变的作用是什么。这些数据本身并不告诉研究者关于受影响的途径或作用机制。它们并不指示哪些作用起因于对主要途径的作用，以及哪些作用是受药物影响的其它次要途径的结果。所有这些受影响途径一个一个单独的知识，对于理解药效，副作用，毒性，可能的失效，以及对代谢应答的激活等等都是有用的。进而，鉴定药物作用的所有途径可以导致发现适合于达到原先治疗目的的另外一些途径。

基因表达研究者必须进一步实验。至少在药物靶标筛选的情况的基因表达研究者必须进一步实验。至少在药物靶标筛选的情况下，需要用于指导分析整理这些数据和这种进一步实验的系统方法。

因此，需要有改进的方法(例如，更快速和较少花费的方法)用于根据对这些数据如基因表达数据的有效分析整理，鉴定药物的活性特征和受药物影响的细胞途径的特征。本发明提供了用于快速鉴定受候选药物影响的靶分子和途径以及描述它们特性的方法。还进一步提供了基于不同于基因表达分析的测定方法的一些方法。

3.发明概述

本发明提供了用于测定通过它药物对细胞起作用的主要和次要生物途径的方法，以及鉴定通过每种途径被影响的蛋白质和基因的方法。这种方法包括将在应答药物暴露时RNA或蛋白质丰度或者活性的测定量与在应答对每种途径受控的已知扰动时可能受药物影响的途径中RNA或蛋白质丰度或者活性的测定量进行比较。在不同强度的药物暴露下测定RNA或蛋白质的丰度或者活性。将已知的途径扰动控制在不同的强度，跨越从途径抑制直至途径饱和范围内的主要区域。另外，本发明提供了通过比较在应答同时的药物处理和受控的途径扰动时RNA或蛋白质丰度或者活性的测定量，证实受药物影响的可能途径的方法。进而本发明提供了比较二种不同药物作用的方法，是通过将在应答暴露于第一种药物时RNA或蛋白质丰度的测定量与在应答暴露于另一种或几种药物时RNA或蛋白质丰度的测定量进行比较。

本发明的方法是基于如下发现，通过应用涵盖一系列途径扰动强度和药物暴露水平的数据，可以使对药物作用生物途径的分析坚实可靠。一般来说，生物途径的扰动和药物暴露水平优选地包括从对整个途径没有作用至饱和状态的范围。在以前的方法中，这种分析常常仅基于这些范围内的二个点，即不暴露或扰动和充分饱和的暴露或扰动。这种局限的信息导致了较少坚实可靠的结果。

例如，这些方法具有显著的优点和改进，优于仅仅基于应用遗传缺失或过度表达的分析方法，这种方法一般仅能给出对固定饱和状态的数据。首先，遗传缺失或过度表达的细胞株未必可用于所需的生物系统。其次，应用来自一系列生物途径扰动强度和药物暴露水平的应答数据，大大提高了区别沿不同途径所介导作用的能力。例如，一种所研究的药物可能沿二条途径具有不同的效力，这二条途径会聚影响一组重叠的基因。跨越一系列途径扰动强度和药物暴露水平的实验可以表明，这些途径在不同的药物暴露水平变得有效。另一方面，来自完全中断每条途径的遗传缺失突变的数据，不能分辨这种效力差异。

更详细地说，本发明提供了用于通过如下步骤鉴定和表现药物对细胞作用的生物途径的方法：(i)测定细胞成分对细胞分级暴露于所研究药物的应答；(ii)测定细胞成分对一种或几种细胞生物途径扰动的应答；以及(iii)定标一组所测定的途径应答，以便使所测定的药物应答最好地符合于客观的测定。在另一些实施方案中，本发明还提供用于检验所鉴定表现的显著性，以及用于验证所鉴定途径是药物作用的真实途径。在一些不同的实施方案中，可以通过测定基因表达(即RNA水平)，蛋白质丰度，蛋白质活性，或一组这样的测定量来检定细胞成分的应答。在不同的实施方案中，通过使用可滴定的表达系统，使用转染系统，改变途径RNAs的丰度，改变途径蛋白质的丰度，或者改变途径蛋白质的活性，可以形成对细胞内生物途径的扰动。本发明还提供了基于鉴定药物作用生物途径的方法用于药物开发的方法。

在第一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用于表现包含在一种细胞类型药物作用中的生物途径，此方法包括：(a)提供该药物在此细胞类型中的药物应答，该药物应答已通过包括在对该药物的多种暴露水平下，测定此细胞类型的细胞中许多细胞成分的方法获得；(b)提供一种作为该细胞类型中一种或几种生物途径应答组合的模式药物应答，其中该细胞类型中的生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定该细胞类型细胞中该生物途径的细胞成分，并且其中该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；以及(c)确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，它可最小化该药物应答与所述模式药物应答之间差异的目标函数值，从而该一种或几种生物途径应答组合在最佳定标转换条件下可表现包含在该细胞类型药物作用中的生物途径。

在第一实施方案的第一方面中，本发明进一步提供，这种确定步骤还包括确定该目标函数的“真实”最小化值，以及在该确定步骤(即上面的步骤c)之后，通过一种方法评价此一种或几种生物途径的所述最佳定标转换的统计学显著性的步骤，此方法包括：(a)获得该目标函数最小化值的预期概率分布；以及(b)依据该目标函数最小化值的预期概率分布，评价所述目标函数真实最小值的统计学显著性，其中该目标函数真实的最小化值是从所提供的药物应答和所述模型药物应答确定的目标函数最小化值。在第一实施方案的这方面，本发明进一步提供，获得所述目标函数最小值预期概率分布的步骤进一步包括如下步骤：(a)通过随机化相对于所述一种或多种生物途径的多种扰动水平的一种或几种生物途径应答，随机化所述相对于多种药物暴露水平的药物应答和随机化所述模式药物应答；(b)通过寻找该一种或几种随机化的生物途径应答的最佳定标转换，确定该目标函数的“理论”最小化值，此最佳定标转换可最小化所述随机化的药物应答与随机化的模式药物应答之间差异的目标函数；以及(c)重复前面的二个步骤，以便确定多个理论最小值，该多个理论最小化值形成所述最小化值的预期概率分布。

在第一实施方案的第三方面，本发明进一步提供了在所述的确定步骤之后通过一种方法验证所述一种或几种生物途径是真实地包含在该细胞类型该药物作用中的生物途径的步骤，此方法包括：(a)通过一种方法提供在该细胞类型中组合的药物-扰动应答，此方法包括测定同时暴露于一种或几种对该药物的暴露水平和一种或几种对所述一种或几种生物途径的扰动水平的该细胞类型中的多种细胞成分；以及(b)选择如下模式应答中行为最类似于所述组合的药物-扰动应答的模式应答：(i)第一种模式应答在最佳定标转换的条件下包含一种或几种生物途径应答的组合，此最佳定标转换是按一个或几个第一总数估算的，每个第一总数是一个或几个药物暴露水平中的一个在定标转换的条件下与一个或几个对生物途径扰动水平中一个的总和，(ii)第二种模式应答包含一个或几个第二总数，每个第二总数在按一个或几个对生物途径扰动水平中一个估算的最佳定标转换条件下，是按一个或几个药物暴露水平中一个计算的药物应答与一个或几个生物途径应答组合的总和，从而如果选择第一种模式应答则可验证所述一个或几个生物途径为真实包含在该细胞类型该药物作用中的生物途径。

在第一实施方案的第四方面，本发明进一步提供，在所述的确定步骤之后，将存在于药物应答中的细胞成分指定属于所述一种或几种生物途径中一种的步骤，其中该细胞成分的生物途径应答在其最佳定标转化的条件下具有与该细胞成分的药物应答最大的相关性。

在第二实施方案，本发明提供了一种从最初的候选药物中确定更具途径-特异性的候选药物的方法，包括：(a)通过第一实施方案的方法表现与最初候选药物作用有关的生物途径；(b)修饰最初候选药物的结构；(c)通过第一实施方案的方法表现与所修饰的最初候选药物作用有关的生物途径；以及(d)如果所修饰的最初候选药物具有比最初候选药物更少的与其作用有关的生物途径，则确定该修饰的最初候选药物比最初候选药物是更具途径-特异性的候选药物。

在第三实施方案中，本发明提供了一种方法，用于鉴定一种或几种与药物的作用有关并介导此药物的副作用的特异性生物途径，该方法包括：(a)对第一种药物实行第一实施方案的方法；(b)对第二种药物实行第一实施方案的方法，其中第一和第二种药物是不同的，并且对相同的疾病或障碍表现出治疗效果；以及(c)鉴定那些与第一种药物作用有关并与第二种药物作用的生物途径不同的特异性生物途径，从而鉴定出一种或几种与第一种药物作用有关并且介导第一种药物的副作用的特异性生物途径。

在第四实施方案中，本发明提供了一种方法，用于鉴定参与介导一种疾病或障碍治疗效果的一种或几种特异性生物途径，该方法包括：(a)对第一种药物实行第一实施方案的方法；(b)对第二种药物实行第一实施方案的方法，其中第一和第二种药物不同并表现出对相同的疾病或障碍有治疗效果；以及(c)鉴定那些与第一种药物和第二种药物作用有关的特异性生物途径，从而鉴定出与第一种药物作用有关并介导对该疾病或障碍治疗效果的一种或几种特异性生物途径。

在第五实施方案，本发明提供了一种方法，用于通过如下步骤比较在一种细胞类型上来自二种不同药物的药物应答，并从而测定此二种不同的药物对该细胞类型作用的相似性：(a)对在该细胞类型所研究的第一种药物提供第一种药物应答，已通过一种方法获得了这种药物应答，此方法包括在对第一种药物多种暴露水平测定该细胞类型细胞中的多种细胞成分；(b)对在一种细胞类型所研究的第二种药物提供第二种药物应答，已通过一种方法获得了第二种药物应答，此方法包括在对第二药物多种暴露水平测定该细胞类型中的多种细胞成分；以及(c)确定第二种药物应答的最佳定标转换，它可最小化第一种与第二种药物应答之间差异的目标函数数值。

在第六实施方案中，本发明提供了一种方法，用于表现与环境改变对一种细胞类型作用有关的生物途径，此方法包括：(a)提供该细胞类型中对此环境改变的环境应答，已通过一种方法获得了这种环境应答，此方法包括在该环境改变的多种严重程度下测定该细胞类型细胞中的多种细胞成分；(b)提供一种模式环境应答作为该细胞类型中一种或几种生物途径应答组合的模式环境应答，其中该细胞类型中的生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定该细胞类型细胞中该生物途径的细胞成分，并且其中该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；以及(c)确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，它可最小化该环境应答与模型环境应答之间差异的目标函数值，从而该一种或几种生物途径应答组合在最佳定标转换条件下可表现与此环境改变对该细胞类型作用有关的生物途径。

在第七实施方案，本发明提供了一个计算机系统，用于表现参与一种细胞类型药物作用的生物途径，此系统包括处理器和偶联于该处理器的存储器，该存储器编码一种或几种程序，该一种或几种程序导致处理器执行包括如下步骤的方法：(a)接收该细胞类型中该药物的药物应答，该药物应答包括在多个药物暴露水平的该细胞类型细胞中多种细胞成分的测定量；(b)接收一种或几种生物途径应答，该一种或几种生物途径应答的每一种都包括在对该生物途径多个扰动水平的该细胞类型细胞中该生物途径细胞成分的测定量；(c)形成一个作为该一种或多种生物途径组合的模式药物应答，该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；(d)确定该药物应答与模式药物应答之间差异的目标函数值；以及(e)通过改变所述一种或几种生物途径应答的定标转换以便获得可最小化所确定的目标函数值的最佳定标转换，用于最小化所确定的目标函数值；从而，所述一种或几种生物途径应答组合在最佳标定转换的条件下可表现参与该细胞类型该药物作用的生物途径。

4.附图简述

图1图解说明假定药物D对生物系统作用的示范性途径。

图2A图示说明在暴露于药物D的图1生物系统中，基因G1，G2和G3表达的示范性应答(数值被标准化成未处理值)；图2B图示说明发生在蛋白质P1对P1分级扰动的途径中基因G1，G2和G3的示范性应答；图2C图示说明在图2A-B中说明的应答之间的示范性相关性。

图3图示说明来自大约6000个所测定的酵母基因30个酵母基因的应答曲线，这些基因对于氨甲喋呤药物暴露具有最大的表达率改变；氨甲喋呤暴露水平是3，6，25，50，100和200μm；100μm滴度导致了50％生长缺乏；在任意横座标的-0.5应答已被设置于0。

图4图示说明Hill函数对图3中所示基因YOLO31C应答的拟合。

图5图解说明本发明方法实施方案的操作流程图。

图6图示说明药物D对基因Gk作用可能的另外途径。

图7A-B图示说明等式10和11的表面透视图。

图8A-C图示说明对分别暴露于药物环孢菌素A，氨甲喋呤和FK506具有最大表达率改变的酵母基因的应答曲线；图8D图示说明图8C中所示的应答对图8A-B中所示应答总和的相关性。

图9图解说明本发明计算机系统的示范性实施方案。

5.详述

此部分对本发明及其对药物发现的应用给予了详细的描述。是通过几个对本发明一般性方法的示范性图解说明，以逐渐增加的详细程度和特殊性进行这种描述。这些实施例不是限制性的，并且对本领域技术人员显然可见的相关变化形式将被包含在所附的权利要求中，下面这些实施例是对伴随这些一般性方法的数据汇集步骤实施方案的描述。

5.1引言

本发明包括用于确定生物途径的方法，通过这种生物途径药物对生物系统(例如细胞，细菌或病人)发挥作用。这些方法包括将应答分级药物暴露时细胞生物状态改变的测定量，与很可能参与此药物作用的生物途径的生物状态改变测定量进行比较，并且后者的改变是应答对这些途径已知的分级扰动。从这种比较得出的结果是作为该药物对每个生物途径单独作用组合的该药物对此细胞作用的表现。

此部分首先提供了某些基本概念，包括药物作用，细胞生物状态，以及生物途径的概念，根据本发明，这些概念可代表药物在细胞内的作用。其次，提供了本发明方法的示意性和非限制性的概述。下面的章节更加详细地提供了本发明的方法。

虽然为简便起见，本公开内容常常提到单细胞(例如，从在单个基因受干扰的细胞中分离RNA)，但是，本领域的技术人员将理解到，更通常是使用许多起源类似的细胞，例如来自培养的细胞系来实施本发明的任何特定步骤。在此这些类似的细胞被称为“细胞类型”。这些细胞或者来自天然的单细胞生物，或者从多细胞高等生物得到。

具体地说，5.1节描述了对进一步说明本发明有用的某些基本概念。5.2节概括地描述了本发明的方法。5.3节描述了本发明方法的优选分析实施方案。5.4节描述了干扰生物途径的方法。5.5节描述了测定细胞成分的方法，最后5.6节描述了本发明对药物发现和开发的某些示范性应用。

药物作用和生物状态：

根据本发明，药物是可干扰生物系统的具有任何复杂程度的任何化合物，不论是通过已知的还是未知的机制，以及是否将它们用于治疗。因此药物包括：具有研究或治疗价值的典型的小分子；天然存在的因子如内分泌因子，旁分泌因子或自动分泌因子，或者与任何类型细胞受体相互作用的因子；细胞内因子如细胞内信号传输途径的成分；以及从其它天然来源分离出的因子等等。药物的生物作用可能特别是药物介导的如下改变的结果：对一种或几种RNA转录或降解速度的改变，对一种或几种多肽翻译或翻译后加工速度和程度的改变，对一种或几种蛋白质降解速度和程序的改变，以及对一种或几种蛋白质的作用或者活性抑制或刺激作用的改变等等。事实上，绝大多数药物是通过与蛋白质相互作用行使它们的影响。增加速度或刺激蛋白质活性的药物在此被称为“激活性药物”，而降低速度或抑制蛋白质活性的药物在此被称为“抑制性药物”。

除药物之外，本发明还同样适用于那些以靶定的方式干扰生物系统的物理环境或物理环境状况的改变。这种环境改变可以包括适度的温度改变(例如温度升高10℃)或者暴露于适度剂量的放射性作用。其它一些环境状况包括营养环境如存在唯一的特种糖类，氨基酸等等。

在本发明是通过观察细胞生物状态改变来测定药物(或物理环境改变)的生物作用。以如在此使用的细胞生物状态意指一群细胞成分的状态，它足以满足鉴定细胞的预定目的，如表示药物作用的特征。对这些成分所作的测定和/或观察，可以是它们的丰度(即细胞中的含量或浓度)，或它们的活性，或它们的修饰状况(例如磷酸化)，或其它与药物作用特征的测定。在不同的实施方案中，本发明包括对不同的细胞成分群进行这些测定和/或观察。在此也将这些不同的细胞成分群称为细胞生物状态形式(如在此使用的术语“细胞成分”不打算指已知的细胞器如线粒体，溶酶体等)。

在本发明通常测定的细胞生物状态的一种形式是它的转录状态。细胞的转录状态包括细胞在给定的一组条件下RNA组成种类，特别是mRNAs的同一性和丰度。优选地是对细胞中所有RNA组成种类的基本组分都进行测定，但是，至少应测定表现所研究药物作用特征的基本组分。转录状态是本发明测定的生物状态目前优选的方面。通过例如以几种现有的基因表达技术中的任何一种测定cDNA丰度，它可以被方便地确定。

在本发明通常测定的细胞生物状态的另一种形式是它的翻译状态。细胞的翻译状态包括在给定的一组条件下细胞中蛋白质组成种类的同一性和丰度。优选地是测定细胞中所有蛋白质组成种类的基本组分，但是，至少应测定表现所研究药物作用特征的基本组分。如本领域的技术人员都知道，转录状态常常足以表现出翻译状态的特征。

细胞生物状态的其它形式方面也可用于本发明。例如，细胞的活性状态，如在此使用的术语包括在给定的一组条件下细胞中蛋白质组成种类的活性(以及还有任选地催化活性的核酸种类)。如本领域技术人员所知道的，翻译状态常常足以表现活性状态的特征。

在相关处本发明还可适用于细胞生物状态的“复合”形式，细胞生物状态不同形式的测定量被组合在其中。例如在一种复合形式中，是将某些RNA种类和某些蛋白质种类的丰度与某些其它蛋白质种类活性的测定量组合在一起。进而从下面所述还将理解到，本发明还适用于可测定的细胞生物状态的其它形式。

药物暴露典型地将影响在本发明特定实施方案中被测定和/或观察的细胞生物状态任何一种形式的许多成分。例如，由于已知存在于细胞中的调节、体内平衡和代偿性网络及系统，即使一种“理想的药物”，即只直接影响细胞内单一成分而不直接作用于任何其它成分的药物，也将具有复杂的，并且常常是不可预料的间接作用。设想例如有一种可特异性和完全抑制假定的单一蛋白质即蛋白质P活性的药物。虽然这种药物本身将直接改变仅仅蛋白质P的活性，但是，受蛋白质P抑制或刺激的，或者被增加或减少以及代偿蛋白质P活性损失的另一些细胞成分也将受到影响。还有其它一些细胞成分也将受第二层次成分的水平或活性改变的影响等等。因此，药物对其靶标蛋白质P的直接作用被隐藏在从蛋白质P向下游方向的大量间接作用中。这种向蛋白质P下游方向的作用在此被称为起源于蛋白质P的生物途径(见下面)。

因此，一个不理想的药物，例如直接影响一个以上靶分子的药物，可能还具有更复杂的向下游方向的作用。一方面根据本发明，分析这些作用可提供关于药物的相当多的信息，包括例如，对受该药物影响的生物途径的鉴别，并可解释它在细胞中的作用和毒性副作用。在相关的方面，本发明提供了用于实现这种分析的方法。

在本发明，测定细胞的转录状态是优选的，不仅因为它比较容易测定，而且因为，虽然药物可能通过转录后机制(如，抑制蛋白质的活性或改变它的降解速度)起作用，但是，给药对于细胞几乎总会通过直接或间接的作用导致可测定的转录状态改变。药物暴露改变细胞转录状态的原因是因为以前所提到的反馈系统或网络，它们以代偿性方式对感染，基因修饰，环境改变包括给药等等起反应，首先就通过改变基因表达或转录的模式起反应。由于内部的代偿作用，对生物系统的许多扰动虽然对系统的外部行为仅有沉默的作用，但是仍然可以深刻地影响细胞中个别成分的内部应答，例如基因表达。

生物途径：

在本发明，药物对细胞的作用，不论是理想的还是不理想的药物以及无论在特定的仪器内如何测定，都是通过组合药物对单个生物途径的作用来表示。例如，图1图示说明药物D通过与生物途径101，102和103相互作用对细胞发挥作用(未显示出途径103的细节)。药物D与这些途径之间的弧线表示药物D对这些途径的可能作用。假定药物D对该细胞总的作用可表示为药物对这三条途径中的一条或一条以上作用的组合。在下面的章节中，首先描述如根据本发明一般使用的生物途径，随之描述便于将本发明应用于它的特定生物途径。

如在此使用的，生物途径一般被理解为一群相关的细胞成分，其中此群集中的每一细胞成分，按照某种生物机制，受此群集中一种或几种其它细胞成分的影响。可以从细胞生物状态的任一方面引导出构成特定途径的细胞成分，例如从转录状态，或翻译状态，或活性状态，或者生物状态的复杂形式。因此，一种途径的细胞成分可以包括mRNA水平，蛋白质丰度，蛋白质活性，蛋白质或核酸修饰的程度(例如磷酸化或甲基化)，以及这些类型细胞成分的组合等等。此群集中的每种细胞成分，通过某种不需详细说明或者甚至不需理解的生物机制，受此群集中至少一个其它细胞成分的影响。在此提供的图解说明中，一种细胞成分对另一种细胞成分的影响，不论是直接的或是间接的，都被显示为二种细胞成分之间的弧线，并且总的途径被显示为连接该途径细胞成分的弧线网络。因此，生物途径被认为是从生物状态某一方面引出的细胞成分的群集，连同这些成分之间影响的网络。

