CN1531440A - 通过调节Th1/Th2比例预防或治疗Th1和Th2细胞相关疾病的药物组合物 - Google Patents

通过调节Th1/Th2比例预防或治疗Th1和Th2细胞相关疾病的药物组合物 Download PDF

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Abstract

通过调节Th1/Th2比例预防或治疗人或动物中Th1－细胞或Th2－细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物包含一种活性物质，该物质由以下部分组成：(i)分别的IL－4和SDF－1α，或者IL－2和SDF－1α，以及其调节物，(ii)分别的IL－4刺激佐剂和SDF－1α，或者IL－2刺激佐剂和SDF－1α，(iii)酪氨酸激酶Syk或ZAP－70的调节物或(iv)活化的T细胞核因子NFAT1或NFAT2的调节物。

Description

通过调节TH1/TH2比例预防或治疗 TH1和TH2细胞相关疾病的药物组合物
发明领域
本发明涉及通过减小Th1/Th2比例而预防或治疗人或动物中Th1细胞相关疾病的药物组合物。
类似地，本发明涉及通过增加Th1/Th2比例而预防或治疗人或动物中Th2细胞相关疾病的药物组合物。
发明背景
CD4+辅助细胞依赖于抗原刺激和细胞因子环境而分化为Th1或Th2细胞。迄今为止，尚不十分明白指导性或/和选择性分化是否可对体内Th细胞形成有贡献。在IL-12存在时首先由抗原活化的T辅助细胞主要发育为Th1细胞，而那些在IL-4存在时活化的则主要发育为Th2细胞(Coffman等人，1999)。人们相信祖先Th细胞在变为能够合成指示Th1或Th2途径的细胞因子之前需要单独的细胞分裂(Bird等人，1998)。包括Syk和ZAP-70酪氨酸激酶的Syk-家族对于淋巴细胞发育和活化是关键的。尽管在Syk和ZAP-70之间有明显的结构类似之处，但有增多的证据表明这两个激酶在表达和活性两方面受不同调节(Chu等人，1998)。Th1和Th2细胞表型在早期活化信号转导途径中相互不同，尤其是在TCR相关蛋白质酪氨酸激酶的作用中(Tamura等人，1995)。TCR及其下游蛋白质酪氨酸激酶如Fyn、p56(lck)和ZAP-70参与Th1和Th2细胞的发育和分化(Swith等人，1998；Faith等人，1997；al-Ramadi等人，1996；Deckert等人，1998)。Cbl是一种衔接蛋白质，该蛋白质对许多起始于细胞表面受体的信号途径如Syk家族发挥负调节物的功能(Meng等人，1999；Ota等人，1997)。Cbl的同系物Cbl-b通过与上游激酶ZAP-70的直接相互作用而起正作用(Zhang等人，1999)。SDF-1α唯一已知的受体CXCR4可与TCR通讯(cross-talk)，从而影响TCR信号转导的重要下游物质包括ZAP-70的抗-CD3-刺激的磷酸化(Peacock等人，1999)。尽管有重大的进展，但涉及Th1和Th2细胞发育和动力学中的信号转导通路仍然未知。
1998年Jourdan等人公开了如下发现，即IL-4在Th2细胞和同样在Th1细胞中特定地促进CXCR4的细胞表面表达。CXCR4配体SDF-1α激活p42 MAP-激酶ERK-2。该活化使得T细胞对HIV易感并促进SDF-1α诱导的细胞迁移。在研究中，对p42 MAP-激酶的活性进行了测量以检查IL-4诱导的CXCR4是否有功能。此外，对ZAP-70酪氨酸激酶的活性进行了测量以作为对信号转导蛋白质的总体水平的测量。
在NFAT1基因敲除小鼠中Th2反应得到增强(Hodge等人，1996；Viola等人，1998)，且在NFAT2基因敲除小鼠中Th2反应得到消弱(Ranger等人，1998；Yoshida等人，1998)。
WO 00/24245公开了技术指导，即NFATp(NFAT1)和NFAT4一起充当Th2细胞的选择性抑制物。文献描述了a)展示增加的Th2细胞活性表型特点的NFATp和NFAT4两者均缺乏的小鼠，b)鉴定Th2细胞活性的调节物的方法，该方法使用NFATp和NFAT4两者均缺乏的细胞、NFATp和NFAT4两者均缺乏的小鼠或含有NFATp和NFAT4两者的指示剂组合物，c)用药剂调节Th2细胞活性的方法，该药剂调节NFATp和NFAT4的活性，和d)通过估计NFATp和/或NFAT4表达中的变化而诊断与异常Th2细胞活性相关的病症的方法。
US-A-5 958 671公开了通过调节c-Maf的活性而调节Th2-相关细胞因子，特别是白细胞介素-4(IL-4)生产的方法和用调节转录因子活性的药剂在被试者中调节Th1和Th2亚型的发育的方法。特别地，文献描述了刺激IL-4生产的方法，该方法利用第一试剂与第二试剂结合来刺激c-Maf的表达或活性，该第二试剂刺激NFAT家族的任何成员，优选地为NFATp的表达或活性。同样地，文献描述了抑制IL-4生产的方法，该方法利用第一试剂与第二试剂结合来抑制maf家族蛋白质的表达或活性，该第二试剂抑制NFAT家族的任何成员的表达或活性。
发明目的
本发明的目的是提供治疗Th1和Th2相关疾病的治疗物质。
发明概述
本发明的目的由本发明的第一个方面获得，该方面涉及通过减小Th1/Th2比例而预防或治疗人或动物中Th1细胞相关疾病的药物组合物，该组合物包含选自下面部分的活性物质，即a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或h)物质a)-g)中任何组的组合。
此外，本发明的目的由本发明的第二个方面获得，该方面涉及通过增大Th1/Th2比例而预防或治疗人或动物中Th2细胞相关疾病的药物组合物，该组合物包含选自下面部分的活性物质，即o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或v)物质o)-u)中任何组的组合。
本发明基于对机理中几个步骤的发现，该步骤在细胞外和细胞内水平两者上都确定祖先T细胞分化为Th1和Th2细胞。首先，本发明基于以下发现，即用IL-2或IL-2刺激佐剂与SDF-1α一起对祖先细胞的刺激导致CD4+T细胞发育为Th1细胞。其次，人们发现用IL-4或IL-4刺激佐剂与SDF-1α一起对祖先细胞的刺激导致CD4+T细胞发育为Th2细胞。人们相信IL-2、IL-4、佐剂和SDF-1α结合到祖先T细胞表面各自的受体上并触发特定的细胞内调节途径，导致向Th1或Th2细胞的分化。
第三，本发明基于如下发现，即导致T细胞向Th1细胞分化的途径包括酪氨酸激酶Syk以及转录因子NFAT1的活化，而其他NFAT转录因子未活化。第四，人们发现导致T细胞向Th2细胞分化的途径包括酪氨酸激酶ZAP-70以及转录因子NFAT2的活化，而其他NFAT转录因子未活化。
考虑到上述关于CD4+T细胞分化为Th1和Th2细胞的机理的发现，本发明进一步基于如下的认识，即任何物质如能够干涉参与该T细胞分化的任何物质的功能，其可用作预防或治疗由Th1或Th2细胞介导的疾病的活性物质。特别地，可能通过抑制T细胞向Th1细胞的分化或通过刺激T细胞向抵消的Th2细胞的分化来治疗Th1细胞相关的疾病，即在其中Th1细胞支持疾病进程的疾病。相应地，可能通过抑制T细胞向Th2细胞的分化或通过刺激T细胞向抵消的Th1细胞的分化来治疗Th2细胞相关的疾病，即在其中Th2细胞支持疾病进程的疾病。
本发明进一步涉及下述内容：
一种药物组合物，该组合物包含选自下列的活性物质，即a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或h)物质a)-g)中任何组的组合。
下列物质在制造通过减小Th1/Th2比例而预防或治疗Th1细胞相关疾病的药物的用途：a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或h)物质a)-g)中任何组的组合。
通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关疾病的方法，该方法包含向被试者给予有效剂量的活性物质，该活性物质选自a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或h)物质a)-g)中任何组的组合。
通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关疾病的方法，该方法包含从被试者取出T辅助细胞，离体使细胞与有效剂量的活性物质接触，该活性物质选自a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或h)物质a)-g)中任何组的组合。
在前面两个段落之一中提及的方法包含使被试者或受体接受第二治疗，该治疗涉及对免疫系统的处理。涉及对免疫系统处理的该第二治疗可选自接种疫苗、抗原特异性免疫治疗、变应原特异性免疫治疗、非特异性免疫治疗和器官移植。
一种药物组合物，该组合物包含选自下列活性物质：o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或v)物质o)-u)中任何一个的组合。
下列活性物质在制造通过增大Th1/Th2比例而预防或治疗Th2细胞相关疾病的药物的用途：o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或v)物质o)-u)中任何组的组合。
通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关疾病的方法，该方法包含向被试者给予有效剂量的活性物质，该活性物质选自o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或v)物质o)-u)中任何组的组合。
通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关疾病的方法，该方法包含从被试者取出T辅助细胞，离体使细胞与有效剂量的活性物质接触，该活性物质选自o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或v)物质o)-u)中任何组的组合。
在前面两个段落之一中提及的方法包含使被试者或受体接受第二治疗，该治疗涉及对免疫系统的处理。涉及对免疫系统处理的该第二治疗可选自接种疫苗、抗原特异性免疫治疗、变应原特异性免疫治疗、非特异性免疫治疗和器官移植。
与编码酪氨酸激酶Syk或其部分的DNA分子互补的反义肽核酸(PNA)。该Syk PNA优选包含5-25个碱基，更优选10-20个，最优选为13-18个。优选，Syk PNA具有SEQ ID NO：01的序列。
与编码酪氨酸激酶Syk或其部分的DNA分子互补的反义肽核酸(PNA)，用于通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关的疾病。
与编码酪氨酸激酶Syk或其部分的DNA分子互补的反义肽核酸(PNA)用于制造药物的用途，该药物通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关的疾病。
通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关的疾病的方法，该方法包含向被试者给予有效剂量的反义肽核酸(PNA)，该反义肽核酸与编码酪氨酸激酶Syk或其部分的DNA分子互补。
与编码酪氨酸激酶ZAP-70或其部分的DNA分子互补的反义肽核酸(PNA)。该ZAP-70 PNA优选包含5-25个碱基，更优选10-20个，最优选13-18个。优选，ZAP-70PNA具有SEQ ID NO：02的序列。
与编码酪氨酸激酶ZAP-70或其部分的DNA分子互补的反义肽核酸(PNA)，用于通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关的疾病。
与编码酪氨酸激酶ZAP-70或其部分的DNA分子互补的反义肽核酸(PNA)用于制造药物的用途，该药物通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关的疾病。
通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关的疾病的方法，该方法包含向被试者给予有效剂量的反义肽核酸(PNA)，该反义肽核酸与与编码酪氨酸激酶ZAP-70或其部分的DNA分子互补。
评价被试者的T辅助细胞的特征的体外诊断方法，该方法包含获得含有来自被试者样品的T辅助细胞，测量样品中磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内NFAT1和/或核内NFAT2的水平并用获得的测量结果来估计Th1/Th2水平。
检验产品或方法对Th1/Th2比例的作用的体外方法，该方法包含获得含有已知Th1/Th2比例的培养物的T辅助细胞，用该产品或方法处理该T辅助细胞，测量样品中磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内NFAT1和/或核内NFAT2的水平并用获得的测量结果来估计Th1/Th2水平的变化。
一种包含一种或多种探针以及可选择的一个检测系统的诊断检验试剂盒，该探针特异性结合磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内NFAT1和/或核内NFAT2。
一种生产富含Th1细胞的培养物的方法，该方法包含获得含有样品的T辅助细胞，用活性物质处理样品以增大Th1/Th2比例，该活性物质选自a)IL-2和SDF-1α，b)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，e)Syk或NFAT1的刺激物，f)物质a)-e)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或g)物质a)-f)中任何组的组合。
