CN1795206A - 半乳糖凝集素－9诱导因子 - Google Patents

Abstract

半乳糖凝集素－9是具有凝集素活性的生理活性物质，经确认在各种细胞中都有表达，还确认其表达量和肿瘤的转移能力之间存在相关性等，并预测其与各种各样的生理现象有关。可以预期可控制该半乳糖凝集素－9的产生－释放的物质预期具有诱导抗肿瘤或抗炎症作用等活性，需要对其作用进行阐明。发现在某种肿瘤细胞膜可溶性级分中存在诱导半乳糖凝集素－9的产生、释放的因子－半乳糖凝集素－9诱导因子。通过利用刀豆球蛋白A吸附级分、Resource Q^TM离子交换柱、羟基磷灰石柱等，可获得保有浓缩的保存活性的该因子的级分。可以开发利用该因子的半乳糖凝集素－9诱导活性的测定试剂、医药、分析等。

Description

半乳糖凝集素-9诱导因子

技术领域

本发明涉及到具有半乳糖凝集素-9诱导活性的因子，即涉及到半乳糖凝集素-9诱导因子，特别是涉及到包括人的半乳糖凝集素-9诱导因子在内的哺乳动物的半乳糖凝集素-9诱导因子。本发明也涉及到该半乳糖凝集素-9诱导因子的利用技术。

背景技术

本发明人的研究小组成功地克隆了来自人T细胞的嗜酸性细胞趋化因子，而且发现它正是Tureci等报告的人半乳糖凝集素-9(非专利文献1)的变异型凝集素IX(ecaleclin)(非专利文献2)。另外，本发明人的研究小组阐明了凝集素IX与半乳糖凝集素-9是同一物质，也阐明了人的半乳糖凝集素-9由于其连接肽长度不同，存在短型、中型和长型3种(非专利文献7)。

【非专利文献1】Tureci O.et al.，J Biol Chem.，Mar.7，1997，272(10)：6416-22

【非专利文献2】Matsumoto R.et al.，J Biol Chem.，1998，273：16976-84

发明内容

半乳糖凝集素-9作为具有凝集素活性的生理活性物质，已经在组织肥大细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、各种各样的肿瘤细胞等中确认其表达，并确认在其表达量与肿瘤的转移能力之间存在相关性等，预测其与各种各样的生理现象有关。因为预期可控制该半乳糖凝集素-9产生和释放的物质具有抗肿瘤效果或诱导抗炎症作用等活性，希望对其进行阐明。人们认为半乳糖凝集素与诱导活化T淋巴细胞的凋亡等各种各样的生物体中重要的生理活性有关。因此，人们认为通过控制半乳糖凝集素-9的产生和释放等，可以控制各种各样的生理现象、生物活性现象。人们期待可控制生物体内的半乳糖凝集素-9量、半乳糖凝集素-9表达以及释放的因子有望用作医药。

本发明人等进行了刻苦研究，结果发现在某种细胞膜可溶性级分(以下称为“mf”)中存在能诱导半乳糖凝集素-9(以下称为“Gal-9”)产生和释放的因子。特别是在肿瘤细胞膜可溶性级分中发现了存在能诱导Gal-9产生和释放的因子。另外，对于该mf，发现在给药部位存在Gal-9产生细胞的浸润和可诱导从这些细胞产生和释放Gal-9的因子。在本说明书中，将该因子称之为“半乳糖凝集素-9诱导因子”。由该因子的生物活性和生理活性可以预见利用该因子有可能诱导抗肿瘤效果或抗炎症作用。

本发明提供如下内容。

[1]人的半乳糖凝集素-9诱导因子，其为能够在来自B细胞淋巴瘤的细胞株BALL-1细胞得到的细胞膜可溶性级分中鉴定其生物活性存在的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征是该半乳糖凝集素-9诱导因子的生物活性至少可通过选自下述的指标加以鉴定：

(1)诱导半乳糖凝集素-9的活性，

(2)在使用Meth-A肉瘤作为靶肿瘤细胞的体内试验中诱发肿瘤细胞的增殖抑制或肿瘤的排斥，

(3)抗肿瘤活性，

(4)在体外试验中能诱导外周血单核细胞的自然杀伤活性，

(5)在使用外周血单核细胞的试验中，使半乳糖凝集素-9mRNA的表达上调，

(6)在使用外周血单核细胞的试验中，使细胞质中半乳糖凝集素-9蛋白质的表达有意义地上升，

(7)通过组织病理学检查，在注射的部位可确认由嗜酸性细胞以及单核细胞所构成的、并伴有少数中性白细胞的肉芽组织，

(8)在注射部位的皮肤肌肉层的上或下的结缔组织中可发现很多肥大细胞，

(9)通过肿瘤周围组织的组织病理学检查，在肿瘤的周围或肿瘤组织中发现有炎症细胞(主要为嗜酸性细胞以及少量的肥大细胞)浸润区域，

(10)在肿瘤周围组织的组织病理学检查中，可检测发现有核固缩的肿瘤细胞，以及

(11)在肿瘤周围组织的组织病理学检查出，可确认在肿瘤周围或肿瘤组织中积累有表现出异染性的肥大细胞。

[2]上述[1]所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征是：来自B细胞淋巴瘤的细胞株BALL-1细胞是被放射线照射处理过的细胞。

[3]上述[1]或[2]所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征是：该因子存在于在蛋白酶抑制剂存在下将BALL-1细胞与表面活性剂一起匀浆处理后的可溶性的细胞膜可溶性级分中。

[4]上述[1]～[3]任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征在于该因子是从由来自B细胞淋巴瘤的细胞株得到的细胞膜可溶性级分通过从由刀豆球蛋白A柱层析、阴离子柱层析以及羟基磷灰石柱层析等柱层析中选择的处理方法可被纯化和/或浓缩。

[5]在细胞中诱导半乳糖凝集素-9的试剂，其特征是含有上述[1]～[4]任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子。

[6]在细胞中诱导半乳糖凝集素-9的方法，其特征是使上述[1]～[4]任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子与细胞接触。

[7]以含有上述[1]～[4]任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子为特征的医药。

[8]上述[7]所述的医药，其特征是可作为抗肿瘤剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂或肾上腺皮质类固醇激素代用剂。

[9]上述[1]～[4]任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征在于该因子是来自人的因子。

由于用本发明可以鉴定半乳糖凝集素-9诱导因子，进行该因子的纯化，所以正在开展使用纯化的半乳糖凝集素-9诱导因子的医药品开发以及与半乳糖凝集素-9有关的生理现象、生物活性的研究。特别是半乳糖凝集素-9诱导因子存在于细胞膜可溶性级分中，可利用刀豆球蛋白A吸附分离、Resource Q^TM离子交换柱、羟基磷灰石柱等从该组分中获得浓缩的保有活性的级分。通过给予该因子可以展现出增强NK活性的活性、抗肿瘤活性等生物活性，所以可以开发利用该半乳糖凝集素-9的诱导活性的测定试剂、医药、分析等。

本领域的技术人员可以通过以下叙述理解本发明其它的目的、特征、优越性以及具有的观点。然而，包括以下所述以及具体的实施例等叙述在内的本说明书所述内容是表示本发明优选方式，仅用于说明。本领域的技术人员很容易理解根据以下叙述以及来自本说明书的其它部分的知识，在本说明书公布的本发明的意图以及范围内，进行的各种变化和/或改变(或修饰)。要解释的是在本说明书被引用的所有专利文献以及参考文献是由于说明的目的而被引用的，这部分作为本说明书的一部分，其内容包括在说明书中。

附图说明

图1表示有关BALL-mf的抗肿瘤活性的试验结果。(a)表示BALL-mf对肿瘤增殖的抑制作用。●：用BALL-mf处置的动物中的肿瘤重量。■：用Daudi-mf处置的动物中的肿瘤重量。○：用PBS处置的动物中的肿瘤重量。在处置后第18日，BALL-mf的肿瘤增殖抑制作用显著(n＝10，p＜0.05)。(b)表示有关Meth-A荷瘤小鼠中肿瘤的排斥作用的试验结果。●：用BALL-mf处置的动物中具有肿瘤排斥的动物数。■：用Daudi-mf处置的动物中，具有肿瘤排斥的动物数。○：用PBS处置的动物中具有肿瘤排斥的动物数。卡方(χ²)检验(n＝10，p＝0.0006)。

图2是表示进行组织病理学检查：对Meth-A荷瘤小鼠进行处置后第27日切取皮肤部位，固定化处理后，经Giemsa染色的生物组织形态的照片。(a)BALL-mf处理。(b)Daudi-mf处理。带有E的箭头表示嗜酸性细胞。

图3是表示进行组织病理学上检查：对Meth-A荷瘤小鼠进行BALL-mf处置后第27日切取肿瘤部位，固定化处理后，经Giemsa染色(a)或甲苯胺蓝染色(b)的生物组织形态的照片。同样也给出了表示切出Daudi-mf处理的小鼠的肿瘤部位，固定化处理后，进行Giemsa染色(c)的生物组织的形态的照片。带有E的箭头表示嗜酸性细胞、带有M的箭头表示肥大细胞，带有N的箭头表示中性白细胞，用单独箭头表示表示核固缩的Meth-A细胞。

图4是表示采取将BALL-mf注射到小鼠背部皮内24小时后的组织，经Giemsa染色后进行组织学研究的结果的生物组织形态的照片。在淋巴细胞或组织肥大细胞都可发现显著的嗜酸性细胞的浸润。对浸润细胞进行研究，确认有很多肥大细胞或嗜酸性细胞(箭头)和少数的淋巴细胞或巨噬细胞浸润。

图5在作为对照，将Daudi-mf注射到小鼠背部皮内时，虽然淋巴细胞系的细胞的浸润显著，但没有发现嗜酸性细胞的浸润。没有发现肥大细胞或嗜酸性细胞的浸润，但淋巴细胞的浸润显著。

图6表示为了研究BALL-mf注射后的浸润细胞是否含有半乳糖凝集素-9mRNA，进行原位杂交的情形。结果(a)肥大细胞含有大量的半乳糖凝集素-9mRNA。嗜酸性细胞、巨噬细胞、成纤维细胞也轻度含有。(b)在肉膜肌(panniculus carnosus muscle)正上方发现肥大细胞的浸润，含有大量的半乳糖凝集素-9mRNA。(c)在Daudi-mf注射的对照组中，于肉膜肌部位没有发现肥大细胞的浸润。另外在浸润的淋巴细胞中也没有发现半乳糖凝集素-9。

图7表示半乳糖凝集素-9诱导因子的体内效果。为阐明在BALL-mf注射位点的半乳糖凝集素-9产生细胞以及保有细胞，分别利用原位杂交(A)、以及免疫染色法(B)进行研究。在原位杂交(A)中，半乳糖凝集素-9产生细胞主要是肥大细胞，其它成纤维细胞、淋巴细胞、嗜酸性细胞也带有半乳糖凝集素-9的基因。用免疫染色(B)同样能发现在上述细胞的细胞质内都保有半乳糖凝集素-9。由此表明通过BALL-mf刺激，可诱发从这些炎症细胞中产生、释放半乳糖凝集素-9，诱导炎症反应。

图8表示对由BALL-mf引起的产生、释放半乳糖凝集素-9效果进行研究的结果。用BALL-mf刺激小鼠腹腔细胞后，提取mRNA，通过RT-PCR法检测半乳糖凝集素-9mRNA量，可知半乳糖凝集素-9mRNA的表达因为BALL-mf的作用而轻度增加。另外进行了Western印迹法和FACS分析。通过FACS分析，阐明了在BALL-mf刺激细胞中细胞质内半乳糖凝集素-9蛋白减少。该结果表明BALL-mf既能增强半乳糖凝集素-9的产生，也能诱导半乳糖凝集素-9释放。

图9是表示对于由BALL-mf引起的产生、释放半乳糖凝集素-9效果进行研究的结果。为了研究在BALL-mf刺激PC的培养上清中是否诱导半乳糖凝集素-9的释放，测定了嗜酸性细胞趋化活性。结果发现嗜酸性细胞的趋化活性增强，而且由于该活性可被抗半乳糖凝集素-9抗体柱吸收，可知半乳糖凝集素-9的释放被增强。由BALL-mf引起的嗜酸性细胞趋化活性虽然可被抗半乳糖凝集素-9抗体吸收，但并不被抗半乳糖凝集素-8抗体吸收。因此认为是半乳糖凝集素-9诱导因子引起的作用。不仅在肥大细胞系细胞中，而且在嗜酸性细胞系、巨噬细胞系细胞、T细胞系细胞中也可以通过半乳糖凝集素-9诱导因子诱导产生半乳糖凝集素-9。