例如图1中，生物途径101包括蛋白质P1(例如P1的丰度或者活性)以及基因G1，G2和G3(例如，它们所转录的mRNA水平)，连同蛋白质P1对此三个基因的直接或间接影响，这种影响被显示为从P1引向这三个基因的弧线。这些影响机制的发生可能因为例如，蛋白质P1可结合于这些基因的启动子，并提高它们转录的丰度。

如在此所理解的，生物途径的具体实例对于本领域是熟知的。它们依赖于不同的生物机制，借此细胞成分相互影响。例如，生物途径包括熟知的生物合成途径，在其中例如分子被降解以便提供细胞能量，或者构成分子以便提供细胞能量贮存，或者其中蛋白质或核酸前体物被合成。合成途径的细胞成分包括酶和合成的中间产物，并且，前体分子对后续分子的影响是通过直接的酶介导的转化作用。生物途径还包括信号传输和控制途径，它们的许多例子也是熟知的。这些途径的细胞成分典型地包括起始的或中间信号传输分子，以及通常赋予这些途径特征的，参与此信号或控制级联的蛋白质。在信号传输途径中，信号分子对受体的结合通常直接影响中间信号传输分子的丰度，并间接影响途径蛋白质的磷酸化(或其它的修饰)的程度。这二种作用本身又影响细胞蛋白质的活性，这些细胞蛋白质是由信号启动的细胞过程的关键性作用因子，例如通过影响细胞的转录状态。控制途径如控制细胞周期时间和发生的途径也是类似的。在这里，多重并常常是不间断的细胞过程暂被协调，常常是通过反馈控制，达到一种稳定的结果，例如细胞分裂与染色体分离的协调。这种协调是该途径发挥功能的结果，常常是由蛋白质对其它各种分子磷酸化(或其它的修饰)程度的影响所介导的。还有一些熟知的控制途径，在波动的环境面前设法保持最佳的细胞代谢水平。另一些按照已被理解的机制运行的细胞途径的例子对于本领域的技术人员也是熟知的。

在本发明中特别感兴趣的途径被定义为“起源”在特定细胞成分的途径，特别是起源在特定细胞成分的分级途径。起源在特定细胞成分的途径包括那些特定的细胞成分，受此特定细胞成分直接影响的第二类细胞成分，受第二类细胞成分直接影响的第三类细胞成分，等等以及在各类细胞成分之间发生影响的网络。细胞成分之间的影响可以是按照任何一种生物机制，例如信号传输机制，或者调节或体内平衡控制机制，或者合成机制。在图1中包括一种蛋白质和几种基因的途径101起源在蛋白质P1。包括二种蛋白质和几种基因的途径102起源在蛋白质P2和P3。

生物途径也可以是分级的或非分极的。一般来说，分级的生物途径不具有反馈环路。更详细地说，分级途径是一种在其中它的细胞成分可以被排列成限定数水平层次的途径，致使属于特定的限定数水平的细胞成分可以只受到属于较低限定数水平的细胞成分影响。分级途径起源于最低限定数的细胞成分。图1中途径101和102是分级的。途径101是明显分级的。在途径102，在最低层次数水平上的蛋白质P2和P3二者都(直接)影响在中间层次水平上的基因G。基因G本身又(可能是间接地)影响均处于最高层次数水平上的基因G4，G5和G6。不同的是，非分级的途径具有一个或几个反馈环路。生物途径中的反馈环路是该途径细胞成分的子系统，反馈环路的每种成分既影响反馈环路中的其它成分，也受这些成分影响。例如，在图1的途径102中，如果基因G6(可能是间接地)影响了蛋白质P3，那么将形成一个包括基因G和G6以及蛋白质P3的反馈环路。

因此概括地说，如在此使用的，生物途径包括一群细胞成分，它们通过任何一种已知的或未知的生物机理相互影响，例如通过细胞的合成，调节，体内平衡或控制网络。一种细胞成分对另一种细胞成分的影响可以特别是通过一种细胞成分合成转换成其它细胞成分，通过二种细胞成分直接的物理相互作用，通过由中间生物过程介导的二种细胞成分的间接相互作用，或者通过其它一些机制。进而，某些对本发明特别感兴趣的途径可以被认为起源于特定的细胞成分，它们影响该途径中的其它细胞成分，但是本身不受该途径中其它细胞成分影响，而在这些途径中没有反馈环路的途径被认为是分级的。

因为本发明涉及通过生物途组合表示药物的作用，所以某些类型的途径特别有价值。药物典型地是通过与一种细胞成分直接相互作用而对细胞起作用，并且更通常是与5-10-50或更多的许多细胞成分直接相互作用。在此将这些细胞成分称为药物的“靶标”。药物对细胞的另一些作用来自直接或间接地受药物直接靶标影响的其它细胞成分。因此，本发明用于表示药物作用有价值的途径包括起源于特定细胞成分的途径，并且特别是分级的途径。并且该起源性细胞成分优选地是潜在性药物靶标的细胞成分。因为大多数药物靶标是蛋白质，所以特别是起源于细胞蛋白质的途径对表现药物作用特别有价值。在表现药物作用中分级途径是优越的，因为存在于非分级途径中的反馈环路可以通过在减弱药物影响的细胞成分中引起代偿性影响而掩盖药物的作用。

下面对本发明不同实施方案的描述，仅为了节省文字并且不带任何限制，主要是针对途径，并且常常只是针对起源于特写蛋白质的分级途径。鉴于后面的叙述，对于本领域的技术人员如何将本发明应用于包括起源于其它细胞成分如mRNA丰度的非分级途径在内的途径将是显而易见的。

对生物途径的鉴定和扰动：

为了用于本发明，可通过几种方式对生物途径，特别是起源于蛋白质的或分级的生物途径进行鉴定，包括通过应用已知的途径以及借助于细胞生物状态方面的测定量。已知的途径如上述的示范型途径通常包括可能是药物靶标的已知活性蛋白(或其它类型的细胞成分)。这种完全已知的途径可以被用于表示药物的作用。另外，可以将这种已知途径的一些部分(在此也被称为“亚-途径”)用于本发明。例如，从这些已知蛋白质(或很可能是药物靶标的其它细胞成分)中任何一种或几种起源的亚-途径，包括受一种或几种已知蛋白质(并排除影响此一种或几种蛋白质的途径成分)直接或间接影响的途径成分。可以从单一已知途径得出许多亚-途径。按照本发明的方法，这些亚-途径中的一种或几种可被用于表示药物的作用。

借助于细胞生物状态方面的测定量，例如借助于转录状态，或翻译状态，或活性状态，或生物状态复合形式的测定量，也可以足够详细地对用于本发明的生物途径进行鉴定。借助于细胞生物状态方面的测定量，在不同干扰状态的条件下，如由暴露于不同药物或由不同的基因操作引起的状态，可对以相互关联方式变化的细胞成分群进行鉴定。相互关联的变化在此意指在此群集中细胞成分的相关变化，换句话说，细胞成分变化的式样在不同状态下是类似的。可以从不同状态中这种类似的变化式样推导出一个将这些成分的群集连接成生物途径的相互影响的网络。当测定过程中这些不同的状态作用在此生物途径上，此途径的成分以由它们相互影响的类型和方向决定的相似变化式样表示应答。即使对这种影响的确切网络和它们作用的机制都还不了解，也可以将这种成分的群集用作本发明中的一种生物途径。

例如，已知作用于单一明确靶标的药物可以被用于测定以这种靶标起源的途径。将细胞暴露于不同浓度的这种药物，可测定生物状态方面的细胞成分，例如转录状态。那些改变药物浓度时以相互关联式样变化的细胞成分可以被鉴定为起源在那些药物的一种途径。

另外，在已经知道途径的情况下，如果在暴露于另外一些环境的过程中测定显示出原来途径的亚-群集按照不同的式样变化，则可以确定被测定途径的亚-途径。然后这些不同变化的亚-群集构成可用于本发明的亚途径。可以根据它们借以受到最大影响的亚途径将所测定途径的细胞成分进行分类。

例如，在一种途径通过测定暴露于变化浓度药物的细胞已被鉴定的情况下，可通过对此细胞进行基因敲除来鉴定亚途径。通过对例如暴露于此药物并具有某些基因敲除的细胞测定其转录状态，可以鉴定起源于此缺失基因的药物途径的亚途径。

图3图示说明通过测定所鉴定的一个途径的例子。此图显示，酿酒酵母30个基因的mRNA表达水平在应答药物氨甲喋呤六个不同的滴度时具有最大的表达改变，此30个基因是来自此酵母基因组内大约6000个基因中。如在5.4部分所述，以基因转录阵列构成了这些基因表达水平的测定量。这20个基因中的每一个都表现出对暴露于不同浓度氨甲喋呤相互关联的应答改变，其中每个基因在应答逐渐增加浓度的氨甲喋呤时，都表现出从自然丰度到饱和丰度的一致增加或降低。因此，这30个基因可以在本发明被用作一种途径，它包含受氨甲喋呤影响的转录状态细胞成分。另外，如果暴露于另外一些环境如不同的药物或药物敲除物(Knockouts)，可显示出另一些行为式样，那么可将这30个基因的组再分成另一些亚途径。

本发明的方法可使用对生物途径分级扰动的测定量，这种方法将很可能与药物作用相关的途径分级扰动的测定量同细胞分级暴露于该药物的测定量进行比较，以便鉴定确实包含在该药物作用中的途径。可以按几种方式实施分级的途径扰动。在起源于已知蛋白质(或其它细胞成分)的已知或已测定途径的情况下，可以通过如突变，转染，可控制的启动子系统，或已知特异性作用的其它药物等方法，以分级的方式干扰这些蛋白质(或其它细胞成分)的丰度或者活性。在5.4节中更详细地描述了这些方法。

借助于确定此途径的影响网络，对起源细胞成分的分级扰动将被传播至该途径的其它细胞成分。这种应答数据特别由对该受影响途径中基因或基因产物的基因转录物或蛋白质丰度测定量组成。借助于随后在5.5节详细论述的方法可以测定应答数据。

在通过测定确定途径的情况下，如果鉴定该途径起源于这些成分是特别有益的。在那时，如对已知途径所述的，可以干扰这些起源成分。如果该起源成分没有被鉴定，则可以按分级的方式操作确定该途径的条件。例如，在其确定条件之一是药物暴露的途径中，可将此药物暴露分级，并观察其细胞成分。如果该确定条件包括基因操作，则可以按照5.4节中所述的方法以分级的方式实施基因操作。

5.2将药物应答分解成途径作用

此部分首先提供本发明方法的概述，其次提供这些方法主要构架的延伸说明实施例。

本发明方法的概述：

通过将一种细胞在应答分级药物暴露时生物状态改变测定量与很可能是参与该药物作用的生物途径的生物状态改变测定量进行比较，本发明的方法可确定通过它药物对生物系统起作用的生物途径，后者的改变是应答对这些途径的分级扰动。

在应答多种强度的药物暴露中，优选地是在从没有药物至充分的药物作用中，测定(如在5.6节中所述的)细胞生物状态的一些方面，例如转录状态，翻译状态或者活性状态。在此将这些测定量的集合称为“药物应答”，并任选地以图解方式提供。可以在从完全途径抑制直至充分途径饱和范围内的主要部分，按照变化的强度分级对本发明有用的途径扰动。在应答多种分级的途径扰动强度时，测定类似于在药物应答时所测定的细胞生物状态的一些方面，例如转录状态。在此将这些测定量的集合称为“途径应答”或“途径特征”，并任选地以图解方式提供。优选地是在改变该途径中主要蛋白质或基因的活性或者丰度的实验中测定这些途径应答。

将在药物暴露中变化的细胞成分与在途径应答中变化的细胞成分相比较，以便发现与全部或基本上全部药物应答相匹配的生物途径或生物途径的组合。当发现大多数在药物应答中变化的细胞成分在一种或几种途径应答中以类似的方式变化时，基本上所有的药物应答与途径应答相匹配。优选地至少75％在药物应答中变化的细胞成分可以被匹配，更优选地至少90％可以被如此匹配。鉴于实验误差，当二种状态的数据很可能是相同数据时，细胞成分在二种应答中以类似的方式变化。

在优选的实施方案中，通过一种方法实施将药物应答与一种或几种途径应答进行比较，按此方法所测定的药物应答与模式药物应答之间差异的客观测定被减至最小。通过组合被认为很可能包含在此药物作用中的那些途径的途径应答来构建模式药物应答。如果一种特殊的细胞成分在唯一的途径应答中发生变化，那么在模式药物应答中那种细胞成分的变化是那一种途径应答中的变化。如果一种特殊的细胞成分在二种或更多途径应答中发生变化，那么在此模式药物应答中那种细胞成分的变化是一组此途径应答中的变化。可以通过叠加或者通过另一种数量组合法进行这种组合(见5.3节)。因为对该药物的强度(例如由描述其作用的动力常数所描述的)与分级途径扰动效率(例如任意测定的扰动控制参考所描述的)的关系还不知道，所以可在对被组合在模式药物应答中的每种途径应答分级扰动强度与分级药物暴露之间形成一个可调整的定标。以可调整的定标将这些细胞成分的变化组合在一起成为其模式药物应答。对于一种途径的可调整的定标通常与对于其它途径的定标无关。

在一个实施方案中，通过调整其模式药物应答中每种途径应答的定标和/或通过改变组合在此模式药物应答中的生物途径的数目或同一性，可使客观测定最小化。通过在不希望的生物途径中设置可调整的定标，可简便地达到改变组合于模式药物应答中的途径的目的，以致使细胞成分不发生改变。在优选的实施方案中，在此是通过在其途径扰动参数与药物暴露之间的线性转换实施这种可调整的定标，通过标准的数值分析技术可实现使客观测定最小化。见例如，Press等，1996， C中的数字诀窍，第二版，剑桥大学出版，Ch.10；Branch等，1996， Matlab最佳工具当使用者指南，Mathworks(Natick，MA)。还有，可以改变来自不同途径的相同细胞成分数值组合变化的方法。例如，可包括相乘的向量积项，此项将特别提供来自多转录因子的倍增应答，这种多转录因子是从不同集合途径会集的，以便形成一个转录复合体。

为了在最小化目标函数之前提供所测定的药物应答，可以按不同的方式选择组合在模式药物应答中的途径。最简便地是，可以将包括许多细胞功能的一大批生物途径同如下数据组合在一起：独立可调整的定标；最小化的客观测定；以及最佳表现所确定药物应答的生物途径的组合。生物途径的“纲要”是用于检测的生物系统中的一组途径，这些途径基本上完全地，或者至少基本上完全地包括所有很可能与药物作用有关的途径。优选地，如果可以将这批途径缩小至很可能包含在药物作用中的途径，那么这种最小化作用变得更有效。例如，以前对药物作用生物途径重要性的认识可以成为这种缩小的根据。

更优选地是，选择起源于特定细胞成分的途径，并且优越地还是分级的(最小化负反馈环路的减弱作用或正反馈的放大作用)。最优选地是，这些起源性细胞成分很可能是所研究药物的靶标，通常是功能性活性蛋白质。例如，给定一种所研究的药物和在细胞中选择一种可能的靶标，那么首先可以测定起源于每种可能靶标的生物途径(如以前在5.1节所述的方法)。第二步，将这些途径与独立的定标因子，最小化的客观测定以及所确定的最佳表现此药物作用的途径组合相组合。从而，在确定包含在药物作用中的真实途径的同时，此药物的真实靶标也被鉴定为真实途径起源于它的细胞成分。

在确定包含在药物作用中的途径之后，可借助于如下本发明的补充方法来证实它们。按照第一种证实方法，基于统计学检验所确定途径的显著性是无疑的，此统计学检验是参照从客观测定由电脑计算的最小值进行的。一个优选的检验如上所述以许多随机化的药物应答数据由电脑计算途径表现，以便确定客观测定最小值的分布。对比此分布，可以判断确实从未随机化的药物应答数据得到的客观测定最小值的统计学显著性。

按照第二种证实方法，借助于对同时既暴露于药物和也具有受干扰的一种或几种确定途径的细胞所作的测定，可以证实所确定的途径。通过干扰药物暴露的细胞(或给药干扰的细胞)，可以得到证据证明此途径实际上是包含在特异性的下游基因和蛋白质的应答中。如果受干扰的生物途径不是包含在此药物的作用中，那此药物和这些扰动将对细胞成分的变化产生独立的，通常基本上是附加的作用。如果受干扰的生物途径确实包含在此药物的作用中，那么此药物和扰动的作用将不是独立的。这些作用将干扰对药物暴露或途径扰动单独观察到的数值，细胞成分的变化也将在这些值达到饱和。

对本发明方法的图解说明：

下面的章节将参照图1和图2A-C概括地说明本发明的几个方法。图1图解说明药物D可能通过三条可能的途径对细胞起作用。途径101和102分别起源于蛋白质P1以及P2和P3，最后影响所指示基因的表达水平，可能是通过影响附加的介导性细胞成分。途径103的细节没有被显示出。本发明的方法确定这三条途径中哪条途径可单独地或以某种组合形式解释药物D对细胞的真实作用。

为了作出这种确定，本发明的方法试图通过途径101，102和103的一组途径应答来表现药物D对细胞的作用，即它的药物应答。对于那种药物D真实影响的途径组合这种表现将是成功的，并且药物D的应答也将被充分地表现。如果通过这些途径应答中的仅仅一种就可以充分地表现所观察到的药物D应答，那么鉴定此途径为药物D作用的唯一途径。

在分别起源于蛋白质P1以及P2和P3的途径101和102的情况下，通过对起源蛋白质丰度、或者活性、或者与药物D作用相关的某种其它特征的已知扰动，可以直接确定这些途径应答。例如，应用可变的扰动104改变蛋白质P1的相关特征，从而影响途径101中其它细胞成分的特征，例如基因G1，G2和G3的表达水平。能够以分级的方式应用扰动104以便在许多扰动控制值产生途径应答，从被干扰蛋白质P1特征的自然水平至那些特征的充分饱和或抑制。可对蛋白质P2形成类似的已知扰动，并且测定基因G4，G5和G6的表达水平。

另一种方法是，如果可以将药物D在细胞上的应答表现为通过干扰P1或P2产生的途径应答，那么本领域的技术人员应理解到，从而这些P1或P2将被鉴定为药物D的蛋白质靶标。

图2A图示说明细胞对药物D的一种可能转录应答。横座标指示药物暴露的程度，例如在细胞环境中药物的浓度，范围从为0数值的未暴露至为数值5的饱和暴露。纵座标指示在暴露于药物D时基因的表达对不存在药物D时基因表达比率的对数。因此，这些药物应答曲线都是在没有药物D时以0开始，对应于表达率1。假定为了此实施例，仅细胞的基因G1、G2和G3以由所标明的应答曲线指示的应答明显地应答对药物的暴露。

虽然为了图示说明，此基因应答曲线被表示为连续的曲线，但是在真正实验确定的药物应答中，仅对有限的一组不连续的药物暴露水平测定了表达率。在真实情况下，曲线图表示的药物应答将由仅在这些不连续的药物暴露水平进行选择和定位，以致使药物应答曲线的陡峭区被充分地取样。优选地使至少5和5以上，更优选地10或10以上的暴露水平位于应答曲线的这些区域，在这些区域药物应答以未暴露水平变化至饱和水平。

借助于5.5节的方法可以制作和测定这种应答曲线。特别是通过应用基因表达分析技术，配合酿酒酵母的基因组序列，可以对这种酵母的几乎全部基因实验制作这种应答曲线。虽然本发明的许多描述是针对测定和模拟基因表达数据，但是本发明同样可用于细胞生物状态其它方面的测定量，如蛋白质丰度或者活性。

图2B图示说明对途径101(图1中)的可能途径应答，途径101以蛋白质P1起源，并在应答对起源蛋白质P1的扰动104时包含基因G1，G2和G3的表达水平。此图中的横座标指示施加于P1的扰动104的强度，范围从在0数值的对P1没有扰动至在数值5的对P1饱和扰动。视情况而定扰动104可以是抑制或激活蛋白质P1。如在5.4节中更详细描述的，特别是通过以不同量表达P1的基因转染以便增加P1的丰度，或者通过在其本身被药物或小分子控制的可控制启动子的控制下表达P1，或者通过暴露于对P1具有已知特异性作用的不同药物而抑制P1的活性，可以实现这种扰动作用。类似于图2A，图2B中的纵座标指示暴露于扰动104时基因表达对不存在扰动104时基因表达比率的对数。通过所标明的曲线图示说明了基因G1，G2和G3表达水平的应答，这些基因是受蛋白质P1影响(不论直接或间接地)的途径101的组成成分。

也类似于图2A的是，虽然这些途径应答曲线被表示为连续的曲线，但是，事实上是以有限的一组不连续值对蛋白质P1施加扰动104，此“曲线”确切地是在这些不连续的扰动控制参数值的表达比率数值。同样优选地是，对这些不连续的扰动值进行选择和定位，以致使途径应答曲线的陡峭区被充分地取样，使至少5和5以上，优选地10或10以上的扰动控制参数值位于应答曲线的这些区域，在这些区域应答从未暴露水平变化至饱和水平。

