WO2014172805A1

WO2014172805A1 - 具有增进的细胞素活性的组合物和其应用

Info

Publication number: WO2014172805A1
Application number: PCT/CN2013/000481
Authority: WO
Inventors: 李德财; 邱绣河; 周宽基; 沈瑞鸿; 范怡馨; 林佩桦; 吴佩珊
Original assignee: Lee Der-Tsai
Priority date: 2013-04-26
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2014-10-30

Abstract

本发明公开了一种具有增进的细胞素活性的组合物及其应用，所述组合物包含趋化素多肽，其为趋化素或其受体结合域；和细胞素多肽，其为TNF超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞。本发明还公开了使用该组合物增进细胞素活性的方法。

Description

具有增进的细胞素活性的组合物和其应用技术领域

本发明涉及一种蛋白组合物，其包含趋化素多肽和细胞素多肽，其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且其具有增进的细胞素活性和增进的趋化素活性。背景技术

细胞素（ cytokine )是一群当细胞受外来刺激后所分泌出来（只有极少种细胞素可表达于细胞膜）的蛋白，细胞素自细胞产生后可以就近或经由血液的运输而作用于标的细胞以产生影响，而且在极低的浓度下就会发挥作用，广泛具有可促使标的细胞生长、分化或活化等功能，许多细胞素可作用在免疫细胞而参与免疫反应。细胞素可依其结构作用不同大致分为趋化素（chemokines )、介白素

( interleukins ), 生长因子 ( growth f actors ), 转形生长因子 ( transforming growth factors )、群落生成刺激因子 ( colony stimulating factors )、肿瘤坏死因子 ( tumor necrosis factors )和干扰素 ( interferons )等。

趋化素（chemokines )是一群可趋化吸引白血球的细胞素，通常为分子量小、带正电、可分泌性的蛋白，主要的功能是将免疫细胞吸引到受伤组织或是有病原感染的区域，白血球继而能够在此特定的部位进行吞噬反应（phagocytosis )或是引发发炎反应（ infla誦 ation), 以抵御病原，趋化素所吸引的白血球可能包括属于先天性免疫力（ innate immunity ) 的中性粒细胞（ neutrophils )、单核球 /巨¹^细胞 ( monocytes/ macrophages )、自然杀伤细胞 ( natural killer cells ), 树突细胞 ( dendritic cells ) 和其他白血球等，或者是属于特异性免疫反应

( adaptive immunity ) 的 T (淋巴）细胞 (T lymphocytes, T cells ) 或 B (淋巴）细胞（B lymphocytes, B cells), 在生物体的免疫系统中扮演相当重要的角色。趋化素大多拥有 4个高度保守的半胱胺酸（cysteine, C)形成双疏键来稳定其结构，依据前两个 C之间的氨基酸数不同和第一个 C有无进行分类，可分成 CXC (或称 oc )、 CC (或称 Ρ )、 C (或称 γ )与 CX₃C四个亚群（subfamilies), 基质细胞衍生因子 ( stromal cell-derived factor- 1, SDF-1 )被归类在趋化素的 CXC亚群里，又称为 CXC配体 12 (CXCL12), 在许多的物种中均有发现，包括哺乳类动物中的人类、小鼠和猫与两栖类动物中的非洲爪蟾（ e/jopus) 以及斑马鱼 (zebra fish)都有发现，在不同物种间变异不大，有相当好的保守性（ Shirozu et al. , Genomics 28， 495-500 )。 SDF-1基因在小鼠和人类中转录出的 mRNA会先经过不同剪接（ splicing),所以可发现有两种 SDF-1同型异构物 ( isoform )： SDF-1 α和 SDF-Ι β , SDF-1的分布极广，包括淋巴组织、肾、肺、肝、脑和肌肉等都可侦测的到 ( Shirozu et al. , Genomics 28， 495-500 )。 SDF-l的受体 CXCR4除了长存于脏器中，亦可见于造血干细胞（ hematopoietic stem cells )、内皮细胞、树突细胞、 B细胞、和 T细胞，因此这些细胞会受 SDF-1吸引，移动到该趋化素浓度高的部位 (Bleul et al. , Nature, 382: 829-833; Oberlin et al. , Nature 382: 833-835; Read et al. , Developmental and comparative immunology, 29, 143-152 )。