图10表示对体内的BALL-mf抗肿瘤活性进行调查的结果。可知BALL-mf抑制Meth-A肿瘤的生长以及增殖。通过卡方(χ²)检验也表明，对照组(PBS处置组)35只中有29只、Daudi-mf处置组25只中有22只肿瘤细胞移植接种成功、增殖，但在BALL-mf处置组中，30只中有24只或被根除(eradicate)，或未移植成功(nontransplanted)。

图11是表示显示进行肿瘤组织的免疫组织学分析结果的组织形态照片。使用抗半乳糖凝集素-9抗体进行免疫组织染色，在BALL-mf处置组中，发现其周围显著具有半乳糖凝集素-9的肥大细胞的浸润(A)、在肿瘤内肥大细胞也正进行浸润(B)。在肿瘤细胞内也有半乳糖凝集素-9的表达(A)。另一方面，在Daudi-mf处置组中没有发现半乳糖凝集素-9表达细胞的浸润，在肿瘤细胞中也几乎看不到表达。

图12表示对由半乳糖凝集素-9引起的Meth-A肿瘤细胞的凋亡诱导活性进行研究的结果。半乳糖凝集素-9诱导Meth-A细胞的凋亡。

图13表示就利用Lentil-Lecftin亲和层析纯化半乳糖凝集素-9诱导因子和对BALL-mf抗肿瘤效果进行研究的结果。用Lentil-Lecftin柱将组分分为非吸附、吸附级分，就其活性进行研究，结果发现半乳糖凝集素-9诱导活性主要出现在吸附级分中。另外，通过抗肿瘤活性测定实验，证实吸附级分具有与起始原料抗肿瘤活性相当的抗肿瘤活性。嗜酸性细胞和肥大细胞的浸润也与起始原料相同。图中、○是用PBS、□是用流出液(Effluent)、■是用洗脱液(Eluate)、●是用起始原料(Original)进行实验的结果。

图14表示就诱导因子的等电点分离和抗肿瘤活性进行研究的结果。用通过Rotofor^法对凝集素柱吸附级分进行等电点分离获得的级分刺激的外周血单核细胞，从中提取RNA，使用RT-PCR法对半乳糖凝集素-9表达进行研究。通过RT-PCR法发现在F-1，F-2和F-4中半乳糖凝集素-9表达明显增强。

图15表示对图14给出的经等电点分级得到的级分的抗肿瘤活性进行研究的结果。F-2和F-3能诱导出很强的抗肿瘤活性。相反F-1以及F-4或者与PBS相同，或者促进肿瘤细胞的增殖。F-2和F-3中含有的诱导因子表现出抗肿瘤活性。通过组织染色可确认嗜酸性细胞或肥大细胞的浸润。

图16表示通过Con A亲和柱层析对BALL-mf进行纯化的结果。通过Con A柱将BALL-mf分为非吸附、吸附级分，进行SDS-PAGE，结果发现不同的蛋白质条带。

图17表示对于用Con A柱分级的级分进行抗肿瘤效果研究的结果。发现吸附级分表现出很强的抗肿瘤活性。由此可知表现出抗肿瘤效果的诱导因子是带有甘露糖或葡萄糖的糖蛋白。

图18是表示对BALL-mf的Con A柱吸附级分的细胞毒活性进行研究的结果的组织照片。

图19是表示就用阴离子柱(RESOURCE Q)Con A柱对吸附级分进行纯化处理得到的各级分(A～G)的抗肿瘤效果进行研究的结果。

图20表示改变用阴离子柱分级Con A柱吸附级分后得到的级分D的浓度，对其抗肿瘤活性进行研究的结果。证实抗肿瘤活性存在浓度依赖性。

图21表示将经阴离子柱(RESOURCE Q)纯化处理获得的级分D用羟基磷灰石柱(CHT2-I)进行分级的结果(洗脱图)以及获得的各级分的电泳结果的照片。

图22表示对用羟基磷灰石柱(CHT2-I)纯化处理得到的各级分进行抗肿瘤活性进行研究的结果。同时也给出了表示级分D的电泳结果的照片。

具体实施方式

本说明书中，作为Gal-9产生、释放细胞，如肥大细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、各种肿瘤细胞等。作为含有该半乳糖凝集素-9诱导因子的级分，如来自B细胞株的mf(例如，由人白血病急性淋巴母细胞(ALL)建立的人细胞系：BALL-1等)、由刀豆球蛋白A吸附级分洗脱出的mf、由Resource Q^TM离子交换柱洗脱出的mf、由羟基磷灰石柱洗脱出的级分。

通过对该半乳糖凝集素-9诱导因子在体外或体内所具有的生物活性、例如半乳糖凝集素-9诱导活性进行检测-测定，可以对其进行确认。例如、可通过用mf刺激上述的Gal-9产生-释放细胞后，利用RT-PCR、蛋白质印迹法、流式细胞术法、免疫组织染色法、ELISA法、ELISPOT法、RIA法等对Gal-9mRNA或Gal-9蛋白质进行定量或定性分析来测定半乳糖凝集素-9在体外的诱导活性。也可以使用该细胞的细胞培养液，通过RT-PCR、蛋白质印迹法、流式细胞术法、免疫组织染色法、ELISA法、ELISPOT法、RIA法等对Gal-9蛋白质进行定量或定性分析后测定。而体内的半乳糖凝集素-9诱导活性可以通过将mf给予小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴等动物后，以半乳糖凝集素-9产生细胞的浸润或Gal-9释放的增强作为指标进行测定。另外也可以以肿瘤细胞中Gal-9的直接的或间接的增强作为指标测定其活性。

作为动物，如代表性的实验动物，作为给予法，如皮内、皮下、肌肉内、静脉或动脉、腹腔内注射，或使之饮用食用等。

通过使半乳糖凝集素-9诱导因子发挥作用，可以诱导肿瘤细胞的凝集或凋亡，进而获得抗肿瘤活性，可以诱导CD4阳性T细胞的凋亡，可以对因其过剩反应导致的变态反应或自身免疫疾病进行调节，可以抑制炎症。

本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子其特征是具有诱导半乳糖凝集素-9表达的活性。该因子其特征是通过其存在或其表达，有意义地诱导半乳糖凝集素-9的表达。该因子通过诱导半乳糖凝集素-9表现出各种各样的生理活性和/或生物活性。

可以从例如放射线照射处理过来自B细胞淋巴瘤的细胞株BALL-1细胞获得本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子。能够用于获得本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子的BALL-1细胞可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，Manassas，Virginia，USA)、厚生劳动省国立医药品食品卫生研究所JCBR CellBank：人类科学研究资源中心(Japanese Collection of ResearchBioresources(JCBR)，National Institute of Health Sciences(NIHS)，Ministry of Health，Labor and Welfare，Japan：HealthScience Research Bioresources Bank，Japan Health SciencesFoundation，Osaka，Japan)获得。上述细胞株可以用含有10％胎牛血清(fetal calf serum；FCS)的RPMI1640培养基等在人细胞的培养中使用的一般培养基进行培养。只要是该细胞株能够增殖培养基，并没有特别限定，例如可以使用含有糖类、氨基酸类、维生素类、其它有机营养素、微量无机盐类等的液体营养培养基等。使其增殖后，根据需要进行放射线照射处理，根据情况不同，再进一步培养，然后回收细胞(例如、通过离心分离等进行回收)，在缓冲液中进行破碎等(例如、通过使用玻璃珠的物理破碎、超音波处理或酶等生化手法)制成无细胞提取液。

作为典型的提取方式，可以从由BALL-1细胞得到的细胞膜可溶性级分中浓缩或分离和/或纯化本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子。可以通过例如在蛋白酶抑制剂(例如、苯甲基磺酰氟等)存在下将BALL-1细胞与表面活性剂一起进行匀浆处理后使其溶化后，然后进行离心处理，获得上清液，对其透析，然后通过0.2μm孔径滤膜制备该细胞膜可溶性级分。通过单独或适当组合利用蛋白质溶解度不同进行的分级(由有机溶剂引起的沉淀或由硫酸铵等引起的盐析等)、透析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析或使用螯合剂、色素、抗体等亲和层析等可以从该细胞膜可溶性级分中纯化本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子。例如、通过使用DEAE-琼脂糖凝胶(Sepharose)等阴离子交换层析、使用蓝-琼脂糖凝胶的亲和层析、Mono Q HR 5/5(FPLC系统、Amersham Phamacia Biotech)等高效液相层析系统等纯化至获得电泳单一条带。在特定的实施方案中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可以获得近乎单一条带的半乳糖凝集素-9诱导因子。

具体来说，通过选自刀豆球蛋白A柱层析、阴离子柱柱层析、以及羟基磷灰石柱层析的处理方法可以从上述BALL-1细胞的细胞膜可溶性级分纯化和/或浓缩本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子。可以使用市售的蛋白质分析试剂盒进行蛋白质定量，例如可以使用色素结合法进行定量，也可以使用蛋白质自动分析仪器进行定量。

可以通过例如以下那样的方法对其进行分离处理编码本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子的DNA。将本发明的诱导因子纯化后对N末端氨基酸序列进行分析。在该诱导因子的氨基酸序列分析中，根据需要可以用赖氨酰肽链内切酶、V8蛋白水解酶等酶酶切纯化物后，通过反相液相层析等纯化肽片段后，通过蛋白质序列仪分析氨基酸序列。在序列分析中，可以利用多个肽段确定其氨基酸序列。以确定的氨基酸序列为基础设计PCR用引物，以诱导因子产生细胞的染色体DNA或cDNA文库(市售的文库也可以)作为模板，通过使用根据氨基酸序列设计的PCR引物进行PCR，可以获得本发明的DNA的一部分。这种情况下，可以使用适当程序(例如BLAST程序等)对人基因组数据库(GenBank^TM，DNA Data Bank of Japan(DDBJ)等)进行检索等。再将得到的DNA片段作为探针，通过将诱导因子产生细胞的染色体DNA的限制酶消化物导入噬菌体、质粒等，利用转化大肠菌得到的文库或cDNA文库，通过菌落杂交、噬斑杂交等可以获得所期望的DNA。另外通过对由PCR得到的DNA片段的碱基序列进行分析，根据得到的序列设计用于向已知DNA的外侧延伸的PCR引物，将诱导因子产生细胞的染色体DNA用适当的限制酶消化后，利用自体环化反应，以DNA作为模板，通过进行反向PCR(Ochman，H.et al.，Genetics，120：621-623(1988)；Innis，M.et al.(Ed.)，PCR：Application & Protocols，Academic Press，New York(1989))、以及RACE法(RapidAmplification of cDNA Ends，Frohman，M.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8998(1988)；Innis，M.A.et al.(Ed.)，PCRProtocols：A guide to methods and applications，pp28-38，Academic Press，New York(1990)，驹野徹编、生物化学实验法47PCR实验手册、学会出版中心(JSSP))等也可以获得目的DNA。另外除了利用以上方法克隆基因组DNA获得目的DNA、或cDNA之外，也可以通过合成获得目的DNA。

可以通过至少从以下各项指标中选择的指标对本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子的生物活性进行鉴定。

(1)诱导半乳糖凝集素-9的活性，

(2)在使用Meth-A肉瘤作为靶肿瘤细胞的体内试验中诱发肿瘤细胞的增殖抑制或肿瘤的排斥，

(3)抗肿瘤活性，

(4)在体外试验中能诱导外周血单核细胞的自然杀伤活性，

(5)在使用外周血单核细胞的试验中，使半乳糖凝集素-9mRNA表达上调，

(6)在使用外周血单核细胞的试验中，使细胞质中半乳糖凝集素-9蛋白质的表达有意义地上升，

(7)通过组织病理学检查，确认在注射的部位存在由嗜酸性细胞以及单核细胞所构成的并伴有少数的中性白细胞的肉芽组织，

(8)在注射的部位的皮肤肌肉层的上或下的结缔组织可发现很多肥大细胞，

(9)通过肿瘤周围组织的组织病理学检查中，发现在肿瘤的周围或肿瘤组织有炎症细胞(主要为嗜酸性细胞以及少量的肥大细胞)浸润区域，

(10)在肿瘤周围组织的组织病理学检查中，发现有表现出核固缩的肿瘤细胞，以及

(11)在肿瘤周围组织的组织病理学检查中，确认在肿瘤周围或肿瘤组织积累有表现出异染性的肥大细胞。典型的可以将半乳糖凝集素-9诱导活性作为指标。可以通过在添加本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子的情况下和不添加的情况下，对半乳糖凝集素-9存在量的变化、半乳糖凝集素-9活性的变化、半乳糖凝集素-9表达活性的变化、半乳糖凝集素-9mRNA量的变化等进行分析后鉴定半乳糖凝集素-9诱导活性。可以参考例如国际公开第02/37114号小册子(WO 02/37114 A1)公布的分析法等分析半乳糖凝集素-9以及半乳糖凝集素-9表达活性。