图2A和2B中的药物应答曲线的途径应答曲线显示了这种曲线的一般预期的形状。这种预期的形状包括在低药物暴露或扰动控制参数的阈下区，在此区域实际上不存在此途径中细胞成分的应答。在此阈下区之后，药物或扰动开始达到有效，细胞成分的特征数值受到干扰。预期这种干扰值的曲线通常具有一个指向饱和渐近水平的单调上升或下降，超过此水平未见进一步的改变。应答曲线终止于此饱和区。

事实上，在某些情况下，被预期的可能是更复杂的，非单调的应答曲线形状。例如，在药物或扰动具有毒性作用的情况下，当毒性出现，上升的细胞成分丰度可能开始下降，而下降的丰度可能开始更快地下降。已知存在于生物系统中的非线性和反馈机制也可能导致非单调的多相应答。这样一种应答可能随着不断增加的扰动幅度或药物暴露先上升然后下降。例如，一种药物或扰动可能通过二种途径对某些细胞成分起作用，以不同阈值，并且以相反的作用产生先上升然后下降(或者相反)的应答。虽然根据单调应答曲线如图2A-B图示说明的，对本发明的方法进行了图解说明和初步描述，但是如根据随后的描述本领域技术人员将发现，这些方法同样适用于非单调的应答曲线。

有了被测定的药物和途径应答，要确定通过它(图1的)药物D对细胞起作用的途径，此问题需要把这种药物应答匹配为一组途径应答。图2A图解说明在对药物D的药物应答中，基因G1，G2，G3，G4，G5和G6的丰度如何变化。因为这些相同的基因在起源于P1和P2的分立途径中发生变化，所以按照本发明的方法可以确定，是否这二种途径都确实参与对药物D的应答中。

根据本发明的方法，是通过调查是否可以将起源于P1和P2途径的途径应答曲线转换匹配图2A的药物应答曲线来作出这些确定。对于起源于P1的唯一途径，是通过尝试将图2B中所显示的此途径的途径应答曲线转换成图2A中所显示的对于G1，G2和G3的药物应答曲线，来获得是否此途径确实包含在药物D作用中的确定。在此不需要考虑对于G4，G5和G6的药物应答曲线，因为起源于P1的途径不影响这些基因。

图2B的途径应答曲线转换成图2A的药物应答曲线一直可以既有纵向分量又有横向分量。在此实例中没有预期到这些曲线的纵向转换。二组应答曲线的幅度将是相等的，因为它们二者都在相同的范围变化，从没有扰动或药物暴露的静态(0)至饱和，药物和扰动已最大程度地影响了途径101的状态。但是，横向转换很可能是必须。因为没有理由认为限定扰动控制的数值，如表达P1的病毒转染载体的暴露数值，或已知特异性作用于P1的其它药物，是与限定暴露于所研究药物D的数值相同的数值，所以这些药物和途径应答曲线必须被横向转换，以便确定任何可能的匹配。因为图2B中对于G1，G2和G3的曲线具有与图2A中相应曲线相同的一般形状，所以在些情况下，这样一种横向转换多半是可能的。

按照本发明寻找一种横向转换法，通过参数化一组可能的转换进行处理。然后，寻找此参数的最佳值，这将使途径应答尽可能确切地说明药物应答。一组更可取的和简单的转换是从振动控制参数值至药物暴露值的线性定标，以延伸或收缩的程度将它们简单地参数化。然后可以借助于标准的方法找到线性延伸的最佳值，例如借助于最小化对途径和药物应答曲线差异的客观测定。

图2C提供了寻找最佳线性定标参数的示范性图解说明。此曲线图的纵座标指示平均相关数，是在图2B的途径应答曲线G1，G2和G3与分别是图2A的药物应答曲线G1，G2和G3之间计算的数值。本领域技术人员熟知，当二组曲线相同时，它们将具有理想的相关数1.0。横座标指示从0至10的可能线性定标参数。在此实例中，理想的相关数1.0出现在定标数参2。以上的线性定标可以将图2B的途径应答曲线转换成完全匹配图2A的药物应答曲线。因此，可以得出结论，起源于P1的途径是药物D作用的途径之一。

为了确定以起源于P1和P2的途径是否可以说明药物D的全部作用，按照本发明可以将这二种途径应答(起源于P2的途径应答未被显示)的总和(这些途径是分立的)转换成所有六个基因对药物D的应答曲线。

5.3分析实施方案

本发明方法的分析实施例包括第一，用于将药物应答表现为一组途径应答的实施方案，以及第二，用于评估统计学显著性和验证所找到的表现结果。

图5对本发明方法的优选实施方案提供了一操作流程图。此实施方案对一种特定药物依据途径应答数据511，确定了表现的药物应答数据510，用于一种或几种途径以及对所确定的表现法作显著性评估和验证。

在本发明的其它实施方案中，图5中所显示的某些步骤可能被省去或者按不同于所显示的顺序进行。例如，在某些实施方案中，候选途径选择步骤501和定标参数化选择步骤502可以被实施一次，用于分析来自几个优选相关药物的应答数据，并且不需要对每个药物分析分别进行。在特定的实施例中，也可以不进行途径显著性赋值和验证，并且因此可以省去步骤505和506，步骤507或步骤508中的一步或一步以上。

5.3.1药物应答的表现

表现依据途径应答数据的药物应答数据优选地以对一种或几种候选生物途径的选择，开始于步骤501，通过这种选择以便对所研究的药物提供药物应答数据。如所论述的，被优选采用的途径是起源于一种或几种细胞成分的途径，更优选地是起源于很可能是所研究药物靶标的蛋白质成分。最优选地是，此候选途径起源于很可能是所研究药物靶标的单一细胞成分。

在不知道候选药物靶标时，可以从现有的途径中，也许是储存于途径一览表中选择单一的途径，并按照图5中所示的如下步骤检验它在表现此药物应答数据中的显著。然后可以采用那些被单独发现在表现药物应答数据中具有显著性的途径，组合在一起，并实施图5的步骤，以便确定用于表现药物作用的最佳途径组合。途径一览表对于用于检测的生物系统优选地是基本完整的(其中它包括那系统中基本上所有的生物途径)，或者至少包括很可能是包含在药物作用中的基本上所有的途径。

按步骤511，对在步骤501中选择的途径测定途径应答数据。在许多情况下，例如，在已通过测定确定了途径时，将已经测定了用于扰动所选择途径的应答数据。在另一些情况下必须在本发明的后续步骤之前测定这些应答数据。如上面所述，一种途径的应答数据，包括存在于该途径中的细胞成分相关特征，对于多种扰动该途径的控制水平，相对改变的测定量。例如，在通过起源于一种蛋白质成分的基因表达水平确定了该途径时，可以按分级的方式干扰此起源蛋白质的活性，并且测定所构成的自然基因表达水平对被干扰的基因表达水平的比率(或这些比率的对数)。择优选择扰动控制水平，以致使5或5以上，或者更优选地10或10以上的扰动控制水平存在于细胞成分的特征从自然水平至饱和水平迅速改变的区域内。

在下面，变量“p”一般指扰动控制水平，可变量“R”一般指途径应答数据。详细地说，在第i生物途径中的第l扰动控制水平被称为“p_i，l”。第i途径中对于第k细胞成分的途径应答是R_i，k。因此，R_i，k(p_i，l)是在第l扰动控制参数水平，第i途径中第k细胞成分的应答。

同样，按步骤510可获得药物应答数据，并且如果不是已经现存的就必须测定。如上面所述，通过在多个药物暴露水平(在此也称为“药物滴定水平”)测定细胞成分特征的改变可获得这些数据。同途径应答数据一样，择优选选择药物暴露水平(或“药物滴定量”)，以致使5或5以上，或者更优选地10或10以上的暴露水平存在于细胞成分的特征从自然水平至饱和暴露水平迅速改变的区域内。

在下面，变量“t”一般被用于指药物暴露(或“滴定”)水平，变量“D”一般指药物应答数据。更详细地，第l测定的药物暴露水平被称为“t₁”。第k细胞成分的药物应答是D_K。因此，D_K(t₁)是在第l药物暴露水平第k细胞成分的药物应答。

在这些方法的随后步骤中，特别是在步骤504，在可能还未测定的药物暴露值或扰动控制参数值时，可能需要药物应答数据值和途径应答数据值。此结果是根据如下事实得出的：测定的药物暴露水平与途径扰动控制参数不一定相关。也就是说，对于特定L的变量t₁与对于不同途径i的p_i，l没有既定的关系。因此，在步骤502必须提供插入不同的应答数据，以便得到所需的值。通过仿样拟合或通过模式拟合可优选地实现这种插入法。在步骤502可实现对插入法和任何必要参数的选择。

在仿样拟合中，通过相加适当仿样插入函数S乘以所测定数据值的乘积可插入药物和途径应答数据，如由如下公式所示的。

变量“u”意指药物暴露水平或扰动控制参数的任意值，在此值分别计算药物应答数据和途径应答数据。一般地，S可以是具有在应答函数中预期结构宽度特征的有限载体的任何平滑(至少以片段方式连续的)函数。可以选择具有特定距离的示范性宽度，在此距离被插入的应答函数其渐近值从10％上升至90％。对于药物应答数据和途径应答数据，以及甚至对于不同途径的应答数据，不同的S函数都可能是适合的。示范性S函数包括线性插入和高斯插入。

对于模式拟合，药物应答和途径应答各自以单一参数化函数通过近似法被插入。适合于近似转录状态的示范性模式拟合函数是Hill函数，此函数具有可调整的参数a，u_o和n。 $H\left(u\right)=\frac{a{(u/u_o)}^n}{1+{(u/u_o)}^n}----\left(2\right)$ 对于药物应答的每种细胞成分和对于途径应答的每种细胞成分，单独地选择可调节的参数。择优选择可调整的参数，以致对于每种途径应答的每种细胞成分，从R_i，k(p_i，l)至H(p_i，l)的距离平方和被最小化，并且对于药物应答的每种细胞成分，从D_K(t₁)至H(t₁)的距离平方和被最小化。这种优选的参数调整法在本领域被称为H()对R_i，k()或对D_k()的最小平方拟合。另一些可能的模式函数是基于多项式拟合，例如借助于不同的已知类型多项式。

根据图3和4可图示说明以Hill函数的模式拟合。如所论述的，图3显示被氨甲喋呤干扰和通过测定鉴别的一种途径的实例。此图显示，酿酒酵母基因组内大约6000个基因中，在应答六个不同的氨甲喋呤暴露水平时具有最大表达改变的此酵母菌30个基因的mRNA表达水平。图4显示，借助于Hill函数，这些基因表达水平之一的途径应答的拟合。特别是，通过Hill函数使此酵母菌的基因YOLO31C与借助于以前所述的最小平方法选择的参数n＝2，a＝-0.61和lob₁₀(u_o)＝1.26相拟合。

因为具有最大应答的所有30个基因都表现出单调的行为，即没有一个应答随药物暴露增加从其最大幅度显著地降低(或者从其最小的幅度显著地提高)，所以Hill函数是一种适合的模式拟合函数。对于非单调表现的将不是这样。

在选择应答数据插入法之后，药物应答数据拟合前的最后步骤503是选择一种定标转换以及任何一些必要的参数，这些参数将使生物途径应答与药物应答相关联。一般来说，一种定标转换可能需要垂直定标以及水平定标。为了使在获得这些应答数据时所形成的每种细胞成分相关特征的不同测定量相关联，垂直定标可能是必不可少的。例如，这些测定量可能是mRNA的丰度或蛋白质的活性。在按相应单位形成这些测定量的情况下，仅为了使不同的测定单位相关联而需要垂直定标。另外，在跨越从自然水平至充分饱和的参数范围形成药物以及途径测定量的情况下，这通常是优选的，可以例如通过饱和值定标这些测量值。这种定标可避免需要任何垂直定标。在此情况下，例如，当通过与Hill函数拟合插入途径应答时，对于所有应答数据参数“a”的值都基本上等于1。在下面，将假定已通过饱和值进行了任何必要的垂直定标，并且所有的途径数据在普通的自然水平与饱和值之间变化。

一般来说，预料水平定标是必不可少的。如上面在5.2节所论述的，这种定标是必不可少的，因为对于不同的候选生物途径，扰动控制参数值在相同数量的扰动控制值很可能不引起饱和应答，在与药物暴露的饱和应答相同的数量值也不引起饱和应答。例如，途径扰动可能按照像如下这样一些完全不同的机制起作用：表达一种途径起源性蛋白质的病毒转染载体的滴定度；或一种控制起源性蛋白质表达的可控制启动子的控制参量；或已知特异性作用于起源性蛋白质的药物暴露水平。这些机制的饱和控制值，以及它们确实的动力学特征，很可能是完全不相关的。所有这些机制可能都不同于所研究药物的作用。例如，在对一种途径起源性细胞成分的扰动作用可以作为Hill函数被模拟的情况下，没有理由认为不同的“u_o”参数将是相同的。

优选的水平定标转换是药物暴露水平线性转换成为相应的扰动控制参量。这样一种转换的示范性表达式为如下。

          p_i，l＝α_it₁+β_i                (3)等式(3)提供了在相应于第l药物暴露水平的第i途径中的扰动控制值。其线性定标常数是α_i和β_i。以一组定标参数表示每种途径的特征。一般地，β_i将是0，因为药物暴露和扰动控制值都是以0开始。实质上α_i代表特定的途径扰动强度对所研究药物强度的比率。例如，当此应答数据可以以Hill函数建立模型时，α_i是所研究药物的u_o参数对此特定途径的u_o参数的比率。

更通用的水平定标转换可能以一些补充的参数表示特征。以若干足够小的，即使是非线性的参数，灵活的定标转换有可能被有效地应用于步骤504的最小化程序。在此用“α_i”代表对于第i途径的多重定标参数。定标转换的另一个实例是一般化线性转换等式(3)的多项式展开。更一般性定标转换的一个简单实例是按照下面等式使用的以前所述的Hill函数。 $p_{i,1}=\frac{{\mathrm{\α}}_i{(t_1/{\mathrm{\μ}}_i)}^{n_i}}{1+{(t_1/{\mathrm{\μ}}_i)}^{n_i}}----\left(4\right)$ 等式(3)再次提供了在相应于第l药物暴露水平的第i途径中的扰动控制值，并且通过3个参数α_i，μ_i和n_i对于每种途径参数化此等式。Hill函数定标是更通用的，至少其中当n_i是1，并且t₁比u_i小很多时它降低为线性定标。

步骤504是本发明方法的中心步骤，其中药物应答被表现为一组适当定标的途径应答。药物应答的优选表现是作为途径应答的一个定标的线性组合。当受一种途径影响的细胞成分或者不受其它途径的影响，或者如果多种途径会集于相同的细胞成分如mRNA或蛋白质丰度而具有线性附加作用时，这种表现法特别有用。因为途径的会聚或重叠最可能在远离初始靶标的下游，在此影响已经分支包括许多基因，所以多种途径的作用更可能作为无关的和附加的影响偶然起作用。如果这些作用通过一种新的细胞成分会聚在二种途径中，那么无关性和附加性就不大可能。在这种情况下，可包括相乘的叉积项，此项可特别表示一种细胞成分的倍增应答，这种应答是起因于多种途径在那种细胞成分的会聚。即使在后一种情况下以及在其它情况下，在这些情况下不保持有线性相加性，可以使线性相加性导入的误差与5.3.1节的技术相关联。

因此，优选地是按照如下等式将药物应答数据通过途径应答数据表示。 $D_k\left(t_1\right)=\underset{i}{\mathrm{\Σ}}{R}_{i,k}({\mathrm{\α}}_i,t_1);k=1,K;l=1,L----\left(5\right)$ 等式(5)对于按照由α_i参数化的所选择转换定标的第k细胞成分，用途径应答的和表示在药物暴露的第l水平第k细胞成分的模式药物应答。在此和随后一般都应理解到，按照步骤502的方法可插入R_i，k()，因为很少有如下情况，按由所定标的药物暴露水平给定的扰动控制值将获得这些测定量。在包括相乘的叉积项的情况下(例如，以前所述的情况)，等式5也包括如R_i，k(α_i，t₁)R_i，k(α_it₁)项。

通过本领域熟知的数值近似法可以获得此后一等式的足够精确的解。这些解确定最佳定标转化，以致使模式药物应答与药物应答尽可能密切地匹配。优选的方法提供了一个程度的数值指示(在此被称为“残数”)，达到此程度等式5则不能被充分满足。按照一种优选的方法，由相关的最小二乘方近似问题的最小化可以确定途径定标参数。

在等式(6)中，R_i，k的内部和包括所有插入的途径应答，这些途径应答是按照相应于药物暴露水平t₁的参数α_i定标的。对于每种生物途径参数α_i一般是确定定标转换的一组几个参数，如从1至5的参数。在t_i此和与药物应答差的绝对值的平方本身又对被‘l’标记的所有的药物暴露水平，以及被‘k’标记的药物应答中或生物途径中所有的细胞成分相加。以对此后一个总和的最小化处理可确实依据生物途径对药物应答的表示法，此总和是相对于每种途径定标转换参数{α_i}的总和。此总和的最小值提供了一个程度的数值指示，即“残数”，达到此程度等式5将被满足。

对于线性定标转换，等式6具有如下较简单的形式。

在等式7，每个α_i是对每种生物途径的单独定标常数。自然地，每个α_i取决于药物暴露所选择的单位，以及对扰动控制值所选择的单位，并且取决于药物的效力与扰动方法的效力之间确实的物理相关性。

应用许多现有数值方法中的任何一种方法可实施对最小二乘方等式6或7的最小化。参见例如Press等1996， C中的数据诀窍，第二版剑桥大学出版，第10，14章；Branch等，1996， Matlab最佳化 工具书，用户指南，Mathworks(Natick，MA)。一种优选的方法是Levenbery-Mar-quant法(在Press等的著作中，14.4节)。因为有K基因和药物暴露的水平L，所以等式6或7代表KL的单独等式。未知数等于假设的途径数目乘以每种途径定标参数的数目。在线性定标的情况下，定标参数的数目等于途径的数目。典型地是，数目KL比定标参数的数目大很多，此致使此最小二乘方问题是相当超定的。超定法是优越的方法，按此方法可使此解法准确，那在单个细胞成分的应答中对测定误差迟钝。

一种代替在等式6和7中所简述的用于解等式5的最小二乘方程序的方法，是最大化在模式药物应答与所测定的药物应答之间的标准化相关性。此程序在数学上与最小二乘方程序密切相关。按照此程序是从求解等式8来确定αi。在此等式中，ρ_k(αi)是对于第k细胞成分的药物应答与对于第k细胞成分的模式途径应答之间的相关系数。详细地说，此相关系数可由等式9给出。 ${\mathrm{\ρ}}_k\left({\mathrm{\α}}_i\right)=\frac{\underset{1}{\mathrm{\Σ}}{D}_k\left(t_1\right)\left(\underset{i}{\mathrm{\Σ}}{R}_{i,k}\left({\mathrm{\α}}_i{t}_1\right)\right)}{{\left(\underset{m}{\mathrm{\Σ}}{\left(D_k\left(t_m\right)\right)}^2\underset{n}{\mathrm{\Σ}}\underset{i}{\mathrm{\Σ}}{\left(R_{\mathrm{ik}}\left({\mathrm{\α}}_i{t}_n\right)\right)}^2\right)}^{1/2}}----\left(9\right)$ 在等式9，内部总和(对i)表示对第k细胞成分的模式药物应答。对所有的药物暴露水平相加模式药物应答与测定药物应答的积，并通过这些应答的平方根(在此也称为“RMS”)值标准化此总和，以便给出相关系数。返回到等式8，优选地可通过幅度A_DK和A_RK标准化此相关系数的值，此幅度A_DK和A_RK是对于第k细胞成分测定的和模式药物应答的应答幅度。这些幅度被选择为在所有的药物暴露水平测定的和模式药物应答的RMS值。这种标准化对具有较大幅度的应答给予较大的加权值，同时确保充分的相关性给出整数值。

另一方面并较少优选的是，可以将这些相关系数非标准化，在这种情况下，等式(8)中的幅度被取作单一值。还可以用此相关系数的负数代替此相关系数，在此情况下，等式(8)的表达式被最小化(而不是被最大化)，以便找到最佳定标参数。

通过在最小二乘方法的情况下所述的方法可以求解等式8和9。本领域的技术人员将明了，上述拟合法与最小化等式8的负数值是等价的。

不论对于最小二乘方法和相关法，对此转换的药物暴露水平相加这些途径应答可能导致超过扰动控制参数测定区间范围的值。这是因为此定标参数α_i可以是基本上大于或小于整数。为了避免测定值的外延，在此二种情况下(等式6和8)的总和仅在具有测定数据的间隔内被延伸。

当将来自二种不同药物的药物应答进行比较时，可以进行此节前面所述的步骤，以便获得一个相关系数，或者按另一种方法得到一个最小二乘方残数，它是二种药物作用相似性的一个测定量。在此实施方案中，仅一种应答途径被定标，以便拟合药物应答数据。因此，在此特定的实施方案中，是按照前述的等式5，在此K＝1，将第二“扰动”药物的应答R与第一种药物D的应答数据相比较。

5.3.2途径确证

在确定了将药物应答表示为一组途径应答之后，优选地，虽然是任选的是，对在步骤506中确定的途径组合赋予统计学显著性，并且确证所确定的途径在步骤507中是显著性的。

检验统计学显著性

对于步骤506，是通过将从求解等式5确定的最小残数值与预期的残数机率分布相比较，确定途径组合的统计学显著性。最小残数按照这种分布表示的可能性越小，所测定的途径组合越具显著性。在相关最大化法的情况下，可以将相同的方法用于等式8中找到的最大值。特别是，可以发现此最大值的预期分布，并且可从此分布确定真实获得的最大值的显著性。