一种生产富含Th2细胞的培养物的方法，该方法包含获得含有样品的T辅助细胞，用活性物质处理样品以减小Th1/Th2比例，该活性物质选自a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)物质a)-e)中任何一组的功能衍生物、类似物或部分或g)物质a)-f)中任何组的组合。
由权利要求60或61的方法生产的培养物在体外或体内研究和试验中的用途。
附图简述
图1A表示新鲜分离的或用IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激的CB T细胞中Syk的活化，如用免疫复合物激酶测定(KA)和免疫印迹(IB)所显示的。
图1B表示新鲜分离的或用IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激的CB T细胞中ZAP-70的活化，如用免疫复合物激酶测定(KA)和免疫印迹(IB)所显示的。
图1C表示新鲜分离的或用IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激的CB T细胞中Cbl的活化，如用免疫复合物激酶测定(KA)和免疫印迹(IB)所显示的。
图1D表示新鲜分离的或用IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激的CB T细胞中Cbl-b的活化，如用免疫复合物激酶测定(KA)和免疫印迹(IB)所显示的。
图2A用免疫复合物激酶测定(KA)和免疫印迹(IB)显示PNA Syk反义物对Syk激酶活化的阻断作用。
图2B用免疫复合物激酶测定(KA)和免疫印迹(IB)显示PNA ZAP-70反义物对ZAP-70激酶活化的阻断作用。
图3A-D表示CB T细胞中经IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激后NFAT的活化和鉴定。
图4表示导致Th1和Th2分化的调节途径的示意性描述。
发明详述
在本发明中，人们发现IL-2或IL-4与SDF-1α的组合以非抗原特异性的方式将脐带血(CB)CD4+T细胞分别转变为Th1和Th2类型的细胞。该发现在蛋白质水平和mRNA水平上都得到了证实。同时，IL-2或IL-4与SDF-1α的组合在8日内于CB CD4+T细胞中分别诱导了Syk和ZAP-70的强且持久的活化。在用IL-2与SDF-1α或IL-4与SDF-1α刺激的细胞中于8日内已经观察到Cbl激酶活性减小的模式或增加的模式。相反地，在用IL-4与SDF-1α或IL-2与SDF-1α刺激的CB CD4+T细胞中于8日内已观察到了Cbl-b激酶的强且持久的活化。Syk或ZAP-70PNA反义物在用IL-2或IL-4与SDF-1α的组合刺激的CB CD4+T细胞中于8日内分别完全消除了Syk或ZAP-70的激酶活性和蛋白质表达。同样地，Syk或ZAP-70PNA反义物在由IL-2或IL-4与SDF-1α的组合诱导的CB CD4+T细胞中选择性地抑制IFN-γ或IL-4 mRNA的表达，从而暗示Syk和ZAP-70激酶活化对于Th1或Th2细胞由IL-2或IL-4与SDF-1α的组合来转变是基本的。此外，在(IL-2+SDF-1α)-或(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞中已观察到了选择性的和持久的NFAT1或NFAT2的活化，从而显示NFAT1或NFAT2也在Th1或Th2细胞的转变中起重要的和选择性的作用。总之，本发明报道了一个可选择的信号转导途径，在其中IL-2或IL-4与SDF-1α的组合诱导了Syk或ZAP-70激酶的选择性的且持久的磷酸化，结果导致非抗原特异性的CD4+T细胞向Th1或Th2细胞的转变。对本发明的该发现的示意图在图4中给出。
如上所述，本发明的试验发现是基于使用脐带血CD4+T细胞，该细胞被认为是原初细胞。人们相信对于原初T细胞的这些发现对于正在进行的免疫反应也是正确的，即有可能起始额外的免疫反应，该反应是添加于正在进行的反应上的。
治疗的疾病
Th1-相关疾病
Th1-相关疾病包含下面类群的疾病：传染性疾病、自身免疫疾病、迟发型超敏疾病和癌。
传染性疾病类群包括由寄生虫和病毒如HIV导致的疾病。
自身免疫疾病类群包括脑脊髓病、脱髓鞘的和其他的自身免疫疾病。
脑脊髓病的例子包括但不局限于多发性硬化(MS)；弥漫性硬化；病灶性硬化；岛式硬化(insular sclerosis)；运动性共济失调(后硬化)；急性和慢性实验型变应性(或自身免疫)脑脊髓炎(EAE)，该疾病是MS的动物模型；急性热病性多神经炎；实验型变应性神经炎(Guillain-Barré综合症的动物模型)；急性弥漫型脑脊髓炎；肌痛性(myalgic)脑脊髓炎(良性的和流行性的)；病毒型脑脊髓炎；肉芽肿性脑脊髓炎等。同样包括的是动物疾病，例如但不局限于犬温热；猫温热；马脑脊髓炎(东部的、Venezuelan和西部的)；禽脑脊髓炎；猪脑脊髓炎；牛脑脊髓炎；小鼠脑脊髓炎等。
脱髓鞘疾病的例子包括但不局限于多发性硬化(MS)、弥漫性硬化(DS)、急性弥漫型脑脊髓炎、进行性多病灶脑白质病(progressivemultifocal leukoencephalopati)(PML)和亚急性硬化泛脑炎(SSPE)。
其他自身免疫疾病的例子包括多发性硬化(MS)、多关节炎结节哮喘(polyartheritis nodosaasthma)、超敏性肺炎、间质肺疾病、肉样瘤病、自发性肺纤维样变性、与局限性回肠炎或溃疡性结肠炎或惠普尔病相关的间质肺疾病、与韦格纳肉芽肿病或超敏性脉管炎相关的间质肺疾病、
脉管炎综合症、亨诺赫-舍恩莱茵紫癜、古德帕斯彻综合症、韦格纳肉芽肿病、
肾疾病如在急性肾小球性肾炎中由抗体介导的肾小球病(glomerulopathia)、与全身性红斑狼疮(SLE)相关的肾炎、与其他全身性疾病如Wegeners肉芽肿和Goodpastures综合症和混合的结缔组织疾病相关的肾炎、慢性间质肾炎、慢性肾小球性肾炎、
胃肠疾病如Crohn氏疾病、溃疡性结肠炎、腹腔疾病、Whipple氏疾病、胶原性结肠炎、嗜酸性结肠炎、淋巴性结肠炎、
肝胆疾病如自身免疫性肝炎、酒精诱导的肝炎、门管周纤维样变性、原初性胆硬变、sclerosing colangitis、
皮肤疾病如牛皮癣、遗传过敏性皮炎、湿疹、变应性皮肤疾病、进行性全身硬化(硬皮病)、剥脱性皮炎、寻常性天疱疮、
关节疾病如类风湿性关节炎(RA)、强直性脊椎炎、与牛皮癣或炎症性肠疾病相关的关节炎、
肌与骨骼的(muscoloskelletal)疾病如重症肌无力(myasteniagravis)(MG)、多肌炎、
内分泌疾病如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎(桥本)、甲状腺毒症(thyreotoxicosis)、甲状腺功能亢进(突眼性甲状腺肿(格雷夫斯氏病))、
造血系统疾病如自身免疫性贫血、自身免疫性血小板减少、
心血管疾病如心肌病(cardiomyopathia)、脉管炎、与全身性疾病如全身性红斑狼疮、结节性多关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、肉样瘤病相关的心血管疾病。
自身免疫疾病的明显特征在于其家族性聚集及与特定基因表达的关联，特别是I型和II型主要组织相容性复合体(MHC)的基因。例如，大部分的MS病人具有HLA-DR2单倍型(Beall SS、Concannon P、Charmley P等人，J.Neuroimmunol.，v 21，p 59-66，1989)。由于不是所有的具有易感的基因型的被试者都发展为自身免疫疾病，因此看来环境因子也发挥重大的作用。例如，MS看来在居住于温和的气候区域的被试者中更普遍(Kurtzke JF，IN：Multiple Sclerosis，编者为Hallpike JF、Adams CWM、Tourtelotte WW，Williams andWilkins，Baltimore，MD，1983，p 49-95)。长期以来推测自身免疫疾病的环境因子可能为传染剂如病毒。几种人和动物疾病的病原学(etilogy)可归因于病毒感染。例如，Theiler氏鼠脑脊髓炎是具有与EAE相似的临床和病理学迹象的脱髓鞘疾病。尽管有抗体参与一些自身免疫疾病的效应物反应，但大多数情况中的触发事件开始于CD4T-细胞的活化，该活化是B细胞成熟和克隆扩充所必需的。
迟发型超敏反应类群包括对低分子量物质的接触性超敏反应。
Th2-相关的疾病
Th2-相关的疾病包含下面类群的疾病：变应性疾病和癌。
众所周知遗传上易患病的个体对源自该个体所暴露的各种环境来源的抗原敏感(过敏)。当先前过敏的个体再次暴露于相同的或同源的变应原时发生变应性反应。变应性反应范围包括枯草热、鼻结膜炎、鼻炎和哮喘到响应于如蜜蜂或大黄蜂刺痛或昆虫叮咬的全身性过敏反应和死亡。该反应是立即发生的并由各种特异反应性变应原导致，该变应原如源自草、树、野草、昆虫、(屋尘)螨、食物、药物、化学物质和香料。
变应性疾病类群包括枯草热、鼻结膜炎、鼻炎和哮喘。
导致发生变应性反应的最普遍的变应原包括吸入性变应原，该变应原即源自树、草、草本植物、真菌、屋尘螨、贮藏螨(storage mite)、蟑螂和动物毛发、羽毛和头皮屑。来自树、草和草本植物的重要的花粉变应原是源自分类学目壳斗目、木犀目(Oleales)和松目，(i.a.)包括桦木(桦木属(Betula))、桤木(赤杨属(Alnus))、榛子(榛属(Corylus))、角树(鹅耳枥属(Carpinus))和橄榄树(齐墩果属(Olea))，禾草目(i.a.)包括黑麦草属(Lolium)、猫尾草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)和黑麦属(Secale)属的草，菊目和荨麻目(i.a.)包括豚草属(Ambrosia)和蒿属(Artemisia)的草本植物。来自真菌的重要吸入性变态反应原(i.a.)源自链格孢属(Alternaria)和芽枝霉属(Cladosporium)。其他重要吸入性变态反应原是那些来自尘螨属(Dermatophagoides)的屋尘螨的和来自Lepidoglyphys destructor属的贮藏螨的、那些来自蟑螂和那些来自哺乳动物如猫、狗、马、母牛和鸟的。同样地，普遍观察到对于刺痛性或叮咬性昆虫的变应性反应，该昆虫来自如分类学目膜翅目，其中包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁。特定的变应原成分为本领域的技术人员所公知，且包括最平常的如壳斗目的Bet v1(白桦(B.verrucosa)，桦木)、Aln g1(胶桤木(Alnusglutinosa)，桤木)、Cor a1(Corylus avelana，榛子)和Car b1(桦叶鹅耳枥(Carpinus betulus)，角树)。其他的最普遍的为Cry j1(松目)、Amb a1和2、Art v1(菊目)、Par j1(荨麻目)、Ole e1(木犀目)、Ave e1、Cyn d1、Dac g1、Fes p1、Hol l1、Lol p1和5、Pas n1、Phl p1和5、Poa p1、2和5、Sec c1和5、及Sor h1(各种草的花粉)、Alt a1和Cla h1(真菌)、Derf1和2、Derp1和2(屋尘螨，分别为粉尘螨(D.farinae)和屋尘螨(D.pteronyssinus))、Lep d1、Bla g1和2、Per a1(蟑螂，分别为德国小蠊(Blatella germanica)和美洲大蠊(Periplaneta americana)、Fel d1(猫)、Can f1(狗)、Equc1、2和3(马)、Apis m1和2(蜜蜂)、Ves v1、2和5、Pol a1、2和5(全为黄蜂)和Sol i1、2、3和4(火蚁(fire ant))。
Th1-和Th2-相关的癌
通常，癌细胞可引起对由癌细胞特异性表达的抗原的免疫反应。由于Th1和Th2免疫反应两者都可驱动强的炎症反应，该炎症反应导致对组织的细胞毒性根除，因此对Th1和Th2免疫反应的调节可用于癌的治疗中。
可用根据本发明的组合物治疗的癌可根据组织发生而分为恶性上皮肿瘤，其中包括癌和腺癌，以及恶性非上皮肿瘤，其中包括脂质肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、成髓细胞瘤、恶性黑素瘤、恶性脑膜瘤、各种白血病、各种脊髓增生疾病、各种淋巴瘤(何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、血管肉瘤(haemangiosarcoma)、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤(lymphangiosarcoma)、恶性畸胎瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤和绒毛膜瘤(choricarcinoma)。
癌和腺癌是最多的(占癌症死亡人数的约90％)，并因此是根据本发明进行治疗/预防的引起关注的目标疾病。最重要的癌和腺癌是那些呼吸道的(尤其是支气管来源的)、乳腺的、结肠的和胃的癌症。然而，前列腺的、卵巢的、淋巴组织的和骨髓的、子宫的、胰腺的、食道的、膀胱的和肾的癌和腺癌同样导致了巨大数目的死亡人数，因此也是引起关注的。
癌疾病的类群进一步包括赛塞利综合症、皮肤T-细胞淋巴瘤、肝癌和肺癌。
活性物质与病原物质的共同给予
在本发明的优选实施方案中，本发明的药物组合物除活性物质之外，还含有引起要治疗的疾病的病原物质。这样的药物组合物具有下面的优点，即免疫反应的偏离仅限于由该病原物质所限定的抗原特异性。
因此，本发明的药物组合物可进一步含有引起要治疗的Th1-相关疾病的病原物质，特别是引起传染性疾病的感染剂或抗原。该抗原可为引起自身免疫疾病的自身抗原、半抗原或引起迟发型超敏反应的变应原。