在本发明中，利用“基因重组技术”，对目的核酸-多肽等进行分离-序列测定，或制备重组体，可以获得目的蛋白质-肽。作为在本说明书中可以使用的基因重组技术，例如该领域中已知的技术，如J.Sambrook et al.，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2nd Edition，1989 & 3rd Edition，2001)；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1 to 3，(The Practical ApproachSeries)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；″Methodsin Enzymology″series，Academic Press，New York、如R.Wu ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.68(Recombinant DNA)，AcademicPress，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)& 101(Recombinant DNA，PartC)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，″Methodsin Enzymology″，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E)& 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)；R.Wu ed.，″Methods inEnzymology″，Vol.216(Recombinant DNA，Part G)，Academic Press，New York(1992)；R.Wu ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.217(Recombinant DNA，Part H)& 218(Recombinant DNA，Part I)，Academic Press，New York(1993)；P.M.Conn ed.，″Methods inEnzymology″，Vol.302(Green Fluorescent Protein)，AcademicPress，New York(1999)；S.Weissman ed.，″Methods in Enzymology″，Vol.303(cDNA Preparation and Characterization)，AcademicPress，New York(1999)等文献中记述的方法或、这些文献中引用的文献记述的方法或、与这些方法实质上同样的方法或改进方法(由于参照这些文献中某些记载，它们也包括在本说明书的内容中)。

在本说明书中，所谓“寡核苷酸”是比较短的单链或双链的多聚核苷酸，优选多聚脱氧核苷酸，可以通过Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.28，p.716-734(1989)所述的已知方法、例如、磷酸三酯法、磷酸二酯法、单磷酸酯法、磷酸胺法、膦酸酯法等方法化学合成。已知可以在被修饰的固体载体上很便利地进行常规合成，例如可以使用市售的自动合成仪器、例如Applied Biosystems 3400 DNAsynthesizer(Applied Biosystems)，ABI 3900 High-Throughput DNAsynthesizer(Applied Biosystems)等进行合成。该寡核苷酸可以含有一个或一个以上修饰的碱基，例如也可以含有次黄嘌呤核苷等自然界中稀有的碱基或三苯甲基化的碱基等，根据情况也可以含有带有标记的碱基。

本说明书中所谓“聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)”或“PCR”，一般指的是H.A.Erlich ed.，PCR Technology，StocktonPress，1989等所述的方法，例如、用于在体外通过酶扩增目的核苷酸序列的方法。一般来说，PCR法是包括使用可以与模板核酸优先杂交的2个寡核苷酸引物，反复进行引物延伸合成循环的方法。在典型的PCR法中使用的引物可以使用与模板内部要扩增的核苷酸序列互补的引物，例如、最好使用与被扩增的该核苷酸序列的两端互补的，或与被扩增的该核苷酸序列邻接的引物。引物优选由5个以上的碱基、更优选由10个以上碱基组成的寡核苷酸、更优选由18～25个碱基组成的寡核苷酸。

可以通过在该领域众所周知的方法或实质上与这些方法同样的方法或改良法进行PCR反应，除了上述文献以外，也可以根据例如R.Saiki，et al.，Science，230：1350，1985；R.Saiki，et al.，Science，239：487，1988；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1，(The Practical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；M.A.Innis et al.ed.，″PCRProtocols：a guide to methods and applications″，Academic Press，New York(1990))；M.J.McPherson，P.Quirke and G.R.Taylor(Ed.)，PCR：a practical approach，IRL Press，Oxford(1991)；M.A.Frohman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等所述的方法或对这些方法进行修饰、改良的方法进行PCR。另外可以使用适合该方法的市售的试剂盒进行PCR，也可以按照试剂盒制造者或试剂盒销售者指明的程序实施PCR。

有代表性的PCR反应是将模板(代表性的模板是DNA)和根据对象核酸设计的引物与10×反应缓冲液(Taq DNA聚合酶附带的)、dNTPs(脱氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP，dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去离子蒸馏水混合。将混合物用GeneAmp^TM PCR system 2700(Applied Biosystems)等自动热循环仪，在常规PCR循环条件下反复进行25～60次PCR循环，用于扩增的循环数可以根据相应目的设定为适当的次数。作为PCR循环条件，例如、变性90～95℃ 5～100秒、退火40～60℃ 5～150秒、延伸65～75℃ 30～300秒的循环、优选变性94℃ 15秒、退火58℃ 15秒、延伸72℃ 45秒的循环，退火的反应温度以及时间可以根据相应的实验选择适当的值，变性反应以及延伸反应的时间也可以根据予想的PCR产物的链长选择适当的值。退火的反应温度最好是根据通常引物和模板DNA的杂交体的Tm值变化而有所变化。延伸反应的时间大致以通常每1000bp的链长需要1分钟程度左右为基准，也可以根据情况选择更短的时间。

当鉴定目的核酸时，可以利用杂交技术。可以利用记载有上述“基因重组技术”的文献所述的方法或与之本质相同的方法或改良方法进行该杂交，例如、可以使用菌落杂交法、噬斑杂交法、杂交-翻译分析法、加-减法等。例如、使含有DNA等核酸的样品转移到载体(包括尼龙膜等膜在内的载体)，根据需要实施变性处理、固定化处理、洗涤处理等后，使转移到该载体(例如膜等)的核酸根据需要与变性的标记探针DNA片段在杂交用缓冲液中反应来进行杂交。另外为了用放射性同位素等对探针进行标记，可以使用市售的标记试剂盒，例如随机引物DNA文库试剂盒(Boehringer Mannheim)等，用[α-³²P]dCTP(Amersham)等对用作探针的DNA进行标记，获得带有放射活性的探针。也可以用该领域中已知的方法进行该标记，例如也可以通过洋地黄毒甙、荧光色素、生物素-抗生物素蛋白系等进行标记。

杂交处理通常在约35℃～约80℃、优选在约50℃～约65℃进行约15分～约36小时，更优选进行约1小时～约24小时，可以选择相应的最适条件进行。例如、杂交处理在约55℃下进行约18小时。作为杂交用缓冲液，可以选用在该领域通常使用的杂交用缓冲液。作为进行转移的载体(例如膜等)的变性处理，如使用碱变性液的方法，碱处理后最好用中和液或缓冲液进行处理。另外作为载体(例如膜等)的固定化处理通常在约40℃～约100℃、优选约70℃～约90℃下，进行约15分～约24小时、优选约1小时～约4小时温育进行，可以选择适宜的理想条件。例如、通过将滤膜等载体于约80℃下温育约2小时进行固定化。作为进行了转移的载体(例如膜等)洗涤处理，可以通过使用该领域通常使用的洗涤液、例如使用含有1M NaCl、1mMEDTA和0.1％二十烷基磺酸钠(SDS)的50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0等进行洗涤。作为包括滤膜在内的载体，可以选用该领域普遍使用的载体，例如、尼龙膜等。

作为上述碱变性液、中和液、缓冲液，可以选用该领域通常使用的相应溶液。作为碱变性液，使用例如含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的溶液等，作为中和液，使用例如含有1.5M NaCl的0.5M Tris-HCl缓冲液，pH8.0等，作为缓冲液，使用例如2×SSPE(0.36M NaCl、20mM NaH₂PO₄和2mM EDTA)等。另外在杂交处理中，为了防止非特异的杂交反应，根据需要最好对转移后的载体(例如、膜等)进行预杂交处理。该预杂交处理，例如通过在浸到预杂交溶液[50％formamide，5×Denhardt′s溶液(0.2％牛血白清蛋白、0.2％ polyvinylpyrrolidone)，5×SSPE，0.1％SDS，100μg/mL热变性鲑鱼精子DNA]等中，于约35℃～约50℃、优选约42℃下使其反应约4～约24小时、优选使其反应约6～约8小时，本领域的技术人员可以通过反复实验确定理想条件。杂交中使用的标记探针DNA片段的变性可以于例如约70℃～约100℃、优选约100℃，加热约1分钟～约60分钟、优选约5分钟等。而杂交可以利用这方面众所周知的方法或源于这些方法的方法进行，本说明书所谓严格的条件指的是例如钠浓度为约15～约50mM、优选约19～约40mM、更优选约19～约20mM，温度为约35～约85℃、优选约50～约70℃、更优选约60～约65℃的条件。

杂交结束后，充分清洗处理滤膜等载体，除去特异的杂交反应的标记探针DNA片段以外的标记探针等之后，进行检测处理。可以选用该领域中通常使用溶液进行滤膜等载体清洗处理，例如、可以通过用含有0.1％ SDS的0.5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸)溶液等进行清洗。

可以通过代表性的放射自显影检测杂交的核酸，已知该领域中有各种的技术手法，也可以从这样的方法中适当选择用于检测。将对应于检测信号的核酸条带悬浮于适当的缓冲液、例如、SM溶液(含有100mM NaCl和10mM MgSO₄的50mM Tris-HCl缓冲液、pH7.5)等，然后适度稀释该悬浊液，分离、纯化目的核酸，可以再进行扩增处理。可以使用该领域通常使用的方法对保有目的核酸的样品(例如、噬菌体粒子、重组质粒或载体等)进行纯化分离，例如、可以通过甘油梯度超离心分离法(Molecular cloning，a laboratory manual，ed.T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd ed.78，1989)等进行纯化。可以使用该领域中通常使用的方法从噬菌体粒子等纯化分离DNA，例如、将得到的噬菌体等悬浮于TM溶液(10mM MgSO₄含有50mM Tris-HCl缓冲液、pH7.8)等，用DNase I和RNase A等处理后，加入20mM EDTA、50μg/ml Proteinase K以及0.5％ SDS混合液等，于约65℃、保温约1小时后，对其进行酚提取、二乙醚提取后，用乙醇使DNA沉淀，然后将得到的DNA用70％乙醇洗涤后乾燥，溶解于TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.0)等之后获得。也可以通过亚克隆等大量获得目的DNA，例如可以使用大肠菌作为宿主，使用质粒载体等进行亚克隆。也可以与上述同样进行离心分离、酚提取、乙醇沉淀等方法从上述亚克隆中纯化分离得到DNA。在本说明书中，核酸可以是单链DNA、双链DNA、RNA、DNA:RNA杂交体、合成DNA等核酸，也可以是基因组DNA、来自基因组DNA文库、细胞的cDNA、合成DNA中的任一种。

按照本发明，利用已阐明的有关半乳糖凝集素-9基因的结构以及该DNA序列的信息，设计用于靶基因组DNA、mRNA的筛选以及半乳糖凝集素-9表达活性、半乳糖凝集素-9活性、以及半乳糖凝集素-9诱导活性等检测的探针和引物等。作为特异的检测用探针以及引物，只要是能够特异性检测半乳糖凝集素-9诱导活性的探针和引物即可。代表性的探针和引物，如可以检测国际公开第02/37114号小册子(WO02/37114 A1)中公布的基因中特征性序列部分的探针和引物，优选只要能起到特异检测作用的探针和引物，容许可检测该半乳糖凝集素-9基因一部分的探针和引物。例如、为了通过PCR获得人半乳糖凝集素-9，除了

Gal-9正义序列：CAGGCACCCATGGCTCAAACTAC [序列编号：1]

     反义序列：TATCAGACTCGGTAACGGGGGT  [序列编号：2]

引物组之外，也可以使用实施例中所述的引物组等。

检测中使用的探针和引物为适用的核酸片段或寡核苷酸，要求这样的核酸片段和寡核苷酸能与目的基因特异性地杂交。在能有效检测的情况下，优选形成杂交体后可有效结合的，为实现该目的，例如使用含有5个或10个以上的连续的碱基的寡核苷酸、优选含有15个或25个以上连续的碱基的寡核苷酸、更优选含有30个或50个以上连续的碱基的寡(或聚)核苷酸。含有可有效与靶序列形成杂交的碱基序列的寡(或聚)核苷酸也可以在该选择的碱基序列的一端或两端附加其它核苷酸或核苷酸链，也可以添加非本说明书中说明的那样标记(也包括标记或报告基因等)等。也可以在例如PCR的过程中引入标记。可以使用在该领域中广泛利用标记物作为标记，例如放射性物质、荧光性物质、发光性物质、酶等，也可以是生物素-抗生物素蛋白类等。适当情况下为了易于检测，最好标记探针。当进行基因分离时，可以使用PCR法、以及使用逆转录酶(RT)的PCR法(RT-PCR)。定量测定时也可以使用竞争PCR法。例如、如果用目的cDNA作为探针，可以通过例如Northern印迹、Southern印迹、原位杂交等对细胞中特有的基因等进行检测、分析。

在检测时，为了特异地扩增目的基因，使用根据要扩增的序列的两端而定义的一对寡核苷酸作为引物，也可以使用一个由本说明书给出的寡核苷酸或本发明定义的目的特异寡核苷酸与一个通用引物构成的一对寡核苷酸组成的引物。