CD40配体 ( CD40 ligand, CD40L ) 是属于肿瘤坏死因子 ( tumor necrosis factor, TNF)超家族（ superfamily )里的一员，此种细胞素具有使肿瘤坏死与促进白血球细胞分化、增生、凋亡的功用。 CD40L蛋白合成时为一跨膜蛋白

( transmembrane protein), 以人类 CD40L为例，蛋白共 261个氨基酸，首先氨基端 22个氨基酸为细胞内区域，接着 24个氨基酸为穿膜区域，靠羧基端 215个氨基酸序列为细胞外（extracellular, Exc ) 区域， Exc区域在羧基端具有一个 TNF超家族蛋白均保守的 TNF同源（TNF homology, TNFh ) 区域。 CD40L主要以跨膜蛋白形式存在活化的 CD4+T细胞表面，也存在 CD8'T细胞、嗜碱性粒细胞（basophils )、嗜酸性粒细胞（eosinophils )、肥大细胞、自然杀伤细胞、血小板、甚至在表达 CD40的细胞表面也有发现。

CD40L的受体为 CD40，分布于 B细胞、树突细胞，巨噬细胞等抗原呈现细胞

(antigen presenting cells, APCs )表面。在生理上这些抗原呈现细胞可受到辅助性 T细胞（T helper cells )表达的 CD40L活化，促进表达第二类主要组织相容性复合体 ( major histocompatibility complex class II, MHC-II )分子与 B7分子以助抗原呈现。 CD40L通过与标的细胞上的 CD40结合而活化信息传递通路，除了上述促进抗原呈现的作用， CD40L在 B细胞可促进 B细胞增殖

( roliferation). 免疫球蛋白的类型碑舍变（ isotype switching ), 抗体分泌、记忆性 B细胞的分化或避免细胞凋亡； CD40L作用在巨噬细胞可加强其活化，促进其产生介白素 -12 (interleukin-12, IL-12) 以活化第一型辅助性 T细胞（ T helper 1， Thl )或是分泌一些趋化素，或是促进一氧化氮（nitric oxide, NO) 产生以提升巨噬细胞防卫微生物的能力；作用在树突细胞可使其成熟活化，活化的树突细胞除了表达大量 MHC-II分子以助抗原呈现，还会分泌 TNF-ot以及 IL-8、巨¹ ¾细胞炎性蛋白 l oc ( macrophage inflammatory protein 1 , ΜΙΡ-1 α )等趋化素。

目前已有许多研究将 CD40L应用在疫苗佐剂或是治疗上，例如做为鸭 Β型肝炎病毒 ( duck hepatitis B virus, DHBV )疫苗 ( Gares ei , Clin Vaccine Immunol 13, 958—965 )、人类免疫缺陷病毒 ( human immunodeficiency virus, HIV) DNA 疫苗（Stone et al. , J Virol 80, 1762-1772 ) 的佐剂或是治疗人类自体免疫性疾病 ( Howard & Miller, Autoimmunity 37, 411-418 )等。

介白素 -2 ( interleukin- 2, IL - 2 )被归类在造血因子 ( hematopoietin ) 家族里，这家族包括了一些与细胞生长有关的介白素或其他细胞素等。 IL-2的功能包括：调节 T细胞的成熟和分化、刺激 B细胞的增殖和抗体分泌、促进自然杀伤细胞的毒杀能力、活化单核细胞和巨噬细胞等。 IL- 2也可以刺激 T细胞与 B细胞持续表 iiMHC, 也可以刺激自然杀伤细胞产生多种不同的细胞素，包括 TNF- oc、 IFN- γ和粒细胞 /巨细胞集落刺激因子 ( granulocyte/macrophage colony stimulating factor, GM- CSF )等。研究显示 IL- 2有抗肿瘤和提升疫苗的作用。