借助于本领域已知的任何一种方法可以评估残数的预期机率分布。典型地是，根据有效输入机率分布的某一事先的假设，分析性地估算这种分布。因为在此情况下这种分析性估算是困难的，所以优选地是根据Fisher所述的方法，通过模拟估算此残数分布。参阅Conover第二版1980，实用非参量统计学，John wiley。此方法通过对输入的数据采取重排列或随机的正集提供经验性残数分布。详细地说，在此可相对于药物暴露水平改变输入。

按照这种优选的方法，通过以随机化的输入数据重复地求解等式5和累加此残数，构建残数分布图，以便形成经验性残数分布。从而，此构建的经验性残数分布图由随机数据产生，这些随机数据具有与真实数据相同的统计学总体。详细地说，首先在步骤505使药物暴露水平或扰动控制参数，或者是药物应答数据，或者是途径应答数据(但不是二者)被随机化。通过如下转换可表示这种随机化转换。

       D_k(t_l)-D_k(t_n(l))                 (10)

   R_i，k(p_i，l)-R_i，k(p_i，n(l))在等式(10)，∏表示对每种细胞成分独立选择的扰动。按照等式10，或者药物应答，或者每种途径应答(但不是二者)被随机化。因此，随机化的药物或途径应答数据是通过测定点的独立扰动从测定的数据得到。第二，然后通过在步骤504中所选用的数值近似技术求解等式5，并且省去形成残数的值。为了足够地随机化，重复这些步骤，以便构建一个充分显著性的，预期的残数分布。为了获得99％或更好的置信度水平(即P值小于0.01)，需要大于100的随机化。

在步骤506已构建经验性残数分布图之后，将真实确定的残数与所构建的分布和根据此分布确定的其机率相比较。此机率是被赋予此途径的显著性。换句话说，在此优选的实施方案中，是通过机率值的微小度对一组途径与药物应答的任何拟合给出统计学显著性，此机率值使随机化数据比真实数据通过假定的途径组合较好地被拟合。

在某些情况下，起初在步骤501中选择的途径组合具有适合的显著性。例如，如果此途径组合具有普通用于医学科学的至少标准的95％机率阈值时情况就是这样。如果这样，那么在步骤507中可以证实此起始的途径组合，并且可以在步骤508中确定一些细胞成分具有单独的生物途径。在另一些情况下，最初不能发现可接受的显著性阈值。如果是这样，那么如箭头512所指示的有利的情况可以是返回至步骤501并选择一组新的候选途径，以便找到一组符合此选择的显著性阈值标准。

因此，所赋予的显著性为赋予显著性值并在途径组合之间进行选择提供了一种客观的方法。这种赋予显著性的客观方法使有可能从一大批很可能包含在所研究药物作用中的可能途径有目的地鉴定这些途径，并且当模式药物应答(可能组合了多种途径)充分客观的显著性时，为停止寻找另外的途径提供了客观的依据。

在如上面确定的显著性的另一种用途中，可按照二种不同的方法检验单一候选途径的显著性。按第一种方法，选取只包含此候选途径的模式药物应答，并通过相关性或最小二乘方残数(如在5.3.1节中所述的)将随此途径的途径应答数据与药物应答数据相比较。将通过上述随机化法确定的拟合显著性与一个阈值如医学科学中的95％阈值标准相比较，并且如果此显著性大于阈值，则此候选途径被认为是药物作用途径。

按第二种方法，假定此模式药物应答参与包括所研究的候选途径在内的多种途径。然后按照等式10，对于此候选途径通过随机作此唯一的途径数据选择性地随机化途径应答数据，借助于以前的方法评估模式药物应答对此选择性随机化数据的显著性。如果此后者的显著性显著地小于此真实数据前者的显著性，那么选取已显著地改善了此模式药物应答的候选途径。在此情况下，该途径很可能是所研究药物作用的途径。

证实途径组合：

关于下一步骤507，通过在此节所述的优选的，但是任选的步骤可以独立地验证按照途径应答对药物应答的表示法。在本发明前面的步骤中(步骤510和511)，生物系统通过药物暴露或通过对所选择途径的扰动而受干扰，但是不该受药物暴露又受途径扰动的干扰。在步骤504和506，先通过一组所选择途径扰动的结果拟合药物暴露的结果，然后检验此拟合的统计学显著性。现在在步骤507中，是将在步骤504中所确定的对此显著性途径同时的药物暴露和扰动，用于证实这些途径确实是药物作用的真实途径。

在论述途径证实的分析细节之前，先根据图6中所示的情形示范性说明同时的药物暴露和途径扰动的优越性。在图6中，基因G_k的表达(例如转录状态的mRNA丰度测定量)受二种途径影响，一种起源于蛋白质P1，另一种起源于蛋白质Px。假定药物D通过抑制P1或通过抑制Px对基因G_k起作用。如果对此二种途径的抑制性扰动在基因G_k产生相似的应答，那么即使药物D仅通过抑制Px起作用，它的药物应答在步骤504中也将通过抑制性扰动601很好地拟合于起源于P1的途径，并且此途径可能被错误地鉴定为药物D作用的很可能途径。通过同时暴露于药物D和抑制P1或Px可以补救这种误差。暴露于药物D和抑制P1将不会导致药物应答改变，因为药物应答实际上是由Px介导的。但是，暴露于药物D和抑制Px将会导致药物应答改变，因为现在药物和扰动都作用于Px。在这二种情况中对同时的药物暴露和途径扰动不同的应答，使之能够对药物D作用的正确途径进行明确的鉴定。

开始概述验证步骤507时，首先考虑只有一种途径被参与表现药物应答的情况，随后考虑多种途径的一般情况。在下面如同以前，D_k(t₁)表示第k细胞成分对第l水平药物暴露的应答，R_i，k(R_i，l)表示在应答时第i途径中第k细胞成分对第l水平的适当扰动控制参数的应答。另外，变量DR表示生物系统组合暴露于药物和途径扰动的结果。详细地说，DR_i，k(R_i，l，t_m)表示在应答时第i途径中第k细胞成分对第l水平的适当扰动控制参数和对第m水平的药物暴露的应答。

在单一途径药物作用的情况下，如果药物确实作用在那种途径，那么可用如下等式给出组合应答DR。

     DR_i，k(p_i，l，t_m)＝R_i，k(p_i，l+α_it_m)    (11)在此α_i是对此途径确定的最佳定标参数。在此假定是线性定标；根据前面的描述显然适合于更一般的定标转换。DR具有上述形式是因为在这种情况下药物和扰动都对途径的相同成分起作用，特别是对它们的起源成分起作用，并且这种途径应答是由于其相加的作用。

等式(11)的状态被图解显示在图7A中，在此只是作为例子，D和R已被Hill函数模拟。特征上，在此情况下函数DR在基本上相同的值饱和，对于大的药物暴露(药物“滴定量”)接近星号701，对于大的扰动接近星号702，而对于大药物暴露和大扰动的组合接近圆圈703。

如果不是那样，药物对不同的途径起作用，而不是对第i途径起作用，那么可由如下等式给出组合的应答DR。

   DR_i，k(p_i，l，t_m)＝R_i，k(p_i，l)+D_k(t_m)   (12)在此情况下应答具有这种形式是因为药物只对第i途径之外的细胞成分起作用。因为途径扰动被限制于第i途径中的细胞成分，所以它独立地起此药物的作用。因而，药物的作用和扰动是独立的，并且它们的作用是附加在细胞成分上。(需要时按照在5.2节中所论述的另一些组合函数这些作用可以被组合)。

图7B图解显示了等式12的状态(假设α_i等于1)，在此仅为了作为例子D和R同样已被Hill函数模拟。在此情况下，函数DR在基本上相同的值饱和，对于大的药物暴露(药物“滴定量”)接近于星号704，而对于大的扰动接近于星号705。但是对于大药物暴露和大扰动的组合，此函数基本上达到比在星号704或705高的值，接近于圆圈706，在此只是药物暴露或扰动单独处于饱和中。

显然，通过对药物暴露和途径扰动都同时存在的验证条件进行实验，有可能区分由图7A和7B表示的情况。这些实验优选地是在由图7A和7B中圆圈所表示的药物暴露和扰动值，而最优选地是在圆圈703和706表示的值。较少优选地是这些实验在这些图中显示的表面内部的数值下进行，特别是在由图7A中星号701和702与圆圈703之间的线条所限定的区域内，以及在由图7B中星号703和704与圆圈705之间的线条所限定的区域内。同样明显的是，仅仅通过进行其中只有一个药物暴露值或扰动控制值是非0的实验是不可能区分这些情况。图7A中星号710与星号701或星号702之间的曲线，基本上与图7B中星号711与星号704或星号705之间的曲线相同。

总之，如果与图7B相比实验结果更密切地相似于图7A，则可证实第i途径为此药物作用途径的鉴定。

考虑到一般是多种途径的情况，TR_k(R_i，L，t_m)表示在应答第i途径中第l水平的适当扰动控制参数以及应答第m水平的药物暴露时，第k细胞成分的总应答。如果此药物通过所指出的途径起作用，则可用如下等式给出TR。 ${\mathrm{TR}}_k(p_{i,1},t_m)=\underset{i}{\mathrm{\Σ}}D{R}_{i,k}(p_{i,1},t_m)=\underset{i}{\mathrm{\Σ}}{R}_{i,k}(p_{i,1}+{\mathrm{\α}}_i{t}_m)----\left(13\right)$ 如此此药物不通过所指出的途径起作用，则可用如下等式给出TR。 $\mathrm{TR}(p_{i,1},t_m)=\underset{i}{\mathrm{\Σ}}D{R}_{i,k}(p_{i,1},t_m)=\underset{i}{\mathrm{\Σ}}(R_{i,k}\left(p_{i,1}\right)+D_k\left(t_m\right))----\left(14\right)$

按照类似于前面小节中所描述的统计学系数评估法的方式，可以在这二种可能性之间作出客观的选择。等式13和14左边TR_k(R_i，l，t_m)的值可对不同优选验证条件通过实验确定，而等式右边的值可根据步骤510和511中药物应答和途径应答的测定量，以及根据步骤504中对最佳定标参数的确定来计算。然后计算对于这二个等式的残数，即左边与右边差的平方和。没有更多时，具有较少残数的二者之一是此客观的选择。

可首先通过评估残数的机率分布来评估此残数的统计学显著性。通过相对于扰动控制参数的指数和药物暴露的指数重复随机化等式13和14的右边，然后重新计算此残数可确定所评估的残数机率分布。然后相对于此模式机率分布确定真实残数的统计学显著性。

典型地是，以显著性证实存在步骤506中被确定的具有显著性的途径，只需要小数目的验证条件。

在最后任选的步骤508中，在步骤504药物应答已被表示为一组途径应答，并且最佳拟合定标参数已被相应地确定之后，可以将每种受影响的细胞成分分配给与它的药物应答最相关的途径。任选地还可在步骤506中基于一个显著性阈值如通常用于医学科学的标准的95％机率阈值，判断此途径是显著性的。在每种途径的应答数据中对于第K细胞成分，它的药物应答D_k(t_l)与该成分的单个应答相关联。

ρ_i，k＝corr(D_k(t_l)R_i，k(α_it_l)) $=\frac{\underset{1}{\mathrm{\Σ}}{D}_k\left(t_1\right)R_{i,k}\left({\mathrm{\α}}_i{t}_1\right)}{{\left(\underset{m}{\mathrm{\Σ}}{\left(D_k\left(t_m\right)\right)}^2\underset{n}{\mathrm{\Σ}}{\left(R_{\mathrm{Jk}}\left({\mathrm{\α}}_J{t}_n\right)\right)}^2\right)}^{1/2}}----\left(15\right)$ 在等式15中，ρ_i，k是第k细胞成分的药物应答与在第i途径中其应答的相关性。第K细胞成分被分配给第i途径，在此由于所有的l都不等于i，ρ_i，k大于ρ_L，k。类似于前面的显著性评估法，可以通过随机化等式15中的药物应答数据来确定此相关性的统计学显著性。

5.3.3执行系统和方法

通过使用如下计算机系统并按照如下的程序和方法，可优选地执行在前面各小节中所述的分析方法。图9显示了一个适合于执行本发明分析方法的示范性计算机系统。计算机系统901被显示包括内部组件，并被连接于外部组件，此计算机系统的内部组件包括处理器元件902，与内存903相互连接。例如，计算机系统901可以是IntelPentium^为基础的200兆或更大时钟频率的处理器，并具32MB或更多的内存。

外部组件包括大容量存储器904。这种大容量存储器可以是一个或几个硬盘(它通常与处理器和内存包装在一起)。这种硬盘一般具有1GB或更大的存储容量。其它的外部组件包括使用者界面装置905，它可以是一套监视器和键盘，以及可以是鼠标的点击装置906，或者其它的图形输入装置(未显示出)。典型地，计算系统901还连接于网络链路907，此网络链路可以是Ethernet连接于其它局部计算机系统的一部分，远程计算机系统，或者广域通信网络如Internet。此网络链路可使计算机系统901与其它计算机一起分享资料和处理任务。

操作此系统时，先将几种软件成分装入内存，这些软件成分既是本领域标准的，又是本发明将有的。这些软件成分共同地导致此计算机系统按照本发明的方法运行。这些软件成分通常存储在大容量存储器904上。软件成分910提供操作系统，负责管理计算机系统901和它的网络互相连接。此操作系统可以是Microfoft Windows^TM家族如Windows 95，Windows 98或Windows NT。软件成分911提供通用语言和功能，方便地存在于此系统上，以便促进程序执行对本发明特定的方法。可用于编程本发明分析方法的语言包括C和C++，或较差点的JAVA^。最优选地是，以数学软件包编程本发明的方法，使之可以应用方程式的符号入口和包括算法的高水平处理规程，从而使用户不需要从程序上编程单个的方程式或算法。这种软件包包括来自Mathworks(natick.MA)的Matlab，来自Wolfram Ragearch(Champaign，Illinois)的Mathematica，或来自Math soft(Seattle，Washington)的S-plus。

因此，软件成分912和913提供本发明的分析方法，如在程序语言或符号包中所编程的。成分912提供一种程序执行用于在5.3.1节中所述的药物应答表示的方法，以及成分913提供一种程序，执行用于在5.3.2节中所述的评估药物应答表示的显著性。

在示范性的执行过程中，为了实行本发明的方法，使用者首先将药物应答数据和途径应答数据输入计算机系统901。这些数据可被使用者从监视器和键盘905直接输入，或者从由网络连接907连接的，或在可移动存储介质(示显示出)上的其它计算机系统输入。下一步使用者引起执行药物应答表示软件912，在任选地供给所研究的起始途径之后，随之执行显著性评估软件913。从而，使用者可获得一个模式药物应答和它的统计学显著性。最后如在5.3.2节中所述，使用者可以通过引起重复和迭代执行药物应答表示软件和统计学显著性评估软件，根据几个选择方案对第一个模式药物应答反复地改进提高。

对于本领域的技术人员，用于执行本发明分析方法的另一些系统和方法将是显而易见的，并打算将它们包括在所伴随的权利要求中。特别是打算使伴随的权利要求包括用于执行本发明方法的另一些程序结构，这对于本领域的技术人员是容易实现的。

5.4途径扰动方法

用于在不同的细胞水平定向扰动生物途径的方法在本领域逐渐被广泛地认识和应用。任何能够特异性地靶向和可控制地修饰(例如通过分级的增加或激活或者通过分级的减少或抑制)特定细胞成分(例如基因表达，RNA浓度，蛋白质丰度，或蛋白质活性等)的这样一些方法，都可被用于实施途径扰动。对细胞成分的可控制性修饰因而可控制性干扰起源于所修饰细胞成分的途径。起源于特定细胞成分的这些途径被优选地用于在本发明表示药物作用。优选的修饰方法能够单独靶向多种细胞成分中的每一种，而最优选地是靶向这些细胞成分的主要部分。

下面的方法是可被用于修饰细胞成分，并从而产生途径扰动的示范性方法。这些途径扰动可产生途径应答，用于前述本发明方法的步骤中。本发明可合适于用于对途径形成可控制性扰动的其它方法，特别是对途径起源的细胞成分的可控制扰动。

优选地可在从如下任何生物体获得的细胞类型中形成途径扰动，对于这些生物体其基因组信息和表达序列信息是现在可利用的，并且也有对于这些生物体允许可控制性地修饰特定基因表达的方法。目前正在对几种真核生物进行基因组测序，包括人，线虫，拟南芥和蝇。在优选的实施方案中，是用一种酵母菌实施本发明，酿酒酵母(S.Cerevisiae)是最优选的，因为已经确定了酿酒酵母菌株的全部基因组序列。此外，用于可控制性修饰酵母菌基因表达的方法已充分地建立或被利用。优选的酵母菌株是已知基因组序列的酿酒酵母菌株，如S288C株或它的同源衍生株(参见例如，自然369，371-8(1994)；P.N.A.S.92：3809-13(1995)；E.M.B.O.J.13：5795-5809(1994)；科学265：2077-2082(1994)；E.M.B.O.J.15：2031-49(1996)，全部被引入作为参考。但是，其它菌株也可能同样良好地被使用。酵母菌株可从美国典型培养物保藏中心(Rockville.MD20852)得到。在如下文献中描述了用于操作酵母菌的标准技术：C.Kaiser，S.Michaelis d A.Mitchell，1994，酵母菌遗传学方法：冷泉港实验室运行手册，冷泉港实验室出版，纽约；和Sherman等，1986，酵母菌遗传学方法：实验室手册，冷泉港实验室出版，纽约冷泉港，它们二者全部被引入作为参考。

下述的示范性方法包括使用可滴定的表达系统，使用转染或病毒转导系统，包括使用具有已知特定作用的药物(或一般的化合物)直接修饰RNA丰度或活性，直接修饰蛋白质丰度，以及直接修饰蛋白质活性。

可滴定的表达系统：

几种可用于芽殖酵母酿酒酵母的已知可滴定或同样可控制的表达系统中的任何一种都适用于本发明(Mumberg等，1994，酿酒酵母菌的可调节启动子：转录活性比较及它们对异源性表达的用途。核酸研究22：5767-5768)。通常是通过转录控制，以将受控制基因的启动子被一个可控制的外源性启动子代替来控制此基因的表达。酵母中最常用的可控制性启动子是GAL1启动子(Johnston等，1984，酿酒酵母菌中调节趋异性GAL1-GAL10启动子的序列，分子细胞生物学8：1440-1448)。培养基中存在葡萄糖可强烈地抑制GAL1启动子。通过逐渐降低葡萄糖的浓度并存在半乳糖，可逐渐以分级的方式开启GAL1启动子使之达到高水平的表达。GAL1启动子通常对所研究的基因可达到在5-100倍范围内的表达控制。

其它常用的启动子系统包括MET 25启动子(Kerjan等1986，酿酒酵母菌MET25基因的核苷酸序列，核酸研究14：7861-7871)和Cup1启动子(Mascorro-Gllardo等，1996，构建调整酿酒酵母菌内基因表达的基于Cup1启动子的载体，基因172：169-170)，培养基中不存在甲硫氨酸可诱导MET 25启动子，而铜离子可诱导Cup1启动子。所有这些启动子系统都是可控制的，其中可通过生长培养基中可控制部分浓度的递增性改变使基因表达受到递增性控制。

上面所列举表达系统的一个缺点是，控制启动子的活性(例如受碳源改变的影响，除去某些氨基酸)，常常会引起细胞生理学的其它一些改变，这些改变可独立地改变其它基因的表达水平。最近对酵母菌建立的一个系统Tet系统在很大程度上解决了这个问题(Gari等1977，用于调整酿酒酵母菌基因表达，具有四环素调节性启动子系统的一组载体，酵母菌13：837-848)。采自哺乳动物表达系统的Tet启动子(Gossen等，1995，四环素对哺乳动物细胞的转录激活作用，美国国家科学院学报89：5547-5551)受抗菌素四环素或结构相关化合物强力霉素浓度的调节。因此，不存强力霉素时此启动子诱导高水平的表达，加入逐渐提高浓度的强力霉素，导致增加对启动子活性的抑制作用。通过加入中等浓度的药物，可使中等水平的基因表达达到稳定状态。而且，给予最大的启动子活性抑制作用的强力霉素浓度(10μg/ml)，对于野生型酵母细胞的生长速度没有明显的作用(Gari等1997，用于调整酿酒酵母基因表达，具有四环素可调节性启动子系统的一组载体，酵母13：837-848)。

对于哺乳动物细胞，有几种滴定基因表达的方法是现存可利用的(Spencer，1996，对哺乳动物引起条件性突变，遗传学动向12：181-187)。如上所述，Tet系统正广泛地被使用，它的原来形式，“正向”系统，对其中加入强力霉素可抑制转录作用，面对于新型的“反向”系统，对其中加入强力霉素可刺激转录作用(Gossen等，1995，美国国家科学院学报89：5547-5551；Hoffanarm等1997，核酸研究25：1078-1079；Hofmann等1996，美国国家科学院学报83：5185-5190；Panlus等，1996，病毒学杂志70：62-67)。另一个在哺乳动物细胞中常用的可控制性启动子系统是由Evans及其同事建立的蜕皮激素-诱导性系统(No等1996，在哺乳动物细胞中蜕皮激素-诱导的基因表达和转基因小鼠，美国国家科学院学报93：3340-3351)，在此，表达受加入到培养细胞中的muristerone浓度控制。最后，应用由Schreibe.Crabtree及其同事建立的“化学剂”诱导的二聚体形成(CID)系统(Belshaw等1996，用诱导蛋白质异二聚体形成的合成配体控制蛋白质的结合和亚细胞定位，美国国家科学院学报93：4604-4607；Spencer 1996，对哺乳动物引起的条件性突变，遗传学动向12：181-187)及酵母菌中类似的系统也可以调节表达。在此系统中，是将所研究的基因置于CID-应答启动子的控制之下，并被转染进入表达二个不同的杂合蛋白质的细胞，一个杂合蛋白质由融合于FKBP12的DNA-结合功能域组成，此功能域可结合FK506。另一个杂合蛋白质包含也融合于FKBP12的转录激活功能域。CID诱导分子是FK1012，这是FK506的同型二聚体形式，它能够同时结合DNA结合性杂合蛋白质和转录激活性杂合蛋白。对于分级存在的FK1012，可激活受控制基因的分级转录作用。