该引物用于要扩增的序列链延伸的起始，不仅可以用于PCR法、也可以使用在LCR法、TAS法等扩增法中。该引物的用途不限定于特定核酸扩增法，也可以用于各种各样的用途、应用、目的。

在该检测方法中，利用上述“基因重组技术”所述方法获得核酸样品，根据需要，可以使用能够特异扩增靶基因的引物进行扩增反应，检定是否发生扩增。因此，在本发明方法中，可以使用已知的DNA，mRNA等核酸提取法或其它适当的核酸提取方法。可以用任意的扩增方法扩增所提取的DNA，mRNA等核酸，例如PCR法、RT-PCR法等。将扩增产物进行例如电泳、如进行琼脂糖凝胶电泳后，通过常规方法，例如用溴乙锭染色剂染色后，通过UV照射检测有无被扩增的DNA。或利用特定探针进行检测。例如、被检验的样品中没有半乳糖凝集素-9基因的表达时，由于不发生扩增或低水平扩增，例如、也可以使用印迹法、反相印迹法等用分离行扩增生成物的检测方法。

在本说明书中，可以单独或组合使用作为靶的相关蛋白质或多肽、其片段以及含有DNA的核酸(包括mRNA划寡核苷酸)，也可以进一步与反义技术、包括单克隆抗体在内的抗体、重组细胞(转化体)等适当组合，可应用于基因组学和蛋白质组学技术。可以使用核酸阵列、蛋白质阵列进行基因表达分析、基因功能分析、蛋白质间相互作用分析、相关基因分析。例如、在核酸阵列技术中可以使用cDNA文库，或用PCR技术将得到的DNA用电印仪器高密度地配置在基板上后，用杂交分析样品的。

该阵列化可以通过使用针或插针(pin)，或喷墨打印技术等，使DNA附着在载玻片、硅板、塑料板等基板的各个固有位置上。观测在该核酸阵列上杂交的结果得到的信号取得数据。可以通过荧光色素等标记(例如、Cy3，Cy5，BODIPY，FITC，Alexa Fluor dyes(商品名)，Texas red(商品名)等)获得该信号。在检测中也可以利用激光扫描等，可以通过装有来自于适当算法的程序的计算机系统处理得到的数据得到的数据。而在蛋白质阵列技术中，可以利用附有的标签重组表达蛋白质产物，利用双向电泳(2-DE)、包括酶消化片段在内的质量分析(MS)(其中包括电喷雾电离法(electrospray ionization：ESI)，基质辅助激光解吸附-电离法(matrix-assisted laser desorption/ionization：MALDI)等技术，可以使用MALDI-TOF分析仪、ESI-3连四重极分析仪、ESI-离子阱分析仪等)、染色技术、同位素标记以及分析、图像处理技术等。因此，在本发明中也包括与上述得到的或可利用的酶-基因系统等以及针对它们的抗体有关的软件、数据库等。

可以通过免疫染色、例如组织或细胞染色、免疫电子显微镜、免疫测定分析、例如竞争性免疫测定分析或非竞争性免疫测定分析进行本发明中的检测-测定，可以使用放射免疫测定法(RIA)，FIA，LIA，EIA，ELISA等，也可以进行或不进行B-F分离，进行测定。最好是RIA，EIA，FIA，LIA以及夹层分析。例如在夹层分析中，一方作为针对本发明的半乳糖凝集素-9多肽的抗体或针对半乳糖凝集素-9相关肽片段的抗体，另一方作为针对半乳糖凝集素-9的C末端侧残基的抗体，然后对一方进行可检测标记(当然也可以是其它的组合，可以根据目的适当设计)。将能够识别同一抗原的其它抗体固定于固相。根据需要为了使被检样品和标记化抗体以及固相化抗体依次反应进行温育处理，分离非结合抗体后，测定标记物。被测定的标记的量与抗原、即半乳糖凝集素-9多肽抗原的量成比例。在该分析中，根据不溶性抗体或标记化抗体的添加顺序被称为同时夹心分析、正向(forward)夹心分析或反向夹心分析等。在这些测定工序中于特定状况下可适当采用例如清洗、搅拌、振荡、过滤或抗原预提取等。特定的试剂、缓冲液等的浓度、温度或温育处理时间等其它测定条件可以根据检体中的抗原浓度、检体样品的性质等要素相应改变。本领域的技术人员可以使用通常的实验法，适当选定针对各测定的有效的最适条件进行测定。

作为半乳糖凝集素-9的测定系统，例如：对于组织，可有效利用免疫染色(METHODS，24，289-296(2001)；J Immunol Methods，47(2)，129-144(1981)；ibid.，150(1-2)，5-21，23-32 & 151-158(1992)；Cancer J，7(1)，24-31(2001)等)、免疫电子显微镜(MolBiotechnol，7(2)，145-151(1997)；J Electron Microsc Tech.，19(1)，57-63 & 64-79(1991)；ibid.，19(3)，305-315(1991)等)这种蛋白测定系统、原位杂交这种的表达基因测定系统，针对组织提取物，可有效利用EIA，RIA，FIA，LIA，western印迹(J ElectronMicrosc(Tokyo)，45(2)，119-127(1996)；Methods Biochem Anal.，33，1-58(1988)；Methods Enzymol.，271，177-203(1996)；ibid.，305，333-345(2000)；J Immunol Methods，152(2)，227-236(1992)；ibid.，170(2)，177-184(1994)；ibid.，195(1-2)，149-152(1996)；口野嘉幸他编、“基因-蛋白质、实验操作绘图法”、株式会社软件科学社、昭和62年11月10日发行等)这种蛋白测定系统、Northern印迹、斑点印迹、RNase保护分析、RT-PCR(reverse transcriptionpolymerase chain reaction)、实时PCR(Clinical Chemistry，46：11，1738-1743(2000))这种表达基因测定系统、以及针对血中、体液等的EIA，RIA，FIA，LIA，Western印迹的蛋白测定系统。另外，可直接构建半乳糖凝集素-9诱导因子的测定系统，然后有效利用。

在EIA测定体系中，例如在竞争法中，用抗半乳糖凝集素-9抗体作为固相化抗体，使用标记抗原以及非标记抗原(作为抗原，如半乳糖凝集素-9或其片段肽等)，而在非竞争法中，例如在夹心法中，除了可以利用固相化抗半乳糖凝集素-9抗体或标记的抗半乳糖凝集素-9抗体外，也可以直接标记抗半乳糖凝集素-9抗体，或不进行固相化对针对抗半乳糖凝集素-9抗体的抗体进行标记后，进行固相化。作为灵敏度扩增法，例如、在与非酶标记一抗的组合中，如利用与高分子聚合物和酶的一抗(应用Envision试剂；Enhanced polymer one-stepstaining(EPOS))，在与非酶标记二抗的组合中，例如PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等的酶和抗酶抗体复合物的组合、SABC(avidin-biotinylated peroxidase complex)法等的生物素标记二抗和生物素标记酶-抗生物素蛋白复合物的组合、ABC(streptavidin-biotin complex)法、LSAB(labeled streptavidin-biotin)法等的生物素标记二抗和生物素标记酶-链抗生物素蛋白复合物的组合、CSA(catalyzed signal amplification)法等的SABC和生物素标记酪胺(Tyramide)和酶标记链霉亲和素的组合、用高分子聚合物对二抗和酶进行标记的组合等。

在本发明的测定法中，优选使用免疫学的测定法，此时作为固相载体，可以任意选用很好吸附抗体等蛋白质的聚苯乙烯制、聚碳酸酯制、聚丙烯制或聚乙烯制的球、微板、杆、微粒或试管等各种各样的材料和形态。

测定时，可以在能够保持最适pH、例如pH约4～约9那样的适当缓冲液系中进行。作为特别优选的缓冲剂，例如乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、Tris-盐酸缓冲剂、巴比妥缓冲剂等。缓冲剂相互间可以以任意比例混合后使用。抗原抗体反应最好是在约0℃～约60℃之间的温度下进行。

将那些包括各个免疫学的测定法在内的各种分析、定量法运用到本发明的测定方法时，不用设定特别条件、操作等。可以在各个方法的通常条件、操作法中考虑到同行通常的技术，构建以本发明的对象物质或与其实质上具有同等活性的物质相关的测定系统。

有关常规技术手段的详细报道可以参照综述、工具书等[例如：入江宽编，《放射免疫分析》，讲谈社，昭和49年发行；入江宽编，《放射免疫分析续》，讲谈社，昭和54年发行；石川荣治等人编，《酶免疫测定法》，医学书院，昭和53年发行；石川荣治等人编，《酶免疫测定法》(第2版)，医学书院，昭和57年发行；石川荣治等人编，《酶免疫测定法》(第3版)，医学书院，昭和62年发行；H.V.Vunakiset al.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.70(ImmunochemicalTechniques，Part A)，Academic Press，New York(1980)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.73(Immunochemical Techniques，Part B)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.74(Immunochemical Techniques，Part C)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methods inEnzymology″，Vol.84(Immunochemical Techniques，Part D：Selected Immunoassays)，Academic Press，New York(1982)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.92(Immunochemical Techniques，Part E：Monoclonal Antibodies andGeneral Immunoassay Methods)，Academic Press，New York(1983)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part I：Hybridoma Technology andMonoclonal Antibodies)，Academic Press，New York(1986)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methods in Enzymology″，Vol.178(Antibodies，Antigens，and Molecular Mimicry)，Academic Press，New York(1989)；M.Wilchek et al.(ed.)，″Methods inEnzymology″，Vol.184(Avidin-Biotin Technology)，AcademicPress，New York(1990)；J.J.Langone et al.(ed.)，″Methodsin Enzymology″，Vol.203(Molecular Design and Modeling：Concepts and Applications，Part B：Anibodies and Antigens，Nucleic Acids，Polysaccharides，and Drugs)，Academic Press，NewYork(1991)等或其中引用的文献(这些文献中记载的内容和相关参考文献都包括在本说明书的内容中)]。

根据上述的《基因重组技术》，通过该领域中用于检测(测定特定基因表达的已知手法、例如原位杂交、Norther印迹、斑点印迹、RNase保护分析、RT-PCR、实时PCR(Journal of Molecular Endocrinology，25，169-193(2000)以及其中引用的文献)、DNA阵列分析法(MarkShena编、″Microarray Biochip Technology″，Eaton Publishing(2000年3月))等检测、测定半乳糖凝集素-9表达基因(包括cDNA等DNA以及mRNA等RNA)，由此检测半乳糖凝集素-9诱导因子活性。采用上述技术的半乳糖凝集素-9基因表达测定系统、在该测定系统中采用的试剂、方法、过程等都包括在本发明的半乳糖凝集素-9诱导因子活性检测剂、半乳糖凝集素-9诱导因子活性检测方法以及利用上述试剂和检测方法的系统中。在该原位杂交中，例如可包括非RI原位杂交，其中可包括直接法和间接法。如：直接法使用可与核酸探针中直接结合的可被检测的分子(报告分子)，间接法使用例如针对报告分子的抗体等使信号扩增。在核酸探针中的寡核苷酸中可以预先导入功能基团(例如、第一级脂肪族氨基、SH基等)，在这种功能基团上结合半抗原、荧光色素、酶等。作为核酸探针的标记，代表性的如洋地黄毒甙(DIG)、生物素、荧光素等，可以适当选用如上述在抗体处说明的标记，或者利用多重标记，还可以利用标记抗体。作为核酸探针的标记法，可以适当选用该领域已知的方法，例如：随机引物法、切口平移法、PCR扩增DNA、标记/加尾法、体外转录法法等。观察处理样品时，可以适当选用本领域已知的方法，例如：可以使用暗视野显微镜、相差显微镜、反射对比显微镜、荧光显微镜、数字图像显微镜、电子显微镜等，还可以使用流式细胞术等。在本发明中，可以使用半乳糖凝集素-9以及半乳糖凝集素-9表达基因作为半乳糖凝集素-9诱导因子的标记(marker)，利用该标记，可以形成各种形态的半乳糖凝集素-9诱导因子活性检测剂或半乳糖凝集素-9诱导因子检测和/或测定剂、半乳糖凝集素-9诱导因子活性检测方法或半乳糖凝集素-9诱导因子检测和/或测定方法、以及半乳糖凝集素-9诱导因子活性检测或半乳糖凝集素-9诱导因子检测和/或测定试剂盒或系统，不仅在半乳糖凝集素-9诱导因子的纯化、鉴定、分离、利用中起作用，而且性能优良。

本发明中提供了通过诱导半乳糖凝集素-9产生、释放来抑制癌转移的方法、该方法中使用的试剂、试剂盒、或系统(包括检测、测定系统)等。通过控制半乳糖凝集素-9在生物体内的浓度、或表达，可以提供抗肿瘤剂、抗变态反应剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素的代用活性成分剂。另外，可以将半乳糖凝集素-9诱导因子应用于需要糖皮质激素的药理作用、生物活性的领域。