然而，本领域中仍然需要具较强活性的细胞素和趋化素。发明内容

在本发明中意外地发现，包含趋化素和细胞素的蛋白组合，具有增进的细胞素活性和增进的趋化素活性。

因此，本发明提供一种组合物，其包含：趋化素多肽，其为一趋化素或其受体结合域；和细胞素多肽，其为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且该组合物具有相较于该趋化素多肽单独施用时更增进的趋化素活性，以及相较于该细胞素多肽单独施用时更增进的细胞素活性。

本发明亦提供一种增进趋化素活性的方法，其包含：将趋化素多肽与细胞素多舦共同施用，其中：该趋化素多肽为一趋化素或其受体结合域，该细胞素多肽为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域；且该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞。

本发明更提供一种增进细胞素活性的方法，其包含：将细胞素多肽与趋化素多肽共同施用，其中：该细胞素多肽为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域，该趋化素多肽为一趋化素或其受体结合域；且该细胞素多肽和该趋化素多肽具有共同的标的细胞。

根据本发明，该趋化素为一 CXC趋化素、 CC 趋化素、 C趋化素或 CX₃C 趋化素，较佳为 CXC趋化素。根据本发明的具体实例，该趋化素是基质细胞衍生因子 ( s troma l cel l- der ived factor-1; SDF-l )。

根据本发明，该细胞素多肽系为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域。在本发明的具体实例中，该细胞素多肽为 IL- ²、 CD⁴0配体 TNFh同源区域 ( CD40 Hgand TNF homology doma in; CD40L_TNFh )或其受体结合域。

本发明的各个具体实例的细节说明如后。本发明的其他特征将会经由以下各个具体实例中的详细说明和申请专利范围而清楚呈现。

无须进一步的阐迷，相信本发明所属技术领域中的技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明，而非以任何方式限制其余的揭露内容。附图说明

图l显示纯化单一蛋白的SDS-PAGE和wes teΓn blot分析结果。第 1道：标签蛋白，预期大小为 21 kDa; 第 2道： SDF-1 , 预期大小为 11 kDa; 第 3道： IL- 2，预期大小为 32 kDa; 第 4道： CD40L誦, 预期大小为 33 kDa;

图 2显示 SDF- 1蛋白趋化 PBMCs的情形。细胞受到胶体外的趋化素吸引，会自中心胶体游向四周，细胞在低放大倍率下呈现云雾状，胶体周围细胞愈多代表趋化细胞程度愈大。在 2 μ Μ下， SDF- 1 + 04()1^ 或30?- 1 + IL- 2蛋白组合趋化细胞程度明显大于 SDF-1单一蛋白；

图 3显示 CD40L衍生蛋白活化巨噬细胞产生 NO的活性。 CD40L_TNFh; SDF-1 + CD40L_TNFh; 和对照组：以 LPS ( 4 μ g/ml )做为阳性对照组（ + ), 标签蛋白（250 nM )和培养液做为阴性对照组（-）。 "表示与个别单一蛋白相比有显著较高活性 ί "ρ < 0. 01 );

图 4显示 IL- 2蛋白促进淋巴球增生试验的结果。增生指数（ s t imulat ion index, SI ) = 试验组别的 0D/仅以 RPMI 1640培养的 0D。 SDF-1 + IL2蛋白组合浓度在 0. 039 nM、 0. 156 nM, 2. 5 nM 与 10 nM 时，其 SI值显著高于单独 IL- 2蛋白（ < 0. 05 );