对于上述的每种哺乳动物表达系统，如本领域技术人员广泛知道的，是将所研究的基因置于可控制性启动子的控制之下，并将包含这种构建体以及抗菌素抗性基因的质粒转染进入培养的哺乳动物细胞内。一般地说，此质粒DNA整合进入基因组，选择出药物活性集落，并对调节基因的适当表达进行筛选。另外，还可以将此受调节基因插入一个游离基因质粒如PCEP4(Invitrogen公司)中，此质粒包含质粒复制所必需的EB病毒成分。

在优选的实施方案中，是将如上述的可滴定的表达系统导入缺乏相应内源性基因和/或此内源性基因活性的细胞或细菌中，例如其中该内源性基因已被破坏或删除的细菌。产生这种“敲除”的方法对本领域的技术人员是熟知的，参见如Pettitt等1996，发育122：4149-4157；Spradling等1995，美国国家科学院学报92：10824-10830；Ramires-Sdis等1993，酶学方法，225：855-878，和Thomas等1987细胞51：503-512。

用于哺乳动物细胞的转染系统：

靶标基因的转染或病毒转导可以将可控制性扰动导入哺乳动物细胞内的生物途径中。优选地可对天然不表达所研究靶标基因的细胞使用靶标基因的转染或转导。可以从正常情况下不表达此靶标基因的组织，或者可使此靶标基因在细胞中特异性地突变的组织中获得这种非表达性细胞。此所研究的靶标基因可以被克隆进入许多哺乳动物表达质粒的一种，例如PCENA3.1+/-系统(Invitrogen公司)或反转录病毒载体，以及被导入非表达性宿主细胞。通过对由此表达载体编码的药物抗性标记进行选择，可分离出表达此靶标基因的被转染或转导的细胞。基因转录水平仅与转染剂量相关联。因此，可以检查靶标基因水平变化的作用。

应用这种方法的一个特殊例子是寻找靶向src-家族蛋白胰蛋白酶激酶lck的药物，lck是T细胞受体激活途径的关键性成分(Anderson等，1994，在T细胞信号传输和胸腺细胞发育中包含蛋白质胰蛋白酶激酶P56(lck)，免疫学进展56：171-178)。这种酶的抑制剂作为可能的免疫抑制药物正在研究中(HankeJH.1996，一种新型、强有力的src-家族选择性胰蛋白酶激酶抑制剂的发现，生物化学杂志271(2)：695-701)。Jurkat T细胞系(JcaM1)的特异性突变体是可利用的，它不表达lck激酶(Straus等，1992，关于在通过T细胞抗原受体信号转导中包含lck胰蛋白酶激酶的遗传学进展，细胞70：585-593)。因此，通过转染或转导将lck基因导入JCaM1使之有可能特异性地扰动由lck激酶调节的T细胞激活途径。转染或转导的效率与这种扰动水平确实有关。这种方法一般可用于对正常情况下不表达受干扰基因的细胞提供基因表达或蛋白质丰度扰动。

修饰RNA丰度或活性的方法：

目前修饰RNA丰度和活性的方法有下三类：核酶，反义物质和RNA衔接子法(Good等，1997，基因治疗4：45-54)。可控制地对细胞使用或将细胞暴露于这些物质则能够可控制地扰动RNA丰度。

核酶是能够催化RNA裂解反应的RNA。(Cech 1987，科学236：1532-1539；PCT国际公开WO 90/11364，1990年10月4日公布；Sarver等1990，科学247：1222-1225)。可以设计“发夹”型和“锤头”型RNA核酶用于特异性地裂解特定的靶标mRNA。已经确立了设计具有核酶活性的短RNA分子的准则，也就是能够以高度的序列特异性方式裂解其它RNA分子，并且可以靶向实际上所有种类的RNA(Haseloff等，1988，自然334：585-591；Koizumi等1988 REBS通讯228：228-230；Koizumi等，1988，FEBS通讯239：285-288)。核酶法包括将细胞暴露于这种RNA核酶小分子，还包括在细胞等内表达这种小分子。(Grassi和Merini，1996，医学年鉴28：499-510；Gibson，1996，癌及转移述评15：287-299)。

可以在体内以对裂解mRNA催化有效的足够数量常规地表达核酶，并且从而改变细胞内mRNA的丰度(Cotten等1989，核酶介导的体内RNA破坏，EMBO杂志8：3861-3866)。特别是，可以将按照前述准则设计、并通过例如亚磷酰胺化学法合成的，编码DNA序列的核酶连接进入编码tRNA基因的反密码子茎和环中的限制性酶位点，然后可以借助于本领域常规的方法将它转化进入所研究的细胞，并在此细胞内表达。优选地还将一个可诱导性启动子(例如糖皮质激素或四环素应答成分)转导进入这种构建体，以致可以选择性地控制核酶的表达。tDNA基因(即编码tRNA的基因)可用于本申请，因为它体积小，转录速度快，以及在不同种组织内普遍存在表达作用。因此，可以按常规设计实际上可裂解任何mRNA序列的核酶，并且可按常规以编码这种核酶的DNA转化细胞，以致表达可控制的、催化有效量的核酶。因此可以干扰实际上任何RNA种类的丰度。

在另一个实施方案中，可以通过可控制地使用反义核酸可控制地抑制靶标RNA(优选地是mRNA)的活性，特别是它的翻译速度。如在此使用的“反义”核酸是指能够借助于与编码区和/或非编码区互补的某一序列与靶标RNA的序列-特异性(例如非-聚腺苷酸)部分杂交的核酸。本发明的反义核酸可以是双链或单链的寡核苷酸，RNA或DNA，它的修饰物或衍生物，可以将这种反义核酸以可控制的方式直接对细胞给药，或者可通过以足够干扰靶标RNA翻译的可控制量转录外源性导入的序列，在细胞内产生这种反义核酸。

优选的反义核酸至少有6个核苷酸，而优选地是寡核苷酸(在6-大约200个寡核苷酸的范围内)。在特殊情况下，此寡核苷酸至少有10个核苷酸，或至少15个核苷酸，或至少100个核苷酸，或至少200个核苷酸。此寡核苷酸可以是DNA或RNA，或者它们的嵌合混合物、衍生物或修饰的形式，单链或双链的。可以在碱基部分，糖基部分或磷酸骨架修饰此寡核苷酸。此寡核苷酸还可能包括其它的添加部分如肽或促进跨细胞膜转运的作用剂(参见例如Letsinger等1989，美国国家科学院学报86：6553-6556；Lemaitre等1987，国家科学院学报84：648-652；PCT公布号WO/88/09810，1988、12、15公布)，杂交触发的裂解剂(见例如Krol等1988。生物技术6：958-976)或嵌入剂(见例如Zon，1988，药学研究5：539-549)。

在本发明优选的方面是提供了一种反义寡核苷酸，优选地是单链DNA。可在其结构的任何部位以本领域一般已知的组成成分修饰此寡核苷酸。

此反义寡核苷酸可能包括至少一个选自如下种类的被修饰的碱基部分，包括但不局限于：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基queosine，次黄苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基次黄苷2，2-二甲基鸟嘌呤，α-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘌呤，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(V)，Wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(V)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)W，以及2，6-二氨基嘌呤。

在另一实施方案中，此寡核苷酸包含至少一个选自但不局限于如下种类的修饰的糖基部分：阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖和已糖。

在还有一个实施方案中，此寡核苷酸包含至少一个选自如下种类的修饰的磷酸骨架：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，酰胺硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷酸三酯，以及formacetal或其类似物。

在再一个实施方案中，此寡核苷酸是2-α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中与通常的β-单位相反，二条链相互平行存在(Gantier等1987，核酸研究15：6625-6641)。

此寡核苷酸还可能与另一分子偶联，例如肽，杂交触发的交连剂，转运剂，杂交触发的裂解剂等。

本发明的反义核酸包含与靶RNA的至少一部分互补的序列。但是，也不需完全互补，虽然优选地是完全互补。这里所指的与“某一RNA的至少一部分互补”的序列意指一种具有能够与此RNA杂交，形成稳定双螺旋的足够互补性的序列；在双链反义核酸的情况下，因此可以测定此双螺旋DNA的一条单链，或者可能测试三链体形式。杂交的能力将取决于互补性的程度和此反义核酸的长度。一般是，杂交的核酸越长，它可能包含与靶标RNA越多的错配，并仍可形成稳定的双螺旋(或三链体，视情况而定)。通过应用标准的程序测定此杂交复合体的熔点，本领域的技术人员可以确定可允许的错配程度。借助于标准的测试技术还可以确定对抑制靶标RNA翻译有效的反义核酸的量。

可以借助于本领域已知的标准方法合成本发明的寡核苷酸，例如通过使用自动DNA合成仪(如可以从Biosearch，Applied Biosystems等购买到)。作为例子，可借用于Stein等(1988，核酸研究16：3209)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，通过使用控制孔径的玻璃聚合物支持体可以制备甲基膦酸酯寡核苷酸(Sarin等1988，美国国家科学院学报85：7448-7451)，等等。在另一实施方案中，此寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，核酸研究15：6131-6148)，或者是一个嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等1987，FEBS通讯215：327-330)。

然后可以将此合成的反义寡核苷酸以可控制的方式对细胞给药。例如，可以将此反义寡核苷酸以可控制的浓度加入到此细胞生长的环境中，在此细胞可以吸收它们。通过应用本领域已知的方法可以检测对此反义寡核苷酸的吸收。

在另一实施方案中，本发明的反义核酸通过从一个外源性序列的转录，可控制地在细胞内被表达。例如，可将一个载体导入体内，以致它被细胞吸收，在该细胞内此载体或它的一部分被转录，产生本发明的反义核酸(RNA)。这种载体含有编码此反义核酸的序列。这种载体可以仍然是游离基因或者被染色体整合，只要它能够被转录产生所需要的反义RNA。可以通过本领域标准的重组DNA技术构建这种载体。载体可以是质粒，病毒或本领域已知的，用于在哺乳动物中复制和表达的其它载体。可以通过本领域已知的在所研究细胞中起作用的任何一种启动子表达编码此反义RNAs的序列。这种启动子可以是诱导的或组成型的。最优选地是，通过给予外源性部分启动子可被控制或诱导，以便实现对此反义寡核苷酸的受控制性表达。这种可控制的启动子包括Tet启动子。可用于哺乳动物细胞但相对不优选的启动子包括，但不局限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，自然290：304-310)，包含在Rows肉瘤病毒3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等，1980细胞22：787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院学报78：1441-1445)，金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等1982，自然296：39-42)等。

因此，反义核酸可以被常规地设计靶向实际上任何一种mRNA序列，并且可以用编码这种反义序列的核酸常规地转化细胞，或者使细胞暴露于这种核酸，以致能表达有效的可控制量反义核酸。因此，实际上可以控制性地干扰任何一种RNA的翻译。

最后，在另一个实施方案中，可以将RNA衔接子导入细胞，或者在细胞中被表达。RNA衔接子是对蛋白质的特异性RNA配体，例如对于Tat和Rev特异的RNA(Good等，1997，基因治疗4：45-54)，此配体可以特异性地抑制它们的翻译。

修饰蛋白质丰度的方法：

修饰蛋白质丰度的方法包括，特别是改变蛋白质降解速度的方法和应用抗体的方法(此抗体结合于影响天然靶标蛋白质丰度或活性的蛋白质)。增加(或降低)某种蛋白质的降解速度，可降低(或增加)这种蛋白质的丰度。本领域已知的用于在应答提高温度和/或暴露于特定药物中可控制地增加靶标蛋白质降解速度的方法可被用于本发明。例如，这样一种方法可利用热诱导的或药物诱导的N-末端降解决定子，它是N-末端蛋白质的一个片段，在较高温度(例如37℃)时它暴露出启动蛋白质迅速降解的降解信号，而在较低温度时(例如23℃)它被隐藏以便防止蛋白质迅速降解(Dohmen等，1994，科学263：1273-1276)。范例性的这样一种降解决定子是Arg-DHFR^ts，这是鼠二氢叶酸还原酶的变异体，其中N-末端Val被Arg取代了，并且位置66的Pro被Leu取代了。按照这种方法，例如借助于本领域已知的标准的基因打靶法(Lodish等，1995，细胞分子生物学，W.H.Freeman and Co.纽约，特别是第8章)用编码融合蛋白Vb-Arg-DHFR^ts-P(“Vb”代表遍在蛋白)的基因代替编码靶标蛋白P的基因。在暴露N-末端降解决定子的翻译之后，N-末端遍在蛋白被迅速裂解。在较低温度时，Arg-DHFR^ts内部的赖氨酸不被暴露，此融合蛋白的遍在蛋白化不发生，降解缓慢，活性靶标蛋白浓度高。在较高浓度(不存在氨中喋呤)时，Arg-DHFR^ts内部的赖氨酸被暴露，此融合蛋白的遍在蛋白化发生，降解迅速，活性靶标蛋白浓度低。通过氨甲喋呤暴露可控制地阻断降解的热激活作用。此方法适合于对其它诱导因子如药物和温度改变敏感的其它N-末端降解决定子。

还可以通过(中和)抗体降低靶标蛋白质的丰度，并且也直接或间接地降低它的活性。通过提供受控制的暴露于这种抗体，可以可控制地改变蛋白质的丰度/活性。例如，针对蛋白质表面适合抗原表位的抗体，通过主动结合靶标蛋白的野生型活性形式，成为与未结合的野生型形式相比较具有较小或最小活性的复合物，可以降低此野生型活性形式的丰度，从而间接地降低它的活性。另外，通过例如，与活性位点直接相互作用，或者通过阻断底物接近活性位点，抗体也可以直接降低蛋白质的活性。相反地，在某些情况下，(激活的)抗体带可以与蛋白质和它的活性位点相互作用，而增加由此引起的活性。在这二种情况下都可以(通过将要论述的方法)产生针对特异性种类蛋白质的(将要描述的不同类型的)抗体，并筛选它们的作用。可以检测这种抗体的作用，并可选择提高或降低靶标蛋白浓度和/或活性的适合的抗体。这种检测包括将抗体导入细胞(见下面)，并借助于本领域已知的标准方法(如免疫测定法)检测野生型数量的浓度或靶标蛋白质的活性。借助于适合于靶标蛋白已知活性的检测方法可测定野生形式的净活性。

可以用多种方式将抗体导入细胞，包括例如将抗体显微注射进入细胞(Morgan等1988，今日免疫学9：84-86)，或者使编码所需抗体的杂交瘤mRNA转化进入细胞(BurkeTFFU，1984，细胞36：847-858)。按照进一步的技术，重组抗体可以是工程构建的，并在广泛多种非淋巴细胞中被表达，以便结合于靶标蛋白以及阻断靶标蛋白的活性(Bioccn等1995，细胞生物学动向5：248-252)。优选地此抗体的表达是在可控制性启动子如Tet启动子的控制之下。第一步是选择对此靶标蛋白具有适当特异性的特定的单克隆抗体(见下面)。然后可以将编码所选择抗体可变区的序列克隆成为不同的工程构建抗体形式，包括例如，全抗体，Fab片段，Fv片段，单链Fv片段(以肽接头结合的V_H和V_L区)(“ScFv”片段)，双抗体(二个具有不同特异性的结合的ScFv片段)，等等(Hayden等1997，免疫学的当前观点9：210-212)。通过将它们表达为与不同已知细胞内引导序列的融合体，可以使细胞内表达的不同形式抗体靶向进入细胞内的区室(例如细胞质，核，线粒体等)(Bradbury等，1995，抗体的工程构建(第二卷)(Borrebaeck编辑)PP295-361，IRL出版)。特别是ScFv形式似乎特别适合于靶向细胞质。

抗体类型包括，但不限于，多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，Fab片段，以及Fab表达文库。本领域已知的不同程序都可以用于产生针对一个靶标蛋白质的多克隆抗体。为了产生这种抗体，可以通过以此靶标蛋白质注射来免疫不同的宿主动物，这种宿主动物包括但不限于兔，小鼠，大鼠等。取决于宿主动物的种类，可使用不同的佐剂以理增强免疫应答，包括但不限于福氏(完全和不完全)佐剂，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷酸，Pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，二硝基酚，以及潜在地可用于人的佐剂如卡介苗(BCG)和小棒杆菌。

为了制备针对一种靶标蛋白的单克隆抗体，可以应用提供通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的任何一种技术。这些技术包括但不限于，最初由Kohler和Milstein(1975，自然256：495-497)建立的杂交瘤技术，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学4：72)，以及产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(Cole等1985，在单克隆抗体和癌治疗中，Alan R.Liss.公司PP.77-96)。在本发明的补充实施方案中，单克隆抗体可以利用最新技术在无菌动物中产生(PCT/US90/02545)。根据本发明可以使用人抗体，并可以通过应用人杂交瘤(Cote等，1983，美国国家科学院学报80：2026-2030)，或者通过在体外以EBV病毒转化人B细胞(Cole等，1985，在单克隆抗体和癌治疗中，Alan R.Liss公司PP.77-96)可以获得人抗体。实际上，根据本发明还可以应用通过如下方法产生“嵌合抗体”(Morrison等，1984，美国国家科学院学报81：6851-6855；Nenberger等，1984，自然312：604-608；Takeda等，1985，自然314：452-454)的技术：将来自小鼠的，对靶标蛋白质特异性的抗体分子的基因与来自人的，具有适当生物活性的抗体分子的基因拼接在一起；这种抗体包括在本发明的范围之内。

此外，如果单克隆抗体较有利，也可以应用噬菌体显示技术从大抗体文库中将它们挑选出(Marks等，1992，生物化学杂志267：16007-16010)。应用这种技术，已使达到10¹²不同抗体的文库表达在fd丝状噬菌体表面，在体外形成一个“单容器”(“Single pot”)抗体免疫系统，可用于选择单克隆抗体(Griffiths等，1994，EMBO杂志13：3245-3260)。借助于本领域已知的技术可以从这文库中选择抗体，包括使此噬菌体与固定化的靶标蛋白质触，选择和克隆结合于此靶标的噬菌体，并且将编码此抗体可变区的序列亚克隆进入表达所需抗体形式的适当载体内。

根据本发明，产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可适合于产生对该靶标蛋白质特异性的单链抗体。本发明的另一个实施方案应用构建Fab表达文库的技术(Huse等1989，科学246：1275-1281)，使之能够快速简便地鉴定对该靶标蛋白质具有所需特异性的单克隆Fab片段。

应用本领域已知的技术可以产生包含该靶标蛋白质独特型的抗体片段。例如，这类片段包括，但不限于可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)₂片段；可通过还原F(ab’)₂片段二硫桥产生的Fab’片段；可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，以及Fv片段。

在产生抗体时，借助于本领域已知的技术例如ELISA(酶连免疫吸附检测法)，可以实现对所需抗体的筛选。为了选择对靶标蛋白质特异性的抗体，可以对产生的杂交瘤或噬菌体显示抗体文库检测结合于该靶标蛋白质的抗体。

修饰蛋白质活性的方法：

直接修饰蛋白质活性的方法包括特别是，优势负突变，特异性药物(在本申请的意义上使用的)或一般的化合物，以及使用前面所述的抗体。

优势负突变是对内源性基因或突变体外源性基因的突变，当这些基因在细胞内表达时会破坏所靶向蛋白质种类的活性。取决于所靶向蛋白质的结构和活性，存在一般性规则来指导选择适当的方案，用于构建破坏靶标活性的优势负突变(Hershkowits，1987，自然329：219-222)。在活性单体形式的情况下，无活性形式的过度表达可引起对天然底物或配体的竞争，足以显著地降低靶标蛋白质的活性。通过例如结合突变基因和增加活性的启动子，优选地是可控制的或可诱导的启动子，可以实现这种过度表达。按另一种方法，可以使活性位点的残基发生改变，以致发生与靶标配体实际上不可逆的结合。以某种胰蛋白酶激酶，通过小心地取代活性位点丝氨酸残基可达到此目的(Perlmntter等，1996，免疫学现代观点8：285-290)。

在活性多聚体形式的情况下，有几种方案可以指导选择优势负突变体。通过编码外源性蛋白质片段的基因表达，可以可控制地降低多聚体的活性，这种外源性蛋白质片段结合于多聚体的结合功能区，而阻止多聚体形成。另一方面，可控制地过度表达特定类型的无活性蛋白单位，可以阻碍无活性多聚体中的野生型活性单位，从而降低多聚体的活性(Nocka等，1990，EMBO杂志9：1805-1813)。例如，在二聚体DNA结合蛋白质的情况下，可以从DNA结合位点删去DNA结合功能区，或者从激活单位中删去激活功能区。在这种情况下，还可以使DNA结合功能区在没有引起与激活单位结合的功能区的情况下被表达。从而，DNA结合位点被阻碍，没有任何可能的表达活性。在特定类型的单位在活性期间正常地经受构象改变的情况下，刚性单位的表达可以使形成的复合物失活。如一个例子是，与细胞机制有关的蛋白质一般是由少数类型的许多亚单位结合组成，这些细胞机制包括例如细胞运动，有丝分裂过程，细胞构建等。这些结构对于包含几个具有结构缺损的单聚体单位的损坏通常高度敏感。这种突变单位会破坏相关蛋白质的活性，并可以在细胞内可控制地被表达。