同样地，本发明的药物组合物可进一步含有引起要治疗的Th2-相关疾病的病原物质，特别是寄生物或其部分或抗原。该抗原可为引起变应性疾病变应原。
活性物质
根据本发明的活性物质即权利要求1的物质a)-g)和权利要求24的o)-u)包含具有细胞外作用位点的物质如IL-4和SDF-1α，和具有细胞内作用位点的物质如Syk、ZAP-70、NFAT1和NFAT2的调节物。
在受体-配体系统中具有细胞外作用位点的物质一般结合到细胞膜的细胞外侧的受体上。通常，这样的系统可被任何结合受体或配体的物质以消弱或预防受体与配体之间的结合的方式抑制。这种抑制剂的例子是抗体、低分子量的有机物质和自由受体。受体-配体系统可由结合受体和配体的任何物质以促进受体与配体之间的结合的方式刺激。同样地，受体-配体系统可通过添加配体分子而增加其数目或通过增加受体分子的数目而刺激，其中受体分子数目的增加通过添加刺激受体的细胞内表达的物质实现。
具有细胞内作用位点的物质可为任何能够调节物质的活性或表达的物质。
在下文中，更详细地描述了根据本发明的各种活性物质。
a)和o)IL-4/IL-2和SDF-1α
IL-2、IL-4和SDF-1α可通过从生物材料中纯化物质或通过用常规重组技术生产物质而获得。
b)和p)IL-4/IL-2和SDF-1α的刺激物
IL-2、IL-4或SDF-1α的刺激物是刺激IL-2、IL-4或SDF-1α受体的细胞内活化或细胞外表达的物质。对于能够刺激IL-2、IL-4或SDF-1α受体表达的物质的详细的量，可以参考下面题目为“e)和s)Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的刺激物”的部分，该部分的内容同样适用于本部分。
c)和q)IL-4/IL-2和SDF-1α的拮抗剂
IL-2、IL-4或SDF-1α的拮抗剂包括IL-2、IL-4或SDF-1α的单克隆和多克隆抗体、包括结合IL-2、IL-4或SDF-1 α的细胞受体结合位点的抗体和结合到IL-2、IL-4或SDF-1α的其他部分从而减少或阻碍了其与受体结合的抗体两种。同样地，配体IL-2、IL-4或SDF-1α的拮抗剂包括IL-2、IL-4或SDF-1α受体(CXCR4)的单克隆和多克隆抗体。受体的抗体可为结合受体的配体结合位点的抗体和结合受体的其他部分从而减少或防止配体与受体结合的抗体两种。
IL-2、IL-4或SDF-1α的拮抗剂进一步包括对配体IL-2、IL-4或SDF-1α或其受体具有结合亲和力的肽，即包含所述分子之一的结合位点或其部分的肽。
此外，IL-2、IL-4或SDF-1α的拮抗剂可为低分子量化合物，如有机化合物。
同样地，可将IL-2、IL-4或SDF-1α的拮抗剂添加为自由受体，即不结合T细胞的受体，以及自由配体，该配体能够与其受体结合但不能对T细胞发挥其效应物的功能或仅能发挥减少的效应物功能。
IL-2、IL-4或SDF-1α的拮抗剂的其他例子是抑制IL-2、IL-4或SDF-1α受体的细胞内表达的物质。对于能够抑制IL-2、IL-4或SDF-1α受体表达的物质的详细的量，可以参考下面题目为“d)和r)Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的抑制剂”的部分，该部分的内容同样适用于本部分。
d)和r)Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的抑制剂
在下文中，参考WO 00/24245，其在此处引入作为参考。
本发明的抑制性化合物可为如细胞内结合分子，该分子特异性地抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的表达或活性。如在此处所用的，术语“细胞内结合分子”意思包括在细胞内通过与蛋白质或编码该蛋白质的核酸(如mRNA分子)结合而抑制该蛋白质的表达或活性的分子。在下面进一步详细描述的细胞内结合分子的例子包括反义核酸、细胞内抗体、抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2与目标分子相互作用的肽化合物(如钙调磷酸酶)和特异性地抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2活性的化学物质。
抑制性化合物的进一步的例子包括磷酸酶和其他酶和能够去磷酸化的化合物。
i.反义核酸分子
在一个实施方案中，本发明的抑制性化合物是反义核酸分子，该分子与编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的基因或与该基因的部分互补，或为编码该反义核酸分子的重组表达载体。反义核酸分子可为DNA、RNA、PNA、LNA或硫代磷酸。使用反义核酸以减量调节细胞中特定蛋白质的表达是本领域中公知的。反义核酸分子包含与另一个分子核酸的编码链(如mRNA序列)互补的核苷酸序列，并因此能够以氢键结合到另一个核酸分子的编码链上。与mRNA序列互补的反义序列可为与在mRNA的编码区的序列、mRNA的5’或3’非翻译区或连接编码区和非翻译区(如在5’非翻译区和编码区的连接处)的序列互补。此外，反义核酸可与编码mRNA基因的调节区在序列上互补，例如转录起始序列或调节元件。优选地，反义核酸设计为与编码链的起始密码子之前或跨越起始密码子或在mRNA的3’非翻译区的区域互补。
假定已知Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2基因的编码链的核苷酸序列(且因此Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 mRNA的序列也已知)，那么本发明的反义核酸可根据沃森和克里克碱基配对法则来设计。反义核酸分子可为与Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 mRNA的整个编码区互补的，但更优选为仅与Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 mRNA的编码或非编码区的部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可与Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 mRNA的翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸长度可为如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长。本发明的反义核酸可用本领域中公知的程序以化学合成或酶促连接反应来构建。例如，反义核酸(如反义寡核苷酸)可用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸进行化学合成，该修饰的核苷酸设计为增加分子的生物学稳定性或增加在反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，如可使用硫代磷酸衍生物和吖啶替代的核苷酸。可用于生成反义核酸的修饰核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧化乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧化乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。为了在培养物中抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2在细胞中的表达，可将一种或多种反义寡核苷酸添加到培养物的细胞中。
或者，反义核酸可用表达载体进行生物学生产，在其中所有或部分的Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA以反义方向进行亚克隆(即从插入的核酸所转录的核酸与目标核酸为反义的方向)。选择可操作地连接到以反义方向克隆的核酸的调节序列，该调节序列可指导反义RNA分子在目标细胞中的表达，例如可选择启动子和/或增强子或其他调节序列，这些序列可指导反义RNA的组成型、组织特异性或诱导型表达。反义表达载体根据构建重组表达载体的标准重组DNA方法制备，只是Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA(或其部分)以反义方向克隆入载体中。反义表达载体可为如重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式。反义表达载体用标准转染技术引入到细胞中。
本发明的反义核酸分子一般在原位给予被试者或生成，从而它们可与编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA进行杂交或与之结合，因此通过如抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质的表达。该杂交可通过常规核苷酸互补进行以形成稳定的双链体，或者为如反义核酸分子通过在双螺旋的大沟中的特定的相互作用结合到DNA双链体上的情况。本发明的反义核酸分子给药途径的例子包括在组织位点的直接注射。或者，可将反义核酸分子修饰为针对所选细胞的，然后全身给药。例如，对于全身给药，可将反义分子进行修饰从而它特异性地在所选细胞表面上结合表达的受体或抗原，如通过将反义核酸分子连接到与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体上。反义核酸分子也可用在此处描述的载体送递到细胞中。为了获得反义分子足够的细胞内浓度，载体构建体优选其中反义核酸分子处于强的pol11或pol III启动子的控制之下。
在另外一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补的RNA形成特定的双链杂交物，其中与通常的P-单位相反地，这些链相互平行。反义核酸分子也可包含2’-o-甲基核糖核苷酸或嵌合的RNA-DNA类似物。
在另外一个实施方案中，本发明的反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，该酶能够切割具有互补区域的单链核酸如mRNA。因而，核酶(如锤头状核酶)可用于催化切割Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 mRNA转录物，并因而抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 mRNA的翻译。具有对Syk-、ZAP-70-、NFAT1-或NFAT2的编码核酸的特异性的核酶可基于Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA的核苷酸序列进行设计。例如，可构建四膜虫属的L-19 IVS RNA的衍生物，在其中活性位点的核苷酸序列与在Syk-、ZAP-70-、NFAT1-或NFAT2的编码mRNA中要切割的核苷酸序列互补。
或者，Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的基因表达可通过针对与Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2基因的调节区域(如Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成三螺旋结构而进行抑制，该三螺旋结构在目标细胞中预防NFAT1基因的转录。
最后，Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2可由编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的催化失活的突变体的核酸抑制。
ii.细胞内抗体
可用于抑制细胞中Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质的表达和/或活性的另一类抑制性化合物为此处所述的Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的细胞内特异性抗体。细胞内抗体抑制细胞中蛋白质功能的应用为本领域中公知。
为了用细胞内抗体抑制蛋白质活性，制备了以这样的形式编码抗体链的重组表达载体，从而当将载体引入到细胞中后，抗体链作为细胞的细胞内区室的功能抗体进行表达。对于根据本发明的抑制方法抑制转录因子活性，优选地在细胞的核内表达特异结合转录因子的细胞内抗体。细胞内抗体的核表达可通过下面方法实现，即从抗体轻链和重链基因中去除那些编码N末端疏水前导序列的核苷酸序列或在轻链和重链基因的N-或C-末端添加编码核定位信号的核苷酸序列。用于细胞内抗体链的核导向的优选的核定位信号是SV40大T抗原的核定位信号。