图 5显示 IL- 2蛋白组合作为新城病（ND )疫苗佐剂的效杲。与疫苗对照组比较，接受 SDF- 1 + IL- 2蛋白组合作为疫苗佐剂（vaccine + SDF-1 + IL-2 )可显著（ p < 0. 05 )提升鸡只对抗 ND病毒的 HI抗体效价；

图 6显示趋化素与细胞素蛋白组合作为传染性支气管炎（IB )疫苗佐剂，可显著促进抗体反应。 A: negat ive contro l ( P月性对照组）； B: vacc ine control

( IB疫苗对照组）; C: vacc ine + SDF-1 ( IB疫苗加 SDF- 1蛋白）; D: vaccine + CD40L_TNFh ( IB疫苗加 CD40L_TNFh蛋白）; E: vaccine + IL 2 ( IB疫苗加 IL- 2蛋白）; F: vacc ine + SDF-1 + CD40L_TNFh ( IB疫苗力口 SDF - 1 和 CD40 _Fh蛋白组合）； G: vaccine + SDF-1 + IL-2 ( IB疫苗加 SDF- 1 和 IL-2蛋白组合）。与对照组别相较，接受 SDF-1和 CD40L_TNFh蛋白组合作为疫苗佐剂的组别 ( vaccine + SDF-1 + CD40L_TNFh )

( p < 0. 001 )、或是接受 SDF-l和 IL-2蛋白组合作为疫苗佐剂的组别（vaccine + SDF-1 + IL-2 ) ( p < 0. 05 ) 均可显著提升抗 IB病毒抗体效价。具体实施方式

除非另有指明 , 所有在此处使用的技术性和科学性术语具有本领域技术人员一般所了解的意义。

本文所使用的「一』一词，如未特别指明，是指至少一个（一个或一个以上）的数量。

本文所使用的「趋化素多肽」一词是指一多肽，其为趋化素（chemokine ) 或其受体结合域（ receptor binding domain ), 其中该趋化素包括但不限于 CXC 趋化素、 CC 趋化素、 C趋化素和 CX3C趋化素。

本文所使用的「细胞素多肽』一词是指一多肽，其为细胞素（cytokine )或其受体结合域，其中谊细胞素包括但不限于介白素和 TNF-超家族细胞素。

本文所使用的「趋化素活性」一词是指趋化素于生物体内所具备或可发挥的活性，包括但不限于趋化多种免疫细胞（包括单核细胞、巨噬细胞、 T细胞、 B细胞、自然杀伤细胞、树突细胞和中性粒细胞等）。

本文所使用的「细胞素活性」一词是指细胞素于生物体内所具备或可发挥的活性，包括但不限于促进 B细胞增殖、免疫球蛋白的类型转变、抗体分泌；记忆性 B细胞的分化或避免细胞凋亡；促进巨噬细胞分泌介白素- 12以活化第一型辅助性 T细胞或分泌趋化素；促进巨噬细胞产生一氧化氮以提升防卫微生物的能力；促进树突细胞成熟活化；调节 T细胞的成熟和分化；促进自然杀伤细胞的毒杀能力、产生多种不同的细胞素；活化单核细胞和巨噬细胞；和刺激 T细胞与 B细胞持续表 iiMHC等。

在一方面，本发明提供一种组合物，其包含：趋化素多肽，其为一趋化素或其受体结合域；和细胞素多肽，其为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且该组合物具有相较于该趋化素多肽单独施用时的增进的趋化素活性，以及相较于该细胞素多肽单独施用时的的增进的细胞素活性。

根据本发明，该趋化素多肽和该细胞素多肽组合在有效浓度下较单一蛋白具更增进的活性。

在本发明一具体实施例中，该趋化素为一 CXC趋化素。在一特定实例中，该趋化素为基质细胞^"生因子（SDF-1 )。在另一特定实例中，该趋化素为 IL-8。

在本发明的部分具体实施例中，该趋化素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 1、 4、 6、 8、 10或其同源物（homolog )和类似物（ ana log )。