除了优势负突变之外，借助于本领域熟知的诱变和筛选步骤，可以找到对温度(或其它外源性因素)敏感的突变靶蛋白。

本发明的技术人员还将理解到，还可以将结合和抑制靶标蛋白的抗体的表达用作另一种优势负突变策略。

已知特异性作用的药物：

最后，通过暴露于药物或配体可以可控制地改变某些靶标蛋白质的活性。在优选的情况是，已知某药物仅与细胞内一个靶标蛋白相互作用，并且仅仅改变这一个靶标蛋白的活性。将细胞分级地暴露于不同量的药物，从而引起对起源于此蛋白质的途径分级的扰动。这种改变可以是降低活性或者增加活性。次优选情况是，已知所使用的某药物以单独的，不同的和非重叠的作用仅改变几个(例如2-5个)靶标蛋白质的活性。分级暴露于这种药物引起对起源于该靶蛋白质的几种途径的分级扰动。

5.5测定方法

通过测定被药物暴露或被途径扰动改变的细胞成分获得用于本发明的药物应答和途径应答。这些细胞特征可以是细胞生物状态的任何方面。它们可以是测定其中RNA丰度的转录状态，测定其中蛋白质丰度的翻译状态，测定其中蛋白质活性的活性状态。这种细胞特征还可以是混合形式，例如其中起始特定生物途径的一种或几种蛋白质的活性，与在该起源蛋白质的途径下游中细胞成分的RNA丰度(基因表达)一起被测定。此部分将描述用于测定药物或途径应答中细胞成分的方法。本发明也适应这种测定的其它方法。

基于测定药物和途径应答转录状态的本发明实施方案是优选的。借助于将在下一小节中描述的与核酸或核酸模拟探针的序列杂交的技术，或者借助于在随后的小节中描述的其它基因表达技术，可以测定这种转录状态。但是所测定的结果是包括表示RNA丰度比率值的应答数据，它通常反映DNA的表达比率(在不存在RNA降解速度差异时)。这种测定方法在5.5.1节中被描述。

在本发明另一些不同的实施方案中，可测定不同于转录状态的其它生物状态方面，例如翻译状态，活性状态，或混合形式。在此部分将描述这些实施方案的细节。在5.5.2节中描述这些测定方法。

5.5.1转录状态测定

优选地，通过与转录物阵列杂交构成了对转录状态的测定，在本小节将对它进行描述。在本小节的后面描述了转录状态测定的某些其它方法。

转录物阵列概述

在优选实施方案中，本发明使用了“转录物阵列”(在此也被称为“微阵列”(“microarrays”))。转录物阵列可被用于分析细胞中的转录状态，特别是用于测定暴露于分级水平的待研究药物或暴露于对所研究生物途径分级扰动的细胞转录状态。

在一个实施方案中，是通过使存在于细胞中，代表mRNA转录物的可测定标记的多核苷酸(例如从细胞总的mRNA合成的荧光标记的cDNA)与一个微阵列杂交来产生转录物阵列。微阵列是具有有序排列的结合(例如杂交)位点的表面，这些结合位点是对细胞或细菌基因组中许多基因，优选地是绝大多数或几乎全部基因产物的结合位点。可以通过多种方式形成微阵列，下面将描述其中的几种方法。但所产生的微阵列具有某些共同特征：这些阵列是可以再生的，有可能对给定的阵列产生多拷贝，并容易互相比较。优选地此微阵列较小，通常小于5cm²，它们由在结合(例如核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中某一给定的结合位点或独特的一组结合位点将特异性地结合细胞中的单一基因产物。虽然每个特定的mRNA可能存在一个以上物理结合位点(此后称位点)，但是为了叙述清楚，下面将假定存在单一位点。

应该理解到，当形成了与细胞RNA互补的cDNA，并在适当的杂交条件下与微阵列杂交时，对在相应于任何特定基因的阵列中位点的杂交水平，将反映细胞中从该基因转录的mRNA的优势。例如，当将与细胞总mRNA互补的可测定标记(例如以荧光团标记)的cDNA对微阵列杂交时，对应于不是在此细胞内转录的基因(即能够特异性结合该基因产物的)的阵列上的位点将具有少量信号或没有信号(例如荧光信号)，并且对于它所编码的mRNA具有优势的基因将具有比较强的信号。

在优选的实施方案中，是将来自二种不同细胞的cDNAs对此阵列的结合位点杂交。在药物应答的情况下，使一种细胞暴露于药物，而另一种相同类型的细胞不暴露于药。在途径应答的情况下，使一种细胞暴露于途径扰动，而另一种相同类型的细胞不暴露于途径扰动。在途径应答的情况下，使一种细胞暴露于途径扰动，而另一种相同类型的细胞不暴露于途径扰动。对来自这二种类型细胞每一种的cDNA作不同的标记，以致可以区分它们。在一个实施方案中，例如应用荧光素标记的dNTP合成了来自以药物处理的(或暴露于途径扰动的)细胞的cDNA，并且应用若丹明标记的dNTP合成了来自未作药物暴露的第二种细胞的cDNA。当将这二种cDNA混合，并对微阵列杂交时，可对阵列上每个位点测定来自每组cDNA信号的相对强度，并且可检测特定mRNA丰度的任何相对差异。

在上述的实例中，当荧光团被激发时，来自药物处理(或途径干扰)细胞的cDNA将发绿色荧光，而来自未处理细胞的cDNA将发红色荧光。结果，当药物处理对细胞中特定mRNA的相对丰度没有直接或间接的作用时，mRNA在二种细胞中都同样占优势，对于逆转录，红色标记的和绿色标记的cDNA也同样占优势。当对微阵列杂交时，对于各种RNA的结合位点将发出二种荧光团的波长特征(组合显示出棕色)。对比之下，当以一种直接或间接增加细胞中mRNA优势的药物处理药物暴露的细胞时，绿色荧光对红色荧光的比率将增加。当药物降低mRNA的优势时，此比率将降低。

对于使用二种颜色的荧光标记和检测以便确定基因表达改变的方案已有论述，例如Shena等1995，用互补性DNA微阵列定量监测基因表达的方式，科学270：467-470，此文献在所有场合下全部被引入作为参考。应用以二种不同荧光团标记cDNA的优点是，可以对二种细胞状态中对应于每种阵列基因的mRNA水平进行直接的和内部控制的比较，由于实验条件(如杂交条件)微小差异引起的改变将不会影响随后的分析。但是还应承认，也可能使用来自单一细胞的cDNA，并且比较例如在药物处理的或途径干扰的细胞和未处理的细胞中特定mRNA的绝对量。

微阵列的制备：

微阵列是本领域已知的由一种表面组成，序列上与基因产物(例如cDNAs，mRNAs，cRNAs，多肽和它们片段)相对应的探针可以在已知的位置特异性地对此表面杂交或结合于此表面。在一个实施方案中，此微阵列是一种阵列(即矩阵)，其中每个位置代表对于一种由基因编码产物(例如一种蛋白质或RNA)的一个分立的结合位点，并且对于该生物体基因组中绝大多数或几乎全部基因产物的结合位点都存在于其中。在优选的实施方案，该“结合位点”(此后称为“位点”)是一种核酸或核酸相似物，特定的同源cDNA可以特异性地对它们杂交。此结合位点的核酸或相似物可以是例如合成的寡聚体，全长度cDNA，比全长度稍短的cDNA，或基因片段。

虽然在优选的实施方案中，这种微阵列包含对于靶标生物体基因组中几乎全部基因产物的结合位点，但是这种全面的包含不是必需的。通常该微阵列具有相当于基因组中至少大约50％基因的结合位点，常常是至少约75％，较通常的是至少约85％，更通常的是大于约90％，而最通常的是最少约99％。优选地，此微阵列具有对于与所研究药物的作用相关的，或者在所研究生物途径中的基因的结合位点。“基因”被鉴定为优选地至少是50，75或90个氨基酸的一个开放读框(ORF)，在生物体(例如如果是单细胞生物体)或在多细胞生物体的某一细胞中信使RNA从此读框被转录。从由生物体表达的mRNA的数目，或者通过从良好特征化的基因组部分推断，可以估算出基因组中的基因数量。研究中的有机体的基因组被测序时，就可以确定ORFs的数目，并可通过分析其DNA序列对mRNA编码区进行鉴定。例如，已经对酿酒酵母基因组进行了完整地测序，并报告具有长度多于99个氨基酸的大约6275个开放读框(ORFs)。对这些ORFs的分析表明，有588个ORFs很可能是规定蛋白质产物的(Goffean等，1996，具有6000个基因的生命，科学274：546-567，此文献全部被引入作为参考)。对比之下，估计人基因组包含大约10⁵个基因。

制备用于微阵列的核酸：

如上面指出的，特定的同源cDNA与之特异性杂交的“结合位点”通常是附着于此结合部位的核酸或核酸相似物。在一个实施方案中，此微阵列的结合位点是对应于某生物体基因组中每个基因至少一部分的DNA多核苷酸。借助于例如聚合酶链反应(PCR)扩增来自基因组DNA，cDNA(例如借助于RT-PCR)，或克隆序列的基因区段可以获得这些DNAs。根据已知的基因或cDNA序列选择可导致独特片段(即不与微阵列上任何其它片段共有相同邻接序列的10个以上碱基的片段)扩增的PCR引物。计算机程序可用于设计具有所需特异性和最佳扩增特性的引物。参见例如Oligo版本5.0(国家生物科学)。在对应于非常长基因的结合位点的情况下，有时理想的是扩增靠近基因3’末端的区段，以致当使寡-dT触发的cDNA探针对微阵列杂交时，比全长度短的探针将能够有效地结合。微阵列上每个基因片段的长度典型地应在大约50bp与大约2000bp之间，更典型的是大约100bp-1000bp，而通常是大约300bp-800bp。PCR法是熟知的，已在例如如下文献中被论述：Innis等编辑，1990 PCR方案：方法及应用指南，Academic出版公司SanDiego.CA，被全部引入作为参考。显然，计算机控制的机器人系统对分离和扩增核酸是有用的。

产生用于微阵列核酸的另一种方法是通过应用N-膦酸或氨基磷酸化学过程人工合成多核苷酸或寡核苷酸(Froehler等，1996，核酸研究14：5399-5407；McBride等1983，四面体通讯24：245-248)。合成的序列长度约15-500个碱基，更典型的是约20-50个碱基。在某些实施方案中，合成的核酸包括非天然碱基，例如次黄嘌呤核苷。如上所述，可用核酸相似物作为杂交的结合位点。适合的核酸相似物的一个例子是肽核酸(参见例如Fgholm等1993，服从Watson-Crick氢键原则的PNA对互补寡核苷酸的杂交，自然365：566-568；还见美国专利No 5,539,083)。

在另一实施方案中，此结合(杂交)位点是由质粒或基因的噬菌体克隆(例如被表达的序列标志)，或者来自其的插入片段构成的(Nguyen等，1995，在鼠胸腺中通过阵列cDNA克隆的定量杂交检测的差示基因表达，基因组29：207-209)。在再一个实施方案中，结合位点的多核苷酸是RNA。

使核酸附着于固体表面：

将核酸或相似物附着于固体支持物，它可能是由玻璃，塑料(例如聚丙烯，尼龙)，聚丙烯酰胺，硝酸纤维素或其它材料。用于将核酸附着于一种表面的优选方法是印制在玻璃板上，如由Schena等在1995，用互补的DNA微阵列定量监测基因表达的式样，科学270：467-470中所概述的。这种方法特别适用于剥离cDNA微阵列。还参见Derisi等1996，用cDNA微阵列分析人癌中的基因表达式样，自然遗传学14：457-460；Shalon等，1996，应用二种颜色荧光探针的杂交分析复合DNA样品的DNA微阵列系统，基因组研究6：639-645；以及Schena等1995，人基因组平行分析法；基于微阵列的1000个基因的表达。美国国家科学院学报93：10539-11286。上述每篇文献均被全部引入作为参考。

用于制备微阵列的第二种优选方法是通过制备高密度的寡核苷酸阵列。技术是已知用于产生包含几千个互补于限定序列的寡核苷酸阵列的技术，在一种表面的限定位置，将光刻技术用于原位合成(参见Fodor等1991，光定向的可空间寻址的平行化学合成法，科学251：767-773；Pease等1994，用于快速DNA序列分析的光定向的寡核苷酸阵列，美国国家科学院学报91：5022-5026；Lochhart等1996，通过对高密度寡核苷酸阵列的杂交监测表达，天然生物技术14：1675；美国专利No.5,578,832，5,556,752，和5,510,270，每篇文献均全部引入人微言轻参考)，或者用于快速合成并沉积限定寡核苷酸的其它方法(Blanchard等1996，高密度的寡核苷酸阵列，生物传感器和生物电子学11：687-90)。当应用这些方法时，是直接在一种表面，如衍生化处理的载波电表面合成已知序列的寡核苷酸(例如20个基体)。通过所产生的阵列是冗余的，每个RNA可有几个寡核苷酸分子。可以选择寡核苷酸探针交替地检测拼接的mRNA。制备微阵列的另一种优选方法是应用喷墨印制法直接在一种固相表面合成寡核苷酸，如在如下专利中所描述的：共同未决的申请美国专利申请号09/008,120，1998，1，16由Blanchard提交，标题是“应用溶剂微滴的化学合成”，在此全部被引入作为参考。

还可以应用其它一些方法制备微阵列，例如通过掩盖法(Maskosand Sonthern，1992，核酸研究20：1679-1684)。主要是将任何形式的阵列，例如斑点印迹在尼龙杂交膜上(见Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989，全部被引入作为参考)，虽然也可以使用并且也得到本领域技术人员的认可，但是制备的阵列将非常小，因为杂交容量比较小。

产生标记探针：

制备总RNA和Poly(A)⁺RNA的方法是已知的，已被概述在Sambrook等，同上中。在一种实施方案中，应用硫氰酸胍盐裂解，随后通过CsCl离心(Chirgwin等1979，生物化学18：5294-5299)，从本发明研究的不同类型细胞中提取RNA。借助于以寡-dT纤维素的选择法(见Sambrood等，同上)选择出Poly(A)⁺腺苷酸RNA。所研究的细胞包括野生型细胞，药物暴露的野生型细胞，修饰的细胞和药物暴露的修饰细胞。

通过寡dT引物或随机引物逆转录从mRNA制备标记的cDNA，这二种方法都是本领域熟知的(见例如Klug和Berger 1987，酶学方法，152：316-325)。可在有偶联于可检测标记的dNTP存在时进行逆转录，最优选的是用荧光标记的dNTP。按另一种方法，可以通过在有标记的dNTPs存在时体外转录双链cDNA将分离出的mRNA转变成所合成的标记反义RNA(Lockhart等1996，通过对高密度寡核苷酸阵列杂交监测表达，天然生物技术14：1675，被全部引入作为参考)。在另一些实施方案中，可以在没有可检测标记存在时合成cDNA或RNA探针，并随后进行标记，例如通过掺入生物素化的dNTP，或rNTP，或者某些类似的方法(例如生物素与RNAs的光交连的psoralen衍生物)，随后加入标记的链亲和素(例如藻红素偶联的链亲和素)或等效果的物质。

当使用荧光探记探针时，许多适合的荧光团是已知的，包括荧光素，丽丝胺，藻红素，若丹明(Perkin Elmer cetns)，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7，Flnorx(Amershem)和其它一些(见例如Kricka，1992，非同位素DNA探针技术，Academic出版，San Diego.CA)。选择具有不同发射光谱的几对荧光团，以致可以方便地区分它们将有更高的价值。

在另一个实施方案中，使用了不同于荧光的标记。例如，可以使用放射活性标记，或一对具有不发射光谱的放射活性标记(见Zhao等，1995，高密度cDNA滤器分析法：用于大批量，定量分析基因表达的新颖方法，基因156：207；Pietu等1996，由高密度cDNA阵列定量杂交揭示的人肌肉内优选表达的新型基因转录，基因组研究，6：492)。但是，因为放射活性微粒的分数，并随之需要宽大空间的结合位点，所以使用放射性同位素是不大优选的实施方案。

在一个实施方案中，是通过在42℃将一个混合物与逆转录酶(例如Super Seript^TMII，LTI公司)共温育60分钟来合成标记的CDNA，此混合物包含0.5mM dGTP，dATP和dCTP加0.1mM dTTP加荧光脱氧核糖核苷酸(例如0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))。

对微阵列杂交：

选择核酸杂交和漂洗的条件，以致探针能够特异性地结合于或者特异性地杂交于特定的阵列位点，也就是说，探针能够杂交、双螺旋化或结合于具有互补核酸序列的阵列序列位点，但是不杂交于具有非互补核酸序列的位点。如在此所使用的，如果当此较短的多核苷酸是小于或等于25个碱基，应用标准的碱基配对原则而没有错配，或者如果此较短的多核苷酸是大于25个碱基，面存在的错配不大于5％，则认为一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列是互补的。优选地此多核苷酸是完美地互补(没有错配)。通过进行一个包括阴性对照的杂交试验可容易地证明，特异性的杂交条件可导致特异性的杂交(见例如Shalon等，同上，和Chee等，同上)。

最佳的杂交条件取决于标记探针以及固定化多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如寡聚体对多核苷酸大于200个碱基)和类型(例如RNA，DNA，PNA)。对于核酸特异性(即严格的)杂交条件的一般参数被描述在如下文献中：Sambrook等，同上，以及Ausabel等1987，分子生物学现代方法，Green Publishing和Wiley-Interseience，纽约，被全部引入作为参考。当使用Schena等的cDNA微阵列，典型的杂交条件是在5×SSC加0.2％ SDS中65℃杂交4小时，随后在低严格漂洗缓冲液(1×SSC加0.2％ SDS)中25℃漂洗，随之在高严格漂洗缓冲液(0.1×SSC加0.2％ SDS)中25℃漂洗10分钟(Shena等1996美国国家科学院学报93：10 614)。例如在如下文献中也提供了有用的杂交条件：Tijessen 1993与核酸探针杂交Elsevier科学出版社，B.V，以及Kricka，1992，非同位素DNA探针技术，Academic出版，San Diego.CA。

信号检测和数据分析：

当使用荧光标记探针时，优选地可借助于扫描共焦激光显微镜检测每个转录阵列位点的荧光发射。在一个实施方案中，应用适当的激发线路对所使用的二种荧光团的每一种实施了单独的扫描。按另一种方法，可以使用的激光是，它有可能在对二种荧光团特异的波长进行同时试样显示，并且可以同时分析来自二种荧光团的发射(见Shalon等1996，一种应用二色荧光探针杂交，用于分析复合DNA样品的DNA微阵列系统，基因组研究6：639-645，全部被引入作为参考)。在优选的实施方案中，是用具有计算机控制的X-Y级和显微镜物镜的激光荧光扫描器扫描此阵列。以复线路混合气体激光可达到连续激发二种荧光团的目的，借助于波长可使发射光分开，并用二个光电倍增管检测。在Schena等1996，基因组研究6：639-645和在此引用的其它一些文献中描述了荧光激光扫描装置。另外，Ferguson等1996，自然生物技术14：1681-1684描述的光纤维束也可用于同时监测在大量位点的mRNA丰度水平。

在优选的实施方案中，借助于计算机，例如应用对数字板的12位模拟量，记录信号并进行分析。在一个实施方案中，先应用绘图程序(例如Itijaak Graphics Suite)使扫描图像去点缀，然后应用图像网格化程序进行分析，对每个位点在每个波长形成一个平均杂交作用的电子数据表。如果必要，可以通过实验确定二种荧光频道之间对“串话干扰”(或重叠)的相关性。对于转录阵列上任何一个特写的杂交位点，可以计算出二种荧光团发射的比率。此比率与同源基因的绝对表达水平无关，但是可用于其表达明显地受给药，基因缺失或任何其它试验过程调制的基因。

根据本发明的方法，对二种细胞或细胞系mRNA的相对丰度被计分表示为所确定的扰动和它的大小(即对于被测试的二种来源的mRNA其丰度是不同的)，或者表示为没有受干扰(即相对丰度相同)。如在此使用的，在二种来源的RNA之间至少有大约25％的差异(从一种来源的RNA比另一种来源的RNA丰度多25％)被记分为扰动，而比较通常是大约50％，甚至常常多大约2倍(2倍的丰度差异)，3倍(3倍的丰度差异)，或5倍(5倍的丰度差异)。目前的检测方法能够可靠地检测大约3倍-5倍数量级的差异，但是预期将发展更灵敏的方法。

优选地除了鉴定扰动是阳性或阴性之外，最好还能确定扰动的大小。如上所述，通过计算用于不同标记的二种荧光团的发射比率，或者通过本领域技术人员显而易见的类似方法可以实现此目的。

对途径应答的测定：

在本发明的一个实施方案中，通过将各对应(即互补)于所研究的不同细胞mRNA的二种不同标记探针的混合物对微阵列杂交，形成了可反映所研究细胞转录状态的转录阵列。根据本发明，这二种细胞是相同类型的，即相同的种或株，但是少数基因座(例如一个，二个，三个或五个，优选地是一个)可能在遗传上有差别。另一种情况是，它们是同源的，而它们的环境历史不同(例如暴露于药物与没有暴露比较)。

为了测定途径应答，可在对所研究的途径存在分级扰动时制备或培养细胞。暴露于扰动的细胞和未暴露于扰动的细胞被用于构建转录阵列，测定此阵列，以便发现由于暴露于药物具有表达改变的mRNA及改变的程度。因此，得到了途径应答。