为了制备细胞内抗体表达载体，一般将编码对目标蛋白质如Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质特异性的抗体链的抗体轻链和重链cDNA从杂交瘤中分离，该杂交瘤分泌对Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质特异的单克隆抗体。抗Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质的抗血清的制备已在本领域中进行了描述。抗-Syk、-ZAP-70、-NFAT1或-NFAT2的抗体可通过对适当的被试者(如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)分别用Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2免疫原的免疫接种而制备。适当的免疫原性制剂可含有如重组表达的Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质或化学合成的Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2肽。该制剂可进一步包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂或者相似的免疫刺激化合物。抗体生产细胞可从被试者中获得并用于以标准技术来制备单克隆抗体，如杂交瘤技术。用于生产单克隆抗体杂交瘤的技术众所周知。简单讲，将一个永生细胞系(一般为骨髓瘤)与来自上述用Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质免疫原进行免疫接种的淋巴细胞(一般为脾细胞)融合，并筛选结果所得的杂交瘤细胞的培养物上清液以鉴定生产单克隆抗体的杂交瘤，该单克隆抗体特异性地结合Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质。用于融合淋巴细胞和永生化的细胞系的许多众所周知的流程的任何一种都可应用于生成抗-Syk、-ZAP-70、-NFAT1或-NFAT2蛋白质的单克隆抗体的目的。此外，普通的技术人员可以理解这种方法有许多同样可用的变体。一般，永生细胞系(如骨髓瘤细胞系)源自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，鼠杂交瘤可通过将来自用本发明的免疫原性制剂进行免疫接种的小鼠的淋巴细胞和永生化的小鼠细胞系进行融合而制备。优选的永生细胞系是对含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)的培养基敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。许多骨髓瘤细胞系的任何一种都可用作根据标准技术的融合伴侣，如P3-NSI/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可获自美国模式培养物保藏所(ATCC)，Rockville，Md。一般地，HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞用聚乙二醇(“PEG”)与小鼠脾细胞进行融合。然后由融合所得的杂交瘤细胞用HAT培养基进行选择，该HAT培养基杀死了未融合的和未生产性地融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞几天后死亡，因为它们没有被转化)。生产特异性结合maf蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清液中的这种抗体而鉴定，如利用标准的ELISA测定。
作为制备单克隆抗体分泌杂交瘤的另一种方法，结合Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的单克隆抗体可通过筛选蛋白质或其肽的重组组合免疫球蛋白文库(如抗体噬菌体展示文库)而鉴定和分离，从而分离特异性结合蛋白质的免疫球蛋白文库成员。生成和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可购得(如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，Catalog No.27-9400-01；和Stratagene SurfZ4p TM Phage DisplayKit，Catalog No.240612)。此外，特别可用于生成和筛选抗体展示文库的方法和化合物的例子可见于文献中。
一旦已鉴定了对Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2特异性的目标单克隆抗体(如杂交瘤衍生的单克隆抗体或来自组合文库的重组抗体，包括本领域中已知的抗Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的单克隆抗体)，那么编码单克隆抗体的轻链和重链的DNA则用标准分子生物学技术进行分离。对于杂交瘤衍生的抗体，轻链和重链cDNA可通过如PCR扩增或cDNA文库筛选来获得。对于重组抗体，如来自噬菌体展示文库的，编码轻链和重链cDNA可从在文库筛选过程中分离的展示包(如噬菌体)中回收。可从其中制备PCR引物或cDNA文库探针的抗体轻链和重链基因的核苷酸序列是本领域中公知的。例如，许多这种序列公开于Kabat，E.A.等人(1991)具有免疫学重要性的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，美国健康和人类服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)、NIH出版物No.91-3242和在“Vbase”人类种系序列数据库中。
一旦获得了，则将抗体轻链和重链序列用标准方法克隆入重组表达载体中。如上所述，将编码轻链和重链疏水前导肽的序列去除并将编码核定位信号(如来自SV40大T抗原的)按符合阅读框架的方式与编码轻链和重链两者的氨基或羧基末端的序列进行连接。表达载体可以以一种或几种不同的形式编码细胞内抗体。例如，在一个实施方案中，载体编码全长的抗体轻链和重链，从而该全长的抗体在细胞内表达。在另外一个实施方案中，载体编码全长的轻链但仅编码重链的VH/CHI区域，从而Fab片段在细胞内表达。在最优选的实施方案中，载体编码单链抗体(scFv)，其中轻链和重链的可变区通过灵活的肽连接体(如(GIY4Ser)3)连接的并作为单链分子进行表达。为了抑制细胞内转录因子的活性，将编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2特异性细胞内抗体的表达载体用在上文中描述的标准转染方法引入到细胞中。
iii.Syk-、ZAP-70-、NFAT1-或NFAT2-衍生的肽化合物
在另一个实施方案中，本发明的抑制化合物是源自Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2氨基酸序列的肽化合物。特别地，抑制化合物包含分别介导Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2与目标分子相互作用的Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的部分(或其模拟物)，从而Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2与该肽化合物的接触竞争性地分别抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2与目标分子的相互作用。在优选的实施方案中，肽化合物基于介导NFAT1与钙调磷酸酶相互作用的NFAT1的区域而设计。如在Avramburu等人(1998)的Mol.Cell.1：627-637(此处特别地引入作为参考)所描述的，NFAT蛋白质的氨基末端的保守区域介导NFAT蛋白质与钙调磷酸酶的相互作用，且跨过该区域的肽抑制钙调磷酸酶结合并使NFAT蛋白质磷酸化的能力，但不影响钙调磷酸酶对其他底物的磷酸酶活性。此外，当在细胞内表达时，跨过该区域的肽抑制响应于刺激的NFAT脱磷酸化、核定位和NFAT-介导响应于刺激的基因表达，从而抑制NFAT依赖性功能。介导与钙调磷酸酶相互作用的NFAT1区域含有保守的氨基酸基元Ser-Pro-Arg-Ile-Glu-Ile-Thr(基元1)。
在一个优选地实施方案中，NFAT抑制化合物是肽化合物，该化合物基于NFAT1的钙调磷酸酶相互作用区域而制备。肽可源自NFAT1的钙调磷酸酶相互作用区域，该区域具有包含上述氨基酸基元1的氨基酸序列。或者，可使用人NFAT1的较长区域，如跨过上述氨基酸基元1的肽。
本发明的肽化合物可通过向细胞中引入编码该肽的表达载体而在细胞(如淋巴样细胞)中进行细胞内的制备。这种表达载体可通过标准技术用如编码上述氨基酸基元之一的寡核苷酸来制备。该肽可作为与另一种蛋白质或肽的融合物(如GST融合物)在细胞内进行表达。作为细胞中肽的重组合成的另一选择，该肽可用标准肽合成技术由化学合成来制备。然后合成的肽可由本领域中将肽引入细胞中的各种方式(如脂质体等)引入到细胞中。制备NFAT抑制肽的重组方法和用它们抑制细胞中NFAT活性的方法进一步详细描述于Avramburu等人(1998)的Mol.Cell.1：627-637中。
同样已证明与钙调磷酸酶相互作用的NFAT1区域对于NFAT1的核输入和有效识别及脱磷酸化是必需的，因而该区域的突变抑制NFAT1活性(参见Avramburu等人(1998)Mol.Cell.1：627-637)。因而，在另一个实施方案中，NFAT1活性可通过在氨基末端使包含上述基元1的钙调磷酸酶结合区域发生突变而进行抑制。可将野生型NFAT1氨基酸修饰为突变的序列以生成具有减少的活性的NFAT1的突变型。
iv.化合物
可用于特异地抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质活性的其他抑制剂直接抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2活性或抑制Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2和目标分子间的相互作用的化学化合物。这种化合物可用选择这种化合物的筛选测定进行鉴定。
ZAP-70抑制性化合物的例子为源自L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-高苯丙氨酸或L-丝氨酸的1，2，4-噁二唑类似物(Vu，2000)；双齿的ζ-ITAM肽的模拟物(Vu，2000)；单齿化合物(Vu，2000)；类肽(peptoid)(Vu，2000)；异噻唑酮(isothiazolone)化合物(Trevillyan等人，1999)；噻氨酯哒唑(Huby等人，1998)；甲基-3-(N-异噻唑酮)-2-噻吩羧酸盐(Trevillyan等人，1999)。
e)和s)Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的刺激物
刺激性化合物的例子包括活性Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质、编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的表达载体和特异刺激Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2活性的化学试剂。
优选的刺激性化合物至少是一种编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的核酸分子，其中该核酸分子以适合于Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2蛋白质在被试者细胞中的表达的形式引入到被试者中。例如，将Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA(全长或部分的Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA序列)克隆入重组表达载体中并用标准的分子生物学技术将该载体转染入细胞中。Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA可通过如用聚合酶链反应(PCR)的扩增或通过筛选适当的cDNA文库而获得。Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA的核苷酸序列为本领域中已知，并可用于设计用标准PCR方法能扩增cDNA的PCR引物，或者用于设计杂交探针，该探针可用于用标准杂交方法筛选cDNA文库。在Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2 cDNA分离或扩增之后，如上所述将DNA片段引入到一种或多种适当的表达载体中。可使用带有Syk和NFAT1或ZAP-70和NFAT2编码序列两者的单一载体，或者使用两个单独的载体。以适合于Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2在宿主细胞中表达的形式编码Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的核酸分子可如前文所述用本领域中公知的核苷酸序列来制备。该核苷酸序列可用于设计用标准PCR方法能够扩增cDNA的PCR引物，或者用于设计杂交探针，该探针可用于用标准杂交方法筛选cDNA文库。
在细胞中刺激Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2表达的刺激性化合物的另一种形式是特异性刺激细胞中内源Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2表达或活性的化学化合物。双过氧化钒(bisperoxovanadium)(bpV)是Zap-70刺激物的一个例子。
刺激性化学化合物可用筛选测定进行鉴定，该测定筛选刺激Syk、ZAP-70、NFAT1或NFAT2的表达或活性的化合物。
f)和t)IL-4和IL-2刺激佐剂
根据本发明的IL-4刺激佐剂可选自A组：
磷酸铝
氢氧化铝
铝胶
磷酸钙
霍乱全毒素
霍乱毒素B亚基
再水化凝胶(rehydragel)HPA/LV
聚磷腈
优选地，A组佐剂是铝胶或磷酸钙。该A组佐剂也指Th2细胞刺激佐剂。
根据本发明的IL-2刺激佐剂可选自B组：
Avridine
嵌段共聚物P1205和可能的其他嵌段共聚物
苏氨酰-MDP
Specol(Marcol 52、Span 85、Tween 85)
QS-21
CpG分子
非离子表面活性剂小泡