在本发明部分具体实施例中，该细胞素多肽为 IL- 2、 CD40配体 TNF同源区域 ( CD40 l igand TNF homo logy doma in; CD40L_TNFh )或其受体结合域。

在本发明部分具体实施例中，该细胞素多肽系具有选自下列的氨基^ ^列之一： SEQ ID NO: 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30或其同源物和类似物。

在本发明特定具体实施例中，本发明的蛋白组合具有选自下列的氨基酸序列組合之一： SEQ ID NO: 2和 12; SEQ ID NO: 2和 22。

另一方面，本发明提供一种增进趋化素活性的方法，其包含：将趋化素多肽与细胞素多肽共同或组合施用，其中：该趋化素多肽为一趋化素或其受体结合域，该细胞素多肽为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域；且该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞。

又一方面，本发明提供一种增进细胞素活性的方法，其包含：将细胞素多肽与趋化素多肽共同或组合施用，其中：铉细胞素多肽为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域，该趋化素多肽为一趋化素或其受体结合域；且该细胞素多肽和该趋化素多肽具有共同的标的细胞。行。于活体外实施本发明的方法时，可将细胞素多肽与趋化素多肽共同施用至其一或多标的细胞。于活体内实施本发明的方法时，可将细胞素多肽与趋化素多肽共同或组合投予至一有需要的个体，以提供增进的细胞素活性或增进的趋化素活性。该个体包括但不限于人类、哺乳类或禽类。

在本发明一具体实施例中，该趋化素系为一 CXC趋化素。在一特定实例中，该趋化素为基质细胞衍生因子（SDF-1 )。在另一特定实例中，该趋化素为 IL- 8。

在本发明的部分具体实施例中，该趋化素多肽系具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10或其同源物（homolog )和类似物（analog )。

在本发明部分具体实施例中，该细胞素多肽为 IL-2、 CD40配体 TNF同源区域 ( CD40 l igand TNF homology doma in; CD40L_TNFh )或其受体结合域。

在本发明部分具体实施例中，该细胞素多肽具有选自下列的氨基酸序列之 —： SEQ ID NO: 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30和其同源物和类似物。

在本发明特定具体实施例中，本发明的蛋白组合具有选自下列的氨基酸序列组合之一： SEQ ID NO: 2和 12; SEQ ID NO: 2和 22。

以下实例仅作为说明，而非作为本发明的限制。实施例 1: 重组蛋白表达

使用先前已构筑鸡 SDF_1、 IL- 8、 CD40L衍生蛋白和 IL-2的表达载体来表达重组蛋白（吴佩珊，国立中兴大学兽医微生物学研究所硕士论文 2008 , 鸡 CD40L及趋化素之研究； Tsa i et a l. , Ta iwan Vet J 31: 38-45 ), 其中鸡 CD40L ( chCD40L) 衍生蛋白包括 CD40L的 TNF同源区域 ( TNF homology doma in of CD40L, CD40L_TNFh: 原 CD40L的氨基酸残基 136- 272 )。将构筑好的原核表达栽体转入 E. col i表达型菌株 BL21 ( DE3 ), 以 0. 5 mM IPTG诱导重组蛋白表达，以离心的方式收取菌体去除培养液。所有的菌体接着以结合緩冲液（binding buffer ) 重悬，使用高压细胞裂解仪 ( French Pressure Cel 1 Press, Thermo IEC, Needham, He ight, MA, USA ) 裂解菌体，高速离心的后水溶性的蛋白会位于上清液，以镍离子亲和管柱进行纯化。不可溶蛋白则会位于离心后的底部团块中，以 8 M尿素处理此部分不可溶蛋白后，尿素会将蛋白质的折叠打开使其溶解于水溶液中，接着以 12000 rpm 离心 30分钟取其上清液进行透析，将尿素慢慢置换出来，使蛋白能再折叠成原来的构形，最后将蛋白质溶解于含有 10 %甘油的磷酸盐緩冲液（pH 7. 3 ) 中，经 0. 22 μ m滤膜过滤后，以 BCA蛋白分析试剂盒（ Pierce, Rockford, IL, USA )测定蛋白浓度，储存在 -20 °C。蛋白纯化后经 MALDI- T0F质讲仪分析鉴定为正确的蛋白， SDS- PAGE与 wes tern Mot (—级抗体为 ant i- Hi s小鼠 IgG抗体，二级抗体为 AP -接合山羊抗小鼠 IgG抗体，呈色剂为 NBT/BCIP)分析显示所表达的鸡重组蛋白符合预期大小，其中栽体编码的标签蛋白为 21 kDa、 SDF- 1为 11 kDa、 IL-2为 32 kDa、 CD40L_TNFh为 33 kDa (参见图 1 )。实施例 2: 趋化活性试验 ( chemotactic activity assay )