变态反应和自身免疫疾病是由CD4阳性T淋巴细胞的过度免疫反应引起的，在顽固性变态反应和自身免疫疾病的治疗中使用类固醇或免疫抑制剂。因为已知半乳糖凝集素-9与这些反应有关，所以预期半乳糖凝集素-9诱导因子会具有免疫抑制作用、抗炎症作用、抗变态反应活性，所以可以用作抗肿瘤剂、抗变态反应剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代剂。

将本发明的活性成分[例如、半乳糖凝集素-9诱导因子、含有该因子的液体等]作为医药使用时，通常将其单独或与药理上容许的各种制剂辅助剂混合之后作成医药组合物或医药制备物等给药。优选以适合口服给药、局部给药、或非口服给药等制剂制备物的形态给药，也可以根据目的使用任一种给药方式(包括吸入法或直肠给药)。

另外，本发明的活性成分也可以与各种医药例如：抗肿瘤剂(抗癌剂)、肿瘤移转抑制剂、血栓形成抑制剂、关节破坏治疗剂、镇痛剂、消炎剂和/或免疫抑制剂配合后使用，这些制剂只要是具有有利的作用，可以无限制地使用，例如可以选用该领域中已知的制剂。

而作为非口服给药方式，包括局部、经皮、静脉内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内给药，也可以向患部直接给药，在某些场合下直接用药也是合适的。优选向包括人在内的哺乳动物经口、或不经口(例、细胞内、组织内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髓腔内、点滴法、注肠、经直肠、点耳、点眼和点鼻、涂布牙、涂布皮肤或涂布粘膜等)给药。作为具体的制剂制备物的形态，如：溶液制剂、分散制剂、半固体制剂、粉粒体制剂、成型制剂、浸出制剂等，例如、片剂、包被片剂、实施了糖衣的制剂、丸剂、锭剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、埋置剂、粉末剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、注射剂、液剂、酏剂、乳剂、灌注剂、糖浆、水剂、乳剂、悬浊剂、搽剂、洗剂、气雾剂、气雾剂、吸入剂、喷雾剂、软膏制剂、硬膏制剂、贴付剂、糊剂、温湿剂、乳膏剂、油剂、栓剂(例如、直肠栓剂)、酊剂、皮肤用水剂、点眼剂、点鼻剂、点耳剂、涂布剂、输液剂、用于注射用液剂等的粉末剂、冷冻干燥制剂、凝胶制剂等。

可以按照通常的方法进行医药用的组合物的制剂。例如、根据相应需要，可以单独或将生理学上认可的载体、在医药上容许的载体、佐剂、赋形剂、助形剂、稀释剂、香味剂、香料、甜味剂、膨化剂、防腐剂、稳定剂、结合剂、pH调节剂、缓冲剂、表面活性剂、基剂、溶剂、填充剂、增量剂、溶解辅助剂、增溶剂、等渗剂、乳化剂、悬浊化剂、分散剂、增粘剂、凝胶化剂、硬化剂、吸收剂、粘着剂、弹性剂、增塑剂、崩解剂、喷射剂、保存剂、抗氧化剂、遮光剂、保湿剂、缓和剂、防带电剂、无痛化剂等组合后使用，可以通过将它们一起与本发明的蛋白质等混合，制造成常规制剂中要求的单位用量形态。

作为适于非经口使用的制剂，如：活性成分与水或其它的药学上容许的介质的无菌性溶液或悬浊液剂等，例如注射剂等。一般来说，优选用如水、盐水、葡萄糖水溶液、其它相关的糖溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等醇类作为理想的注射剂用液体载体。制备注射剂时，使用蒸馏水、林格液、生理盐水那样的载体、适当的分散剂或湿化剂以及悬浊液剂等，通过该领域中已知的方法，将溶液、悬浊液、乳剂制备成能够分次注射的形式。

作为注射用水性液，例如含有生理盐水、葡萄糖或其它的辅料(例如、D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)的等渗液等，也可以并用药理上容许的适当的溶解辅助剂、例如醇(如乙醇等)、聚醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如聚山梨酯80^TM，HCO-50等)等。作为油性液，如芝麻油、大豆油等，作为溶解辅助剂，也可以并用苯甲酸苄酯、苄醇等。另外，也可以与缓冲剂(例如：磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)或用于调节渗透压的试剂、无痛化剂(例如：烷基二甲基苄基氯化铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如：人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如：苄醇、苯酚等)、抗坏血酸等抗氧化剂、吸收促进剂等配合。制备的注射液通常充填在适当的安瓿瓶中。

在不经口给药时，可以加或不加表面活性剂以及其它药学上容许的助剂，制剂成水、乙醇或油那样的无菌的药学上容许的液体中的溶液或悬浊液的形态。作为制剂中可使用的油性载体或溶剂，如：天然或合成或半合成的单、或二、或三甘油酯类；天然、半合成或合成油脂类或脂肪酸类，例如：花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如：这样的注射剂通常可以制备成含有0.1～10重量％左右的本发明化合物制剂。

可以使用药理上容许的载体通过惯用的方法制备适于局部的、例如口腔、或直肠使用的制剂，例如：漱口剂、磨牙剂、口腔喷雾剂、吸入剂、软膏剂、牙科充填剂、牙科包衣剂、牙科膏剂、栓剂等。作为漱口剂、其它牙科用剂。作为口腔喷雾剂、吸入剂，可以将本发明化合物本身或其与药理上容许的非活性载体一起溶解于湿雾剂或喷雾器用的溶液或作为吸入用微粉末投给牙等。可以通过添加通常使用的基剂、例如、软膏基剂(白色凡士林、石蜡、橄榄油、聚乙烯二醇400、聚乙烯二醇软膏等)等，利用惯用的方法制备软膏剂。

可以将向牙、皮肤局部涂布用的药品制备成适当杀菌的水或非水赋形剂溶液或悬浊液制剂。作为添加剂，例如亚硫酸氢钠或依地酸二钠类的缓冲剂；醋酸或含有硝酸苯基汞、烷基二甲基苄基氯化铵或双氯苯双胍己烷的杀菌和抗真菌剂的防腐剂，以及羟丙甲纤维素那样的增稠剂。

对于栓剂，使用在该领域公知的载体，优选非刺激性的适当的赋形剂、例如聚乙烯二醇类、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等，优选常温下为固体，而在肠道温度下为液体，在直肠内释放出融解的药物的载体等，可以通过惯用的方法制备，通常制备成含有本发明化合物0.1～95重量％左右的制剂。通过使用不同的赋形剂和浓度，可以使药品悬浮于或溶解于赋形剂中。可将局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂这类辅料溶解于赋形剂中。

作为适合经口使用的制剂，可列举：片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、口含片这种固体组合物、或者液剂、糖浆、悬浊剂这种液体状组合物等。制备制剂时，可使用该领域已知的制剂辅料等。片剂和丸剂也可以再包被糖衣。配料单位方式为胶囊时，除了可以使上述类型的材料之外，还可再含有油脂这种液体状载体。

此外，当活性成分为蛋白质或多肽时，由于聚乙烯二醇(PEG)在哺乳动物中毒性非常低，可以使之与蛋白质或多肽结合使用。另外，如果结合使用PEG，有时可以有效地减少异种性化合物的免疫原性以及抗原性。该也可以将化合物加入到微囊中后再给药。如PEG的聚合物可以简便地附着在氨基末端氨基酸的α-氨基、赖氨酸侧链的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸侧链的羧基、羧基末端氨基酸的α-羧基、或某些天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基上的葡糖链被活化的衍生物上。

已知有很多适合与蛋白质直接反应的已活化形式的PEG。作为可用于与蛋白质的氨基反应的PEG试剂，如：羧酸、羧酸衍生物的活性酯、特别是释放基团为N-羟琥珀酰亚胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸。同样含有氨基肼或酰肼基的PEG试剂可用于与蛋白质中的过碘酸氧化而生成的醛的反应。

本发明的活性成分其给药量选择范围很宽可以根据治疗患者的性别、年龄、体重、一般的健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄速度、药物的组合、患者进行治疗时的病情，考虑了这些因素以及其它要素后决定给药量以及给药次数等。

制造医药品时，其添加剂等或制备法等可以参考例如日本药局方说明书编集委员会编、第十四改正日本药典说明书、平成13年6月27日发行、株式会社广川书店；Hisashi Ichibagade等编，医药品的开发12卷(制剂素剂[I])、平成2年10月15日发行、株式会社广川书店；同、医药品的开发12卷(制剂素材[II])平成2年10月28日发行、株式会社广川书店等所述，从中根据需要适当选择运用。

本发明的活性成分的用途及其优点正如本说明书所说明的：该活性成分通过诱导(a)半乳糖凝集素-9的产生以及释放，对半乳糖凝集素-9承担的生物活性进行控制，例如：人半乳糖凝集素-9对正常细胞没有表现出细胞素活性，但对肿瘤细胞表现出细胞素活性的性状，诱导肿瘤细胞凋亡，但不诱导正常细胞凋亡的性状，抑制恶性细胞的转移性的性状，诱导活化的免疫细胞、特别是诱导活化的CD4阳性T细胞的凋亡的活性(与此相反，对静止的T细胞、特别是CD4阳性静止的T细胞(辅助T细胞)无凋亡诱导活性的性状)等，有望将其用作抗肿瘤剂、抗变态反应剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂、可利用其与肾上腺皮质类固醇激素同样活性的药剂。

在本说明书中可以测定自然杀伤细胞的细胞毒性。有关通过活性物质的刺激引起的自然杀伤(NK)细胞的细胞素性的测定法可以从该领域中已知的方法中选择适用的测定法，可以利用市售的分析试剂盒。作为市售分析试剂盒，例如LDH细胞毒性检测试剂盒(TaKaRa)等。具有代表性的细胞毒性测定法是通过测定由细胞放出的乳酸脱氢酶(LDH)来测定细胞毒的方法，该LDH通常不能通过细胞膜，如果细胞膜受到伤害，就会释放到细胞外、即培养基中。该方法是根据释放在培养基中的LDH使乳酸脱氢后生成丙酮酸和NADH的活性进行分析的方法。生成的NADH在黄递酶催化下还原为四氮唑盐，由于形成具有490nm吸收的红色的甲臜色素，490nm的吸光度量增大，所以可以测定LDH活性。在该方法中，由于死细胞或细胞膜受到伤害的细胞数表现为培养上清中的LDH酶活性增加，由此可以测定细胞毒活性。

在其它的分析法中，在得到单核白细胞(mononuclear leukocyte；MNL)后，用活性物质(例如：BALL-mf、IL-2等)刺激该细胞(3×10⁶个/mL)或进行对照的无刺激处理(例如：用PBS进行处理)，在添加了10％FCS的适当培养基(例如：抗菌、抗真菌性溶液(antibioticantimycotic solution；Sigma chemicals，St.Louis，MO，USA)RPMI1640培养基等)中进行培养。培养后将该细胞用作靶细胞的效应细胞。用Na₂ ⁵¹CrO₄(Daiichi Radioisotope Laboratories，东京；比活性，1mCi/mL)进一步处理靶细胞K562，对其进行标记(50μCi/10⁶个细胞)。将该细胞洗2次后，再于37℃下培养30分钟。将洗涤后的细胞按照1×10⁵个/mL的比例重悬。将该标记的细胞加到96-孔的圆底微孔板的各个孔中(1×10⁴个细胞/孔，3组)、按照效应细胞∶靶细胞比(E∶T比)为10～40，将其与效应细胞一起温育处理。为了检测到自发性的Cr释放，在单独的培养基中使用进行温育处理的靶细胞，为了检测到最大的Cr释放，使用在1N HCl中进行温育处理的靶细胞。

将板于37℃下温育处理4小时，于350g下离心处理6分钟，获得上清液(100μL)，使用γ计数器(Aloka，东京)测定上清液的放射活性。

利用下式计算细胞的裂解％：

用平均值±SE表示细胞毒性，使用Student′s检试评价统计上的有意性。

在说明书以及附图中，所用用语参照IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature或本领域的习惯用语。

实施例

以下给出实施例，对本发明进行具体说明，该实施例只是为了对本发明进行说明，是作为发明的具体方式的参考提供的。这些示例是为了说明本发明的特定具体的方式的示例，并不表示限定或限制本说明书公布的发明范围。就本发明来说，应当理解为基于本说明书的思想的各种各样的实施方式都是可能的。

所有的实施例除了另外详细叙述的内容之外，都是利用标准技术实施或可以实施的例子，这些是同行众所周知的惯用作法。

另外，在以下的实施例中，没有特别指出时，在DNA克隆中的具体的操作以及处理条件等根据J.Sambrook，E.F.Fritsch &T.Maniatis，″Molecular Cloning″，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)以及D.M.Gloveret al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1 to 4，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；PCR法，H.A.Erlich ed.，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover et al.ed.，″DNA Cloning″，2nd ed.，Vol.1，(ThePractical Approach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)以及M.A.Innis et al.ed.，″PCR Protocols″，AcademicPress，New York(1990)所述的方法进行，或者在使用市售试剂或试剂盒时，使用附带的说明书或附带的药品等。