Murapalmitine
Murametide
MPL(单磷酰脂质A)
大肠杆菌(E coli)不稳定外毒素
γ菊粉
弗氏完全佐剂
弗氏不完全佐剂
优选地，B组佐剂是CpG分子或MPL(单磷酰脂质A)。该B组佐剂也指Th1细胞刺激佐剂。
通常，根据本发明的IL-4刺激佐剂可为任何佐剂，该佐剂引起的细胞因子反应比上述任何B组佐剂引起的细胞因子反应更倾斜于Th2细胞。
同样地，根据本发明的IL-2刺激佐剂可为任何佐剂，该佐剂引起的细胞因子反应比上述任何A组佐剂引起的细胞因子反应更倾斜于Th1细胞。
g)和u)物质a)-f)和o)-t)的衍生物、类似物或部分
物质a)-f)和o)-t)的衍生物、类似物或部分可为现有技术中公知的衍生物、类似物或部分。例如，当活性物质是蛋白质时，可使用具有至少部分保守功能的蛋白质部分。特别地，当活性物质是抗体时，可使用包含至少部分其特异性的抗体分子部分。
药物组合物
如上所述，用于本发明的活性物质理论上可为有机物质、肽、蛋白质和核酸。依赖于所用的活性物质的类型，可将该活性物质制备于任何现有技术中公知的药物组合物中，该组合物包括用于注射和口服、肠胃外的、肺的和鼻的给药的药物组合物。
口服组合物包括片剂、胶囊、药丸、药片或药糖块、扁胶囊(cachet)或丸。
药物组合物可包括任何现有技术中公知的药物学可接受的赋形剂，该赋形剂包括稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、着色剂、调味剂、分解剂、粘合剂、抗摩擦剂、助流剂、表面活性剂、佐剂和/或载体，如描述于第18版Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)中的。
治疗方法
优选，本发明的药物组合物通过肠胃外注射给药或粘膜给药。局部给药优选全身给药以避免SDF-1α的任何不想要的副作用。在这一点上，“局部给药”的表达指局部的给予或局部注射。“局部注射”指在这种注射中，其活性物质的全身散布少于50％，优选地为40％，更优选地为30％，更优选地为20且最优选地为10％。
本发明的治疗方法可在体外或体内实施(后者在下面的分段中进一步讨论)。为了在体外实施该方法，可从被试者中通过标准的方法获得细胞并在体外与本发明的药物组合物进行温育(即培养)。
例如，可从被试者中分离淋巴样细胞，在体外用本发明的调节剂进行处理，然后再次施予相同的被试者组织，或者另一个与细胞供体相容的被试者组织。因此，在另一个实施方案中，本发明的调节方法包含在体外用活性物质(调节物)培养细胞，并进一步包含将细胞施用于被试者，从而在被试者中调节Th1/Th2细胞比例。对于向被试者施用细胞，优选在将它们给予被试者之前首先从细胞中去除培养物中的残余化合物。这可通过如细胞的梯度离心或通过洗涤细胞而完成。对于在再次给予被试者之后细胞的离体遗传修饰，也参见W.F.Anderson等人的美国专利No.5,399,346。
在另一个实施方案中，活性物质在体内给予被试者。对于包含核酸(如编码活性物质的重组表达载体)的刺激剂或抑制剂，可用本领域中公知的在体内将核酸(如DNA)引入到细胞中的方法将该化合物引入到细胞中。这种方法的例子包括：
直接注射：裸DNA可通过直接将DNA注射到细胞中而在体内引入到细胞中(参见如Acsadi等人(1991)Nature 332：815-818；Wolff等人(1990)Science 247：1465-1468)。例如，可使用在体内将DNA注射入细胞中的递送仪器(如“基因枪”)。这种仪器可购得(如购自BioRad)。
受体介导的DNA摄入：裸DNA也可通过将DNA复合入阳离子如聚赖氨酸而在体内引入到细胞中，该阳离子与细胞表面受体的配体偶联。DNA-配体复合物与受体的结合促进由受体介导的胞吞作用导致的DNA的摄入。可使用结合腺病毒衣壳的DNA-配体复合物以避免该复合物由细胞内溶酶体导致的降解，该衣壳天然破坏内体(endosome)并因而将物质释放到胞质体中。
反转录病毒：缺陷型反转录病毒用于基因治疗目的的基因转移已经得到良好的鉴定(综述参见Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。可构建重组反转录病毒，该病毒具有插入到反转录病毒基因组中的核苷酸序列。此外，可将反转录病毒基因组的部分去除以使得反转录病毒的复制有缺陷。然后将复制缺陷型反转录病毒包装入病毒体中，该病毒可用于由标准技术应用辅助病毒感染目标细胞。生产重组反转录病毒和在体外或体内用这种病毒感染细胞的流程可见于Ausubel，F.M.等人(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)的CurrentProtocols in Molecular Biology中的9.10-9.14章节和其他的标准实验室手册中。适当的反转录病毒的例子包括本领域的技术人员众所周知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。适当的包装病毒系的例子包括Y Crip、yCre、y2和yAm。已将反转录病毒用于在体外和/或在体内将多种基因引入到许多不同的细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞。反转录载体需要目标细胞分裂以使得反转录病毒基因组(和插入到其中的外源核酸)整合入宿主基因组中，从而稳定地将核酸引入到细胞中。因而，必需的是刺激目标细胞的复制。
腺病毒：可对腺病毒基因组进行处理，从而它编码并表达目标基因产物，但在其以正常的裂解病毒生活史进行复制的能力方面是失活的。源自腺病毒品系Ad型5 d1324或其他腺病毒株(如Ad2、Ad3、Ad7等)的适当腺病毒载体对于本领域的技术人员是众所周知的。重组腺病毒载体的优点在于它们不需要分裂细胞而成为有效的基因递送载体，且可用于感染多种细胞类型，包括呼吸道上皮细胞、内批细胞、肝细胞和肌肉细胞。此外，引入的腺病毒DNA(和在其中含有的外源DNA)不整合入宿主细胞的基因组中，而是停留于附加体中，从而避免当插入的DNA整合入宿主基因组(如反转录病毒DNA)时插入诱变导致的潜在问题。此外，腺病毒基因组对外源DNA的携带能力相对于其他基因递送载体较大(达8千碱基对)。大多数目前所用的复制缺陷型腺病毒载体删除了全部或部分的病毒E1和E3基因，但保留了多达80％的腺病毒遗传材料。
腺相关病毒：腺相关病毒(AAV)是天然存在的缺陷型病毒，该病毒必需其他病毒如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒以进行有效的复制和生产性的生活史。它也是可将其DNA整合入非分裂细胞中的少数病毒之一，且展示高频率的稳定整合。含有AAV的少至300个碱基对的载体会进行包装并可整合。外源DNA的空间限于约4.5kb。如在Tratschin等人(1985)的Mol.Cell.Biol.5：3251-3260中描述的AAV载体可用于将DNA引入到细胞中。已用AAV载体将多种核酸引入到不同细胞类型中。
具体的表达载体系统的效率和将核酸引入到细胞中的方法可通过常规地用于本领域中的标准方法进行估计。例如，引入到细胞中的DNA可通过滤膜杂交技术(如DNA印迹)来检测，且RNA可通过如RNA印迹、RNase保护或逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)来检测。基因产物可通过适当的测定进行检测，如通过对生产的蛋白质的免疫学检测如用特异性的抗体，或者通过功能测定来检测基因产物的功能活性，如酶测定。
诊断检验试剂盒
诊断检验试剂盒包含对于要测量的每一种化合物的一种或多种探针。作为探针，可使用任何已知的可结合要测量的化合物，即磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内的NFAT1或核内的NFAT2的探针，如抗体、核酸、其片段等。该探针可用如标记物进行标记。
或者，该试剂盒可包含检测系统。作为检测系统，可使用任何已知的检测系统。优选，该检测系统包含能够结合探针的检测试剂且包含标记化合物。这种检测系统的例子是抗探针的标记的抗体。
定义
关于本发明，术语“X的刺激物”指不管涉及何种机制，直接或间接刺激X的表达和/或活性的任何试剂。
关于本发明，术语“X的抑制剂”指不管涉及何种机制，直接或间接抑制X的表达和/或活性的任何试剂。
术语“Th1细胞”指能够分泌IL-2和IFNγ的任何CD4+T辅助1细胞。
术语“Th2细胞”指能够分泌IL-4和IL-5的任何CD4+T辅助2细胞。
表述“Th1细胞相关疾病”指任何疾病，在其中Th1细胞支持、导致或介导疾病进程或在其中Th1细胞参与治愈或减轻疾病的症状。
表达“Th2细胞相关疾病”指任何疾病，在其中Th2细胞支持、导致或介导疾病进程或在其中Th2细胞参与治愈或减轻疾病的症状。
术语“病原物质”指在被试者中引起疾病的任何物质。
术语“抗原”指在被试者中引起免疫学疾病的任何物质。
“免疫学疾病”的表述指由免疫学反应系统所支持的任何疾病。
“核内NFAT1”和“核内NFAT2”的表述分别指存在于T淋巴细胞细胞核内的NFAT1和NFAT2。
术语“佐剂”指非特异性地增强对抗原的免疫反应的任何物质。
表述“反义核酸分子”指形式为DNA、RNA、PNA、LNA或硫代磷酸或其衍生物、类似物或片段的核酸分子，该核酸分子能够减量调节由与反义核酸互补的核酸编码的特定蛋白质的表达。
表述“减小Th1/Th2比例”指减少Th1细胞的水平和/或增加Th2细胞的水平。相应地，表述“增大Th1/Th2比例”指增加Th1细胞的水平和/或减少Th2细胞的水平。
缩写
IL-2：白细胞介素2
IL-4：白细胞介素4
SDF-1α：基质细胞衍生因子-1α
Syk：Syk酪氨酸激酶
ZAP-70：ZAP-70酪氨酸激酶(ζ链相关的蛋白质70kD)
Cbl：casitas B-谱系淋巴细胞
Cbl-b：casitas B-谱系淋巴细胞-b区
NFAT：活化的T细胞的核因子
TCR：T细胞受体
CXCR4：CXC受体4
DNA：脱氧核糖核酸
RNA：核糖核酸
PNA：肽核酸
LNA：锁定的(locked)核酸
实施例
实施例1
材料与方法
细胞
来自无并发症的分娩的脐带血的CD4+T细胞是如在别处所描述的进行纯化的(Jinquan等人，1997)。简单地，单核细胞是用Ficoll-Hypaque(Nycomed，Oslo，挪威)从肝素化的脐带血中分离。CD4+T细胞根据生产商的说明书用Dynabeads(Dynal A/S，挪威)进行纯化。用流式细胞仪测量的CD4+T细胞纯度≥96％。所有的血清IgM均在可检测的水平之下。
细胞因子的细胞内免疫荧光染色
如在别处所描述的(Chalmers等人，1998)，根据生产商的说明书将细胞在PBS中洗涤两次，然后用IntraPrep(Coulter-ImmunoTech，Miami，Florida，美国)进行混合和透化处理。对于细胞内IL-4染色，然后在室温将细胞与初级小鼠抗人IL-4mAb(10μg/ml，R&D Systems，Oxon，英国)温育15分钟。将细胞洗涤两次，并在室温用FITC-缀合的山羊抗小鼠抗体染色15分钟。对于第二细胞因子的染色，将染色的细胞在室温与小鼠IgG(300μg/ml)温育30分钟以封闭山羊抗小鼠抗体的自由结合位点。对于第二细胞内细胞因子IFN-γ的染色，然后在室温将细胞与初级小鼠抗人IFN-γmAb(10μg/ml，R&D Systems，Oxon，英国)温育15分钟。将细胞洗涤两次，并在室温用PE-缀合的山羊抗小鼠抗体染色15分钟。将细胞洗涤并在含有0.5％甲醛的PBS中重悬以进行FACS分析。
免疫沉淀
如在别处所描述的(Tamura等人，1995)，将细胞(5×106)溶解于1ml冷的TNE缓冲液中，该缓冲液由50mM Tris-HCL(pH8.0)、150mM NaCl、含有20mM EDTA的1％(v/v)乙基苯基聚乙二醇(NonidetP-40)、10μg/ml抑蛋白酶肽、0.4mM钒酸钠和10mM焦磷酸钠组成。将细胞裂解产物与10,000×g离心5分钟并用蛋白质G-琼脂糖凝胶将上清液进行预清除。然后于4℃将水解产物与5μg的兔抗-Syk(c-20)、兔抗-ZAP-70(LR)、山羊抗-Cbl(C-15)或山羊抗-Cb1-b(C-20)(均购自Santa Cruz BioTech.Inc.，Santa Cruz，CA，美国)温育1小时，并将免疫复合物用蛋白质G-琼脂糖凝胶进行沉淀。为进行印迹，将免疫混合物用TNE缓冲液洗涤5次。
免疫复合物激酶测定
如在别处所描述的(Tamura等人，1995)，将用蛋白质G-琼脂糖凝胶沉淀的免疫复合物用TNE缓冲液洗涤4次并用激酶缓冲液(50mMHEPES-NaOH，pH7.4和10mM MnCl2)洗涤4次。将免疫沉淀在20μl含有10μCi[γ-32P]ATP的激酶缓冲液中悬浮并与30℃温育30分钟。该反应通过加入15μl 3×的样品缓冲液(195mM Tris-HCl，pH6.8、9％SDS、15％2-ME和30％甘油)而进行终止。然后将混合物煮沸5分钟，并在还原的条件下进行8％的SDS-PAGE，随后进行放射自显影。
免疫印迹
如在别处所描述的(Tamura等人，1995)，将免疫沉淀中的蛋白质在还原条件下用SDS-PAGE进行解析，然后转移到聚偏二氟乙烯微孔膜上(Schleicher & Schuell Life Science，Dassel，德国)。将膜在5％的BSA-TBS(20mM Tris-HCl，pH7.5和150mM NaCl)中进行封闭，然后用抗-Syk、抗-ZAP-70、抗-Cbl或抗-Cbl-b进行温育。免疫印迹用[γ-125I]蛋白质A(NENLife Science Products，Inc.，Boston，MA，美国)进行温育。温育之后，将膜用TBS进行洗涤并随后进行放射自显影。
肽核酸(PNA)反义测定