分级药物暴露和分级扰动控制参数水平的密度受单个基因应答的鲜明度和结构控制-应答的一部分越急剧、最急剧时，为了适当地分辨此应答需要越浓密的水平。通过图3的实例大致地指示了此示范性密度。在此，对氨甲喋呤100倍浓度范围的6种暴露正好是以分辨基因表达应答。但是，对这种途径更精细的应答有更多的暴露是优选的。

进而，为了减少实验误差，在二种颜色的差异性杂交实验中交换荧光标记是优选的，这样可以减少为单个基因或阵列点位置所特有的偏差。换句话说，优选地是，首先测定来自二种被测定细胞中具有一种标记的mRNA基因表达(例如以第一种荧光染料标记受干扰的细胞，以第二种荧光染料标记未受干扰的细胞)，然后测定来自具有相反标记细胞的基因表达(例如以第二种荧光涂料标记的受干扰细胞，以第一种荧光染料标记的未受干扰的细胞)。在暴露水平和扰动控制参数水平内进行多次测定，可提供附加的实验误差控制。当在应答函数中选择用于在均衡误差和丧失结构之间插入应答数据的仿样函数S宽度时，以适当的取样可能形成一个折衷选择。在药物暴露和扰动控制参数间隔内作大约10次测定，以相反的荧光标记重复一遍，二者合起来，每个药物应答或扰动应答需要大约20次杂交实验，这样可对途径以及它们的成员基因和蛋白质得到可靠的鉴定。

对药物应答数据的测定：

为了测定药物应答数据，将细胞暴露于分级浓度的所研究的药物或候选药物。当在体外培养细胞时，通常是将此化合物加到它们的营养培养基中，对于酵母菌，优选地是在对数生长早期收获酵母细胞，因为表达式样对那里的收获时间相对不敏感。以分级的含量加入药物，取决于药物的特征，但通常是大约1ng/ml-100ng/ml。在某些情况下是将药物溶解于溶剂中，如DMSO。

将暴露于药物的细胞和不暴露于药物的细胞用于构成转录阵列，对它们进行测定，以便发现由于暴露于药物具有改变表达的mRNA。从而获得药物应答。

类似于对途径应答的测定，在二色差异性杂交的情况下，也以相反的标记进行测定，对于药物应答也是优选的。同样优选的是，所用的药物暴露水平对药物应答的快速改变区提供了足够的分辨能力(例如通过应用大约10个药物暴露水平)。

转录状态测定的其它方法：

还可借助于本领域已知的其它基因表达技术测定细胞的转录状态。这样的几种技术可产生被限定复杂性的限制性片段混合物，用于电泳分析，例如，双限制性酶消化与定相引物结合的方法(见例如欧洲专利0 534858 A1，1992年9月24日由Zabean等提交的)，或者选择具有最靠近所确定mRNA末端位点的限制性片段的方法(见例如Prashar等1996，美国国家科学院学报93：659-663)。另一些方法是对cDNA混合物进行统计学取样，例如通过对每个多cDNA测序足够的碱基(例如20-50个碱基)，以便鉴定每个cDNA，或者通过测序在相对于所确定mRNA未端已知位置产生的短标志(例如9-10个碱基)(见例如，Velculescu，1995，科学270：484-487)。

5.5.2对生物状态其它方面的测定

在本发明不同的实施方案中，为了得到药物应答和途径应答，可以测定除了转录状态以外的另一些生物状态，例如翻译状态，活性状态，或混合的形式。在此节将描述这些实施方案的细节。

基于翻译状态测定的实施方案：

可以按照几种方法实施对翻译状态的测定。例如，通过构建一个微阵列可实施蛋白质的全基因组监测(即，“Proteome”，Goffeau等，同上)，此微阵列中其结合位点包含对该细胞基因组编码的多种蛋白质特异性的固定化抗体，优选的是单克隆抗体。优选地，存在的抗体是针对所编码蛋白质的基本组分，或者至少是针对与所研究的药物作用相关的那些蛋白质。制备单克隆抗体的方法是熟知的(见例如Harlow和Lane，1988，抗体：实验室手册，冷泉港，纽约，全部被引入作为参考)。在优选的实施方案中，是针对根据该细胞基因组序列设计的合成肽片段产生单克隆抗体。以这样一种抗体阵列，使来自该细胞的蛋白质与此阵列接触。

按另一种方法，可借助于双向凝胶电泳系统使蛋白质分离。双向凝胶电泳是本领域熟知的，典型地包括沿着第一向的等电聚焦，随之沿着第二向的SDS-PAGE电泳。见例如Hames等1990，蛋白质凝胶电泳：实践入门，IRL出版，纽约，Shevchenko等1996，美国国家科学院学报93：1440-1445；Sagliocco等1996，酵母菌12：1519-1533；Lander，1996，科学274：536-539。所形成的电泳图谱可借助于多种技术进行分析，包括质谱技术，应用多克隆抗体和单克隆抗体的蛋白质印迹分析和免疫印迹分析，以及内部和N-端微测序。应用这些技术，有可能鉴定在给定生理状态下产生的所有蛋白质的基本组分，包括暴露于药物的细胞中(例如酵母菌中)，或者由例如特定基因缺失或过度表达所改变的细胞中的生理状态。

基于生物状态其它方面的实施方案：

虽然监测除mRNA丰度以外的细胞成分目前还存在某些在监测mRNAs中未遇到的技术困难，但是，本领域的技术人员都明了，本发明方法的用途，包括途径扰动不同的已知方法的应用，也适用于可被监测的任何一种细胞成分。

特别是，在与药物作用特征有关的蛋白质活性可以被测定的情况下，本发明的一些实施方案可以基于这些测定。通过适合于被特征化的特定活性的任何功能性的，生物化学的，或物理的手段，可以实现这些活性测定。在此活性包括化学转变的情况下，可以使此细胞蛋白质与天然底物接触，并测定这种转变速度。在此活性包括多聚体单位中的缔合时，例如激活的DNA结合复合体与DNA的缔合，可以测定缔合蛋白质的含量或此缔合作用的继发性结果，如被转录的mRNA含量。还有，在已知唯一的功能活性时，例如在细胞周期控制中，可以观测这种功能的表现。然而蛋白质活性中的这些已知的和被测定的改变可构成借助于本发明前述方法分析的应答数据。

在另一个非限制性实施方案中，应答数据可由细胞生物状态的混合形式构成。例如生物应答数据可以由某些mRNA丰度的改变，某些蛋白质丰度的改变，以及某些蛋白质活性的改变构成。

5.6对药物发现的应用

本发明在药物发现领域具有多种用途，在这里将提供一些用途。在一种应用中，本发明提供了一种方法，用于确定其推定的作用途径已经被鉴别确定的候选药物作用的其它生物途径。如前面指出的，药物开发常常包括试验许多化合物对已知生物途径的特殊作用，例如起源于一克隆的基因序列或者分离的盐或蛋白质的途径。在此方法中，虽然鉴定了明显影响此假定途径的候选药物，但是只得到了很少或没有得到关于该药物作用特异性(例如受影响的其它生物途径是什么)的信息，或者关于该药物对受影响途径的特定作用的信息。本发明的方法可提供这种信息。

例如，倘若有一个似乎影响某假定生物途径的候选药物，可以应用本发明的方法证实此假定途径确实是药物作用的途径，以及用于开发对此假定途径更特异性的(即，更途径特异性的)药物(例如理想的药物)，此药物几乎不影响除了所希望的假定途径以外的生物途径。通过直接采用在5.2节概述的，在5.3节具体描述的方法(特别是参照图5)可以达到此应用目的。因此，一方面通过如下步骤可达到此目的：(i)对于所研究的药物或候选药物测定药物应答数据；(ii)对于药物作用的假定生物途径测定扰动应答(例如，如果此生物途径起源于基因，那么可以按分级的方式控制此基因的表达)；(iii)尽可能最佳地将假定的药物作用途径的途径应答数据表示为药物应答数据；以及(iv)评估这种表示法的显著性，以便确定是否已充分地表现了药物的显著作用，并证实此假定的途径确实是此药物作用的途径。

如在上面关于步骤507中所详述的，如果使细胞暴露于药物同时暴露于对假定途径的扰动可导致对此途径细胞成分应答的干扰作用，那么表示此途径确实是该药物作用的途径。换句话说，可评估这种组合应答以便确定与图7B中显示的相比较是否它更象图7A中显示的。另一方面，如果这种组合暴露的作用主要是附加性的(如在图7B显示的)，那么表明此假定的途径不是药物作用的途径，如果发现通过途径应答数据对药物应答数据的最佳表示法是高度显著性的，例如具有95％的显著性阈限，那么表明此候选药物对假定的生物途径是高度特异性的(对其它的生物途径，如起源于其它基因或基因产物，或者基因产物活性的生物途径很少或没有直接的作用)。另一方面，如果发现这种表示法没有足够的显著性，那么表明其它的生物途径受到了所研究药物或候选药物的影响。

在细胞中的其它生物途径受到影响的后一种情况下，可对候选药物的结构进行修饰(例如应用制药学或药物化学领域熟知的有机合成法)，或者可以对密切相关的化合物进行鉴定，等，并按照本发明进行试验，直到鉴定出对于假定的途径更具途径特异性的(即几乎不影响除假定途径以外的途径)药物(或者甚至是只影响假定途径的理想药物)。

在另一种应用中，可应用本发明的方法，通过对一批化合物的所有的细胞生物途径进行鉴定，从一组候选的化合物中挑选出具有最高途径特异性的一个或几个药物。通常，具有最高途径特异性的药物将是只直接影响其预期途径的药物。当不知道预期的途径时，那么与影响较多途径的药物相比较，影响最少途径的药物就很可能是更具途径特异性的，而是优选的候选药物。具有高特异性(即高途径特异性)的药物是所希望的药物，因为这种药物在对病人给药时将很可能具有较少的副作用。

在进一步的应用中，对于一种对细胞(或对病人)具有已知生物作用，但不知道其作用机制或途径的药物，可以应用本发明鉴定它的作用途径。通过鉴定具有理想治疗活性的药物作用途径，有可能鉴定具有类似治疗活性的化合物。在这种应用中，使药物应答数据与很可能受此药物影响的一组途径拟合，或者与从途径一览表中简单地抽出的途径拟合，并确定最佳拟合药物应答的途径组合。相反地，可以用本发明的方法鉴定影响细胞中以前确定的特定生物途径的，或者影响特定途径组合的化合物。在这种应用中，需确定药物应答数据对途径应答数据(或途径应答数据的组合)最佳拟合的显著性，以便观察它是否符合一定的显著性阈限。

在还有另一种应用中，该方法用于鉴定“第二级药物座位”。第二级药物座位是间接受给药影响的任何类型的细胞成分(如基因或基因产物或者基因产物的活性)。是根据如下事实对它们进行鉴定，它们相当于对途径应答数据具有正或负扰动的细胞成分，但是不直接受药物的影响。例如，第二级药物座位包括起源于直接受影响药物靶标的生物途径中的细胞成分(排除直接受影响的起源性靶标细胞成分)。鉴定第二药物座位对药物设计是有用的。如上面所述，细胞的适应性机制通常可确保一种细胞成分的改变(例如基因或基因产生，或者基因产物的活性改变)，将通过其它细胞成分的表达和/或活性改变受到补偿。

承认这种代偿性改变提供了一种药物介入的新方法，如下所述：通常认为疾病是由于起源该途径的细胞成分(如宿主或病源体的基因)的异常表达引起此生物途径异常激活的结果。传统的药物介入方法寻求通过在此主要的起源性细胞成分起作用来调整异常的途径活性。但是，本方法鉴定作为细胞成分的第二级药物座位，如基因或基因产物，当某一途径直接受影响时，药物间接地影响第二级药物座位(例如通过作为受影响生物途径的一部分)。应用这种信息，有可能发现影响第二级细胞成分的药物，提供治疗疾病的另一种方法(以及更大的一批潜在性药物作用途径)。

例如，如果疾病状态中细胞成分X被表达不足，那么传统的治疗目标是恢复X的表达，并且可能会认同通过直接影响X表达实现此结果的药物。但是，本发明的方法使有可能鉴定具有X作为第二级药物座位的其它细胞成分，正是这些其它的细胞成分起源了包括X的途径，它们也受到药物作用的影响。成分X的正确表达从而将由药物对这些途径的作用引起。因此，可以鉴定如果被抑制或激活将产生所需治疗效果的第二级途径(例如起源于蛋白质或蛋白质活性的途径)，并且可以鉴定不同于通过直接作用于X，而是影响这些其它的途径以便达到所需治疗效果(例如恢复对X的表达)的药物。

在另外的一些应用中，本发明可被用于通过将所研究的药物与具有相似治疗作用的其它药物相比较，鉴定介导所研究药物治疗作用或副作用的生物途径，如果二种药物对病人或动物疾病模型的相同疾病或障碍表现出类似的治疗效果，则可认为它们二者具有类似的治疗作用。常常发现已知具有相似或密切相关治疗效果的药物对相同的生物途径起作用。因此，可以将本发明的方法用于确定受所研究药物影响的，并且也受具有类似治疗作用的第二种药物影响的途径。对二种药物共同的途径是很可能介导所研究药物(并且也是第二种药物的)治疗作用的那些途径。通过比较对具有类似治疗作用的补充药物确定的共同途径，可以进一步限定或发现介导所研究药物治疗作用的途径。

类似地，通过本发明的方法可以确定受药物影响的，介导副作用的途径。按照本发明，可以确定受所研究药物影响的，和受具有类似治疗作用的第二药物影响的途径。还不是第二药物途径的所研究药物的途径，很可能是介导所研究药物副作用的途径。通过比较对具有类似治疗作用的补充药物确定的共同途径，可以更肯定地鉴定介导所研究药物副作用的途径。任选地，通过下一步应用前述的步骤，改进所研究药物的特异性以便删除介导作用的途径，可以鉴定出更具途径特异性的所研究药物的衍生物。

当用于本发明方法的细胞是非人类的真核生物细胞，例如酵母细胞时，常常可能根据药物对非人类细胞的作用推测对人细胞的作用。这部分地是由于如下事实，在绝大多数真核生物中大部分基因都具有相似功能的同源物。如上面所指出的，在人类遗传性疾病人，被鉴定为有缺损的几乎半数蛋白质显示出与酵母菌蛋白质的氨基酸相似性。还有报导，已知引起人类疾病的所有基因的大约80％在新杆秀丽线虫中具有同源物(“讨论用于功能基因分析技术的专家推测”，基因工程新闻：16、1996，11，15)。

还有另一些应用，是可以将本发明的方法用于确定不同药物作用的相似性。这种应用适合于特殊情况，其中被定标拟合药物应答数据的途径数目等于单数，即等于1。因此，在特定的实施方案中，R表示在此被称为药物R的“扰动”药物的应答，将此应答与由在此被称为药物D产生的应答D相比较。从等式8和9得到的相关系数，或者按另一种方式，从等式6得到的最小二乘方残数提供了此二个药物作用相似性的定量测定。

由于如下原因，比较药物应答的本方法显著优于根据单浓度测定的相关方法。研究的二个药物，药物D和R可能具有相同的作用途径，但是具有不同的效力。在一个浓度的测定因此只能在一个滴定水平取样试验药物应答曲线，如在图2A中显示的曲线。一般地说，对应于药物D给定浓度的滴定水平将不同于对应于药物R相同浓度的滴定水平。例如，对药物D的测定可能相当于图2A中的滴定水平1，而对药物R的测定可能相当于滴定水平4。因此对于药物D仅观察到基因G1和G2的改变，面对于药物R将观察到所有基因G1-G6的改变。结果是，药物D和R应答的相似性将不像下述情况那样很明显：如果对于药物D和药物R都从0浓度至饱和取样试验整个应答曲线，并且借助于如上面5.3.1节所述的定标转换发现了最佳相关性。

这种对药物相似性的优越测定法可能作为一种基础，例如用于将新化合物归类于由现存化合物所确定的种类中，包括基于这种分类识别可能的治疗作用或毒性作用。这种对药物相似性的优越测定法还可能作为基础用于对新的或现有的化合物进行分类，以便减少冗长的化合物文库或列表，或者支持对如下问题作出决定：筛选什么化合物，或者对于特定化合物将选取其它什么作用。

6实施例

作为对上面所述发明的说明而不是对前面所述内容的限制，将提供如下通过已知特定作用药物的途径扰动实施例。在此实施例中，通过将细胞分级暴露于环孢菌素A(“CyA”)和氨甲喋呤(“Mtx”)限定了途径，并且确定了“未知”药物，在此是FK506的作用途径。

作为背景材料，CyA的作用是直接抑制钙神经素，可以被用于限定起源于钙神经素的途径。Mtx的作用是直接抑制DHFR(二氢叶酸还原酶)蛋白，也可以被用于限定起源于这种蛋白质的途径。FK506也是钙神经素蛋白的特异性调节剂，它通过一个具有FK506结合蛋白的复合物对此蛋白质起作用(Cardenas等，1994，作为模拟T细胞的酵母菌，药物发现和设计的前景2：103-126)。

按如下详述实施了在图8A-C中显示的基因表达测定。为了制作环孢菌素剂量应答曲线，将酿酒酵母R506株(基因型：Mat a ura3-52 lys 2-801 ade 2-101 trp 1-Δ63 his 3-Δ200 leu 2-Δ1 his3∷HIS3)培养过夜的起始培养物以YAPD加10mM CaCl₂的培养基稀释至200ml(见例如，Ausubel等编著，1996，分子生物学现代方法，John Wiley & Sons公司，特别是第13章)，形成DO₆₀₀为0.1并在30℃以300rpm速度振摇培养。30分钟之后对培养物加入溶于乙醇的环孢菌素A，达到60，30，15，6和3μg/ml的最终浓度。对照培养物以正好相同体积的乙醇处理。通过OD₆₀₀监测细胞培养，在OD₆₀₀＝1.4±0.1时收获细胞，借助于在Sorvall Rc5C+离心机SLA-1500转子中室温下离心2分钟。弃去上清液，并吸去残留的液体，将细胞再悬浮于4ml RNA提取缓冲液(0.2M Tris HClpH7.6，0.5M NaCl，10mM EDTA，1％ SDS)中。放置搅拌3秒钟使细胞沉淀再悬浮，然后立即转移至其中加有2.5g烘干玻璃微珠(425-600μm)和4ml苯酚∶氯仿(50∶50 v/v)的50ml圆锥形离心管中。先将此离心管在VWR多管涡旋器中，设定8档搅拌2分钟，然后在Sorvall T600D型台式离心机中，3000rpm室温下离心5分钟进行相分离。以等体积苯酚∶氯仿(50∶50 v/v)。通过设定6档搅拌30种，随后同上离心，对水相作再提取。对水相加入2.5倍体积乙醇，并将此样品贮存于-80℃等待分离polyA⁺mRNA。

为了制作FK506剂量应答曲线，再仿效上述程序，不同的是溶解于乙醇中的FK506被加到培养物中，最后的浓度是10，3.1，1.0，0.31，0.10μg/ml。

为了制作氨甲喋呤剂量应答曲线，将酿酒酵母By 4741株(基因型：Mat a his3ΔO len2DO ura3Δ0 met15Δ0)培养过夜的起始培养物以SC培养基稀释至200ml(见例如Ausubel等，第13章)，形成OD₆₀₀为0.1，并在30℃以300rpm速度振摇培养。30分钟之后，对培养物加入溶于水中的氨甲喋呤，达到最后浓度200，100，50，25，6.2和3.1μM。对照培养物以相同体积的水处理。其余的步骤同上。

对于所有的上述情况，都是借助于标准的方案(见例如Sambrook等1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版)通过寡-dT纤维素层析法应用两次选择分离出poly A⁺RNA。如前面5.5.1节中所述的，将2μg poly A⁺RNA用于逆转录反应。也如前面5.5.1节中所述的将cDNA纯化，并对聚赖氨酸玻片杂交。通过使用AppliedPrecision公司生产的标准型多框架CCD摄像机滑动装置扫描确定杂交的程序。对图象进行信息学处理，并输入至Inpharma数据库中，应用Mat Lab数据分析包进行分析。

图8C显示通过一系列FK506暴露得到的药物应答数据。此图的横座标是药物暴露数值，纵座标是受FK506影响的大多数基因表达率的对数值。图8A显示对于起源于钙神经素的途径，由一系列CyA暴露得到的途径应答数据。此图和图8B具有途径扰动控制参数值，在此情况下它是横座标上的药物暴露水平，在纵座标上具有受这些药物影响的大多数基因表达率的对数值。图8B显示对于起源于DHFR(二氢叶酸还原酶)蛋白的途径，由一系列Mtx暴露得到的途径应答数据。

以所测定的由分级暴露于CyA或Mtx(分别暴露)引起的途径应答的线性总和模拟了“未知”药物FK506，形成了包括起源于钙神经素和起源于DHFR的最少途径的组合应答。图8D显示相关系数曲线，通过以FK506应答与CyA和氨甲喋呤组合途径应答的全基因组相关性对用于FK506数据的定标参数的不同值作图得到此曲线。按照5.3.1节描述的方法，特别是根据等式8和9得到了此相关系数。回收到大约是63的FK506和Cyc A近似相对效力，如图8D中显示的相关性峰值位置。

表I列出了FK506和CyC A应答共同的一批基因。这些基因被鉴定为具有在药物和途径应答曲线之间的相关系数的基因，对于这种基因至少0.9位于定标参数(63)的值，给出最大的全基因组相关性。按照等式9将这些相关系数计算为ρ_k(63)，在此下标‘k’对应于一个特定基因。无论Mtx途径应答是否被加到求最小值的过程中，这些相关的基因都是相同的，表明在组合应答中鉴定一种途径的能力。