评估趋化素（SDF-1 ) 与 CD40L衍生蛋白 CD40L_TNFh或 IL 2組合后的趋化活性，以 Histopaque 1077 ( Sigma, Saint Louis, Mo, USA ) 分离周边血液单核细胞 ( peripheral blood mononuclear eel Is, PBMCs ), 以 PBS冲洗两次后，再以含 10 % 胎牛血清（ fetal bovine serum, FBS ) ^jRPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 悬浮后加入融溶状态的 0.6 %洋菜胶，混合均匀，使最后洋菜胶的浓度为 0.3 %, 接着取此混合液 2 μ 1/孔点在 48孔盘的中央，放入冰箱五分钟使洋菜胶凝固，而将细胞固定在胶的范围内。接着每孔加入 250 μΐ含有各浓度待测蛋白的培养液，于 37 'C培养隔夜后观察。

依据各蛋白发挥趋化活性的最低有效浓度（ minimal effective concentration, MEC ), MEC值愈小即趋化活性愈佳， SDF-1无论与 0401^₁₎或 -2 组合均可降低 MEC值，提高趋化活性，其趋化活性比 SDF-1单一蛋白更好（参见表 1 )。各蛋白浓度愈高，趋化效果愈佳，在相同浓度下， SDF- l+CD40LTNFh或 SDF- 1+IL- 2蛋白组合趋化细胞程度明显大于 SDF-1单一蛋白（参见图 2 )。

表 1：趋化活性的最低有效浓度 ( MEC )

编

蛋白名称最低有效浓度

号

A SDF-1 125 nM

B SDF-l+CD40LTNFh 62.5 nM

C SDF-1+IL-2 62.5 nM 实施例 3: CD40L_TNfh蛋白活化巨噬细胞产生一氧化氮（nitric oxide, NO)活性分析

基于 CD40L可活化巨噬细胞产生 NO的特性，评估趋化素与 CD40L衍生蛋白 CD40L_TNFh组合后的 CD40L活性。分离周边血液单核细胞，以 PBS沖洗两次后，以含 10 % FBS的匪 I 1640培养液外加 125 ng/ml 鸡 IL- 2和 4 μ g/ml LPS调整细胞至 2 X 107ml, 24孔盘中各放入 1 ml,两天后外加新鲜培养液 1 ml(同样添加 125 ng/ml 鸡 IL- 2和 4 g/ml LPS), 五天后完成刺激，单核细胞会分化成巨噬细胞。以 PBS 冲洗三次去除悬浮细胞后加入不同浓度的 CD40L_TNFh或其蛋白组合，并以培养液、栽体表达的标签蛋白和加入 4 μg/m\ LPS的培养液分别做为阴性和阳性对照组，培养 48小时后取 50 μ 1利用商业可获得的试剂盒（Griess Reagent System; Promega, Madison, WI, USA )测定培养液中亚硝酸（由 NO转化）浓度。结果显示 SDF1 + CD⁴0L_TNFh蛋白组合活化巨噬细胞产生 NO的活性显著较单一 CD40L™蛋白更好（ 0.8-180 n , p < 0.01 ) (参见图 3 )。实施例 4: IL- 2蛋白促进淋巴球增生的活性