如在前文所描述的，并做了修改(Norton等人，1996)，将纯化的CB T细胞用缓冲的溶液进行透化，该缓冲的溶液含有相对低浓度的去污剂(20mM Tris-HCL，pH8.3、1.5mM MgCL2、68mM KCL、0.05％Tween 20、1mM乙烯双(氧化乙烯-次氮基)四乙酸、5.0％甘油和0.1mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟)。然后将细胞在2μM反义PNA(PE Applied Biosystems，Foster City，美国)存在时于RPMI中与10％的FCS进行培养，在所示的时间内有或无刺激。所用的PNA序列如下：
反义Syk   (933)5’-ATTTTTTGACATGGGA-3’(918)(SEQ ID NO.01)
反义ZAP-70(738)5’-GTTTGCGCTCGGCCTC-3’(723)(SEQ ID NO.02)
对于其他的测定，在程序之前将细胞充分洗涤。
实时定量的反转录(RT)-PCR测定
所有实时定量的RT-PCR实验都如在别处所描述的那样进行(Heid等人，1996；Kruse等人，1997)。简单地，来自CB T细胞(2×106)的总RNA用Quick PrepTotal RNA Extraction Kit(PharmaciaBiotech，美国)进行制备，并根据生产商的说明书将任何潜在的污染染色体DNA用DNAse I进行消化。对于反转录，根据生产商的说明书将RNA用12-18寡聚的脱氧胸苷酸和Superscript II反转录酶(LifeTechnologies，Grand Island，美国)进行反转录。反转录于37℃进行60分钟，且任何潜在的污染蛋白质通过于95℃温育10分钟进行变性。定量的PCR根据生产商的说明书在ABI PRISM 7700 SequenceDetector Systems(PE Applied Biosystems)上以96孔的微量滴定板(PE Applied Biosystems，Foster City，美国)的形式在特殊的光学管中进行。通过使用SYBRGreen PCR Core Reagents Kit(PerkinElmer Applied Biosystems，P/N 4304886)，在每一个PCR循环中经由AmpliTaq Gold(Kruse等人，1997)的5’到3’的内切核酸酶活性生成荧光信号以提供实时定量性PCR信息。使用了下面γIFN和IL-4的特定引物的序列(DNA Technology，Aarhus，丹麦)：
γIFN有义：   5’-TGTAAGCCCCCAGAAACAGAAAG-3’
γIFN反义：   5’-TTGCCCATCAAGAAACAGCAG-3’
IL-4有义：    5’-TCACTCTTCACTCTTTTCTTCCCC-3’
IL-4反义：    5’-TCTTCCCACTTTGCTGTTCCTC-3’
这些寡核苷酸序列用软件Primer Express TM 1.0(PE AppliedBiosystems)进行设计。它们跨过外显子接头以防止基因组DNA的扩增。使用含有Passive Reference 1(ROX)的Taqmanuniversal PCRmaster mix(PE Applied Biosystems)来使荧光信号中非-PCR-相关的波动归一化。将具有已知量的分子的标准DNA模板(每孔1.0×103、2.0×103、4.0×103、1.0×104、2.0×104、1.0×105个)和“无模板”对照用于生成标准曲线。将所有未知的cDNA稀释到含有相同量的β-肌动蛋白cDNA。将标准物、“无模板”对照和未知的样品以每个反应总体积50μl来添加。PCR保持条件为50℃2分钟，95℃10分钟，以95℃15秒，60℃60秒的40个循环进行每次扩增。潜在的PCR产物污染通过尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)进行消化，这是由于dTTP被dUTP替代了(Kruse等人，1997)。所有的PCR实验均以热启动进行。在反应系统中，根据生产商的说明书应用UNG和AmpliTaq Gold(PE Applied Biosystems)(Heid等人，1996；Kruse等人，1997)。为了分析PCR产物的数据，将两个术语用于表述结果：ΔRn代表归一化的报告信号减去在最初少量循环的PCR中确立的基线信号；CT(阈值循环)代表其中基线以上报告分子荧光信号的增加可首先被检测到的PCR循环。
电泳迁移率变动分析(EMSA)
核提取物如McCaffrey所述进行制备(McCaffrey等人，1992；Aramburu等人，1995)。简而言之，向细胞中(5×106)先加入400μl冰冷的Dignam缓冲液A，然后加入25μl 10％NP-40。涡旋处理细胞并离心(9000rpm，30秒，4℃)。使沉淀的核在50μl Dignam缓冲液C中裂解，离心(12,000rpm，10分钟，4℃)，并将结果所得的上清液用Dignam缓冲液D进行稀释(1∶1)。将双链合成寡核苷酸DNA探针用[γ-32P]ATP(5.000Ci/mmol)和T4多核苷酸激酶(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，英国)进行末端标记。所用的寡核苷酸探针(5’到3’，一条链)为(Jain等人，1993；McCaffrey等人，1993)：人IL-2远侧NFAT位点(NFAT hulL-2)GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGG(结合序列加下划线)。EMSA反应在室温以25μl的终体积进行。核提取物(每反应体积3μg蛋白质)在结合缓冲液中温育15分钟(Aramburu等人，1995)，随后加入0.5ng 30P-标记的探针反应15分钟，并使样品在0.25TBE缓冲液中的非变性的5％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。在一些实验中，用于凝胶阻滞的mAb或pAb(均以10μg/ml)与核提取物在冰上温育30分钟。
结果
结果示于表1、2和3及图1A、1B、1C、1D、2A、2B、3A、3B、3C和3D中。
将CB CD4+ T细胞转变为Th1和Th2细胞
表1：用流式细胞仪对细胞内Th1和Th2细胞因子的检测
第1天 第2天 第4天 第8天
刺激a                  IFN-γIFN-γb IL-4    +IL-4                 IFN-γIFN-γ     IL-4    +IL-4                 IFN-γIFN-γ     IL-4    +IL-4                 IFN-γIFN-γ     IL-4    +IL-4
IL-2+SDF-1αIL-4+SDF-1αIL-2+SDF-1α+AbcIL-4+SDF-1α+AbIL-2+SDF-1α+1dIL-4+SDF-1α+1 11.4b   13.6    18.89.7      9.9     6.214.2     6.7     14.99.2      2.8     21.216.7     9.8     11.25.6      12.3    11.0 35.4    0.9     8.40.1     21.1    0.418.0    6.6     2.814.2    0.5     5.433.9    0.5     5.55.5     23.1    5.6 60.9    5.0     3.56.2     62.2    6.94.7     13.1    14.911.2    29.1    15.859.3    16.8    3.712.9    57.2    7.8 84.0    0.2     0.40.1     90.3    0.10.4     1.6     9.52.8     0.6     12.385.3    0.1     0.23.9     84.3    2.5
新分离的 8.5      12.1    9.7 N.D.e  N.D.    N.D. N.D.    N.D.    N.D. N.D.    N.D.    N.D.
表1：用流式细胞仪对细胞内Th1和Th2细胞因子的检测。a：用IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合对CB T细胞进行刺激，如在材料与方法中所描述的细胞内细胞因子测定之前所显示的。b：表中所列的数字是如在材料与方法中所描述的用细胞内细胞因子测定所检测的百分数。Th1和Th2细胞因子是IFN-γ、IL-4或IFN-γ和IL-4。c：5μg/ml的CXCR4小鼠mAb。d：5μg/ml的与CXCR4小鼠mAb匹配的同种型Ig。e：N.D.未确定。所列的数据来自所进行的5个实验中的一个代表实验。
如在表1中所示的数据中所显示的，来自正常CB的CD4+T细胞似乎是显示天然Th模式的“未分化的和未接触过抗原的”。在新鲜分离的CB CD4+T细胞中，IFN-γ和IL-4双阳性为9.7％，而IFN-γ或IL-4单阳性分别为8.5％或12.1％。在用IL-2和SDF-1α刺激8日之后，根据IFN-γ的表达细胞被转变为Th1模式(84％)，而用IL-4和SDF-1α的刺激导致CB T细胞表达Th2模式(90.3％)。单独的IL-2、IL-4和SDF-1α或IL-2和IL-4的组合均不显示这种功能(数据未显示)。在用IL-2或IL-4以及SDF-1α一起刺激的CB CD4+T细胞和8日内无刺激培养的CB CD4+T细胞之间的细胞增殖方面未观察到显著的差异，如由[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷插入DNA的测定所检测的(我们未发表的结果)。无刺激培养的细胞在8日中细胞内细胞因子表达方面未观察到任何显著的变化(数据未显示)。有趣的是，CXCR4 mAb可显著地阻断这种转变，而同种型Ig却不可以。此外，CD3 mAb已用于替代SDF-1α来刺激CB T细胞，在其中我们未能诱导这种模式转变(数据未显示)。
表2：IFN-γ和IL-4的mRNA表达
刺激物  IFN-γ       IL-4
 Ct    拷贝       Ct        IL-4
IL-2+SDF-1α                                           18.9  1.0×104                                24.7      3.6×102IL-4+SDF-1α                                           27.4  7.8×101                                19.1      1.3×104新鲜的                          23.5  7.3×102                                 21.7      2.1×103
表2：CB T细胞中IFN-γ和IL-4的cDNA的实时检测和扩增。使用10ng/ml的IL-2和IL-4，并使用100ng/ml的SDF-1α。所示的值是所进行的4个相似实验的代表。
也由实时定量RT-PCR检查了CB T细胞中IFN-γ和IL-4的mRNA表达。如在表2中所示的，在新鲜分离的CB T细胞中约有7.3×102个拷贝的IFN-γ，在用IL-2和SDF-1α刺激8日的细胞中有1.0×104个拷贝的IFN-γ，且在用IL-4和SDF-1α刺激8日的细胞中有7.8×101个拷贝的IFN-γ。同样如表2所示的，在新鲜分离的CB T细胞中约有2.1×103个拷贝的IL-4，在用IL-2和SDF-1α刺激8日的细胞中有3.6×102个拷贝的IL-4，且在用IL-4和SDF-1α刺激8日的细胞中有1.3×104个拷贝的IL-4。在标准DNA模板或目标cDNA(IFN-γ和IL-4)的CT和对数起始质量(log starting quality)之间已检测到线性关系(数据未显示)。相关系数≥0.99。
Syk或ZAP-70的持久活化是必须的
图1显示CB T细胞中Syk(A)、ZAP-70(B)、Cbl(C)和Cbl-b(D)激酶的活化。该细胞为新鲜分离的或者用所示的IL-2(10 ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激的。KA代表免疫复合物激酶测定，IB代表免疫印迹。将细胞刺激所示的不同的时间间隔、裂解并用如在材料与方法中描述的兔抗-Syk pAb、兔抗-ZAP-70pAb、山羊抗-Cbl pAb或山羊抗-Cbl-b pAb进行免疫沉淀。使免疫沉淀物进行激酶反应或用如在材料与方法中描述的各抗体进行免疫印迹。最左边的泳道为单独使用抗体的。
如在图1中所示的，IL-2和SDF-1α一起在30分钟内诱导Syk激酶的活化。用IL-2和SDF-1α刺激的在4日和8日已观察到SyK激酶的强且持久的磷酸化，而与新鲜分离的CB T细胞中的水平相比，IL-2和IL-4的组合或IL-4和SDF-1α的组合均不诱导Syk激酶活化(图1A)。相反地，IL-4和SDF-1α一起在30分钟内已诱导了ZAP-70激酶的磷酸化。用IL-4和SDF-1α刺激的在4日和8日已观察到ZAP-70激酶的强且持久的磷酸化，而与新鲜分离的CB T细胞中的水平相比，IL-2和IL-4的组合或IL-2和SDF-1α的组合均不诱导ZAP-70激酶活化(图1B)。在将正常兔血清用于免疫沉淀测定的泳道中未观察到条带(数据未显示)。
此外，已研究了CB T细胞中连接物蛋白质Cbl和Cbl-b的活化。如在图1C和1D中所示的，在新鲜分离的CB T细胞中无可检测的Cbl和Cbl-b激酶活性。IL-2和SDF-1α一起在30分钟内诱导了Cbl强的活化。用IL-2和SDF-1α刺激的在4日和8日已观察到Cbl激酶活性减弱的模式，而用IL-4和SDF-1α刺激的在4日和8日已观察到Cbl激酶活性增强的模式(图1C)。相反地，IL-2和SDF-1α一起在30分钟内诱导了Cbl-b激酶弱的活化。用IL-2和SDF-1α或IL-4和SDF-1α刺激的在4日和8日已观察到Cbl-b激酶强且持久的活化(图1D)。由于报道认为Cbl和Cbl-b对ZAP-70激酶具有相反的作用，所以它们的调节作用的最终结果依赖于两种激酶之间活性的平衡。在将山羊血清用于免疫沉淀测定的泳道中未观察到条带(数据未显示)。