实施例1

[肿瘤细胞膜的溶解]

作为肿瘤细胞使用来自B细胞淋巴瘤的细胞株BALL-1细胞以及Daudi细胞制备该细胞膜可溶性级分。使用对Hirashima，M.et al.，Immunol.Letters，36：273-281(1993)以及Seki，M.et al.，Int.Arch.Allergy Immunol.，114：2-5(1997)所述方法加以改变的方法进行溶解处理。将在含有10％ FCS的RPMI1640培养基中培养的BALL-1细胞作为起始原料。将收获的BALL-1细胞重悬于1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)-PBS中(1×10⁹cell/5mL)。使用液氮和室温水进行4次冷冻-融解处理(冷冻-融解×4次)。然后超声处理(output＝4，dutycycle％＝50、冰上、4分钟(实际上2分钟左右))。超声处理2分钟后，间歇后，再超声2分钟。对得到的破碎物进行离心分离。于100000G，1小时，4℃的条件下实施离心分离处理。

将经离心分离处理得到的沉淀重悬于由与将上述BALL-1细胞悬浮于1mM PMSF-PBS时等量的50mM Tris-HCl(pH 8.2)，1mM EDTA以及1％CHAPS组成的溶液中，进行匀浆处理。使用10mL或20mL的聚四氟乙烯(注册商标)-玻璃匀浆器，于冰上进行数分钟匀浆处理，直至沉淀完全消失。对得到的生成物进行离心分离。于20000G(15,000rpm)，30分钟，4℃的条件下实施离心分离处理。

回收上清液(Sup(MF))，测定吸光度(Optical Density：OD)。使用由50mM Tris-HCl(pH 8.2)，1mM EDTA以及1％ CHAPS组成的溶液作为空白。用PBS彻底透析得到的上清液，然后使之通过0.2μmL孔径的滤膜，获得肿瘤细胞膜可溶性级分(mf)。在使用之前一直保存在-80℃。另外对于在含有20％ FCS的RPMI1640培养基中培养的Daudi细胞(2×10⁸个/mL)进行同样处理，得到mf，在使用之前一直保存在-80℃。

[肿瘤细胞制备]

使用Meth-A肉瘤作为靶肿瘤细胞。可以在含有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素以及0.25μg/mL双性霉素B的RPMI 1640培养基中维持培养Meth-A肉瘤细胞。将培养的细胞(1×10⁶个/100μL PBS液)接种在Balb/c小鼠的背部皮下。3周后、将生长的肿瘤切下，切成2cm大小，置于添加了1mg/mL胶原酶(I型、Sigme C-0130；Sigma，St.Louis，MO，USA)的含有10％FBS的RPMI 1640培养基中。将混合物用匀浆器进行持续搅拌，于37℃下进行1.5小时匀浆处理化处理，通过绵纱布过滤后，用PBS洗2次，然后再次悬浮于PBS中(2×10⁶个/mL；活细胞率，约90％)。

[肿瘤的增殖和排斥]

将Meth-A细胞(1×10⁵个/50μL)于BALB/c小鼠(7周令雄，n＝10/组)的背部进行皮下接种。接种后立即向该动物的该肿瘤细胞接种部位周围皮下注射100ng/200μL的BALL-mf或Daudi-mf(100μL/部位)。使用PBS作为对照。每隔3日注射一次，反复进行。每周对该动物的体重以及该肿瘤的大小(短轴为a，长轴为b)测定三次。依据Attia et al.，Cancer Res.，26：1787-1800(1966)所述的方法，用下式计算求出肿瘤的体积(V)：V(mm³)＝0.4×a×b²。

[半乳糖凝集素-9的RT-PCR]

使用TRIZOL试剂(Gilbco，BRL)从BALL-mf，Daudi-mf或用PBS处理的细胞中分离出总RNA。使用Gene Amp RNA PCR试剂盒(PerkinElmer)对0.5μg的总RNA进行一步逆转录处理，制备DNA，然后通过聚合酶链式反应(PCR)对小鼠半乳糖凝集素-9或人半乳糖凝集素-9以及GAPDH的转录产物进行扩增。依据试剂盒制造者的指示进行逆转录(RT)反应以及PCR。即使用通过Amersham Pharmacia Biotech合成的如下引物序列：

人半乳糖凝集素-9

正义序列，hG9S：CGTCAATGGCTCTGTGCAGCTGTC[序列号：3]

反义序列，hG9AS：AGATCCACACTGAGAAGCTCTGGC[序列号：4]

小鼠半乳糖凝集素-9

正义序列，mG9SQ1：GGTCAGAGTTCAAGGTGATGGTGA[序列号：5]

反义序列，mG9SQ2：GCCTGATATCATGATGGACTTGGA[序列号：6]

反复进行30次PCR循环，对所有的转录产物进行扩增。所有反应都是在GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer AppliedBiosystems)中进行的。为了能够在UV下可见，将PCR产物加到含有溴乙锭(1μg/mL)的琼脂糖凝胶中。纯化各PCR产物。使用ABIPRISM Big Terminator Dye Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin Elmer Applied Biosystems)进行半乳糖凝集素-9PCR产物的测序。

在各反应中，将如下试剂：8μL的Terminator Reaction Mix，500ng的PCR产物，3.2pmol的用于Gal-9的引物以及去离子水添加到试管中。在GeneAmp PCR System 2400上进行DNA的测序。

由低分子条带处的PCR产物和高分子条带处的PCR产物两处得到的序列对应于连接肽区域长度不同的半乳糖凝集素-9的序列。最后使用NIH image 1.61程序测定带的强度。

[Western印迹]

(1)从兔抗人重组半乳糖凝集素-9CT血中纯化人重组半乳糖凝集素-9CT特异抗体

由用人Gal-9的C-末端侧结构域免疫的兔中得到纯化的多克隆抗体(抗人Gal-9抗体)。该抗体是使用结合Gal-9的C-末端侧结构域的琼脂糖纯化的抗体，确认该抗体也可识别小鼠Gal-9。

1.抗血清的硫铵分级(粗IgG级分的制备)

将抗血清(兔抗人重组半乳糖凝集素-9CT血清、100mL)和磷酸缓冲生理盐水(以下称为PBS，100mL)加入到冰冷玻璃制烧杯中，使用30mm的聚四氟乙烯(注册商标)搅拌子于磁力搅拌器上对该液一边搅拌，一边以每分钟5mL的速度滴下饱和硫酸铵溶液(100mL)。将饱和硫酸铵溶液全部添加完后，再继续搅拌30分钟。将得到的液体移到离心管中，于13000rpm(RPR-16转头、17000xG、高速离心机、日立工机(株))下离心30分钟(4℃；以后没有特别指定时，离心操作都是在4℃进行)。去掉上清，向沉淀物中加100mL的PBS(冰冷；以后没有特别指定时，都是使用冰冷的PBS)，进行溶解。将得到的溶液移到放入20mm聚四氟乙烯(注册商标)搅拌子的烧杯中。通过与上述同样的操作，滴下冰冷下饱和硫酸铵溶液(67mL)，再搅拌30分钟。将得到的溶液移到离心管，于13000rpm(RPR-16转子、高速离心机、日立工机(株))离心30分钟。去掉上清，将沉淀溶解于PBS(50mL)。将溶液加到透析管(透析膜27、和光纯药工业(株))中，用PBS进行透析处理。将透析后透析袋内的液体移到离心管，于13000rpm(RPR-16转子)离心30分钟。每10mL上清加0.05mL的10％(w/v)叠氮钠，装入到塑料瓶中保存在4℃下(粗IgG级分)。

2.使用抗原柱的亲和纯化

向上述过程1.制备的粗IgG级分(50mL)中加入等量的PBS(含有40mmol/L乳糖和0.05％(w/v)叠氮钠)，作为稀释的粗IgG级分液。将GST-重组半乳糖凝集素-9CT(10～20mg)固定化HiTrap^NHS-活化柱(5ml、Amersham Biosciences社)与恒流泵连接，通过用20mL的PBS(20mmol/L乳糖含有)清洗柱子，进行平衡(流速：每分2ml)。使稀释的粗IgG级分液流过平衡后的柱子(流速：每分钟1ml)，将由柱流出的最初5mL舍去，而将之后的流出液收集在塑料瓶中。粗IgG级分一流完，再使5mL的PBS流过，该流出液也收集在同一塑料瓶中。使塑料瓶内的液再度于同样条件流过柱，此时的流出液都收集在塑料瓶。然后用50mL的PBS(含有20mmol/L乳糖)清洗(流速：每分钟2mL)柱。将流出液的最后2mL收集在试管中，用PBS(含有20mmol/L乳糖)作为对照，测定280nm的吸光度。吸光度在0.02以上时，再用10mL的PBS(含有20mmol/L乳糖)清洗。测定流出液的最后2mL的吸光度，反复进行该操作，直至吸光度处于0.02以下为止。然后使30mL的0.2mol/L甘氨酸-盐酸(pH 2.5)流过柱子(流速：每分钟1mL)，按照每2mL对流出液进行分级。测定各级分的280nm吸光度，将吸光度0.1以上的级分归为一个级分。使用1mol/L的2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(以下称为tris)和pH计，将该洗脱级分的pH调到7～7.5。用40mL的PBS(含有0.05％(w/v)叠氮钠)平衡(流速：每分钟2mL)柱子，保存在4℃下。将洗脱级分装入透析管(透析膜20、和光纯药工业(株))，用PBS进行透析处理(4℃)。将透析管内的溶液移到离心管中，于13,000rpm(RPR-18转子、17,000xG、高速离心机、日立工机(株)))离心30分钟。每10mL上清加0.1mL的10％(w/v)叠氮钠，装入塑料瓶保存在4℃下(亲和纯化抗-9CT抗体)。

3.从亲和纯化抗重组半乳糖凝集素-9CT抗体中除去重组半乳糖凝集素-7交差抗体

将GST-重组半乳糖凝集素-7(5～10mg)固定化HiTrap^NHS-活性柱(5mL、Amersham Biosciences社)与恒流泵连接，用20mL的PBS清洗(流速：每分钟2mL)。使上述2.中得到的亲和纯化抗重组半乳糖凝集素-9CT抗体流过(流速：每分钟0.5mL)GST-重组半乳糖凝集素-7固定化柱，舍去从柱中流出的最初的4mL，将之后流出的溶液收集在塑料瓶中。亲和纯化抗重组半乳糖凝集素-9CT抗体一流完，再使5mL的PBS流过，该流出液也收集在同一塑料瓶。使收集在塑料瓶的流出液再度于同样条件下流过柱，按照同样要领收集流出液。测定280nm吸光度，保存在4℃下(最终纯化抗重组半乳糖凝集素-9CT抗体标准品)。使0.2mol/L甘氨酸-盐酸(pH 2.5)流过(流速：每分钟1mL)该柱，对吸附的半乳糖凝集素-7交差抗体进行洗脱，获得该抗体。

(2)免疫染色

向细胞沉淀中加裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，0.15M NaCl，2mMEDTA，2mM EGTA、然后新添加0.5mM PMSF，10μg/mL的亮抑酶肽，镇痛素，抑肽素A以及1mM DTT)后进行超声处理，制备细胞裂解液。

然后向细胞裂解液加SDS，将样品混合物于100℃下进行5分钟热处理后，置于冰上。将各样品加到12％丙烯酰胺-SDS凝胶上，使电泳分离后的蛋白质转移到PVDF膜(BioRad Laboratories)上。使用含有5％脱脂牛奶的0.1％Tween-20的PBS液(PBS-T)对非特异结合进行封闭。将该PVDF膜用PBS-T洗几次后，与用PBS-T稀释的10μg/mL的纯化抗重组半乳糖凝集素-9CT抗体一起温育处理1小时。然后将PVDF膜清洗后，与含有结合过氧化物酶的羊抗兔IgG(AmershamPharmacia Biotech)的PBS-T一起温育处理45分钟。该PVDF膜浸泡在ELC试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)中的ECL-HRP基质液中，用XJB-1 X射线(Kodak)进行曝光，使条带可见。

[流式细胞测量法分析]

为了研究结合于细胞表面的半乳糖凝集素-9的表达，进行离心处理后，收集细胞，用含有0.05％ NaN₃以及2％胎牛血清(FCS)的PBS(PBS+)进行清洗，在25μg/mL的兔抗人Gal-9抗体存在下于冰上进行30分钟温育处理。将细胞用PBS+洗几次后，与偶连FITC的山羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz Biotechnology)一起于冰上进行30分钟温育处理。