基于 I L-2可促进淋巴球增生的活性，评估趋化素与 I L-2组合后的 I L-2活性。利用细胞内酸性去磷酸酶（acid phosphatase) 的活性与细胞数成正比，加入呈色受质对硝'基磷酸苯酯（ p_nitrophenyl phosphate, pNpp )。分离周边血液单核细胞后，以含 10% FBS的 RPMI 1640培养液加上不同浓度的蛋白、 10 μ g/ml ConA (阳性对照组）、或 10 nM 标签蛋白（阴性对照组），培养于 96孔盘当中，每孔细胞量为 2 χ 10⁵，培养三天后 3000 rpm离心 10分钟，接着去掉培养液，每孔加入 100 μ ΐ的呈色试剂（0.1 M sodium acetate, pH 5.5， 0.1% Triton X-100, and 10 mM pNpp), 37 。( 培养两个小时，接着加入 10 μ 1 I N NaOH终止反应，以波长 405 nm读取吸光值并计算增生指数（ stimulation index, SI ), 其中 SI = 试验组别的 0D/仅以 RPMI 1640培养的 0D。结果显示 SDF-1 + IL2蛋白组合于 0.039 nM、 0.156 nM、 2.5 nM, 与 10 nM时促进增生的活性均显著高于 IL- 2 (p< 0.05 ), 此结果显示组合趋化素后 IL-2活性显著提高（参见图 4)。实施例 5:趋化素与 IL- 2蛋白组合作为禽类新城病（Newcastle disease, ND) 疫苗佐剂促进疫苗引发的抗体反应

以趋化素 SDF- 1 + IL- 2蛋白组合作为疫苗佐剂（vaccine adjuvant ), 配合禽类新城病（Newcastle disease, ND ) 活毒疫苗株 LaSota施用于鸡只，于施用疫苗后抽取鸡血。以血球凝集抑制试验（ hemagglutination inhibition test, HI test ) 测定其 HI抗体效价，于每孔 96孔 U型底微量盘 ( 96 well microplate )加入 25 μ ΐ生理食盐水（0.9% NaCl ), 继而加入 25 μ 1待测鸡血清做 2倍系列稀释，之后每孔加入 25 μ ΐ 含 8 hemagglutination unit (HAU) 的 ND病毒液，作用 15分钟后加入 50 μ ΐ 0.7 % (ν/ν) 的鸡只红血球，最后静置 40分钟判读其抗体抑制病毒凝集血球之 HI效价。结果显示，与疫苗对照组比较，接受 SDF-l + IL-2蛋白组合作为疫苗佐剂组别（vaccine + SDF-1 + IL-2 )可显著（ p < 0.05 )提升鸡只对抗 ND病毒的 HI抗体效价（参见图 5 )。实施例 6: 趋化素与细胞素蛋白组合作为禽类传染性支气管炎（ infectious bronchitis, IB )疫苗佐剂促进抗体免疫反应