图2显示PNA Syk和PNA ZAP-70反义物对Syk激酶和ZAP-70激酶活化的阻断作用。在A和B中，细胞为纯化的CB T细胞，该细胞在进一步测定之前进行了透化处理，并如材料与方法中所述在PNA反义物存在或不存在时与其他刺激物培养8日。如关于图1所描述的，然后将细胞裂解、进行免疫沉淀并进行激酶反应(KA)或免疫印迹(IB)。最左边的泳道为单独使用抗体的。
为了证实上述观察，已进行了PNA反义物测定。Syk PNA反义物和ZAP-70 PNA反义物也分别在8日内显著地抑制培养物中未被刺激的CBT细胞中Syk和ZAP-70的激酶活性和蛋白质表达(图2)。Syk PNA反义物可在1日内显著地减少Syk激酶的活性(数据未显示)，并在(IL-2+SDF-1α)-和(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞中于8日内完全消除Syk激酶活性(图2A)。Syk蛋白质的总量也急剧减少了。同样，ZAP-70 PNA可在1日内显著地减少ZAP-70激酶的活性(数据未显示)，并在(IL-2+SDF-1α)-和(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞中于8日内完全消除ZAP-70激酶活性(图2B)。ZAP-70蛋白质也完全消除了。在将兔血清用于免疫沉淀测定的泳道中未观察到条带(数据未显示)。
表3：IFN-γ和IL-4的mRNA表达：
Syk PNA和Zap-70PNA的作用
刺激物 IFN-γ   IL-4
Ct    拷贝   Ct    IL-4
Syk PNA+IL-2+SDF-1α                                                            23.1   4.5×102                 25.6  3.6×102Zap-70PNA+IL-2+SDF-1α                                                       16.6   1.1×105                 24.7  8.5×102Syk PNA+IL-4+SDF-1α                                                           22.4   1.2×103                 18.9  1.9×104Zap-70PNA+IL-4+SDF-1α                                                       25.1   1.4×102                 26.1  6.1×101
表3：CB T细胞中IFN-γ和IL-4的cDNA的实时检测和扩增。使用10ng/ml的IL-2和IL-4，并使用100ng/ml的SDF-1α。所示的值是所进行的4个相似实验的代表。
类似地，Syk PNA反义物引人注目地抑制由IL-2和SDF-1α诱导的IFN-γ mRNA的表达(4.5×102个拷贝)(表3)，而它不显著改变由IL-4和SDF-1α诱导的IFN-γ mRNA的表达(1.2×103个拷贝)。相反地，ZAP-70PNA反义物没有这种抑制由IL-2和SDF-1α诱导的IFN-γ mRNA的表达(1.1×105个拷贝)的能力，而它也不显著地改变由IL-4和SDF-1α诱导的IFN-γ mRNA的表达(1.4×102个拷贝)。同样类似地，ZAP-70 PNA反义物引人注目地抑制由IL-4和SDF-1α诱导的IL-4 mRNA的表达(6.1×101个拷贝)(表3)，而它不显著改变由IL-2和SDF-1α诱导的IL-4 mRNA的表达(1.8×102个拷贝)。相反地，Syk PNA反义物没有这种抑制由IL-4和SDF-1α诱导的IL-4mRNA的表达(1.9×104个拷贝)的能力，而它也不显著地改变由IL-2和SDF-1α诱导的IL-4 mRNA的表达(8.5×102个拷贝)。Syk PNA反义物和ZAP-70 PNA反义物也分别在8日内显著地抑制培养物中未被刺激的CB T细胞中IFN-γ和IL-4的mRNA的表达(数据未显示)。实时mRNA定量实验的相关系数≥0.97。总之，这些结果显示Syk激酶活化对由IL-2和SDF-1α诱导的Th1细胞转变是必须的，且ZAP-70激酶活化对由IL-4和SDF-1α诱导的Th2细胞转变是必须的。
NFAT1或NFAT2的持久活化也是重要的
图3显示CB T细胞中NFAT在IL-2(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)和SDF-1α(100ng/ml)的不同组合刺激下的活化和鉴定。试验的材料为核提取物(A、C和D)或全细胞提取物(B)。该细胞为新鲜分离的或在所示各时间间隔用不同刺激物进行刺激的。NFAT活化通过如材料与方法中所述用32P-标记的NFAT hulL-2探针的EMSA进行测定。在A和B中，显示了NFAT的位置。NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4存在性的鉴定通过用针对NFAT1或/和NFAT2(C)或针对NFAT3或/和NFAT4(D)的Ab和如材料与方法中描述的凝胶阻滞测定中的EMSA来分析。在加入32P-标记的NFAT hulL-2探针之前，使同样的等份试样样品在以下情况进行温育：没有(-)或有同种型小鼠IgG或山羊血清(i)、小鼠NFAT1 mAb(1)、小鼠NFAT2 mAb(2)、NFAT1 mAb加NFAT2 mAb(1.2)、或者山羊NFAT3 pAb(3)、山羊NFAT4 pAb(4)、NFAT3 pAb加NFAT4 pAb(3.4)，结合到32P-标记的NFAT hulL-2探针上的NFAT和在特定的Ab存在时诱导的凝胶阻滞分别用下和上箭头显示。
为了进一步阐明在Syk或ZAP-70活化之后的下游事件，我们下一步研究了(IL-2+SDF-1α)-或(IL-4+SDF-1α)-诱导的CB T细胞中NFAT的活化。在图3A中，在新鲜分离的CB T细胞的核提取物中无可检测的NFAT。在用IL-2+SDF-1α、IL-4+SDF-1α或IL-2+IL-4刺激30分钟之后，在CB T细胞核提取物中检测到了NFAT hulL-2，这显示用这些组合的刺激可诱导NFAT的活化，该活化确保CB T细胞中NFAT的转位。然而，IL-2+IL-4在NFAT从细胞质向细胞核的转位方面仅诱导弱的NFAT的活化。(IL-2+SDF-1α)或(IL-4+SDF-1α)刺激在第1日、4日和8日中诱导了强且持久的NFAT活化，而该现象在用(IL-2+IL-4)刺激的CB T细胞中未观察到(图3A)。相反地，在CB T细胞的全细胞提取物中有几乎相等的NFAT蛋白质，该CBT细胞或者为新鲜分离的，或者为用不同的组合刺激的(IL-2+SDF-1α、IL-4+SDF-1α或IL-2+IL-4)(图3B)，从而显示不同组合的刺激仅诱导NFAT的活化，但不诱导NFAT的新合成。在图3C中，在用IL-2和SDF-1α刺激8日之后用NFAT hulL-2探针在CB T细胞的核提取物中检测到了NFAT复合物。该复合物已用抗-NFAT1 mAb进行了凝胶阻滞。同种型小鼠抗体或抗-NFAT2 mAb均不能影响(IL-2+SDF-1α)-刺激的CB T细胞的核提取物中NFAT复合物的相对迁移率。相反地，在用IL-4和SDF-1α刺激后的CB T细胞的核提取物中NFAT复合物已由抗-NFAT2 mAb进行了凝胶阻滞。同种型小鼠抗体或抗-NFAT1mAb均不能影响(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞的核提取物中NFAT复合物的相对迁移率。这些结果证实了只有NFAT1而不是NFAT2存在于(IL-2+SDF-1α)-刺激的CB T细胞的核提取物中。这些结果也证实了只有NFAT2而不是NFAT1存在于(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞的核提取物中。在图3D中，在(IL-2+SDF-1α)-或(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞的核提取物中检测到的NFAT复合物根本未被抗-NFAT3 pAb或抗-NFAT4 pAb凝胶阻滞。这些结果证实NFAT3或NFAT4均不存在于(IL-2+SDF-1α)-或(IL-4+SDF-1α)-刺激的CB T细胞的核提取物中。
讨论
Th1和Th2细胞因子情况之间的平衡可修饰炎症位点的免疫反应(Coffman等人，1999)。例如，变应性炎症是Th2-相关的疾病(Casolaro等人，1996)。Th2细胞因子在变应性炎症过程的起始、发展、前进和终止中起基本的作用。对Th1和Th2细胞因子的表达和动力学的确定对于Th1-和Th2-相关疾病的诊断和预后是关键的。应该考虑的一个重要方面是Th1和Th2克隆首先从超免疫的小鼠中(O’Garra等人，1998)或在人的慢性疾病中(Romagnani等人，1994；Sher等人，1992)分离得到。迄今为止，人Th1和Th2 T细胞已从外周血、引流的(draining)淋巴结和受影响慢性感染性疾病和变态反应的组织中分离得到(Romagnani等人，1994)。尽管Th1和Th2细胞通过产生高水平的调节细胞因子来影响慢性疾病或病理学过程的能力勿庸置疑，但它们在何种数量程度上支配体内反应至今仍不明白(O’Garra等人，1998)。Th1和Th2亚类从相同的T细胞祖先发育而来，该祖先是成熟的原初CD4 +T细胞，其在抗原物异性的刺激下主要生产IL-2(O’Garra等人，1998)。确定Th1和Th2从该祖先分化的因子是在TCR连接阶段的免疫反应的起始时存在的细胞因子(Abbas等人，1996)。
目前显示IL-2或IL-4与SDF-1α的组合可将非-抗原-特异性的CB CD4+T细胞转变为Th1或Th2细胞的数据确定无疑地引出了下面的问题，即SDF-1α在Th1和Th2细胞形成的定向方面是否具有促细胞分裂原样的功能。如果没有，该问题可延伸为在Th1和Th2细胞形成中抗原特异性阶段是否绝对必需。类似于Th1和Th2形成的诱导，SDF-1α与IL-2或IL-4一起诱导Syk和ZAP-70激酶的持久和选择性活化，并随后导致信号转导系统的其他元件的下游活化，包括Cbl家族和NFAT家族。因而，这些数据似乎指出了另一途径，即一些趋化因子(SDF-1α)与Th导向的细胞因子一起可以选择性地起始另一个TCR-相关的酪氨酸激酶磷酸化，并随后激活包括调节物的下游元件，且信号转导中元件的这样一系列的活化和它们之间的平衡导致Th1或Th2极化的转变。该系统的示意性解释在图4中说明。
TCR-介导的信号转导对于T细胞发育是关键的。属于Syk激酶家族并与TCR相关的Syk和ZAP-70在表达和活性两方面均是不同的，尽管它们有明显的结构相似性(Chu等人，1998)。尽管有一些证据显示Syk家族中的激酶选择性地参与Th1和Th2细胞的活化(Tamura等人，1995；Faith等人，1999)，但是导致Th1和Th2细胞极化的信号途径至今尚不清楚。目前的研究提供了第一份证据表明由IL-2与SDF-1α诱导的持久的Syk激酶活化导致向Th1细胞的转变，而由IL-4与SDF-1α诱导的持久的ZAP-70激酶活化触发向Th2细胞的转变。因而，显然Syk和ZAP-70之间的差异不仅在表达和活性方面存在，而且在功能方面存在。趋化因子调节许多生物学过程，包括不同淋巴细胞的运输和骨髓祖先细胞的增殖。Th1和Th2细胞表达不同组的趋化因子受体。尽管有关于CXCR4和TCR之间通讯和相互调节的建议(Peacock等人，1999)，但目前的研究首先报道SDF-1α与IL-2或IL-4一起选择性地且特异性地诱导累积的且持久的Syk和ZAP-70激酶活化，并随后诱导Th1或Th2细胞的转变。
在Th1和Th2细胞发育的早期阶段，它们两者均是可相互转变的，但随着重复的刺激，两个群体变得不可逆了。该可逆性和稳定性的生物化学基础可为细胞因子基因的调节转录或细胞因子受体的表达(Abbas等人，1996)。一些研究人员认为前体Th细胞因抗原刺激和体内细胞因子环境而分化为Th1或Th2细胞。一些临床症状似乎不支持这种观点。例如，Th2细胞因子在其中起关键和支配作用的变应性哮喘可在数秒内发作，但在减轻的过程中，Th1和Th2细胞因子之间的平衡可合理地得到支持。基于目前的结果，可以假设休眠的Th细胞因抗原刺激和体内细胞因子刺激可完全且迅速转变为Th1或Th2细胞，该过程在早期阶段为局部发生的，而在晚期阶段为全身发生的。新生的孩子具有低水平的可触发的Th1和Th2细胞。这些细胞在天然Th细胞的发育中变为记忆Th1和Th2细胞。记忆Th1和Th2细胞在暴露于抗原之后可存在于体内，该细胞在细胞因子合成和分泌的数量和能力方面在正常条件下处于平衡状态。记忆Th1和Th2细胞，可能是遗传上“生病的”Th1和Th2细胞与其他免疫细胞如巨噬细胞一起在原位提供自分泌细胞因子环境，其中发生Th1-或Th2-极化的疾病。
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序列表
<110>ALK-ABELLO A/S
<120>通过调节TH1/TH2比例预防或治疗TH1和TH2细胞相关疾病的药物组合物
<130>P200001244
<140>
<141>
<160>2
<170>Patentln Ver.2.1
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：反义Syk激酶PNA序列