为了研究半乳糖凝集素-9在细胞内的表达，使用对Jacob，M.C.et al.，Cytometry，12：550-558(1991)以及Sumner，H.et al.，J.Immunol.Methods，136：259-267(1991)所述方法的稍做改变后的方法。

即，对细胞用含有冰冷的4％低聚甲醛的PBS再进行10分钟固定化处理。将细胞用PBS+清洗后，与添加了25μg/mL兔抗人Gal-9抗体的皂甙缓冲液(含有0.1％皂甙以及0.01M HEPES缓冲液的PBS，pH7.4)中的混合，将该细胞于室温下进行30分钟温育处理，然后于冰上与偶联FITC的山羊抗兔IgG抗体(Santa Cruz Biotechnology)一起进行30分钟温育处理。

通过使用SYSTEM II^TM Software Version 1.0的COULTER EPICSXL-MCL流式细胞仪对于在散射计(15000events)分选的全部细胞的半乳糖凝集素-9染色进行分析。为了确认流式细胞仪的最适配置以及流动系统，使用Flow-check^TM荧光粒子(fluorospheres；COULTERCorporation)。

[组织病理分析]

肿瘤细胞接种27日后切取肿瘤，测定其重量。在缓冲处理为中性的10％甲醛溶液中对组织病理检查用样品进行固定化后，将石蜡包埋组织切成4μm厚度的切片，进行脱石蜡处理、再水化处理、然后用苏木精和伊红或吉姆萨试剂染色。

[原位杂交]

为了研究在注射BALL-mf的部位蓄积的细胞中是否含有半乳糖凝集素-9mRNA，进行原位杂交。

使用DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7；Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，德国)，通过体外转录法合成用洋地黄毒甙标记的RNA探针。将通过PCR扩增得到的半乳糖凝集素-9的cDNA片段(核苷酸序列的第500～1208位的碱基；Matsumoto，R.et al.，J.Biol.Chem.，273：16976-13984(1998))连入到pGEM-T EasyVector(Promege，Madison，WI，美国)中，进行克隆，使用线型的质粒DNA作为体外转录的模板DNA。合成正义探针和反义探针，使用正义探针作为阴性对照。按照适用于4μm的石蜡切片的杂交程序以试剂制造商提供的程序进行。于37℃下用蛋白酶激酶K消化处理2小时后，与20μL含1μg/mL探针的杂交液在43℃密封条件下杂交过夜。在严格条件下洗涤后、使用洋地黄毒甙检测试剂盒(RocheMolecular Biochemicals)使洋地黄毒甙标记显影。作为对照，使用该正义探针以及不用探针。

[结果]

[肿瘤的增殖曲线和肿瘤的排斥比率]

将Meth-A肉瘤接种于Balb/c小鼠后，研究BALL-mf，Daudi-mf以及PBS对肿瘤增殖影响的效果，结果表明在所有组中肿瘤细胞在最初2周都同样进行增殖(图1(a))。在Daudi-mf处置组以及PBS处置组两组小鼠中，后者肿瘤细胞还继续增殖，而这两组小鼠中肿瘤大小没有特别的差异(图1(a))。

BALL-mf处置组的小鼠于2周后肿瘤的大小开始减少，18日后与Daudi-mf处置组以及PBS处置组的小鼠相比，其肿瘤的大小显著变小(图1(a))。然而，实验期间中这三组小鼠之间体重没有明显的差异。在10只小鼠中有1只观察到在BALL-mf处置后第20天开始排斥肿瘤，而在第22天再有3只小鼠，在第25天又有4只小鼠也分别观察到排斥肿瘤。在用BALL-mf处置的10只小鼠中的8只在第27天完全排斥肿瘤，但在PBS处置组的小鼠或Daudi-mf处置组的小鼠中10只中仅有1只排斥。

这些结果表明BALL-mf具有抗肿瘤活性(图1(b)，卡方(χ²)检验，p＝0.0006)。

[组织病理学的检查]

通过组织病理学研究阐明了肿瘤周围BALL-mf注射部位的细胞的反应。就像图2a所示那样，在注射了BALL-mf的小鼠中，在其注射的部位发现主要由嗜酸性细胞(加了E的箭头)以及单核细胞组成的、伴有少数中性白细胞的肉芽组织。虽然在用Daudi-mf处置的小鼠中也发现肉芽组织，但浸润细胞主要是单核细胞，不是嗜酸性细胞(图2b)。在注射了BALL-mf的部位的皮肤肌肉层的上或下的结缔组织中发现很多肥大细胞，但在注射了Daudi-mf的部位的皮肤肌肉层的上结缔组织中只存在很少的肥大细胞。

另外还进行了肿瘤周围组织的组织病理学检查。就像图3a所示那样，在用BALL-mf处置的小鼠中，在肿瘤周围或肿瘤组织发现了炎症细胞(主要是嗜酸性细胞[加有E的箭头]以及少量肥大细胞[加有M的箭头]，不是中性白细胞)浸润的区域(图3a)。也发现了表现出核固缩(只有箭头的地方)的肿瘤细胞(图3a)。就像图3b所示那样，确认在肿瘤的周围或肿瘤组织中累积表现出异染性的肥大细胞。经比较，在用Daudi-mf处置的小鼠的肿瘤周围的组织发现显著的细胞内浸(图3c)，令人惊奇的是在肿瘤组织周围发现了无数中性白细胞(加有N箭头)以及单核细胞。在该部位检测到少量的嗜酸性细胞以及肥大细胞，未发现表现出核固缩的肿瘤细胞(图3c)。

[原位杂交]

为了确定在注射部位表达半乳糖凝集素-9的细胞的种类，进行了原位杂交。结果在皮下的肉膜肌(panniculus carnosus muscle)下发现嗜酸性细胞的浸润，已知在该部分主要是肥大细胞、以及成纤维细胞、淋巴细胞、嗜酸性细胞产生半乳糖凝集素-9(图6a)。在正常情况下通常在肉膜肌周围看不到肥大细胞，但由于注射BALL-mf在肉膜肌部发现含有半乳糖凝集素-9的肥大细胞的浸润(图6b)。就像图6a表示的那样，可在注射BALL-mf的部位发现表达Gal-9mRNA的细胞。通过形态学以及Giemsa染色认为强表达该Gal-9mRNA的细胞是肥大细胞(图6a以及6b)。虽然这个部位的单核细胞、嗜酸性细胞、成纤维细胞等也表达Gal-9mRNA，但与肥大细胞相比较，水平低得多(图6a)。另外在注射Daudi-mf的部位几乎看不到阳性细胞(图6c)。

用BALL-mf对Meth-A肉瘤荷瘤小鼠进行体内处置，发现肿瘤排斥，该肿瘤排斥可能是由于自然杀伤(NK)细胞的活化或半乳糖凝集素-9的产生-释放增强导致的结果。另外，在肿瘤周围组织发生嗜酸性细胞增加。已知恶性肿瘤的预后与浸润肿瘤的支持组织中的细胞的种类之间存在相关性。例如、在肿瘤周围存在淋巴细胞浸润的患者其预后良好。这可能是淋巴因子产生和/或NK细胞活化的结果。

肿瘤支持组织的嗜酸性细胞增加可能与良好的预后有关，但如果中性白细胞增加的组织和/或外周血中的中性白细胞：淋巴细胞的比率高，可能与预后不良相关。对此的一种解释是可能嗜酸性细胞与中性白细胞相比表现出的细胞毒活性更强，这大概是由于依赖于嗜酸性细胞过氧化物酶的羟自由基的生成引起的结果。杀肿瘤性嗜酸性细胞对肿瘤细胞的粘附与蛋白激酶的活化存在相关性。

在用BALL-mf处置的小鼠的肿瘤周围组织中发现不是中性白细胞，而是嗜酸性细胞的浸润。另外，在用Daudi-mf处置的小鼠中主要诱导了中性白细胞的浸润(图2a和图2b)。

认为在用Daudi-mf诱导的组织的嗜酸性细胞增加与用BALL-mf在该部位诱导的半乳糖凝集素-9有关。至此本发明人等发现半乳糖凝集素-9是属于半乳糖凝集素家族的成员，是新型、强效的嗜酸性细胞趋化因子(chemoaltraclenl)。

除了嗜酸性细胞之外，也可在肿瘤以及BALL-mf的注射部位的周围组织诱导肥大细胞的浸润(图2以及6)。而且已经表明肥大细胞与嗜酸性细胞同样可能与良好的预后有关。另外已经知可能嗜酸性细胞与由IL-4介导的抗肿瘤活性有关。本发明人等发现用IL-4短时间刺激能增加PPD诱导的半乳糖凝集素-9的产生，但抑制了外周血单核细胞的IL-5的产生。由于肥大细胞可能是炎症部位的主要的IL-4来源，所以这个部位的肥大细胞也许与嗜酸性细胞的累积有关。另外如果依据原位杂交的结果，肥大细胞可以看作BALL-mf处置部位的重要的半乳糖凝集素-9来源(图6)。

另外，本发明人等发现如果将人的外周血单核细胞与放射线照射处置的BALL-1细胞共同培养，NK活性[对肿瘤细胞株K562(NK-敏感细胞)以及其它肿瘤细胞株(例如：LAK-敏感细胞Daudi，KMG-2(胶质瘤细胞)，KATOIII(胃癌)等)两方]被增强。在本发明中发现通过半乳糖凝集素-9可以增强对Meth-A的细胞毒性和NK样活性(虽然其活性低)。综合起来看，表明通过BALL-mf活化的NK细胞对于其它肿瘤细胞也有效。

在肿瘤接种2周内，在用BALL-mf处理的小鼠，用Daudi-mf处理的小鼠以及用PBS处理的小鼠上的肿瘤的成长是相同的(图1(a))。由此表明BALL-mf具有NK活性或具有产生半乳糖凝集素-9的因子。

用BALL-mf处理的小鼠和用Daudi-mf处理的小鼠上，肿瘤细胞的外观不同。在用BALL-mf处理的小鼠中，在非常接近肿瘤周围的纤维状组织的几个肿瘤细胞中发现核固缩，而在用Daudi-mf处理的小鼠中未发现表现出核固缩的细胞(图3a和图2c)。已知半乳糖凝集素类对凋亡起着重要的作用。例如：半乳糖凝集素1能诱导T细胞的凋亡，而半乳糖凝集素3却表现出防止细胞死亡的活性。最近，研究表明半乳糖凝集素7的过度表达也许与用UVB诱导的晒黑的角化细胞的凋亡过程有关。关于半乳糖凝集素-9，已有报道指出小鼠的半乳糖凝集素-9能诱导胸腺细胞或活化T淋巴细胞的凋亡。

即使用BALL-mf刺激肿瘤细胞，也没有发现该细胞表达半乳糖凝集素-9或诱导其凋亡。而半乳糖凝集素-9本身可诱导肿瘤细胞的凋亡。由此表明BALL-mf不是通过直接作用于肿瘤细胞表现抗肿瘤效果，而是通过诱导T细胞或肥大细胞表达或释放半乳糖凝集素-9，表现出抗肿瘤效果。

综合体外的组织标本的结果以及用PC的免疫染色的结果可知，肥大细胞、巨噬细胞、粒细胞(特别是嗜酸性细胞)是含有半乳糖凝集素-9的细胞，所以可使用肥大细胞株MC9进行实验。对肥大细胞株MC9中半乳糖凝集素-9表达进行研究。如果用BALL-mf刺激MC9细胞后，虽然在24小时内细胞表面半乳糖凝集素-9表达轻度增强，但没有发现细胞质内半乳糖凝集素-9表达增强。

实施例2

[半乳糖凝集素-9诱导因子的纯化]

使用实施例1得到的来自BALL-1细胞的膜可溶性级分(BALL-1 mf)作为起始物质，进行纯化处理。

当用Lentil-Lecftin柱分成非吸附级分和吸附级分时，主要在吸附级分发现半乳糖凝集素-9诱导活性。另外通过抗肿瘤实验证实在该吸附级分中存在与起始物相当的抗肿瘤活性。在嗜酸性细胞或肥大细胞的浸润方面也得到了与起始物同样的结果。

使用Rotofor^法对凝集素柱吸附级分进行等电点分级，从用所得级分刺激的外周血单核细胞中提取RNA，通过RT-PCR法对半乳糖凝集素-9的表达进行研究。通过RT-PCR法确认在上述等电点分级中得到的级分F-1，F-2和F-4中半乳糖凝集素-9表达有明显增强。就这些经等电点分级得到的级分的抗肿瘤活性进行了研究。结果证实级分F-2和F-3诱导强的抗肿瘤活性。相反，F-1和F-4与PBS同样，可以使肿瘤细胞的增殖亢进。可证实在级分F-2和F-3中含有的诱导因子具有抗肿瘤活性。就该级分来说，用组织染色可确认嗜酸性细胞或肥大细胞的浸润。