              表1

暴露于氨甲喋呤	不暴露于氨甲喋呤
		gyp7	gyp7
YJL171C	YJL171C
		CMK2	CMK2
YRO2	YRO2
		RIM101	RIM101
YKL218C	YKL218C
		YLR414C	YLR414C
YDR425W	YDR425W
		YNL195C	YNL195C
YOR385W	YOR385W
		YOR220W	YOR220W
HAC1	HAC1
		YLR121C	YLR121C
hxk1	hxk1
		YHR097C	YHR097C
SUR1	SUR1
		CWP1	CWP1
YBR005W	YBR005W
		yap3	yap3
YMR316W	YMR316W
		YBR004C	YBR004C

此实施例表明本发明方法的有效性，其中可容易地鉴定了定标参数的最大值和恒定的一批被鉴定的基因。

在此实验中，对于数值分析线性地加入了Cyc A和氨甲喋呤应答(如前面所述)，在同时暴露于二个药物的真实情况下，可能需要对此模式药物应答加入非线性项。

7.被引用的参考文献

在此引用的所有参考文献均以其完整形式全部同样程度地被引入作为参考，如同每单一刊物或专利或者专利申请被特别地和单独指出将以其完整形式全部被引入作为参考。

按照本发明的构思和范围可以作出本发明的许多修改和变化的形式，这对于本领域的技术人员是显而易见的。在此所述的特定实施方案仅作为实例被提供，并且，本发明将仅仅通过所附的权利要求加以限制，除此之外还有这些权利要求的等效形式的全部范围。

Claims (50)

1.一种鉴定参与一种细胞类型中药物作用的生物途径的方法，包括：

(a)提供该药物在此细胞类型中的药物应答，该药物应答已通过包括在对该药物的多种暴露水平下测定此细胞类型中多种细胞成分的方法获得；

(b)将一种模式药物应答表示为该细胞类型中一种或几种生物途径应答的组合，其中该细胞类型中的生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定所述细胞类型细胞中生物途径的细胞成分，并且其中该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；以及

(c)确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，它可使所提供的药物应答与所述模式药物应答之间差异的目标函数值最小化，

其中该一种或几种生物途径应答的组合，在最佳定标转换条件下可鉴定参与该细胞类型中此药物作用的生物途径。

2.权利要求1的方法，其中的确定步骤(c)进一步包括确定该目标函数的真实最小化值，该目标函数的真实最小化值是从所提供的药物应答和该模式药物应答确定的目标函数的最小化值，并且其中所述的方法进一步包括在步骤(c)之后，通过一种方法检验此一种或几种生物途径的所述最佳定标转换的统计学显著性的步骤，此方法包括：

(d)获得该目标函数最小化值的预期概率分布，以及

(e)依据该目标函数真实最小值的预期概率分布，评价该目标函数其实最小化值统计学显著性。

3.一种鉴定参与一种细胞类型中药物作用的生物途径的方法，该方法包括确定一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，它可使所提供的药物与应答与模式药物应答之间差异的目标函数值最小化，其中：

(a)所述一种或几种生物途径是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定该细胞类型细胞中一种或几种生物途径的细胞成分；

(b)通过一种方法提供这种所提供的药物应答，此方法包括在对该药物的多种暴露水平测定该细胞类型细胞中的多种细胞成分；以及

(c)将所述模式药物应答表示为该一种或几种生物途径应答的组合，该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换，

其中该一种或几种生物途径应答的组合，在最佳定标转换条件下可鉴定参与该细胞类型中此药物作用的生物途径。

4.权利要求2的方法，其中获得所述目标函数最小值预期概率分布的步骤包括：

(i)通过相对于对所述一种或几种生物途径的所述多种扰动水平随机化一种或几种生物途径应答，而相对于所述多种药物暴露水平随机化药物应答，并随机化所述模式药物应答；

(ii)通过寻找到该一种或几种随机化的生物途径应答的最佳定标转换，确定该目标函数的理论最小值，此最佳定标转换可使所述随机化的药物应答与随机化的模式药物应答之间差异的目标函数最小化；以及

(iii)重复步骤(i)和(ii)，以便确定多个理论最小值，此多个最小值形成所述最小化值的预期概率分布。

5.权利要求1或3的方法，进一步包括通过一种方法验证所述一种或几种生物途径确实是参与在该细胞类型中药物作用的生物途径的步骤，此方法包括从第一模式应答和第二模式应答中选择一种行为与组合的药物-扰动应答最相似的模式应答，其中：

(i)通过一种方法提供所述组合的药物-扰动应答，此方法包括测定同时暴露于一种或几种该药物的暴露水平和一种或几种所述一种或几种生物途径扰动水平的该细胞类型细胞中的多种细胞成分；

(ii)该第一模式应答包括在最佳定标转换下所述一种或几种生物途径应答的组合，此最佳定标转换是按一个或几个第一总数估算的，每个第一总数是最佳定标转换下一个或几个药物暴露水平中的一个，与一个或几个对该生物途径扰动水平中一个的总和，

(iii)该第二模式应答包括一个或几个第二总数，每个第二总数在按一个或几个对该生物途径扰动水平中的一个估算的最佳定标转换条件下，是按一个或几个药物暴露水平中一个估算的药物应答与该一个或几个生物途径应答组合的总和，

其中如果选择第一模式应答，则可验证所述一个或几个生物途径为确实参与该细胞类型中药物作用的生物途径。

6.权利要求1或3的方法，进一步包括将存在于药物应答中的细胞成分指定属于所述一种或几种生物途径中一种的步骤，其中该细胞成分的生物途径应答在其最佳定标的条件下具有与该细胞成分的药物应答最大的相关性。

7.权利要求1或3的方法，其中所述定标转换包括将所述的药物暴露水平转换成对所述生物途径相应的扰动水平。

8.权利要求7的方法，其中的转换是通过线性作图完成的。

9.权利要求1或3的方法，其中是通过选择对所述定标转换最佳的一组参数将所述目标函数最小化。

10.权利要求1或3的方法，其中所述目标函数包含在对该药物暴露水平的药物应答与在该药物暴露水平的模式药物应答差的平方和，并进一步须经所述定标转换。

11.权利要求1或3的方法，其中的目标函数包含该药物应答和模式药物应答相关数的负值。

12.权利要求1或3的方法，其中是在对所述生物途径的扰动水平，通过包括插入所测定值的方法提供所述生物途径应答。

13.权利要求12的方法，在此所述的插入包括通过仿样函数和的近似法。

14.权利要求12的方法，在此所述的插入包括通过Hill函数的近似法。

15.权利要求1或3的方法，其中该细胞类型中的一种或几种生物途径被选择作为很可能参与该细胞类型中药物作用的生物途径。

16.权利要求1或3的方法，其中的一种或几种生物途径是选自该细胞类型存在的生物途径一览表。

17.权利要求1或3的方法，其中所述的细胞类型是基本上与酿酒酵母等基因的细胞类型。

18.权利要求1或3的方法，其中所述细胞成分包括存在于该细胞类型中的多种RNA的丰度。

19.权利要求18的方法，其中是通过一种方法测定该多种RNA的丰度，此方法包括使一个基因转录阵列与来自该细胞类型细胞的RNA，或者与由其得到的cDNA接触，其中的基因转录阵列包括一个具有所附着核酸或核酸相似物的表面，该核酸或核酸相似物能够与所述多种RNA，或者与由其得到的cDNA杂交。

20.权利要求19的方法，其中是通过一种方法实施步骤(a)中对细胞成分的测定，此方法包括使一种或几种基因转录阵列(i)与RNA，或者与由其得到的cDNA接触，此RNA是来自被暴露于该药物的所述细胞类型的细胞，以及(ii)与RNA，或者与由其得到的cDNA接触，而此RNA是来自未被暴露于该药物的所述细胞类型的细胞，并且

其中是通过一种方法实施步骤(b)中对细胞成分的测定，此方法包括使一种或几种基因转录阵列(i)与RNA，或者与由其得到的cDNA接触，此RNA是来自被暴露于对所述一种或几种生物途径扰动的该细胞类型的细胞，以及(ii)与RNA，或者与由其得到的cDNA接触，而此RNA是来自未被暴露于所述扰动的该细胞类型的细胞。

21.权利要求1或3的方法，其中所述的细胞成分包括存在于该细胞类型中多种蛋白质的丰度。

22.权利要求21的方法，其中是通过一种方法测定该多种蛋白质的丰度，此方法包括使一种抗体阵列与来自该细胞类型细胞的蛋白质接触，其中所述的抗体阵列包括具有附着抗体的表面，该抗体能够与所述多种蛋白质结合。

23.权利要求21的方法，其中是通过一种方法测定该多种蛋白质的丰度，此方法包括对来自该细胞类型细胞的蛋白质实施双向电泳。

24.权利要求1或3的方法，其中所述的细胞成分包括存在于该细胞类型中的多种蛋白质的活性。

25.权利要求1或3的方法，其中该细胞类型中的所述一种或几种生物途径包括起源于一种或几种特定细胞成分的生物途径，并且其中是通过包括修饰所述一种或几种特定细胞成分的方法实施对该生物途径的扰动。

26.权利要求25的方法，其中是通过一种方法修饰所述一种或几种特定的细胞成分，此方法包括在可控制表达系统的控制之下引起该一种或几种特定细胞成分表达。

27.权利要求25的方法，其中是通过一种方法修饰所述一种或几种特定的细胞成分，此方法包括可控制地转染表达该一种或几种特定细胞成分的基因。

28.权利要求25的方法，其中是通过一种方法修饰所述一种或几种特定的细胞成分，此方法包括可控制地降低该细胞类型细胞中编码该一种或几种特定细胞成分的RNA种类的丰度。

29.权利要求28的方法，其中所述可控制地降低该RNA种类丰度的方法包括将该细胞类型的细胞暴露于定向断裂该RNA种类的核酶。

30.权利要求25的方法，其中是通过一种方法修饰所述一种或几种特定的细胞成分，此方法包括可控制地降低该细胞类型细胞中编码该一种或几种特定细胞成分的RNA种类的翻译速度。

31.权利要求30的方法，其中所述可控制地降低RNA种类翻译速度的方法，包括将该细胞类型的细胞暴露于可对该RNA种类或对编码此RNA种类的DNA杂交的反义核酸或反义核酸模拟物。

32.权利要求25的方法，其中所述一种或几种特定的细胞成分是蛋白质种类的丰度或蛋白质种类的活性，并且其中是通过包括可控制地降低该细胞类型细胞中这些丰度的方法修饰该一种或几种特定的细胞成分。

33.权利要求32的方法，其中可控制地降低所述丰度的方法，包括在该细胞类型细胞中引起将所述一种或几种蛋白质种类表达为包含该蛋白质种类和一个降解决定子的融合蛋白，其中该降解决定子可控制地增加该蛋白质种类的降解速度。

34.权利要求32的方法，其中可控制地降低所述丰度的方法包括将该细胞类型的细胞暴露于抗体，其中该抗体可结合所述蛋白质种类。

35.权利要求25的方法，其中所述一种或几种特定细胞成分是蛋白质的活性，并且其中是通过包括可控制地降低该细胞类型细胞中所述活性的方法修饰该一种或几种特定细胞成分。

36.权利要求35的方法，其中可控制地降低所述活性的方法，包括将该细胞类型细胞暴露于可直接和特异性地抑制所述蛋白质种类活性的药物。

37.权利要求35的方法，其中可控制地降低所述活性的方法，包括将该细胞类型细胞暴露于优势负突变蛋白质种类，其中该优势负突变蛋白质种类是抑制所述活性的蛋白质。

38.一种从最初的候选药物中确定更具途径-特异性的候选药物的方法，包括：

(a)通过一种方法鉴定参与最初候选药物作用的生物途径，此方法包括确定一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，此生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定一种细胞类型细胞中一种或几种生物途径的细胞成分，其中

        (i)该最佳定标转换可使对于该最初候选药所提供

    的药物应答与对于该最初候选药物的模式药物应答之间差

    异的目标函数值最小化，

        (ii)是通过一种方法提供了对于该最初候选药物所

    提供的药物应答，此方法包括在暴露于该最初候选药物的多

    种水平测定此细胞类型细胞中的多种细胞成分，以及

        (iii)将对于该最初候选药物的模式药物应答表示为

    该一种或几种生物途径应答的组合，该组合中的一种或几种

    生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；

(b)修饰此最初候选药物的结构，产生修饰的候选药物；以及

(c)通过一种方法鉴定参与此修饰的候选药物作用的生物途径，此方法包括确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，其中

        (i)该最佳定标转换可使对于修饰的候选药物所提

    供的药物应答与对修饰的候选药物模式药物应答之间差异

    的目标函数值最小化；

        (ii)是通过一种方法提供了对于修饰的候选药物所

    提供的药物应答，此方法包括在暴露于修饰的候选药物的多

    种水平测定此细胞类型细胞中的多种细胞成分，以及

        (iii)将对于修饰的候选药物的模式药物应答表示为

    该一种或几种生物途径应答的组合，该组合中的一种或几种

    生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；其中如果鉴定表明修饰的候选药物作用中具有比最初候选药物作用中更少的生物途径，则该修饰的候选药物是比最初候选药物更具途径特异性的候选药物。

39.一种用于鉴定参与药物作用并介导此药物副作用的一种或多种特异性生物途径的方法，此方法包括：

(a)通过确定一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，鉴定参与第一种药物作用的一种或几种生物途径，此生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定一种细胞类型细胞中一种或几种生物途径的细胞成分，其中

        (i)该最佳定标转换可使对于第一种药物所提供的

    药物应答与对于第一种药物的模式药物应答之间差异的目

    标函数值最小化，

        (ii)是通过一种方法提供对于第一种药物所提供的

    药物应答，此方法包括在暴露于第一种药物的多种水平测定

    此细胞类型细胞中的多种细胞成分，以及

        (iii)将对于第一种药物的模式药物应答表示为该一

    种或几种生物途径应答的组合，该组合中的一种或几种生物

    途径应答的每一种须经单独的定标转换；

(b)通过确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，鉴定参与第二种药物作用的一种或几种生物途径，其中该第一种和第二种药物是不同的，并表现对相同的疾病或障碍具有治疗效果，并且其中

        (i)该最佳定标转换可使对于第二种药物所提供的

    药物应答与对于第二种药物的模式药物应答之间差异的目

    标函数值最小化，

        (ii)是通过一种方法提供对于第二种药物所提供的

    药物应答，此方法包括在暴露于第二种药物的多种水平测定

    此细胞类型细胞中的多种细胞成分，以及

        (iii)将对于第二种药物的模式药物应答表示为该一

    种或几种生物途径应答的组合，该组合中的一种或几种生物

    途径应答的每一种须经单独的定标转换；以及

(c)鉴定参与第一种药物作用的特异性生物途径，它们不同于参与第二种药物作用的生物途径，从而鉴定参与第一种药物的作用并且介导第一种药物的副作用的一种或多种特异性生物途径。

40.一种用于鉴定参与介导对于疾病或障碍的治疗效果的一种或多种特异性生物途径，该方法包括：

(a)通过确定一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，鉴定参与第一种药物作用的一种或几种生物途径，此最佳定标转换是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定一种细胞类细胞中一种或几种生物途径的细胞成分，其中

        (i)该最佳定标转换可使对于第一种药物所提供的

    药物应答与对于第一种药物的模式药物应答之间差异的目

    标函数值最小化，

        (ii)是通过一种方法提供对于第一种药物所提供的

    药物应答，此方法包括在暴露于第一种药物的多种水平测定

    此细胞类型细胞中的多种细胞成分，以及

        (iii)将对于第一种药物的模式药物应答表示为该一

    种或几种生物途径应答的组合，该组合中的一种或几种生物

    途径应答的每一种须经单独的定标转换；

(b)通过确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，鉴定参与第二种药物作用的生物途径，其中该第一种和第二种药物是不同的，并表明对相同的疾病或障碍具有治疗效果，并且其中

        (i)该最佳定标转换可使对于第二种药物所提供的

    药物应答与对于第二种药物的模式药物应答之间差异的目

    标函数值最小化，

        (ii)是通过一种方法提供对于第二种药物所提供的

    药物应答，此方法包括在暴露于第二种药物的多种水平测定

    此细胞类型细胞中的多种细胞成分，以及

        (iii)将对于第二种药物的模式药物应答表示为该一

    种或几种生物途径应答的组合，该组合中的一种或几种生物

    途径应答的每一种须经单独的定标转换；以及

(c)鉴定参与第一种药物和第二种药物作用的特异性生物途径，从而鉴定参与第一种药物的作用并且介导对于该疾病的障碍的治疗效果的一种或几种特异性生物途径。

41.一个用于鉴定参与一种细胞类型药物作用的生物途径的计算机系统，包括处理器和偶联于该处理器的内存，该内存编码一种或几种程序，该一种或几种程序导致处理器执行包括如下步骤的方法：

(a)接收该细胞类型中该药物的药物应答，该药物应答包括在多个药物暴露水平的该细胞类型细胞中多种细胞成分的测定量；

(b)接收一种或几种生物途径应答，该一种或几种途径应答的每一种都包括在对该生物途径多个扰动水平的该细胞类型细胞中该生物途径细胞成分的测定量；

(c)形成一个模式药物应答作为该一种或几种生物途径的组合，其中该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；

(d)确定该药物应答与模式药物应答之间差异的目标函数值；以及

(e)通过改变所述一种或几种生物途径应答的定标转换，以便获得可使所确定的该目标函数值最小化的最佳定标转换，用于使所确定的该目标函数值最小化；

其中该一种或几种生物途径应答的组合在所述最佳定标转换的条件下可鉴定参与该细胞类型药物作用中的生物途径。

42.权利要求41的计算机系统，在此所述的接收步骤包括形成从内存中可获得的该药物应答测定量和生物途径应答测定量。

43.权利要求41的计算机系统，其中所述形成一个模式药物应答包括加入该一种或几种生物途径应答。

44.权利要求41的计算机系统，其中所述的目标函数包括在所述药物暴露水平下该药物应答与模式药物应答差的平方和，在所述药物暴露水平通过借助于所述定标转换将所述药物暴露水平转换成相应的对每个所述生物途径的扰动水平，并且通过将所述生物途径应答插入成所述相应的扰动水平，形成了所述模式药物应答。

45.权利要求41的计算机系统，其中所述最小化包括实施Levenherg-Marquandt法。

46.一种测定二种药物对某一细胞类型作用相似性的方法，包括：

(a)提供该细胞类型中第一种药物的第一种药物应答，已通过一种方法获得了这种药物应答，此方法包括在对第一种药物的多种暴露水平测定该细胞类型细胞中的多种细胞成分；

(b)对在某一细胞类型中的第二种药物提供第二种药物应答，已通过一种方法获得了第二种药物应答，此方法包括在对第二种药物的多种暴露水平测定该细胞类型细胞中的多种细胞成分；以及

(c)确定该生物途径应答的最佳定标转换，它可使第一种药物应答与第二种药物应答之间差异的目标函数值最小化，

其中该目标函数的最小化值构成了对第一种药物和第二种药物在该细胞类型中作用相似性的测定。

47.一种用于鉴定参与环境改变对某一细胞类型作用的生物途径的方法，包括：

(a)提供该细胞类型对此环境改变的环境应答，已通过一种方法获得了这种环境应答，此方法包括在该环境改变的多种严格程度下测定该细胞类型细胞中的多种细胞成分；

(b)将一种模式环境应答表示为该细胞类型中一种或几种生物途径应答的组合，其中该细胞类型中的生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定该细胞类型细胞中该生物途径的细胞成分，并且其中该组合中所述一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换；以及

(c)确定该一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，它可使该环境应答与模式环境应答之间差异的目标函数值最小化，

其中该一种或几种生物途径应答的组合，在最佳定标转换条件下可鉴定为参与此环境改变对该细胞类型作用的生物途径。

48.权利要求3的方法，其中对在最佳定标转换条件下的该一种或几种生物途径应答的组合作了统计学显著性检验，其中是通过一种方法进行此统计学显著性检验，此方法包括：

(a)获得该目标函数最小化值的预期概率分布；以及

(b)依据此预期的概率分布评价该目标函数真实最小化值的统计学显著性，其中该目标函数的真实最小化值是从所提供的药物应答和此模式药物应答确定的。

49.权利要求48的方法，其中是通过一种方法获得所述预期概率分布，此方法包括：

(a)相对于所述多种药物暴露水平随机化该药物应答，

(b)通过一种方法随机化该模式药物应答，此方法包括相对于对所述一种或几种生物途径的多种扰动水平随机化所述一种或几种生物途径应答；

(c)通过确定该一种或几种随机化生物途径应答的最佳定标转换来确定该目标函数的理论最小值，此最佳定标转换可使所述随机化的药物应答与随机化的模式药物应答之间差异的目标函数最小化；以及

(d)重复步骤(a)-(c)，从而可确定多个理论最小值，

其中此多个理论最小值形成所述预期概率分布。

50.一种用于鉴定参与环境改变对某一细胞类型作用的生物途径的方法，此方法包括确定一种或几种生物途径应答的最佳定标转换，它可使所提供的环境应答与模式环境应答之间差异的目标函数值最小化，其中：

(a)该一种或几种生物途径应答是一种方法的结果，此方法包括在对该生物途径的多种扰动水平测定该细胞类型细胞中一种或几种生物途径的细胞成分；

(b)通过一种方法获得该所提供的环境应答，此方法包括在对该环境改变的多种暴露水平测定此细胞类型细胞中的多种细胞成分；以及

(c)将该模式环境应答表示为该一种或几种生物途径应答的组合，此组合中该一种或几种生物途径应答的每一种须经单独的定标转换，

其中该一种或几种生物途径应答的组合，在所述最佳定标转换条件下可鉴定为参与所述环境改变对该细胞类型作用的生物途径。

Images