<300>
<312>2002-12-01
<400>1
attttttgac atggga                                              16
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：反义ZAP-70激酶PNA序列
<400>2
gtttgcgctc ggcctc                                              16

Claims (62)

1.一种通过减小Th1/Th2比例而预防或治疗人或动物中Th1细胞相关疾病的药物组合物，该组合物包含选自下列的活性物质：a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或h)物质a)-g)中的任何组合。
2.根据权利要求1的组合物，其中Th1细胞相关的疾病是感染性疾病。
3.根据权利要求1的组合物，其中Th1细胞相关的疾病是自身免疫性疾病。
4.根据权利要求1的组合物，其中Th1细胞相关的疾病是迟发型超敏反应。
5.根据权利要求1的组合物，其中Th1细胞相关的疾病是癌症。
6.根据权利要求1的组合物，其进一步包含引起要治疗的Th1-相关疾病的病原物质。
7.根据权利要求6的组合物，其中病原物质是引起感染性疾病的感染剂。
8.根据权利要求6的组合物，其中病原物质是抗原。
9.根据权利要求8的组合物，其中抗原是引起自身免疫疾病的自身抗原。
10.根据权利要求8的组合物，其中抗原是半抗原或引起迟发型超敏的变应原。
11.根据前面权利要求中任何一项的组合物，其中物质b)是IL-4或SDF-1α与其各自受体之间的结合的刺激物；或者是IL-4或SDF-1α受体表达的刺激物。
12.根据前面权利要求中任何一项的组合物，其中物质c)是IL-2或SDF-1α或其受体之一的抗体；对IL-2或SDF-1α或其受体之一具有结合亲和力的肽；一种低分子量化合物、一种游离的IL-2或SDF-1α受体；具有减小的对T细胞发挥其效应物功能的能力的IL-2或SDF-1α；或者IL-2或SDF-1α受体表达的抑制物。
13.根据前面权利要求中任何一项的组合物，其中物质d)是：i)一种反义核酸分子，ii)一种细胞内抗体，iii)一种Syk-或NFAT1-衍生的肽化合物，或iv)一种特异性抑制Syk或NFAT1的化学化合物。
14.根据权利要求13的组合物，其中反义链是DNA、RNA、PNA、LNA或硫代磷酸。
15.根据前面权利要求中任何一项的组合物，其中物质e)是活性ZAP-70或NFAT2蛋白质、编码ZAP-70或NFAT2的表达载体和特异性刺激ZAP-70或NFAT2活性的化学物质。
16.根据前面权利要求中任何一项的组合物，其中物质e)是双过氧化钒(bpV)。
17.根据前面权利要求中任何一项的组合物，其中物质f)是磷酸钙或铝胶。
18.一种药物组合物，其包含选自下列的活性物质：a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或h)物质a)-g)中的任何组合。
19.下列物质在制造通过减小Th1/Th2比例而预防或治疗Th1细胞相关疾病的药物的用途：a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或h)物质a)-g)中的任何组合。
20.一种通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关疾病的方法，该方法包含向被试者施用有效剂量的活性物质，该活性物质选自a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或h)物质a)-g)中的任何组合。
21.一种通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关疾病的方法，该方法包含从被试者取出T辅助细胞，使细胞与有效剂量的活性物质离体接触，该活性物质选自a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)IL-4刺激佐剂和SDF-1α，g)物质a)-f)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或h)物质a)-g)中的任何组合。
22.权利要求20或21的方法，该方法包含对要治疗的被试者或受体实施涉及对免疫系统操作的第二治疗。
23.根据权利要求22的方法，其中涉及对免疫系统操作的第二治疗选自疫苗接种、抗原特异性免疫治疗、变应原特异性免疫治疗、非特异性免疫治疗和器官移植。
24.一种通过增大Th1/Th2比例而预防或治疗人或动物中Th2细胞相关疾病的药物组合物，该组合物包含选自下列的活性物质：o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激性佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或v)物质o)-u)中任何组的组合。
25.根据权利要求24的组合物，其中Th2细胞相关疾病是变应性疾病。
26.根据权利要求25的组合物，其中变应性疾病选自枯草热、鼻结膜炎、鼻炎和哮喘。
27.根据权利要求24的组合物，其中Th2细胞相关疾病是癌症。
28.根据权利要求24的组合物，其进一步包含引起要治疗的Th2细胞相关疾病的病原物质。
29.根据权利要求28的组合物，其中病原物质是寄生生物或其部分。
30.根据权利要求28的组合物，其中病原物质是抗原。
31.根据权利要求30的组合物，其中抗原是引起变应性疾病的变应原。
32.根据权利要求24-31中任何一项的组合物，其中物质p)是IL-2或SDF-1α与其各自受体之间的结合的刺激物；或者是IL-2或SDF-1α受体表达的刺激物。
33.根据权利要求24-32中任何一项的组合物，其中物质q)是IL-4或SDF-1α或其受体之一的抗体；对IL-4或SDF-1α或其受体之一具有结合亲和力的肽；一种低分子量化合物、一种游离的IL-4或SDF-1α受体；具有减小的对T细胞发挥其效应物功能的能力的IL-4或SDF-1α；或者IL-4或SDF-1α受体表达的抑制物。
34.根据权利要求24-33中任何一项的组合物，其中物质r)是i)一种反义核酸分子，ii)一种细胞内抗体，iii)一种ZAP-70-或NFAT2-衍生的肽化合物或iv)一种特异性抑制ZAP-70或NFAT2的化学化合物。
35.根据权利要求34的组合物，其中物质r)是源自L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-高苯丙氨酸或L-丝氨酸的1，2，4-噁二唑类似物；双齿的ζ-ITAM肽的模拟物；单齿化合物；类肽；异噻唑酮化合物；噻氨酯哒唑；甲基-3-(N-异噻唑酮)-2-噻吩羧酸盐；编码ZAP-70的无催化活性突变体的DNA。
36.根据权利要求34的组合物，其中反义核酸分子是DNA、RNA、PNA、LNA或硫代磷酸。
37.根据权利要求24-36中任何一项的组合物，其中物质s)是活性Syk或NFAT1蛋白质、编码Syk或NFAT1的表达载体和特异性刺激Syk或NFAT1活性的化学物质。
38.根据权利要求24-37中任何一项的组合物，其中物质t)是CpG分子或MPL(单磷酰脂质A)。
39.一种药物组合物，该组合物包含选自下列的活性物质：o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或v)物质o)-u)中任何组的组合。
40.下列物质在制造通过增大Th1/Th2比例而预防或治疗Th2细胞相关疾病的药物中的用途：o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任一的功能衍生物、类似物或部分或v)物质o)-u)中任何组的组合。
41.一种通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关疾病的方法，该方法包含向被试者施用有效剂量的活性物质，该活性物质选自：o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或v)物质o)-u)中任何组的组合。
42.一种通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关疾病的方法，该方法包含从被试者取出T辅助细胞，使细胞与有效剂量的活性物质离体接触，该活性物质选自o)IL-2和SDF-1α，p)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，q)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，r)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，s)Syk或NFAT1的刺激物，t)IL-2刺激佐剂和SDF-1α，u)物质o)-t)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或v)物质o)-u)中任何组的组合。
43.权利要求41或42的方法，其包含对要治疗的被试者或受体实施涉及对免疫系统操作的第二治疗。
44.根据权利要求43的方法，其中涉及对免疫系统操作的第二治疗选自疫苗接种、抗原特异性免疫治疗、变应原特异性免疫治疗、非特异性免疫治疗和器官移植。
45.与编码酪氨酸激酶Syk的DNA分子或其部分互补的反义肽核酸(PNA)。
46.根据权利要求45的PNA，其包含5-25个碱基，优选10-20个，更优选13-18个碱基。
47.根据权利要求45或46的PNA，其具有SEQ ID NO：01的序列。
48.与编码酪氨酸激酶Syk的DNA分子或其部分互补的反义肽核酸(PNA)，该肽核酸用于通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关的疾病。
49.与编码酪氨酸激酶Syk的DNA分子或其部分互补的反义肽核酸(PNA)用于制造药物的用途，该药物用于通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关的疾病。
50.通过减小Th1/Th2比例来预防或治疗Th1细胞相关的疾病的方法，该方法包含向被试者施用有效剂量的反义肽核酸(PNA)，该反义肽核酸与编码酪氨酸激酶Syk的DNA分子或其部分互补。
51.与编码酪氨酸激酶ZAP-70的DNA分子或其部分互补的反义肽核酸(PNA)。
52.根据权利要求51的PNA，其包含5-25个碱基，优选10-20个，更最优选13-18个碱基。
53.根据权利要求51或52的PNA，其具有SEQ ID NO：02的序列。
54.与编码酪氨酸激酶ZAP-70的DNA分子或其部分互补的反义肽核酸(PNA)，用于通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关的疾病。
55.与编码酪氨酸激酶ZAP-70的DNA分子或其部分互补的反义肽核酸(PNA)用于制造药物的用途，该药物用于通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关的疾病。
56.一种通过增大Th1/Th2比例来预防或治疗Th2细胞相关疾病的方法，该方法包含向被试者施用有效剂量的反义肽核酸(PNA)，该反义肽核酸与编码酪氨酸激酶ZAP-70的DNA分子或其部分互补。
57.一种评价被试者的T辅助细胞的特征的体外诊断方法，该方法包含从被试者获得含有T辅助细胞的样品，测量样品中磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内NFAT1和/或核内NFAT2的水平并用获得的测量结果来估计Th1/Th2水平。
58.一种检验产品或方法对Th1/Th2比例的作用的体外方法，该方法包含获得含T辅助细胞的具有已知Th1/Th2比例的培养物，用该产品或方法处理该T辅助细胞，测量样品中磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内NFAT1和/或核内NFAT2的水平并用获得的测量结果来估计Th1/Th2水平的变化。
59.一种诊断检验试剂盒，其包含一种或多种探针以及可选择的一个检测系统，该探针特异结合磷酸化的Syk、磷酸化的ZAP-70、核内NFAT1和/或核内NFAT2。
60.一种生产富含Th1细胞的培养物的方法，该方法包含获得含有T辅助细胞的样品，用活性物质处理样品以增大Th1/Th2比例，该活性物质选自a)IL-2和SDF-1α，b)IL-2的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-4的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)ZAP-70或NFAT2的抑制剂，e)Syk或NFAT1的刺激物，f)物质a)-e)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或g)物质a)-f)中任何组的组合。
61.一种生产富含Th2细胞的培养物的方法，该方法包含获得含有T辅助细胞的样品，用活性物质处理样品以减小Th1/Th2比例，该活性物质选自a)IL-4和SDF-1α，b)IL-4的刺激物和SDF-1α的刺激物，c)IL-2的拮抗剂和SDF-1α的拮抗剂，d)Syk或NFAT1的抑制剂，e)ZAP-70或NFAT2的刺激物，f)物质a)-e)中任一的功能衍生物、类似物或部分，或g)物质a)-f)中任何组的组合。
62.由权利要求60或61的方法生产的培养物在体外或体内研究和试验中的用途。
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