实施例3

[BALL-1细胞的溶解]

把在含有10％ FCS的RPMI1640培养基中培养的BALL-1细胞作为起始原料。将收获的BALL-1细胞重悬于1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)-PBS(1×10⁹cell/5mL)。使用液氮和室温水，进行4次冷冻-融解处理(冷冻-融解×4次)。然后进行超声处理(output＝4，duty cycle％＝50、冰上、4分钟(实际上2分钟左右))。超声处理实施2分钟后间歇，再进行2分钟的操作。离心分离得到的破碎物。离心分离处理在4℃条件下，于100,000G进行1小时。

将离心分离处理得到的沉淀重悬于与使上述BALL-1细胞重悬于1mM PMSF-PBS时等量的由50mM Tris-HCl(pH 8.2)，1mM EDTA以及1％ CHAPS组成的溶液中，进行匀浆处理。使用10mL或20mL的聚四氟乙烯(注册商标)-玻璃匀浆器，于冰上上进行数分钟匀浆处理，直至沉淀完全消失。将得到的生成物进行离心分离。离心分离处理在4℃条件下，于20,000G进行30分钟。

将上清液(Sup(MF))回收。测定吸光度(Optical Density：OD)。使用由50mM Tris-HCl(pH 8.2)，1mM EDTA以及1％ CHAPS组成的溶液作为空白。

[柱层析纯化]

(1)对上述得到的MF实施使用以刀豆球蛋白A(Con A)作为配体的载体的柱层析。

将Con A琼脂糖珠和MF按照(1∶1)混合，在4℃、按照O/N旋转。MF的浓度浓时，用PBS(-)稀释2倍后进行混合。然后将它加到柱上。柱条件：

poly-Prep^层析柱(BIO-RAD 731-1550)

柱体积1.6～2mL

洗脱＝Elu：22G下自然洗脱、Ft，洗涤：无注射器，重力作用下自然流出

珠＝Con A琼脂糖珠(Phamacia)

(珠的预处理：用H₂O洗后、在4℃下用1,000rpm离心1分钟后、进行平衡)

平衡缓冲液＝含有1mM CaCl₂，0.1％ CHAPS的TBS

(流过凝胶量10倍以上的量)

洗涤＝平衡缓冲液

洗脱＝Fr.1～2：0.1M硼酸缓冲液(pH 6.5)(Borate)

      Fr.3～：0.2M硼酸、0.15M NaCl

保存＝含有0.02％NaN₃ PBS、4℃保存

回收洗脱下来的Ft。用与上样体积等量的平衡缓冲液流过柱子进行洗涤。加洗脱缓冲液，封栓，于室温保持20分钟。各1mL、每隔5分钟回收一次到试管中。监测OD(280nm)。

(2)对Con A亲和层析处理级分进行阴离子柱层析

将上述得到的9mL BALL-1 Mf ConA级分(用0.1M borate-NaOH(pH 6.5)洗脱)加样到阴离子柱RESOURCE Q柱(1mL，AmershamBioscience)上进行层析。

缓冲液：A，10mM Tris-HCl(pH 7.5)，0.03％ CHAPS

        B，10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1M NaCl，0.03％ CHAPS

梯度：％B＝0→100(25分钟内)

流速：1mL/min.

级分体积：1mL

监测：UV(A_280nm)0-0.05

导电度，0-100mS

使用Strata Clean Resin(Stratagene，CA，USA)进行样品浓缩(×10)。将浓缩的样品加到SDS-PAGE：12％凝胶(用SYPRO Orange(Molecular Probes，Inc.，USA)染色。

(3)将RESOURCE Q柱层析处理级分进行羟基磷灰石柱层析

使用羟基磷灰石柱CHT2-I柱(Bio-Rad)对上述得到的RESOURCEQ-fraction(fraction Nos.14-17)进行层析。

柱：CHT2-I(Bio-Rad)，2mL

缓冲液：A，10mM Na-Pi(pH 6.8)，0.03％ CHAPS，0.05％ NaN₃

        B，500mM Na-Pi(pH 6.8)，0.03％ CHAPS，0.05％ NaN₃

梯度：％B＝0→80in 30min.

流速：1mL/min.

级分体积：1mL

监测：UV(A_280nm)0-0.02

导电度：0-50mS

使用Strata Clean Resin(Stratagene，CA，USA)进行样品浓缩(×40)。将浓缩的样品进行SDS-PAGE：12％凝胶、用SYPRO Orange(Molecular Probes，Inc.，USA)染色。

(4)对RESOURCE Q柱层析处理级分D实施羟基磷灰石柱层析

对在上述RESOURCE Q处理中得到的级分D实施使用羟基磷灰石柱CHT2-I柱(Bio-Rad)的层析。

柱：CHT2-I(Bio-Rad)

缓冲液：A，10mM Na-Pi(pH 6.8)，0.03％CHAPS

缓冲液：B，500mM Na-Pi(pH 6.8)，0.03％CHAPS

梯度：％B 0→180in 30min.

流速：1mL/min.

级分体积：1mL

监测：UV(A_280nm)0-0.02

导电度：0-50mS

使用Strata Clean Resin(Stratagene，CA，USA)样品进行浓缩(×40)。将浓缩的样品进行SDS-PAGE：12％凝胶、用SYPRO Orange(Molecular Probes，Inc.，USA)染色。

[BALL-mf层析纯化级分的生物活性]

将溶解的肿瘤细胞膜级分利用Lentil-Lecftin柱进行柱层析，然后再通过等电点分级进行纯化，将含有抗肿瘤活性的4个级分作为含有半乳糖凝集素-9诱导因子的候选级分。不过由于回收的蛋白量少，要进入到下面的纯化步骤需要很多人力和时间，所以重新进行提取法和纯化法的调查、研究。使用与Lentil-Lecftin柱具有同样结合特异性，而且结合量多的刀豆球蛋白A(Con A)柱进行纯化。将溶解的膜级分分为Con A柱的吸附、非吸附级分。通过Con A柱将BALL-mf分为非吸附级分、吸附级分，通过SDS-PAGE电泳时，确认不同的蛋白质条带(图16)。当将各级分向Meth-A荷瘤小鼠进行皮下注射时，证实吸附级分(A)存在强的抗肿瘤活性(图17)。非吸附级分(B)与PBS相比，虽然抑制了肿瘤增殖，但没有排斥肿瘤(表1)。在光学显微镜下对给予吸附级分的周围组织的标本进行观察，发现在肿瘤细胞的表层细胞中有表现出核固缩的细胞，暗示可能发生了凋亡(图18)。另一方面没有发现对正常细胞的细胞毒活性。

然后尝试通过阴离子交换柱(RESOURCE Q)进行纯化。从各个级分的电泳条带可分出7个级分(按照洗脱顺序暂称为：A，B，C，D，E，F，G)，当对各级分的抗肿瘤活性进行研究时(图19)，证实级分D表现出最强的抗肿瘤活性。再改变级分D的浓度(稀释倍率：1200、6000、30000倍)研究抗肿瘤活性时，确认抗肿瘤活性存在浓度依赖性(图20)。通过制作组织标本的实验，可以对癌细胞特异性的细胞损伤活性进行研究。

表1.刀豆球蛋白A柱纯化级分的抗肿瘤效果

刀豆球蛋白A柱	消失/存活(只)
		吸附级分非吸附级分	15/52/18
PBS	3/17

经阴离子柱RESOURCE Q纯化后，将RESOURCE Q柱层析处理级分D进行羟基磷灰石柱层析，得到A～E级分(图21)。在图21中也给出了各级分的SDS-PAGE结果。与上述同样，当进行抗肿瘤活性调查时，观察到与其它级分比较，羟基磷灰石柱CHT2-I级分D的抗肿瘤活性最强(图22)。在图22中也给出了该级分的SDS-PAGE结果。

在图1中，各符号代表如下意思。

在图1(a)中

●：用BALL-mf处置的动物的肿瘤重量

■：用Daudi-mf处置的动物的肿瘤重量

○：用BPS处置的动物的肿瘤重量

在图1(b)中

●：在用BALL-mf处置的动物中发生肿瘤排斥的动物数

■：在用Daudi-mf处置的动物中发生肿瘤排斥的动物数

○：在用BPS处置的动物中发生肿瘤排斥的动物数

产业上的可利用性

在本发明鉴定并纯化了半乳糖凝集素-9诱导因子，可以使用该纯化半乳糖凝集素-9诱导因子进行医药品开发、与半乳糖凝集素-9相关的生理现象、生物活性的研究开发。特别是可以通过利用Resource Q^TM离子交换柱、羟基磷灰石柱等从细胞膜可溶性级分以及从该级分获得刀豆球蛋白A吸附级分中获得浓缩的保有半乳糖凝集素-9活性的级分。通过给予该因子，可以获得增强NK样活性的活性、抗肿瘤活性等生物活性，所以利用该半乳糖凝集素-9诱导活性可以开发测定试剂、医药、分析等。

<序列表>

SEQ ID NO：1，用作PCR引物的寡核苷酸

SEQ ID NO：2，用作PCR引物的寡核苷酸

SEQ ID NO：3，用作PCR引物的寡核苷酸

SEQ ID NO：4，用作PCR引物的寡核苷酸

SEQ ID NO：5，用作PCR引物的寡核苷酸

SEQ ID NO：6，用作PCR引物的寡核苷酸

序列表

<110>GALPHARMA公司

<120>半乳糖凝集素-9诱导因子

<130>GL-04PCT

<150>JP 2003-124452

<151>2003-04-28

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR引物的寡核苷酸

<400>1

caggcaccca tggctcaaac tac                                             23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR引物的寡核苷酸

<400>2

tatcagactc ggtaacgggg gt                                              22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR引物的寡核苷酸

<400>3

cgtcaatggc tctgtgcagc tgtc                                            24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR引物的寡核苷酸

<400>4

agatccacac tgagaagctc tggc                                            24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR引物的寡核苷酸

<400>5

ggtcagagtt caaggtgatg gtga                                            24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用作PCR引物的寡核苷酸

<400>6

gcctgatatc atgatggact tgga                                            24

Claims (8)

1.人的半乳糖凝集素-9诱导因子，其为能够在来自B细胞淋巴瘤的细胞株BALL-1细胞得到的细胞膜可溶性级分中鉴定其生物活性存在的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征是该半乳糖凝集素-9诱导因子的生物活性至少可通过选自下述的指标加以鉴定：

(1)诱导半乳糖凝集素-9活性，

(2)在使用Meth-A肉瘤作为靶肿瘤细胞的体内试验中诱发肿瘤细胞的增殖抑制或肿瘤的排斥，

(3)抗肿瘤活性，

(4)在体外试验中能诱导外周血单核细胞的自然杀伤活性，

(5)在使用外周血单核细胞的试验中，使半乳糖凝集素-9mRNA的表达上调，

(6)在使用外周血单核细胞的试验中，使细胞质中半乳糖凝集素-9蛋白质的表达有意义地上升，

(7)通过组织病理学检查，在注射的部位可确认由嗜酸性细胞以及单核细胞所构成的、并伴有少数中性白细胞的肉芽组织，

(8)在注射部位的皮肤肌肉层的上或下的结缔组织中可发现很多肥大细胞，

(9)在肿瘤周围组织的组织病理学检查中，在肿瘤的周围或肿瘤组织中发现有炎症细胞(主要为嗜酸性细胞以及少量的肥大细胞)浸润区域，

(10)在肿瘤周围组织的组织病理学检查中，可检测发现有核固缩的肿瘤细胞，以及

(11)在肿瘤周围组织的组织病理学检查中，可确认在肿瘤周围或肿瘤组织中积累有表现出异染性的肥大细胞。

2.权利要求1所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征是：来自B细胞淋巴瘤的细胞株BALL-1细胞是被放射线照射处理过的细胞。

3.权利要求1或2所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征是：该因子存在于在蛋白酶抑制剂存在下将BALL-1细胞与表面活性剂一起匀浆处理后的可溶性的细胞膜可溶性级分中。

4.权利要求1～3任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子，其特征在于该因子是从由来自B细胞淋巴瘤的细胞株得到的细胞膜可溶性级分通过从由刀豆球蛋白A柱层析、阴离子柱层析以及羟基磷灰石柱层析等柱层析中选择的处理方法可被纯化和/或浓缩。

5.在细胞中诱导半乳糖凝集素-9的试剂，其特征是含有权利要求1～4任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子。

6.在细胞中诱导半乳糖凝集素-9的方法，其特征是使权利要求1～4任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子与细胞接触。

7.以含有权利要求1～4任一项所述的半乳糖凝集素-9诱导因子为特征的医药。

8.权利要求7所述的医药，其特征是可作为抗肿瘤剂、抗炎症剂、抗变态反应剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂或肾上腺皮质类固醇激素代用剂。

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