趋化素 SDF- 1与 CD40L_TNFh蛋白组合或与 IL-2蛋白组合作为疫苗佐剂，配合禽类传染性支气管炎（ infectious bronchitis, IB) 活毒疫苗株 H120 ( Intervet, Boxmeer, Netherlands )施用于鸡只，于施用 2周后后抽取鸡血，使用 IBV Ant ibody Test Kit (Idexx, MA, U.S. A.) 测试。先将待测血清以样本稀释液 500倍稀释，取 100 μ 1加至 antigen- coated plate中于室温下作用 30分钟，接着以 ddH20清洗 5次，再加入 100 μ 1偶联 HRP的二抗于室温下作用 30分钟， ddH20清洗 5次后加入 100 μ ΐ呈色试剂 (TMB substrate solution)作用 15分 4中，最后加入 100 μ ΐ的终止反应溶液，以波长 405 nm读取吸光值并依据阳性对照血清的读值换算抗体效价。与对照组别相较，接受 SDF- 1与 00401^_1]蛋白组合作为疫苗佐剂的组别 (vaccine + SDF-1 + CD40L_TNFh) ( p < 0.001 ) 与接受 SDF- 1与 IL-2蛋白组合作为疫苗佐剂的组别（vaccine + SDF-1 + 11-2) ( p < 0.05 ) 均可显著提升抗 IB病毒抗体效价（参见图 6)。

Claims

权利要求

1. 一种组合物，其包含：

趋化素多肽，其为一趋化素或其受体结合域；和

细胞素多肽，其为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域；其中该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞，且谅组合物具有相较于该趋化素多肽单独施用时更增进的趋化素活性，以及相较于该细胞素多肽单独施用时更增进的细胞素活性。

2. 根据权利要求 1所述的组合物，其中该趋化素选自于由 CXC趋化素、 CC 趋化素、 C趋化素和 CX₃C 趋化素所组成的群。

3. 根据权利要求 2所述的组合物，其中该趋化素为 CXC趋化素。

4. 根据权利要求 3所述的组合物，其中该趋化素为基质细胞衍生因子。

5. 根据权利要求 1所述的组合物，其中该趋化素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10或其同源物和类似物。

6. 根据权利要求 1所述的组合物，其中该细胞素多肽为 IL- 2、 CD40配体或其受体结合域。

7. 根据权利要求 1所述的组合物，其中该细胞素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 12、 14、 16、 18、 20、 11、 24、 26、 28、 30或其同源物和类似物。

8. 根据权利要求 1所述的组合物，其中该趋化素多肽具有 SEQ ID NO: 2的序列，且其中该细胞素多肽具有 SEQ ID NO: 12或 22的序列。

9. 根据权利要求 1所述的组合物，其为医药组合物，且更包含一医药上可接受的载剂。

10. 权利要求 1所述的组合物在制备疫苗佐剂中的应用。

11. 一种增进趋化素活性的方法，其包含：

将趋化素多舦与细胞素多肽共同施用，其中：

该趋化素多肽为一趋化素或其受体结合域，该细胞素多肽为一介白素、一

TNF-超家族细胞素或其受体结合域；且

该趋化素多肽和该细胞素多肽具有共同的标的细胞。

12. 一种增进细胞素活性的方法，其包含：

将细胞素多肽与趋化素多肽共同施用，其中：

该细胞素多肽为一介白素、一 TNF-超家族细胞素或其受体结合域，该趋化素多肽为一趋化素或其受体结合域；且

该细胞素多肽和该趋化素多肽具有共同的标的细胞。

1 3. 根据权利要求 1 1或 12所述的方法，其中该趋化素选自于由 CXC趋化素、 CC 趋化素、 C趋化素和 CX₃C 趋化素所组成的群。

14. 根据权利要求 1 3所述的方法，其中该趋化素为基质细胞衍生因子。

15. 根据权利要求 11或 12所述的方法，其中该趋化素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 1 0或其同源物和类似物。

16. 根据权利要求 11或 12所述的方法，其中该细胞素多肽为 IL- 2、 CD40配体或其受体结合域。

17. 根据权利要求 11或 12所述的方法，其中该细胞素多肽具有选自下列的氨基酸序列之一： SEQ ID NO: 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28、 30或其同源物和类似物。

18. 根据权利要求 1 1或 12所述的方法，其中该趋化素多肽具有 SEQ ID NO: 2 的序列，且其中该细胞素多肽具有 SEQ ID NO: 12或 22的序列。